JP2010533690A - ペプチドギャップ結合モジュレーター - Google Patents
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Abstract
Description
orylation of Connexin 43 by v-Src is Mediated by SH2 and SH3 Domain Interactions」、J. Biol. Chem.、272(36):22824〜22831頁、(1997);Lampeら、「Phosphorylation of Connexin43 on Serine368 by Protein Kinase C Regulates Gap Junctional Communication」、J. Cell Biol.、149(7):1503〜1512頁、(2000);Lauら、「Regulation of Connexin43 Function by Activated Tyrosine Protein Kinases」、J. Bioenerg. Biomembr.、28(4):359〜368頁、(1996);Shinら、「The Regulatory Role of the C-Terminal Domain of Connexin43」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):271-275 (2001);TenBroekら、「Ser364 of Connexin43 and the Upregulation of Gap Junction Assembly by cAMP」、J. Cell Biol.、155(7):1307〜1318頁、(2001))、非触媒タンパク質のリガンド(Giepmans & Moolenaar、「The Gap Junction Protein Connexin43 Interacts with the Second PDZ Domain of the Zona Occludens-1 Protein」、Curr. Biol.、8(16):931〜934頁、(1998);Giepmansら、「Connexin-43 Interactions with ZO-1 and Alpha- and Beta-tubulin」、Cell Commun. Adhes.、8(4-6):219〜223頁、(2001);Toyofukuら、「Direct Association of the Gap Junction Protein Connexin-43 with ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、273(21):12725〜12731頁、(1998);Toyofukuら、「c-Src Regulates the Interaction between Connexin-43 and ZO-1 in Cardiac Myocytes」、J. Biol. Chem.、276(3):1780〜1788頁、(2000);Zhouら、「Dissection of the Molecular Basis of pp60(v-Src) Induced Gating of Connexin 43 Gap Junction Channels」、J. Cell Biol.、144(5):1033〜1045頁、(1999);Aiら、「Wnt-1 Regulation of Connexin43 in Cardiac Myocytes」、J. Clin. Invest.、105(2):161〜171頁、(2000);Xuら、「N-Cadherin and Cx43[alpha]1 Gap Junctions Modulates Mouse Neural Crest Cell Motility Via Distinct Pathways」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):321〜324頁、(2001);Schubertら、「Connexin Family Members Target to Lipid Raft Domains and Interact with Caveolin-1」、Biochem.、41(18):5754〜5764頁、(2002))、および細胞間のカップリングを調節するゲート開閉粒子(Duffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002);Morenoら、「Role of the Carboxyl Terminal of Connexin43 in Transjunctional Fast Voltage Gating」、Circ. Res. 90(4):450〜457頁、(2002)、92(1):e30 (2003) (erratum);Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996);Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001))として働くCTドメインである。
式I:
R1-Z-(L-R)p-R2
[式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、あるいは欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5である]。
式II:
R1-Z-L-Q-R2
式中、Z、L、Q、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
式III:
R1-Z-R2
式中、Z、R1、およびR2は、式Iで定義した通りである。
A1は、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2は、Lys、Arg、または(2S4R)Amp(Ac)であり、
A3は、A4が欠失している場合は、Lys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、AsnまたはGlnであり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している。
A1およびA5は、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6は、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7は、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8は、同じアミノ酸または共に欠失している。
Ac-Lys-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-ArgAsn-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Tyr-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-His-NH2
Ac(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Trp-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Phe-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Ile-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)Asn-Met-NH2
Ac-(D-Arg)-(DArg)-Asn-Val-NH2
Ac-(D-Arg)-(D-Arg)-Asn-Leu-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Arg-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Lys-NH2
Ac-Tyr-Asn-Lys-Lys-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Arg)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Arg)-(D-Lys)-NH2
Ac-(D-Tyr)-(D-Asn)-(D-Lys)-(D-Lys)-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Phe-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-His-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Trp-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Val-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Leu-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Ile-NH2
Ac-Lys-Lys-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-His-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Trp-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Ile-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Val-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Leu-NH2
Ac-Arg-Arg-Gln-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Phe-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Tyr-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-His-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Trp-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Val-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Leu-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Ile-NH2
Ac-Amp-Amp-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Phe-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-His-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Trp-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Val-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Leu-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Ile-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Met-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Phe-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-His-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Trp-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Val-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Leu-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Ile-NH2
Ac-Lys-Arg-Asn-Met-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Lys(4-ヒドロキシベンゾイル)-Arg-Arg-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(4-ヒドロキシベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(ベンジル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(ベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn(CONH-(α-メチルナフチル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Lys(NH(α-ナフトイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-ArgArg-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Damba(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Orn(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dab(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Daa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-(4S-Amoa)(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Arg-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
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Ac-Lys-Arg-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
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Ac-Arg-Lys-Dapa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
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Ac-Arg-Lys-Amp(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
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Ac-Arg-Lys-Phe(4-NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ameg(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-pmGly(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Ica(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Arg-Lys-Apa(NH(4-ヒドロキシベンゾイル))-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Arg-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Lys-Asn-Tyr-Lys-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Lys-Lys-Asn-Tyr-NH2
Ac-Lys-Lys-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
が挙げられる。
特段の記載がない限り、以下の定義は、以下の記載に使用する特定の用語についてのものである。
R1-Z-R2については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-A5A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-A2-A3-A4-L-LM(NH2)-A6-A7-A8-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-A3-A4-L-LM(NH2)-LM(NH2)-A7-A8-R2
R1-A1-LM(NH2)-A3-A4-L-A5-LM(NH2)-A7-A8-R2
R1-Z-R2については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-A2-LM(NH-B)-R2
R1-LM-LM-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM-LM(NH-B)-R2
R2-Z-L-Q-R1については:
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-A1-A2-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-A2-LM(NH-B)-L-A5-A6-LM(NH-B)-R2
R1-A1-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-A6-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-A5-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
R1-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-L-LM(NH2)-LM(NH2)-LM(NH-B)-R2
等
R1-A4-A3-A2-A1-R1
R1-A4-A3-LM(NH2)-LM(NH2)-R2
R1-LM(NH-B)-A2-A1-R2
本明細書の定義に用いる炭素数(例えば、C1〜10アルキル、C2〜10アルケニル、C2〜10アルキニル、C6〜20アリールなど)は、炭素主鎖および炭素側鎖についてであり、置換基の炭素原子は含まない。
一態様では、本発明は、GJICの障害に関連した状態を有するまたは発症するリスクのある患者に、上記したいずれかのペプチドを治療に有効な量投与する方法を提供する。本発明によるペプチドを用いて治療できる患者として、動物、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター、およびラビットなどのウサギを含む)、イヌ、ブタ、ヤギ(一般なあらゆる家畜)、および霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な一態様では、患者はヒトである。
好適な一態様では、本発明は、心血管疾患、例えば、急性虚血性心疾患(例えば、安定狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞)、うっ血性心不全(例えば、収縮期心不全、弛緩期心不全、高心拍出量性心不全、低拍出量性心不全、右心不全、または左心不全)、先天心疾患、肺性心、心筋症、心筋炎、高血圧性心疾患、および冠動脈血管再生などの際に起こる不整脈および血栓合併症の治療用の薬学的に活性な抗不整脈ペプチドおよびその使用法を提供する。
GJICが骨の形成に重要であることは理解されている。さらに好ましいペプチドは、これに加えてまたは別法として、このようなペプチドの存在下での骨芽細胞のカルシウム波形成および/またはアルカリホスファターゼ活性を測定する「標準的な骨芽細胞活性アッセイ」と本明細書で呼ぶ骨芽細胞活性を増大させる。好ましくは、このようなペプチドは、波に関連した細胞数(fura-2などのカルシウム感受性蛍光染料を用いて細胞内Ca2+のレベルを測定し、蛍光を発した細胞を計数して決定する)の増加として示されるカルシウム波活性を増大させた。アルカリホスファターゼ活性を用いても、標準的な比色アッセイによって骨芽細胞活性の測定を行うことができる。
さらに別の態様では、本発明によるペプチドは癌の治療に用いられる。発癌は、成長因子、発現遺伝子、および癌抑制遺伝子が関与する成長制御機構の進行性の障害を特徴とする。発癌および腫瘍形成における一般的なテーマは、GJICの下方制御である。色素移動アッセイを用いた腫瘍細胞におけるギャップ結合の透過性は、通常は、周囲組織におけるGJICよりも低い。さらに、ギャップ結合のゲート開閉は、GJICを減少させる腫瘍プロモーターによる影響を受けることが知られている。したがって、一態様では、本発明によるペプチドは、単独または従来の抗癌療法と組み合わせて、癌の治療薬として用いられる。
さらなる態様では、本発明によるペプチドは、創傷の治療、特に創傷の治癒を早めるために用いられる。創傷の治癒には、多数種の細胞の相互作用が関与し、ギャップ結合によって仲介される細胞間コミュニケーションは、組織の修復および再生に関与する細胞の成長および発達の際の細胞の代謝の調整に重要な役割を果たすと考えられている(K. M. Abdullahら、(1999)、Endocrine、10 35〜41頁;M. Saitohら、(1997)、Carcinogenesis、18:1319〜1328頁;J. A. Goligerら、(1995)、Mol.Biol.Cell、6 1491〜1501頁)。ペプチドは、当分野で周知の担体(例えば、軟膏やクリームなど)を用いて局所投与によって創傷部位に投与するか、または、例えば、慢性胃潰瘍病変の治療などのように内部組織の創傷の治療のために全身投与することができる。
Cx43からなるギャップ結合チャネルは、膵島のグルコース感受性細胞とラット膵島細胞腺腫細胞系のグルコース感受性細胞を機能的に結合する[91]。対照的に、インスリンを異常に分泌しているいくつかの細胞系の細胞は、Cx43を発現せず、ギャップ結合がほとんどなく、カップリングが弱い。Cx43 cDNAの安定したトランスフェクションによるこれらの障害の修正後、適度なレベルでCx43を発現し、Cx43をカップリングする細胞は、天然β-細胞で観察されているように、野生型(カップリングしていない)細胞およびCx43を過剰発現しているトランスフェクト細胞の両方で観察されたものと比較すると著しく高いインスリン遺伝子およびインスリン量の発現を示す。これらの発見は、十分なCx43のカップリングが、適切なインスリンの産生および貯蔵に必要であることを示している[91]。さらに、グリベンクラミドによるインスリン放出のin vivo刺激は、Cx43の発現の上昇および膵島内の近接するβ-細胞間の細胞と細胞のカップリングの上昇に関連している。
乾癬は、慢性皮膚疾患である。組織学的に、乾癬は、表皮の過剰増殖、伸びた顕著な血管、および厚い血管周囲のリンパ球浸潤を特徴とする。乾癬は、現在は、自己免疫疾患とみなされている。この疾患は、すべての年齢群で発症するが、主に成人が発症する。乾癬は、男性と女性で同等のようである。乾癬は、皮膚細胞が皮膚表面の下側のそれらの起源から急速に増大する際に生じ、皮膚細胞が成熟する機会を得る前に皮膚表面に積み重なる。通常は、この変化(代謝回転とも呼ぶ)には約1カ月かかるが、乾癬では、この変化が僅か2、3日で起こる。その典型的な形態では、乾癬は、銀白色の鱗屑で覆われた厚くて赤い(炎症)のパッチ状の皮膚になる。時にプラークとも呼ばれるこのようなパッチ状の皮膚は、通常は痒みまたは痛みを伴う。パッチ状の皮膚は、肘、膝、脚の他の部分、頭皮、腰、顔面、掌、および足の裏などにできるが、体のどの皮膚にも出現しうる。乾癬は、体表の5%未満にできた場合は軽度、5〜30%の場合は中程度、30%を超える場合は重度とみなされる。乾癬は、通常は、頭皮および四肢の伸筋表面、特に肘や膝に出現する。
本発明はまた、薬学的に許容される担体および/または希釈剤と組み合わせた、上記のペプチドの1種または複数種を含む医薬組成物にも関する。投与のための製剤は、当業者に公知の方法、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第17版、Alfonso R. Gennaro編集、Mark Publishing Company、Easton, PA, U.S.A.、1985年およびこの最新版、ならびに研究書「Drugs and the Pharmaceutical Sciences」シリーズ、Marcel Dekkerに一般に記載されているように調製することができる。
以下に記載する実施例を用いて本発明をさらに例示する。以降に記載するものは単なる例であり、本発明の範囲内に収まったまま、細部の変更が可能であることを理解されたい。
ペプチド合成
すべてのペプチドは、固相法または液相法のいずれかによって合成した。しかしながら、固相ペプチド合成のより詳細な説明が、参照によりその全容が本明細書に組み込まれる国際公開第98/11125号パンフレットおよび国際公開第2007/078990号パンフレットに記載されている。
装置および合成法
N-α-アミノ酸の保護基として9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)および側鎖の官能基のための適当な一般的保護基を用いて、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器で、ペプチドをバッチ式に合成した。
溶媒DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen、Germany)を、強力なカチオン交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H強酸、Bayer AG Leverkusen、Germany)が充填されたカラムに通して精製し、使用の前に、遊離アミンが存在する場合は黄色(Dhbt-O‐アニオン)に変化する3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)の添加により遊離アミンについて分析した。溶媒DCM(分析用ジクロロメタン、Riedel de-Haen、Germany)は、精製しないで直接用いた。アセトニトリル(HPLC用、Lab-Scan、Dublin Ireland)は、精製しないで直接用いた。
Fmoc-保護アミノ酸は、適当な側鎖保護形態でAdvanced ChemTech (ACT)から購入した。他の方法で保護されたアミノ酸(Boc-Asp(OFm)-OH、Boc-D-Asp(OFm)-OH、Fmoc-Lys(Aloc)-OH、Fmoc-D-Lys(Aloc)-OH、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Boc-D-Lys(Fmoc)-OH、Boc-Orn(Fmoc)-OHは、Bachem (Switzerland)から購入し、Fmoc-Lys(ivDde)-OH、Fmoc-Sar-OHは、NovaBiochem (Switzerland)から購入した。
安息香酸およびベンジルアミン誘導体は、Aldrichから購入し、さらに精製することなく使用した。
カップリング試薬ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は、(Riedel de-Haen、Germany)から購入し、PyBopは、Advanced ChemTechから購入した。
(4-ヒドロキシメチルフェノキシ)酢酸(HMPA)は、スイス国のNovabiochemから購入し、DICによって生成した予備形成1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)エステルとして樹脂に結合させた。
ペプチドを、TentaGel S樹脂0.22〜0.31mmol/g(TentaGel-S-NH2;TentaGel-S-Ram、Rapp polymere、Germany)上で、Fmoc法によって合成した。
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)は、ドイツ国のAldrichから、エチレンジアミンは、Flukaから、ピペリジンおよびピリジンは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから、4-(N,N-ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)は、スイス国のFlukaから購入し、対称無水物を用いるカップリング反応の触媒として用いた。エタンジチオールは、独国フランクフルトのRiedel de-Haenから購入し、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(HOAt)は、スイス国のFlukaから入手した。
適切なn-α-保護アミノ酸から生成し、DMFに溶解した対称無水物として、第1のアミノ酸をカップリングさせることができる。次いで、得られたアミノ酸を、DMFに溶解したDICによって適切なn-α-保護アミノ酸およびHOBtまたはHOAtから作製したin situ生成HOBtまたはHOAtエステルとしてカップリングさせることができる。試験中のFmoc脱保護を防止するために、80℃でニンヒドリン試験を行ってアシル化をチェックした(B.D.Larsen、A.Holm、Int.J Pept.Protein Res.1994、43 1〜9頁)。
Fmoc基の脱保護は、DMFに溶解した20%ピペリジンによって処理(1×5分および1×10分)し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄(5×15ml、各5分)して行った。
15〜20mlのCHCl3、AcOH、NMM(37:2:1)に溶解させた3当量のPd(PPh3)4溶液をペプチド樹脂に加えた。この処理は、この混合物にN2流をバブリングして室温で3時間続けた。
3当量のN-α-アミノ保護アミノ酸を、3当量のHOBtおよび3当量のDICと共にDMFに溶解してから、この樹脂に加えた。
6当量のN-α-アミノ保護アミノ酸をDCMに溶解して0℃に冷却した。DIC(3当量)を加え、反応を10分間続けた。溶媒を減圧除去し、残留物をDMFに溶解した。この溶液を直ちに樹脂に加え、次いで0.1当量のDMAPを加えた。
95%のトリフルオロ酢酸(TFA、Riedel de-Haen、Frankfurt, Germany)-水v/vまたは95%TFAと5%エタンジチオールv/vで、室温で2時間処理して、ペプチドを樹脂から切断した。濾過した樹脂を95%TFA-水で洗浄し、減圧下で濾液および洗浄液を蒸発させた。残渣をエーテルで洗浄し、酢酸-水から凍結乾燥させた。粗製凍結乾燥産物を、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析し、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESMS)によって同定した。
TentaGel樹脂(1g、0.22〜0.31mmol/g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れた。この樹脂をDMF(15ml)中で膨潤させ、DMFに溶解した20%ピペリジンで処理して、樹脂上の非プロトン化アミノ基の存在を保証した。この樹脂を排出し、排出されたDMFにDhbt-OHを添加した後、黄色が検出できなくなるまでDMFで洗浄した。HMPA(3当量)を、上記のように予備形成HOBt-エステルとしてカップリングさせ、このカップリングを24時間続けた。樹脂を排出し、DMFで洗浄し(5×5ml、各5分)、ニンヒドリン試験によってアシル化をチェックした。第1のアミノ酸を、上記したように予備形成対称無水物としてカップリングさせた。配列にしたがって続くアミノ酸を、上記したように予備形成Fmoc保護HOBtエステル(3当量)としてカップリングさせた。特定の定めがない限り、このカップリングを2時間続けた。余分な試薬を除去するために、樹脂を排出して、DMFで洗浄した(5×15ml、各5分)。すべてのアシル化を、80℃でニンヒドリン試験を行ってチェックした。合成の完了後、ペプチド-樹脂を、DMF(3×15ml、各5分)、DCM(3×15ml、各1分)、および最後にジエチルエーテル(3×15ml、各1分)で洗浄し、減圧乾燥した。
分取クロマトグラフィーを、AFC2000自動フラクションコレクター/オートサンプラーを備えたVISION Workstation(PerSeptive Biosystem)を用いて行った。VISION-3ソフトウェアを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
Kromasil(EKA Chemicals)KR100-10-C8 100Å、C-8、10μm;CER2230、250×50.8mmまたはVYDAC218TP101550、300Å、C-18、10〜15μm、250×50mm。使用した緩衝液系は、A:MQVに溶解した0.1%TFA、B:0.085%TFA、10%MQV、90%MeCNを含んでいた。流速は、35〜40ml/分とし、カラム温度は、25℃とした。UV検出は、215nmおよび280nmで行った。適した勾配を、個々のペプチドに対して最適化した。
勾配HPLC分析を、HP 1100クォターナリポンプ(Quaternary Pump)、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタット、およびHP 1100多波長検出器からなるHewlett Packard HP 1100 HPLCシステムを用いて行った。LCソフトウェア(A.06.01改訂版)用のHewlett Packardケムステーションを、機器の制御およびデータ取得のために用いた。
ペプチドを、超勾配メタノール(super gradient methanol)(Labscan、Dublin, Ireland)、Milli-Q水(Mollipore、Bedford, MA)およびギ酸(Merck、Damstadt, Germany)(50:50:0.1v/v/v)に溶解して1〜10μg/mlの濃度にした。ペプチド溶液(20μl)を、+/-0.1m/zの精度のLCT質量分析計(Micromass、Manchester, UK)を用いてESI-TOF-MSによって陽極性モードで分析した。
すべての合成では、乾燥TentaGel-S-NH2(0.23mmol/g、1g)を、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、「TentaGel樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載されているように処理した。リジンおよびその類似体(例えば、オルニチン2,4-ジアミノブタン酸(Ornithin,2,4-Diaminobutanoic acid)、1,3-ジアミノプロパン酸など)が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のivDdeまたはAloc保護基(例えば、Fmoc-Lys(Aloc)-OH)のいずれかを備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。リジンおよびその類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFmoc保護基(例えば、Boc-Lys(Fmoc)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、C末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のAllylic保護基(例えば、Fmoc-Asp(Oallyl)-OH)を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせた。アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらの類似体が、N末端に位置している場合は、これらを、側鎖官能性のFm保護基(例えば、Boc-Asp(OFm)-OH)を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。これら以外のアミノ酸が、C末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Fmoc保護誘導体としてカップリングさせ、N末端に位置している場合は、これを、側鎖官能性の適当な保護基を備えたN-α-Boc保護誘導体としてカップリングさせた。
組換えタンパク質の産生
組換えCx43CTは、参照によりその全容が本明細書に組み込まれるDuffyら、「pH-Dependent Intramolecular Binding and Structure Involving Cx43 Cytoplasmic Domains」、J. Biol. Chem.、277(39):36706〜36714頁、(2002)に記載されているように産生した。簡単に述べると、ラットCx43由来のcDNAをpGEX-6P-2 (Amersham)に導入して、大腸菌(BL-21)で発現させた。得られたGST融合タンパク質を、GST PreScission Protease(登録商標)(Amersham Biosciences)から切断した。切断後の組換え産物は、4個の追加アミノ酸(GPLG)に先行したrCx43の配列255〜382を含んでいた。タンパク質濃度を、Bio-Rad DCタンパク質アッセイを用いて測定した。タンパク質の純度をSDS-PAGEによって評価した。
表面プラズモン共鳴(SPR)
SPRは、リアルタイムで結合の振幅および動態を決定する分光法である(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331 (2):131〜152頁、(1997);Duffyら、「Functional Demonstration of Connexin-protein Binding Using Surface Plasmon Resonance」、Cell Adhes. Commun.、8(4-6):225〜229頁、(2001);Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。組換えCx43CTは、カルボキシルメチルデキストランマトリックスに共有結合させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Salamonら、「Surface Plasmon Resonance Spectroscopy as a Tool for Investigating the Biochemical and Biophysical Properties of Membrane Protein Systems. II: Applications to Biological Systems」、Biochim. Biophys. Acta、1331(2):131〜152頁、(1997))。特定のペプチドを提示し、実施可能な場合は、解離定数(KD)を、1:1(Langmuir)結合および解離速度モデル(Biacoreソフトウェアパッケージ)を用いて、リガンドの結合および解離の経時的変化から算出した。両方の相(結合および解離)では、記録の初めの5〜8秒は、フローセル内のペプチドの分布から生じるアーチファクトを回避するために、フィットに含めなかった(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Langら、「Surface Plasmon Resonance as a Method to Study the Kinetics and Amplitude of Protein-protein Binding」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH 936〜947頁、(Stefan Dhein、Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))。
SPRを用いたペプチドのCx43に対する結合の決定
Table 2(表3)およびTable 3(表4)に示すペプチドを、表面プラズモン共鳴(「SPR」)を用いてCx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に対する結合について調べた。SPRは、元のRXPE配列を同定するために用いられた方法である(Shibayamaら、「Identification of a Novel Peptide that Interferes with the Chemical Regulation of Connexin-43」、Circ. Res.、98:1365〜72頁、(2006))。任意の単位における反応の振幅に対するペプチドの濃度をTable 2(表3)に示す。反応の振幅は、ライゲートの質量の関数でもあり、個々のペプチドの分子量によって正規化したデータをTable 3(表4)に示す。これらのデータは、僅かアミノ酸4個の長さのペプチドが、Cx43のカルボキシル末端ドメイン(CT)に結合できること示している。
核磁気共鳴(NMR)
すべてのNMRデータは、凍結探針を用いてVarian INOVA 600-MHz NMR分光計で得ることができ(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、MacUra & Ernst、「Elucidation of Cross Relaxation in Liquids by Two-dimensional NMR Spectroscopy」、Mol. Phys. 41:95〜117頁、(1980));試料の温度は7℃に維持する。勾配増強2次元1H-15N HSQC実験(Gradient-enhanced two-dimensional 1H-15N HSQC experiments)(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Kayら、「Pure Absorption Gradient Enhanced Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy with Improved Sensitivity」、J. Am. Chem. Soc.、114:10663〜10665頁、(1992))を用いて、15N標識Cx43CTにおけるすべての主鎖アミド共鳴を観察する。データは、t2の1024の複合点およびt1の128の複合点で得た。スイープ幅は、陽子次元で10,000Hzであり、窒素次元で2,500Hzである。ペプチドのCx43CTに対する濃度は、約2.4〜0.8mM(3:1の比)であった。すべてのNMRデータは、NMRPipe(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Delaglioら、「NMRPipe: A Multidimensional Spectral Processing System Based on UNIX Pipes」、J. Biomol. NMR、6(3):277〜293頁、(1995))を用いて処理し、NMRView(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sorgen、「How to Solve a Protein Structure by Nuclear Magnetic Resonance - The Connexin43 Carboxyl Terminal Domain」、PRACTICAL METHODS IN CARDIOVASCULAR RESEARCH
、948〜958頁、(Stefan Dhein, Friedrich Wilhelm Mohr & Mario Delmar編集、2005))を用いて分析した。
電気生理学的分析
N2a(Neuroblastoma)細胞に対して実験を行った。Cx43は、lac-スイッチ安定系(IPTG 0.1〜1.0mMによって誘導(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Zhongら、「LacSwitch II Regulation of Connexin43 cDNA Expression Enables Gap-junction Single-channel Analysis」、Biotechniques、34(5):1034〜1034頁、1041〜1044頁、1046頁、(2003)))で発現させるか、またはeGFPをコードするIRESプラスミドを用いて一過性に発現させた(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。M257(アミノ酸257位で切断されたCx43の変異体(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Morleyら、「Intramolecular Interactions Mediate pH Regulation of Connexin43 Channels」、Biophys. J.、70(3):1294〜1302頁、(1996)))を、eGFP含有IRESプラスミドを用いてN2a細胞で一過性に発現させた。細胞を、落射蛍光(Nikon Diaphoto200、Filter: 520〜560 nm)用の倒立顕微鏡のステージに載せた。結合部電流(Ij)を、二重全細胞電圧クランプ構造(保持電位:-40mV、細胞間電位差Vj:+60MV、ステップ期間:10〜30秒)内のeGFP-陽性細胞対から記録した。パッチピペットを、
セシウム含有溶液で満たした(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。pHの低い実験の場合は、HEPESの代わりにMES(10mM)を用いた。ピペットの抵抗は、4.0〜6.0MΩであった。合成ペプチドを、最終濃度0.1mMになるまでピペット溶液で希釈した。記録の際は、細胞は、セシウム含有溶液中で、室温で維持した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。一部の実験では、オクタノール(2.0mM)を記録の際に灌流させた。単チャネル検出におけるデータの取得および記録、ならびに基準は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loo
p Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004)およびSekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004)に報告されているものと同様とした。
Cx43CT-化合物の相互作用の定量分析
特定の実験:
(1)Cx43CT-化合物の解離定数の決定
各化合物のCx43CTに対する結合動態を、SPRによって評価する。様々な濃度の結合物を用い、結合および解離の速度を、Langmuir 1:1動態モデル(Biacore)にフィットさせる。このモデルは、結合の1次動態を推定する。適切なフィッティングにより、推定KDが得られる。しかしながら、化合物のCx43CTとの相互作用が1対1モデルから逸脱し、KD値が生成されないことも起こりうる。このような場合は、架橋結合の実験および以下に提案するNMRを利用する。
このシステムにより、たとえ結合動態がKDの決定に適していないとしても、化合物-Cx43CT結合の量的パラメータを設定することができる。架橋結合を、Cx43CTの一定濃度および化合物の連続希釈について調べた。化合物の濃度が低下すると、低い移動性のバンド(すなわち、化合物-Cx43CT複合体に一致する)を犠牲にして単量体および二量体Cx43CTのバンドの密度が漸進的に上昇することが予想される。結合密度の非結合密度に対する比を、化合物の濃度の関数としてプロットする。S字状の濃度-依存関係が予想される。最大値の半分の結合に一致するペプチド濃度を、見掛けEC50と定義した。
以前の研究により、空間における位置がRXP4およびRXPEによって影響を受けるCx43CTのアミノ酸が同定された。Cx43CTの共鳴地図を、候補化合物で繰返す。官能基に対して同様の効果を持つペプチドも同じアミノ酸領域に結合するという仮説を立てる。
二重パッチクランプによる機能性評価
化合物を、オクタノール誘導脱共役を阻害する能力について調べた。また、化合物を、酸性化誘導脱共役を阻害する能力についても調べる。
実験を、Shibayamaら、(2006)に記載されているようにモデル化した。Cx43-発現N2a細胞対間の結合コンダクタンスを、従来の二重パッチクランプを用いて評価した。ペプチドをパッチピペット溶液で希釈し、細胞をオクタノールまたは細胞内の低いpHに曝す。化合物の非存在下で、コントロール実験を行った。結果を図3A〜図3Eに示す。図3A〜図3Eは、Cx43-発現N2a細胞から記録されたカップリングにおける時間経過によるオクタノール誘導変化を示すグラフである。図3A〜図3Eはそれぞれ、ペプチド2517、2518、2529、2520、および2624に関する。パッチクランプ実験は、ピペット内液に溶解した0.1mMのペプチド2517、2518、2519、2520、および2624の非存在下(黒のトレース、四角のデータ点)または存在下(赤のトレース、丸のデータ点)で行った。時間0は、オクタノール灌流の開始に一致する。結合コンダクタンスの相対的低下が決定された。
ペプチドのCx43CTに対する結合
本明細書の特定のペプチドのCx43CTに対する結合能は、これらのペプチドがCx43チャネルの動作を変化させうることを示唆している。ギャップ結合部電流を、Cx43をトランスフェクトしたN2a細胞から記録した。巨視的電流を低下させて1つのチャネルの現象を検出できるようにするために、細胞対をオクタノールで灌流した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Anumonwoら、「The Carboxyl Terminal Domain Regulates the Unitary Conductance and Voltage Dependence of Connexin40 Gap Junction Channels」、Circ. Res.、88(7):666〜673頁、(2001); Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res. 95(4):e22〜e28頁、(2004); Sekiら、「Loss of Electrical Communication, but Not Plaque Formation, After Mutations in the Cytoplasmic Loop of Connexin43」、Heart Rhythm.、1(2):227〜233頁、(2004))。本明細書の特定のペプチドがピペット内液中に存在することにより、図1A〜図1Cに示すように、Cx43チャネルのオクタノール誘導閉止が防止される。図1Aは、コントロール条件(ペプチドを含まない)下でCx43-発現細胞対から得た結合部電流トレースを示している。結合部通過電圧(Vj)は+60mVとした。矢印で示す点でオクタノールを灌流に加えた。僅かに遅れて、結合部電流が急速に低下し、オクタノールの添加後3分以内に0になった。オクタノールがギャップ結合を高効率で脱共役する能力は文献(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Johnston & Ramon、「Electrotonic Coupling in Internally Perfused Crayfish Segmented Axons」、J. Physiol.、317:509〜518頁、(1981))に詳細に報告されている。図1Bおよび図1Cに示すトレースは、異なる細胞対から得た。ここで、ペプチド2371および2372は、ピペット内液で希釈した。オクタノールの添加の3分後、Gjの低下は、全くまたは僅かしか観察されなかった。累積データを図2A〜図2Fに示す。図2A、図2C、および図2Eは、オクタノール灌流の後も結合したままの細胞対のパーセントを示している(脱共役は、60mVの結合部通過電圧パルスによって誘発される結合部電流が0と定義)。7つの異なる細胞対を、ペプチド含有溶液で満たしたパッチピペットを用いて記録した。7つの対はペプチドを用いずに試験した。コントロール実験(ペプチドを使用しない)は、ペプチドの存在下で脱共役に失敗したプレートと同じプレートの細胞に対して行った。図2Aに示すように、ペプチド2372に曝露された細胞対はいずれも、オクタノール灌流後に脱共役しなかったが(破線)、ペプチド2371および2366(図2Aおよび図2C)での処理中、細胞対は、脱共役してから再結合した。ペプチドの非存在下、コントロール細胞対の7個の内の6個が(コントロールは実線)、オクタノール灌流の2分後に完全な脱共役を示した。図2Bは、オクタノール灌流の開始後、時間の関数として結合コンダクタンスの時間経過による変化を示している(Gj;個々の実験のコントロールに対して測定)。ペプチドの非存在下で得たデータは、実線および閉じた記号で示している。これらの結果は、オクタノール灌流の約2分後に漸近値に達するGjの特徴的な急激な低下を示している。破線は、ペプチド2371、2372、2366、および2497の存在下で得たデータに一致している。ペプチド2372では脱共役が観察されなかったが、Gjの僅かな低下は明らかであった。結局、データは、すべての化合物2371、2372、2366、および2497が、Cx43-発現細胞対のオクタノール誘導脱共役を防止したことを示している。さらに、2366、2371、および2372は、脱共役した細胞を共役細胞に戻すことができた。ペプチドの効果は、パッチピペット内のいかなるペプチド分子の存在にも起因するものではない。実際、以前の研究が、細胞質ループに由来するペプチドがチャネルの特徴は変更したが、オクタノール感受性を変化させなかったことを示した(参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、Sekiら、「Modifications in the Biophysical Properties of Connexin43 Channels by a Peptide of the Cytoplasmic Loop Region」、Circ. Res.、95(4):e22〜e28頁、(2004))。
Claims (23)
- 式I:
R1-Z-(L-Q)p-R2
を有するペプチドであって、
式中、R1は、H、Ac、ベンゾイル、およびTfaから選択され、
Zは、A1-A2-A3-A4またはそのレトロ類似体であり、
A1は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A2は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A4は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
Bは疎水性基であり、
Lは、X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15またはそのレトロ類似体であり、
X1は、Gly、Ala、Ser、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、または欠失しており、
X2は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X3は、Gly、Ala、Ser、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X4は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X5は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X6は、Val、Ile、Leu、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X7は、Pro、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X8は、Trp、Tyr、Phe、Leu、Val、Ile、または欠失しており、
X9は、Trp、Tyr、Phe、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X10は、Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、His、または欠失しており、
X11は、Arg、Lys、His、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X12は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X13は、Val、Leu、Ile、または欠失しており、
X14は、Gly、Ala、Ser、または欠失しており、
X15は、Arg、Lys、His、または欠失しており、
Qは、A5-A6-A7-A8またはそのレトロ類似体であり、
A5は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A6は、Arg、Lys、もしくはHisなどの塩基性アミノ酸またはリジン模倣物であり、
A7は、任意選択によりBで修飾される、好ましくはGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択される任意のアミノ酸であり、または任意選択によりBで修飾されるリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)であり、
A8は、Trp、Tyr、Phe、もしくはHisなどの芳香族アミノ酸、Ala、Val、Leu、もしくはIleなどの脂肪族アミノ酸、またはMetであるか、または欠失しており、
R2は、NH2、OH、OR、NHR、NRRであり、
RはC1〜C6アルキルであり、
pは0、1、2、3、4、または5であるペプチド。 - A4が存在する場合は、A3が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、A4が欠失している場合は、A3が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1に記載のペプチド。
- p=0であり、
A1が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A2が、Lys、Arg、または(2S4R)Ampであり、
A4が欠失している場合は、A3がLys(NH-B)またはAsn(CONH-B)であり、A4が存在する場合は、A3がAsnまたはGlnであり、
A4が、Trp、Tyr、Phe、His、または欠失している、請求項1に記載のペプチド。 - p=0である、請求項1から3のいずれか一項に記載のペプチド。
- p=1、2、3、4、または5であり、
A8が存在する場合は、A7が、Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択され、
A8が欠失している場合は、A7が、Bで修飾されたGly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、Glu、Asp、Ser、およびThrから選択されるアミノ酸であり、またはBで修飾されたリジン模倣物であり、またはGlx(CONH-B)である、請求項1または2に記載のペプチド。 - p=1、2、3、4、または5であり、
A1およびA5が、同じアミノ酸または同じリジン模倣物であり、
A2およびA6が、同じアミノ酸またはリジン模倣物であり、
A3およびA7が、同じアミノ酸もしくはリジン模倣物、または共にGlx(NH-B)であり、
A4およびA8が、同じアミノ酸、または共に欠失している、請求項1、2、または5に記載のペプチド。 - Bが、6〜12員の任意選択で置換される芳香族炭素環を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチド。
- Bが、6〜12員の芳香族炭素環を含む、任意選択で置換されるアラルキル基、アリール基、またはアロイル基である、請求項7に記載のペプチド。
- Bが、ベンジル、4-ヒドロキシベンジル、ベンゾイル、または4-ヒドロキシベンゾイルである、請求項8に記載のペプチド。
- Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Tyr-Asn-Arg-Arg-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Arg-Asn-Pro-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Val-Pro-Phe-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Val-Pro-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-(8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Val-Pro-Phe-Tyr-Ser-His-Ser-Arg-Arg-Asn-Tyr-NH2
H-(2S,4R)Amp((2S,4R)Amp(Ac))-Asn-Tyr-NH2
Ac-Arg-Arg-Asn(CONH-Bzl)-NH2
Ac-Arg-Arg-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)-NH2
Ac-Lys(NH-4-ヒドロキシベンゾイル)Arg-Arg-NH2
およびこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項1、7、8、および9のいずれか一項に記載のペプチド。 - 治療方法で使用するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のペプチド。
- ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を治療する治療方法で使用するための、請求項11に記載のペプチド。
- 前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態からなる群から選択される、請求項12に記載のペプチド。
- 組織、細胞、または細胞画分の機能のモジュレーターである、請求項1から13のいずれか一項に記載のペプチド。
- 細胞集団におけるギャップ結合コミュニケーションを調節するための方法であって、細胞集団に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを有効量投与し、それにより細胞間のギャップ結合コミュニケーションを調節する工程を含む方法。
- 前記投与をin vivoで行う、請求項15に記載の方法。
- ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態を有するまたはこのような病態を発症するリスクのある患者を治療する方法であって、患者に請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドを治療有効量投与する工程を含む方法。
- 前記患者がヒトである、請求項17に記載の方法。
- 前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項17または18に記載の方法。
- ギャップ結合コミュニケーション障害を伴う病態の治療用の薬物を製造するための、請求項1から14のいずれか一項に記載のペプチドの使用であって、前記治療が、患者に前記ペプチドを治療有効量投与する工程を含む使用。
- 前記患者がヒトである、請求項20に記載の使用。
- 前記病態が、心血管疾患、気道上皮の炎症、肺胞組織の障害、膀胱失禁、難聴、内皮損傷、糖尿病性網膜症、糖尿病性ニューロパチー、中枢神経系の虚血、脊髄の虚血、歯組織の障害、腎疾患、骨髄移植不全、創傷、勃起不全、泌尿器に関する膀胱失禁、神経障害痛、亜慢性および慢性炎症、癌、移植不全、過剰な活性酸素種および/またはフリーラジカルおよび/または硝酸によって引き起こされる状態、糖尿病、骨粗鬆症、ならびに乾癬からなる群から選択される、請求項20または21のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項1から14に記載のペプチドおよび薬学的担体を含む医薬組成物。
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