CN114668831A - 一种内皮素-1a型受体拮抗剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种内皮素‑1A型受体拮抗剂的应用，该拮抗剂为BQ‑123。本发明通过结扎小鼠后腿浅层血管来建立外周血管痛模型，然后采用药理学方法来评估ET‑1的A型受体(ETAR)拮抗剂即BQ‑123在外周血管痛中的作用。BQ‑123是一种特异性的ETAR阻断剂，研究发现，在外周血管痛模型中的不同时期，通过系统(腹腔内)或中枢局部(鞘内)给予BQ‑123，都能治疗外周血管痛。

Description

一种内皮素-1A型受体拮抗剂的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种内皮素ET-1A型受体拮抗剂的应用。
背景技术
内皮素(Endothelin，ET)为人体内血管内皮细胞分泌的具有强烈缩血管作用的多肽类物质，广泛分布于中枢和周围神经系统。人体内皮素有三种，其中ET-1收缩血管的能力较强，作用时间较持久，主要与内皮素A受体(ETAR)和内皮素B受体(ETBR)结合发挥生理功能。按照对ET受体选择的差别分为选择性拮抗剂和非选择性拮抗剂，例如作用于ETAR或ETBR的选择性受体拮抗剂，同时作用于ETAR和ETBR的非选择性受体拮抗剂。鉴于ET-1的重要的生理功能，而使用ETAR拮抗剂作用于外周血管痛动物模型的研究还少有报道。
外周血管疾病，即除了心脏及脑血管疾病以外所有血管疾病，常见的有下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓、下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉血栓形成，以及急性下肢动脉栓塞、下肢血栓闭塞性脉管炎，以及下肢深静脉功能不全、瓣膜分流等，都属于下肢的血管疾病；而外周血管疾病还包括颈动脉狭窄、颈动脉瘤，以及颈动脉夹层、主动脉夹层、胸主动脉瘤、腹主动脉瘤、髂动脉瘤，还包括脏器动脉瘤，如脾动脉瘤、肠系膜动脉瘤、肠系膜动脉狭窄、肠系膜动脉血栓、肠系膜静脉血栓，都是周围血管常见的疾病，他们的共同临床症状、也是他们共同临床主诉，就是疼痛，在这里我们定义为外周血管痛。目前，对于外周血管痛，缺乏相关的实验动物模型，所以在疼痛机制研究方面以及疼痛药物研发上，少有研究报道。
其他疼痛模型如神经病理性疼痛模型、炎性痛疼痛模型、癌症痛模型、糖尿病所致疼痛模型等，均与外周血管痛无关。而偏头痛和心绞痛模型，为血管痛模型，但非外周血管痛模型。
ET-1在炎性痛和神经病理性疼痛中发挥一定的作用，其A型受体拮抗剂在动物模型水平也有一定的治疗炎性痛和神经病理性疼痛的作用，但在外周血管痛模型上目前研究较少，更无有效的治疗药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种内皮素-1(ET-1)A型受体拮抗剂的应用，以解决现有技术中无外周血管痛治疗药物的问题，本发明研究发现ET-1的A型受体拮抗剂即BQ-123可以在外周血管痛的不同阶段都有缓解血管痛的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种内皮素-1A型受体拮抗剂在制备治疗外周血管痛的药物中的应用，所述拮抗剂为BQ-123。
优选地，所述拮抗剂还包括BQ-123在药学上可接受的盐。
优选地，所述外周血管痛为下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓、下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉血栓形成、急性下肢动脉栓塞、下肢血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉功能不全、瓣膜分流、颈动脉狭窄、颈动脉瘤、颈动脉夹层、主动脉夹层、胸主动脉瘤、腹主动脉瘤、髂动脉瘤、脾动脉瘤、肠系膜动脉瘤、肠系膜动脉狭窄、肠系膜动脉血栓或肠系膜静脉血栓。
一种治疗外周血管痛的药物组合物，包括BQ-123或其在药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
一种内皮素-1A型受体拮抗剂在制备用于阻断ET-1信号通路的药物中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明用一种拮抗剂阻断内皮素(ET-1)信号通路，具体涉及内皮素A型受体拮抗剂，通过结扎小鼠后腿浅层血管来建立外周血管痛模型，然后采用药理学方法来评估ET-1的A型受体(ETAR)拮抗剂即BQ-123在外周血管痛中的作用。BQ-123是一种特异性的ETAR阻断剂，研究发现，在外周血管痛模型中的不同时期，通过系统(腹腔内)或中枢局部(鞘内)给予BQ-123，都能治疗外周血管痛。
附图说明
图1中：a为外周血管痛早期阶段大鼠结扎血管中ET-1在内皮细胞(ECs)中的表达的免疫荧光代表图(左图)及ET-1表达的量化(右图)；b为DRG神经元中ETAR表达的免疫荧光代表图(左图)及ETAR表达的定量(右图)；c为腹腔注射的全身给药示意图(左图)及早期外周血管痛模型组小鼠全身给药(腹腔注射)BQ-123阻断ETAR信号的机械痛结果图(右图)；d为分离的DRG神经元的钙成像和膜片钳记录的示意图；e为记录动作电位发射的钙成像结果图；f为记录动作电位发射膜片钳结果图；BS为基础值；CKO为条件性敲除；i.p.为腹腔注射；L为腰部；pre为预先给药；PWT为缩足阈值；WT为野生型；比例尺：100μm(a)，50μm(b、e)；所有数据均表示为平均值±s.e.m；统计学比较：单因素方差分析和Sidak’s post hoc检验(a、b)，双因素方差分析和Bonferroni post hoc检验(c、f)，双侧t检验(e)；
图2中：a为外周血管痛模型组小鼠和假手术对照组小鼠的腰4-5DRG组织中神经元上ET-1表达的免疫荧光图；b为ET-1表达的定量图；c为腹腔注射(i.p.)或鞘内注射(i.t.)的全身或局部给药示意图；d为早期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-123阻断ETAR信号的机械痛结果图；e为中期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-123阻断ETAR信号的机械痛结果图；f为晚期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-123阻断ETAR信号的机械痛结果图；g为早期外周血管痛模型组全身给药(腹腔注射)BQ-788阻断ETBR信号的机械痛结果图；h为早期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-788阻断ETBR信号的机械痛结果图；i为中期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-788阻断ETBR信号的机械痛结果图；j为晚期外周血管痛模型组小鼠中枢局部给药(鞘内注射)BQ-788阻断ETBR信号的机械痛结果图；BS为基础值；i.p.为腹腔注射；i.t.为鞘内注射；pre为用药前；PWT为缩足阈值；比例尺：50μm(a)；所有数据均以平均值±s.e.m表示；统计学比较：单因素方差分析与Sidak’s post hoc检验(b)，双因素方差分析与Bonferroni post hoc检验(d、e、f、g、h、i、j)；
图3中：a为通过膜片钳记录，假手术对照组小鼠与外周血管痛模型组小鼠的离体L4-5 DRG神经元对ET-1产生反应的神经元数量结果图；b为通过膜片钳记录，假手术对照组小鼠与外周血管痛模型组小鼠的离体L4-5 DRG神经元对ET-1产生反应的输入电流结果图；所有数据均表示为平均值±s.e.m；统计学比较：卡方检验(a)，双因素方差分析与Bonferroni post hoc检验(b)。
具体实施方式
以下是本发明的动物试验例，对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐述。但是，本发明的保护范围并不受限于以下实施例，凡是基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
以下实施例中的成年雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠和Sprague-Dawley(SD)大鼠均由汕头大学动物实验中心和南通大学动物实验中心提供。
实施例1
一种内皮素-1(ET-1)A型受体拮抗剂即BQ-123应用于治疗外周血管痛，包括以下步骤：
(1)动物分组：选取20只的成年雄性野生型(WT)C57BL/6J小鼠和10只Sprague-Dawley(SD)大鼠，小鼠(2～5只/笼)和大鼠(2只/笼)在标准条件下饲养(21～24℃，60％湿度，光照/黑暗周期12h:12h)，并提供自由饮水和进食。随机选取5只小鼠作为假手术对照组(Sham)，其余15只分配为外周血管痛模型组(CVP)。随机选取5只大鼠作为假手术对照组(Sham)，其余5只分配为外周血管痛模型组(CVP)。
(2)外周血管痛模型制备：用1％戊巴比妥钠(100mg/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，剃除左后肢大腿内侧的毛发，将小鼠置于仰卧位，此时通过皮肤能够清楚地看到大隐静脉和隐动脉；常规消毒后，用眼科剪刀沿血管内侧约0.5cm和胫骨的一半做一个约0.5cm的纵向切口；在手术显微镜下可看到大隐静脉(内侧)和其伴随的隐动脉及隐神经(外侧)，用眼科剪的尖端把动静脉和神经之间的黏膜小心地分离开，然后用6-0缝合线把动脉和静脉完全结扎，对于假手术对照组的处理是类似操作但不结扎；缝合皮肤；术后把动物放在电热毯上恢复，随后把他们放回笼子里如常饲养。
(3)实施Von Frey实验来测试机械痛：对步骤(2)中的假手术对照组和外周血管痛模型组小鼠实施Von Frey实验。机械痛的测量是通过小鼠对Von Frey纤毛刺激的缩足阈值来确定的，即把小鼠放在高架金属网上的箱子里，允许它们在里面适应30min。然后，用一系列硬度呈对数增长的Von Frey纤毛(0.16、0.40、0.60、1.00和2.00g)来刺激它们的后足。纤毛垂直于小鼠后足的跖面，使用Dixon’s up-down法确定50％的缩足阈值。通过测量使用0.16、0.40或0.60g Von Frey纤毛的亚阈值重复刺激(10～20次，每次刺激之间间隔＞5s)时的缩足频率来评估机械痛敏。
(4)免疫荧光法测量外周血管痛早期阶段大鼠结扎的血管中ET-1表达：为了进行血管染色，对大鼠进行深度麻醉(2％戊巴比妥钠，80mg/kg)后用含4％多聚甲醛和0.02％苦味酸的PBS灌注。将大隐静脉和其伴随的隐动脉与隐神经分离，剥离出大隐静脉和其伴随的隐动脉，在4％多聚甲醛中，固定过夜。随后用30％蔗糖溶液对血管进行脱水过夜。使用Leica CM1950切片机制备血管组织漂片(50μm)。使用鼠抗CD31一抗(1:1000)和兔抗ET-1一抗(1:2000)孵育血管切片。接下来，用二抗孵育血管切片。用LSM 800激光扫描共聚焦成像系统对荧光图像进行拼图拍照，并使用Image-Pro Plus 8.0软件分析荧光信号。
(5)免疫荧光法测量背根神经节(DRG)中ET-1、ETAR的表达：深度深度麻醉的小鼠(2％戊巴比妥钠，80mg/kg)后用含4％多聚甲醛和0.02％苦味酸的PBS灌注。分离出腰(L)4-5DRG和脊髓(SC)，在4％多聚甲醛中，DRG固定1.5h，脊髓固定过夜。随后用30％蔗糖溶液对组织进行脱水过夜。使用Leica CM1950切片机制备DRG切片(7μm)和SC切片(14μm)。对于ETAR、ET-1的染色，在柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，然后将切片在室温下封闭。用鼠抗ETAR单克隆抗体(1:800)结合兔抗CGRP抗体(1:2000)以及兔抗ET-1一抗(1:2000)孵育切片。接下来，用二抗孵育切片。用LSM 800激光扫描共聚焦成像系统对荧光图像进行拼图拍照，并使用Image-Pro Plus 8.0软件分析荧光信号。
(6)免疫荧光半定量分析：为了对免疫染色结果进行量化，每只动物至少选择3个切片(每4个切片取1张)，每组至少5只动物进行双盲分析。为了确定DRG中标记的神经元(标记为ETAR、ET-1)的百分比，将阳性神经元的数量(背景信号的3倍)除以神经元的总数。
(7)系统给药(腹腔注射)：在外周血管痛模型组小鼠4周腹腔给药BQ-123以及在外周血管痛模型组小鼠6周腹腔给药BQ-788。左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部和背部皮肤，右手持1mL注射器，将针头刺入腹白线稍左侧或稍右侧皮下。针头到达皮下后，再向前推进3～5mm左右，接着使注射器针头与皮肤呈45°刺入腹腔，此时有落空感。随后固定针头，保持针尖不动，回抽针栓，如无回流物即可缓慢注射药液。
(8)中枢局部给药(鞘内注射)：在外周血管痛模型组小鼠早期(5周)、中期(9周)和晚期(14周)鞘内给药BQ-123以及在外周血管痛模型组小鼠早期(6周)、中期(11周)和晚期(14周)鞘内给药BQ-788。在进行鞘内注射三天前，用异氟烷(2％)将动物麻醉后，将每只动物的背面的毛发剃光，以暴露出注射部位。蛛网膜下腔穿刺的部位是通过触诊髂骨粗隆、最后一个腰椎的棘突和腰骶部下面的区域来确定的。通过食指沿中线向喙部方向滑动来确定腰椎(L)5-6椎间隙。动物被麻醉后，将无菌的30-G针头推进到椎间隙的中线，针头的斜面朝向喙侧。当针尖插入椎间隙的深度为2～3mm时，通过小鼠轻弹尾巴来验证针尖在蛛网膜下的准确位置。然后，将BQ-123(5μL)注入马尾区的蛛网膜下腔。针头在原地停留5s后再拔出，以避免注射的药物反流。
(9)DRG神经元培养：用1％戊巴比妥钠(100mg/kg)对小鼠进行深度麻醉，然后迅速切除L4-5 DRG，并收集在冰冷的DH10培养基中，其中培养基中含有90％DMEM/F-12、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)。在37℃条件下，用酶溶液(5mg/mL分散酶和1mg/mL 1A型胶原酶溶于不含Ca2+或Mg2+的D-Hanks)消化DRG 20～30min，然后用Pasteur吸管机械解离。将DRG神经元悬浮在DH10中，然后用100μm的细胞过滤器过滤DRG神经元。1200rpm离心5min后，将DRG神经元重新悬浮在含有NGF(25ng/mL)的温热DH10培养基中，并紧贴在聚D-赖氨酸和层析蛋白涂层的玻璃盖板上。在37℃的培养箱(95％的氧气和5％的二氧化碳)中培养DRG神经元，并在24h内用于钙成像和膜片钳记录。
为了对培养的神经元进行免疫染色，分离成年小鼠的DRG，用胶原酶I、胰蛋白酶和DNaseI的混合酶消化。用15％Percoll离心去除非神经细胞后，获得DRG神经元，并在含有2％B27补充剂、2mM L-谷氨酰胺和10μM 5-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷以抑制非神经细胞增殖的培养基中培养。在24h或48h后，用ET-1(100ng/mL)处理贴在盖玻片上的DRG神经元，并在室温下用4％多聚甲醛固定15min。然后，将神经元与抗CGRP一抗(1:1000)在4℃下孵育过夜，再在37℃下孵育与荧光染料共轭的二抗(1:1000)45min。用Leica SP8共聚焦显微镜捕获荧光图像。
(10)钙成像：成年雄性小鼠(8周龄)进行血管结扎后，迅速分离出结扎后4w的L4-5DRG，并培养DRG神经元8h。在37℃的黑暗环境下，用Fura-2和F127孵育培养的DRG神经元。孵育30min后，用钙成像缓冲液(137mM NaCl，5.4mM KCl，1.2mM MgCl2，1.0mM CaCl2，1.0mMNaH2PO4，10mM葡萄糖，20mM HEPES；用NaOH调整到pH 7.3～7.4)清洗DRG神经元两次。将含有DRG神经元的盖玻片放在一个腔室中，用钙成像缓冲液灌注。使用配备有比率成像系统的Olympus IX51显微镜进行比率钙成像。记录由连续扫描单色光源提供的激发波长为340nm和380nm的钙信号，以测量细胞内钙浓度的变化。
(11)全细胞膜片钳记录：成年雄性小鼠(8周龄)接受血管结扎后四周，迅速切除L4-5 DRG，并培养DRG神经元。使用Multiclamp 700B放大器和pCLAMP10软件在室温下进行全细胞电流钳记录。使用P-97微吸管拔出器拔出贴片吸管，在注入内部溶液后，电阻为3～4MΩ。内部溶液含有(135mM KCl，3mM MgATP，0.5mM Na2ATP，1.1mM CaCl2，2mM EGTA，5mM葡萄糖；用NaOH调整到pH 7.38，用蔗糖调整到渗透压300～310mOsm)。外部溶液含有(140mMNaCl，2mM CaCl2，4mM KCl，2mM MgCl2，10mM HEPES，5mM葡萄糖；用NaOH调整到pH 7.38，用蔗糖调整到渗透压310～320mOsm)。在电流钳模式下记录每个直径为15～30μm的DRG神经元的静息膜电位(RMP)。动作电位(APs)由两种刺激方式诱发，即斜坡方式和逐步方式(斜坡方式的刺激范围为0～100pA或300pA，持续时间为300ms；逐步方式的刺激范围为0～300pA或600pA，持续时间为300ms，递增20pA或50pA)。
实施例2
通过实施例1所述各步骤，分析ET-1A型受体拮抗剂即BQ-123治疗外周血管痛的作用，分析结果如下：
(1)通过测量ET-1在大鼠结扎的血管中的表达(小鼠血管太细，难以分离)来研究内皮细胞的功能，如图1a所示为外周血管痛早期阶段大鼠结扎血管中ET-1表达的上调情况，箭头表示ET-1在内皮细胞中的表达，无尾箭头表示CD31在内皮细胞中的表达，可以发现在外周血管痛早期，内皮细胞表达更多的点状ET-1；而DRG神经元中表达的ET-1则没有改变，如图2a和图2b所示，外周血管痛模型组小鼠和假手术对照组小鼠的腰4-5DRG的ET-1表达没有差异。
(2)本发明研究了外周血管痛小鼠的伤害感受器中ET-1A受体(ETAR)的表达。与假手术对照组小鼠对比，外周血管痛模型组小鼠中腰4-5DRG神经元中的ETAR表达增加，如图1b所示，外周血管痛模型组小鼠腰4-5DRG中ET-1A受体(ETAR)的表达增高；本实施例没有研究ET-1B受体(ETBR)的表达，它主要在DRG的卫星细胞中表达。
(3)采用药理学方法来评估ETAR和ETBR在外周血管痛中的作用。BQ-123是一种特异性的ETAR阻断剂，全身(腹腔内)或局部(鞘内)给予BQ-123，在早期阶段几乎将建立的机械痛敏逆转到正常的阈值基线，如图1c所示，全身抑制ETAR能缓解外周血管痛模型组小鼠早期的机械痛敏；如图2c所示为腹腔注射(i.p.)或鞘内注射(i.t.)的全身或局部给药示意图，随后用Von Frey纤毛进行机械痛测试；如图2d-f所示，用BQ-123中枢局部给药(鞘内注射)阻断ETAR信号能抑制外周血管痛小鼠早期(图2d)的机械痛敏，然而这种阻断剂的效果在中期(图2e)和晚期(图2f)有所下降。BQ-788是一种特异性的ETBR阻断剂，全身(腹腔内)或局部(鞘内)给予BQ-788对建立的机械痛敏没有效果，如图2g-j所示，用BQ-788全身(图2g)或局部(图2h-j)给药阻断ETBR信号并不能抑制外周血管痛小鼠早期(图2g、图2h)、中期(图2i)和晚期(图2j)的机械痛敏。
(4)为了研究在外周血管痛期间痛觉感受器对ET-1的兴奋性，本发明在离体的小鼠L4-5 DRG神经元中进行了钙成像，如图1d所示。如图1e所示，与假手术对照组小鼠的神经元对比，外周血管痛模型组小鼠的神经元ET-1的急性孵育诱发的细胞内钙的流入更明显。
(5)为了研究在外周血管痛期间痛觉感受器对ET-1的兴奋性，本发明在离体的小鼠L4-5 DRG神经元中进行了全细胞膜片钳记录，如图1d所示。暴露于ET-1后，假手术对照组小鼠和外周血管痛模型组小鼠分离的DRG痛觉感受器的动作电位发射增加；值得注意的是，如图1f所示，外周血管痛模型组小鼠的神经元表现出更高的敏感性，如尖峰的数量和反应性神经元的比例；如图3a所示，通过膜片钳记录，与假手术对照组小鼠对比，慢性血管性疼痛(CVP)小鼠(即外周血管痛模型组小鼠)的离体腰(L)4-5背根神经节(DRG)神经元对ET-1的反应神经元数量更多。用ET-1急性孵育减少了假手术对照组小鼠和外周血管痛模型组小鼠的神经元引起动作电位所需的注射电流；然而，外周血管痛模型组小鼠的神经元的刺激注射电流比假手术对照组小鼠的低，如图3b所示，通过膜片钳记录，与假手术对照组小鼠对比，外周血管痛模型组小鼠的L4-5 DRG神经元对ET-1的反应神经元的输入电流更敏感。
(6)与假手术对照组小鼠对比，外周血管痛模型组小鼠的DRG神经元对ET-1更敏感。这些数据共同表明，内皮细胞通过ET-1直接与血管神经纤维沟通，这足以驱动痛觉反应。

Claims (5)

1.一种内皮素-1A型受体拮抗剂在制备治疗外周血管痛的药物中的应用，其特征在于，所述拮抗剂为BQ-123。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述拮抗剂还包括BQ-123在药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外周血管痛为下肢静脉曲张、下肢深静脉血栓、下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉血栓形成、急性下肢动脉栓塞、下肢血栓闭塞性脉管炎、下肢深静脉功能不全、瓣膜分流、颈动脉狭窄、颈动脉瘤、颈动脉夹层、主动脉夹层、胸主动脉瘤、腹主动脉瘤、髂动脉瘤、脾动脉瘤、肠系膜动脉瘤、肠系膜动脉狭窄、肠系膜动脉血栓或肠系膜静脉血栓。
4.一种治疗外周血管痛的药物组合物，其特征在于，包括BQ-123或其在药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体。
5.一种内皮素-1A型受体拮抗剂在制备用于阻断ET-1信号通路的药物中的应用。
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