ES2228807T3 - Nuevo peptidos antiarritmicos. - Google Patents

Nuevo peptidos antiarritmicos.

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ES2228807T3
ES2228807T3 ES01907393T ES01907393T ES2228807T3 ES 2228807 T3 ES2228807 T3 ES 2228807T3 ES 01907393 T ES01907393 T ES 01907393T ES 01907393 T ES01907393 T ES 01907393T ES 2228807 T3 ES2228807 T3 ES 2228807T3
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Jorgen Soberg Petersen
Eddi Meier
Anne Louise Kjolbye
Niklas Rye Jorgensen
Morten Schak Nielsen
Niels-Henrik Holstein-Rathlou
James B. Martins
David Knott
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Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula I: X-(Y¿)b-(Px)2- G¿-A-(G¿)a-R7 en la que todos los residuos aminoácidos son, de manera independiente, formas D y en la que X representa H o Ac; G¿ representa un residuo de glicina o Sar; A representa alanina; Px representa un residuo aminoácido de la fórmula II (II) en la que n es un número entero que tiene el valor de 3, 4 ó 5, y R representa un sustituyente opcional, Y¿ representa tirosina o fenilalanina opcionalmente sustituida en el anillo fenilo con halógeno o hidroxi; a y b son, independientemente, 0 ó 1; R7 representa OH, NH2, NHNH2-Asn-NH2 o Gln-NH2; y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Description

Nuevos péptidos antiarrítmicos.
La presente invención se refiere a nuevos péptidos, incluidos nuevos péptidos antiarrítmicos de estructura lineal o cíclica, que exhiben una estabilidad mejorada in vitro y/o in vivo, a composiciones que comprenden dichos péptidos, y al uso de dichos péptidos para la preparación de medicamentos.
Antecedentes de la invención
La muerte súbita debida a arritmias cardiacas es una de las principales causas de muerte en el mundo occidental. La enfermedad más frecuente, responsable de la muerte súbita, es la cardiopatía isquémica, pero en pacientes más jóvenes son también importantes enfermedades hereditarias tales como cardiomiopatía hipertrófica y el síndrome de QT largo.
Las arritmias cardiacas pueden surgir de anomalías en la formación del impulso, en la conducción del impulso, o una combinación de ambas. La regulación de la formación y conducción del impulso implica una compleja interacción entre el sistema nervioso autónomo, los canales de iones cardiacos y las uniones por hendidura cardiacas.
Los resultados de la prevención farmacológica, en especial de las arritmias inducidas por isquemia, han sido desalentadores. De este modo, ensayos clínicos han puesto de manifiesto que diversos fármacos antiarrítmicos de clase I y clase III incrementan la mortalidad en pacientes con cardiopatías isquémicas (1). Una característica común de todos los antiarrítmicos actualmente utilizados es que interfieren con los canales de iones cardiacos (canales de sodio, potasio y calcio), o con el sistema nervioso autónomo, interfiriendo, de esta forma, con la generación del potencial de acción. Este es, probablemente, el motivo por el que no sólo producen una acción antiarrítmica, sino también un efecto pro-arrítmico, con el potencial de inducir arritmias letales en especial en pacientes con una función reducida del ventrículo izquierdo, insuficiencia cardiaca congestiva o antecedentes de taqui-arritmia ventricular sostenida. Ejemplos de fármacos antiarrítmicos son flecainida, encainida, moricizina y quinidina. Los fármacos antiarrítmicos que prolongan la repolarización cardiaca, tales como amiodarona y sotalol, se asocian con el desarrollo potencial de una arritmia específica y llamativa, torsades de pointes. Torsades, una arritmia ventricular muy rápida, se produce probablemente cuando un conjunto de características asociadas: hipopotasemia, bradicardia y, posiblemente, conducción retrasada, altera la estabilidad de membrana, provocando oscilaciones. Amiodarona, al igual que sotalol, está indicada solamente en arritmias amenazantes para la vida. El fármaco bloquea los canales de sodio y, en cierto grado, los canales de calcio, y tiene también efecto beta-bloqueadores. En ensayos precoces, los efectos secundarios (que están relacionados con la dosis), dieron lugar a la interrupción del medicamento hasta en 20% de los pacientes en un año. Las toxicidades cardiacas incluyen bradicardia sinusal, bloqueo aurículo-ventricular, insuficiencia cardiaca congestiva y arritmias ventriculares.
En resumen, los fármacos antiarrítmicos actualmente disponibles no han sido capaces de prevenir la muerte súbita causada por arritmias cardiacas. Por lo tanto, existe una gran necesidad, insatisfecha, de nuevos fármacos antiarrítmicos seguros y eficaces para el tratamiento de arritmias amenazantes para la vida. Debido a los graves efectos secundarios que limitan el uso de los actuales antiarrítmicos, resulta deseable una nueva clase de fármacos antiarrítmicos, con un mecanismo de acción completamente diferente. Como se ha mencionado anteriormente, la regulación de la formación y conducción del impulso es una compleja interacción entre el sistema nervioso autónomo, los canales de iones cardiacos y las uniones por hendiduras cardiacas. Hasta la fecha, el desarrollo de antiarrítmicos se ha centrado en el sistema nervioso autónomo y en los canales de iones cardiacos y ningún fármaco, actualmente disponible, actúa abriendo las uniones por hendidura cardiaca. Sin embargo, recientemente, diversas líneas de investigación han puesto de manifiesto el importante papel de las uniones por hendidura en el desarrollo de arritmias, por lo que la modulación de las uniones por hendidura representa una nueva diana muy interesante en el tratamiento de las arritmias.
Las uniones por hendidura son regiones especializadas de la membrana celular con racimos de centenares a millares de canales de unión por hendidura, densamente reunidos, que conectan directamente el compartimiento citoplasmático de dos células adyacentes. Los canales de uniones por hendidura están compuestos por dos hemicanales (conexones) proporcionados por cada una de las dos células adyacentes. Cada conexón consiste en seis proteínas llamadas conexinas. Las conexinas son una amplia familia de proteínas, todas las cuales comparten la estructura básica de cuatro dominios trans- membranosos, dos asas extracelulares y un asa citoplasmática. Existe un elevado grado de conservación de las asas extracelulares y dominios trans-membranosos entre las especies e isoformas de conexinas. No obstante, la longitud del extremo C varía considerablemente, dando lugar a la clasificación de las conexinas sobre la base del peso molecular. La distribución de los diferentes tipos de conexinas (Cx) varía a todo lo largo del corazón. La isoforma Cx43 es el tipo predominante en los ventrículos, en tanto que Cx40 es la isoforma más abundante en las aurículas y en el sistema de conducción. El canal de unión por hendidura puede variar entre un estado abierto y uno cerrado por un movimiento de torsión. En el estado abierto, iones y moléculas pequeñas, menores de aproximadamente 1000 D pueden pasar a través del poro. La conducción del impulso eléctrico tiene lugar a través de las uniones por hendidura y, por consiguiente, las uniones por hendidura de funcionamiento normal son un prerrequisito para una conducción normal y, por lo tanto, un ritmo cardiaco normal.
El desarrollo de ratones "knockout", exentos de diferentes tipos de conexinas, ha proporcionado una creciente comprensión del importante papel de las uniones por hendidura en la conducción anormal. A partir de estos estudios, se ha demostrado que los ratones homocigóticos para una deleción dirigida del gen Cx43 mueren poco después de nacer por malformaciones cardiacas y pulmonares, en tanto que los ratones heterocigóticos sobreviven. Sin embargo, el genotipo heterocigótico presenta una conducción significativamente ralentizada en comparación con los ratones de tipo salvaje (2). En ratones adultos (6-9 meses de edad), la conducción epicárdica ventricular de latidos mercados se ralentiza en 44% y los complejos QRS de los registros de ECG se prolongan de manera significativa, en comparación con los ratones de tipo salvaje. La expresión reducida de Cx43 está directamente relacionada con un aumento de la incidencia de arritmias ventriculares durante la isquemia en ratones heterocigóticos para la deleción del gen Cx43 (3). De esta forma, la incidencia de taquicardia ventricular espontánea tras la inducción de una isquemia regional en corazón aislados prefundidos de ratones heterocigóticos es el doble con respecto a la incidencia de corazones de tipo salvaje. Adicionalmente, los ratones con una pérdida cardioespecífica de Cx43 desarrollan arritmias ventriculares espontáneas y muerte súbita cardiaca, con 100% de mortalidad hacia los dos meses de edad. La eliminación del gen Cx43 no es mortal, si bien la conducción auricular, aurículo-ventricular y de His-Purkinje es significativamente más lenta en ratones Cx40 -/- con respecto a ratones Cx40 +/+, exhibiendo los ratones Cx40 -/- un mayor riesgo de arritmias y de bloqueo de la rama del haz (4-6).
También se ha establecido la relación entre anomalías en las conexinas y la cardiopatía en humanos. Un ejemplo es la enfermedad de Chagas, causada por el parásito protozoario Tripanosoma cruzi. Esta enfermedad es una causa importante de disfunciones cardiacas en América Latina. Se ha observado una distribución alterada de Cx43 en células infectadas con Tripanosoma cruzi y dicha alteración puede intervenir en la génesis de los trastornos de conducción por los que se caracteriza la enfermedad (7). Varios estudios sobre la expresión y distribución de Cx43 en corazones crónicamente isquémicos, en hibernación o hipertróficos describen también en grado reducido de expresión de Cx43 y un patrón modificado de distribución (8-10). De hecho, la expresión y/o distribución de las conexinas han estado alteradas en todos los estados patológicos de los corazones investigados hasta la fecha.
En resumen existen múltiples pruebas que relacionan el malfuncionamiento o la ausencia de uniones por hendidura con un riesgo incrementado de arritmias, y múltiples evidencias que ponen de manifiesto una expresión/distribución alterada de conexinas en la cardiopatía crónica. Como se ha mencionado anteriormente, ningún fármaco antiarrítmico actualmente disponible actúa aumentando la función de la unión por hendidura. Sin embargo, se ha descrito en el pasado un grupo de péptidos (péptidos antiarrítmicos) capaces de incrementar la conductancia de la unión por hendidura.
Péptidos antiarrítmicos
En 1980, Aonuma et al. (11) aislaron un hexapéptido con un peso molecular de 470 D de la aurícula bovina. En cardiomiocitos de rata recién nacida se demostró que 0,1 \mug/ml de este péptido podía convertir la fibrilación inducida por uabaína, niveles elevados de calcio (3 mM) o bajos de potasio (0,7 mM) en ritmo normal. Además, 2,5-5,0 \mug/ml de este péptido podían convertir el movimiento arrítmico de aurículas aisladas de ratas, inducido por la combinación de bajos niveles de potasio (0,3 mM) y acetilcolina en ritmo normal. De este modo, este péptido se denominó péptido antiarrítmico (AAP) (Ejemplo Comparativo 1 más adelante (CE1)). AL agregarlo a un medio de cultivo celular, AAP aumentó el número de centros de latido, el contenido relativo de células en diseminación y la síntesis de proteínas (12). En 1982, se determinó la secuencia de aminoácidos de AAP como H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (13). En estudios in vivo posteriores, se confirmó el efecto antiarrítmico de AAP observado in vitro. Se demostró que AAP, 10 mg/kg, era eficaz contra la arritmia inducida por CaCl_{2}-, uabaína y acotinina en el ratón (14). Se han analizado varios derivados sintéticos de AAP, que han demostrado ser más potentes que el AAP endógeno contra las arritmias inducidas experimentalmente en ratones y ratas (15-17). El derivado sintético más extensamente investigado es AAP10 (H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH_{2}) (Ejemplo Comparativo 2, más adelante (CE2)). En el corazón aislado y prefundido de conejo, 0,1 nmol/l a 10 nmol/l de este péptido redujeron la dispersión de los intervalos de activación-recuperación medidos en 256 electrodos epicárdicos ventriculares bajo condiciones normales (18). AAP10 carece de efecto sobre la duración media del potencial de acción, la presión diastólica final del ventrículo izquierdo, el flujo coronario, la duración de QRS o sobre la intervalo PQ. Si se sometían los corazones a isquemia regional por oclusión de la rama descendente de la arteria coronaria izquierda durante 30 min, el pretratamiento con 10 nmol/l de AAP10 condujo a una reducción significativa de las alteraciones inducidas por la isquemia de los patrones de activación y redujo la dispersión de los intervalos de activación-recuperación (18). Estudios adicionales demostraron que AAP10 no afectó al potencial de acción de músculos papilares aislados de corazones de cobaya en concentraciones de hasta 1 \mumol/l (18). Estos hallazgos concuerdan con los de Argentieri et al. (19), quienes investigaron el mecanismo de las propiedades antiarrítmicos de AAP por medio del examen del efecto sobre el potencial de acción en fibras de Purkinje caninas aisladas. En este modelo, AAP no afectó a la inotropia ni a ninguno de los parámetros electro-fisiológicos medidos (potencial diastólico máximo, amplitud del potencial de acción, velocidad máxima de despolarización, y duración del potencial de acción con repolarización de 50% y 95%). Se concluyó, por lo tanto, que AAP no afecta a las corrientes de iones transmembranosas. En músculos papilares de cobaya, se examinó el efecto sobre el tiempo de acoplamiento, es decir, el intervalo de tiempo entre la electroestimulación y el inicio del potencial de acción (20). Se encontró que concentraciones altas de AAP10 (1 \muM) podían disminuir el intervalo de estímulo-respuesta en aproximadamente 10% bajo condiciones normóxicas. Adicionalmente, durante la hipoxia y la perfusión sin glucosa, se impidió el incremento del intervalo de estímulo-respuesta, lo que indica desacoplamiento, por medio de 10 nmol/l de AAP10. Dado que el efecto de AAP10 sobre el tiempo de acoplamiento fue muy pronunciado en células de escaso acoplamiento, los autores sugirieron que AAP10 actúa, de forma preferente, sobre células de escaso acoplamiento. El efecto sobre el tiempo de acoplamiento indicó que AAP ejerce sus acciones a través de la conductancia en uniones de hendidura. Para comprobar esta teoría, los autores examinaron el efecto de AAP10 sobre la conductancia en uniones por hendidura en cardiomiocitos ventriculares de cobayas maduras, empleando la técnica de grapas de voltaje de doble célula. Estos estudios demostraron que 10 nmol/l de AAP10 produjeron un incremento rápido y reversible de la conductancia en uniones por hendidura. De esta forma, las propiedades antiarrítmicas de AAP10 se explicaron por una mejoría del acoplamiento de las uniones por hendidura, reduciendo de este modo la dispersión del potencial de acción y previniendo la ralentización de la conducción.
En resumen, los péptidos antiarrítmicos son un grupo de péptidos que ejercen su efecto de manera selectiva sobre las uniones por hendidura y reducen, de esta forma, el desacoplamiento celular y reducen la dispersión de la duración o la forma del potencial de acción. Por lo tanto, cabe esperar que los péptidos antiarrítmicos carezcan de los efectos proarrítmicos que limitan el uso de muchos antiarrítmicos actualmente disponibles. Esto hace que los péptidos antiarrítmicos sean extremadamente interesantes como clase potencialmente nueva y más segura de compuestos antiarrítmicos. Sin embargo, tanto el AAP nativo como el AAP10 sintético poseen varias características indeseables tales como baja estabilidad, alta concentración efectiva, etc., que, hasta ahora, han impedido su uso como fármacos. Grover y Dhein (21) han caracterizado dos conformaciones semi-cíclicas de AAP10, empleando espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Por consiguiente, un método para obtener un péptido antiarrítmico estable podría ser la provisión de derivados cíclicos de péptidos antiarrítmicos. El documento DE19707854 describe CF_{3}C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH aparentemente cíclico y CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH cíclico que poseen las mismas propiedades antiarrítmicas que AAP y AAP10, pero de los que se afirma que tienen una estabilidad mejorada en solución acuosa y después de ciclos repetidos de congelación y descongelación. No obstante, las condiciones experimentales descritas en el documento DE19707854 son insuficientes para la preparación de dichos compuestos cíclicos, y los datos de identificación química indicados en el citado documento, usando HPLC, no son suficientes para identificar los mencionados compuestos cíclicos. El documento US 4.775.743 describe HP5, un derivado peptídico que posee la secuencia N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH y que es activo contra la aglutinación plaquetaria. Dhein y Tudyka (22) han revisado la bibliografía relativa a actividad y concentración de péptidos, incluidos los derivados peptídicos pertenecientes al grupo de péptidos antiarrítmicos, véase la Tabla 1, encontrando solamente 7 compuestos activos y otros 4, que fueron débilmente activos. No obstante, ninguno de estos péptidos o derivados peptídicos ha demostrado ser suficientemente estable para ser eficaz en un régimen terapéutico.
Adicionalmente, en la solicitud de patente japonesa nº 08281636 y en la solicitud de patente japonesa nº 09308589 se describen depsipéptidos cíclicos con acción antiarrítmica, pero que poseen un enlace éster que exhibe labilidad frente a las esterasas endógenas. Además, el documento WO96/21674 describe derivados de AAP10 en los que se ha sustituido un hidrógeno en el anillo fenilo del residuo tirosina con halógeno. Dichos derivados de AAP10 poseen propiedades antiarrítmicas y un riesgo proarrítmico reducido en comparación con lidocaína y flecainida.
En la bibliografía se describen los siguientes péptidos AAP y compuestos similares a AAP:
(AAP) H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-4Hyp-OH,
H-Gly-Pro-OH,
H-Gly-Pro-Leu-OH,
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-OH,
H-4Hyp-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Gly-Gly-OH,
H-Pro-Pro-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-OH,
H-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH,
(HP5) N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-fenilpropionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-fenilpropil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-OH,
N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-OH,
N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-OH,
N-3-(3-hidroxifenil)-propionil-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
(AAP10) H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH_{2},
H-Gly-Sar-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Sar-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-F)-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Cl)-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-Br)-NH_{2},
H-Arg-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2},
H-Val-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2},
H-Ala-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-His-Tyr-NH_{2},
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Phe-NH_{2},
Ciclo-(CF_{3}C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH), y
Ciclo-(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH).
Los siguientes compuestos:
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (AAP),
H-Gly-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-NH_{2} (AAP10),
H-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-OH,
H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr(3-I)-NH_{2},
H-Gly-Pro-Sar-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (HP5),
N-3-fenilpropionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH,
N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-Pro-Gly-Ala-Gly-OH,
Ciclo-(CF_{3}C(OH)-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH), y
Ciclo-(CO-Gly-Ala-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-CONH)
han demostrado actividad o actividad débil en modelos de ensayo, véase, por ejemplo, Dhein y Tyduka (1995).
Aunque se han proporcionado péptidos antiarrítmicos activos, ninguno de ellos ha conducido al desarrollo de un muy buscado fármaco antiarrítmico. El propósito de la presente invención es proporcionar péptidos antiarrítmicos adicionales y análogos funcionales de los mismos, útiles en el tratamiento de diversas cardiopatías coronarias y de utilidad para preparar medicamentos. Adicionalmente, los nuevos péptidos descritos en este documento incrementan la comunicación intercelular en las uniones por hendidura (GJIC) en el tejido de vertebrados y, de forma específica, en el tejido de mamífero, y son útiles en el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades y trastornos en vertebrados tales como mamíferos, relacionados con o causados por un descenso de la función de comunicación de la unión por hendidura intercelular, como se describe más adelante.
Resumen de la invención
El propósito de la presente invención se consigue con los presentes péptidos, incluidos los compuestos peptídicos antiarrítmicos, que se distinguen por tener la siguiente fórmula general I, como se establece en la reivindicación 1, y a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos, y a su uso médico, en especial para el tratamiento de arritmias.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración de los diferentes principios útiles en la ciclación de las secuencias peptídicas.
La Figura 2 muestra los cambios relativos de las GJ de conductancia intercelular en función del tiempo, antes y durante la estimulación con el Compuesto 2 (10^{-8} M), o vehículo, sobre miocitos aislados de cobaya. El cambio de conductancia se expresa como variación porcentual en relación con la conductancia inmediatamente anterior a la perfusión con Compuesto 2.
La Figura 3 muestra el ciclo metabólico de fosfoinositol (PI) como función de la concentración de noradrenalina en cultivos de cardiomiocitos aislados de ratas Wistar recién nacidas, después de 10 minutos de privación de glucosa y oxígeno.
La Figura 4 muestra el efecto del Compuesto 2 sobre el incremento atenuado, inducido por noradrenalina, del ciclo metabólico de fosfoinositol durante la tensión metabólica inducida por isquemia y carencia de glucosa cuando se agrega al cultivo de cardiomiocitos.
La Figura 5 muestra mediciones de la desviación estándar de APD_{90} como medida de dispersión eléctrica (dispersión de APD_{90}) durante cuatro protocolos de perfusión conservadora. * indica p<0,05 frente al grupo tratado con vehículo.
La Figura 6 es un mapa de activación de un corazón canino, en el que la capa de Purkinje se estimula aproximadamente dos horas después de una oclusión de una arteria coronaria con un plano de activación epicárdica (EPI) en los planos superior izquierdo y sub-epicárdico (S-EPI), de pared media, sub-endocárdico (S-ENDO), endocárdico (ENDO) y de Purkinje (PURK) representados hacia abajo a la derecha del último estímulo prematuro.
La Figura 7 ilustra electrogramas epicárdicos (E-) en el mismo perro cuyos ejemplos se presentan en las Figuras 6, 7 8 y 9, registrado con una derivación de superficie de ECG II y V5R durante el segundo hasta el quinto estímulo extra prematuro (se ve mejor en E-L), con complejos aseguradores 4 de VT. Los electrogramas de registran de las zonas lateral, límite (L) de marcado, y este (E), norte (N), central (C), sub-epicárdico (SE), debajo de E-C, así como sur (S) y noroeste (NW) y suroeste (SW) de E-C.
La Figura 8 ilustra la activación epicárdica del primer complejo de la taquicardia ventricular, que se inicia a -44 mseg antes del inicio del QRS de superficie, y que se corresponde con el electrograma registrado en E-C en la Figura 7. La activación tiene lugar en una reentrada de doble asa que se activa, primero, a -17 mseg y, a continuación, prosigue hasta 57 mseg en el asa noroeste. El asa sureste se activa, en primer lugar, a 2 mseg, 31 mseg y, entonces, a 57 mseg.
La Figura 9 muestra las mismas derivaciones del o de los mismos perros (?) que se presentan en la Figura 7. Esta figura ilustra los electrogramas epicárdicos (E-) registrados durante la estimulación del mismo sitio utilizado en la Figura 7, pero tras la administración i.v. de Compuesto 2. Después de 30 minutos, se administró una segunda dosis de Compuesto 2 y, después de 30 minutos adicionales, se administró una tercera dosis. Tras la administración de cualquiera de estas dosis, no se indujo VT hasta una hora y media después de la administración del péptido antiarrítmico.
La Figura 10 muestra el efecto a corto plazo de 1 x 10^{-8}M de Compuesto 2 sobre la propagación de la onda de calcio intercelular en osteoblastos humanos. Se traza el número de células en la onda antes (1) y 10 minutos después de agregar el Compuesto 2 (2) a la solución de baño.
La Figura 11 muestra el número de células en la onda de calcio trazada antes (1) y 10 minutos después de la adición de 1 x 10^{-8} M de Compuesto 2 (2) a células ROS 17/2,8, cultivadas bajo condiciones de hipoxia (CO_{2} al 5%).
La Figura 12 ilustra la transferencia de tinción de células ROS 17/2,8, cultivadas bajo condiciones de hipoxia (O_{2} al 3-6%). Se traza el número de células acopladas antes (1) y 10 minutos después de agregar 1 x 10^{-8} M de Compuesto 2 (2) a la solución del baño.
La Figura 13 ilustra el efecto a corto plazo de 1 x 10^{-8} M de Compuesto 2 sobre la propagación de la onda de calcio intercelular en osteoblastos humanos bajo condiciones de hipoxia. La Figura muestra el número de células en la onda durante la hipoglucemia (1) y 10 minutos después de agregar Compuesto 2 a la solución de baño hipoglucémica (2).
La Figura 14 muestra la actividad de fosfatasa alcalina (ALP) en cultivos de células osteoblásticas humanas. La actividad de ALP es una medición de actividad osteoblástica. La actividad de ALP se midió durante una estimulación de 4 días con 10^{-13}-10^{-6} M de Compuesto 2 en cada cultivo, y se comparó con controles no tratados. La relación entre la actividad de ALP en los cultivos tratados y no tratados se trazan para cada concentración del compuesto. El Compuesto 2 estimuló la actividad de ALP y, por consiguiente, la actividad osteoblástica a todas las concentraciones, en un intervalo de concentraciones de 10^{-13} a 10^{-7} M.
La Figura 15 muestra el efecto del Compuesto 2 sobre la transferencia de tinción Amarillo Lucifer (LY) en células osteoblásticas humanas tratadas con DDT 13 \muM, el compuesto 1,1-bis-(p-clorofenil)-2,2,2-tricloroetano. La incubación durante 10 minutos con Compuesto 2 10^{-8}M produjo un incremento el número de células acopladas a la tinción en todos los experimentos (1 indica antes y 2, después de la adición de Compuesto 2 al baño).
En la descripción detallada y Ejemplos, se hace referencia a compuestos no incluidos en el alcance de la reivindicación 1 a modo de comparación.
Descripción detallada de la invención
En realizaciones preferidas de la invención, los enlaces covalentes se seleccionan de enlaces peptídicos, enlaces disulfuro, enlaces éster, enlaces de amida reducida, enlaces alcoxi, enlaces oxicarbonilo y enlaces aciloxi-alcoxi.
Ejemplos de Px son aminoácidos representados por la fórmula II
1
en la que n es un número entero con un valor de 3, 4 ó 5, y R representa un sustituyente opcional, seleccionado preferentemente del grupo consistente en halógeno, fenilo, hidroxi, NH_{2} y alquilo-C(1-6).
Preferentemente, la secuencia (Px)_{2}A-B representa un dipéptido seleccionado del grupo consistente en Sar-Sar, Sar-Hyp, Hyp-Sar, Pro-Sar, Sar-Pro, Pro-Hyp, Pro-Pro, Hyp-Pro, e Hyp-Hyp, en donde Pro e Hyp, en donde la estructura de anillo de Pro e Hyp está opcionalmente sustituida con halógeno, nitro, metilo, amino, o fenilo, e Hyp representa 3-hidroxiprolina o 4-hidroxiprolina, o uno de los dos residuos de aminoácidos de Px es un residuo Sar o N-ciclohexil-glicina,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 2), y sus sales farmacéuticamente aceptables.
La presente invención proporciona compuestos de la fórmula general (I)
X -(Y^{1})_{b}-(Px)_{2}-G'-A-(G')_{a}-R_{7}
que especifica una secuencia peptídica en la que los residuos aminoácidos son, de forma independiente, formas D y
en la cual
X representa H o Ac;
G' representa un residuo de glicina o Sar, G' es, preferentemente, glicina;
A representa alanina;
Px representa un residuo aminoácido de la fórmula II tal como Hyp o Pro, preferentemente, prolina;
Y' representa tirosina o fenilalanina, opcionalmente sustituida en el anillo fenilo con halógeno o hidroxi; Y' es, preferentemente, tirosina;
a y b son, independientemente, 0 ó 1,
R_{7} representa OH, NH_{2}-NHNH_{2}-Asn-NH_{2}, o Gln-NH_{2};
y sus sales.
Derivados peptídicos foto / termolábiles
La marca por afinidad es una técnica frecuentemente utilizada para estudiar las interacciones de moléculas biológicamente activas. Para la investigación se usa un análogo foto- o termolábil del compuesto.
Un análogo fotolábil del compuesto analizado, que es estable en la oscuridad, se convierte por iluminación en un intermedio reactivo que puede participar en reacciones de inserción. Éste, al formar un enlace covalente, estabiliza la interacción basada en la afinidad biológica. Como foto-muestras, las azidas aromáticas y los diazocompuestos estabilizados producen, con la fotólisis, intermedios muy reactivos e inespecíficos, nitrenos y carbenos, respectivamente capaces de participar en reacciones de inserción. De esta forma, la marca de fotoafinidad que utiliza azidas arílicas y diazo-compuestos estabilizados como foto-muestras se puede llevar a cabo en cualquier punto de unión que contiene enlaces carbono-hidrógeno y no requiere la presencia de un grupo funcional reactivo particular en el punto de unión. La especificidad de la marca depende, por consiguiente, de la unión específica del ligando al receptor que, entonces, va seguida por una reacción que forma un enlace covalente inespecífico que garantiza la marca del punto de unión. Las muestras de fotoafinidad son particularmente útiles para marcar sitios receptores de hormonas en los que puede no haber presentes grupos funcionales reactivos, pero que, con toda seguridad, contienen enlaces de carbono-hidrógeno. Como funcionalidad foto-activa , los azidos, diazirino, \alpha-diazido-cetonas, tia-y selenodiazoles, benzofenonas y nitrofenilo son especialmente útiles. El proceso de marcado empleando azidas arílicas incluye la fotólisis a \lambda_{ex} = 300 -
320 nm durante aproximadamente 0,5 - 2 h a temperatura ambiente de una solución acuosa que contiene el análogo peptídico fotolábil y el receptor.
Un compuesto termolábil contiene un grupo reactivo que puede formar un enlace covalente en una reacción térmicamente controlada, con especificidad hacia los grupos amino o mercapto. Como muestras térmicas se pueden usar haluros alifáticos, en especial, yodo y bromo, ésteres activos tales como N-hidroxi-succinimida, cloruros ácidos, disulfuros de piridilo, isocianatos, isotiocianatos, carbodiimidas y maleimido.
Las marcas para aplicaciones in vitro se seleccionan, muy a menudo, como isótopos radiactivos tales como Yodo-125 y 131, C-14 y tritio, o muestras de fluorescencia, o biotina o haptenos. Es necesario investigar la influencia de la marca sobre la actividad de fijación del ligando con el fin de asegurar que se conserva la afinidad del receptor. Como marca radiactiva, se utiliza a menudo Yodo-125 para aplicaciones in vitro, debido a su semivida de 60 días y emisiones de fotones de baja energía. La prolongada semivida permite la preparación y almacenamiento de análogos fotoactivos marcados y los productos de proteínas marcadas resultantes durante períodos prolongados antes de su uso o análisis. La incorporación de yodo (I-125) a ligandos peptídicos se puede realizar fácilmente si en la secuencia peptídica se encuentran presentes, por ejemplo, tirosina o histidina. Es necesario investigar la influencia de la marca del péptido sobre la actividad biológica del ligando para garantizar el mantenimiento de la actividad biológica. Dhein et al. (documento WO96/21674) han demostrado que un derivado de AAP10, en el que el anillo fenilo de los residuos Tyr porta un sustituyente Yodo-125 tiene actividad biológica. Sin embargo, el uso de dicha variante de AAP10 como muestra de afinidad no es posible debido a la unión reversible a un posible ligando o receptor. La marca de fotoafinidad usando azidas arílicas da como resultado, por lo general, 50-60% del ligando peptídico unido de forma no reversible a la proteína diana (receptor). Por lo tanto, un propósito de la presente invención es proporcionar, adicionalmente, un péptido antiarrítmico adecuadamente modificado con una foto- o termo-muestra y, opcionalmente, una marca radiactiva, para utilizarlo en ensayos para la identificación de posibles ligandos o receptores para el péptido antiarrítmico. Dicho propósito se consigue con un compuesto de las fórmulas I, XII, XII o 9 del presente documento, derivatizado con una de las foto-muestras anteriormente mencionadas, preferentemente, 4-azido-saliciloílo (ASAL) y AB-(4-azido-benzoílo). Preferentemente, dicho compuesto derivatizado está adicionalmente sustituido con una marca radiactiva tal como Yodo-125.
Sales
Se prefiere que los compuestos de la invención se utilicen en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, un éster alquílico, una amida, una alquilamida, una dialquilamida o una hidrazida formada con la función ácido carboxílico C-terminal de un compuesto lineal, o una función ácido carboxílico libre, si está presente, de un compuesto cíclico. Amidas y amidas de alquilo inferior de compuestos lineales se encuentran entre los compuestos de la invención preferidos. Las sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de adición de ácidos y sales básicas. Ejemplos de sales de adición de ácidos son sales hidrocloruro, sales sódicas, sales de calcio, sales de potasio, etc. Ejemplos de sales básicas son sales en las que el catión se selecciona de metales alcalinos tales como sodio y potasio, metales alcalino-térreos tales como calcio, y iones de amonio ^{+}N-(R^{3})_{3}(R^{4}), en donde R^{3} y R^{4} designan, independientemente, alquilo-C_{1-6} opcionalmente sustituido, alquenilo-C_{2-6} opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son, por ejemplo, las que se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª edición, Alfonso R. Genaro (comp..), Mark Publishing Company, Easton, PA, EE.UU., 1985 y ediciones más recientes, y en la Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
Definiciones
A lo largo de la descripción y reivindicaciones se utiliza el código de tres letras para los aminoácidos naturales, así como los códigos de tres letras generalmente aceptado para otros \alpha-aminoácidos tales como sarcosina (Sar), ácido \alpha-amino-iso-butanoico (Aib), naftil-alanina (Nal), incluida 1-naftil-alanina (1Nal) y 2-naftil-alanina (2Nal), fenilglicina (Phg), ácido 2,4-diamino-butanoico (Dab), ácido 2,3-diamino-propanoico (Dapa) e hidroxiprolina (Hyp). Si no se especifica lo contrario, Hyp representa 4-hidroxiprolina. Los aminoácidos naturales o esenciales son los constituyentes aminoácidos de las proteínas. Los aminoácidos aromáticos son Phe, Tyr, Trp, 1Nal, 2Nal e His. Cuando no se especifica la forma L o D, se debe entender que el aminoácido en cuestión tiene la forma L natural, véase Pure & Appl. Chem. Vol. 56(5), págs. 595-624 (1984).
Si no se especifica lo contrario, se debe entender que el aminoácido C-terminal de un compuesto de la invención existe en forma de ácido carboxílico libre, que también se puede especificar como "-OH". Se puede demostrar que el aminoácido C-terminal de un compuesto de la invención tiene la función terminal "-OH/NH_{2}", que significa que existen dos formas preferidas del compuesto: el ácido carboxílico libre y el derivado amidado. Los compuestos hexapeptídicos de la invención, que comprenden la secuencia Ala-Gly-Hyp y que poseen un grupo -NH_{2} en el extremo C, no contienen un Phe o Tyr C-terminal, ni derivados de los mismos que tienen una sustitución de halógeno en el anillo fenilo.
Por "análogos funcionales" de péptidos antiarrítmicos se entiende cualquier entidad o compuesto químico que tiene una conformación estructural y/o propiedades de unión suficientemente similar a la del AAP endógeno para proporcionar una o más de las propiedades antiarrítmicas o antitrombóticas beneficiosas del AAP endógeno.
El término "heteroarilo" incluye grupos heterocíclicos monocíclicos aromáticos de 5 ó 6 miembros, que contienen1-4 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre tales como pirrolilo, furilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, triazolilo, piridilo, y grupos heterocíclicos bicíclicos aromáticos que contienen 1-6 heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre tales como quinolinilo.
La expresión "retro-análogo" quiere dar a entender un péptido cuya secuencia es el inverso del péptido mencionado.
El término "halógeno" se refiere a F, Cl, Br e I, siendo preferidos F e I.
El término "alquilo" se refiere a grupos univalentes derivados de alcanos por la eliminación de un átomo de hidrógeno de cualquier átomo de carbono: C_{n}H_{2n+1}-. Los grupos derivados por la eliminación de un átomo de hidrógeno desde un átomo de carbono terminal de alcanos no ramificados forman una subclase de grupos alquilo (n-alquilo): H[CH_{2}]_{n}-. Los grupos RCH_{2}-, R_{2}CH- (R es diferente de H) y R_{3}C- (R diferente de H) son, respectivamente, grupos alquilo primarios, secundarios y terciarios. Alquilo-C(1-22) se refiere a cualquier grupo alquilo que tiene 1 a 22 átomos de carbono e incluye alquilo-C(1-6) tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, pentilo y hexilo y todos sus posibles isómeros. Por "alquilo inferior" se da a entender alquilo-C(1-6), preferentemente, alquilo-C(1-4) y, más preferentemente, metilo y etilo.
El término "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo lineal, ramificado o cíclico que contiene uno o múltiples dobles enlaces carbono-carbono. Alquenilo-C(1-22) se refiere a cualquier grupo alquenilo que tiene 1 a 22 átomos de carbono, e incluye alquenilo-C(2-6), vinilo, alilo, 1-butenilo, etc.
El término "aralquilo" se refiere a aril-alquilo-C(1-22), y el término "arilo" significa, en toda esta especificación, fenilo o naftilo.
HPP se refiere a hidroxifenil-propionilo,
4HPP se refiere a 3-(4-hidroxifenil)-propionilo,
2HPP se refiere a 3-(2-hidroxifenil)-propionilo,
4HPPA se refiere a ácido 4-hidroxi-fenoxiacético,
2HPPA se refiere a ácido 2-hidroxi-fenoxiacético,
4HMPA se refiere a ácido 4-(hidroximetil)-fenoxiacético,
4HPA se refiere a ácido 4-hidroxi-fenilacético,
3HPA se refiere a ácido 3-hidroxi-fenilacético,
2HPA se refiere a ácido 2-hidroxi-fenilacético,
4HBG se refiere a N-(4-hidroxibenzoil)-glicina,
3HBG se refiere a N-(3-hidroxibenzoil)-glicina,
2HBG se refiere a N-(2-hidroxibenzoil)-glicina,
4HPG se refiere a N-(4-hidroxifenil)-glicina,
Ac se refiere al radical acetilo,
Tfa se refiere al radical trifluoroacetilo,
ASAL se refiere al radical 4-azido-saliciloílo,
AB se refiere al radical 4-azido-benzoílo,
HOBt se refiere a 1-hidroxibenzotriazol,
HOAt se refiere a 1-hidroxi-7-aza-benzotriazol,
Acm se refiere al radical acetamidometilo,
Pd(PPh_{3})_{4} es tetrakis-(trifenilfosfin)-paladio(0)
Estabilidad de los compuestos de la invención
Adicionalmente, los compuestos de la presente invención se distinguen por ser estables frente a la degradación enzimática, y/o por ser estables frente a la degradación en plasma, y/o por tener una semivida in vivo mejorada.
Se prefiere que los compuestos que incluyen los compuestos antiarrítmicos de la presente invención sean estables frente a la degradación enzimática, y/o estables en plasma. Los diversos derivados y modificaciones químicas de la secuencia peptídica nativa de AAP tal como los presenta la invención, por ejemplo, la amidación o esterificación C-terminal, el uso de D-aminoácidos y derivados de aminoácidos naturales, las modificaciones N-terminales, y los análogos cíclicos, representan, en su totalidad, modificaciones diseñadas para potenciar la estabilidad, conservando a la vez las propiedades antiarrítmicas y/o antitrombóticas esenciales del AAP nativo.
La siguiente Tabla 1 muestra la semivida de degradación (T_{1/2}) de diversos compuestos de la invención, comparada con AAP10, AAP y HP5. De la tabla, parece deducirse que los compuestos 2, 3, 27, 48 y 49 de la invención, con semividas de 3 horas o más, son considerablemente más estables en plasma y suero que AAP10, que posee una semivida menor de 10 minutos, y HP5, que tiene una semivida menor de 12 minutos.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Resultados del ensayo de estabilidad in vitro en plasma y suero, T_{1/2} en min y h
2
Método de análisis de la estabilidad plasmática in vitro
La estabilidad de los péptidos se analiza en diferentes tipos de plasma y suero. Los péptidos se incuban a 37ºC en plasma y se toman muestras a aproximadamente 9 intervalos regulares entre t=0 y t=156. El análisis se efectúa por HPLC.
Se estima que las condiciones apropiadas (columna, disolvente, gradiente y temp.) para los análisis de HPLC garantizan que el pico de fármaco y los picos plasmáticos no tengan el mismo tiempo de retención. Esto se lleva a cabo por medio de inyecciones subsiguientes del fármaco, plasma y una co-inyección con el fármaco y el plasma, seguida de una optimización de los parámetros del método LC hasta obtener una separación satisfactoria. Se efectúan tres experimentos paralelos para cada tipo de plasma. Se mezclan 100 \mul de péptido con 900 \mul de plasma en t=0 y se incuban a 37ºC (concentración de la mezcla de fármaco-plasma 0,1 mg/ml). Se retiran muestras de 100 \mul de la mezcla de fármaco-plasma a intervalos adecuados y la degradación se detiene por precipitación de la muestra con 10 \mul de MeCN:TFA 50:50 en volumen. Asimismo, se toma una muestra de plasma de control sin el fármaco, tratada de la misma forma. Las muestras de plasma se centrifugan durante 15 min a 12.000 rpm (centrifugadora de Eppendorf) a temperatura ambiente. La solución sobrenadante resultante se transfiere a viales de 300 \mul de auto-muestreador HP y se analizan por HPLC. Los análisis de HPLC se llevan a cabo del modo siguiente:
Compuesto CE1
Columna: Vydac 218MS52, 250 x 2,1 mm, caudal: 0,200 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 25 min.
Vol. de Iny.: 15 \mul. Detección: DAD1 A, 214,5 nm.
Compuesto CE2
Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm, caudal: 1 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 20 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214,5 nm.
Excepto para suero de conejo: DAD1 A, 214,5 nm.
Excepto para plasma de rata: Disolvente: MeOH/MQW/TFA (0,1%). Detección: VWD1 A, 210 nm.
Compuesto CE3
Columna: Vydac 218MS52, 250 x 2,1 mm, caudal: 0,200 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 35 min.
Vol. de Iny.: 15 \mul. Detección: DAD1 A, 214,5 nm.
Compuesto 3
Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm, caudal: 1 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 25 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214,5 nm.
Compuesto 2
Columna: Luna 3u C18(2), 150 x 2 mm, caudal: 0,250 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/HFBA (0,02%). Tiempo de recorrido: 25 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214,5 nm.
Excepto para plasma humano: Columna: Luna 5u C18, 150 x 2 mm, Temp.: 10ºC.
Excepto para suero humano: Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm,
caudal: 1 ml/min. Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%).
Compuesto 27
Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm, caudal: 1 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 20 y 25 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214 nm.
Compuesto 49
Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm, caudal: 1 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 25 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214,5 nm.
Compuesto 48
Columna: Kromasil KR100-10C8, 250 x 4,6 mm, caudal: 1 ml/min. Temp.: 40ºC.
Disolvente: MeCN/MQW/TFA (0,1%). Tiempo de recorrido: 25 min.
Vol. de Iny.: 25 \mul. Detección: VWD 1 A, 214,5 nm.
Las muestras se analizan en el orden siguiente: blanco, el péptido a 0,1 mg/ml, el plasma sin el péptido, las tres muestras paralelas para t=0, las tres muestras paralelas para t=5 min, las tres muestras paralelas para t=10 min, etc. Y, por último, se repiten las tres muestras paralelas para t=0 para asegurar que no ha habido degradación u otro error durante los análisis. Las concentraciones de muestra (altura del pico en mAU) se trazan frente a tiempo y se ajustan a una función que describe una degradación mono-exponencial (Excel). Las semividas de los péptidos en los diferentes tipos de plasma se presentan en la Tabla 1 como media (n=3) \pm desviación estándar.
Antecedentes generales sobre uniones por hendidura
En un organismo multicelular, la coordinación entre células es de enorme importancia. Entre los diversos medios de interacción cruzada celular, las uniones por hendidura proporcionan la vía más directa. Las uniones por hendidura son un tipo de complejo de unión formado entre células adyacentes y consisten en canales agregados que conectan directamente los interiores (citoplasma) de las células adyacentes. En el mamífero adulto, las uniones por hendidura se encuentran en la mayor parte de tipos de células, con una excepción conocida, que son los elementos circulantes de la sangre.
La unidad estructural del canal de unión por hendidura es el conexón o hemi-canal. Cada conexón está compuesto por seis polipéptidos conexina (Cx) que se oligomerizan para formar un poro acuoso que se extiende en una única membrana plasmática. Para formar un canal de unión por hendidura completo, se alinean dos conexones de células adyacentes y se enlazan entre sí para formar un canal continuo, que une los citoplasmas de las dos células.
Las conexinas que forman el canal de unión por hendidura comprenden una familia multi-génica, habiéndose descubierto hasta la fecha catorce conexinas de mamíferos. La expresión de las conexinas es específica para tejido y célula, expresando algunas células múltiples isoformas de conexinas. La evidencia experimental indica que son posibles dos diferentes configuraciones híbridas: canales intercelulares heterotípicos, en los que cada conexón o hemi-canal consiste en una isoforma de conexina específica; o canales heterómeros, en los que cada conexón es una mezcla de las diversas isoformas de conexinas expresadas en un tipo de célula particular. Las conexinas se expresan de manera específica para célula, tejido y desarrollo.
Se conoce relativamente poco sobre la estructura génica de las conexinas. Los resultados comunicados para Cx43 de ratón han revelado que Cx43 contiene dos exones y un intrón localizados en la región 5' no traducida. Análisis adicionales han demostrado el punto de inicio de la trascripción de Cx43 tanto en embriones como en tejidos adultos. Se han identificados varios sitios de unión de factores de trascripción putativos en el promotor 5' proximal. Estudios in vitro han demostrado que se podrían producir canales permeables por hemi-canales compuestos por diferentes pares de Cx. Por ejemplo, Cx43 puede producir canales funcionales con Cx32, Cx37 y Cx endógeno de oocitos (Cx38), pero no con oocitos Cx26. Sin embargo, es muy poco lo que se conoce sobre sus propiedades, así como sobre la regulación de la permeabilidad de estos heterocanales. Cx se expresan en la inmensa mayoría de tejidos y las células únicas son capaces de expresar varias Cx diferentes. Se pueden formar uniones por hendidura permeables entre células que expresan diferentes tipos de Cx. De esta forma, la comunicación intracelular de uniones por hendidura (GJIC) en los tejidos parece ser muy importante para el mantenimiento de la integridad del tejido. Parece ser que varios genes generan los productos equivalentes para prevenir la pérdida de GJIC debida a la mutación de uno de los genes.
El diámetro de poro del canal de unión por hendidura formado se ha establecido en el intervalo de 0,8-1,4 nm. Las uniones por hendidura son relativamente no selectivas y permiten el paso de moléculas de hasta aproximadamente 1.000 daltons. Estas sustancias son, entre otras, iones, agua, azúcares, nucleótidos, aminoácidos, ácidos grasos, pequeños péptidos, fármacos y carcinógenos. El paso a través del canal no requiere ATP y parece ser el resultado de difusión pasiva. Este flujo de materiales entre las células, a través de los canales de las uniones por hendidura, se conoce como comunicación intercelular por uniones por hendidura (GJIC), que desempeña una función importante en la regulación del metabolismo y proliferación celulares, y en la señalización célula a célula. Una de las implicaciones fisiológicas más importantes de GJIC es que las células acopladas por uniones por hendidura en el interior de un tejido no son entidades discretas individuales, sino que se encuentran altamente integradas con sus vecinas. Esta propiedad facilita la homeostasia y permite, igualmente, la transferencia rápida y directa de segundos mensajeros entre las células para coordinar las respuestas celulares en el interior del tejido.
El proceso de GJIC está regulado por una diversidad de mecanismos que se pueden dividir en dos categorías principales. El primer tipo de regulación controla la cantidad de células de las uniones por hendidura, influyendo sobre la expresión, degradación, tráfico celular de conexinas a la membrana plasmática, o el ensamblaje de conexinas en uniones por hendidura funcionales. La GJIC alterada, causada por la regulación negativa de la expresión de conexinas en células tumorales es un ejemplo de este modo de regulación. El segundo tipo de regulación no implica, por lo general, ninguna alteración manifiesta de los niveles celulares de uniones por hendidura o conexinas, sino que induce la apertura, cierre o acción de barrera de las uniones por hendidura existentes. Factores solubles extracelulares tales como mitógenos (por ejemplo, DDT), hormonas (por ejemplo, catecolaminas), anestésicos (por ejemplo, halotano), biomoléculas intracelulares (por ejemplo, AMPc) y el estrés celular (por ejemplo, tensión mecánica o metabólica) pueden tener como consecuencia este tipo de regulación. Adicionalmente, GJIC se regula durante el ciclo celular y durante la migración celular.
El modo de regulación de GJIC o barrera de unión ha sido extensamente estudiado para las uniones por hendidura, en especial, uniones por hendidura compuestas por conexina 43 (Cx43) y, por lo tanto, se le ha utilizado como representativa de todas las conexinas. Algunos factores ejercen sus efectos inhibitorios sobre la GJIC de manera indirecta, alterando, por ejemplo, el ambiente lipídico y la fluidez de las membranas celulares, en tanto que otros inhibidores de la GJIC incluyen oncogenes, factores de crecimiento y promotores tumorales, que inducen diversas modificaciones sobre la Cx43. La disrupción de la permeabilidad de unión puede ser necesaria para mediar las funciones biológicas específicas de este último grupo. Estos agentes inician complejas vías de señalización, consistentes en la activación de quinasas, fosfatasas, y proteínas de interacción. La comprensión de los mecanismos de acción de estos moduladores de la GJIC no sólo definirá sus respectivas vías de señalización, responsables de la regulación de las uniones, sino que proporcionará herramientas experimentales para caracterizar las funciones biológicas de GJIC y las conexinas.
Las variaciones de la fosforilación de sitios específicos del dominio carboxi-terminal del citoplasma de Cx43 parecen ser esenciales para la abertura y cierre del canal de la unión por hendidura. La fosforilación del dominio carboxi-terminal puede ser importante también para el proceso de conducir el hemicomplejo de uniones por hendidura de Cx43 a la membrana de superficie, su internalización y degradación. Las conexinas tienen semividas (horas) mucho más breves que la mayor parte de las proteínas de membrana plasmática (días); por ejemplo, la semivida de Cx43 en el corazón de rata es menor que 1,5 horas. De este modo, la regulación de la velocidad metabólica sería un factor importante en la regulación de la GJIC.
El dominio carboxi-terminal contiene sitios de fosforilación putativos para múltiples proteín-quinasas (PKA, PKC, PKG, MAPK, CaMkII y tirosín-quinasa). La fosforilación de estos sitios del dominio carboxi-terminal tiene como consecuencia el cierre de los canales de las uniones por hendidura, y diversos inhibidores de los canales de la unión por hendidura de Cx43 utilizan diferentes vías de señalización para inducir la fosforilación del dominio carboxi-terminal. El tipo de célula y el inhibidor pparticular determinan qué vía de señalización se deben utilizar, y el tipo de proteín-quinasa implicada indica el sistema de mensajero intracelular empleado. Por lo tanto, se ha comunicado que la activación de PKA requiere la implicación del sistema de segundo mensajero AMPc, en tanto que PKC requiere la participación del sistema de señalización intracelular de fosfoinositol.
Otros mecanismos que regulan el sistema de barrera de los canales incluyen los niveles intracelulares de iones de hidrógeno y calcio, el voltaje entre uniones, y radicales libres. Un pH o pCa disminuido induce el cierre del canal de manera específica para la célula y la conexina.
Además del control del crecimiento, se han propuesto muchas funciones fisiológicas para la GJIC:
Homeostasia. La GJIC permite el rápido equilibrio de nutrientes, iones y fluidos entre células. Podría ser la función más antigua, extendida e importante para estos canales.
Acoplamiento eléctrico. Las uniones por hendidura actúan como sinapsis eléctricas en células eléctricamente excitables tales como miocitos cardiacos, células musculares lisas y neuronas. En estos tejidos, el acoplamiento eléctrico permite una transmisión célula a célula más rápida de los potenciales de acción que las sinapsis químicas. En los cardiomiocitos y en las células musculares lisas, esto permite su contracción sincrónica.
Respuesta tisular a las hormonas. La GJIC puede potenciar la capacidad de respuesta de los tejidos a estímulos externos. Mensajeros secundarios tales como nucleótidos cíclicos, calcio y fosfatos de inositol son suficientemente pequeños para pasar desde células hormonalmente activadas a células quiescentes a través de canales de unión y activar a estas últimas. Este efecto puede aumentar la respuesta de tejidos a un agonista.
Regulación del desarrollo embrionario. Las uniones por hendidura pueden actuar como vías intercelulares para señales químicas y/o eléctricas de desarrollo en embriones, y para definir los límites de los compartimientos de desarrollo. La GJIC se produce en patrones específicos en las células embrionarias, habiéndose relacionado al alteración de la GJIC con anomalías del desarrollo y los efectos teratogénicos de muchos productos químicos.
La comunicación intercelular garantiza que las actividades de las células individuales tengan lugar de manera coordinada y la integración de estas actividades en la dinámica de un tejido funcional que sirve al organismo al que pertenece. Por lo tanto, no es demasiado sorprendente que una amplia variedad de trastornos patológicos hayan sido asociados con una GJIC disminuida.
Farmacología Indicaciones cardiacas
Como se ha señalado en la descripción de los antecedentes de la invención, existe amplia evidencia que apoya un papel importante de la GJIC en los cardiomiocitos bajo condiciones normales y patológicas. Más adelante se discuten trastornos cardiacos específicos asociados con una alteración de GJIC, y se presentan pruebas in vitro e in vivo que demuestran que los compuestos que incrementan la GJIC en el corazón son de utilidad para la prevención y/o el tratamiento de una serie de trastornos patológicos del corazón.
Arritmias de reentrada
Las arritmias cardiacas están causadas por un inicio anormal del impulso o una conducción anormal del impulso. Entre las arritmias con una conducción anormal del impulso, las causadas por un mecanismo de reentrada son las más graves.
Reentrada ventricular
La reentrada es la causa principal de la fibrilación ventricular sostenida y de la muerte súbita cardiaca. La reentrada se produce cuando el impulso de propagación no termina tras la activación completa del corazón, sino que persiste para re- excitar el corazón después de finalizar el período refractario. La inducción de la reentrada se ve facilitada por una conducción lenta, un aumento de dispersión de la repolarización, anisotropía no uniforme y bloqueo unidireccional de la conducción. La enfermedad subyacente responsable de la mayoría de los casos de reentrada ventricular es la cardiopatía isquémica (por ejemplo, infarto agudo de miocardio, infarto de miocardio crónico, angina de pecho estable, y angina de pecho inestable). Durante la isquemia aguda, los canales de la unión por hendidura se cierran, dando lugar al desacoplamiento de las células vecinas. Cambios heterogéneos de la función de los canales iónicos y de la unión por hendidura conducen a un aumento de la dispersión de la duración del potencial de acción y del período refractario efectivo, en especial en la zona límite que separa la zona isquémica del miocardio normal. Desde hace tiempo se sabe que la dispersión aumentada de la duración del potencial de acción facilita la inducción de fibrilación ventricular (23). Normalmente, en células bien acopladas, la diferencia de la duración del potencial de acción se ve suavizada por el acoplamiento eléctrico. Sin embargo, el desacoplamiento impedirá dicho efecto de suavización y contribuye al desenmascaramiento de la dispersión de la duración del potencial de acción y del período refractario (24). SI la isquemia es prolongada, se puede observar un grado reducido de expresión de Cx43 y un patrón alterado de la distribución. El cierre de los canales de la unión por hendidura durante la isquemia aguda, así como las variaciones del patrón de expresión y distribución en la isquemia crónica, pueden dar lugar a una conducción lenta, aumento de la dispersión, anisotropía no uniforme y bloqueo unidireccional de la conducción, facilitando, de esta forma, la inducción de arritmias de reentrada. De este modo, estudios experimentales han puesto de manifiesto una correlación entre el sitio de expresión y distribución anormales de conexinas y la localización de los circuitos de taquicardia ventricular de reentrada (25).
Las condiciones que favorecen el desarrollo de la reentrada, es decir, conducción lenta, dispersión aumentada de la repolarización, anisotropía no uniforme y bloqueo unidireccional de la conducción, se encuentran presentes en diversas medidas en una serie de cardiopatías adicionales. Por lo tanto, en cardiomiopatías infecciosas o autónomas, la inflamación que se produce puede llevar al depósito de tejido fibroso en el miocardio, creando, de este modo, focos de conducción lenta-aumento de la dispersión y, posiblemente, bloqueo unidireccional de la conducción. La cardiomiopatía hipertrófica (por ejemplo, debida a hipertensión, estenosis aórtica, congénita) puede tener como consecuencia arritmias de reentrada debidas a un emparejamiento inadecuado de la gran cantidad de tejido miocárdico y la cantidad, relativamente reducida, de tejido conductor, que puede dar lugar a conducción lenta, dispersión aumentada y bloqueo unidireccional de la conducción. Enfermedades congénitas (por ejemplo, síndrome de QT prolongado) y fármacos que prolongan el intervalo QT (por ejemplo, fármacos antiarrítmicos, antipsicóticos, antihistamínicos, antibacterianos, etc.) también aumentan la dispersión de la duración del potencial de acción debido, posiblemente, a la heterogeneidad de la distribución de los canales iónicos a lo largo de las diferentes capas del miocardio, y constituyen una causa importante de muerte súbita inducida por reentrada en sujetos más jóvenes (26).
Reentrada auricular
La fibrilación auricular -la arritmia cardiaca más frecuente- también está causada por un mecanismo de reentrada. En este caso, múltiples ondas viajan a través de la aurícula y re-excitan el tejido que ya no es refractario. La fibrilación auricular puede persistir durante años y conducirá, finalmente, a un remodelamiento de las aurículas. Una parte importante del proceso de remodelamiento está constituida por los cambios de distribución de las uniones por hendidura. De esta forma, el patrón de distribución de Cx40 se torna crecientemente heterogéneo. La evolución en el tiempo de los cambios en la distribución y contenido de las uniones por hendidura Cx40 se correlaciona con un incremento de la estabilidad y complejidad de la FA, e indica que el remodelamiento de las uniones por hendidura Cx40 podría intervenir en la patogenia de la fibrilación auricular sostenida (27). Adicionalmente, diversas líneas de investigación confirman la opinión de que durante las condiciones de enlentecimiento de la conducción auricular, se eleva la susceptibilidad a la fibrilación auricular.
Repolarización alternante
La aparición de ondas T electrocardiográficas alternantes con una frecuencia cardiaca elevada o un insulto metabólico se ha observado durante cerca de un siglo. Las ondas T alternantes macroscópicas se registran con frecuencia como presagio de la muerte súbita por arritmia. Investigaciones recientes sugieren un mecanismo común que puede relacionar la presencia de una repolarización alternante discordante con el inicio de diversas arritmias de reentrada, dependiendo de la naturaleza anatómica del sustrato (28). Bajo estrés cronotrópico o metabólico, la fase de repolarización del potencial de acción del miocardio desarrolla una alternancia en morfología y duración. Con estrés adicional, o en presencia de barreras estructurales, la repolarización alternante se hace discordante en el espacio. La alternancia discordante da lugar a gradientes de repolarización suficientemente amplios, capaces de producir bloqueo unidireccional y reentrada. Sin una barrera estructural, la reentrada es funcional y se manifiesta como fibrilación ventricular o taquicardia ventricular polimórfica. En presencia de una barrera estructural, la reentrada se puede fijar de manera anatómica, dando como resultado taquicardia ventricular monomórfica (29).
En resumen, parece ser que una sustancia tal como los compuestos de la presente invención, que aumenta la conductancia de la unión por hendidura y torna la anisotropía más uniforme, impedirá el bloqueo unidireccional y las arritmias de reentrada. Esta sustancia será útil en pacientes con circuitos de reentrada de origen tanto ventricular como auricular. Los pacientes con onda T alternante son propensos a las arritmias de reentrada, y una sustancia capaz de aumentar el acoplamiento de las uniones por hendidura y reducir la anisotropía, puede ser útil en la prevención de arritmias ventriculares letales en estos pacientes.
Bradiarritmias
Las bradiarritmias pueden estar causadas por una conducción lenta o un bloqueo de conducción en el nódulo seno-auricular, nódulo aurículo-ventricular, haz de His y rama derecha o izquierda. La principal conexina responsable de la conductancia a lo largo del sistema de conducción es Cx40. Ratones homocigóticos para una eliminación del gen de Cx40 muestran una conducción auricular, aurículo-ventricular y de His-Purkinje significativamente más lenta y presentan un riesgo aumentado de arritmias y bloqueo de rama. (4-6). Por consiguiente, las uniones por hendidura Cx40 de funcionamiento normal son esenciales para el mantenimiento del ritmo normal.
Una sustancia tal como los compuestos de la presente invención, que aumenta la conductancia de las uniones por hendidura, resulta útil en la prevención y/o el tratamiento de la conducción lenta en el corazón.
Contractilidad reducida
La contractilidad reducida es una característica común de muchas cardiopatías crónicas. En el peor de los casos (es decir, insuficiencia cardiaca terminal), la contractilidad está reducida hasta un punto en que la fracción de eyección es tan baja que no se pueden mantener ya las necesidades basales de la perfusión del órgano. Evidencias tanto experimentales como clínicas han demostrado que la expresión y distribución de conexinas en el corazón de pacientes con insuficiencia cardiaca final están modificadas. De este modo, Cx43 sufre una significativa regulación negativa con una distribución altamente irregular en el tejido anormal. La expresión de Cx45 que, bajo condiciones normales, es muy limitada, se encuentra significativamente aumentada en la insuficiencia cardiaca; sin embargo, las propiedades de conducción de Cx45 son inferiores a las de Cx43 y son incapaces de compensar, por consiguiente, la reducción de Cx43. Pruebas recientes indican que algunos canales iónicos de regulación y receptores se encuentran concentrados en sitios de unión intercelular, por lo que es muy probable que los cambios de expresión y distribución de Cx43 puedan afectar al acoplamiento excitación-contracción y, por lo tanto, a la contractilidad (30). Una fuerte evidencia de relación entre la función de las uniones por hendidura y la contractilidad es el hecho de que ratones quiméricos, formados a partir de células madre embrionarias exentas de Cx43 y blastocitos de tipo salvaje, y que expresan, por lo tanto, una pérdida heterogénea de Cx43, desarrollan graves defectos de contracción (31).
Los presentes inventores sugieren que una sustancia capaz de aumentar la conductancia de las uniones por hendidura mejorará la comunicación intercelular de los mediadores que intervienen en el acoplamiento excitación-contracción, mejorando, de esta forma, la contractilidad.
Ejemplo experimental 1
Efecto del Compuesto 2 sobre la GJIC en cardiomiocitos
Preparación de células: Se aislaron células de corazones de cobayas por perfusión con colagenasa, de acuerdo con el método de Langendorf. En pocas palabras, se heparinizaron cobayas con una inyección intraperitoneal de heparina (1000 UI/kg). Después de 30 minutos, el animal se sacrificó por un golpe en el cuello, seguido de la sección de la columna dorsal a la altura del cuello. Se abrió el tórax y se canuló la aorta. Seguidamente, la cánula se fijó a la aorta por medio de una ligadura, se escindió y se prefundió con solución de Tyrodes durante un par de minutos. La solución de Tyrodes tuvo la siguiente composición en mM: Na^{+} 135,33, K^{+} 4, Cl^{-} 145, PO_{4}^{-} 0,33, Mg^{2+} 1, Ca^{2+} 2, Hepes 10, glucosa 10, pH 7,4. Todos los medios de perfusión se burbujearon con oxígeno al 100%. A continuación, se prefundió el corazón durante dos minutos con solución de Tyrodes exenta de Ca^{2+}, seguida de perfusión durante dos minutos con una solución con un elevado contenido en K^{+}, que contuvo en mM: Na^{+} 20, K^{+}120, Cl^{-} 22, glutamato 120, Mg^{2+} 1, Ca^{2+} 25 \muM, Hepes 10, glucosa 10, pH 7,4.
A continuación, el corazón se prefundió con una solución con un elevado contenido en K^{+} con 0,6 mg/ml de colagenasa, lo cual se realizó durante 10- 15 minutos en función del aspecto del corazón. Se seccionaron las aurículas, los ventrículos se trituraron, tras lo cual los trozos se agitaron en la solución de colagenasa, burbujeando suavemente con oxígeno al 100%. Seguidamente, las células se hicieron pasar por un tamiz para aislar las células liberadas y se separó la colagenasa por centrifugación. Las células se resuspendieron en solución de Tyrodes exenta de Ca^{2+} y se aumentó lentamente el contenido en Ca^{2+} hasta 0,65 mM. Las células se mantuvieron en esta solución a temperatura ambiente hasta su transferencia a la cámara experimental.
Electrofisiología: Se montan placas de cubreobjetos en una cámara abierta en un microscopio invertido, en donde las células se perfunden con solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (PBS) a 1 ml/min, 37ºC. La solución contiene (en mM): Na^{+} 152, K^{+} 4,2, Cl^{-} 141,5, PO_{4}^{3-} 9,5, Ca^{2+} 0,9, Mg^{2+} 0,5, pH 7,2. A partir de capilares de vidrio de 1,5 mm se cortan pipetas de pinza (GCF150F-15, Harvard Apparatus) en un dispositivo de microelectrodo Sutter Flaming-Brown P-87 y se pulen al fuego hasta una resistencia de 4-6 M\Omega. Las pipetas se llenan con una solución similar a la intracelular que contiene, en mM: K^{+} 145, Na^{+} 15, Cl^{-}5, gluconato^{-} 153, piruvato 5, EGTA 1. HEPES 5, Ca^{2+} 0,42 mM, Mg^{2+} 1,6, pH 7,2. A esta solución se agrega anfotericina B (240 \mug/ml) a partir de una solución madre de 60 mg/ml (disolvente: DMSO).
El ensamblaje de pinzas de parche consiste en dos amplificadores discontinuos sincronizados (SEC-05LX, NPI Electronics) y los datos se digitalizan usando una interface INT-10 (NPI Electronics) y una tabla de adquisición de datos PC1200 (National Instruments). Se filtran las señales tanto de corriente como de voltaje por paso bajo a 1 kHz, usando los filtros internos de los amplificadores y se digitalizan a 10 kHz.
Una célula de un par se aproxima con un electrodo, usando un micro-manipulador PatchMan 5173 (Eppendorf). Cuando se obtiene el contacto con la célula (se observa como un incremento súbito de la resistencia de entrada), se aplica succión hasta el establecimiento de la configuración de sello Giga. Se repite, entonces, este procedimiento sobre la otra célula. A continuación, la membrana bajo las pipetas se rompe por una breve aplicación de succión y se fija el interior celular a -70 mV, que es un valor próximo al potencial de membrana espontáneo de las células. Durante 10 segundos, cada una de las células se hiperpolariza de forma consecutiva con 10 mV durante 1 segundo y, entonces, el cambio de corriente resultante en la otra célula se puede utilizar para calcular la conductancia intercelular (G_{j}) usando la fórmula:
Ecuación 1G_{j} = \frac{\Delta I_{p}}{\Delta U_{j}} = \frac{I_{p.pulse} - I_{p.rest}}{U_{p} - U_{a}}
en la que I_{p.pulse} e I_{p.rest} representan la corriente en la célula pasiva durante el pulso y antes del pulso, respectivamente, y U_{p} y U_{a} representan el voltaje de la célula pasiva y activa. Este tipo de experimentos no permite la comparación de valores absolutos de G_{j} debido a las diferencias en el contacto entre las células y, por consiguiente, la cantidad de canales funcionales de uniones por hendidura. Sin embargo, la variación del valor de G_{j} frente a una intervención estandarizada, como un fármaco, se puede analizar comparando los cambios relativos de G_{j}.
Resultados: En la Figura 2 se resumen los resultados de 9 experimentos que tuvieron éxito. Esta figura muestra la G_{j} relativa como función del tiempo antes y durante la estimulación con el Compuesto 2 (10^{-8}M). En los cinco experimentos en los que las células se trataron con Compuesto 2, éste produjo un incremento significativo de G_{j}, que alcanzó un nivel de estado constante después de aproximadamente 400 segundos de estimulación (\DeltaG_{j} = +120 \pm 46%). La conductancia se mantuvo inalterada en las cuatro preparaciones tratadas con vehículo (\DeltaG_{j} = -3 \pm 5%).
Estos hallazgos concuerdan con los experimentos sobre los que se informa en la bibliografía, que usaron el análogo sintético de AAP, AAP10, y que mostraron un incremento del acoplamiento eléctrico entre los cardiomiocitos tras la estimulación (32). No obstante, en el estudio de Müller et al. (32), la conductancia de las uniones por hendidura no fue estable durante las condiciones de control. De esta forma, en tres de seis experimentos, la aplicación de AAP10 no aumentó la conductancia, pero evitó la disminución de la conductancia de las uniones por hendidura y, en dos de seis experimentos, la conductancia de las uniones por hendidura aumentó de hecho durante el período de control. En los experimentos que se presentan en este documento, el Compuesto 2 aumentó la conductancia de las uniones por hendidura en preparaciones con condiciones de control estables.
Ejemplo experimental 2
Unión de Compuesto 2 a preparaciones histológicas de corazón de ratón Preparación
Se separan corazones de ratón (Balb/cJ, 20 g), se enjuagan dos veces en sacarosa helada (0ºC) 0,32 M y se homogeneizan sobre hielo en 10 volúmenes de sacarosa con un homogeneizador Ultra Turrax (1000 rpm) durante 2 minutos. el homogeneizado se centrífuga a 1000 g_{media} durante 10 minutos a 4ºC y el sobrenadante se recoge y filtra a través de 4 capas de gasa. A continuación, el filtrado se centrífuga a 50.000 g_{media} durante 45 min a 4ºC y el granulado se resuspende en 10 vol_{\text{org. peso húmedo}} de agua destilada helada, y se incuba durante 60 min a 0ºC, y se vuelve a centrifugar a 50.000 g_{media} durante 45 min a 4ºC. El granulado resultante se resuspende en 2 vol_{\text{org. peso húmedo}} de PBS (solución Salina Tamponada con Fosfato) y se almacena a -80ºC hasta su uso.
Tratamiento previo
El día del análisis, las células se retiran del incubador y cada pocillo se lava dos veces con, dependiendo del experimento, 2 ml de D-PBS precalentado (37ºC) o helado (0ºC) para separar el suero. Es importante mantener al mínimo el período durante el cual las células permanecen sin soluciones fisiológicas, para evitar que se sequen durante los procedimientos de lavado. Las células lavadas en frío se utilizan directamente para los ensayos de fijación, en tanto que las células lavadas en caliente se usan para experimentos con privación de glucosa y oxígeno.
Privación de glucosa y oxígeno
Las células se incuban durante 10 min en una atmósfera de N_{2} en D-PBS exento de glucosa (pH 7,2), pre-equilibrado con N_{2} durante al menos 10 min a 37ºC. Las células de control se incuban de manera similar durante 10 min a 37ºC sólo, bajo condiciones atmosféricas normales y en D-PBS que contiene glucosa (6 mM).
Ensayo de fijación
La fijación in situ se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo modificado, basado en la descripción de Koenig (34). Se separa el D-PBS del cultivo celular y se agregan 0,50 ml de solución de [^{125}I]AAP10 con o sin ligando no marcado o compuesto de ensayo. Las células se incuban durante la noche a 4ºC hasta alcanzar el equilibrio. A continuación, cada pocillo, y uno en cada ocasión, se enjuaga rápidamente con 2 x 1ml de D-PBS y se dejan secar.
Se agregan 0,25 ml de Triton-X-100 al 0,5% (en volumen) a cada pocillo y se dejan solubilizar las células durante por lo menos 1 h. El extracto se trasfiere a viales de conteo, los pocillos se lavan con 0,25 ml de agua y el extracto de enjuague se agrega a los correspondientes viales. Los viales se someten a recuento en un contador gamma.
TABLA 3 Fijación in situ, CI_{50} (nM)
Compuestos de ensayo CI_{50} (nM)
AAP (CE1) 0,8
AAP10 (CE2) 130
Compuesto 2 0,5
Compuesto 32 0,5
Compuesto 24 65
Estos resultados ponen de manifiesto una fijación de alta afinidad a las células CHO de diferentes sustancias de la presente invención, comparable a la de los péptidos de la técnica anterior.
Experimentos de desplazamiento con Compuesto 2
Se incuban 40-250 \mug de filtrado o material de membrana en un volumen total de 100 \mul de D-PBS (Solución Salina Tamponada con Fosfato de Dulbecco que contiene 1 g/l de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O y CaCl_{2}) que contiene [^{125}I]AAP10 0,8 nM y una concentración creciente de los compuestos de ensayo AAP y Compuesto 2. La fijación inespecífica se determina con AAP10 10 \muM (CE2).
Cálculos
Los datos de los experimentos de desplazamiento se ajustan a la ecuación:
f = (Total - ns)/(1+s/CI_{50}) + ns
en la que Total es la radiactividad fijada total a la concentración s del ligando marcado, ns es fijación inespecífica y CI_{50} es la concentración de compuesto de ensayo que reduce la fijación específica (Total - ns) a 50% de la fijación específica máxima.
Resultados TABLA 2 Desplazamiento de [^{125}I]AAP10 0,8 nM de preparaciones de tejido cardiaco de ratón (n.e. = no ensayado)
Compuestos de ensayo Filtrado CI_{50} (nM) Membranas CI_{50} (nM)
AAP 1,2 n.e.
AAP10 (CE2) 1,2 n.e.
Compuesto 2 3,6 1,2
Los valores indicados en la anterior Tabla 2 son del mismo orden de magnitud (0,2 nM) que el indicado para AAP10 por Dhein et al. (33), utilizando membranas de corazón de conejo.
Método de fijación in situ en células intactas Cultivos de células CHO
Se siembran células CHO en placas multi-pocillos de 24 unidades en una densidad de 7.900 células /cm^{2} (\sim 15.000 células/pocillo) y se cultivan durante 3 días in vitro (DIV) sobre 1 ml/pocillo de Mezcla Nutriente F-12K suplementada con Suero de Ternero Fetal al 10% (FCS) y 1000 unidades de penicilina/1000 \mug de estreptomicina (pen./estrep) en una atmósfera de CO_{2} al 5% y humedad de 100% a 37ºC. La densidad celular había aumentado hasta ese momento a 295.000 células/cm^{2} (152 pg_{prot}/célula \sim 85 \mug_{prot}/pocillo).
Ejemplo experimental 3
Efecto del Compuesto 2 sobre la formación de AMPc en células CHO Cultivo de células CHO
Se siembran células CHO en placas de microtitulación de 96 pocillos en una densidad de 6.000 células/cm^{2} (\sim 2.000 células/pocillo) y se cultivan durante 4 días in vitro en 200 \mul/pocillo de medio de crecimiento, según se ha descrito en la sección anterior.
Tratamiento previo
El día del análisis, se retiran las células del incubador y se lavan dos veces con 200 \mul de D-PBS (pH 7,2) precalentado (37ºC) para separar el suero. Las células se incuban durante 10 min en D-PBS exento de glucosa y bajo atmósfera de N_{2}, según se ha descrito en la sección anterior.
Ensayo de eficacia de AMPc
Se incuban células CHO a 37ºC en D-PBS (pH 7,2) que contiene glucosa 6 mM, IBMX (bloqueador de fosfodiesterasa) 2,0 mM, forskoline (estimula la formación de AMPc) 10 \muM y concentraciones crecientes del péptido de ensayo. La reacción se detiene después de 20 min por medio de la adición de 20 \mul de HCl 0,5 M y se deja durante al menos 20 min a temperatura ambiente.
El contenido en AMPc se analiza mezclando 20 \mul del extracto celular ácido en pocillos FlashPlate® (kit de ensayo NEN SMP001) que contiene 180 \mul de solución trazadora de [^{125}I]AMPc. FlashPlates® se incuban durante la noche a 4ºC y la radiactividad fijada a la placa se cuenta en TopCount® (Packard Instruments). Los datos se calculan de la forma descrita en la sección anterior.
Resultados
La inhibición de la formación de AMPc estimulada por forskoline causada por los compuestos semejantes a AAP en células CHO indica que los receptores de AAP se acoplan de forma negativa al sistema de segundo mensajero de AMPc. Adicionalmente, demuestra la presencia de receptores funcionales de AAP en células CHO.
TABLA 4 Inhibición de la formación de AMPc estimulada por forskoline en células CHO
Compuestos de ensayo CE_{50} (nM)
AAP 53
AAP10 (CE2) 11
Compuesto 2 6,2
Ejemplo experimental 4
Análisis de fosfoinositol en cardiomiocitos primarias de rata Cultivo de cardiomiocitos primarios
Se utilizan ratas Wistar recién nacidas (1-2 días de edad).Se emplea solución salina equilibrada de Hank, exenta de calcio y magnesio, tamponada con HEPES 10 mM para el lavado durante los procedimientos de separación celular. Se extraen los corazones, se aíslan los ventrículos y el tejido se secciona en trozos pequeños. Las células del miocardio se aíslan por degradación enzimática gradual con colagenasa al 0,05%, como se describe en (35). Después de ciclos repetidos de centrifugación y lavado, las células precipitadas se resuspenden en medio de cultivo M199 con sal de Earle, NCS al 10%, penicilina (75 U/ml) y estreptomicina (75 U/ml) y se pre-siembran en una placa Petri durante 90 minutos. Las células no adherentes se recogen en el medio de cultivo y se siembran en multi-placas a 2,5\cdot10^{5} células/pocillo. Los cultivos se mantienen en un incubador de CO_{2} saturado con agua a 37ºC. Los cultivos de cardiomiocitos se utilizan para análisis después de 6-7 días.
Análisis del ciclo metabólico de fosfoinositol
Los cultivos de cardiomiocitos se incuban durante 48 horas en un medio de cultivo que contiene 4 \muCi/ml de mio-[2^{-3}H]-inositol para marcar los fosfolípidos de inositol. El día del análisis, se sustituye el medio por una solución tampón que contiene litio y se incuba a 37ºC, del modo descrito por Meier et al. (36). Después de al menos cinco minutos, este tampón se sustituye por el mismo volumen de tampón que contiene el compuesto de ensayo, y se incuba durante exactamente veinte minutos. La reacción se detiene por la rápida sustitución del medio por ácido perclórico (PCA) helado al 4% en volumen, e incubación durante al menos 20 minutos a 0ºC. El extracto de PCA se neutraliza y los fosfatos de [^{3}H]-inositol se separan los cromatografía de intercambio de aniones, utilizando columnas Amprep® que contienen 100 mg de amina SAX Quaternary. Los monofosfatos de [^{3}H]-inositol se eluyen y se mide la radiactividad en la fracción por conteo de escintilación líquida.
Privación de glucosa y oxígeno
Antes de agregar las sustancias de ensayo a los cultivos, las células se someten a depleción de glucosa y oxígeno mediante su incubación en una atmósfera de N_{2} en tampón de litio exento de glucosa durante 10 minutos a 37ºC. Las células de control se incuban, asimismo, bajo condiciones atmosféricas normales y en un tampón que contiene glucosa.
La noradrenalina (NA) estimula el ciclo metabólico de fosfoinositol en los cultivos de cardiomiocitos de forma dependiente de la concentración. Sin embargo, la capacidad de la noradrenalina (NA 300 nM) para estimular el ciclo metabólico de fosfoinositol resulta considerablemente reducido en los cultivos, después de 10 minutos de privación de glucosa y oxígeno, como se muestra en la Figura 3.
Bajo condiciones atmosféricas y nutricionales normales, los presentes inventores obtuvieron un valor de E_{máx} de 3852 \pm 266 cpm y un valor de CE_{50} de 203 nM (SD_{R} = 1,2), en tanto que en las células sometidas a una atmósfera de N_{2} y con depleción de glucosa, se evidenciaron un valor de E_{máx} de 2248 \pm 702 cpm y un valor de CE_{50} de 303 nM (SD_{R} = 1,7).
Para examinar el efecto de sustancias de esta invención sobre el incremento atenuado e inducido por noradrenalina del ciclo metabólico de fosfoinositol durante la tensión celular inducida por isquemia y privación de glucosa, se agregaron Compuesto 2 o AAP10 (CE2) a los cultivos de cardiomiocitos. Ambas sustancias potenciaron de manera muy fuerte el ciclo metabólico de fosfoinositol, siendo el Compuesto 2 el más potente. Como se muestra en la siguiente Tabla 5, el valor de CE_{50} para AAP10 (CE2) fue 200 veces superior durante la normoxia y 10 veces superior durante la tensión metabólica inducida por la anoxia y la privación de glucosa que el valor de CE_{50} para el Compuesto 2.
TABLA 5 Potenciación del ciclo metabólico de fosfoinositol durante la tensión metabólica inducida por anoxia y privación de glucosa, mediante Compuesto 2 y AAP10
CE_{50} (nM) CE_{50} (nM)
AAP10 (CE2) Compuesto 2
Condiciones normales 2000 10
Privación de glucosa y oxígeno 100 10
La adición de Compuesto 2 (100 nM) careció de efecto adicional sobre el incremento, inducido por noradrenalina (300 nM), del ciclo metabólico de fosfoinositol en los cardiomiocitos de ratas neonatas durante las condiciones de control, pero en células sometidas a anoxia y privación de glucosa (tensión metabólica), la adición de Compuesto 2 (100 nM) + noradrenalina (300 nM) normalizó el ciclo metabólico alterado de fosfoinositol, como se muestra en la Figura 4, con un incremento que fue mayor en aproximadamente 70% que el aumento efectuado por noradrenalina sola.
Ejemplo experimental 5
Modelo de arritmia inducida por calcio en ratones
Los efectos antiarrítmicos de los compuestos de esta invención se ensayaron en un modelo in vivo de arritmias inducidas por calcio, de acuerdo con el modelo de Lynch et al (37). Se anestesiaron ratones (25-30 g) con una combinación de neuroléptico-anestésico (Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml) + midazolam (5 mg/ml)). Las soluciones comerciales de Hypnorm® y midazolam se diluyeron 1:1 en agua destilada y se mezcla una parte de Hypnorm® diluido con una parte de midazolam diluido.
La anestesia se indujo por administración s.c. en una dosis de 0,05-0,075 \mul/10 gramos de ratón. Se insertó una cánula i.v. en la vena caudal. Se registró de forma continua la señal ECG de la derivación II situando un electrodo de ECG de acero inoxidable en la pata anterior derecha y en la pata trasera izquierda. El electrodo de tierra se colocó en la pata posterior derecha. La señal se amplificó (x 5.000-10.000) y filtró (0,1-150 Hz) a través de un módulo ECG de Hugo Sachs Electronic modelo 689. La señal analógica se digitalizó a través de una placa de adquisición de datos de 12 bits (Data Translation, modelo DT321) y se hizo un muestreo a 1000 Hz empleando el software Notocord HEM 3.1 para Windows NT. Después de un período de equilibrado de 10 min, la muestra de ensayo de fármaco se inyectó en la vena caudal. Los ratones pretratados con vehículo se ensayaron como medida del nivel de control en animales no tratados. El volumen de inyección fue de 100 \mul en todos los experimentos. La infusión de CaCl_{2} (30 mg/ml, 0,1 ml/min \approx100 mg/kg/min (cloruro de calcio-2 hidrato, Riedel-de Häen, Alemania)) se inició 3 min después de la administración i.v. de fármaco o vehículo. El espacio de tiempo hasta el 2º grado de bloqueo AV se determinó como el tiempo transcurrido desde el inicio de la infusión de CaCl_{2} hasta la aparición del primer acontecimiento arrítmico. Un acontecimiento de bloqueo AV de 2º grado se definió como el fracaso intermitente de la conducción AV, caracterizado por una onda P sin el complejo QRS concomitante.
Las respuestas se expresaron en relación con el tiempo hasta la aparición del bloqueo AV de 2º grado en ratones tratados con vehículo. El efecto máximo de cada una de las sustancias ensayadas se resume en la siguiente Tabla 6.
TABLA 6 Actividad antiarrítmica in vivo de los compuestos de la invención
\text{+++} hace referencia a un incremento >60% en el tiempo hasta la arritmia; ++ se refiere a un incremento de 30-50% del tiempo hasta la arritmia; + se refiere a un incremento de 15-29% del tiempo hasta la arritmia; (+) se refiere a un incremento \leq 15% del tiempo hasta la arritmia, y nd indica "no determinado".
3
4
5
6
Como se puede observar de los resultados que se muestran en la Tabla 6, una amplia gama de nuevos compuestos de la presente invención muestra actividad antiarrítmica comparable con la de los compuestos AAP, AAP10 y HP5 de la técnica anterior.
Ejemplo experimental 6
Efectos del Compuesto 2 sobre corazones prefundidos aislados de conejo Principio de la técnica de Langendorff
La técnica de Langendorff proporciona un método para mantener los requisitos metabólicos adecuados de un corazón aislado, permitiendo, de esta forma, la realización de experimentos in vitro sobre la totalidad del corazón durante varias horas. En el método de Langendorff, el corazón se perfunde de forma retrógrada a través de una cánula insertada en la aorta. Cuando la solución de perfusión penetra en la aorta, la presión resultante en la aorta cierra las válvulas aórticas, evitando de este modo que entre líquido en las cámaras cardiacas. En su lugar, la solución de perfusión entra en la circulación coronaria que suple al corazón. Por consiguiente, en la técnica de Langendorff, el flujo total en la aorta es igual al flujo coronario. Los experimentos de Langendorff se llevan a cabo utilizando el aparato
Tipo 833 para el TAMAÑO 5 DE CORAZÓN AISLADO, fabricado por Hugo Sachs Elektronik, Alemania. El componente central de este aparato es el bloque aórtico al que está unido el corazón por medio de una cánula. El bloque aórtico está directamente conectado a un resistor de flujo artificial, operado por un botón rotatorio que permite, por lo tanto, ajustes de la carga posterior y, por consiguiente, de la presión de perfusión. El líquido de perfusión se suministra desde un depósito provisto de termostato al bloque aórtico a través de tubos conectados a una bomba de rodillos. EL volumen suministrado por la bomba se puede ajustar para adaptarse a diferentes necesidades. El exceso de líquido fluye de vuelta desde el bloque aórtico al depósito. Debajo del bloque aórtico existe una cámara cardiaca dotada de termostato que se puede elevar para cubrir el corazón. Esta disposición permite efectuar registros continuos de flujo coronario, presión del ventrículo izquierdo (LVP), presión de perfusión, un ECG de 12 derivaciones y 8 potenciales de acción monofásicos (MAP's). El resultado de estos múltiples registros se analiza usando el software NOTOCORD HEM 3.3. Este software permite el cálculo de una amplia gama de parámetros electro-fisiológicos y hemodinámicos del corazón.
Técnica de perfusión y medios de perfusión
Los experimentos se llevan a cabo en el modo de perfusión de presión constante. El caudal de la bomba se fija para proporcionar 70 ml/min y la carga posterior se establece en 50 mm Hg, garantizando una presión de perfusión de aproximadamente 60 mm Hg. A menos que se especifique lo contrario, los corazones se perfunden con una solución de Krebs-Henseleit modificada y precalentada (38ºC) con la siguiente composición (mmol/l): NaCl: 118, KCl: 4,7, CaCl_{2},2H_{2}O: 2,52, KH_{2}PO_{4}: 1,18, Mg_{2}SO_{4},7H_{2}O: 1,64, piruvato sódico: 2,0, NaHCO_{3}: 24,88, glucosa: 5,55. La solución se filtra a través de un filtro de cuello de botella de 45 \mum antes de su uso.
Se obtiene un pH de aproximadamente 7,4 y un contenido adecuado en oxígeno de la solución por medio de burbujeo continuo con carbógeno (O_{2} al 95%/CO_{2} al 5%). Se permite que volúmenes de 2 o más litros se equilibren con carbógeno durante al menos 20 min, en tanto que volúmenes menores de 1 litro se dejan equilibrar durante 10 min.
Anestesia, cirugía y procedimientos experimentales
Se utilizan conejos Ssc:CPH machos (2,5-4,0 kg), adquiridos de Hvidesten, Aller\phid, Dinamarca. Se les seda con 1,2 ml de Hypnorm® (citrato de fentanilo 0,315 mg/ml y fluanisona 10 mg/ml), i.m. Diez min más tarde, se induce la anestesia por administración i.v. lenta de 0,55 ml de Dormicum® (midazolam 5 mg/ml). Adicionalmente, reciben 500 UI de heparina por vía i.v. para prevenir la coagulación.
Los conejos se fijan sobre el lomo, con las patas delanteras fijadas a los lados y se realiza una incisión para exponer la tráquea. Se efectúa la traqueotomía y se ventila a los conejos con oxígeno usando un ventilador para roedores de Ugo Basile (volumen de ventilación pulmonar: 18 ml, frecuencia: 60 pr. min). Se abre la cavidad abdominal desde el extremo caudal hasta el apéndice xifoides y se seccionan lateralmente los músculos abdominales en ambos lados. Para lograr el acceso a la cavidad torácica, se abre el diafragma por debajo del esternón y el corte se extiende bilateralmente a lo largo de la curvatura costal. El mediastino se secciona lo más próximo al esternón y se cortan las costillas en ambos lados, paralelamente al esternón, para permitir levantar la pared torácica en dirección del cráneo. La pared torácica levantada se fija sobre la cabeza del conejo para ofrecer una visión completa de la cavidad torácica. Se abre el saco pericárdico y se expone la aorta. Se sitúa una ligadura suelta alrededor de la aorta. Se pinza la vena cava caudal en dirección craneal hasta el hígado para reducir el flujo de retorno al corazón, y se abren la vena cava craneal y la arteria pulmonar para reducir la sobrecarga de volumen al corazón. Se abre la aorta y se inserta de inmediato la cánula, conectada al bloque aórtico por medio de un tubo de extensión relleno con líquido de perfusión, para permitir la perfusión artificial. La ligadura se aprieta y se extrae el corazón, que se transfiere al aparato de perfusión. El tiempo transcurrido desde el pinzamiento de la vena cava caudal hasta la inserción de la cánula es de aproximadamente 30 seg.
Se hace un muestreo de las MAP's a 2000 Hz y los parámetros de presión y caudal a 500 Hz. Se calcula la duración media del potencial de acción a partir de los 8 registros de MAP como la duración media desde el momento de máxima despolarización (tiempo de dV/dt Max) hasta el momento de 90% de repolarización. Esta duración se designa como APD_{90} y la dispersión de APD_{90} se mide como la desviación estándar de las 8 mediciones de APD_{90}.
Resultados
Como se ilustra en la Figura 5, se estudiaron tres grupos. Los corazones de conejo se perfundieron con tampón de Krebs-Henseleit solo (vehículo; n = 11 experimentos), 10^{-10} mol/l de Compuesto 2 (n = 10 experimentos), o 10^{-10} mol/l de AAP10 (CE2; n = 3 experimentos). El incremento de la dispersión de APD_{90} observada durante la iisquemi aguda del miocardio por hipopotasemia en los corazones de conejo tratados con vehículo se previno con 10^{-10} mol/l de Compuesto 2, pero no con 10^{-10} mol/l de AAP10 (CE2). Estos hallazgos demuestran que el Compuesto 2 previene el incremento de la dispersión eléctrica durante la isquemia, y sugieren que las propiedades antiarrítmicas del Compuesto 2 están relacionadas con este mecanismo. Se ha informado anteriormente de que AAP10 (CE2) es capaz de reducir la dispersión del intervalo de activación-recuperación epicárdica y disminuir las alteraciones de los patrones de activación epicárdica inducidas por la isquemia regional en el conejo, con un efecto máximo a una concentración de 10^{-8} mol/l (39). En los experimentos de los presentes inventores, el Compuesto 2 previno eficazmente el incremento de dispersión eléctrica inducida durante la isquemia a una concentración de 10^{-10} mol/l, en tanto que AAP10 (CE2) fue ineficaz a esta concentración. Estas diferencias no se debieron a diferencias en el tamaño del infarto de miocardio, porque la reducción del caudal coronario durante la isquemia y la zona de riesgo fueron similares en todos los grupos. Estos resultados indican que el Compuesto 2 es más potente que AAP10 (CE2).
Ejemplo experimental 7
Efecto del Compuesto 2 sobre las arritmias de reentrada ventricular en perros
La influencia de las uniones por hendidura en las arritmias se ha clarificado en estudios realizados sobre la influencia de la conexina 43 (Cx43) sobre las propiedades de conducción del ventrículo (33). En un ratón heterocigótico suprimido, deficiente en Cx43 hay dos veces la frecuencia de VT espontánea con oclusión de la arteria coronaria (CAO) (3). La isquemia regula negativamente el efecto de Cx43 después de 6 horas en el perro, mostrando una reducción de 60% de la Cx43 de extremo a extremo y una reducción de 49% de la Cx43 de lado a lado (40), probablemente secundario a la desfosforilación. En la isquemia subaguda en el perro, la reentrada epicárdica se ve facilitada en las zonas donde Cx43 está reducida (25). De este modo, los mecanismos de reentrada pueden ser críticamente dependientes de la regulación negativa, mediada por la isquemia, de Cx43 y, supuestamente, la resistencia de las uniones por hendidura que hacen que la heterogeneidad de la recuperación y las propiedades de conducción que predispongan a VT y VF.
Cuando el corazón ha sido transferido al aparato, se realiza una incisión en la aurícula izquierda para permitir la inserción de un globo lleno de líquido (tamaño 12) en el ventrículo izquierdo, para medir la presión del ventrículo izquierdo. El volumen del globo se ajusta para dar una presión diastólica final de aproximadamente 10 mm Hg. Se coloca alrededor del corazón, a la altura del surco coronario, el anillo de electrodos para las mediciones de un ECG de 12 derivaciones, quedando la punta de la aurícula izquierda entre la 5ª y 6ª derivación precordial. Los 8 electrodos de MAP se sitúan sobre el corazón, en contacto directo con el epicardio. MAP5 y MAP6 se sitúan sobre el ventrículo derecho, en tanto que los otros electrodos de MAP se distribuyen uniformemente sobre el ventrículo izquierdo. Este método es similar al utilizado por Zabel et al. (38). Cuando todos los electrodos están en su sitio, se eleva la cámara cardiaca para asegurar que el corazón esté sumergido en solución de Krebs-Henseleit a 38ºC en todo momento.
Antes de iniciar el experimento, se coloca una ligadura alrededor de la rama mayor de la arteria circunfleja, que suple a una gran parte del ventrículo izquierdo. Se hacen pasar los dos extremos de la ligadura a través de un pequeño tubo de plástico que permite la inducción de una isquemia presionando el tubo de plástico contra el corazón, y pinzar los extremos de la ligadura. Todos los corazones se dejan equilibrar durante 15 min antes de iniciar el experimento.
El programa en el tiempo de los experimentos es el siguiente:
1. 15 min de perfusión con tampón de Krebs-Henseleit normal (período de equilibrado).
2. 15 min de perfusión con compuesto agregado al tampón de Krebs-Henseleit normal (período de control normo-potasémico; y = 0-15 min).
3. 15 min de perfusión con compuesto agregado a solución de Krebs-Henseleit que contiene una concentración reducida de K^{+} (2,5 mM) (período de control hipopotasémico: t = 15-30 min).
4. Inducción de isquemia regional, seguida de 30 min de perfusión con el compuesto agregado a solución de Krebs-Henseleit que contiene una concentración reducida de K^{+} (2,5 mM) (período de isquemia hipopotasémica; t = 30-60 min).
Al final del experimento, los corazones se perfunden con tinción azul de Evans para evaluar el área de riesgo de infarto. Se seccionan las aurículas y el ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo remanente se separa en el área teñida con azul de Evans y la zona que no se tiñe, es decir, la zona de riesgo. Las dos áreas se secan con toallas de papel y se pesan, para determinar la zona porcentual de riesgo de infarto.
Registros
Se registran de manera continua los siguientes parámetros: flujo coronario, presión del ventrículo izquierdo, presión de perfusión, ECG de 12 derivaciones y 8 registros de MAP. El ECG y los...
En los estudios descritos más adelante, los presentes inventores examinaron el efecto del Compuesto 2 sobre las arritmias de reentrada durante la isquemia del miocardio inducida por CAO de la arteria descendente anterior.
Preparación de los animales
Se estudiaron tres perros anestesiados, con la cavidad torácica abierta para facilitar la colocación de electrodos para el mapeo. Se administró \alpha-cloralosa en forma de bolo (200 mg/kg) y, seguidamente, como infusión constante de 8 mg/kg/h (disuelta en polietilenglicol, PM = 200). Se canularon la vena y arteria femorales para la administración de líquido y fármacos, y para la medición de la presión aórtica ascendente, respectivamente.
Métodos electro-fisiológicos
El nódulo sinusal se pinzó y se activó la orejuela auricular con un estimulador programable con salidas de corriente constante a dos veces el umbral diastólico. La frecuencia de activación fue \geq 200 latidos/min para controlar las frecuencias cardiacas. La colocación ventricular de un polo de una aguja multipolar en la zona normal empleó un ánodo (7 cm^{2} de acero inoxidable) en el músculo abdominal. Se midió el Período Refractario Efectivo Endocárdico (ERP) por la técnica convencional de estímulos extra. El umbral diastólico ventricular tardío se midió durante cada intervención; la corriente de activación fue cuatro veces el umbral.
Registro del electrograma
Se seleccionaron sitios de ensayo a lo largo del cuerpo de 16 agujas polares (J. Kassell, Fayetteville, NC); cada polo rodea por completo el cuerpo de la aguja para prevenir que la direccionalidad de la orientación de la aguja registrase las fibras de Purkinje adyacentes. Se registraron seis electrogramas bipolares (espaciados a 1 mm) de manera secuencial a lo largo del cuerpo de la aguja, amplificando hasta 1000 veces, filtrando de 3-1300 Hz y registrando a través del osciloscopio durante la activación auricular. Se registran cuatro electrogramas intramurales en cada aguja multipolar. Los electrogramas epicárdicos se activan en último lugar en cada aguja. Se utilizó una disposición de 23 electrodos multipolares, con 17 de ellos situados en la zona de riesgo de infarto en la arteria coronaria descendente anterior, y 6 en la zona normal circundante, como lo describen detalladamente Xing y Martins (41). La distancia entre agujas medida en el epicardio varía en 6-10 mm en perros de 12-16 kg de peso.
Inducción de arritmias
El endocardio se activó en la base, tabique apical y en la pared lateral libre, inmediatamente fuera de la zona de riesgo. Después de determinar el ERP, se prolongó el intervalo S1-S2 en 4 mseg > ERP y se agregó un S3 al protocolo inicialmente, con un intervalo S2-S34 igual a 50 mseg > S1-S2. Los intervalos se redujeron hasta que fue imposible detectarlos. Si no se indujo taquicardia ventricular en ningún sitio de activación, se agregaron un tercer (S4) y cuarto (S5) estímulo extra. Los presentes inventores llevaron a cabo un protocolo completo de inducción de taquicardias ventriculares antes de la CAO para excluir taquicardias ventriculares artificiales debidas a la masa de la aguja o a isquemia debida a que las agujas comprometieran el flujo de sangre. Después de confirmar los gases en sangre fisiológicos y una anestesia adecuada, se ligó la CAO descendente anterior. Después de 60 minutos, el tamaño del infarto es de aproximadamente 75% de la zona de riesgo y resulta despreciable un aumento adicional de la zona de infarto. Se indujo, entonces, taquicardia ventricular al menos dos veces antes de las intervenciones. Se repitieron los ensayos cada 20 minutos y continuaron hasta 3 horas después de la CAO. Con cada intervención se registró el ERP del músculo cardiaco normal.
Mapeo de las arritmias
Se llevó a efecto un mapeo epicárdico usando un sistema informatizado de BARD Electrophysiology Inc. El software abarca 64 canales de datos con una resolución de 12 bits, con una frecuencia de muestreo de 1 kHz/canal. El filtrado fue de 30-300 Hz. Se desencadenan externamente ventanas de ocho segundos, incluyendo hasta 8 seg de datos antes de la señal de desencadenamiento. Este sistema se utiliza para realizar registros desde los 2-3 bipolos epicárdicos exteriores en cada electrodo de registro.
Se utilizó un sistema de software informático adaptado al cliente para resolver las señales de Purkinje desde los 3 bipolos internos en cada electrodo multipolar endocárdico mediante muestreo a 3 kHz por canal. Los filtros incorporan la frecuencia de Purkinje (3-1300 Hz). La frecuencia de muestreo fue de 235 kHz. El PC estuvo conectado en interface con un amplificador consistente en un multiplexor analógico de señales y 64 circuitos amplificadores de instrumentos. Cada uno de ellos tuvo una ganancia seleccionable (hasta 1000) y cortes de ancho de banda. La adquisición, procesamiento y visualización de los datos electro-fisiológicos se realizaron por medio del software. La adquisición de alta velocidad permitió a los presentes inventores 14 seg de datos, incluidos hasta 8 seg antes de la señal de desencadenamiento.
Análisis de mapeo
El análisis de mapeo se llevó a cabo fuera de línea. El ordenador selecciona tiempos de activación usando el primer dv/dt máximo. Los electrogramas se consideraron imposibles de interpretar sólo si no fueron reproducibles con estímulos; no hubo ninguna exclusión basada en el voltaje de los electrogramas. Se considera que están presentes los potenciales electrotónicos o de campos lejanos cuando se produce una pérdida sustancial de voltaje y dv/dt en un complejo, con intervalos de acoplamiento menores de la capacidad refractaria. Los isocronos se trazan manualmente. Los mecanismos de taquicardia ventricular se definen del modo siguiente: se produce taquicardia ventricular de reentrada cuando el electrodo que registra la actividad más temprana, que se produce tras el bloqueo unidireccional, está localizado inmediatamente adyacente al sitio de la última activación del complejo anterior y se registra actividad diastólica entre complejos. Casi siempre se registra la reentrada epicárdica en la isquemia aguda, de forma que se observa activación retrógrada (epicárdica a endocárdica) de la pared.
Protocolo experimental
Tras la instrumentación del corazón y después de una hora de CAO, se llevaron a cabo los protocolos de activación para inducir taquicardia ventricular para confirmar la capacidad de inducción reproducible (doble inducción de taquicardias ventriculares con morfologías de superficie similares), o el fracaso de inducción (activando dos veces los tres sitios sin taquicardia ventricular durante una hora). En tres perro con taquicardia ventricular re-inducible se identificó un mecanismo de reentrada. En estos tres perros, el Compuesto 2 se administró en forma de inyección i.v. de bolo, seguida de la infusión constante durante 30 min a tres niveles de dosis en dos perros, en tanto que el tercero de ellos se trató con solución salina. Se repitió, entonces, el ensayo de estímulos extra a través de la totalidad del protocolo en todos los sitios, para determinar si existía o no taquicardia ventricular. El Compuesto 2 se administró por vía i.v. a tres niveles de dosis para producir concentraciones en plasma de 10^{-10} M (bolo: 0,1 \mug/kg; infusión: 2 ng/kg/min), 10^{-9} M (bolo: 1,1 \mug/kg; infusión: 21 ng/kg/min), y 10^{-8} M (bolo: 11 \mug/kg; infusión: 210 ng/kg/min), respectivamente.
Resultados
El primer animal, del cual se adjuntan las Figuras 6-9, se estudió tras la inducción de VT monomórfica sostenida. La inducción se efectuó solamente desde el sitio de activación ventricular lateral, dos veces sucesivas que tuvieron lugar a las 2 horas y 10 minutos y que se repitieron a las 2 horas y 20 minutos después de la CAO. En la Figura 6 se presenta un mapa de activación tras la activación septal, que no provocó VT. Ésta muestra el patrón de activación ortogrado normal, con activación precoz del sitio de activación de PURK, activado a los 6 mseg tras el estímulo, y la activación tardía del sitio epicárdico activado, a más tardar, a 107 mseg. Obsérvese que el tiempo de activación adyacente a los 86 mseg, inmediatamente al este y sur de la última activación en el epicardio es E-S en la Figura 7. La activación epicárdica del primer complejo de la VT, que se inicia a -44 mseg antes del inicio del QRS superficial, y que corresponde al electrograma registrado en E-C en la Figura 7.
En la Figura 7, se muestra la taquicardia ventricular (VT) monomórfica sostenida, inducida por la estimulación en el sitio de activación ventricular epicárdica lateral que causa un circuito de reentrada. La activación tiene lugar en una reentrada de doble asa, que activa, en primer lugar, a -17 mseg y, a continuación, tiene lugar a 57 mseg en el asa noroccidental. El asa suroriental se activa, en primer lugar, a 2 mseg, 31 mseg y, entonces, a 57 mseg. El protocolo que indujo VT fue S1-S2 = 150, S1-S3 = 280, S1-S4 = 390, S1-S5 = 490 mseg. La figura ilustra electrogramas epicárdicos (E-) registrados con la derivación de superficie ECG II y VSR durante el segundo a quinto estímulo extra prematuro (se ve mejor en E-L), que asegura 4 complejos de VT. Los electrogramas se registran desde el sitio de activación de la zona límite (L), lateral, y este (E), norte (N), central (C), subepicárdica (SE), bajo E-C, así como sur (S) y noroccidental (NW) y suroccidental (SW) de E-C. E-C muestran electrogramas gradualmente disociados, mostrando el último prematuro un bloqueo del segundo componente (líneas perpendiculares). El retraso de conducción adyacente en ES permitió que la conducción prosiguiera alrededor y de vuelta al sitio central (EC), continuando la excitación de reentrada entre EC y ES (línea recta y línea con flecha).
La Figura 8 ilustra el mapa de activación durante la activación epicárdica del primer complejo de la taquicardia ventricular, que se inicia a -44 msec antes del inicio de QRS de superficie y que corresponde al electrograma registrado en E-C en la Figura 7. La activación tiene lugar en una reentrada de doble asa que activa, en primer lugar, a -17 mseg y que, a continuación sigue hasta 57 mseg en el asa noroccidental. Este mapa de activación ilustra, asimismo, la activación retrógrada de la pared ventricular durante la arritmia de reentrada.
El Compuesto 2 se administró en tres dosis i.v. crecientes, que no alteraron la tensión arterial media (MAP = 80 mm Hg). El período refractario efectivo en control fue de 150 mseg, 154 mseg después de la dosis más baja y fue de 148 mseg con la dosis última y más elevada. La VT que se pudo inducir fue la típica taquicardia de reentrada epicárdica que se muestra en las Figura 7 y 8. Después de la primera dosis de Compuesto 2 (bolo: 0,1 \mug/kg; infusión: 2 ng/kg/min), ya no fue posible inducir una VT, a pesar del hecho de que se reprodujeron los protocolos de inducción que indujeron VT antes de la administración del Compuesto 2; el protocolo que indujo VT antes de la administración del fármaco fue S1-S2 = 150, S1-S3 = 280, S1-S4 = 390; S1-S5 = 490 mseg, y durante la infusión del Compuesto 2 los intervalos fueron 150, 270, 370 y 470 mseg, respectivamente. No se indujo VT hasta una hora y media después de haber iniciado la infusión de la dosis mínima de Compuesto 2. En la Fig. 9 se muestran los registros electrocardiográficos tras la administración i.v. de la dosis más baja de Compuesto 2. Estos resultados demuestran que el Compuesto 2 bloqueó eficazmente la VT de reentrada en este perro.
Se estudió un segundo perro con VT inducible, esta vez desde dos sitios de activación de las zonas límites, localizados lateralmente y en el tabique. Tampoco en esta ocasión produjo el Compuesto 2 alteración alguna de la MAP, que se inició en 90 mm Hg y finalizó en 90 mm Hg. El período refractario efectivo en los dos sitios de inducción se mantuvo en 163 y 144 mseg, respectivamente, a lo largo de todo el período de ensayo del Compuesto 2, que se inició 85 minutos después de la CAO y continuó durante 2 horas adicionales. Después de la dosis mínima de Compuesto 2, la VT inducida desde la pared lateral ya no fue inducible; el mecanismo de esta VT fue la reentrada epicárdica, muy similar a la que se muestra en las Figuras 7-9. La VT inducida desde el sitio septal también fue de reentrada epicárdica antes de la administración del Compuesto 2, pero, tras la administración del Compuesto 2, se bloqueó por completo la reentrada epicárdica. De esta forma, en estos dos experimentos, fue posible inducir VT de reentrada epicárdica antes de la administración de la dosis más baja de Compuesto 2 y, tras la administración de la sustancia, no fue posible re-inducir ninguna reentrada con ninguna dosis.
Por último, un animal adicional se sometió a ensayos electro-fisiológicos durante el período de tiempo usado en los dos experimentos anteriormente descritos, sin introducción de Compuesto 2, sino usando solución salina. Se indujo reentrada epicárdica una hora después de la CAO y se indujo la misma morfología de VT y mecanismo de reentrada 1,5-2,5 horas de la CAO. De esta forma, la reproducibilidad de la VT de reentrada en este experimento controlado con el tiempo es consistente con la noción de que el Compuesto 2 es un eficaz compuesto antiarrítmico bajo las condiciones de arritmias de reentrada.
Estos experimentos demuestran que el Compuesto 2 es eficaz en la prevención y/o el tratamiento de las arritmias de reentrada mortales. Por consiguiente, es propósito de la presente invención ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento de arritmias de reentrada cardiacas de origen supraventricular o ventricular. Este objetivo de cumple con los presentes compuestos peptídicos tales como los compuestos de las fórmulas I, XII, XIII, XIIIa, XIV, XV y XVI y de las fórmulas 2-12 de la presente invención, más específicamente los compuestos de los Ejemplos de Síntesis 1-47 de este documento.
Ejemplo experimental 8
Efecto de los abridores de las uniones por hendidura sobre las células del tejido óseo Antecedentes
Los osteoblastos, que son células formadoras de tejido óseo, y los osteocitos están bien conectados. Se han encontrado conexiones osteoblasto-osteoblasto, osteoblasto-osteocito y osteocito-osteocito en preparaciones óseas examinadas a microscopia electrónica (42). La conexina más interesante en relación con el tejido óseo es Cx43, como sucede en el corazón. En las células óseas, la expresión de estas proteínas está asociada a la expresión de algunas proteínas específicas de los osteoblastos. Las hormonas calciotrópicas pueden regular también la expresión de las proteínas de las uniones por hendidura.
Se ha demostrado que los osteoblastos humanos (HOB) y las células estromáticas derivadas de la médula ósea (BMSC) expresan Cx43 y Cx45. Como se demuestra con la técnica de transferencia de tinción de Amarillo Lucifer (LY), se encuentran funcionalmente acopladas (43). Las líneas celulares de osteoblastos de rata difieren de los cultivos primarios humanos; las células ROS 17/2,8 expresan sólo Cx43 y están bien acopladas, en tanto que UMR 106-01 expresan, de forma predominante, Cx45 y están escasamente acopladas a la tinción (44). Las dos líneas celulares osteoblásticas de rata están eléctricamente acopladas. La transfección de Cx43 en las células UMR da como consecuencia células altamente acopladas a la tinción. De este modo, Cx43 permite la transferencia de LY y otras moléculas mayores, mientras que Cx45 no permite este paso. Por el contrario, la introducción de Cx45 q células que expresan Cx43 reduce el acoplamiento a la tinción. En la diferenciación de osteoblastos, se modifica la expresión de Cx43; de esta manera, cuanto más maduros son los osteoblastos, mayor es la expresión de Cx43 (45).
Se ha investigado el efecto de diferentes estímulos sobre las células óseas y la relación con variaciones de la comunicación de las uniones por hendidura. Es bien sabido que una moderada tensión mecánica sobre el hueso aumenta la densidad ósea. Para limitar esta situación, se expusieron células ROS 17/2,8 a tensión cíclica, que dio como resultado un incremento del acoplamiento a la tinción de las células. La tensión cíclica aplicada a las células UMR 106-01 escasamente acopladas tuvo como consecuencia también un incremento del acoplamiento a la tinción, pero menos intenso en comparación con las células ROS. No se encontró un aumento de ARNm para Cx43, sino que se observaron más formas fosforiladas de Cx43, lo cual indica que la tensión cíclica sobre los osteoblastos aumenta la comunicación mediante las uniones por hendidura entre las células al modular la localización intracelular de la proteína de la unión por hendidura Cx43. El mismo grupo ha demostrado que la transfección de Cx43 a las células UMR 106-01 escasamente acopladas no sólo incrementa el acoplamiento a la tinción (46), sino que aumenta también la expresión de los productos de los osteoblastos maduros, osteocalcina y sialoproteína ósea (BSP). La disminución del acoplamiento entre células osteoblásticas (ROS) por medio de la transfección de Cx45 en las células reduce la expresión de osteocalcina y BSP, genes que son fundamentales para la formación y calcificación de la matriz ósea. Un estudio reciente ha puesto de manifiesto que ratones exentos de Cx43 exhiben una formación de tejido óseo y un desarrollo deficientes en comparación con ratones de tipo salvaje (47). De este modo, se requiere una red de comunicación intercelular para la completa elaboración de un fenotipo osteoblástico diferenciado, así como para la formación y el ciclo metabólico del tejido óseo. Por lo tanto, una comunicación de uniones por hendidura deficiente puede tener como consecuencia un aumento de la pérdida de hueso.
Igualmente, se ha demostrado que las uniones por hendidura son parcialmente responsables de la propagación de señales de calcio intercelular en las células óseas. La estimulación mecánica de un osteoblasto humano es una monocapa celular, in vitro, induce un pulso de calcio que se propaga hacia una serie de células adyacentes. La propagación de esta señal implica el paso de una molécula mensajera a través de las uniones por hendidura, con la activación subsiguiente de las células adyacentes (48,49). Probablemente, estas señales se propagan a través de la red celular del tejido óseo in vivo, en respuesta a estímulos mecánicos, y podrían ser responsables del incremento de formación de tejido óseo en respuesta a la carga mecánica sobre el hueso.
La comunicación de las uniones por hendidura y el efecto de las hormonas calciotrópicas están unidos. Se ha demostrado que la estimulación con 1,25-(OH)_{2}-vit-D_{3} de los fibroblastos de la piel humana potencia la comunicación a través de las uniones por hendidura, así como que aumentan los niveles de proteína Cx43 y ARNm (50), pero sólo en presencia de receptores funcionales de la vitamina D (VDR). Se ha demostrado que la pérdida de expresión de Cx43 disminuye la capacidad de respuesta de las células a la PTH, sin que se produzcan variaciones del número de receptores de PTH ni de la respuesta de AMPc (51). Por el contrario, PTH y PGE2 potencian la comunicación entre uniones por hendidura en cultivos de células osteoblásticas a través de dos mecanismos: una rápida redistribución inicial de Cx43 a la membrana celular, y una estimulación posterior de la expresión del gen Cx43 (52). De esta manera, la modulación de la comunicación intercelular representa un mecanismo por el cual los factores osteotrópicos regulan la actividad de las células formadoras de tejido óseo.
Es muy posible que la comunicación intercelular de uniones por hendidura demuestre ser uno de los mecanismos más importantes mediante el que las células óseas coordinan sus actividades y respuestas a estímulos mecánicos y hormonales. De esta forma, si fuera posible aumentar por medios farmacológicos la comunicación por uniones por hendidura entre las células óseas, se podría aumentar la actividad de los osteoblastos, potenciando la formación de tejido óseo in vivo.
Los miocitos cardiacos también están conectados por uniones por hendidura y, al igual que en los osteoblastos, la conexina predominante es Cx43. Se ha observado que determinados compuestos aumentan la comunicación entre uniones por hendidura entre los miocitos cardiacos, de los cuales el AAP10 (CE2), de síntesis artificial, es el mejor investigado. Los miocitos cardiacos responden a la isquemia con un descenso del acoplamiento celular. En experimentos in vitro, la adición de AAP10 (CE2) a miocitos cardiacos expuestos a isquemia restableció parte del acoplamiento celular perdido. Si los miocitos cardiacos son capaces de responder a este grupo de compuestos con un aumento de acoplamiento de uniones por hendidura, los osteoblastos podrían hacer lo mismo. En este caso, resulta evidente que el aumento de acoplamiento celular podría acompañarse perfectamente de un incremento de la maduración y actividad de los osteoblastos, y del subsiguiente aumento de la formación de tejido óseo. Para investigar esta hipótesis, los presentes inventores han examinado el efecto del Compuesto 2 sobre la GJIC en osteoblastos humanos y células de osteosarcoma de rata. Adicionalmente, los inventores han estudiado el efecto del Compuesto 2 sobre una marca (es decir, fosfatasa alcalina) para la actividad de los osteoblastos humanos y la formación de tejido óseo.
Métodos Cultivo celular
Osteoblastos humanos (hOB): se aislaron células de la médula ósea humana obtenida por punción de la cresta iliaca posterior de voluntarios sanos (edades 20-36 años: se recogieron 10-15 ml de material medular en 15 ml de PBS+Ca,Mg (Life Technologies, nº de Cat. 14040) con 100 U/ml de heparina (Sigma, nº de Cat. H-3149). La fracción mononuclear de la médula se aisló en un graddiente de Lymphoprep (Nycomed Pharma, nº de Cat. 1001967), por centrifugación a 2200 rpm durante 30 min. Después de la cosecha, la fracción mononuclear se lavó una vez con medio de cultivo y se centrifugó a 1800 rpm durante 10 min. A continuación, las células se contaron y sembraron en placa con medio de cultivo a 8 x 10^{6} células/placa de 100 mm. Medio hOB (todos los reactivos proceden de Life Technologies): MEM son Rojo Fenol con Glutamax (nº de Cat. 041-93013), suplementado con suero de ternero fetal, inactivado por calor, al 10% (nº de Cat. 10106) y Penicilina/Estreptomicina al 0,1% (nº de Cat. 15140). El medio se cambió al día siguiente y las células se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 5%, con cambio de medio cada 7 días. Después de 3-4 semanas de cultivo, las células habían alcanzado una confluencia de 70%. El medio se suplementó, entonces, con dexametasona 100 nM (Sigma, nº de Cat. D-4902) durante 7 días. A continuación, las células se sembraron en placas para experimentos con imágenes de vídeo: se colocó un cubreobjetos de vidrio de 25 mm nº 1 en una placa de 35 mm (o cada pocillo de una placa múltiple de 6 pocillos), las células se sembraron en placas a 2,5 x 10^{5} células/cubreobjetos y se cultivaron durante 2-3 días antes de su uso.
Células ROS 17/2,8: las células se cultivaron en placas de 100 mm a 37ºC con CO_{2} al 5% y cambio de medio cada 2-3 días. Medio ROS (todos los reactivos proceden de Life Technologies): MEM (nº de Cat. 31095) suplementado con suero de ternero fetal, inactivado por calor, al 10% (nº de Cat. 16170), NEAA al 1% (nº de Cat. 11140), Piruvato Sódico al 1% (nº de Cat. 11360), L-Glutamina al 1% (nº de Cat. 25030) y Penicilina/Estreptomicina al 0,1% (nº de Cat. 15140). Para los experimentos de imágenes de vídeo, las células se sembraron en cubreobjetos a 2-3 x 10^{5} células/cubreobjetos y se cultivaron durante 2-3 días antes de su uso.
Medición de ondas de calcio
Las células cultivadas sobre cubreobjetos se cargaron con fura-2-AM 5 \muM (Molecular Probes, nº de Cat. F-1221), durante 30 minutos a 37ºC, y se incubaron en medio fresco durante 20 minutos. Seguidamente, los cubreobjetos se fijaron a una cámara de cultivo PDMI-2 (Medical Systems Corp.), se mantuvieron a 37ºC con perfusión de CO_{2}, sobre un microscopio Zeiss Axiovert. Se indujeron ondas de calcio intercelular por estimulación mecánica de una sola célula, utilizando una micro-pipeta de vidrio de borosilicato unida a un micro-manipulador Eppendorf 5171. Las imágenes se obtuvieron usando un sistema de obtención de imágenes MetaMorph (Universal Imaging). La luz de excitación (340 y 380 nm) se proporcionó por medio de un Monochromator (T.I.L.L. Photonics GmbH). Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD intensificada (Dage MTI) y se digitalizaron con una placa de procesamiento de imágenes Matrox MVP.
Microinyección
Las células cultivadas en cubreobjetos se colocaron en el microscopio de la forma anteriormente descrita. Se efectuaron microinyecciones usando el micro-manipulador Eppendorf 5171 y el sistema Eppendorf Transjector 5346. Se cargó una micro-pipeta con solución de Amarillo Lucifer (LY) 10 mM (Sigma, nº de Cat. L-0259). Se inyectó cuidadosamente una célula de la monocapa con LY durante 30 segundos, se extrajo la micro-pipeta de la célula y, después de 30 segundos, se contó el número de células que mostraban transferencia de tinción. La luz de excitación para LY fue 430 nm y las imágenes se adquirieron de la forma anteriormente descrita.
Ensayo de fosfatasa alcalina
Día 1: las células se sembraron en placas de 96 pocillos en una concentración de 8000 células/pocillo (hOB) o 3000 células/pocillo (ROS) en 200 \mul de medio de cultivo normal.
Día 2: se cambió el medio en las células.
Día 4: (Día 3 para ROS): las células se lavaron con 200 \mul de MEM, BSA al 0,1% (Sigma, nº de Cat. A-9418), Se agregaron a las células 200 \mul de MEM, BSA al 0,1% que contuvo diversas concentraciones de Compuesto 2, y el cultivo se continuó durante 4 días (2 días para las células ROS).
Día 8: (Día 5 para ROS): el ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) es un método colorimétrico para medir la actividad enzimática, y se llevó a cabo usando el kit de Fosfatasa Alcalina (Sigma, nº de Cat. 104-LL): las células se lavaron una vez con 200 \mul de PBS+Ca,Mg. Se agregaron 100 \mul de Solución Tampón Alcalina a cada pocillo y la placa se colocó a 37ºC durante 10 min. Se agregaron 100 \mul de Solución de Sustrato a cada pocillo y la placa se incubó a 37ºC durante 30 min. Se agregaron 100 \mul de NaOH 2,0 N a cada pocillo para detener la reacción. Se midió la absorbancia usando un lector de placa a 405 nm.
Efectos del Compuesto 2 sobre la GJIC
Para evaluar la capacidad de los modificadores de las uniones por hendidura para aumentar la comunicación a través de señales de calcio intercelulares, mediadas por las uniones por hendidura, se cargaron monocapas de osteoblastos humanos sobre cubreobjetos de vidrio con fura-2. Durante la obtención de imágenes en tiempo real, se llevó a efecto una estimulación mecánica con una micro-pipeta de vidrio. Se produjo un incremento del calcio intracelular, con la subsiguiente difusión de la señal a las células circundantes. El número medio de células en la onda fue de 6,5 células. A continuación, se agregó Adenosín-tri-fosfato (ATP) 100 \muM para desensibilizar los receptores purinérgicos. Tras la desensibilización, la propagación de la onda de calcio depende exclusivamente de la GJIC. Con la estimulación de ATP, se observó un incremento de calcio intracelular en la mayoría de las células en el campo de visión. Una vez más, se estimuló mecánicamente una única célula. Ahora, la propagación de la onda se limitó a una media de 4,5 células en la onda. Se agregó Compuesto 2 en una concentración de 10^{-8} mol/l a la solución del baño. Se observó un incremento de las concentraciones de calcio intracelular en la mayoría de las células en el campo de visión. Después de 10 minutos de incubación con el Compuesto 2, se volvió a estimular mecánicamente una sola célula. Nuevamente, la concentración intracelular de calcio aumentó en la célula estimulada, con una subsiguiente propagación de la onda. En este caso, la onda se extendió a una media de 6,2 células (Figura 10), con un aumento significativo en comparación con la alcanzada antes de la adición de Compuesto 2.
Con el fin de ensayar la capacidad del compuesto para restaurar el acoplamiento suprimido de uniones por hendidura, se realizaron experimentos similares con la línea celular de osteoblastos ROS 17/2,8 (ROS), pero tras la incubación de las células durante 48 horas bajo condiciones de hipoxia, con sólo 3-6% de O_{2}, es decir, condiciones conocidas por reducir el acoplamiento celular. Células ROS en monocapas se cargaron con fura-2 y, bajo las mismas condiciones anteriores, se practicó una estimulación mecánica. Dado que las células ROS no expresan receptores purinérgicos, no se realizó el tratamiento previo con ATP. Tras la estimulación, la concentración intracelular de calcio aumentó en la célula estimulada y se inició una onda, que difundió a un promedio total de 2,2 células (n = 18). A continuación, se agregó Compuesto 2 a la solución de baño, en una concentración final de 10^{-8}M. Después de 10 minutos, se repitió la estimulación mecánica. Ahora, la onda se propagó a una media de 5,4 células (n = 18) (Figura 11), lo que representa un incremento significativo en comparación con el obtenido antes de agregar el compuesto. Por consiguiente, el Compuesto 2 aumenta de manera eficaz las ondas de calcio intercelular mediadas por las uniones por hendidura.
Para evaluar el efecto del compuesto sobre el acoplamiento celular directo, se llevaron a cabo experimentos de microinyección de acuerdo con el método anteriormente descrito. Se inyectó la tinción Amarillo Lucifer (LY) en un único osteoblasto humano en una monocapa. Después de 30 segundos, se evaluó el número de células que contienen la tinción. Bajo condiciones fisiológicas, la tinción difundió a una media de 14 células (n = 19). Para suprimir el acoplamiento celular, se incubaron las células ahora bajo condiciones de hipoxia (3-6% de O_{2}) durante 48 horas. A continuación, se reevaluó el acoplamiento celular por microinyecciones de LY y, en este caso, la tinción pasó únicamente a una media de 7 células (n = 10). Se agregó Compuesto 2 al medio y, después de 10 minutos, se volvió a evaluar el acoplamiento de tinción. Ya después de 10 minutos de incubación con Compuesto 2, el acoplamiento celular aumentó, con transferencia de tinción a 9 células (n = 11).
Se llevaron a cabo experimentos similares con células ROS. El acoplamiento básico bajo condiciones fisiológicas en células ROS fue de 12 células (n = 19). Después de 48 horas de incubación en 3-6% de O_{2}, se observó una reducción de la transferencia de tinción a 9 células (n = 27). Una vez más, se agregó Compuesto 2 a la solución de baño, y el acoplamiento celular se restauró a los niveles previos a la hipoxia, con una transferencia media de tinción a 12 células (n = 27) (Figura 12). Por lo tanto, el Compuesto 2 es capaz de aumentar la comunicación entre las uniones por hendidura y restaurar las reducciones inducidas por hipoxia del acoplamiento celular.
Se sabe también que la tensión metabólica inducida por la hipoglucemia disminuye la comunicación entre uniones por hendidura. Por consiguiente, los presentes inventores decidieron evaluar si el Compuesto 2 podía invertir la reducción del acoplamiento celular inducido por la hipoglucemia. Se cultivaron osteoblastos humanos en monocapas sobre cubreobjetos de vidrio y se cargaron con fura-2. Después de la desensibilización como la anteriormente descrita, se estimuló mecánicamente una sola célula, y se registró el número de células en la onda. En este grupo de experimentos, la onda se extendió a una media de 3,2 células (n = 19). Se cambió el medio a medio sin glucosa y, después de 8 minutos, se realizó otra estimulación mecánica. Ahora, la onda estuvo prácticamente bloqueada, con una propagación de onda de sólo 1,4 células (n = 20). Se agregó Compuesto 2 al medio en una concentración final de 10^{-8} M. Se efectuó una estimulación final y se restauró casi por completo la onda, con una extensión media de 2,9 células (n = 18) (Figura 13). Por lo tanto, el Compuesto 2 es capaz de restaurar el desacoplamiento celular inducido por hipoglucemia.
Por último, para evaluar el efecto del Compuesto 2 sobre la formación de tejido óseo y la actividad de los osteoblastos, los presentes inventores midieron el efecto del compuesto sobre la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de las células. Se estimularon osteoblastos humanos con diferentes concentraciones de Compuesto 2, desde 1 x 10^{-13} hasta 1 x 10^{-6}, y se compararon con controles no tratados. Bajo condiciones normales de cultivo, el Compuesto 2 aumentó la actividad de ALP con la mayoría de las concentraciones ensayadas, excepto con la máxima (10^{-6} mol/l), que puede ser tóxica (Figura 14).
Adicionalmente, se ensayó también el efecto del compuesto sobre la actividad de ALP bajo condiciones de hipoxia. Se cultivaron osteoblastos humanos durante cuatro días en 5% de O_{2}. El medio se enriqueció con diferentes concentraciones de Compuesto 2, y se compararon con las respuestas durante las condiciones normales. Durante la hipoxia, la estimulación de la actividad de ALP inducida por el Compuesto 2 fue alrededor de 15% mayor que durante la normoxia en todas las concentraciones comprendidas en el intervalo de 10^{-11} a 10^{-8} mol/l (Figura 15).
En resumen, estos resultados demuestran que el Compuesto 2 es capaz de normalizar la GJIC atenuada entre osteoblastos humanos durante la hipoxia. Adicionalmente, el Compuesto 2 estimula la producción de fosfatasa alcalina, lo que sugiere que el Compuesto 2 es capaz de estimular la actividad de los osteoblastos y, por lo tanto, la formación de tejido óseo. De esta forma, el Compuesto 2 puede ser útil en el tratamiento de enfermedades óseas con formación alterada de hueso con respecto a la resorción ósea. El efecto del Compuesto 2 sobre el acoplamiento entre células durante la hipoxia indica que las sustancias de la presente invención pueden ser de utilidad en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades óseas asociadas con mala vascularización, hipoxia e isquemia del tejido óseo.
A partir de estos experimentos, se puede concluir que las sustancias de la presente invención, que aumentan la GJIC, pueden ser útiles para la preparación de medicamentos para la prevención y/o el tratamiento de la osteoporosis. En algunos casos, la osteoporosis es una manifestación de otras enfermedades tales como el síndrome de Cushing o la osteogénesis imperfecta. En la mayoría de los casos de osteoporosis, sin embargo, no resulta evidente otra enfermedad. Una forma se manifiesta en niños o adultos jóvenes de ambos sexos y con función gonadal normal, que a menudo se designa como osteoporosis idiopática, aun cuando la mayor parte de las formas restantes también son de patogenia desconocida. La osteoporosis de tipo I se produce en un subconjunto de mujeres postmenopáusicas con edades comprendidas entre 51 y 75 años, y se caracteriza por una pérdida acelerada y desproporcionada de hueso trabecular. Complicaciones frecuentes son las fracturas de cuerpos vertebrales y del antebrazo distal. Un descenso de la función del paratiroides puede compensar el aumento de resorción ósea. La osteoporosis de tipo II se manifiesta en mujeres y hombres mayores de 70 años de edad y se asocia con fracturas del cuello femoral, del húmero proximal, la tibia proximal y la pelvis, es decir, sitios que contienen tejido óseo tanto cortical como trabecular. Además de la osteoporosis, las sustancias que aumentan la GJIC pueden incrementar también la formación de tejido óseo en enfermedades metabólicas óseas tales como raquitismo y osteomalacia, y en la osteoporosis debida a la administración crónica de glucocorticoides o insuficiencia renal crónica. Por lo tanto, un propósito de la presente invención es ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento de la osteoporosis. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre el cartílago
El cartílago articular es un tejido diseñado para resistir la compresión durante el movimiento de las articulaciones e, in vivo, está sometido a una amplia gama de fuerzas de carga mecánicas. Se ha demostrado que la sensibilidad mecánica influye sobre el metabolismo condrocitario y la homeostasia del cartílago. En muchos tipos de células, la estimulación mecánica induce incrementos de la concentración citosólica de Ca^{2+}, que se propaga de una célula a otra en forma de onda intercelular de Ca^{2+}. La comunicación entre células a través de uniones por hendidura subyace en la coordinación tisular del metabolismo y sensibilidad a estímulos extracelulares. La permeabilidad de las uniones por hendidura a segundos mensajeros intracelulares permite que las vías de transducción sean compartidas entre varias células, dando como resultado último respuestas tisulares coordinadas. Se ha investigado la señalización de Ca^{2+} inducida mecánicamente en los condorcitos, y se ha demostrado que la comunicación entre uniones por hendidura resulta esencial para la señalización de Ca^{2+} inducida mecánicamente en los condorcitos (53). Adicionalmente, la estimulación mecánica activa la fosfolipasa C, conduciendo, de esta forma, a un incremento de 1,4,5-trifosfato de inositol intracelular. El segundo mensajero, a través de las uniones por hendidura, estimula la liberación de Ca^{2+} intracelular en células vecinas y se considera que este sistema es muy importante para la señalización coordinada en condorcitos durante la tensión mecánica, pudiendo proporcionar un mecanismo para la actividad metabólica coordinada durante la tensión metabólica en los condorcitos (53,54). La conexina predominante en el cartílago es Cx43 que, además de su función en la regulación entre células del metabolismo y la señalización, resulta esencial para la condrogénesis normal (47,55).
De este modo, parece ser que las sustancias de esta invención, que incrementan la CJIC, se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento de artropatías que implican un acoplamiento alterado entre células.
Como han demostrado los presentes inventores en osteoblastos humanos, estos inventores sugieren también que las sustancias que aumentan la GJIC se pueden utilizar para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades articulares que implican tensión metabólica. Éstas incluirían cualquier forma de artritis asociada con una vascularización o cicatrización reducida del tejido condral fracturado. Por consiguiente, es un propósito de la presente invención proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades articulares, incluida la artritis. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre el cáncer
La permeabilidad de las uniones por hendidura y la regulación de la GJIC ocurren a distintos niveles en la célula. La reducción o ausencia de GJIC puede ser consecuencia de variaciones en la expresión de Cx durante la trascripción y traducción, alteración del procesamiento post-traducción y alteración del ensamblaje e inserción de conexones en la membrana plasmática. Una característica inusual de Cx es su breve semivida en comparación con otras proteínas de membrana. El rápido ciclo metabólico de las conexinas ha demostrado encontrarse entre 1,5 y 2 h. Se ha demostrado que la degradación de Cx depende de la fosforilación, que conduce a la desestabilización de algunos subtipos de conexinas. La rápida velocidad del ciclo metabólico proporciona un mecanismo adicional mediante el cual se puede regular la GJIC mediante sustancias que afectan a la semivida del ARNm de Cx, traducción, transporte intracelular y ensamblaje de Cx en las uniones por hendidura.
Otra forma adicional de regular la permeabilidad de las uniones por hendidura es el cierre completo o parcial de los canales de las uniones por hendidura bajo determinadas circunstancias, mediante la torsión mecánica de las seis subunidades o conexón. Se sabe que los promotores tumorales, que reducen la GJIC, provocan la formación de barreras en las uniones por hendidura. Los promotores tumorales son agentes que potencian o aceleran la carcinogénesis cuando se administran de manera repetida tras el inicio del tumor. Los mecanismos por los que los promotores tumorales modulan la GJIC no están totalmente comprendidos, pero existen pruebas que confirman que los promotores tumorales pueden afectar a la GJIC alterando la fosforilación de Cx y/o inhibiendo la expresión y ensamblaje de Cx. Resultados recientes han demostrado que la transferencia de genes in vivo, mediada por retrovirus, de conexina 43 en procesos malignos con baja capacidad de GJIC reducen significativamente la capacidad de formación de tumores (56). Como confirmación adicional de un papel esencial de la GJIC normal en la prevención del cáncer, se ha demostrado que ratones deficitarios en Cx32 exhiben una incidencia muy elevada de tumores hepáticos espontáneos, así como una susceptibilidad aumentada a desarrollar tumores hepáticos inducidos químicamente (57). Adicionalmente, la acción promotora de tumores de fenobarbital requiere Cx32 funcional para la progresión tumoral (58). Esto indica que el desacoplamiento de la GJIC es importante para las acciones oncogénicas de fenobarbital (58).
La carcinogénesis se caracteriza por la progresiva alteración de los mecanismos de control del crecimiento en los que intervienen factores de crecimiento, oncogenes y genes supresores de tumores. Puesto que la alteración de la GJIC podría dar como resultado la alteración del control de crecimiento, el efecto de los factores de crecimiento y los oncogenes sobre la GJIC podría ser crucial para la génesis de tumores. Se ha demostrado de varios oncogenes median en la regulación negativa de la GJIC (59). Se demuestra que pp60^{v-ser} media el cierre de la unión por hendidura Cx43 por medio de un mecanismo de bola y cadena, que implica la fosforilación del residuo serina C-terminal por medio de la MAP-quinasa (59). Es interesante destacar que, en algunos casos, las células transfectadas con oncogenes podrían comunicarse entre sí, pero que carecen de la comunicación heteróloga con las células normales adyacentes.
La permeabilidad de las uniones por hendidura en células tumorales, empleando el ensayo de transferencia de tinción, fue menor que la GJIC en el tejido hepático circundante. De manera interesante, muchos tumores están encapsulados en una estructura semejante a una matriz extracelular, y se encuentran físicamente separados del tejido normal.
La transformación neoplásica en los tejidos humanos normales se produce como consecuencia de una acumulación de alteraciones genéticas. Sin embargo, un tema general en la carcinogénesis y en la génesis de tumores es la regulación negativa de la GJIC. Las diversas conexinas se expresan de manera específica para los tejidos. Se han detectado Cx43, Cx26, Cx32 en el tejido mamario normal. Se analizó en un conjunto de cánceres mamarios humanos el nivel de expresión de Cx43. No se observaron uniones por hendidura Cx43 en carcinomas ductales in situ, carcinomas ductales infiltrantes y carcinomas lobulares infiltrantes, y parecen ser independientes del estado de los receptores de estrógeno, progesterona y erbB2. Por el contrario, las líneas celulares de cáncer mamario humano y los tejidos de carcinoma mamario de roedores han mostrado una regulación negativa de Cx43, que demostró encontrarse a nivel del ARNm, lo que sugiere la existencia de un mecanismo transcripcional para el descenso de la proteína Cx43 en el cáncer de mama (60). Otro ejemplo de la conexión entre cáncer y GJIC es el carcinoma hepatocelular, en el que la eliminación de la conexina 32 ha demostrado ser propensa para este tipo específico de cáncer (57). Estudios con células ovales han indicado que éstas pueden diferenciarse en hepatocitos y que los derivados neoplásicos de células ovales pueden producir neoplasias tanto hepatocelulares como biliares. La conexina específica expresada por las células ovales en diferenciación determina si se comunica con hepatocitos o células epiteliales biliares. Esta comunicación puede ser necesaria para la diferenciación adicional y el crecimiento regulado de las células ovales en diferenciación, y la alteración de GJIC puede contribuir a la formación de neoplasias hepatocelulares y colangio-celulares. De esta forma, la GJIC puede ser el factor clave en la diferenciación de células ovales, y un bloqueo de la GJIC puede promover su transformación neoplásica. Adicionalmente, análisis in vitro de la invasión tumoral en células endoteliales del pulmón de rata tratadas con malotilato han demostrado que el malotilato estimuló el desarrollo de adhesión entre células mediante uniones por hendidura, que dio como resultado la inhibición de las células tumorales (61). Tomados conjuntamente, estos hallazgos confirman en gran medida la hipótesis de que la alteración de la GJIC es un acontecimiento crítico en la carcinogénesis y que las sustancias de la presente invención, que aumentan la GJIC, podrían resultar beneficiosas en la terapia del cáncer. Por consiguiente, un propósito adicional de la invención es ofrecer nuevos compuestos que aumentan la GJIC. Los presentes inventores sugieren que los compuestos peptídicos de la invención pueden resultar especialmente ventajosos como medicamentos para el tratamiento del cáncer debido a su baja concentración eficaz y, en consecuencia, baja toxicidad.
Ejemplo experimental 9
Efecto del Compuesto 2 sobre la disminución de la comunicación entre uniones por hendidura inducida por DDT en osteoblastos humanos Protocolo y resultados
El compuesto 1,1-bis-(p-clorofenil)-2,2,2-tricloroetano, también conocido como el insecticida DDT, es un inhibidor de la comunicación entre uniones por hendidura y exhibe una capacidad promotora de tumores. Inhibe la comunicación entre células por la reducción del número y tamaño de las uniones por hendidura, así como por niveles celulares reducidos de formas fosforiladas (activas) de la proteína Cx43 de las uniones por hendidura. Se considera que estas acciones son fundamentales para las propiedades oncogénicas del compuesto (62-64). Por lo tanto, compuestos con la capacidad de prevenir la disminución de GJIC inducida por promotores tumorales pueden ser candidatos potenciales para ser utilizados en la protección contra la promoción de tumores y en el tratamiento del cáncer (65). Para examinar si las sustancias de esta invención previenen la reducción de GKIC inducida por promotores tumorales, los presentes inventores han estudiado los efectos del Compuesto 2 sobre el desacoplamiento, inducido por DDT, en osteoblastos humanos.
Métodos Cultivo celular
Osteoblastos humanos: se aislaron las células de médula ósea humana, obtenida por punción de la cresta iliaca posterior de voluntarios sanos (20-36 años de edad): se recogieron 10-15 ml de material medular en 15 ml de PBS + Ca, Mg (Life Technologies, nº de Cat. 14040), con 100 U/ml de heparina (Sigma, nº de Cat. H-3149). Se aisló la fracción mononuclear de la médula en un gradiente de Lymphoprep (Nycomed Pharma, nº de Cat. 1001967), por centrifugación a 2200 rpm durante 30 min. Después de la cosecha, se lavó la fracción mononuclear con medio de cultivo y se centrifugó a 1800 rpm durante 10 min. Seguidamente, se contaron las células y se sembraron en placas en medio de cultivo, a 8 x 10^{6} células/placa de 100 mm. Medio hOB (todos los reactivos se adquirieron en Life Technologies): MEM sin Rojo Fenol con Glutamax (nº de Cat. 041-93013), suplementado con suero de ternero fetal, inactivado por calor, al 10% (nº de Cat. 10106) y 0,1% de Penicilina/Estreptomicina (nº de Cat. 15140). El medio se cambió al día siguiente y las células se cultivaron a 37ºC en CO_{2} al 5%, con cambio de medio cada 7 días. Después de 3-4 semanas de cultivo, las células alcanzaron una confluencia de 70%. Se suplementó entonces el medio con Dexametasona 100 nM (Sigma, nº de Cat. D-4902) durante 7 días. A continuación, las células se sembraron en placa para experimentos con obtención de imágenes de vídeo: se colocó un cubreobjetos de vidrio de 25 mm nº 1 en una placa de 35 mm (o en cada pocillo de una placa de 6 pocillos), las células se sembraron a 2,5 x 10^{5} células/cubreobjetos y se cultivaron durante 2-3 días antes de su uso.
Microinyección
Las células se cultivaron sobre cubreobjetos y se fijaron a una cámara de cultivo PDMI-2 (Medical Systems Corp.), se mantuvieron a 37ºC con perfusión de CO_{2}, en un microscopio Zeiss Axiovert. Las microinyecciones se llevaron a cabo usando un micro-manipulador Eppendorf 5171 y el sistema Eppendorf Transjector 5346. Se cargó una micro-pipeta con solución de Amarillo Lucifer (LY) 10 mM (Sigma, nº de Cat. L-0259). Se inyectó cuidadosamente una célula de la monocapa con LY durante 30 segundos, se extrajo la micro-pipeta de la célula y, después de 30 segundos, se contó el número de células que mostraban transferencia de tinción. La luz de excitación (430 nm) la proporcionó un monochromator (T.I.L.L. Photonics GmbH). Las imágenes se adquirieron con una cámara CCD intensificada (Dage MTI) y se digitalizaron con una placa de procesamiento de imágenes Matrox MVP, empleando el software para obtención de imágenes MetaMorph (Universal Imaging).
Resultados
Para evaluar la capacidad de los modificadores de uniones por hendidura para evitar la promoción tumoral, los presentes inventores quisieron analizar si los modificadores de uniones por hendidura podían invertir la disminución de la comunicación entre uniones por hendidura inducida por un agente promotor de tumores bien conocido, el DDT. Por lo tanto, se incubaron monocapas de osteoblastos humanos sobre cubreobjetos de vidrio a 37ºC en una atmósfera húmeda que contuvo CO_{2} al 5%. Se agregó DDT al medio en una concentración final de 13 \muM y se dejó durante 60 minutos.
Para evaluar el efecto del Compuesto 2 sobre el acoplamiento celular directo después del tratamiento con DDT, se llevaron a cabo experimentos con microinyecciones según el método anteriormente descrito. Se inyectó la tinción Amarillo Lucifer (LY) en un único osteoblasto humano en una monocapa. Después de 30 segundos, se evaluó el número de células que contenía la tinción. Bajo condiciones de control (sin tratamiento con DDT), la tinción difundió a una mediana de 14,5 células (n = 12). Se realizó el mismo experimento con células expuestas a DDT. Estas células mostraron un acoplamiento celular reducido, con una mediana de 7 (n = 13). Se agregó Compuesto 2 a la solución del baño en una concentración final de 10^{-8} mol/l y, después de 10 minutos, se efectuó otra microinyección. El Compuesto 2 produjo un incremento de la transferencia intercelular en todas las preparaciones, con una mediana de 8,3 células (Figura 15). Este incremento es altamente significativo, con p < 0,01, usando el ensayo estadístico no paramétrico de Wilcoxon. Por consiguiente, los abridores de las uniones por hendidura son capaces de invertir el acoplamiento intercelular disminuido, relacionado con la promoción tumoral, lo que sugiere que las sustancias de esta invención pueden ser de utilidad en la quimio-prevención y/o el tratamiento del cáncer. Los compuestos de la presente invención son útiles para la preparación de medicamentos para la quimio-prevención y/o el tratamiento del cáncer. Los compuestos de esta invención se pueden utilizar también en una terapia de combinación con otros agentes anticancerosos. Por lo tanto, es propósito de la presente invención ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento del cáncer. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos
peptídicos.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre la cicatrización de heridas
Una herida es una discontinuación de la anatomía normal que afecta a la piel, y puede ser una herida quirúrgica o traumática, o puede ser secundaria a diversas enfermedades tales como diabetes, arteriosclerosis, malnutrición, etc. La cicatrización normal de las heridas es un proceso sistémico que se produce de forma gradual, y que incluye hemostasia e inflamación. El remodelamiento sigue a estos procesos, que pueden durar años, y es responsable de la formación de tejido cicatricial. La hemostasia con fibrina proporciona una superficie bajo la cual tienen lugar migraciones y movimientos de los bordes de la herida. La epitelización, fibroplasia y la proliferación capilar en la herida en proceso de cicatrización se inician de inmediato. Los brotes capilares angiogénicos invaden el coágulo de fibrina de la herida y, al cabo de pocos días, se organizan en una red microvascular a lo largo del tejido de granulación, también formado por leucocitos y células mononucleares fagocíticas. Se produce una interacción muy dinámica entre los diversos componentes tisulares que intervienen en el proceso de cicatrización de la herida. El proceso angiogénico resulta esencial para una cicatrización eficaz. La comunicación intercelular y las uniones por hendidura son esenciales para la creación de un sincitio de fibroblastos y la proliferación de la red capilar. La distribución normal de conexina 43 es necesaria para este crecimiento de los diferentes componentes tisulares.
Diversos factores locales observados a menudo durante condiciones patológicas, tales como edema, isquemia, bajo tensión de oxígeno e infecciones, pueden retrasar el proceso de cicatrización de las heridas. La cicatrización implica las interacciones de muchos tipos de células y se considera que la comunicación intercelular, mediada por las uniones por hendidura, juega un papel importante en la coordinación del metabolismo celular durante el crecimiento y desarrollo de tejidos y órganos (66-68).
Los presentes inventores señalan que las sustancias de esta invención, que aumentan la GJIC, se pueden utilizar para el tratamiento de heridas y, en particular, para acelerar la cicatrización de las mismas. Teniendo en consideración que los experimentos con tejidos cardiaco y óseo sugieren que estas sustancias exhiben una eficacia potenciada durante la tensión metabólica (por ejemplo, hipoglucemia, hipoxia, isquemia), se puede deducir que estas sustancias pueden ser especialmente útiles en el tratamiento de úlceras por isquemia. Por lo tanto, es un propósito de la presente invención ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en el tratamiento de heridas y, en particular, de úlceras isquémicas. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Efectos de los abridores de las uniones por hendidura sobre la cicatrización de úlceras gástricas y duodenales
Mine et al. han demostrado que la mucosa gástrica humana normal contiene conexina 32 y conexina 43 (69,70). Por el contrario, la mucosa gástrica que rodea una lesión de úlcera gástrica crónica contiene una cantidad menor de conexina 32 y conexina 43. En los estudios de Mine et al. se investigó la relación entre la aparición de conexinas y la cicatrización de úlceras. Cuando se observó cicatrización de úlceras, las conexinas 32 y 43, que estaban disminuidas en la fase de úlcera activa, retornaron prácticamente a los niveles observados en la mucosa gástrica normal. Estos datos indican que la desaparición de ambas conexinas, 32 y 43, se encuentra estrechamente relacionada con la fase de las lesiones crónicas de úlceras gástricas. Adicionalmente, empleando un modelo de rata de úlcera gástrica crónica inducida por ácido acético, el mismo grupo de investigadores demostró que el efecto clínico del fármaco anti-ulceroso cimetidina estuvo estrechamente relacionado con la reaparición de conexina 32 (69).
Por lo tanto, las sustancias de esta invención, que aumentan la GJIC, pueden estimular la cicatrización de úlceras gástricas y duodenales. En consecuencia, es un propósito de la presente invención ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en el tratamiento de úlceras gástricas y duodenales. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Función de las uniones por hendidura en la biología vascular
La coordinación de respuestas celulares en la interface endotelial entre la sangre y los tejidos subyacentes está mediada por múltiples mecanismos de señalización, incluida la comunicación intercelular directa a través de uniones por hendidura. Entre las funciones en las que se ha implicado la comunicación intercelular por uniones por hendidura se encuentra el comportamiento migratorio de las células endoteliales tras lesiones, en la angiogénesis, crecimiento endotelial y senescencia, y la coordinación de las respuestas vasomotoras (71).
La regulación del flujo de sangre requiere, en un intervalo altamente dinámico, respuestas coordinadas de resistencia y arterias de alimentación. Esta coordinación entre vasos se puede lograr por los efectos vasculares de la tensión de cizallamiento ejercida por el torrente circulatorio o por la conducción de señales vasomotoras a lo largo de células de la pared vascular. De hecho, la aplicación local de ciertos compuestos vasoactivos tales como acetilcolina (ACh) o norepinefrina (NE) induce no sólo una dilatación o constricción local, sino también respuestas vasomotoras varios milímetros corriente arriba o corriente abajo (71). También se pueden conducir respuestas vasomotoras desde los capilares a las arteriolas, y pueden contribuir al emparejamiento de demandas de tejido y aporte de sangre. Esto se ha demostrado de la manera siguiente: al estimular la contracción de fibras musculares aisladas, se observó la dilatación de arteriolas corriente arriba de los capilares que alimentan estas fibras (72).
La elevada velocidad de conducción es consistente con la transmisión electrotónica de una señal a lo largo de la pared vascular. De hecho, se ha demostrado que hiperpolarizaciones y despolarizaciones inducidas localmente se conducen varios milímetros corriente arriba en las células endoteliales y musculares lisas vasculares. La conducción de la señal eléctrica exige el acoplamiento de células vasculares por medio de uniones por hendidura que proporcionan conductos de baja resistencia eléctrica entre las células. En el tejido vascular se expresan al menos tres proteínas conexina (Cx) diferentes (Cx37, Cx40 y Cx43) que forman uniones por hendidura. Cx40 parece ser la isoforma de conexina predominante en las células endoteliales de la aorta, en tanto que en el músculo liso, la expresión de Cx43 es abundante.
Estudios en ratones deficitarios en Cx40 (Cx40 -/-) han demostrado que la difusión de la vasodilatación inducida por la aplicación local de acetilcolina o bradiquinina está fuertemente atenuada en los animales Cx40 -/-, en comparación con los animales de tipo salvaje normales (Cx40 +/+) (73). Adicionalmente, la tensión arterial se encuentra significativamente aumentada en los animales Cx40 -/- comparados con los ratones normales de tipo salvaje (Cx40 +/+). Estos resultados confirman un papel importante de Cx40 en la comunicación intercelular vascular, e indican que la comunicación alterada entre las uniones por hendidura en la pared vascular se asocia con una transmisión disminuida de las respuestas de vasodilatación dependientes den endotelio que, a su vez, aumenta la resistencia vascular y provoca hipertensión. Estudios in vivo recientes señalan que las oscilaciones normales de presión en el riñón son extremadamente importantes para la regulación de la tensión arterial (74). De esta forma, las respuestas vasomotoras alteradas, debidas a un escaso acoplamiento entre las células, pueden contribuir al desarrollo de hipertensión en animales deficitarios en Cx40.
La regulación negativa de ARNm de Cx43 y de los niveles de proteínas en células endoteliales senescentes sugiere que la comunicación intercelular alterada entre uniones por hendidura podría desempeñar una función en el proceso de envejecimiento vascular (75).
Basándose en la información disponible sobre el papel de las uniones por hendidura en las respuestas vasculares, es probable que un compuesto farmacológico capaz de incrementar el acoplamiento de las uniones por hendidura en la pared vascular pudiera facilitar la conducción de respuestas vasculares y mejorar el suministro de sangre durante situaciones en las que se produce una demanda metabólica aumentada (por ejemplo, ejercicio físico, taquicardia) y durante la isquemia. Además, una sustancia de este tipo podría prevenir y/o tratar la hipertensión. Por consiguiente, es un propósito adicional de la invención ofrecer compuestos que aumenten el acoplamiento de las uniones por hendidura y/o la GJIC en la pared vascular, siendo útiles, por tanto, para la prevención o el tratamiento de la hipertensión. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre el tejido nervioso
En el SNC se expresan ocho conexinas diferentes (Cx26, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 46). Adicionalmente, Cx36 parece estar preferentemente expresada en las neuronas. Las diferentes conexinas permiten la comunicación entre diversas poblaciones celulares o segregar células en compartimientos aislados, de acuerdo con su patrón de expresión de conexinas. Existen interfaces compartimentales, en las que el acoplamiento heterotípico podría tener importancia funcional, entre los oligodendrocitos (Cx32, Cx45) y astrocitos (Cx43, Cx45, Cx40, Cx30) o neuronas (Cx26, Cx32, Cx43) (76).
Resulta factible que un conjunto específico de conexinas proporcione una ventaja funcional en determinados compartimientos del cerebro; es decir, una conductancia unitaria mayor o menor podría facilitar o limitar funcionalmente la sincronización de las entradas neurales o la rapidez de conducción.
En neuroblastos inmaduros y neuronas post-natales se ha documentado un extenso acoplamiento intercelular mediado por uniones por hendidura (76,77). El incremento post-natal de uniones por hendidura neuronales y su organización cortical sugieren un papel esencial de estas uniones en acontecimientos morfogenéticos subyacentes a la fase crítica de corticogénesis. La implicación de las uniones por hendidura en el tráfico neuronal se ve potenciada por el hecho de que los neurotransmisores son capaces de modificar el acoplamiento de las uniones por hendidura.
Por lo tanto, los presentes inventores sugieren que las sustancias de esta invención, conocidas por incrementar la GJIC, podrían acelerar la reparación tras lesiones nerviosas o durante el injerto de células inmaduras (células progenitoras) en el tejido cerebral. Entre las tecnologías sometidas actualmente a evaluación experimental para la reparación celular del sistema nervioso central, se encuentran los injertos de células progenitoras, tejido fetal y vectores virales utilizados para el tratamiento de enfermedades tales como la de Parkinson, de Huntington y otras enfermedades cerebrales neurodegenerativas.
La lesión del axón activa rápidamente células microgliales y astrogliales próximas a las neuronas axotomizadas. Tras una lesión de un axón motor, los astrocitos regulan positivamente en cuestión de hora(s) la proteína de la unión por hendidura conexina 43 y, en el plazo de un día, la proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Simultáneamente, proliferan células microgliales y migran hacia el pericarion de la neurona axotomizada. Un esquema hipotético de la activación de células gliales tras una lesión de axón supone que las neuronas dañadas interactúan inicialmente con los astrocitos adyacentes a través de la GJIC. Seguidamente, se activan las células microgliales vecinas que se encuentran en reposo. Estas reacciones gliales se amplifican por mecanismos paracrinos y autocrinos, en los que las citoquinas parecen jugar un papel importante como mediadores. Las propiedades funcionales específicas de las células gliales activadas determinarán su influencia sobre la supervivencia neuronal, la regeneración del axón y la plasticidad sináptica. Por lo tanto, el control de la inducción y progresión de estas respuestas son posiblemente críticos para el resultado de, por ejemplo, traumatismos neurológicos, isquemia cerebral y enfermedades neurodegenerativas crónicas (78).
Se cree que las uniones por hendidura proporcionan en enlace molecular para la señalización coordinada a largo rango entre miembros individuales del compartimiento glial. Del mismo modo, los astrocitos están especialmente adaptados para el apoyo metabólico de las neuronas, puesto que están polarizados funcionalmente, tocando un extremo el lecho vascular y el otro polo se aproxima al parénquima neuronal (76). De esta forma, el mal funcionamiento de estos mecanismos de apoyo puede ser instrumental para el mal funcionamiento de las vías neuronales integradas y, por lo tanto, el desarrollo de enfermedades en el sistema nervioso central. Por consiguiente, los presentes inventores sugieren que las sustancias de esta invención, que han demostrado incrementar la GJIC, pueden prevenir la lesión isquémica en el cerebro al aumentar el apoyo metabólico entre las células gliales y las neuronas. Adicionalmente, las sustancias de la invención pueden ser de gran importancia en pacientes con psicosis orgánicas que pueden presentarse con signos tales como depresión, ansiedad, déficits de aprendizaje y memoria, fobias y alucinaciones. Por lo tanto, es un propósito de la presente invención ofrecer compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención de la lesión isquémica en el cerebro, y para el tratamiento de psicosis orgánicas, incluidas depresión, ansiedad, déficits de aprendizaje y memoria, fobias y alucinaciones. Este objetivo se alcanza con los compuestos peptídicos de la invención, cuando se les selecciona o formula de manera que estén disponibles para el sistema nervioso central.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre la catarata
La lente ocular de los vertebrados es un quiste sólido de células que crece durante toda la vida por la adición de nuevas células sobre la superficie. Las células más antiguas, enterradas por las nuevas generaciones, se diferencian en largas fibras prismáticas, pierden sus orgánulos celulares y rellenan sus citoplasmas con elevadas concentraciones de proteínas solubles, las cristalinas. Las fibras lenticulares de larga duración están interconectadas por uniones por hendidura, tanto entre sí como con la capa anterior de células epiteliales cúbicas sencillas, en la superficie de la lente. Esta red de uniones por hendidura reúne las células de la lente en un sincitio con respecto a pequeñas moléculas, permitiendo la cooperación metabólica: difusión intercelular de iones, metabolitos y agua. En contacto con nutrientes en la superficie de la lente, las células epiteliales conservan sus orgánulos celulares y son capaces de proporcionar la energía metabólica necesaria para mantener concentraciones correctas de iones y metabolitos en el interior del citoplasma de las fibras lenticulares, de forma que las cristalinas se conservan en solución y no se agregan (catarata). En la lente están presentes tres clases de conexinas: Cx43, Cx46 y Cx50, y se han asociado mutaciones de cada una de estas proteínas de las uniones por hendidura con la catarata (79-81). Estos hallazgos demuestran que la GJIC resulta esencial para el metabolismo y función normales de la lente. Por lo tanto, los presentes inventores sugieren que las sustancias de esta invención, conocidas por aumentar la GJIC, se pueden usar en la prevención y/o el tratamiento de la catarata. Por consiguiente, es un propósito de la presente invención proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento de la catarata. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura sobre enfermedades de los oídos
Se han encontrado muchas diferentes mutaciones de Cx32 en la neuropatía periférica hereditaria - síndrome de la sordera asociada a X de Charcot-Marie-Tooth, habiéndose detectado múltiples mutaciones de Cx25 y Cx31 en la sordera (80). De esta forma, los presentes inventores sugieren que las sustancias de esta invención, de las que se sabe que incrementan la GJIC, se pueden utilizar en la prevención y/o el tratamiento de determinados tipos de sordera asociadas con una GJIC alterada en el oído. Por lo tanto, es un propósito de la presente invención proporcionar compuestos para la preparación de medicamentos útiles en la prevención y/o el tratamiento de la sordera asociada con una GJIC alterada. Este objetivo se alcanza con los presentes compuestos peptídicos.
Función de los abridores de uniones por hendidura sobre los intestinos
En la pared del intestino delgado se expresan tanto Cx43 como Cx45 (82). Se cree que las células que expresan Cx45 a lo largo del plexo muscular profundo del intestino delgado actúan, probablemente, como constituyentes de un sistema marcapasos, que puede incluir un sistema conductivo, formando una red celular que opera a través de tipos específicos de uniones por hendidura. En el intestino y en el colon, las células intersticiales de Cajal (ICC) son células marcapasos localizadas entre los músculos lisos intestinales; generan ondas lentas espontáneas de las capas de músculos lisos y median la neurotransmisión. La red celular tridimensional de ICC está conectada por uniones por hendidura Cx43 tanto entre ICC como entre ICC y células musculares lisas (83). En pacientes con enfermedad de Hirschsprung, la ausencia de expresión de Cx43 en el intestino aganglionar sugiere que la alteración de la comunicación intercelular entre ICC y las células musculares lisas puede ser parcialmente responsable de la disfunción de la motilidad en esta enfermedad (83). Los pacientes con enfermedad de Chagas (causada por la infección con el protozoo Tripanosoma cruzii) exhiben una marcada reducción de la expresión de Cx, que se considera responsable tanto de la cardiomiopatía como del megacolon gravemente dilatado que se registra en estos pacientes (7). Por lo tanto, la comunicación normal por uniones por hendidura entre ICC y entre ICC y las células musculares lisas se considera esencial para la motilidad normal del intestino delgado y del colon. Por consiguiente, es un propósito adicional de la invención ofrecer una sustancia capaz de aumentar la conductancia entre uniones por hendidura en el intestino y que, por lo tanto, puede ser útil en el tratamiento de los trastornos de motilidad gastrointestinal.
Órganos reproductores y uniones por hendidura Ovarios
Las uniones por hendidura entre células de granulosa y entre el ovocito y las células de granulosa circundantes juegan un papel importante durante el desarrollo del folículo ovárico. En el nacimiento, el ovario contiene folículos primordiales consistentes en ovocitos detenidos en meiosis, rodeados por una capa única de células de sustentación (granulosa). De forma periódica, subgrupos de folículos primordiales sufren un desarrollo adicional, durante el cual el ovocito aumenta de tamaño y las células de la granulosa proliferan, se estratifican y desarrollan un antro relleno de líquido. Tras la ovulación, los ovocitos reanudan la meiosis y las células de granulosa retenidas en el folículo se diferencian en células esteroidegénicas, formando el cuerpo lúteo.
Las uniones por hendidura conectan directamente las células adyacentes, permitiendo los movimientos de difusión de iones, metabolitos y otras moléculas potencialmente señalizadoras de importancia en la regulación del ciclo ovárico y de la fertilidad femenina. Como confirmación de la función esencial de las uniones por hendidura para la función ovárica normal, se ha demostrado que ratones deficitarios de Cx37 carecen de folículos (de Graaf) maduros, no ovulan y desarrollan numerosos cuerpos lúteos inadecuados. Además, el desarrollo de los ovocitos se detiene antes de ser competitivos en la meiosis. De esta forma, la señalización intercelular a través de los correspondientes canales regula de manera crítica el conjunto altamente coordinado de interacciones celulares necesario para una ovogénesis eficaz y la ovulación (84).
La hormona folículo-estimulante (FSH) es el principal regulador del crecimiento y desarrollo del folículo ovárico. Junto con sus diversas acciones sobre la maduración del folículo, la FSH mejora el acoplamiento entre células entre las células de la granulosa y potencia la expresión del gen Cx43 y, posiblemente, la formación de nuevas uniones por hendidura (85). Por el contrario, la hormona luteinizante (LH) interrumpe la comunicación entre células en el interior del folículo ovárico, dando lugar a un descenso de las concentraciones intra-ovocitarias de AMPc, seguido de una reanudación de la meiosis (86).
Estos datos demuestran que la presencia de una comunicación normal mediante uniones por hendidura a través de Cx37 y Cx43 resulta esencial para el crecimiento folicular normal y para la ovulación. De este modo, es posible que determinadas formas de infertilidad femenina se deban a un escaso acoplamiento entre células en los ovarios. Por lo tanto, se podría utilizar una sustancia que aumente el acoplamiento entre células para el tratamiento de la infertilidad femenina en mujeres con una expresión y/o regulación alterada de la función de las uniones por hendidura del ovario. Los compuestos de la presente invención, al tener la capacidad de incrementar la GJIC, son útiles para el tratamiento de la infertilidad femenina debida a un escaso acoplamiento entre células en los ovarios.
Útero
Las potentes contracciones sincrónicas del útero durante el parto dependen del acoplamiento eléctrico de las células musculares lisas del miometrio a través de uniones por hendidura. En el ser humano y otros mamíferos, las uniones por hendidura son escasa en el miometrio del útero no gestante, pero se tornan abundantes a término y/o con el inicio del parto. La proteína de uniones por hendidura predominantemente expresada por las células musculares lisas del miometrio humano es Cx43, pero también se han identificado Cx26, Cx40 y Cx45 en el miometrio humano (87,88).
Debido a la gran importancia de las contracciones musculares coordinadas durante el parto, es un propósito adicional de la invención proporcionar una sustancia capaz de incrementar el acoplamiento entre células en el miometrio, de la que se espera que tenga una influencia positiva sobre la sincronización de las contracciones musculares. Dicha sustancia se puede utilizar junto con oxitocina para la inducción y facilitación del parto. Este objetivo se logra con los presentes compuestos peptídicos y la invención se refiere, adicionalmente, al uso de los compuestos peptídicos de la invención para la preparación de un medicamento para la inducción y facilitación del parto.
Órganos reproductores masculinos
Cx43 es la conexina más abundante en los testículos y resulta interesante destacar que las cepas de ratas con una expresión de Cx43 reducida exhiben una espermatogénesis alterada (ratones ebo/ebo, jun-d-/-, Cx43 +/-). Adicionalmente, trabajos anteriores sugieren que los pacientes con hipospermia o aspermia presentan uniones por hendidura reducidas en los testículos (90). Estos datos confirman la sugerencia de que un acoplamiento reducido entre células en los testículos puede dar lugar a infertilidad masculina y, por consiguiente, es un propósito adicional de la invención ofrecer una sustancia capaz de incrementar el acoplamiento entre células y, de esta forma, puede ser un útil agente terapéutico en el tratamiento de la infertilidad masculina asociada a un acoplamiento alterado entre células.
Función de las uniones por hendidura en el páncreas
Los canales de uniones por hendidura, formados por Cx43, acoplan funcionalmente las células sensibles a la glucosa de los islotes pancreáticos y de una línea celular de insulinoma de rata (91). Por el contrario, células de varias líneas celulares con secreción anormal de insulina no expresan Cx43, presentan escasas uniones por hendidura y están escasamente acopladas. Tras la corrección de estos defectos por transfección estable de ADNc de Cx43, las células que expresaban niveles modestos de Cx43 y acoplamiento, como se observa en las células beta nativas, muestran una expresión del gen de insulina y un contenido en insulina marcadamente elevado, en comparación con los observados tanto en células de tipo salvaje (desacopladas) y en células transfectadas que sobre-expresan Cx43. Estos hallazgos indican que se requiere un acoplamiento adecuado de Cx43 para una adecuada producción y almacenamiento de insulina (91). Adicionalmente, la estimulación in vivo de la liberación de insulina por medio de glibenclamida se asocia con un incremento de expresión de Cx43 y un aumento del acoplamiento entre células entre células \beta adyacentes dentro del islote pancreático (92).
Estas observaciones indican una importante función del acoplamiento por uniones por hendidura entre las células \beta de los islotes pancreáticos para la producción y liberación de insulina. Por lo tanto, es todavía un propósito adicional de la presente invención proporcionar una sustancia capaz de aumentar la conductancia eléctrica de las uniones por hendidura y, de este modo, mejorar la tolerancia a la glucosa en sujetos con diabetes mellitus no insulino-dependiente. Dicho objetivo se logra con los compuestos peptídicos de la invención.
Efectos de los abridores de uniones por hendidura (péptidos antiarrítmicos) sobre la trombosis
Se ha demostrado anteriormente que dos péptidos estrechamente relacionados con las sustancias de la presente invención tienen actividad antitrombótica. De esta forma, Dikshit et al. (15) hallaron que los péptidos Gly-Pro-Prp-Gly-Ala-Gly y Gly-Pro-Gly-Gly-Ala-Gly previenen el desarrollo del embolismo pulmonar en el ratón cuando se administra una dosis i.v. de colágeno y adrenalina. El documento US 4.775.743 describe HP5, un péptido derivado de AAP que tiene la secuencia N-3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH y que es activo contra la aglutinación plaquetaria. Los compuestos de la presente invención exhiben una llamativa similitud y es probable que muestren efectos similares sobre la trombosis. De este modo, las sustancias de esta invención se pueden usar en la prevención de la trombosis.
Composiciones
La invención se refiere también a una composición que comprende un péptido antiarrítmico farmacológicamente activo, como se ha definido en este documento, en combinación con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden encontrarse en una forma adaptada para la administración oral, subcutánea, parenteral (intravenosa, intraperitoneal), intramuscular, rectal, epidural, intratraqueal, intranasal, dérmica, vaginal, bucal, ocular, cerebral o pulmonar directa, preferentemente, en una forma adaptada a la administración subcutánea, intravenosa u oral, y estas composiciones se pueden preparar de manera bien conocida para el experto en la técnica, por ejemplo, como se describe en general en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17ª edición, Alfonso R. Gennaro (compilador), Mark Publishing Company, Easton, PARTÍCULA, EE.UU., 1985 y ediciones más recientes, y en las monografías en la serie "Drugs and the Pharmaceutical Sciences", Marcel Dekker. Las composiciones pueden estar presentes en formas convencionales, por ejemplo, soluciones y suspensiones para inyección, incluidos concentrados para infusiones i.v., cápsulas y comprimidos, preferentemente, en forma de formulaciones entéricas, por ejemplo como se describe en el documento US 5.350.741, para administración oral.
El vehículo o diluyente farmacéutico empleado puede ser un vehículo sólido o líquido convencional. Ejemplos de vehículos sólidos son lactosa, arcilla blanca, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico o éteres de alquilo inferior de celulosa. Ejemplos de vehículos líquidos son jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, polioxietileno y agua.
De modo similar, el vehículo o diluyente puede contener cualquier material de liberación sostenida conocido en la técnica tales como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, solo o mezclado con una cera.
Si se utiliza un vehículo sólido para la administración oral, la preparación se puede comprimir, incluir en forma de polvo o granulado en una cápsula de gelatina dura, o puede estar en forma de trocisco o pastilla. La cantidad de vehículo sólido variará extensamente, pero normalmente será de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1 g.
Un comprimido típico, que se puede preparar por técnicas convencionales de compresión, puede contener: Núcleo: compuesto activo (como compuesto libre o como su sal), 100 mg; dióxido de silicio coloidal (Aerosil), 1,5 mg; celulosa, microcristalina (Avicel), 70 mg; goma de celulosa modificada (Ac-Di-Sol), 7,5 mg; estearato de magnesio.
Recubrimiento: HPMC, aproximadamente 9 mg; *Mywacett 9-40T, aproximadamente 0,9 mg; *monoglicérido acilado usado como plastificante para recubrimiento de película.
Si se utiliza un vehículo líquido, la preparación puede estar en forma de jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda o líquido inyectable estéril, tal como una suspensión o solución líquida acuosa o no acuosa.
Asimismo, la composición puede estar en una forma adecuada para la inyección o infusión local o sistémica y, como tal, se puede formular con agua estéril o una solución salina o de glucosa isotónica. Las composiciones se pueden esterilizar por técnicas convencionales de esterilización, bien conocidas en la técnica. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar para su uso, o se filtran bajo condiciones de asepsia y se liofilizan, combinándose la preparación liofilizada con la solución acuosa estéril antes de la administración. La composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según sean necesarias para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponantes, agentes ajustadores de tonicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, lactato sódico, cloruro sódico, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc.
Formulación de péptidos para administración intravenosa
Se pueden preparar formulaciones multi-dosis en forma de solución de un compuesto de la invención en solución salina estéril e isotónica, envasada en viales provistos de tapón y, si es necesario, se agrega un conservante (por ejemplo, benzoatos). Se pueden preparar formulaciones de dosis fija en forma de solución del compuesto en solución salina estéril e isotónica, envasada en ampollas de vidrio y, si es necesario, envasadas con un gas inerte. Cada dosis del compuesto se envasa en seco en ampollas o viales provistos de tapón, envasadas, si es preciso, con gas inerte. La formulación multi-dosis exige el máximo grado de estabilidad del compuesto. Cuando la estabilidad del compuesto es baja, se pueden usar formulaciones de dosis fija. El péptido se puede formular también como concentrado para infusión i.v.
Para la administración nasal, la preparación puede contener un compuesto de la presente invención disuelto o suspendido en un vehículo líquido, en particular, un vehículo acuoso, para la aplicación por aerosol. El vehículo puede contener aditivos tales como agentes solubilizantes, por ejemplo, propilenglicol, tensioactivos tales como sales de ácidos biliares, o éteres alcohólicos superiores de polioxietileno, potenciadores de la absorción tales como lecitina (fosfatidil-colina) o ciclodextrina, o conservantes tales como parabenos.
Adicionalmente, el pequeño tamaño de los compuestos peptídicos de la invención puede ser una ventaja para la administración oral o nasal, debido a que la absorción relativamente rápida a través de las membranas mucosas, en comparación con péptidos de mayor tamaño, minimiza la degradación enzimática, especialmente en el duodeno y el íleon.
Preparación de comprimidos entéricos que contienen Compuesto 2
Se disuelven 400 mg de ácido L-tartárico y 40 mg de aceite de ricino hidrogenado-polietilenglicol en 5 ml de metanol. La solución se deposita en un mortero previamente calentado a 30ºC. A la solución se agregan 1,5 mg de Compuesto 2. Inmediatamente después de la adición del Compuesto 2, la mezcla se agita con la mano de mortero bajo una corriente de aire caliente de 40ºC y, a continuación, se coloca en un disecador al vacío durante la noche para separar el disolvente. La masa sólida resultante se pulveriza con la mano del mortero y se amasa con 30 mg de bicarbonato sódico y una pequeña cantidad de etanol al 70%. Seguidamente, la mezcla se divide y se conforma en comprimidos y se seca. Los comprimidos secos se recubren con ftalato de hidroxipropil-metilcelulosa para obtener un comprimido entérico.
La invención también se refiere a un péptido o derivado peptídico o análogo funcional del mismo, antiarrítmico y farmacológicamente activo, como se ha descrito en este documento, para uso en terapia, y a su uso como se define en este documento para la fabricación de una composición farmacéutica para usar en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de arritmias y complicaciones trombóticas durante trastornos cardiovasculares tales como cardiopatía isquémica (por ejemplo, angina de pecho estable, angina de pecho inestable, infarto agudo de miocardio), insuficiencia cardiaca congestiva (por ejemplo, insuficiencia cardiaca sistólica, diastólica, de alto gasto, de bajo gasto, del lado derecho o izquierdo), cardiopatías congénitas, cor pulmonale, cardiomiopatías, miocarditis, cardiopatía hipertensiva, y durante la revascularización coronaria.
En realizaciones específicas, se puede usar un péptido antiarrítmico según la presente invención para tratar y/o prevenir bradiarritmias (por ejemplo, debidas a enfermedades del nódulo sinusal, nódulo AV, haz de His, rama derecha o izquierda), y taquiarritmias asociadas con reentrada (por ejemplo, complejos auriculares prematuros, complejos de la unión AV, complejos ventriculares prematuros, fibrilación auricular, flúter auricular, taquicardia supraventricular paroxística, taquicardia de reentrada del nódulo sinusal, taquicardia de reentrada del nódulo AV, y taquicardia ventricular no sostenida), ya sea solo o en combinación con otros compuestos antiarrítmicos tales como agentes de clase I (por ejemplo, lidocaína), agentes de clase II (por ejemplo, metoprolol o propranolol), agentes de clase III (por ejemplo, amiodarona o sotalol), o agentes de clase IV (por ejemplo, verapamilo).
En realizaciones específicas, se puede utilizar un péptido antiarrítmico según la presente invención para prevenir acontecimientos trombóticos en pacientes con enfermedades de la pared vascular (por ejemplo, aterosclerosis), producción incrementada de plaquetas (policitemia universal), y/o reducción del flujo (cardiopatía, vasculopatía), ya sea solo o en combinación con inhibidores de GP IIb/IIIa (por ejemplo, c7E3; abciximab), inhibidores de la ciclooxigenasa (por ejemplo, aspirina), antagonistas de tromboxano A2, derivados de cumarina (por ejemplo, warfarina), o con el péptido sintético intergrilina.
En realizaciones específicas, se puede utilizar un péptido antiarrítmico según la presente invención, debido a su efecto sobre los canales de las uniones por hendidura intercelulares, para tratar y/o prevenir pérdida de tejido óseo y acelerar la consolidación de fracturas óseas (93); tratar y/o prevenir enfermedades en cartílagos y articulaciones con mala vascularización (94); tratar y/o prevenir cataratas (81); tratar y/o prevenir la vascularización de la córnea en estados patológicos con mala nutrición de la córnea e incrementar la curación de lesiones corneales (95); tratar y/o prevenir el crecimiento y difusión de células cancerosas tales como células cancerosas derivadas de líneas celulares epiteliales (96); tratar y/o prevenir hipertensión por incremento de la vasomoción (74); prevenir el rechazo de injertos tales como células y órganos en un organismo.
Síntesis de péptidos
A continuación, se describe un procedimiento general preferido. Sin embargo, en el documento WO98/11125 se encuentran descripciones más detalladas de la síntesis de péptidos en fase sólida.
Aparato y estrategia de síntesis
Los péptidos se sintetizaron de manera discontinua en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración, usando 9-fluorenilmetil-oxicarbonilo (Fmoc) como grupo N-\alpha-amino-protector y grupos comunes adecuados de protección para las funcionalidades de cadena lateral.
Disolventes
El disolvente DMF (N,N-dimetilformamida, Riedel de-Häen, Alemania) se purificó haciéndolo pasar a través de una columna empaquetada con una potente resina de intercambio iónico (Lewatit S 100 MB/H ácido fuerte, Bayer AG, Leverkusen, Alemania), y se analizaron las aminas libres antes de usarlo por adición de 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH), dando lugar a un color amarillo (anión Dhbt-O^{-}) en caso de haber aminas libres presentes. El disolvente DCM (diclorometano, categoría de análisis, Riedel de-Häen, Alemania) se utilizó directamente, sin purificación. Se utilizó acetonitrilo (categoría de HPLC, Lab-Scan, Dublín, Irlanda) directamente sin purificación.
Aminoácidos
Se adquirieron aminoácidos protegidos con Fmoc en Advanced ChemTech (ACT) en formas de protección de la cadena lateral adecuadas. Aminoácidos protegidos de otra forma (Fmoc-Glu(OH)-O-alilo; Fmoc-Asp(OH)-O-alilo se adquirieron en NovaBiochem (Suiza), Fmoc-4-Hyp(OtBu)-OH en Bachem (Suiza).
Reactivos de acoplamiento
El reactivo de acoplamiento diisopropil-carbodiimida (DIC) se adquirió en Riedel de-Häen, Alemania, PyBop en Advanced ChemTech.
Enlazadores
Se adquirió ácido (4-hidroximetil-fenoxi)-acético (HMPA) en Novabiochem, Suiza y se acopló con la resina en forma de un éster de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) preformado, generado mediante DIC.
Soportes sólidos
Los péptidos sintetizados según la estrategia de Fmoc sobre resinas TentaGel S 0,22-0,31 mmol/g (TentaGel-S-NH_{2}; TentaGel S RAM, TentaGel S-RAM-Lys(Boc)-Fmoc; polímero Rapp, Alemania);
Catalizadores y otros reactivos
Se adquirió diisopropil-etilamina (DIEA) en Aldrich, Alemania, y etilendiamina en Fluka, piperidina y piridina en Riedel de-Häen, Frankfurt, Alemania. Se adquirió 4-(N,N-dimetilamino)-piridina (DMAP) en Fluka, Suiza, y se usó como catalizador en las reacciones de acoplamiento en las que intervinieron anhídridos simétricos. Etanoditiol se adquirió en Riedel de-Häen, Frankfurt, Alemania. En Fluka, Suiza, se adquirieron 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt)(HOAt).
Procedimientos de acoplamiento
El primer aminoácido se acopló en forma de anhídrido simétrico en DMF generado a partir del aminoácido N-\alpha-protegido adecuado y DIC. Los siguientes aminoácidos se acoplaron como ésteres de HOBt o HOAt generados in situ, preparados a partir de aminoácidos N-\alpha-protegidos adecuados y HOBt o HOAt por medio de DIC en DMF. Las acilaciones se analizaron por medio del ensayo de ninhidrina realizado a 80ºC para prevenir la desprotección de Fmoc durante el ensayo (97).
Desprotección del grupo N-\alpha-amino-protector (Fmoc)
La desprotección del grupo Fmoc se llevó a cabo por tratamiento con piperidina al 20% en DMF (1 x 5 y 1 x 10 min), seguido de un lavado con DMF (5 x 15 ml, 5 min cada uno) hasta que no se detectó color amarillo alguno tras la adición de Dhbt-OH al DMF drenado.
Desprotección de alilo
Se agregó a la resina peptídica una solución de 3 eq. de Pd(PPh_{3})_{4} disuelto en 15-20 ml de CHCl_{3}, AcOH, NMM (37:2:1). El tratamiento se continuó durante tres horas a temperatura ambiente, acompañado por el burbujeo de una corriente de N_{2} a través de la mezcla.
Acoplamiento de ésteres de HOBt
Se disolvieron 3 eq. de aminoácidos N-\alpha-amino-protegidos en DMF junto con 3 eq. de HOBt y 3 eq. de DIC, agregándolo luego a la resina.
Anhídrido simétrico preformado
Se disolvieron 6 eq. de aminoácido N-\alpha-amino-protegido en DCM y se enfrió a 0ºC. Se agregó DIC (3 eq.) y la reacción se prosiguió durante 10 min. El disolvente se separó al vacío y el remanente se disolvió en DMF. La solución se agregó de inmediato a la resina, seguida de 0,1 eq. de DMAP.
Ciclación del péptido sobre la resina
Se disolvieron 1,5 eq. de PyBop en DMF junto con 1,5 eq. de HOBt y se agregaron 3 eq. de NMM a la resina peptídica. La reacción se continuó durante la noche.
Escisión del péptido de la resina con ácido
Los péptidos se escindieron de las resinas mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% (TFA, Riedel de-Häen, Frankfurt, Alemania)-agua v/v, o con TFA al 95% y etanoditiol al 5% v/v, a temperatura ambiente durante 2 h. Las resinas filtradas se lavaron con TFA al 95%-agua y los filtrados y lavados se evaporaron bajo presión reducida. El residuo se lavó con éter y se liofilizó a partir de ácido acético-agua. El producto liofilizado bruto se analizó por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y se identificó por espectrometría de masa de ionización de electrospray (ESMS).
Síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel (PEG-PS)
Se depositó resina TentaGel (1 g, 0,22-0,31 mmol/g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración. La resina se hinchó en DMF (15 ml) y se trató con piperidina al 20% en DMF para asegurar la presencia de grupos amino no protonados en la resina. La resina se drenó y se lavó con DMF hasta que no se pudo detectar color amarillo alguno tras la adición de Dhbt-OH a la DMF drenada. Se acopló HMPA (3 eq.) en forma de éster de HOBt preformado, como se ha descrito anteriormente, y el acoplamiento se prosiguió durante 24 h. La resina se drenó y se lavó con DMF (5 x 5 ml, 5 min cada vez) y se comprobó la acilación mediante el ensayo de ninhidrina. El primer aminoácido se acopló en forma de anhídrido simétrico preformado, del modo anteriormente descrito. Los aminoácidos siguientes, según la secuencia, se acoplaron como ésteres de HOBt protegidos con Fmoc preformados (3 eq.) como se ha descrito anteriormente. Los acoplamientos se continuaron durante 2 h, a menos que se especifique lo contrario. La resina se frenó y se lavó con DMF (5 x 15 ml, 5 min cada vez) para separar el exceso de reactivo. Todas las acilaciones se comprobaron por el ensayo de ninhidrina realizado a 80ºC. Después de finalizada la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 5 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y, por último, éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
Condiciones de HPLC
El análisis de gradiente de HPLC se llevó a cabo usando un sistema de HPLC Hewlett Packard HP 1100 consistente en una Bomba Cuaternaria HP 1100, un Automuestreador HP 1100, un Termostato de Columna HP 1100 y un Detector de Longitudes de Onda Múltiples HP 1100. Se utilizó la Chemstation de Hewlett Packard para el software LC (rev. A.06.01) para el control de instrumentos y la adquisición de datos.
Se utilizaron las siguientes columnas y sistemas de tampón de HPLC:
Columna
Kromasil, Phenomenex 00F-3033-EO, 329889 (nueva); 5 \mum C-18, 100 \ring{A} 150 x 4,6 mm; Lote nº 5243-10.
Sistema de tampón: A: TFA al 0,1% en MQV; B: TFA al 0,085%, MQV al 10%, MeCN al 90%.
Gradiente:
1 - 1,5 min. 25% B
1,5 - 13,5 min. 25-50% B
13,5 -14,5 min. 50-100% B
14,5 - 15,5 min. 100% B
15,5 - 17,5 min. 100-25% B
17,5-20 min. 25% B
Caudal: 1,5 ml/min
Temperatura del horno: 40ºC
Detección UV: \lambda = 215 nm
Los espectros de masa se obtuvieron en un instrumento LCT Micro-mass.
La invención se ilustra, adicionalmente, por los siguientes ejemplos de síntesis específicos.
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Síntesis peptídica de péptidos individuales
Ejemplo de síntesis 1
Síntesis peptídica de Ac-Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (Compuesto 1) sobre TentaGel-S-NH_{2}; polímero Rapp, Alemania
Primer lote: se depositó TentaGel-S-NH_{2} seco (0,27 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. El producto liofilizado bruto se analizó por HPLC y se demostró que la pureza fue mayor que 70%, y se confirmó la identidad del péptido por ES- MS (MH^{+} hallado 619,24, MH^{+} calculado 619,26). El rendimiento de material bruto fue de 137,7 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 59 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 35%.
Segundo lote: se depositó TentaGel-S-NH_{2} seco (0,27 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma descrita anteriormente y se liofilizó a partir de ácido acético. El producto liofilizado bruto se analizó por HPLC y se demostró que la pureza fue mayor que 70%, y se confirmó la identidad del péptido por ES-MS (MH^{+} hallado: 619,25; MH^{+} calculado, 619,26). El rendimiento de material bruto fue de 137,3 mg. Tras la purificación usando HPLC de preparación de la forma anteriormente descrita, se recogieron 27,9 mg de producto peptídico con una pureza superior a 91%. Rendimiento total de producto peptídico purificado: 15,5%.
Ejemplo de síntesis 2
Síntesis de péptido de Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 2) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Primer lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la D-tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. El rendimiento de producto bruto liofilizado fue de 119,7 mg. Se confirmó la identidad del péptido por ES-MS (MH^{+} hallado 618,25, MH^{+} calculado 618,28). Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 42 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 30%.
Segundo lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la D-tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma descrita anteriormente y se liofilizó a partir de ácido acético. El rendimiento de producto bruto liofilizado fue de 119,7 mg. Se confirmó la identidad del péptido por ES-MS (MH^{+} hallado: 618,29; MH^{+} calculado, 618,28). Tras la purificación usando HPLC de preparación de la forma anteriormente descrita, se recogieron 100 mg de producto peptídico con una pureza superior a 99%. Rendimiento total de producto peptídico purificado: 71%.
Ejemplo de síntesis 3
Síntesis de péptido de ciclo-(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 3) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Primer lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético con un rendimiento de producto bruto de 57 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 2,7 mg de producto peptídico cíclico, con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 1,3%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 673,32; MH^{+} calculado, 673,28).
Segundo lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente, y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético con un rendimiento de producto bruto de 57 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 10 mg de producto peptídico cíclico, con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 7%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 673,30; MH^{+} calculado, 673,29).
Ejemplo de síntesis 4
Síntesis de péptido de ciclo-(Tyr-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Asn) (Compuesto 4) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Primer lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético para dar el producto bruto. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogió un producto peptídico cíclico.
Segundo lote: se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente, y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al
vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético, para dar 58,6 mg de producto bruto.
Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 5,7 mg de producto peptídico cíclico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 4,4%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 616,25; MH^{+} calculado, 616,27).
Ejemplo de síntesis 5
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 5) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 46,6 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 28,6%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 576,27, MH^{+} calculado 576,26).
Ejemplo de síntesis 6
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 6) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 26 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 16,3%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 560,25, MH^{+} calculado 560,28).
Ejemplo de síntesis 7
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-D-Pro-Ala-Tyr-NH_{2} (Compuesto 7) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 18,9 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 12,2%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 534,25, MH^{+} calculado 534,26).
Ejemplo de síntesis 8
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-Gly-D-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 8) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 130 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 70,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 94%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 48,2%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 520,25, MH^{+} calculado 520,56).
Ejemplo de síntesis 9
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-Ala-Tyr-NH_{2} (Compuesto 9) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 131 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 72,4 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 92%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 49%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 550,28, MH^{+} calculado 550,59).
Ejemplo de síntesis 10
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 10) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 150,8 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 93,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 58%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 576,63, MH^{+} calculado 576,63).
Ejemplo de síntesis 11
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-NCG-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 11) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 24,3 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 10,2 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 91%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 4%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 602,23, MH^{+} calculado 602,32).
Ejemplo de síntesis 12
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-T4C-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 12) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 29,9 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 19 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 50%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 578,18, MH^{+} calculado 578,23).
Ejemplo de síntesis 13
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-A2C-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 13) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 27,3 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 12,7 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 34%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 546,28, MH^{+} calculado 546,55).
Ejemplo de síntesis 14
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-PC-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 14) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 23,4 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 13,5 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 34,6%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 574,32, MH^{+} calculado 574,29).
Ejemplo de síntesis 15
Síntesis de péptido de Ac-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 15) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N-terminal se acetiló con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
Tras la desprotección del grupo Fmoc y del grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 89,9 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 80,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 58,9%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 618,30, MH^{+} calculado 618,28).
Ejemplo de síntesis 16
Síntesis de péptido de H-Cys(Acm)-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH_{2} (Compuesto 16) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la Cistina(Acm) N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 47,3 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 29,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 12,9%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 924,50, MH^{+} calculado 924,36).
Ejemplo de síntesis 17
Síntesis de péptido de H-Cys(Acm)-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys(Acm)-NH_{2} (Compuesto 17) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la Cistina(Acm) N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto 45,67 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 29,15 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 94%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 14,9%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 796,25, MH^{+} calculado 796,30).
Ejemplo de síntesis 18
Síntesis de péptido de H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-Cys(Acm)-NH_{2} (Compuesto 18) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la Cistina(Acm) N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. El producto bruto liofilizado se analizó por HPLC y se purificó y caracterizó de forma similar el compuesto 17.
Ejemplo de síntesis 19
Síntesis de péptido de H-Cys(Acm)-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys(Acm)-NH_{2} (Compuesto 19) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la Cistina(Acm) N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 2,76 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 94%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 17,9%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 796,25, MH^{+} calculado 796,30).
Ejemplo de síntesis 20
Síntesis de H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH_{2} (Compuesto 20)
Se oxidan 19 mg del péptido H-Cys-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Cys-NH_{2} disolviendo el péptido en 1,5 ml de ácido acético al 5% en agua y DMSO, 4:1 v/v, pH \sim 6. La mezcla se sitúa en el refrigerador durante 6 días.
Tras la purificación usando HPLC de preparación, de la forma anteriormente descrita, se recogieron 91 mg de producto peptídico con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 47%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 652,29, MH^{+} calculado 652,21).
Ejemplo de síntesis 21
Síntesis de H-Cys-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH_{2} (Compuesto 21)
Se oxidan 32 mg del péptido H-Cys-Gly-4Hyp-Pro-Tyr-Cys-NH_{2} disolviendo el péptido en 1,5 ml de ácido acético al 5% en agua y DMSO, 4:1 v/v, pH \sim 6. La mezcla se coloca en el refrigerador durante 6 días.
Tras la purificación usando HPLC de preparación, de la forma anteriormente descrita, se recogieron 6,13 mg de producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 3%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 652,23, MH^{+} calculado 652,21).
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Ejemplo de síntesis 22
Síntesis de péptido de H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-NH_{2} (Compuesto 22) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 47 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 94%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 30%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 576,26, MH^{+} calculado 576,26).
Ejemplo de síntesis 23
Síntesis de péptido de H-Gly-D-Ala-Gly-D-Hyp-D-Pro-D-Tyr-D-Asn-OH (Compuesto 23) sobre TentaGel-S-Ram; volumen Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 93,7 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 60,7 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 93%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 47,5%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 690,32, MH^{+} calculado 690,30).
Ejemplo de síntesis 24
Síntesis de Ac-D-Tyr(3,5-di-I)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 24)
Se disuelven 40,6 mg (64 \mumol) del péptido (Compuesto 2) en 10 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5 (solución A).
Se disuelven 75,6 mg de KI (400 \mumol) en 10 ml de tampón fosfato a pH 6,5 y se agregan 120 perlas de yodo (IODO-BEADS, N-cloro-bencenosulfonamida, capacidad oxidativa 0,55 \mumol/perla; PIERCE 28665ZZ), y se deja la solución a temperatura ambiente durante 10 min (solución B).
Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 15 min. El péptido yodado se aisló y purificó usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente. Se recogieron 39,5 mg de producto peptídico con una pureza superior a 90%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 870,09, MH^{+} calculado 870,08).
Ejemplo de síntesis 25
Síntesis de Ac-D-Tyr(mono-yodo)-D-Pro-D-Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 25)
Se disuelven 40,6 mg (64 \mumol) del péptido (Compuesto 2) en 10 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5 (solución A).
Se disuelven 75,6 mg de KI (400 \mumol) en 10 ml de tampón fosfato a pH 6,5 y se agregan 120 perlas de yodo (IODO-BEADS, N-cloro-bencenosulfonamida, capacidad oxidativa 0,55 \mumol/perla; PIERCE 28665ZZ), y se deja la solución a temperatura ambiente durante 10 min (solución B).
Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 15 min. El péptido yodado se aisló y purificó usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente. Se recogieron 3,3 mg de producto peptídico con una pureza superior a 90%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 744,19, MH^{+} calculado 744,18).
Ejemplo de síntesis 26
Síntesis de péptido de Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-(1,2^{13}C,^{15}N-Gly)-D-Ala-(1,2^{13}C,^{15}N-Gly-NH_{2} (Compuesto 26) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la D-tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N-terminal se acetiló con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 142,4 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 79,7 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 50%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 624,25, MH^{+} calculado 624,26).
Ejemplo de síntesis 27
Síntesis de péptido de H-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-Hyp-NH_{2} (Compuesto 27) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la prolina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 135,7 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 82,7%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 690,38, MH^{+} calculado 690,31).
Ejemplo de síntesis 28
Síntesis de péptido de H-Hyp-Pro-Tyr-Asn-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 28) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la 4-hidroxiprolina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 127 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 69,8%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 690,25, MH^{+} calculado 690,31).
Ejemplo de síntesis 29
Síntesis de péptido de H-Sar-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 29) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la sarcosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 150 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 85,5 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 93%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 57%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 604,33, MH^{+} calculado 604,30).
Ejemplo de síntesis 30
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Sar-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto 30) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 124 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 64,8 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 96%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 41,6%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 590,19, MH^{+} calculado 590,29).
Ejemplo de síntesis 31
Síntesis de péptido de ASAL-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 31) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la prolina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N-terminal se acetiló con ácido Azido-salicílico usando el procedimiento de acoplamiento convencional, como se ha descrito anteriormente. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 15,9 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 94%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 575,23, MH^{+} calculado 575,56).
Ejemplo de síntesis 32
Síntesis de péptido de ASAL(mono-yodo)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 32)
Se disuelven 10,3 mg del péptido (Compuesto 31) en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5 (solución A).
Se disuelven 18,9 mg de KI (100 \mumol) en 2,5 ml de tampón fosfato a pH 6,5 y se agregan 30 perlas de yodo (IODO-BEADS, N-cloro-bencenosulfonamida, capacidad oxidativa 0,55 \mumol/perla; PIERCE 28665ZZ), y se deja la solución a temperatura ambiente durante 10 min (solución B).
Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 1 hora. El péptido yodado se aisló y purificó usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente. Se recogieron 4,4 mg de producto peptídico con una pureza superior a 99%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 701,13, MH^{+} calculado 701,46).
Ejemplo de síntesis 33
Síntesis de péptido de AB-Tyr-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 33) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N-terminal se acetiló con ácido Azido-benzoico usando el procedimiento de acoplamiento convencional, como se ha descrito anteriormente. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 20,5 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 90%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 721,28, MH^{+} calculado 721,26).
Ejemplo de síntesis 34
Síntesis de péptido de AB-Tyr(3,5-di-yodo)-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 34)
Se disuelven 10,3 mg del péptido (Compuesto 33) en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5 (solución A).
Se disuelven 18,9 mg de KI (100 \mumol) en 2,5 ml de tampón fosfato a pH 6,5 y se agregan 30 perlas de yodo (IODO-BEADS, N-cloro-bencenosulfonamida, capacidad oxidativa 0,55 \mumol/perla; PIERCE 28665ZZ), y se deja la solución a temperatura ambiente durante 10 min (solución B).
Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 1 hora. El péptido yodado se aisló y purificó usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente. Se recogieron 1,2 mg de producto peptídico con una pureza superior a 90%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 973,08, MH^{+} calculado 973,46).
Ejemplo de síntesis 35
Síntesis de péptido de ciclo-(Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Gln) (Compuesto 35) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Glu(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 135,3 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 19,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 6,6%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 687,38; MH^{+} calculado, 687,32).
Ejemplo de síntesis 36
Síntesis de péptido de ciclo-(Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-Asn) (Compuesto 36) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 xx 15 ml, min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 63,4 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 13,2 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 97%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 6,2%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 673,38; MH^{+} calculado, 673,30).
Ejemplo de síntesis 37
Síntesis de péptido de ciclo-(Gly-Ala-Gly-Pro-Pro-Tyr-Asn) (Compuesto 37) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 85,1 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 9,8 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 3,5%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 657,38; MH^{+} calculado, 657,31).
Ejemplo de síntesis 38
Síntesis de ciclo-(Tyr(3,5-diyodo)-Pro-4Hyp-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 38)
Se disuelven 10,8 mg del péptido (Compuesto 3) en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5 (solución A).
Se disuelven 18,9 mg de KI (400 \mumol) en 2,5 ml de tampón fosfato a pH 6,5 y se agregan 30 perlas de yodo (IODO-BEADS, N-cloro-bencenosulfonamida, capacidad oxidativa 0,55 \mumol/perla; PIERCE 28665ZZ), y se deja la solución a temperatura ambiente durante 10 min (solución B).
Se combinan las soluciones A y B y se agitan suavemente durante 2 horas. El péptido yodado se aisló y purificó usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente. Se recogieron 9,8 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 925,10, MH^{+} calculado 925,30).
Ejemplo de síntesis 39
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH_{2} (Compuesto 39) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 124 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 26,5 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 96%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 20,5%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 480,24, MH^{+} calculado 480,50).
Ejemplo de síntesis 40
Síntesis de péptido de Ac-Gly-Asn-Tyr-NH_{2} (Compuesto 40) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la acilación del grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 90,4 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, de la forma anteriormente descrita, se recogieron 63,4 mg de producto peptídico con una pureza superior a 99%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 65,1.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 394,16, MH^{+} calculado 394,20).
Ejemplo de síntesis 41
Síntesis de péptido de H-Gly-Asn-Tyr-NH_{2} (Compuesto 41) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 91,4 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 62,1 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 54,5%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 352,16, MH^{+} calculado 352,18).
Ejemplo de síntesis 42
Síntesis de péptido de Ac-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH_{2} (Compuesto 42) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la alanina N-terminal. Después de la desprotección del grupo Fmoc, se acetiló el grupo amino N-terminal con anhídrido de ácido acético (1 ml, 10,5 mmol), junto con 100 \mul de piridina disueltos en 2 ml de DMF. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la acilación del grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 105 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, de la forma anteriormente descrita, se recogieron 52 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 45%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 465,22, MH^{+} calculado 465,30).
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Ejemplo de síntesis 43
Síntesis de péptido de H-Ala-Gly-Asn-Tyr-NH_{2} (Compuesto 43) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la alanina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 104,5 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 77,8 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 96%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 58,8%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 423,19, MH^{+} calculado 423,28).
Ejemplo de síntesis 44
Síntesis de péptido de ciclo-(Tyr-Ala-Ser-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 44) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 60,2 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 5,0 mg de producto peptídico con una pureza superior a 87%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 4,3%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 564,25, MH^{+} calculado 564,57).
Ejemplo de síntesis 45
Síntesis de péptido de ciclo-(Tyr-Gly-Asn-Tyr-Gly-Asn) (Compuesto 45) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 79,1 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 20 mg de producto peptídico con una pureza superior a 90%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 14%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 569,25, MH^{+} calculado 569,67).
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Ejemplo de síntesis 46
Síntesis de péptido ciclo-(Tyr-Gly-Asn-Tyr-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 46) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 58,9 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 15,9 mg de producto peptídico con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 11%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 740,31, MH^{+} calculado 740,75).
Ejemplo de síntesis 47
Síntesis de péptido ciclo-(Tyr-Val-Ser-Gly-Ala-Gly-Asn) (Compuesto 47) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel". El primer aminoácido Fmoc-Asp(OH)-O-All se conectó a la resina TentaGel-S-Ram a través del ácido carboxílico de cadena lateral, que terminará siendo amidado (Asn) finalmente, tras la escisión. Se siguió el procedimiento descrito bajo "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la tirosina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron por la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc y del grupo alilo (según el procedimiento anteriormente descrito), el péptido unido a la resina se cicló usando PyBop como reactivo de acoplamiento, como se ha descrito anteriormente y el acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez), y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de producto bruto, 54,1 mg. Después de la purificación usando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 19,6 mg de producto peptídico con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 15%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 649,10, MH^{+} calculado 649,68).
Ejemplo de síntesis 48
Síntesis de péptido de H-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-OH (Compuesto CE-1) sobre TentaGel-S-NH_{2}; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-NH_{2} seco (0,27 mmmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 16,9 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 92%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 10,1%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 471,22, MH^{+} calculado 471,21).
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Ejemplo de síntesis 49
Síntesis de péptido de H-Gly-Ala-Gly-Hyp-Pro-Tyr-NH_{2} (Compuesto CE-2) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la glicina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de la desprotección del grupo Fmoc y el grupo amino N-terminal, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 159 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 101 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 98%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 60%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 576,26, MH^{+} calculado 576,26).
Ejemplo de síntesis 50
Síntesis de péptido de 3-(4-hidroxifenil)-propionil-Pro-Hyp-Gly-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto CE-3) sobre TentaGel-S-Ram; polímero Rapp, Alemania
Se depositó TentaGel-S-Ram seco (0,23 mmol/g, 1 g) en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para la filtración, y se trató del modo descrito en "síntesis discontinua de péptidos sobre resina TentaGel" hasta finalizar el acoplamiento de la prolina N-terminal. Todos los acoplamientos se continuaron durante la noche. Después de la desprotección del grupo Fmoc, el grupo amino N-terminal se acetiló con ácido 3-(4-hidroxifenil)-propiónico, utilizando el procedimiento de acoplamiento convencional anteriormente descrito. El acoplamiento se continuó durante la noche. Se comprobaron las acilaciones por el ensayo de ninhidrina llevado a cabo a 80ºC, como se ha descrito anteriormente. Después de completar la síntesis, la resina con péptidos se lavó con DMF (3 x 15 ml, 1 min cada vez), DCM (3 x 15 ml, 1 min cada vez), éter dietílico (3 x 15 ml, 1 min cada vez) y se secó al
vacío.
El péptido se escindió de la resina de la forma anteriormente descrita y se liofilizó a partir de ácido acético. Rendimiento de material bruto, 143 mg. Tras la purificación utilizando HPLC de preparación, como se ha descrito anteriormente, se recogieron 73,7 mg de producto peptídico, con una pureza superior a 95%. El rendimiento total de producto peptídico purificado fue de 50%.
La identidad del péptido se confirmó por ES-MS (MH^{+} hallado 561,30, MH^{+} calculado 561,24).
Bibliografía
[1.] A. L. Waldo, A. J. Camm, H. deRuyter, P. L. Friedman, D. J. MacNeil, J. F. Pauls, B. Pitt, C. M. Pratt, P. J. Schwartz, E. P. Veltri, Lancet 1996, 348 7-12.
[2.] P. A. Guerrero, R. B. Schuessler, L. M. Davis, E. C. Beyer, C. M. Johnson, K. A. Yamada, J. E. Saffitz, J Clin Invest 1997, 99 1991-1998.
[3.] D. L. Lerner, K. A. Yamada, R. B. Schuessler, J. E. Saffitz, Circulation 2000, 101 547-552.
[4.] A. Hagendorff, B. Schumacher, S. Kirchhoff, B. Luderitz, K. Willecke, Circulation 1999, 99 1508-1515.
[5.] S. Kirchhoff, E. Nelles, A. Hagendorff, O. Kruger, O. Traub, K. Willecke, Curr Biol 1998, 8 299-302.
[6.] A. M. Simon, D. A. Goodenough, D. L. Paul, Curr Biol 1998, 8 295-298.
[7.] A. C. de Carvalho, M. O. Masuda, H. B. Tanowitz, M. Wittner, R. C. Goldenberg, D. C. Spray, J Cardiovasc Electrophysiol 1994, 5 686-698.
[8.] R. R. Kaprielian, M. Gunning, E. Dupont, M. N. Sheppard, S. M. Rothery, R. Underwood, D. J. Pennell, K. Fox, J. Pepper, P. A. Poole-Wilson, N. J. Severs, Circulation 1998, 97 651-660.
[9.] N. S. Peters, C. R. Green, P. A. Poole-Wilson, N. J. Severs, Circulation 1993, 88 864-875.
[10.] J. E. Saffitz, R. B. Schuessler, K. A. Yamada, Cardiovasc Res 1999, 42 309-317.
[11.] S. Aonuma, Y. Kohama, K. Akai, Y. Komiyama, S. Nakajima, M. Wakabayashi, T. Makino, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1980, 28 3332-3339.
[12.] S. Aonuma, Y. Kohama, K. Akai, S. Iwasaki, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1980, 28 3340-3346.
[13.] S. Aonuma, Y. Kohama, T. Makino, Y. Fujisawa, J Pharmacobiodyn 1982, 5 40-48.
[14.] M. A. Ronsberg, T. K. Saunders, P. S. Chan, P. Cervoni, Med Sci 86 A.D., 14 350-351.
[15.] M. Dikshit, R. Srivastava, B. Kundu, K. B. Mathur, K. Kar, Indian J Exp Biol 1988, 26 874-876.
[16.] Y. Kohama, N. Okimoto, T. Mimura, C. Fukaya, M. Watanabe, K. Yokoyama, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1987, 35 3928-3930.
[17.] Y. Kohama, S. Kuwahara, K. Yamamoto, M. Okabe, T. Mimura, C. Fukaya, M. Watanabe, K. Yokoyama, Chem Pharm Bull (Tokyo) 1988, 36 4597-4599.
[18.] S. Dhein, N. Manicone, A. Muller, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, C. Minke, W. Klaus, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1994, 350 174-184.
[19.] T. Argentieri, E. Cantor, J. R. Wiggins, Experientia 1989, 45 737-738.
[20.] A. Muller, M. Gottwald, T. Tudyka W. Linke, W. Klaus, S. Dhein, Eur J Pharmacol 1997, 327 65-72.
[21.] R. Grover, S. Dhein, Peptides 1998, 19 1725-1729.
[22.] S. Dhein, T. Tudyka, Drugs 1995, 49 851-855.
[23.] C. S. Kuo, K. Munakata, C. P. Reddy, B. Surawicz, Circulation 1983, 67 1356-1367.
[24.] S. Dhein, K. Krusemann, T. Schaefer, Br J Pharmacol 1999, 128 1375-1384.
[25.] N. S. Peters, J. Coromilas, N. J. Severs, A. L. Wit, Circulation 1997, 95 988-996.
[26.] D. W. Liu, C. Antzelevitch, Circ Res 1995, 76 351-365.
[27.] Kanagaratnam, P., Severs, N. J., and Peters, N. S. The Relationship between Conduction, Activation pattern and Quantity of Immunoreactive Connexin in Chronic Human Atrial Fibrillation. Circulation 102[18], II-485. 2000. Ref Type: Abstract
[28.] J. M. Pastore, D. S. Rosenbaum, Circulation Research 2000, 87 1157-1163.
[29.] R. D. Berger, Circulation Research 2000, 87 1083-1084.
[30.] J. E. Saffitz, K. A. Yamada, Circulation 1998, 97 630-632.
[31.] Gutstein, D. E., Morley, G. E., Tamaddon, Houman S., Vaidya, D., Schneider, M. D., Chen, J., Chien, K. R., Stuhlmann, H., and Fishman, G. I. Genetic Manipulation of Connexin43 Expression in the Heart: Establishing a Role for Gap Junction Remodeling in Arrhythmogenesis and Ventricular Dysfunction. Circulation 102[18], 11-15. 2001. Ref Type: Abstract
[32.] A. Muller, T. Schaefer, W. Linke, T. Tudyka, M. Gottwald, W. Klaus, S. Dhein, Naunyn Schmiedebergs Arch .Pharmacol. 1997, 356 76-82.
[33.] S. Dhein, R. Grover, A. Muller, M. Lauven, P. Poeppel, T. Schaefer, Circulation 1999, 100 I-426.
[34] Koenig, J. I. Radioligand binding in intact cells. Keen, M. [106], 89-98. 1999 Tótowa, NJ, Humana Press Inc. Methods in Molecular Biology. Ref Type: Serial (Book,Moiloraph)
[35.] K. Wassermann, K. Molgaard, E. Steiness, Cancer Chemother. Pharmacol. 1985, 15 244-252.
[36.] E. Meier, K. Frederiksen. M. Nielsen, H. L. Lembol, H. Pedersen, J. Hyttel, Drug Development Research 1997, 40 1-16.
[37.] J. J. Lynch, R. G. Rahwan, D. T. Witiak, J Cardiovasc. Pharmacol. 1981, 3 49-60.
[38.] M. Zabel, S. H. Hohnloser, S. Behrens, R. L. Woosley, M. R. Franz, J Cardiovasc Electrophysiol 1997, 8 1239-1245.
[39.] S. Dhein, N. Manicone, A. Muller, R. Gerwin, U. Ziskoven, A. Irankhahi, C. Minke, W. Klaus, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 1994, 350 174-184.
[40.] X. D. Huang, G. E. Sandusky, D. P. Zipes, J Cardiovasc. Electrophysiol. 1999, 10 79-91.
[41.] D. Xing, J. B. Martins, Am J Physlol Heart Circ. Physiol 2001, 280 H684-H692.
[42.] F. Shapiro, Calcif Tissue Int 1997, 61 285-293.
[43.] R. Civitelli, E. C. Beyer, P. M. Wariow, A. J. Robertson, S. T. Geist, T. H. Steinberg, J. Clin. Invest. 1993, 91 1888-1896.
[44.] T. H. Steinberg, R. Civitelli, S. T. Geist, A. J. Robertson, E. Hick, R. D. Veenstra, H. Z. Wang, P. M. Warlow, E. M. Westphale, J. G. Laing, a. et, EMBO J. 1994, 13 744-750.
[45.] H. Chiba, N. Sawada, M. Oyamada, T. Kojima, S. Nomura, S. Ishii, M. Mori, Cell Struct. Funct. 1993, 18 419-426.
[46.] F. Lecanda, D. A. Towler, K. Ziambaras, S. L. Cheng, M. Koval, T. H. Steinberg, R. Civitelli, Mol Biol Cell 1998, 9 2249-2258.
[47.] F. Lecanda, P. M. Warlow, S. Sheikh, F. Furlan, T. H. Steinberg, R. Civitelli, J. Cell Biol. 2000, 151 931-943.
[48.] N. R. Jorgensen, S. T. Geist, R. Civitelli, T. H. Steinberg, J. Cell Biol. 1997, 139 497-506.
[49.] N. R. Jorgensen, Z. Henriksen, C. Brot, E. F. Eriksen, O. H. Sorensen, R. Civitelli, T. H. Steinberg, J Bone Miner. Res. 2000, 15 1024-1032.
[50.] A. Clairmont, D. Tessman, A. Stock, S. Nicolai, W. Stahl, H. Sies, Carcinogenesis 1996, 17 1389-1391.
[51.] M. A. Van der Molen, C. T. Rubin, K. J. McLeod, L K. McCauley, H. J. Donahue, J. Biol. Chem. 1996, 271 12165-12171.
[52.] R. Civitelli, K. Ziambaras, P. M. Warlow, F. Lecanda, T. Nelson, J. Harley, N. Atal, E. C. Beyer, T. H. Steinberg, J. Cell Biochem. 1998, 68 8-21.
[53.] P. D'Andrea, A. Calabrese, I. Capozzi, M. Grandolfo, R. Tonon, F. Vittur, Biorheology 2000, 37 75-83.
[54.] P. D'Andrea, F. Vittur, Cell Calcium 1996, 20 389-397.
[55.] S. Loty, C. Foil, N. Forest, J. Sautier, Arch. Oral Biol. 2000, 45 843-856.
[56.] N. Cirenei, B. M. Colombo, M. Mesnil, S. Benedetti, H. Yamasaki, G. Finocchiaro, Gene Ther. 1998, 5 1221-1226.
[57.] O. Moennikes, A. Buchmann, K. Willecke, O. Traub, M. Schwarz, Hepatology 2000, 32 501-506.
[58.] O. Moennikes, A. Buchmann, A. Romualdi, T. Ott, J. Werringloer, K. Willecke, M. Schwarz, Cancer Res. 2000, 60 5087-5091.
[59.] L. Zhou, E. M. Kasperek, B. J. Nicholson, J Cell Biol. 1999, 144 1033-1045.
[60.] D. W. Laird, P. Fistouris, G. Batist, L. Alpert, H. T. Huynh, G. D. Carystinos, M. A. Alaoui-Jamali, Cancer Res. 1999, 59 4104-4110.
[61.] T. Shibata, H. Nagayasu, J. Hamada, S. Konaka, M. Hosokawa, T. Kawano, H. Kitajo, M. Arisue, Tumour. Biol. 2000, 21 299-308.
[62] X. Guan, R. J. Ruch, Carcinogenesis 1996, 17 1791-1798.
[63.] R. J. Ruch, W. J. Bonney, K. Sigler, X. Guan, D. Matesic, L. D. Schafer, E. Dupont, J. E. Trosko, Carcinogenesis 1994, 15 301-306.
[64.] B. V. Madhukar, H. L. Feijter-Rupp, J. E. Trosko, Cancer Lett. 1996, 106 117-123.
[65] W. K. Hong, M. B. Spom, Science 1997, 278 1073-1077.
[66.] K. M. Abdullah, G. Luthra, J. J. Bilski, S. A. Abdullah, L. P. Reynolds, D. A. Redmer, A. T. Grazul-Bilska, Endocrine. 1999, 10 35-41.
[67.] M. Saitoh, M. Oyamada, Y. Oyamada, T. Kaku, M. Mori, Carcinogenesis 1997, 18 1319-1328.
[68.] J. A. Goliger, D. L. Paul, Mol. Biol. Cell 1995, 6 1491-1501.
[69.] T. Mine, R. Kushima, T. Fujita, J Clin. Gastroenterol. 1997, 25 Suppl 1 S111-S115.
[70.] T. Mine, H. Yusuda, A. Kataoka, A. Tajima, J. Nagasawa, T. Takano, J Clin. Gastroenterol. 1995, 21 Suppl 1 S104-S107.
[71.] G. J. Christ, P. R. Brik, Braz. J Med Biol. Res. 2000, 33 423-429.
[72.] B. R. Berg, K. D. Cohen, I. H. Sarelius, Am J Physiol 1997, 272 H2693-H2700.
[73.] C. de Wit, F. Roos, S. S. Bolz, S. Kirchhoff, O. Kruger, K. Willecke, U. Pohl, Circulation Research 2000, 86 649-655.
[74.] B. Nafz, J. Stegemann, M. H. Bestle, N. Richter, E. Seeliger, I. Schimke, H. W. Reinhardt, P. B. Persson, Circulation 2000, 101 553-557.
[75.] H. Q. Xie, V. W. Hu, Exp. Cell Res. 1994, 214 172-176.
[76.] R. Dermietzel, Brain Res Brain Res Rev 1998, 26 176-183.
[77.] R. Rozental, M. Srinivas, S. Gokhan, M. Urban, R. Dermietzel, J. A. Kessler, D. C. Spray, M. F. Mehler, Brain Res. Brain Res. Rev. 2000, 32 57-71.
[78.] H. Aldskogius, E. N. Kozlova, Prog. Neurobiol. 1998, 55 1-26.
[79.] J. D. Pal, X. Liu, D. Mackay, A. Shiels, V. M. Berthoud, E. C. Beyer, L. Ebihara, Am J Physiol Cell Physiol 2000, 279 C596-C602.
[80.] V. Krutovskikh, H. Yamasaki, Mutat. Res. 2000, 462 197-207.
[81.] D. Mackay, A. Ionides, Z. Kibar, G. Rouleau, V. Berry, A. Moore, A. Shiels, S. Bhattacharya, Am J Hum. Genet. 1999, 64 1357-1364.
[82.] K. Nakamura, Y. Shibata, Cells Tissues. Organs 1999, 165 16-21.
[83.] L. Nemeth, S. Maddur, P. Puri, J Pediatr. Surg. 2000, 35 823-828.
[84.] A. M. Simon, D. A. Goodenough, E. U, D. L. Paul, Nature 1997, 385 525-529.
[85.] B. Sommersberg, A. Bulling, U. Salzer, U. Frohlich, R. E. Garfield, A. Amsterdam, A. Mayerhofer, Biol. Reprod. 2000, 63 1661-1668.
[86.]1. Granot, N. Dekel, Hum. Reprod. 1998, 13 Suppl 4 85-97.
[87.] W. M. Kilarski, E. Dupont, S. Coppen, H. I. Yeh, C. Vozzi, R. G. Gourdie, M. Rezapour, U. Ulmsten, G. M. Roomans, N. J. Severs, Eur. J Cell Biol. 1998, 75 1-8.
[88.] H. N. Ciray, X. Fu, M. Olovsson, G. Ahlsen, C. Shuman, B. Lindblom, U. Ulmsten, Am J Obstet. Gynecol. 2000, 182 926-930.
[89.] C. Batias, N. Defamie, A. Lablack, D. Thepot, P. Fenichel, D. Segretain, G. Pointis, Cell Tissue Res. 1999, 298 113-121.
[90.] E. Schleiermacher, Hum. Genet. 1980, 54 391-404.
[91.] C. Vozzi, S. Ulirich, A. Charollais, J. Philippe, L. Orci, P. Meda, J Cell Biol. 1995, 131 1561-1572.
[92.] P. Meda, M. Chanson, M. Pepper, E. Giordano, D. Bosco, O. Traub, K. Willecke, A. el Aoumari, D. Gros, E. C. Beyer, Exp. Cell Res. 1991, 192 469-480.
[93.] K. Ziambaras, F. Lecanda, T. H. Steinberg, R. Civitelli, J. Bone Miner. Res. 1998, 13 218-228.
[94.] I. Capozzi, R. Tonon, P. D'Andrea, Biochem J 1999, 344 Pt 2 545-553.
[95.] S. G. Spanakis, S. Petridou, S. K. Masur, Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1998, 39 1320-1328.
[96.] H. Yamasaki, V. Krutovskikh, M. Mesnil, T. Tanaka, D. M. Zaidan, Y. Omori, C. R. Acad. Sci. III. 1999, 322 151-159.
[97.] B. D. Larsen, A. Holm, Int. J Pept. Protein Res. 1994, 43 1-9.

Claims (12)

1. Un compuesto que tiene la fórmula I: X-(Y')_{b}-(Px)_{2}-G'-A-(G')_{a}-R_{7} en la que todos los residuos aminoácidos son, de manera independiente, formas D y en la que
X representa H o Ac;
G' representa un residuo de glicina o Sar;
A representa alanina;
Px representa un residuo aminoácido de la fórmula II
8
en la que n es un número entero que tiene el valor de 3, 4 ó 5, y R representa un sustituyente opcional,
Y' representa tirosina o fenilalanina opcionalmente sustituida en el anillo fenilo con halógeno o hidroxi;
a y b son, independientemente, 0 ó 1;
R_{7} representa OH, NH_{2}, NHNH_{2}-Asn-NH_{2} o Gln-NH_{2}; y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Un compuesto según la reivindicación 1 en el que Px representa el residuo aminoácido de 3Hyp, 4Hyp o Pro.
3. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionado del grupo consistente en
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-OH,
Ac-D-Tyr-D-Pro-D-4Hyp-Gly-D-Ala-Gly-NH_{2} (Compuesto 2)
y sus sales farmacéuticamente aceptables.
4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
5. Una composición según la reivindicación 4, que es una preparación para inyección.
6. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de arritmias.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que dicha arritmia es fibrilación auricular, fibrilación ventricular o bloqueo AV.
8. Uso según la reivindicación 6, en el que la arritmia es bradiarritmia.
9. Uso según la reivindicación 7, en el que la arritmia es taquiarritmia.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que la taquiarritmia es taquicardia ventricular.
11. Uso de un compuesto, según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la contractilidad reducida.
12. Uso de un compuesto, según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de pacientes con alternancia de onda T.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7250397B2 (en) 2000-02-23 2007-07-31 Zealand Pharma A/S Antiarrhythmic peptides
US7585839B2 (en) 2000-02-23 2009-09-08 Zealand Pharma A/S Medical uses of intercellular communication facilitating compounds
JP2005506295A (ja) * 2001-02-22 2005-03-03 ジーランド ファーマ アクティーゼルスカブ 細胞間連絡促進化合物の新規医薬使用
EA006860B1 (ru) 2002-01-29 2006-04-28 Уайт Композиции и способы модулирования гемиканалов коннексина
WO2004048400A1 (en) * 2002-11-25 2004-06-10 Zealand Pharma A/S Peptide gap junction modulators
US7405210B2 (en) 2003-05-21 2008-07-29 Osi Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolopyridine-2-carboxylic acid amide inhibitors of glycogen phosphorylase
DE602005023965D1 (de) 2004-03-08 2010-11-18 Prosidion Ltd Pyrrolopyridin-2-carbonsäurehydrazide als inhibitoren von glykogenphosphorylase
GB0514071D0 (en) 2005-07-07 2005-08-17 Zealand Pharma As N- or C- terminally modified small peptides
AU2006332945C1 (en) 2005-12-23 2013-02-28 Wyeth Modified lysine-mimetic compounds
EP2074087A2 (en) 2006-12-21 2009-07-01 Wyeth Synthesis of pyrrolidine compounds
EP2260859A1 (en) * 2009-06-12 2010-12-15 Zealand Pharma A/S Compounds acting as peptide gap junction modulators and their uses
CN104603146B (zh) 2012-09-29 2018-01-02 诺华股份有限公司 环肽类化合物及其作为药物的用途
CN103113456B (zh) * 2013-03-05 2014-07-16 中国药科大学 具有抗血小板聚集活性的僵蚕多肽及其制备方法和应用
DK3618847T3 (da) 2017-05-05 2021-05-25 Boston Medical Ct Corp GAP-junction-modulatorer af intercellulær kommunikation og deres anvendelse til behandling af diabetisk øjensygdom

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6259296A (ja) * 1985-09-10 1987-03-14 Green Cross Corp:The ペプタイド誘導体
DE19500990A1 (de) * 1995-01-14 1996-07-18 Stefan Dr Med Dhein Neues Peptid, seine Herstellung und Verwendung
DE19707854A1 (de) * 1997-02-27 1998-09-03 Dhein Stefan Priv Doz Dr Med Neue Cyclopeptide, deren Herstellung und Verwendung

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