WO2016036165A1 - 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물 - Google Patents

오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물 Download PDF

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cancer
osteopontin
cells
protein
expression
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강창율
김은경
전인수
서형석
송보영
박영준
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서울대학교 산학협력단
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    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns

Definitions

  • composition for the treatment of cancer containing an inhibitor of the expression or activity of osteopontin protein as an active ingredient
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer or an anticancer agent comprising an inhibitor of the expression or activity of osteopont in protein, which is a novel cancer treatment target.
  • cancer treatment vaccines that can induce anti-cancer immune reactions in the human body by using Daron's immunotherapy therapy is actively progressing.
  • Representative examples are dendritic cells that can induce human anti-cancer immune responses.
  • Provenge a cancer treatment vaccine, is being used to treat prostate cancer with approval from the US FDA in 2010.
  • Such immunotherapy is attracting attention as an effective cancer treatment method because it minimizes the side effects of existing anticancer drugs or radiation therapy and acts selectively on cancer cells, but it has limited the effect in practical clinical application. The reason for this is that the immunosuppressive environment formed around the cancer cells of the actual cancer patient is the main cause, and the development of technology to overcome this is required.
  • Cancer avoids or inhibits the host's immune response by inducing or attracting various cancer-derived myeloid cells (over immunosuppressive).
  • Recent studies have revealed the ontogeny or phenotype of cancer-related myeloid cells, and gastric cells derived from the common myeloid progenitor of the bone marrow are cancer-related as a collection of heterogenous myeloid cells. It consists of a macrophage (Tumor-associated macrophage, TAM), cancer-associated ' neutrophil (TAN), Tie2 + monocytes and MDSC.
  • TAM Tumor-associated macrophage
  • TAN cancer-associated ' neutrophil
  • Tie2 + monocytes and MDSC.
  • MDSC is a heterogenous mononuclear (Mo MDSC) or granular (PMN MDSC) immature myeloid cell that plays a key role in creating an immunosuppressive environment in the cancer environment, and consequently contributes to the neutralization of various anti-cancer immune responses.
  • MDSCs are cells induced in various inflammatory environments (cancer, infection, trauma, etc.).
  • the increase in the number of peripheral MDSCs is closely related to the poor prognosis of cancer patients. Suggest.
  • Immune cells are hematopoietic stem cells
  • LSK cells then differentiate into either 1 ineageneg / CD127- / CD117 + / Scal +, LS cells).
  • LSK cells then differentiate into either 1 ineageneg / CD127- / CD117 + / Scal-myeloid progenitor cells (LK cells) or 1 ineageneg / CD127 + / CD117 + / Scal + lymphocyte progenitor cells (common lymphoid progenitor (CLP)).
  • CLP common lymphoid progenitor
  • EM extramedullary myelopoiesis
  • Osteopontin is a protein commonly found in interstitial fluids (Denhardt DT, Noda M. J Cell Biochem Sup. 1998; 3 31: 92— 102.). plasmacytoid DC), which is regulated from the transcription factor T_bet (Mari L. Shinohara., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102: 17101-).
  • Osteopontin was initially known as a noncollagenous bone matrix protein, but later it was known to play an important role in the regulation of cytokine secretion and cell migration in the immune system (Ashkar, S. et al., Science, 287). : 860-864, 2000; Iizuka, J., et al., Laboratory investigation 78: 1523-1533, 1998; Weber, GF, et al., Cytokine & growth factor reviews, 7: 241-248, 1996).
  • osteopontin is overexpressed in various solid cancer cell tumors and closely related to cancer growth and metastasis, and thus, the use of osteopontin as a diagnostic marker for predicting the prognosis of cancer patients has been noted (Zhou Y. et al. , J Invest Dermatol. 2005; 124: 1044-52, Wai PY. Carcinogenesis. 2005; 26: 741-51. Rangaswami H. et al., Trends Cell Biol. 2006; 16: 79-87.).
  • the present inventors have endeavored to develop a new target that can be used as an existing anticancer therapy or as an adjuvant therapy for anticancer immunotherapy for the purpose of preventing the formation of an anticancer immunosuppressive environment in a cancer environment.
  • EM increases through the Erkl / 2- ⁇ signaling pathway, which is mediated by the media, and osteopontin-enhanced EM directly contributes to the accumulation of MDSC in the cancer environment.
  • Knock-DoTO (KD) of osteopontin is inhibited in cancer cells, cancer growth and EM are significantly inhibited in the mouse.
  • anti-osteopontin antibody is used to inhibit cancer growth in mice.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer containing an inhibitor of the expression or activity of osteopont in protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides an anticancer adjuvant containing an inhibitor of expression or activity of osteopontin protein as an active ingredient.
  • It provides a method for screening cancer treatment or anticancer adjuvant, comprising selecting a test substance whose expression level of the osteopontin protein is decreased compared to a control group not treated with the test substance.
  • the present invention also provides a method for treating, ameliorating or preventing cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of an osteopont in protein expression or activity inhibitor to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of osteopont in A method of treating, ameliorating or preventing cancer comprising administering a protein expression or activity inhibitor and an immunotherapeutic vaccine to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a composition comprising or inhibiting the expression or activity of osteopont in protein for use in the prevention, amelioration and treatment of cancer.
  • the present invention provides inhibitors for the expression or activity of osteopont in protein and immunotherapeutic vaccines, or compositions thereof, for use in the prophylaxis or treatment of cancer.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer or an anticancer adjuvant comprising an inhibitor of the expression or activity of osteopont in protein, a novel cancer treatment target, wherein osteopontin derived from cancer mediates CD44.
  • Increased EM through Erkl / 2- ⁇ signaling pathway, and osteopontin-induced EM directly contributes to MDSC accumulation in cancerous environment, and when Knock-down (KD) of osteopontin in colon cancer cells It was confirmed that cancer growth and EM were significantly inhibited in mice.
  • the inhibitor of the expression or activity of the osteopontin protein can be used to treat cancer And it can be usefully used as an active ingredient of anticancer adjuvants.
  • 1A is a diagram showing the absolute number and frequency of LK and LSK cells in splenocytes of wild type or CT26 TBM.
  • 1B is a diagram showing the absolute number and frequency of LK and LSK cells in splenocytes of wild type or MC28 TBM.
  • 1C shows CD45 with MC38 tumors.
  • 1 + / + pseudogenic C57BL / 6 mice The figure shows that the LK cells and LSK cells isolated from the spleen were donor cells and remained in the vein of wild-type CD45.2 + / + C57BL / 6 normal mice or MC38 tumors (week 2) mice (recipients).
  • Figure 1D shows CD45 in the spleen of the recipient 7 days after delivery of donor cells. 1 + / + donor cells analyzed.
  • FIG. 2A shows relative levels of cytokine expression in splenic lysates of control Balb / c mice and 3 weeks of CT26 TBM.
  • Fig. 2B is a diagram showing the average density of each spot and the average value of the reference. The data was calculated by repeating three times.
  • Figure 2C is a diagram showing the concentration of osteopontin in the spleen lysate and serum (serum).
  • FIG. 2D shows Sppl (osteopontin) m NA levels in CD4 + T cells, CD8 + T cells, B cells, Mo MDSC, BIN MDSC and total BM cells.
  • 2E shows Sppl mRNA levels at the injection site.
  • Figure 3A is a Western blot confirming the levels of osteopontin protein in CT26pGIPZ or CT26psh0pn.
  • 3B is a diagram showing in vitro differentiation of CT26pGIPZ or CT26psh0pn.
  • FIG. 3C shows the identification of [3H] thymidine inserted into CT26pGIPZ or CT26psh0pn.
  • 3D shows tumor size measured by subcutaneous injection of CT26pGIPZ or CT26psh0pn cell lines into Balb / c mice.
  • Figure 3E is a diagram showing the total number of splenocytes after 21 days of tumor injection.
  • Figure 3F is a diagram showing the percentage and number of LSK cells, LK cells.
  • 3G is a diagram showing the percentage and number of Mo MDSC and P ⁇ MDSC.
  • ' 4A is a diagram showing that Balb / c mice were injected subcutaneously with CT26pGIPZ or CT26psh0pn, and 500 nig / kg BrdU was injected daily from 15 to 25 days after tumor injection.
  • 4C is a flow cytometry analysis of BrdU inserted into spleen or bone marrow LK cells.
  • FIG. 4D shows an experimental design (top) and BrdU (bottom) inserted in spleen LK cells to analyze the extent of proliferation of spleen LK cells in vitro.
  • 4E shows injection of 4 rm0pn (dissolved in PBS) or vehicle into the veins of Balb / c mice on days 0, 2, 4 and 6, and 7 days later the mice were sacrificed to obtain LK and LSK cells in the spleen. This is the limit of analysis.
  • FIG. 5 ⁇ is a diagram confirming the degree of insertion of BrdU in LK cells of all splenocytes cultured in vitro from CT26 TBM treated with or without indicated blocking Ab of 20 / g / raii and 2 g / m £ rmOpn.
  • 5C is a Western blot analysis of the signal molecules of LK cells from splenocytes of CT26 TBM.
  • FIG. 5D is a diagram measuring the in vitro proliferation of LK cells in splenocytes of CT26 TBM under conditions treated with PD98053 and 2 ⁇ g / m ⁇ rmOpn of 20.
  • 6B is a diagram showing tumor volume of Balb / c mouse tumor model implanted with CT26. B cell-based immunotherapy vaccines were used as additional treatments on day 10, and data were calculated two times independently and expressed as mean lump SEM.
  • FIG. 6C shows tumor volume of a Balb / c mouse tumor model implanted with MC38. Some animals also used a B cell-based immunotherapy vaccine on day 9.
  • the data in FIG. 6 is shown as mean ⁇ SEM, and two way ANOVA analysis was used to determine the difference between the multiple iple groups (* P ⁇ 0.05, ** compared to the control IgG group). ⁇ ⁇ 0.01, *** ⁇ ⁇ 0.001, #P ⁇ 0.05, ## P ⁇ 0.001) compared to control IgG & BBV group.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a gating strategy for flow cytometry.
  • 8A is a diagram showing the total splenocyte counts of wild-type mice and 3 weeks of CT26 TBM.
  • MDSC myeloid-derived suppressor cells
  • Mo mononuclear
  • PMN granular
  • 8C is a diagram showing the number and frequency of CD4 + T cells, CD8 + T cells.
  • FIG. 8E shows CD45 using LK cells and LSK cells isolated from the spleen of CD45.2 + / + wild-type C57BL / 6 mice with MC38 tumors.
  • CD45.2 + / + donor cells were analyzed in the spleen of the recipient 7 days after delivery into the vein of a 1 + / + pseudogenic C57BL / 6 normal mouse or MC38 tumor (2 weeks) mouse (recipient). That's the limit.
  • 9A shows the number of total splenocytes after 3 weeks of tumor transplantation.
  • 10A is a diagram showing the concentration of osteopontin in spleen lysates and serum of wild type mice or MC38 TBM.
  • Figure 10B shows Sppl mRNA levels at the spleen, bone marrow (left) and tumor graft site (right) of wild type mice or MC38 TBM.
  • 11A shows the results of immunostaining tumor tissues with Ki-67 (red) and Hoechst (blue).
  • FIG. 11B shows the results of immunostaining tumor tissue with annexin V (red) and Hoechst (blue).
  • Figure 13A is a diagram measuring the weight of tumors at the expense of mice 10 days after tumor injection.
  • 13B is a diagram measuring the concentration of osteopontin in serum.
  • FIG. 13C shows Sppl mRNA levels of tumor cells, tumor stromal cells and total TIL in tumor tissues.
  • 13D is a diagram showing the percentage and number of LK cells in the spleen.
  • 13E is a diagram showing the percentage and number of DSC in the spleen.
  • 14A is a diagram showing a schematic diagram of a transwell system and a migration index of cells of LK.
  • FIG. 14B shows CCK-8 colorimetric analysis of surviving cells 12 hours after incubation of Mo MDSC and PMN MDSC isolated from mice with CT26 tumor with or without 2 ⁇ g ⁇ i osteopontin.
  • Figure is confirmed using the assay).
  • Figure 15 shows the signal molecules confirmed by Western blot after pretreatment with 20 ⁇ g / ml CD44 blocking Ab in spleen LK cells sorted from mice with CT26 tumors. [Best form for implementation of the invention]
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating cancer, which contains an inhibitor of the expression or activity of osteopontin protein as an active ingredient.
  • the osteopontin preferably has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the inhibitor of the expression of the osteopontin protein is a group consisting of antisense nucleotides that bind complementarily to the mRNA of the osteopontin gene, short hairpin small hairpin RNA (RA), small interfering RNA (NA) and ribozyme (ribozyme)
  • the active inhibitor of the osteopontin protein is selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, substrate analogs, aptamers and antibodies that complementarily bind to osteopontin protein. It is preferably any one selected, but is not limited thereto.
  • the siRNA consists of a 15 to 30 mer sense sequence selected in the base sequence of the mRNA of the gene encoding a human osteopontin protein and an antisense sequence complementary to the sense sequence, wherein
  • the sense sequence is not particularly limited thereto, but is preferably composed of 25 bases, but is not limited thereto.
  • antisense nucleotides as defined by Watson-click base pairs, bind (combine) to the complementary sequencing of DNA, immature -mRNA or mature mRNA to disrupt the flow of genetic information as a protein in DNA.
  • the nature of antisense nucleotides that are specific for the target sequence makes them exceptionally multifunctional. Since antisense nucleotides are long chains of monomeric units they can be easily synthesized for the target RA sequence. Many recent studies have demonstrated the utility of antisense nucleotides as biochemical means for studying target proteins (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst., 81: 1539-1544, 1999).
  • nucleotide synthesis and nucleotide synthesis exhibiting enhanced cell adsorption, target binding affinity and nuclease resistance Because of recent advances in the field, the use of antisensenucleotides can be considered as a new type of inhibitor.
  • Peptide Minetics is to inhibit the activity of the osteopontin protein that inhibits the binding of the osteopontin protein main.
  • Peptide mimetics may be peptides or non-peptides and may be amino acids bound by non-peptide bonds, such as psi bonds (Benkirane, N., et al. J. Biol. Chem., 271: 33218-33224, 1996). It can be configured as. It also includes a "conformational ly constrained" peptide, a cyclic mimetics, at least one exocyclic domain, a binding moiety (binding amino acid) and an active site. It may be a cyclic mimetics.
  • Peptide mimetics are structured similar to the secondary structural properties of osteopontin proteins and are either antibodies (Park, BW et al. Nat Biotechnol 18, 194-198, 2000) or water soluble receptors (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270, 1997), which can mimic the inhibitory properties of large molecules and may be novel small molecules that can act as an equivalent to natural antagonists (Wrighton, NC et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997).
  • the aptamer is a single-stranded DNA or RNA molecule and has a high affinity for a specific chemical molecule or biological molecule by an evolutionary method using an oligonucleotide library called SELEXC systematic evolution of ligands by exponential enrichment. It can be obtained by separating loligomers that bind with selectivity (C. Tuerand L. Gold, Science 249, 505-510, 2005; AD Ellington and JW Szostak, Nature 346, 818-822, 1990; M. Famulok , et. al., Acc. Chem. Res. 33, 591-599, 2000; DS Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68, 611-647, 1999). Aptamers can specifically bind to the target and modulate the target's activity, for example, by blocking the ability of the target to function.
  • the antibody may specifically and directly bind to osteopontin to effectively inhibit the activity of osteopontin.
  • As the antibody specifically binding to osteopontin it is preferable to use a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Antibodies that specifically bind to osteopontin are known to those skilled in the art. It may be prepared by known methods known in the art, and commercially known osteopontin antibodies may be purchased and used.
  • the antibody can be prepared by injecting the osteopontin protein, an immunogen, into an external host according to conventional methods known to those skilled in the art. External hosts include mammals such as mice, rats, sheep and rabbits. Immunogens are injected by intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous injection and are usually administered with an adj uvant to increase antigenicity.
  • Antibodies can be isolated by collecting blood from an external host at regular intervals and collecting serum that shows specific titers and specificity for the antigen.
  • the cancer may include liver cancer, stomach cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, cervical cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer, anus Proximal cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, lymph gland cancer, bladder cancer, gallbladder cancer, endocrine adenocarcinoma, thyroid cancer Thyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureter cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) ) Is preferably any one selected from the group consisting of tumor, primary CNS lymphoma, spinal
  • the cancer is most preferably colon cancer.
  • the present inventors have found that osteopontin derived from cancer increases EM through the Erkl / 2- ⁇ s ignal i ng pathway, which mediates CD44, and the enhancement of the osteopontin by EM Also directly contributes to the accumulation of MDSC in the tumor cells, and when Knock-down (KD) of osteopontin in colon cancer cells, cancer growth and EM are significantly inhibited in mice. By confirming the inhibition of cancer growth in mice, it was confirmed that the inhibitor of the expression or activity of the osteopontin protein can be usefully used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating cancer.
  • the present invention suggests that cancer-derived osteopontin induces proliferation of ⁇ ocytes in immunosuppressive myeloid cells, resulting in the accumulation of immunosuppressive myeloid cells in the environment surrounding cancer. It has been confirmed that it contributes to the composition of the cancer immunosuppression environment thereby. In addition, it proves the fact that it inhibits cancer-derived osteopontin and induces the activation of anti-cancer immunity.
  • Pharmaceutical compositions containing the expression or activity inhibitor of the osteopontin protein of the present invention as an active ingredient preferably containing 0.0001 to 50% by weight of the active ingredient based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodulin solution, glycerol, ethane, liposomes and one or more of these components.
  • Other conventional additives such as antioxidants, buffers, bacteriostatics, can be added.
  • injectable formulations pills, capsules, granules or tablets, such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc.
  • diluents dispersants, surfactants, binders and lubricants and which are specific for the target organ.
  • Target organ specific antibodies or other ligands can be used in combination with the carrier so that they can act.
  • Remington's Pharmaceut i cal Science Remington's Pharmaceut i cal Science (Recent Edition), Mack Publ i Shing Company, East on PA, or Depending on the component, it may be formulated preferably.
  • Nucleotides or nucleic acids used in the present invention can be prepared for oral, topical, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal and the like.
  • Nucleic acids or vectors are used in injectable forms.
  • the area to be treated may be combined with any pharmaceutically acceptable vehicle for injectable compositions for direct infusion.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may in particular comprise isotonic sterile solutions or lyophilized compositions which allow the composition of injectable solutions upon the addition of dry, in particular sterile water or appropriate physiological saline. Direct injection of nucleic acid into a patient's tumor is advantageous because it allows the treatment efficiency to be focused on the infected tissue.
  • the dosage of nucleic acid used may vary with various parameters, in particular genes, It can be controlled by the vector, the mode of administration used, the disease in question or alternatively the duration of treatment required. In addition, the range varies depending on the patient's weight, age, sex, health status, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the disease.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • the present invention also provides an anticancer adjuvant containing an inhibitor of expression or activity of osteopontin protein as an active ingredient.
  • the suppression of the expression or activity of the osteopontin protein is preferably treated with an immunotherapeutic vaccine to exhibit an anticancer adjuvant effect that significantly increases the effect of the therapeutic vaccine.
  • the immunotherapeutic vaccine is preferably but not limited to a B cell immunotherapeutic vaccine, a monocyte immunotherapeutic vaccine, a dendritic cell-based immunotherapeutic vaccine or an immunotherapeutic vaccine using microorganisms such as viruses and bacteria as antigen carriers.
  • osteopontin derived from cancer increases EM through the Erkl / 2- ⁇ signaling pathway, which mediates CD44, and the enhancement of EM by os.thepontin is an MDSC accumulation in the cancer environment. It also contributes directly to the cancer cells, and when Knock-Down (KD) of osteopontin in the cancer cells, cancer growth and EM are significantly inhibited in the mouse.
  • KD Knock-Down
  • anti-osteopontin antibody is used to increase cancer growth in the mouse.
  • the inhibitor of expression or activity of the osteopontin protein can be usefully used as an active ingredient of an anticancer adjuvant.
  • Immune cell-based therapeutic vaccines are usually administered in the range of 1 to 10, and pharmaceutical compositions for cancer treatment containing osteopontin protein expression or activity inhibitors as active ingredients are simultaneously administered within the period of use of the immune cell-based therapeutic vaccines. And cross-administration. It can also be used alone after the last dose of the immunotherapeutic vaccine to maintain the efficacy of the immunotherapeutic vaccine for a long time.
  • the present invention confirms that cancer-derived osteopontin induces proliferation of progenitor cells of immunosuppressive myeloid cells, resulting in the production of immunosuppressive myeloid cells in the surrounding environment of cancer, thereby contributing to the composition of cancer immunosuppressive environment. .
  • the present invention also provides a method for screening a substance for cancer treatment or cancer metastasis inhibition using osteopontin protein.
  • the expression level of the osteopontin protein includes a step of selecting a test substance which is reduced compared to a control group which is not treated with the test substance, but is not limited thereto.
  • the cell line of step 1) is preferably any one selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, colon cancer, colon cancer, skin cancer and gastric cancer cell lines, and more preferably colon cancer cell lines.
  • the expression level of the protein in step 2) is measured by immunoprecipi tat ion, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), immunohistochemistry, RT-PCR, Western blott. ing) and flow cytometry (FACS), preferably any one selected from the group consisting of, but any method of measuring transcripts or proteins and amounts encoded therefrom known to those skilled in the art can be used. Another way is,
  • 3) preferably, but not limited to, selecting a test substance whose activity level of the osteopontin protein is reduced compared to a control group not treated with the test substance.
  • the activity level of the protein of step 2) is SDS-PAGE, immunofluorescence It is preferable to measure by any one selected from the group consisting of a method, enzyme immunoassay (ELISA), mass spectrometry and protein chip, but is not limited thereto.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • a novel anticancer target osteopontin was selected through a data mining technique based on a large gene expression database of human cancer tissue, and the osteopontin Knock-Down (KD) for osteopontin in cancer cells.
  • KD osteopontin Knock-Down
  • the degree of expression or activity of the opontin protein may be usefully used to screen cancer therapeutic or anticancer adjuvant.
  • the present invention also provides a method for treating, ameliorating or preventing cancer, comprising administering to a subject in need thereof a pharmaceutically effective amount of an osteopont in protein expression or activity inhibitor.
  • the present invention also provides a method for treating, ameliorating or preventing cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of an osteopont in protein or an inhibitor and an immunotherapeutic vaccine to a subject in need thereof. do.
  • the present invention provides a composition comprising an inhibitor of or inhibiting the expression or activity of osteopont in protein for use in the prevention, amelioration and treatment of cancer.
  • the present invention provides inhibitors for the expression or activity of osteopont in protein and immunotherapeutic vaccines, or compositions thereof, for use in the prevention or treatment of cancer.
  • the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples.
  • Example i Preparation of Mouse and Tumor Model
  • mice and C57BL / 6 were purchased from the Charles Laboratories (Seoul, Korea>). All mice were maintained in an SPF environment and approved for all animal experiments conducted in this study by Seoul University IACUC.
  • Mouse Tumor Model Study In the case of, 5 3xl0 labeled tumor cells were injected subcutaneously in the left flank of mice that had no experience with experiments or drug treatment, and mice with tumors 3-4 weeks after the injection of tumor cells were used for the experiment.
  • Antibodies for flow cytometry were purchased from Biolegend (Blolegend, San Diego, CA, USA) or IBaoscience (eBioscience, San Diego, CA, USA).
  • lineage markers conjugated with FITC CD3 ⁇ , ⁇ 220, CDllb, GRl, TER-119
  • CD127 7R34 conjugated with FITC or APC_cy7 CD16 / 32 conjugated with APC
  • complex CD117 (2B8) conjugated with PE-cy7 Sca-1 (D7) conjugated with PE-Cy5, CD34 conjugated with APC or eFluor ⁇ 450 (RAM34)
  • RAM34 eFluor ⁇ 450
  • APC conjugated CD29 (HM ⁇ 31-1), CD44 (IM7), CD6KHMP3-1), PE conjugated CD49d (Rl-2) and CD5KRMV7) were used.
  • FITC conjugated Ly6C H 1.4
  • PE-cy7 conjugated Ly6G LA8
  • APC conjugated CDllb M1 / 70
  • PerCP-cy5.5 Conjugated CD4 GK1.5
  • APOcy7 conjugated CD8 ⁇ 53-6.7
  • PE or eFluor ⁇ 450 conjugated CD3 ⁇ 145-2C11
  • CT26shopn or CT26pGIPZ cells were cultured on each of the 4 dogs 2xl0 8 well chamber slide play bit. After 2 days of culture, harvested cells were fixed with 70% ethane and stained with Ki67 antibody conjugated with Alexa647 (M-19, Santacruz). In order to analyze the cell number, cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with nuclear marker Hoechst 33342 (Invi trogen, KDR biotech, Seoul, Korea). Fluorescence images were obtained at 350 nm (Exci tat ion) using a fluorescence microscope, and cell numbers were measured using ImageJ software.
  • cytokine array kits R & D systems, ARY-015 and ARY-006 were used as per the manufacturer's protocol.
  • Mean spot density was measured using open software provided by ImageKNIH) and mean values higher than the reference (mean spot density of negative control spots) were plotted using Graph Pad Prism software (La Jol, CA, USA). Shown in
  • RNeasy mini kit Qiagen, Valencia, CA, USA
  • amfiRivert Platinum GenDEPOT, Baker, TX, USA
  • SYBR Premix ExTaq Tekara, Otsu, Shiga, Japan
  • Light Cycler opt ical system Roche, Basel, Switzerland
  • mouse HPRT forward primer AAG ACT TGC TCG AGA TGT CAT GAA
  • mouse HPRT reverse primer ATC CAG CAG GTC AGC AAA GAA
  • mouse SPP1 forward Primer CCG AGG TGA TAG CTT GGnC TT
  • mouse SPP1 reverse primer CCG CCC ⁇ CCG TTG TTG TC; SEQ ID NO: 6
  • Balb / c mice and Balb / c mice with CT26pGIPZ or CT26sh0pn tumor cells were administered intraperitoneally. Mice were analyzed 26 days after tumor infusion. Spleen cells and bone marrow cell surface staining, and inserted BrdU was stained using the APC BrdU Flow kit (BD Pharmigen TM. San Jose, CA, USA). For in vitro analysis of BrdU insertion, total splenocytes from 3 week old CT26 TBM were treated with 1% penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamic acid, nutritional supplement (40X stock supplemented with STEMPR034), 10 ng / mi.
  • mice On days 4 and 6, they were administered intravenously of Balb / c mice. Hematopoietic progenitor cells were isolated from mice on day 7 and analyzed by flow cytometry.
  • LK cells were isolated from 3w CT26 TBM using FACSArialll, and the isolated cells 1 ⁇ 10 5 were left for one hour and then treated with rni-osteopontan 2 / ig / ml for 5 minutes. Cells were then subjected to harvest Western blot analysis.
  • mice On day 1, mouse subcutaneous CT26 or MC38 tumors (3xl0 5 cells), which were colon cancer cell lines, were injected. From day 7 after tumor infusion, 0.5 mg daily was administered intraperitoneally with mlgG daily for 10 days as anti-osteopontin (MPIIIB10) or control. Some mice received B cell based vaccines on Day 9 (MC38 model) or Day 10 (CT26 model). B cell-based therapeutic vaccines have been previously described using H-2 D epitope peptides (AH1 6-14, SPSYVYHQF) of CT26 tumor GP70 GP70 or H-2 D epitope peptides (pl5E 604-611, SPWFTTL) of MC38 tumor GP70.
  • H-2 D epitope peptides AH1 6-14, SPSYVYHQF
  • H-2 D epitope peptides pl5E 604-611, SPWFTTL
  • MDSC is known to accumulate in the spleen and cancer tissues in cancerous hosts as the cancer grows.
  • the number of splenocytes was increased about 2 times at 21 days after cancer transplantation (FIG. 8A).
  • the ratio and number of Mo MDSC and Plia MDSC in the spleen of the mouse was significantly increased (Fig. 8B).
  • the proportion of CD4 + or CD8 + T cells was decreased and the number was not changed (FIG. 8C).
  • mice with cancer result in dysregulat ion, especially EM.
  • LSK and LK cells heterogenous myeloid progenitor
  • mice with the CD45.1 congenic marker with MC38 cancer were examined to determine whether the increase in MDSC was caused by the increase in LK cells and LSK cells in mice with cancer.
  • LSK and LK cells were isolated from mouse stems and injected intravenously into CD45.2 normal mice or CD45.2 MC38 female mice (recipients). As a result CD45 within mouse recipients with cancer.
  • FIG. 8E More than 80% of 1+ donor cells differentiated into myeloid cells and most of them were Mo MDSC or P ⁇ MDSC (FIG. 1C and FIG. 1D) and similar results were obtained with the opposi te trasnfer system (donor CD45.2, donor CD45). Also confirmed in 1) (FIG. 8E).
  • cytokine array kit Specifically, relative changes of various cytokines and chemokines in the spleen tissue of normal and cancer mice were analyzed using cytokine array kit.
  • osteopontin is significantly increased not only in the spleen of the mouse but also in the plasma (FIG. 2C).
  • increased osteopontin was mainly produced in cancer cells through real time PCR analysis (Fig. 2D), and that osteopontin was also produced in the MC38 mouse cancer model (FIGS. 10A and 10B).
  • Example 3> Promotes cancer growth in the body by cancer-derived osteopontin and confirms the increase of LK cells in the spleen
  • osteopont is a osteopont in-shRNA trasnsfect ion through a lent iviral vector in CT26 cancer cell line. Tyn was produced by knock-down (KD) Sikkin cell line (CT26sh0pn). A CT26 cell line transformed with a lent iviral control vector (pGIPZ) was constructed as a control. (CT26pGIPZ). Arler, KD of osteopontin was confirmed by Western blot (Fig. 3A).
  • osteopontin does not affect the growth of cancer cells itself in vitro and in vitro.
  • the present inventors transplanted the cancer cell lines into mice and confirmed the growth of cancer.
  • CT26sh0pn female mice had a significantly smaller spleen size than CT26pGIPZ female mice, plasma concentrations of osteopontin and osteopontin expression in cancer tissues were also lower than those of CT26pGIPZ female mice (FIG. 3E).
  • cancer-derived osteopontin contributes to cancer growth in the body by a mechanism other than the effect on cancer cells by inhibiting cancer cell apoptosis.
  • present inventors analyzed the hematopoietic cell change in the spleen of the normal mouse, CT26pGIPZ cancer mouse, CT26sh0pn cancer mouse in order to confirm the effect of osteopontin on the cancer environment EM by f kw cytometry.
  • LK cells are a generic term for heterogenous myeloid progeni tor and are composed of common myeloid progeni tor (CMP), granulocyte I macrophage progeni tor (GMP), and megakaryocyte-erythroid progeni tor (MEP). Changes in the CMP, GMP, and MEP cells in the spleen were similar to those of LK cells.
  • the results confirm that cancer-derived osteopontin promotes cancer growth in vivo, is involved in the increase of LK cells in the spleen, and MDSC accumulation occurs accordingly.
  • the present inventors confirmed whether the inhibition of MDSC accumulation in CT26sh0pn cancer mice is a result of cancer size (ie, the effect of relatively small cancer size, not the effect of cancer producing osteopontin).
  • an initial mouse cancer model (Day 10) with similar cancer size between CT26pGIPZ and CT26sh0pn was established by transplanting different numbers of cancer cells into mice. (FIG. 13A).
  • Bromodeoxyur idine (BrdU) was injected intraperitoneally, and the prol i feraion of each cell was analyzed by the degree of incorporat ion BrdU (Fig. 4A).
  • Fig. 4A the degree of incorporat ion BrdU
  • FIG. 4B BrdU incorporat ion of bone marrow LK cells showed no difference between CT26pGIPZ, CT26sh0pn cancer mice and normal mice.
  • BrdU incorporat ion of LK cells in the spleen of CT26pGIPZ female mice was significantly increased compared to normal mice and CT26sh0pn cancer mice (FIG. 4C).
  • osteopontin affects LK cells more than MDSC.
  • osteopontin receptors on the surface of LK cells were analyzed.
  • LK cells were isolated from the spleen of CT26 cancer mice, stimulated with osteopontin on in vitro, and the changes in signal ing molecules in various cells were observed.
  • osteopontin induces the proliferation of LK cells in cancer mice through activation of Erkl / 2- ⁇ signaling pathway and subsequent increase of Rb phosphorylation and Cycl inDl / CDKl complex.
  • Experimental Example 7 Effect of Anti-Osteopontin Antibody on the Immune Cell-based Anticancer Vaccine
  • the present inventors confirmed the mechanism by which the cancer-derived osteopontin worsens the cancer immunosuppressive environment through the ⁇ Experimental Example>. Therefore, the present inventors have found whether anti-cancer immune response can be enhanced by inhibiting osteopontin, either alone or in combination with immune cell-based therapeutic vaccines . It was confirmed through.
  • the present inventors have already completed the development of anticancer immunotherapy vaccines based on B cells (Enhanced antitumor immunotherapeutic effect of B cell based vaccine transduced with modified adenoviral vector containing type 35 fiber structures: Gene Therapy 2014, 21 (1): 106-14; CD40-targeted recombinant adenovirus significantly enhances the efficacy of antitumor vaccines based on dendritic eel Is and B eel Is.Hum Gene Thera. 2010 21 (12), 1697-706; a- Galactosylceramide-loaded, antigen ⁇ expressing B cells prime a wide spectrum of antitumor immunity.Int J Cancer.
  • mice receiving B-cell vaccine had significantly decreased, and anti-osteopontin antibody alone could significantly inhibit the cancer growth of mice.
  • the mouse cancer growth rate is significantly reduced compared to the use of each alone (Figs. 6B and 6C).
  • osteopontin can not only slow the growth rate of cancer but also enhance the anti-cancer immune response of anti-cancer vaccine.

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Abstract

본 발명은 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로， 구체적으로 암에서 유래한 오스테오폰틴이 CD44를 매개하는 Erkl/2-ΜΑΡΚ signaling pathway를 통하여 EM을 증가시키고， 오스테오폰틴에 의한 EM증진은 암 환경에서 MDSC 축적에 직접적으로 기여하며， 또한 암세포에 오스테오폰틴을 Knock-Down(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우스에서 유의적으로 억제되고， 더욱이 항 오스테오폰틴 항체의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제하고， 면역세포기반 백신과 함께 적용시 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 암치료 및 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
오스테오폰틴 단백질의 발현 또는활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 신규한 암 치료 타겟인 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발 현 또는 활성 억제제를포함하는 암 치료용 약학적 조성물 또는 항암보조제에 관한 것이다.
【배경기술】
수술요법， 화학요법， 방사선 요법은 기존에 암을 치료하는 대표적인 3대 요법으로， 기존의 암 치료법인 화학요법은 과증식하는 세포를 타겟으로 하므로 암세포 뿐 아니라 정상 세포까지 사멸시키기 때문에 많은 부작용을 야기하며 약제 내성을 갖는 암세포가 생길 수 있어 효과가 완벽하지 못한 실정이다. 수술요법 또한 침습적 방법으로 암 세포를 제거하는 것이기 때문에 전이되지 않은 고형암올 제거하는 데는 효과적이나， 전이암에는 그 효과가 제한적이다. 따라서 이러한 기존의 암 치료법의 단점을 보완해 줄 수 있는 새로운 암 치료법으로 최근 환자 스스로의 항암 면역반응을 유도하여 암을 치료하는 항암면역치료가 연구되고 있다. 현재 10여 종의 항체들이 임상적으로 사용되고 있으며, 이는 세계 바이오 의약시장의 주요한 성장동력이다 (시장 규모- 2007년도 ： 140억 달러, 2014년도: 344억 달러 예상) . 이 외에 다론 면역 치료 요법으로 인체에서 항암 면역 반웅을 유도하여 암 치료의 효과를 나타낼 수 있는 암 치료 백신의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 대표적인 예로 인체의 항암면역반응을 유도할 수 있는 수지상세포—기반 암치료 백신인 Provenge 가 2010년 미국 FDA의 승인을 받아 전립선암 치료에 사용되고 있다. 이러한 면역치료요법은 기존 항암제나 방사선치료의 부작용을 최소화하고 암 세포 선택적으로 작용하기 때문에 효과적인 암 치료방법으로 주목되고 있으나 실질적인 임상 적용에 있어서 그 효과에 한계를 보이고 있으며, 그 이유로는 실제 암 환자의 암세포 주변에 형성되어있는 면역억제적인 환경이 주된 원인으로 지적되고 있고 이를 극복할 수 있는 기술개발이 요구되고 있다. 암은 다양한 암 유래 골수성 세포들 (면역억제능을 지난)올 유도하거나 끌어들임으로써 숙주의 면역반응을 회피 또는 억제한다. 최근 연구에서 암 -관련 골수성 세포들의 발생 (ontogeny)이나 표현형 (Phenotype)이 밝혀지고 있으며， 골수의 골수성전구세포 (common myeloid progeni tor )로부터 유래한 위 세포들은 heterogenous한 골수성 세포의 집합으로 암 -관련 대식세포 (Tumor-associated macrophage, TAM) , 암 -관련 중성구 (tumor-associated 'neutrophil, TAN) , Tie2+ 단핵구 및 MDSC로 이루어져 있다. 이중 MDSC는 heterogenous 한 단핵구성 (Mo MDSC) 혹은 과립성 (PMN MDSC) 미성숙 골수세포로 암 환경에서 면역억제환경을 조성하는데 핵심적인 역할을 하고 있으며， 결과적으로 다양한 항암 면역반응을 무력화시키는데 기여한다.
MDSC는 다양한 염증환경 (암， 감염， 외상 등)에서 유도되는 세포임이 알려져 있으며， 말초의 MDSC 수 증가는 암 환자의 나쁜 예후와 밀접한 관련이 있고 이는 숙주의 암 방어기전에 MDSC가 해로운 작용을 함을 시사한다. 면역세포들은 다능성 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell ,
1 ineageneg/CD127-/CD117+/Scal+ , LS 세포)에서 유래한다. LSK 세포는 이후 1 ineageneg/CD127-/CD117+/Scal- 골수성 전구세포 (LK 세포) 혹은 1 ineageneg/CD127+/CD117+/Scal+ 림프구전구세포 (common lymphoid progenitor , CLP)로 분화한다. 조혈과정은 평소 엄격히 조절되나 암환경과 같은 만성 염증환경에서는 조혈조절이 통제되지 않고 과도한 골수성 세포생성을 유도하며 이는 MDSC의 증가의 원인으로 추정된다. 특히 암이 성장할수록 골수성 세포생성이 골수 외의 장소에서 증가하는데 이러한 현상을 extramedullary myelopoiesis (골수 외 골수생성， EM) 이라고 하며， 암 -관련 골수성 세포들의 비장내 축적과 EM의 관련성이 지금까지 제기되어 왔다. 오스테오폰틴 (osteopontin)은 조직간액에서 흔히 존재하는 단백질로 (Denhardt DT, Noda M. J Cell Biochem Sup l. 1998;3으31:92— 102. )활성된 T 세포 또는 형질세포형 수지상세포 (plasmacytoid DC)로부터 발현되어지는데 이것은 전사 인자 (transcript ion factor)인 T_bet으로부터 조절되어 진다 (Mari L. Shinohara. , et al . , Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102:17101-17106， 2005； Mari L Shinohara. , et al. , Nature i隱 unology, 7:498—506， 2006). 오스테오폰틴은 초기에 비교원 골기질 (noncollagenous bone matrix) 단백질로 알려졌으나， 후에는 면역시스템에서 싸이토카인 분비 조절이나 세포의 이동 등에 중요하게 작용하는 것으로 알려졌다 (Ashkar , S. et al. , Science, 287:860-864， 2000； Iizuka, J., et al. , Laboratory investigation 78:1523-1533, 1998； Weber , G.F. , et al. , Cytokine & growth factor reviews, 7:241-248, 1996) . 특히， 면역반응에서 CD4 T 세포를 TH1으로 분화시키는데 아주 중요한 요인으로 알려졌고 (A. C. Renkl, et al. , Blood, 106:946-955， 2005； Li, X. , et al. , J Interferon Cytokine Res, 23:259- 265, 2003) , 대식세포의 활성조절 (Ellen E. Rolo et al. , Journal of Leukocyte Biology, Vol 60 397-404, 1996) 및 증성구가 염증부위로 이동하는데 증요하게 작용하는 사이토 카인으로 알려졌다 (Adeline Koh et al . , Immunology 122： 466- 475, 2007) . 최근 오스테오폰틴이 다양한 고형암 세포종에서 과발현 되고 암의 성장과 전이에 밀접한 관련이 있다는 사실이 밝혀져 암환자의 예후를 예측하는데 진단마커로써 오스테오폰틴의 용도가 주목되고 있다 (Zhou Y. et al. , J Invest Dermatol. 2005； 124： 1044-52 , Wai PY. Carcinogenesis. 2005； 26： 741-51. Rangaswami H. et al. , Trends Cell Biol. 2006;16:79-87.). 이에， 본 발명자들은 암 환경에서 항암면역억제 환경조성을 방지하는 용도로 기존의 항암치료법 또는 항암면역치료의 보조요법으로사용할수 있는 신규 타겟을 개발하기 위해 노력한 결과， 암에서 유래한 오스테오폰틴이 CD44를 매개하는 Erkl/2-ΜΑΡΚ signaling pathway를 통하여 EM을 증가시키고， 오스테오폰틴에 의한 EM증진은 암 환경에서 MDSC 축적에 직접적으로 기여하며， 또한 암세포에 오스테오폰틴을 Knock-DoTO(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우스에서 유의적으로 억제되고， 더욱이 항 오스테오폰틴 항체의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제하고， 면역세포기반 백신과 함께 적용시 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암 치료 및 항암보조제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 신규 암 치료 타겟인 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물， 또는 항암보조제를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 오스테오폰틴 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상가세포주의 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 항암 보조제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질꾀 발현 또는 활성 억제제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암치료, 개선 또는 예방 방법을 제공한다.
또한 ,· 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신을 치료가 필요한 개체에 병용투여하는 단계를 포함하는 암 치료， 개선 또는 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 예방, 개선 및 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제, 또는 이를 포함하는 조성물을쎄공한다.
아을러, 본 발명은 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신， 또는 이들을 포함하는 조성물을 제공한다. 【유리한 효과】
본 발명은 신규한 암 치료 타겟인 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물， 또는 항암보조제에 관한 것으로， 암에서 유래한 오스테오폰틴이 CD44를 매개하는 Erkl/2-ΜΑΡΚ signal ing pathway를 통하여 EM을 증가시키고, 오스테오폰틴에 의한 EM증진은 암 환경에서 MDSC 축적에 직접적으로 기여하며， 결장암세포에 오스테오폰틴을 Knock- Down(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우스에서 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다. 또한， 항오스테오폰틴 증화항체의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제하고， 면역세포기반 백신과 병용 시 시너지 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 암 치료 및 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한설명】
도 1A는 야생형 또는 CT26 TBM의 비장세포 (splenocyte)에서 LK 및 LSK 세포의 절대 수 및 빈도를 나타낸 도이다.
도 1B는 야생형 또는 MC28 TBM의 지라세포에서 LK 및 LSK 세포의 절대 수 및 빈도를 나타낸 도이다.
도 1A와 1B의 데이터는 3번 반복수행하여 계산되었고， mean 土 SEM(n=3 , *P<0.05 , **P<0.01 , ***P<0.001)로 나타내었다.
도 1C는 MC38 종양을 가진 CD45. 1+/+ 유사유전자형의 C57BL/6 마우스의 비장에서 분리한 LK 세포 및 LSK 세포를 공여세포로 하여 야생형 CD45.2+/+ C57BL/6 정상 마우스 혹은 MC38 종양 (2주)마우스 (수여자)의 정맥안으로 잔달한 것을 나타낸 도이다.
도 1.D는 공여세포를 전달하고 7일 후, 수여자의 비장에서 CD45. 1+/+ 공여세포를 분석한 도이다.
도 2A는 대조군 Balb/c 마우스 및 3주의 CT26 TBM의 비장 용해물 ( lysate)에서 사이토카인의 발현양을 상대적인 수준으로 측정한도이다. 도 2B는 각 스팟 (spot )의 평균 밀도가 특정되고, 상기 참조의 평균 값을 나타낸 도이다. 상기 데이터는 3번 반복수행하여 계산되었다.
도 2C는 비장 용해물 및 혈청 (serum)에서 오스테오폰틴의 농도를 나타낸 도이다.
도 2D는 CD4+ T세포， CD8+ T 세포， B세포, Mo MDSC , BIN MDSC 및 전체 BM 세포에서 Sppl (오스테오폰틴) m NA수준을 나타낸 도이다.
도 2E는 주사 위치에서 Sppl mRNA수준을 나타낸 도이다.
도 2의 모든 데이터는 3번 수행하여 계산되었고， mean 土 SEM(n=3 , *P<0.05
**P<0.01 , ***P<0.001)로 나타내었다.
도 3A는 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn에서 오스테오폰틴 단백질의 수준을 웨스턴 블랏으로 확인한 도이다.
도 3B는 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn의 시험관 내 ( in vi tro) 분화를 나타낸 도이다.
도 3C는 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn에 삽입된 [3H]티미딘 ( thymidine)올 확인한 도이다.
도 3D는 Balb/c 마우스에 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn 세포주 3 x 105개를 피하주사하여 종양의 크기를 측정한도아다.
도 3E는종양주사 21일 후, 전체 비장세포의 수를 나타낸 도이다.
도 3F는 LSK세포, LK 세포의 백분율 및 수를 나타낸 도이다.
도 3G는 Mo MDSC 및 P顧 MDSC의 백분율 및 수를 나타낸 도이다.
도 3의 모든 데이터는 3번 수행하여 계산되었고， mean 土 SEM(n=3 , *P<0.05, **P<0.01 , ***PO.001)로 나타내었다. ' 도 4A는 Balb/c 마우스에 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn를 피하주사하고， 500 nig/kg BrdU를 종양주사 후 15일부터 25일까지 매일 주사한 것을 나타낸 도이다. 도 4B는 종양 주사 7일 후， 2일 또는 3일에 한번씩 종양의 크기를 측정한 도이다 (n=5).
도 4C는 비장 또는 골수 LK 세포에 삽입된 BrdU을 유동세포분석법 (flow cytometry)으로 분석한도이다.
도 4D는 시험관 내 비장 LK 세포의 증식정도를 분석하기 위한 실험 계획 (위) 및 비장 LK세포에서 삽입된 BrdU (아래)를 나타낸 도이다.
도 4A, 4B, 4C, 4D의 데이터는 3번 수행하여 계산되었고, mean 士 SEM(n=3, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)로 나타내었다.
도 4E는 0， 2， 4, 6일에 4 rm0pn(PBS에 녹임) 또는 비히클 (vehicle)을 Balb/c 마우스의 정맥으로 주사하고， 7일 후， 마우스를 희생하여 비장의 LK 및 LSK 세포를 분석한도이다.
도 5A는 야생형 마우스 및 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn에 관련된 마우스의 지라 LK 세포에서 CD44ᅳ CD49d, CD29, CD51 및 CD61의 발현 수준을 확인한 도이다 (n=3). MFI 값은 이소타입 (isotype) 대조군 항체의 MFI 값으로 정규화 (normalize)하였다.
도 5β는 20 /g/raii의 표시된 블로킹 Ab 및 2 g/m£ rmOpn을 처리하거나 처리하지 않은 CT26 TBM으로부터 시험관내에서 배양된 전체 비장세포의 LK 세포에 있어서 BrdU의 삽입정도를 확인한 도이다.
도 5C는 CT26 TBM의 비장세포로부터 LK 세포의 신호분자 (signal ing molecule)를 웨스턴 블랏으로 분석한 도이다.
도 5D는 CT26 TBM의 비장세포 내 LK세포의 시험관 내 증식정도를 20 의 PD98053 및 2 ^g/m^ rmOpn을 처리하거나 처리하지 않은 조건에서 측정한 도이다. 도 5의 모든 데이터는 3번 수행하여 계산되었고, mean 士 SEM(n=3, *P<0.05, **P<0.01, ***PO.001)로 나타내었다.
도 6A는 Balb/c 마우스 또는 C57BL/6 마우스에 CT26 또는 MC38 세포 3 x 105개를 각각 피하주사하고， 종양 주사 7일 후, 대조군으로 mlgG 또는 MPIIIBIO (항 -Opn mlgG) 을 0.5 nig 씩 마우스의 복강에 주사한 뒤, 종양 크기를 측정한도이다 (n=5) . - 도 6B는 CT26이 이식된 Balb/c 마우스 종양 모델의 종양 부피를 나타내는 도이다. B세포-기초의 면역요법 백신이 10일째에 추가적인 치료로서 사용되었고, 데이터는 독립적으로 2번 수행하여 계산되었으며， mean 士 SEM로 나타내었다.
도 6C는 MC38 이 이식된 Balb/c 마우스 종양 모델의 종양 부피를 나타낸 도이다. 어떤 동물은 B세포-기초의 면역요법 백신이 9일째에 또한사용되었다. 도 6의 데이터는 mean ± SEM로 나타내었으며， 양방향 (two way) ANOVA 분석이 다중집단 (mult iple group) 사이의 차이를 결정하기 위해 사용되었다 (대조군 IgG 군과 비교하여 *P<0.05 , **ρ<0.01 , ***Ρ<0.001 , 대조군 IgG & BBV 군과 비교하여 #P<0.05, ##P<0.001) .
도 7은 유동세포분석법을 위한 게이팅 전략 (gat ing strategy)을 나타낸 도이다.
도 8A는 야생형 마우스 및 3주 CT26 TBM의 전체 비장세포 수를 나타내는 도이다.
도 8B는 단핵구성 (Mo) 혹은 과립구성 (PMN)인 골수유래 억제세포 (myeloid- der ived suppressor cel l , MDSC)의 절대 수 및 빈도를 나타내는 도이다.
도 8C는 CD4+ T세포, CD8+ T세포의 수 및 빈도를 나타내는 도이다.
도 ^는 정상마우스 또는 CT26 TBM의 비장세포에서 CLP 세포를 유동세포분석법으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8 8A-8D의 데이터는 3번 수행하여 계산되었고， mean 士 SEM(n=3 , *P<0.05 ,
**P<0.01 , ***P<0.001)로 나타내었다.
도 8E는 MC38 종양을 가진 CD45.2+/+ 야생형의 C57BL/6 마우스의 비장에서 분리한 LK 세포 및 LSK 세포를 공여세포로 하여 CD45. 1+/+ 유사유전자형 C57BL/6 정상 마우스 혹은 MC38 종양 (2주)마우스 (수여자)의 정맥안으로 전달하고 공여세포 전달 7일 후， 수여자의 비장에서 CD45.2+/+ 공여세포를 분석한도이다.
도 9A는 종양 이식 3주 후， 전체 비장세포의 수를 확인한도이다.
도 9B는 야생형 또는 MC38 TBM의 비장세포에서 Mo-MDSC, PMN-MDSC의 수 및 빈도를 나타낸 도이다 (n=3) .
도 9의 모든 데이터는 3번 수행하여 계산되었고, mean 土 SEM(n=3 , *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)로 나타내었다.
도 10A는 야생형 마우스 또는 MC38 TBM의 지라 용해물 및 혈청에서 오스테오폰틴의 농도를 나타낸 도이다.
도 10B는 야생형 마우스 또는 MC38 TBM의 지라， 골수 (왼쪽) 및 종양 이식위치 (오른쪽)에서 Sppl mRNA수준을 나타낸 도이다. - 도 11A는 Ki-67(빨강) 및 훼 gm스트 (Hoechst) (파랑)으로 종양조직을 면역염색한 결과를 나타내는 도이다.
도 11B는 아넥신 V(annexin V) (빨강) 및 훼흐스트 (Hoechst )(파랑)으로 종양조직을 면역염색한 결과를 나타내는 도이다ᅳ 도 12는 정상 마우스 및 CT26pGIPZ 또는 CT26psh0pn 암을 가진 마우스의 비장세포에서 CMP, GMP 및 MEP의 수 및 빈도를 나타내는 도이다. 도 12의 모든 데이터는 3번 수행하여 계산되었고. mean 土 SEM(n=3, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)로 나타내었다.
도 13A는 종양 주사 10일 후， 마우스를 희생하여 종양의 무게를 측정한 도이다.
도 13B는 혈청내의 오스테오폰틴의 농도를 측정한 도이다.
도 13C는 종양 조직에 있어서 종양 세포， 종양 간질세포 (tumorᅳ stromal cell) 및 전체 TIL의 Sppl mRNA수준을 측정한 도이다.
도 13D는 비장 내 LK 세포의 백분율 및 수를 나타내는 도이다.
도 13E는 비장 내 DSC의 백분율 및 수를 나타내는 도이다.
도 13의 데이터는 mean 土 SEM(n=3, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001)로 나타내었다.
도 14A는 트랜스웰 시스템 (transwell system)의 모식도 및 LK의 세포의 이등지수 (migration index)를 나타내는 도이다.
도 14B는 CT26 종양을 지닌 마우스로부터 분리된 Mo MDSC 및 PMN MDSC를 2 μgI^i 오스테오폰틴을 처리하거나 처리하지 않고 배양한 뒤， 배양 12시간 후， 생존한 세포를 CCK-8 비색분석법 (colorimetric assay)을 사용하여 확인한 도이다. 도 15는 CT26 종양을 지닌 마우스로부터 분류된 지라 LK 세포에서 20 μg/ml CD44블로킹 Ab로 전처리한 뒤 신호 분자를 웨스턴 블랏으로 확인한도이다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 오스테오폰틴 (osteopontin) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 오스테오폰틴은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서 열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 억제제는 오스테오폰틴 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 R A(small hairpin RNA), 작은 간섭 NA(small interfering RNA) 및 리보자임 (ribozyme)으로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성 억 제제는오스테오폰틴 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물， 펩티드， 펩티드 미메 틱스， 기질유사체， 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것 이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 siRNA는 인간 오스테오폰틴 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA의 염 기서열 내에서 선텍되는 15 내지 30머 (mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보 적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며， 이때, 상기 센스 서열은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 25개의 염기로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않 는다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨—클릭 염기쌍에 정의된 바에 따라， DNA, 미성숙 -mRNA 또는 성숙된 mRNA의 상보적 염기서열에 결합 (흔성화)하여 DNA에서 단 백질로서 유전정보의 흐름을 방해하는 것이다. 표적 서열에 특이성이 있는 안티센 스 뉴클레오티드의 성질은 그것들을 예외적으로 다기능이 되도록 한다. 안티센스 뉴클레오티드는 모노머 단위의 긴 사슬이기 때문에 이들은 표적 R A 서열에 대해 쉽게 합성될 수 있다. 최근 많은 연구들은 표적 단백질을 연구하기 위한 생화학적 수단으로 안티센스 뉴클레오티드의 유용성을 증명하였다 (Rothenberg et al., J. Natl. Cancer Inst. , 81:1539-1544， 1999) . 을리고뉴클레오티드 화학 및 향상된 세포흡착， 표적결합 친화도 및 뉴클레아제 내성을 나타내는 뉴클레오티드 합성 분 야에서 최근 많은 진보가 있었으므로 안티센스뉴클레오티드의 사용은 새로운 형태 의 억제제로 고려될 수 있다.
상기 펩티드 미메틱스 (Peptide Minetics)는 오스테오폰틴 단백질의 결합도 메인을 억제하는 오스테오폰틴 단백질의 활성을 억제하는 것이다. 펩티드 미메틱 스는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있고, psi 결합 (Benkirane, N. , et al. J. Biol. Chem. , 271:33218-33224, 1996)과 같은, 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산으 로 구성될 수 있다. 또한, "구조작으로 강제된 (conformational ly constrained)" 펩티드， 사이클릭 미메틱스 (cyclic mimetics), 적어도 하나의 액소사이클릭 도메인 (exocyclic domain), 결합부분 (결합 아미노산) 및 활성 부위를 포함하는 사이클릭 미메틱스일 수 있다. 펩티드 미메틱스는 오스테오폰틴 단백질의 이차구조 특성과 유사하게 구조화되고 항체 (Park, B. W. et al . Nat Biotechnol 18， 194-198， 2000) 또는 수용성 수용체 (Takasaki, W. et al. Nat Biotechnol 15, 1266-1270 , 1997)와 같은 거대한 분자의 억제 특성을 모방할 수 있으며， 천연의 길항제와 동등한 효과 로 작용할 수 있는 신규한 소분자일 수 있다 (Wrighton, N. C. et al. Nat Biotechnol 15, 1261-1265, 1997) .
상기 앱타머 (aptamer)는 단일 사슬 DNA 또는 RNA 분자로서， SELEXC systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올 리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 을리고 머를 분리하여 수득할 수 있다 (C. Tuerand L. Gold, Science 249， 505 - 510, 2005； A. D. Ellington and J. W. Szostak, Nature 346, 818 - 822, 1990； M. Famulok, et. al. , Acc. Chem. Res. 33， 591 - 599， 2000； D. S. Wilson and Szostak, Annu. Rev. Biochem. 68， 611 - 647, 1999) . 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적 의 활성을 조정할수 있는데， 예컨대， 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단 할수 있다.
상기 항체는 오스테오폰틴에 특이적이고 직접적으로 결합하여 오스테오폰틴 의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 오스테오폰틴에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리클로날 (polyclonal) 항체 또는 모노클로날 (monoclonal) 항체를 사용하 는 것이 바람직하다. 상기 오스테오폰틴에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에 게 알려진 공지의 방법으로 제작하여도 무방하며， 상업적으로 알려진 오스테오폰틴 항체를 구입하여 사용할수 있다. 상기 항체는 당멉자에게 알려진 종래 방법에 따 라 면역원인 오스테오폰틴 단백질을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스， 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 포함한다. 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사방법으로 주사되며， 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제 (adj uvant )와 함께 투여할수 있다. 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채 취하여 형상된 역가 및 항원에 대한특이성을 보이는 혈청을 수거하여 항체를 분리 할수 있다.
상기 암은 간암， 위암， 결장암 유방암， 폐암, 비소세포성폐암， 골암， 췌장 암， 피부암， 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구 내 흑색종， 자궁경부암， 난소암， 대장암， 소장암， 직장암, 항문부근암， 나팔관암종， 자궁내막암종， 자궁경부암종, 질암종， 음문암종， 호지킨병 (Hodgkin ' s di sease) , 식도암， 소장암， 임파선암， 방광 암， 담낭암, 내분비선암， 갑상선암， 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암， 음 경암， 전립선암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 방광암， 신장 또는 수뇨 관 암, 신장세포 암종， 신장골반 암종， 중추신경계 (CNS ; cent ral nervous system) 종양， 1차 CNS 림프종, 척수 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지 는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 암은 결장암 인 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암에서 유래한 오스테오폰 틴이 CD44를 매개하는 Erkl/2-ΜΑΡΚ s ignal i ng pathway를 통하여 EM을 증가시키고, 오스테오폰틴에 의한 EM증진은 암 환경에서 MDSC 축적에 직접적으로 기여하며 , 또 한 결장암세포에 오스테오폰틴을 Knock— Down(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우 스에서 유의적으로 억제되고， 더욱이 항 오스테오폰틴 항체의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제함을 확인함으로써， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 암 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확 인하였다.
본 발명은 암유래 오스테오폰틴이 면역 억제 골수성 세포의 ^구세포의 증 식을 유도함으로써 결과적으로 암 주변 환경에서 면역 억제 골수성 세포의 축적을 야기하며 이로 인한 암 면역 억제 환경 조성에 기여함을 확인하였다. 또한， 암 유 래 오스테오폰틴을 억제함으로써 항암 면역 작용의 활성화를 유도한다는 사실을 증 명하여 항암 면역 치료제 개발의 근거를 제시하고 있다. 본 발명의 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은， 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량 %로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은， 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약 제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수， 멸균수， 링거액, 완충 식염수， 덱스트로즈 용액， 말토 텍스트린 용액， 글리세롤， 에탄을， 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이 상을 흔합하여 사용할 수 있으며， 필요에 따라 항산화제， 완충액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 회석제, 분산제， 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형 , 환 약， 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며， 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용 할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington' s Pharmaceut i cal Sci ence (최근판)， Mack Publ i shing Company, East on PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하 게 제제화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 뉴클레오티드 또는 핵산은, 경구， 국소， 비경구， 비 내， 정맥 내， 근육 내， 피하, 안 내， 경피 등의 투여를 목적으로 제조될 수 있다. 바람직하게는，. 핵산 또는 백터가 주사가능한 형태로 사용된다. 이에 따라 서 특히 처리될 영역으로는 직접적인 주입을 위하여 주사 가능한 조성물을 위한 임 의의 약학적으로 허용되는 매개체와 흔합될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특히 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가에 따 라 주사 가능한 용액의 조성을 가능케 하는 동결건조 조성물을 포함할 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접적인 주입은 치료 효율을 감염된 조직에 집중시키도 록 하므로 유리하다. 사용되는 핵산의 투여량은 다양한 파라미터, 특히 유전자, 백터 , 사용되는 투여 방식， 문제시되는 질병 또는 대안적으로 요구되는 치료기간에 의해 조절될 수 있다. 또한， 환자의 체중， 연령， 성별, 건강상태, 식이， 투여시간, 투여방법， 배설율 및 질환의 중증도 둥에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량 은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고， 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 1 회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분 으로 함유하는 항암보조제를 제공한다.
상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제쎄는 면역 치료백신과 함 께 처리하여， 상기 치료백신의 효과를 유의적으로 상승시키는 항암 보조효과를 나 타내는 것이 바람직하다.
상기 면역 치료백신은 B 세포 면역치료백신， 단구 (monocyte) 면역치료백신, 수지상세포 기반 면역치료백신 또는 바이러스 및 세균 등의 미생물을 항원 전달체 로사용하는 면역 치료백신인 것미 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 암에서 유래한 오스테오폰틴이 CD44를 매 개하는 Erkl/2-ΜΑΡΚ signal ing pathway를통하여 EM을 증가시키고, 오스.테오폰틴에 의한 EM증진은 암환경에서 MDSC축적에 직접적으로 기여하며， 또한 암세포에 오스 테오폰틴을 Knock-Down(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우스에서 유의적으로 억 제되고， 더욱이 항 오스테오폰틴 항체의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제하 고， 면역세포기반 백신과 함께 적용시 시너지 효과를 나타낼 수있음을 확인함으로 써， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 항암보조제의 유효성분 으로 유용하게 사용될 수 있다.
면역세포기반 치료백신의 투여는 통상 1~10희 실시하며, 오스테오폰틴 단백 질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물은 면역세포기반 치료백신의 사용기간 내에서 동시 투여 및 교차 투여 등의 방법으로 사용이 가능하다. 또한， 면역치료백신 최종 투여 이후에 단독 사용하여 면역치료 백신의 효능을 장기간유지시킬 수 있다. 본 발명은 암유래 오스테오폰틴이 면역 억제 골수성 세포의 전구세포의 증 식을 유도함으로써 결과적으로 암 주변 환경에서 면역 억제 골수성 세포의 축작을 야기하며 이로 인한 암 면역 억제 환경 조성에 기여함을 확인하였다. 또한， 암 유 래 오스테오폰틴을 억제함으로써 항암 면역 작용의 활성화를 유도한다는 사실을 증 명하여 항암 면역 치료제 개발의 근거를 제시하고 있다. 또한， 본 발명은 오스테오폰틴 단백질을 이용한 암 치료 또는 암 전이 억제 용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로， 상기 방법은
1) 오스테오폰틴 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 세포주의 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대 조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. "
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 세포주는 폐암， 유방암， 대장암, 결장암， 피부암 및 위암 세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하 고, 결장암 세포주인 것이 더욱 바람직하다.
상기 방법에 있어서， 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법 ( immunoprecipi tat ion) , 방사능면역분석법 (RIA) , 효소면역분석법 (ELISA) , 면역조직 화학, RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blott ing) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어 진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 당업자에게 알려진 전사체 또는 그로부터 코딩된 단백질와 양을 측정하는 모든 방법을 사용할 수 있다. 또 다른 방법은,
1) 오스테오폰틴 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대 조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서， 단계 2)의 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE , 면역형광 법， 효소면역분석법 (ELISA)， 질량분석 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되 는 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 구축한， 인체 암 조직의 대규모 유전자 발현 데이터베이스를 바탕으로 하는 데이터마이닝 기법을 통해 신규한항암 표적인 오스테오폰틴를 선별 하였고， 상기 오스테오폰틴는 암세포에 오스테오폰틴을 Knock-Down(KD) 하였을 때 암의 성장과 EM이 마우스에서 유의적으로 억제되고， 더욱이 항 오스테오폰틴 항체 의 사용으로 마우스에서 암의 성장을 억제하고， 면역세포기반 백신과 함께 적용시 시너지 효과를 나타내므로， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 정도를 이 용하여 암의 치료제， 또는 항암 보조제물질을 스크리낭하는데 유용하게 이용될 수 있다. . 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료, 개선 또는 예방 방법올 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신을 치료가 필요한 개체에 병용투여하는 단계를 포함하는 암 치료， 개선 또는 예방방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 암 예방, 개선 및 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제， 또는 이툽 포함하는 조성물을 제공한다. ,
아울러, 본 발명은 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신, 또는 이들을 포함하는 조성물을 제공한다. 이하， 본 발명올 실시예 및 실험예쎄 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며， 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다ᅳ <실시예 i>생쥐 및 종양모델의 제작
BALB/c 생쥐와 C57BL/6은 찰스 라버 연구소 (서을， 한국 >에서 구입하였다. 모든 생쥐는 SPF 환경에서 유지하였고， 서을대학교 IACUC로부터 본 연구에서 실시 한모든 동물 실험을 승인 받았다. 생쥐 종양 모델 연구의 경우， 표시된 종양 세포 3xl05 개를 실험이나 약물처리의 경험이 없는 생쥐의 왼쪽 옆구리의 피하로 주입하 였다. 종양 세포가 주입 후 3-4주 후에 종양이 발생한 마우스를 실험에 이용하였 다.
<실시예 2>유세포분석기 분석 및 ELISA를위한항체의 준비
유세포분석을 위한 항체는 바이오레전드 (Blolegend, San Diego, CA, USA) 또는 이바아오사이언스 (eBioscience, San Diego, CA, USA) 에서 구입하였다. 조혈 줄기 세포와 골수 전구 세포를 검출하기 위하여， FITC가 컨쥬게이션된 계통 (lineage) 마커 (CD3 ε， Β220, CDllb를， GRl, TER-119), FITC또는 APC_cy7가 컨쥬 게이션된 CD127 7R34)， PE또는 APC가 컨쥬게이션된 복합 CD16/32, PE-cy7이 컨쥬 게이션된 복합 CD117(2B8), PE-Cy5가 컨쥬게이션된 Sca-1(D7), APC 또는 eFluor© 450이 컨쥬게이션된 CD34 (RAM34)를 사용하였다.
LK 세포의 표면 분자를 분석하기 위해서， APC가 컨쥬게이션된 CD29 (HMί31- l)， CD44(IM7), CD6KHMP3-1), PE가 컨쥬게이션된 CD49d(Rl-2) 및 CD5KRMV7)를 사용하였다. MDSCs 및 T 세포를 검출하기 위해서， FITC가 컨쥬게이션된 Ly6C (H 1.4), PE-cy7이 컨쥬게이션된 Ly6G(lA8), APC가 컨쥬게이션된 CDllb를 (M1/70) , PerCP-cy5.5가 컨쥬게이션된 CD4(GK1.5), APOcy7이 컨쥬게이션된 CD8 α (53-6.7) , PE또는 eFluor©450이 컨쥬게이션된 CD3 ε (145-2C11)을 사용하였다.
유세포 분석은 FACSAriallKBD 바이오 사이언스)를 사용하여 수행하였다. ELISA와 웨스턴 블롯 분석을 위해， 염소 항 -생쥐 오스테오폰틴 (시그마， 시그마 알 드리치 코리아)， 재조합 마우스 오스테오폰틴 (raOpn)과 바이오린결합염소 항 -생쥐 오스테오폰틴 (R & D systems, Minneapolis, MN, USA)*사용하였다.
<실시예 3>세포 배양
MPIIB10 하이브리도마는 Development Studies Hybridoma Bank (Iowa city IA. USA)로부터 구입하였고， 10 % FBS (GIBCO) , 1% 페니실린 /스트렙토마이신 (Lonza ， Walkersvi le , MD, USA) , 500 //g/m£의 제네티신을 추가한 RPMI 배지에서 배양하였다. 본 발명에서 사용된 CT26 및 MC38 결장암 (colon carcinoma)세포는 10% FBS와 1 » 페니실린 /스트랩토마이신을 추가한 DMEM 배지에서 배양하였다.
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<실시예 4> 마우스 오스테오폰틴 렌티바이러스 백터와 shRNA 형질전환 (transfection)
마우스 오스테오폰틴를 녹다운 (knockdown)하기 위해 GIPZ 렌티 바이러스의 shRNA 백터 (画 4532-圈 _009263， pGIPZ-shOpn) 및 GIPZ non-si lenc ing shRNA 대조군 (RHS4346 , pGIPZ)을 OpenBiosystems (서린， 경기도, 한국)에서 구입하였다. 렌티 바 이러스 파티클의 제조를 위핵 제조업체의 지침에 따라 트랜스 렌티 바이러스 shRNA 패키징 키트를 이용하였다. CT26의 오스테오폰틴 녹다운 또는 대조군 세포를 확립 하기 위하여， 렌티바이러스 입자를 함유하는 pGIPZ-shOpn 또는 대조군 pGIPZ를 제 조업체의 지침에 따라 CT26 세포에 형질 전환하였다. 형질전환된 CT26 세포는 10 //g/ml의 퓨로마이신을 함유하는 배지에서 선택되고 서브클로닝되었다.
<실시예 5>종양세포의 in vitro증식의 평가
CT26shopn 또는 CT26pGIPZ 세포 각 2xl04 개를 8-웰 챔버 슬라이드 플레이 트 상에서 배양 하였다. 배양 2 일 후에 , 수거된 세포를 70 % 에탄을로 고정하고 Alexa647이 컨쥬게이션된 Ki67 항체 (M-19 , Santacruz)로 염색하였다. 세포수를 분 석하기 위해， 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고， 핵 마커인 훼흐스트 (Hoechst ) 33342 ( Invi trogen, KDR biotech, Seoul , Korea)로 염색하였다. 형광 이미지는 형광 현미경을 이용하여 350 nm(Exci tat ion)에서 얻었고， 세포수는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.
세포 증식의 정량적 분석을 위해, CT26shopn 또는 CT26pGIPZ 세포 각 2xl04 를 웰당 l u Ci [¾]-싸이미딘 (Perkin EElmer , Wal tham , MA, USA) 존재하에 96-웰 플 레이트에 48시간 동안 배양하고， [¾]-싸이미딘의 세포내 삽입은 액체 섬광 계수기 (Tr i-Carb LSC , Perkin Elmer )로 검출되었다. <실시예 6>사이토카인의 분석
비장 용해물에서 다양한 사이토카인 또는 케모카인 레벨의 비교 분석을 위 해, 사이토카인 어레이 키트 (R&D systems, ARY-015 및 ARY-006)를 이용하여 제조자 의 프로토콜대로 수행하였다. 평균 스팟 밀도는 ImageKNIH에 의해 제공되는 공개 소프트웨어) 소프트웨어를 이용하여 측정하였고， 기준 (음성 대조군 스폿의 평균 스 폿 밀도)보다 높은 평균값은 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 그래프 (La Jol , CA, USA)에 나타내었다.
<실시예 >실시간정량적 PCR(Quantitave Real-Time PCR)
실시간 정량적 PCR을 위해， RNeasy 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA), amfiRivert Platinum (GenDEPOT, Baker, TX, USA), SYBR Premix ExTaq (Takara, Otsu, Shiga, Japan) , Light Cycler opt ical system (Roche, Basel , Switzerland)를 실시간 정량적 PCR에 사용 하였다. 또한， 다음의 프라이머를 사용하였다 ： 마우스 HPRT 포워드 프라이머 (AAG ACT TGC TCG AGA TGT CAT GAA; 서열번호 3), 마우스 HPRT 리버스 프라이머 (ATC CAG CAG GTC AGC AAA GAA; 서열번호 4)， 마우스 SPP1 포 워드 프라이머 (CCG AGG TGA TAG CTT GGnC TT; 서열번호 5)， 마우스 SPP1 리버스 프 라이머 (CTG CCC ΤΓΤ CCG TTG TTG TC; 서열번호 6).
<실시예 8>브로모디옥시유리딘 (BrdU) 삽입
생체 BrdU의 삽입 분석올 위해 BrdU 500 mg/kg을 어떤 처치도 하지 않은
Balb/c 마우스 및 CT26pGIPZ 또는 CT26sh0pn 종양 세포를 가지고 있는 Balb/c 마우 스의 복강 내로 투여하였다. 마우스는 종양 주입 후 26일째에 분석하였다. 비장 세포와 골수 세포 표면 염색하고， 삽입된 BrdU는 APC BrdU Flow 키트 (BD Pharmigen™. San Jose, CA, USA)를 사용하여 염색 하였다. 생체외에서 BrdU의 삽 입 분석을 위해, 3주령 CT26 TBM으로부터의 전체 비장 세포를 1% 페니실린 /스트렙 토마이신, 2 mM의 L-글루탐산， 영양 보충제 (STEMPR034가 보충된 40X 스탁)， 10 ng/ mi rmIL3, 10 ng/mi rmIL6, 10 ng/mt rmSCF (STEMPR034 complete medium)가 첨가된 STEMPR034 무혈청배지 (GIBCO)에서 2 /ml의 오스테오폰틴을 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다. 일부의 실험에서는， 20 /ml의 표시된 블라킹 항체 또는 20tiM PD98059( Sigma Aldrich)를 배양 배지에 첨가하였다. 배양 24 시간후, BrdU를 1 !ig /ml의 최종 농도로 첨가하였다. BrdU의 삽입은 상술한바와 같이 측정하였다.
<실시예 9>오스테오폰틴의 생체내 처치
재조합 마우스 오스테오폰틴 (R & D systems, in PBS) 4 pg 또는 PBS를 0， 2，
4, 6일째에 Balb/c 마우스의 정맥으로 투여하였다. 7일째 마우스로부터 조혈 전구 세포를 분리하여， 유세포 분석기로 분석하였다.
<실시예 10>웨스턴 블로팅
웨스턴 블롯 분석을 위해 다음 항체를 사용 하였다: α-rabbit— phospho
ERKl/2(llir202/204) , α -rabbit ERK1/2, α -rabbit CyclinDl, a -rabbit -phospho Rb(Ser8078n) (D20B12), a-rabbit-RB(D20)(Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA). 3w CT26 TBM으로부터 LK 세포를 FACSArialll을 이용하여 분리하고， 분리된 세포 1X105를 한시간 방치한후， rni-오스테오폰탄 2 /ig/ml을 5분 동안 처리하였다. 그후， 세포를 수거 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
<실시예 11>종양치료모델
첫째 날， 마우스 피하에 결장암세포주인 CT26또는 MC38 종양 (3xl05 세포) 를 주입하였다. 종양을 주입한 후 7일 째부터 항-오스테오폰틴 (MPIIIB10) 또는 대 조군으로써 mlgG를 십일동안 매일 0.5 mg을 복강으로 투여하였다. 일부 마우스에 는 9일째 (MC38 모델) 또는 10일째 (CT26 모델)에 B 세포 기반 백신이 처리되었다. B세포 기반 치료용 백신은 CT26 종양 GP70 GP70의 H-2D에피토프 펩티드 (AH1 6-14， SPSYVYHQF) 또는 MC38 종양 GP70의 H-2D 에피토프 펩티드 (pl5E 604-611， SPWFTTL) 를 이용하여 이전 문헌에 기재된 방법대로 준비하였다 (Kim EK, Seo HS, Chae MJ, J eon IS, Song BY, Park YJ, et al. Enhanced antitumor immunotherapeut ic effect of B-cel 1 -based vaccine transduced with modified adenoviral vector containing type 35 fiber structures. Gene Ther . 2014 ;21: 106ᅳ 14; Yang JC, Perry-Lai ley D. The envelope protein of an endogenous murine retrovirus is a tumor-associated T一 cell antigen for multiple murine tumors . J I隱 unother. 2000 ;23： 177-83) . <실사예 12>통계
데이터는 평균土 SEM으로 표시하였다. 통계적 유의성은 그래프 패드 프리즘 소프트웨어로 분석하였다. 아 two— tai led Student© t-test 또는 two-way ANOVA를 통계학적 유의성을 계산하기 위해 사용하였다. 0.05 미만의 p값은 95 % 신뢰 구간 에서 유의하다고 판단하였다.
<실험예 1> 암 성장에 따른 골수 외 골수성 세포 생성 (extramedul lary myelopoiesis; EM) 및 이에 '따른 미분화 골수성 세포 (Myeloid derived' suppressor cells;MDSC)의 축적 확인
MDSC는 암의 성장에 따라암을 가진 숙주 (host )에서 비장과 암 조직에 축적 된다고 알려져 있다. CT26 암세포주를 이식한 Balb/c 마우스 암모델에서 암 이식 21일째 비장세포의 수가 2배가량 증가함을 확인하였다 (도 8A) . 또한， 상기 마우스 의 비장에서 Mo MDSC와 P丽 MDSC의 비율과 수가 현저히 증가되어 았을을 확인하였 다 (도 8B) . 반면 CD4+ 혹은 CD8+ T 세포의 비율은 감소하였으며 그 수는 변함이 없음을 확인하였다 (도 8C) . 또한， 암 환경과 같은 만성 염증상황이 골수에서뿐만 아니라 비장에서의 조 혈작용을 촉진시키는 것으로 알려져 왔기 때문에， 본 발명자들은 암을 가진 마우스 에서 증가하는 MDSC가 조혈작용 조절불량 (dysregulat ion) , 특히 EM에 의한 것인지 확인하기 위하여, LSK 와 LK 세포 (heterogenous myeloid progenitor) , CLP 세포의 비율과수를 암을 가진 마우스와 정상 마우스에서 비교분석 수행하였다.
그 결과， LSK와 LK세포의 수와 비율이 정상마우스에 비해 암을 가진 마우 스에서 유의적으로 증가함을 확인하였다 (도 1A) . 반면 CLP세포의 비을은 이들 마 우스 간차이가보이지 않았다 (도 8D) . 다른 마우스 암모델인 MC38마우스 암모 델에서도 이와 비슷한 현상이 관찰되었다 (도 1B및 도 9) . 아울러， 암을 가진 마우스에서 MDSC 증가가 LK 세포 및 LSK 세포의 증가로 인한 것인지를 알아보기 위하여 MC38 암을 가진 CD45.1 congenic marker를 가진 마 우스의 버장에서 LSK 와 LK 세포를 분리하여 (세포 공여자) CD45.2 정상 마우스 또 는 CD45.2 MC38 암마우스 (수여자)에 정맥주사하고 위 세포와변화를 추적하였다. 그 결과 암을 가진 마우스 수여자 내의 CD45. 1+ 공여자 세포 80% 이상이 골수성 세포로 분화하였고 이들의 대부분은 Mo MDSC 혹은 P匪 MDSC임을 확인하였고 (도 1C 및 도 1D) , 비슷한 결과를 opposi te trasnfer system (공여자 CD45.2 , 수여자 CD45. 1)에서도 확인하였다 (도 8E) .
따라서， 상기 결과를 통해 , 암 환경에서 말초의 LSK 및 LK 세포 증가가 MDSC 축적과 직접적인 관련이 있음을 확인하였다. <실험예 2>암마우스에서 오스테오폰틴 (osteopont in)의 증가확인
암에서 생산되는 수용성 인자들이 암 마우스의 비장 내 LSK 및 LK 세포 증 가에 관여하는지 확인하였다. ■
구체적으로， 정상 마우스 및 암 마우스의 비장조직 내의 각종 사이토카인 및 케모카인의 상대적인 변화를 cytokine array ki t를사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 2A 및 2B에 나타낸 바와 같이， CD26 , CXCL1 , CCL2 및 오스테오 폰틴의 레벨이 암 마우스의 비장조직에서 증가되어있음을 확인하였다 (도 2A 및 도 2B) .
한편, 오스테오폰틴이 EM에 어떠한 영향을 미치는지 알려진바 없으므로， 본 발명자들은 암 마우스의 비장에서 증가된 오스테오폰틴이 EM에 미치는 영향을 ELISA분석을 통하여 cytokine array data를 다시 한 번 검증하였다.
그 결과， 오스테오폰틴이 암 마우스의 비장 뿐만 아니라 혈장 내에도 현저 히 증가함을 확인하였다 (도 2C) . 또한 real t ime PCR분석을 통하여 증가된 오스테 오폰틴이 주로 암세포에서 생산됨을 확인하였으며 (Fig 2D) , MC38 마우스 암모델에 서도오스테오폰틴이 생산됨을 확인하였다 (도 10A 및 10B) .
<실시예 3> 암유래 오스테오폰틴에 의한체내 암성장을촉진 및 비장내 LK세포 증가확인
암 유래 오스테오폰틴의 역할을 직접적으로 규명하기 위하여 CT26 암 세포 주에 lent iviral vector를 통한 osteopont in-shRNA trasnsfect ion으로 오스테오폰 틴을 knock-down (KD) 식킨 세포주를 제작하였다 (CT26sh0pn) . 대조군으로 lent ivi ral control vector(pGIPZ)를 형질전환한 CT26 세포주를 제작하였다. (CT26pGIPZ) . 아을러 , 오스테오폰틴의 KD 여부는 웨스턴 블랏으로 확인하였다 (도 3A) .
그 결과, 도 3B 및 3C에 나타낸 바와 같이, 오스테오폰틴 KD는 in vi tro상 암 세포주의 성장에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 3B 및 3C) .
따라서， 체외， 시험관 내에서 암 세포 자체의 성장에 오스테오폰틴이 영향 을 미치지 않음을 확인하였다. . 아울러， 본 발명자들은 상기 암세포주들을 마우스에 이식하고 암의 성장을 확인하였다.
그 결과, In vi tro 상의 암 성장 결과와는 반대로, in vivo(마우스 체내) 상에서 CT26sh0pn의 암 성장속도가현저히 저해되는 것을 확인하였다 (도 3D) . 이에, in vivo 상 암 성장속도 차이가 in vivo 내 암세포의 증식이나 세포 사멸의 차이 때문인지 알아보기 위하여 각각 암 조직을 Ki67 또는 AnnexinV로 immunostaining하여 확인하였다 .
그 결과， In vivo 상 세포증식은 CT26pGIPZ와 CT26sh0pn 암 조직간 차이가 없었던 반면 (도 11A) , CT26sh0pn 암 조직의 세포사멸이 증가되어 있음을 관찰하였 다 (도 11B) . 추가적으로 CT26sh0pn 암마우스는 CT26pGIPZ 암마우스에 비하여 비 장의 크기가 현저히 작았고, 오스테오폰틴의 혈장 내 농도, 암조직 내 오스테오폰 틴의 발현양또한 CT26pGIPZ 암마우스에 비해 적은 것을 확인하였다 (도 3E) .
종합하여 상기 결과들은 암 유래 오스테오폰틴이 암 세포 세포사멸을 억제함으로써 암 세포에 미치는 영향 외의 기전으로 체내 암 성장에 기여함을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은， 암 환경 EM에 오스테오폰틴이 미치는 영향을 구체적 으로 확인하기 위하여 정상 마우스， CT26pGIPZ 암 마우스， CT26sh0pn 암 마우스의 비장 내 조혈세포 변화를 f kw cytometry로 분석하였다.
그 결과， 정상 마우스 그룹과 비교하여 CT26pGIPZ 암 마우스， CT26sh0pn 암 마우스의 LK와 LSK 세포의 수와 비을이 모두 유의적으로 증가되어 있음을 확인하였 다. 그러나 LK 세포의 증가폭은 CT26sh0pn 암-마우스 그룹이 CT26pGIPZ 암 마우스 그룹보다 유회적으로 낮았으며, LSK 세포의 변화는 두 그룹간유사한 것을 확인하 였다 (도 3F) . 아을러， LK 세포는 heterogenous myeloid progeni tor의 총칭으로 common myeloid progeni tor(CMP) , granulocyte一 macrophage progeni tor (GMP) , megakaryocyte-erythroid progeni tor (MEP)로 구성되어 있으며， CT26pGIPZ 암마우 스와 CT26sh0pn 암 마우스의 비장 내 CMP, GMP , MEP세포들의 변화도 LK세포의 변 화폭과 비슷한 경향을 확인하였다 (도 12) .
또한, CT26sh0pn 암 마우스의 비장 내 Mo MDSC 및 P丽 MDSC의 수와 비율이 정상마우스에 비해 증가되어 있기는 하나 그 증가량은 CT26pGIPZ 암 마우스에서 보 이는 증가량보다유의적으로 낮음을 확인하였다 (도 3G) .
따라서， 상기 결과들을 통해 암 유래 오스테오폰틴이 in vivo 상에서 암의 성장을 촉진하고， 비장 내 LK 세포 증가에 관여하고, 이에 따른 MDSC 축적이 일어 남을 확인하였다. 또한， 본 발명자들은 CT26sh0pn 암 마우스에서 MDSC 축적이 저해된 것이 암 의 크기에 의존적인 결과 (즉, 암생산오스테오폰틴에 의한 영향이 아닌 상대적으로 작은 암사이즈에 의한 효과인지)인지 확인하였다.
구체적으로, CT26pGIPZ와 CT26sh0pn간 비슷한 암 사이즈를 가진 초기 마우 스 암 모델 (Day 10)을 각각 다른 수의 암세포를 마우스에 이식함으로써 정립하였 다. (도 13A) .
그 결과， 상기 셋팅을 바탕으로, CT26sh0pn 암 마우스의 혈장 내 오스테오 폰틴의 농도 및 비장 내 LK 세포의 증가， MDSC의 증가가 CT26pGIPZ 암마우스에 비 해 유의적으로 저해되어 있음을 확인하였고 (도 13B, 13D, 13E) , CT26pGIPZ 암 마우 스에서 증가되어 있는 오스테오폰틴은 전적으로 암 조직 내 악성 세포 ( inject ion 한 암세포)에 의한 것임을 확인하였다 (도 13C) .
따라서， 상기 결과를 바탕으로， 암 마우스에서 증가된 오스테오폰틴이 초기 암 단계에서부터 EM에 기여하며, 이는 암의 크기와는 관계 없음을 확인하였다. <실험예 4>암유래 오스테오폰틴에 의한 LK세포증식 (prol iferation) 효과확인 암 유래 오스테오폰틴이 어떠한 기전으로 비장 내 LK 세포를 증가시키는지 알아보기 위하여， 본 발명자들은 오스테오폰틴이 직접적으로 암마우스 비장내 LK 세포의 증식에 영향을 미칠수 있는지를 확인하였다.
구체적으로， CT26pGIPZ 또는 CT26sh0pn 암 마우스에 미리 500 mg/Kg의
Bromodeoxyur idine(BrdU)를 복강내 주사를 하였고， 각 세포들의 prol i feraion정도 를 incorporat ion 된 BrdU의 정도로 분석하였고 (.도 4A) , 상기 실험을 통해， CT26sh0pn의 암성장이 현저히 저해된 것을 확인하였다 (도 4B) . 골수내 LK세포의 BrdU incorporat ion은 CT26pGIPZ, CT26sh0pn 암 마우스， 정상마우스간 차이를 보이 지 않았다. 반면에 CT26pGIPZ 암마우스의 비장 내 LK 세포의 BrdU incorporat ion 이 정상마우스, CT26sh0pn 암 마우스에 비해 현저히 증가되어 있음을 확인하였다 (도 4C) . In vi tro 배양에서도 recombinant 오스테오폰틴 처리로 LK 세포의 BrdU incorporat ion이 유의적으로 증가됨을 확인하였다 (도 4D) . 또한 recombinant 오스 테오폰틴을 정상마우스에 주사하였을 때 비장 내 LK세포 수가증가됨을 확인하였 다 (도 4E) . 오스테오폰틴이 또한 LK 세포의 이동에 영향을 미치는지를 알아보기 위해 trasnwel l에서 오스테오폰틴 유무에 따른 LK세포의 chemotaxi s를 관찰하였다. 그 결과， 오스테오폰틴은 LK 세포의 이동을 약간 증가시키나 (도 14A) , MDSC의 in vi tro survival이나 migrat ion에 영향을 미치지 않음을 확인하였다 (도 14B) .
따라서 위 결과로 오스테오폰틴이 MDSC 보다 LK 세포에 영향을 미침을 확인 하였다.
<실험예 5>오스테오폰틴에 의한 LK세포증식에 관여하는 리셉터 확인
오스테오폰틴에 의한 LK 세포 증식에 관여하는 기전을 알아보기 위해 LK세 포 표면의 오스테오폰틴 리셉터돌을 분석하였다.
그 결과， 기존 알려진 오스테오폰틴 리셉터들 중 CD44와 CD49d가 CT26pGIPZ 암 마우스의 비장 LK세포에서 정상마우스에 비해 증가되었음을 확인한 반면， CD51 과 CD61의 발현은 감소됨을 확인하였다 (도 5A) . 또한， CT26sh0pn 암마우스의 비장 LK 세포 표면의 CD44와 CD49d 발현양은 CT26pGIPZ 암 마우스 그룹보다 유의적으로 낮았고 이는 이들 분자가오스테오폰틴에 의한 LK 세포 증샥과 관련이 있음을 확인 하였다.
따라서， 상기 리셉터 중 어떤 리셉터가 오스테오폰틴에 의한 LK 세포 증식 에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 각각의 리셉터의 neutral izing Ab를 in vi tro LK prol i ferat ion실험에 적용하여 확인하였다.
그 결과, 항 -CD44항체의 처리로 오스테오폰틴에 의한 LK 세포 증식이 완전 히 차단되었으며， 항 -CD49d항체는 LK세포의 증식을 약간 억제하는 것을 확인하였 다 (도 5B) .
따라서， 상기 결과를 바탕으로， 비장 내 LK 세포에서의 CD44 발현 증가가 오스테오폰틴에 의한 이들 세포의 증식을 유발함을 확인하였다.
<실험예 6> 암 -유래 오스테오폰틴에 의한 LK 세포 내 ERK1/2- APK signal transduction증가효과 확인
오스테오폰틴에 의한 LK 세포 증식에 관여하는 세포 내부 신호전달 체계 변 화 등의 분자생물학적 기전에 대해 확인하였다.
구체적으로， CT26 암 마우스의 비장에서 LK세포를 분리하여 in vi tro 상에 서 오스테오폰틴으로 자극을 준 후 각종 세포 내 signal ing molecule의 변화를 관 찰하였다.
그 결과, 도 5C에 나타낸 바와 같이 , 인산화 -Erkl/2, Cyc l inDl 및 인산화
(Ser807/811)-Rb의 단백질양이 오스테오폰틴 처리에 의해 증가함을 관찰하였고 위 효과는 Erkl/2 특이적인 inhibi tor인 PD98059처리에 의해 완벽하게 억제되었다 위 결과와 일치하게， PD98059는 오스테오폰틴에 의한 in vi tro LK prol i ferat ion (BrdU incorporat ion)을 억제함을 확인하였다. 또한， 오스테오폰틴에 의한 LK 세 포 내 인산화 -Erkl/2의 증가가항 -CD44항체에 의해 억제됨을 확인하였다 (도 15) . 따라서 오스테오폰틴은 Erkl/2-ΜΑΡΚ signal ing pathway의 활성화를 통해， 이에 이어지는 Rb 인산화와 Cycl inDl/CDKl complex 증가를 통하여 암 마우스의 LK 세포의 증식을 유도함을 확인하였다. <실험예 7 항-오스테오폰틴 항체에 의한 면역세포기반 항암치료백신의 치료효율 향상효과확인
본 발명자들은 상기 <실험예 >를 통해， 암 유래 오스테오폰틴이 암 면역억제 환경을 악화시키는 기전에 대하여 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 오스테오폰 틴을 저해함으로써 항암면역반응을 향상시킬수 있는지를 항-오스테오폰틴 항체의 단독사용 또는 면역세포기반 치료백신과 항체의 병행사용을 .통해 확인하였다. 구체적으로， 본 발명자들은 이전에 이미 B 세포를 기반으로 한 항암면역치 료백신의 개발을 완료한 바 있으므로 (Enhanced antitumor immunotherapeutic effect of B cell based vaccine transduced with modified adenoviral vector containing type 35 fiber structures: Gene Therapy. 2014， 21(1) :106-14； CD40- targeted recombinant adenovirus significantly enhances the efficacy of antitumor vaccines based on dendritic eel Is and B eel Is. Hum Gene Thera. 2010 21(12) , 1697-706； a -Galactosylceramide-loaded, antigen一 expressing B cells prime a wide spectrum of antitumor immunity. Int J Cancer . 2008, 122(12) , 2774-83； CDld-restricted T eel Is license B eel Is to generate long-lasting cytotoxic antitumor immunity in vivo. Cancer Res. 2006, 66(13)', 6843-50) , 상 기 B 세포백신과 항 오스테오폰틴 항체의 병행사용 또는 항 오스테오폰틴 항체 단 독사용 시의 항암효과를 두 종류의 마우스 암모델 (CT26 모델과 MC38 모델)에서 확 인하였고， 실험일정은 도 6A에 나타내었다. B세포백신은 CT26 암모델의 경우 암 이식 후 10일째， MC38 모델와 경우 암 이식 후 9일째에 1희 투여하였다 (도 6B와 6C).
그 결과， B세포 백신을 투여받은 마우스들의 암 성장속도가 유의적으로 저 해되었고， 항-오스테오폰틴 항체 단독 사용으로도 마우스의 암 성장을 유의적으로 저해시킬 수 있음을 확인하였다. 또한， B 세포백신와 항-오스테오폰틴 항체를 함 께 사용한 경우 각각의 단독사용에 비해 마우스 암 성장 속도가 현저히 감소함을 확인인하였다 (도 6B 및 6C).
따라서， 상기 결과를 통해， 오스테오폰틴을 저해함으로써 암의 성장속도를 지연시킬 뿐 아니라 항암치료백신의 항암 면역반응 또한 증진시킬 수 있음을 확인 하였다.

Claims

[청구의 범위】
【청구항 1】
오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 억제제는 오스테오폰틴 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA( smal l interfer ing RNA) 또는 리보자임 (r ibozyme)인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 오스테오폰틴 단백질의 활성 억제제는 오스테오폰틴 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물， 펩티드， 펩티드 미메틱스， 기질유사체， 앱타머 또는 항체인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 암은 간암， 위암: 결장암， 유방암, 폐암, 비소세포성폐암， 골암， 췌장암， 피부암, 두부 또는 경부암， 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁경부암， 난소암, 대장암， 소장암， 직장암， 항문부근암， 나팔관암종， 자궁내막암종， 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병 (Hodgkin ' s di sease) , 식도암， 소장암， 임파선암， 방광암， 담낭암， 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암， 부신암, 연조직 육종， 요도암， 음경암 전립선암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종， 방광암， 신장 또는 수뇨관 암， 신장세포 암종， 신장골반 암종， 중추신경계 (CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종， 척수 종양， 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는 암치료용 약학적 조성물.
【청구항 6】
제 5항에 있어서， 상기 암은 결장암인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
【청구항 7】
오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 항암보조제 .
【청구항 8]
제 7항에 있어서， 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 면역 치료백신과 함께 처리하는 것을 특징으로 하는 항암보조제 .
.
【청구항 9】
제 7항에 있어서， 상기 면역 치료백신은 B 세포 면역치료백신, 단구 (monocyte) 면역치료백신， 수지상세포 기반 면역치료백신 또는 바이러스 및 세균 등의 미생물을 항원 전달체로 사용하는 면역 치료백신인 것을 특징으로 하는 항암보조제 .
【청구항 10】
오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신을 포함하는 항암제.
【청구항 11】
1) 오스테오폰틴 단백질 발현 세포주에 피검물질을 처리하는 단계 ;
2) 상기 세포주의 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계 ; 및
3) 상기 오스테오폰틴 단백질의 발현 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는， 암 치료, 또는 항암 보조제 스크리닝 방법 .
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역침강법 ( i讓 imoprecipitat ion) , 방사능면역분석법 (RIA) , 효소면역분석법 (ELISA) , 면역조직화학， RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western Blott ing) 및 유세포 분석법 (FACS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법 .
【청구항 13】
약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료， 개선 또는 예방 방법 .
'
【청구항 14】
약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신을 치료가 필요한 개체에 병용투여하는 단계를 포함하는 암치료， 개선 또는 예방 방법 .
【청구항 15】
암 예방, 개선 및 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백질의 발현 또는 활성 억제제, 또는 이를 포함하는 조성물.
【청구항 14]
암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 오스테오폰틴 (osteopont in) 단백 발현 또는 활성 억제제 및 면역 치료백신， 또는 이들을포함하는 조성물.
PCT/KR2015/009303 2014-09-05 2015-09-03 오스테오폰틴 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 암치료용 약학적 조성물 WO2016036165A1 (ko)

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