CN104962278A

CN104962278A - 一种钯离子荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104962278A
Application number: CN201510253981.5A
Authority: CN
Inventors: 田宝柱; 相开强; 张金龙; 陈日升; 常顺周; 李长江; 刘允昌
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2035-05-18
Also published as: CN104962278B

Abstract

本发明公开一种钯离子荧光探针及其制备方法和应用，所述钯离子探针以甲酸烯丙脂为响应基团，加入钯离子后吸收光谱和荧光发射光谱均发生红移。所述的钯离子探针可以高灵敏度、高选择性地检测钯离子，可通过比率方式对钯离子进行定量检测。本发明所述的钯离子比率型荧光探针可对低浓度钯离子进行快速、高灵敏度和专一性检测，并且具有合成方法简单，可工业化量产的优点。

Description

一种钯离子荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种可用于定量检测钯离子的比率型荧光探针，属于染料化学领域。

背景技术

用于环境和活体内检测重金属和过渡金属荧光探针具有十分重要的意义。特别是金属钯作为稀有过渡金属，经常应用于催化反应、染料电池和珠宝首饰等领域。尽管金属钯在这些应用中扮演着十分重要的角色，但是环境中的钯离子进入生物体后会对生物体产生伤害，它可以与DNA、蛋白质和其他生物分子与生物过程结合，从而干扰正常生理过程的进行。

因此，发明一些高选择性和高敏感度的分析方法用于钯离子的检测非常有必要。一些经典的用于定性检测钯离子的分析方法主要有原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、固相微萃取-高效液相色谱法和X射线荧光。此外，荧光成像作为一种新型的分析手段，因其高选择性和高灵敏度而受到研究者的广泛关注。近期的研究成果表明，比率荧光信号优于荧光强度响应信号,提高了灵敏度,引入自动校准功能,可实现定量检测，从而可以提高动态检测范围和内置校正，减小外部环境的影响，提高检测的准确性。

目前，用于检测钯离子的荧光探针具有以下两方面的局限性：(1)只是单纯的off-on体系，很难排出环境的干扰；(2)检测波长较低，容易损伤细胞和组织。针对钯探针以上两点局限，我们根据金属钯和双键具有配位作用的特性，设计合成了一种以异佛尔酮为母核的红光荧光探针，它可以通过比色和比率检测两种方式来对钯离子进行定量检测。探针在加入钯离子之后，橙色荧光消失，红色荧光生成，探针的饱和响应时间为30分钟，并且检测极限能达到13.16nM。

发明内容

本发明的目的在于合成一种发射红光的新型钯离子荧光探针，对钯离子进行定量检测。

本发明的所合成的钯离子荧光探针的结构式如下：

该钯离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈的合成：在反应器中，按摩尔比(异佛尔酮/丙二腈＝1/1)加入异佛尔酮和丙二腈，以乙醇为溶剂、哌啶为催化剂，在80℃-100℃下反应8-10小时，减压蒸馏除去溶剂,得到粗产品。用硅胶柱色谱提纯，得到2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈。

(2)(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈的合成：在反应器中，加入等摩尔量的2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和对乙酰氨基苯甲醛，以甲苯为溶剂、乙酸哌啶(1:1)为催化剂，在氮气保护，100-120℃下，反应8-10小时，减压蒸馏后得到粗产品。用硅胶柱色谱提纯，得到(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈。

(3)一种以异佛尔酮为母核钯离子比率型荧光探针的合成：在反应器中，按摩尔比加入1份(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈和10份氯甲酸烯丙脂，以二氯甲烷为溶剂、三乙胺为催化剂，室温下反应12小时。减压蒸馏后得到粗产品。用硅胶柱色谱提纯，得到目标产物钯离子探针。

本发明所公开的以异佛尔酮为母核的比率型钯离子荧光探针，可用于检测环境和生物体中钯离子的定量检测。

本发明所公开的钯离子荧光探针具有以下特点：荧光探针合成步骤简单，目标产物产率高，容易分离提纯；其发射在红光区，染料结构稳定性好，可用于中性条件下钯离子的检测；此外，该探针可用反应前后的荧光发射强度比I₆₄₃/I₅₇₀作为信号参数，显著提高了探针的灵敏度和选择性。钯离子在2-15μM范围内，I₆₄₃/I₅₇₀与钯离子浓度具有很好的线性关系。

附图说明

图1是10μM探针溶液，加入50μM的Pd(PPh₃)₄后，在0～30分钟的光吸收曲线变化曲线。

图2是10μM探针溶液，加入50μM的Pd(PPh₃)₄后，在0～30分钟的的荧光光谱变化图。

图3是10μM探针溶液，加入0、2、5、7、10、15、20μM的Pd(PPh₃)₄后的紫外吸收曲线。

图4是10μM探针溶液，加入0、2、5、7、10、15、20μM的Pd(PPh₃)₄后的荧光强度变化。

图5是10μM探针溶液，分别加入50μM钠离子、钾离子、锌离子、铝离子、钙离子、铁离子、铜离子、锰离子、镍离子、镉离子、银离子、钴离子、铅离子、钡离子、汞离子和钯时的紫外吸收图。

图6是10μM探针溶液，分别加入50μM钠离子、钾离子、锌离子、铝离子、钙离子、铁离子、铜离子、锰离子、镍离子、镉离子、银离子、钴离子、铅离子、钡离子、汞离子和钯时的荧光强度图。

图7是10μM探针溶液，分别加入50μM钠离子、钾离子、锌离子、铝离子、钙离子、铁离子、铜离子、锰离子、镍离子、镉离子、银离子、钴离子、铅离子、钡离子、汞离子和钯的荧光强度比值I₆₄₃/I₅₇₀。

图8是10μM探针溶液，分别在pH＝5.7、6.0、6.3、6.6、6.9、7.2、7.5、7.8、8.0时加入50μM的Pd(PPh₃)₄时的荧光强度图。

图9是10μM探针溶液，加入0、2、5、7、10、15、20μM的Pd(PPh₃)₄后，在472nm和420nm处吸光度比值的变化，它与钯离子浓度呈很好的线性关系。

图10是10μM探针溶液，加入0、2、5、7、10、15、20μM的Pd(PPh₃)₄时的荧光强度比值I₆₄₃/I₅₇₀的变化，将荧光强度和Pd(PPh₃)₄的浓度取对数后呈现很好的线性关系。

具体实施方式

以下是本发明制备方法的具体实施例。

实施例1

(1)化合物III的合成

将异佛尔酮I(5.0g,36.2mmol)和丙二腈II(2.87g,43.4mmol)溶于50毫升的乙醇中，然后加入哌啶(0.5g,4.8mmol)，氮气保护下120摄氏度加热回流反应12小时，反应结束后蒸干溶剂，用二氯甲烷溶解，经水洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋蒸得到式III粗品；经硅胶柱分离提纯后得到化合物III 4.72g,产率为70％。洗脱液为：石油醚:乙酸乙酯＝5:1

(2)化合物V的合成

将(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈(化合物III)(300mg,1.6mmol)和对乙酰氨基苯甲醛(化合物IV)(263mg,1.6mmol)溶解在20毫升甲苯中，分别加入0.3毫升的哌啶和乙酸作为催化剂，氮气保护下120摄氏度回流反应8小时。反应结束后抽滤，将得到的滤饼溶于乙醇和盐酸的混合溶液30毫升(体积比为2:1)，加热回流直至溶液澄清透明；反应结束后用氢氧化钠中和至中性，乙酸乙酯萃取3次，经无水硫酸钠干燥，抽滤，减压旋蒸。粗品经硅胶柱分离提纯后得到(化合物V)340mg,产率为64％。洗脱液为纯二氯甲烷。

(3)化合物VII的合成

在50毫升的烧瓶中加入化合物V(200mg,0.69mmol)、三乙胺0.5毫升和二氯甲烷15毫升冰浴下搅拌5min。将氯甲酸烯丙脂0.5毫升溶于5毫升二氯甲烷逐滴加入反应液中，混合溶液先在冰浴下反应30min，然后常温搅拌过夜。反应结束后旋干溶剂，粗品经硅胶柱分离提纯得到化合物VII 98mg,产率为38％。目标化合物把离子探针的结构通过核磁氢谱、碳谱以及高分辨质谱表征。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝9.99(s,1H),7.64(d,J＝8Hz,2H),7.51(d,J＝8Hz,2H),7.25(m,2H),6.82(s,1H),6.00(m,1H),5.37(dd,J＝4Hz,J＝8Hz,1H),5.25(dd,J＝4Hz,J＝8Hz,1H),4.63(d,J＝8Hz,2H),2.59(s,2H),2.52(s,2H),1.01(s,6H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):δ＝170.21,156.19,152.98,140.53,137.49,130.11,122.02,117.72,113.96,113.16,75.70,64.81,39.68,38.10,31.62,27.39.

HRMS(ESI):calcd.for[C₂₃H₂₃O₂N₃-H]⁺372.1712；found 372.1710.

实施例2、探针化合物VII对Pd(PPh₃)₄的响应时间实验

使用实施例1中合成的化合物VII先用DMSO配成1×10^-4mol/L的探针母液，然后两驱0.3毫升母液加入1.5毫升PBS缓冲液(20mM)和1.2毫升DMSO的混合溶液中。加入50μM的Pd(PPh₃)₄检测其荧光强度和紫外吸光度在0～30min内的变化。荧光光谱测试过程中的狭缝设置为5/5。测试结果如图1和图2,可以看出随着加入时间增加，420nm处的紫外吸光度不断降低，而472nm处的荧光强度不断升高，同时570nm处的荧光强度不断降低，643处的荧光强度不断升高。两组实验都能在30min实现响应饱和。

实施例3、探针化合物VII对Pd(PPh₃)₄的浓度滴定实验。

实施例1中合成的化合物VII按实施例2配成溶液稀释到1.5毫升PBS缓冲液(20mM)和1.2毫升DMSO的混合溶液中。依次加入0、2、5、7、10、15、20μM的Pd(PPh₃)₄，每加一次需等待30min再检测其紫外吸光度和荧光强度的变化。荧光光谱测试过程中的狭缝设置为5/5。从图3和图4中可以看出随着Pd(PPh₃)₄浓度增加，420nm处的紫外吸光度不断降低，而472nm处的紫外吸光度不断升高，同时570nm处的荧光强度不断降低，643处的荧光强度不断升高。两组实验紫外红移达到52nm，荧光红移达到73nm。

实施例4、探针化合物VII对Pd(PPh₃)₄的选择性实验。

实施例1中合成的化合物VII按实施例2配成溶液稀释到1.5毫升PBS缓冲液(20mM)和1.2毫升DMSO的混合溶液中。然后分别加入50μM的Pd(PPh₃)₄，100μM的钠离子、钾离子、锌离子、铝离子、钙离子、铁离子、铜离子、锰离子、镍离子、镉离子、银离子、钴离子、铅离子、钡离子、汞离子。30min后检测其紫外吸光度和荧光强度的变化。荧光光谱测试过程中的狭缝设置为5/5。测试结果如图5、图6和图7，从结果可以看出，该探针对其他金属离子基本没有响应，而对金属钯的响应较强。说明了探针VII对金属钯具有很好的选择性。

实施例5、探针化合物VII在不同pH下的稳定性实验。

实施例1中合成的化合物VII按实施例2配成溶液稀释到1.5毫升NaH₂PO₄-Na₂HPO₄按不同比例配制不同pH的溶液和1.2毫升DMSO的混合溶液中检测其荧光强度。然后分别加入50μM的Pd(PPh₃)₄，30min后检测其荧光强度。结果如图8所示，该探针该探针在不同pH下有很好的稳定性。

实施例6、探针化合物VII对Pd(PPh₃)₄的检测限实验。

将实施例3得到的420nm处和472nm处的紫外吸光度(A472/A420)作为纵坐标，加入的Pd(PPh₃)₄浓度做为横坐标，描点，将得到的点进行直线拟合，线性系数为0.996。将实施例3得到的570nm处和643nm处的荧光强度(I643/I570)作为纵坐标,描点，将得到的点进行曲线线拟合，得到一条抛物线。将荧光强度(I643/I570)和Pd(PPh₃)₄浓度分别取对数后再进行直线拟合，线性系数为0.998。通过测试五次空白对照，通过公式：检测限(LOD)＝3σ/k，其中σ为五次空白对照的标准差，k为图10中的线性系数。可计算得到探VII对Pd(PPh₃)₄的检测限为13.16nm。

Claims

1.一种钯离子荧光探针，其特征在于，其结构式如下：

2.根据权利要求1所述的一种钯离子荧光探针的制备方法，其特征在于，其具体合成步骤如下：

(1)2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈的合成：在反应器中，按摩尔比加入一份异佛尔酮和1.5份丙二腈，以乙醇为溶剂、哌啶为催化剂，在80℃-100℃下反应8-10小时，减压蒸馏除去溶剂得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈；

(2)(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈的合成：在反应器中，按摩尔比加入一份2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯基)-丙二腈和一份对乙酰氨基苯甲醛，以甲苯为溶剂、乙酸哌啶(1:1)为催化剂，氮气保护下100℃-120℃反应8-10小时，减压蒸馏后得到粗产品。用硅胶柱色谱提纯，得到(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈；

(3)一种以异佛尔酮为母核钯离子比率型荧光探针的合成：在反应器中，按摩尔比加入一份(E)-2-(3-(4-氨基苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯基)丙二腈和十份氯甲酸烯丙脂，以二氯甲烷为溶剂、三乙胺为催化剂，室温下反应12小时，减压蒸馏后得到粗产品，用硅胶柱色谱提纯，得到该探针。

3.权利要求1所述的钯离子荧光探针，其特征在于，该探针用于环境或生物体内钯离子的定量检测。