CN118043347A - 用于抗sars-cov-2抗体的双重免疫测定的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

用于抗sars-cov-2抗体的双重免疫测定的组合物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

公开了含有多重化学发光检测系统的试剂盒和用于检测样品中的抗SARS‑CoV‑2抗体的存在和/或浓度的微流体装置以及方法。试剂盒、微流体装置和方法利用与发射以不同波长的光的两种或更多种荧光分子组合的单线态氧可激活的化学发光化合物。在某些非限制性实施方案中，试剂盒、微流体装置和方法可以区分响应疫苗接种生成的抗SARS‑CoV‑2抗体与响应感染生成的抗SARS‑CoV‑2抗体。

Description

用于抗SARS-COV-2抗体的双重免疫测定的组合物、试剂盒和 方法
相关申请的交叉引用/通过引用并入的声明
不适用。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
背景技术
医学诊断领域利用许多不同形式的分析技术。当怀疑患者感染微生物(例如但不限于细菌或病毒)时，可以对来自患者的生物样品执行测定，以检测通过患者的免疫系统产生的针对微生物的抗体。
当需要检测患者血清和血浆中的抗病毒或抗细菌抗原抗体(例如但不限于IgG、IgM和/或IgA)时，已采用桥接血清学测定，其中固定化的病毒/细菌抗原和标记的病毒/细菌抗原经常用于配制测定试剂。在另一个实例中，乳胶颗粒凝集测定利用病毒/细菌抗原包被的乳胶颗粒作为单一试剂，其在患者样品中的抗病毒/细菌抗原抗体的存在下聚集。
商业上使用的测定的一个实例是发光氧通道测定(Luminescent OxygenChanneling Assay)技术。/>高级化学发光测定例如在美国专利号5，340，716(Ullman等人)中进行描述，所述美国专利的全部内容通过引用明确并入本文。目前可用的/>技术具有高灵敏度并使用几种试剂。特别地，/>测定要求这些试剂中的两种(被称为“感光珠(sensibead)”和“发光珠(chemibead)”)由其它特异性结合配偶体测定试剂以这样的方式保持，由此感光珠和发光珠彼此紧密接近，以实现信号。当暴露于以特定波长的光时，感光珠释放单线态氧，并且如果两种珠紧密接近，则单线态氧转移到发光珠；这引起化学反应，其导致发光珠释放出可以在不同波长下进行测量的光。
在2020年6月，美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)(FDA)对于通过Siemens Healthineers(Tarrytown，NY)开发的基于实验室的总抗体测试颁发了紧急使用授权(Emergency Use Authorization)(EUA)，所述总抗体测试用于检测血液中的总SARS-CoV-2抗体，包括IgM和IgG的存在。这种免疫测定基于平台，并且被称为CV2T/>免疫测定。
SARS-CoV-2病毒的表面上的刺突蛋白致使病毒能够穿透并感染多种器官和血管中发现的人细胞。Siemens Healthineers的Total Antibody COV2T CV2T免疫测定设计为检测针对刺突蛋白的受体结合结构域(RBD)的抗体。这些抗体中的一些被认为中和SARS-CoV-2病毒，并且因此预防感染。
另外，对于SARS-CoV-2已开发并利用了多种疫苗，其包括在其焦点内的刺突蛋白，包括广泛使用的Pfizer/BioNTech、Moderna、Johnson&Johnson(Janssen)和Oxford-AstraZeneca COVID-19疫苗。因此，免疫的患者目前正在产生针对SARS-CoV-2刺突蛋白的抗体。
因此，本领域需要用于检测SARS-CoV-2抗体的存在的新的和改进的免疫测定，其可以区分响应疫苗接种产生的抗体与响应感染产生的抗体，并且从而克服了现有技术的缺点和缺陷。本公开正是涉及此类测定，以及含有其的试剂盒和微流体装置以及使用其的方法。
附图说明
图1示意性地描绘了SARS-CoV-2总(COV2T)测定(Siemens Healthineers，Tarrytown，NY)。
图2和图3示意性地描绘了按照本公开构建的双重免疫测定形式的一个非限制性实施方案。图2描绘了所利用的试剂，而图3描绘了在抗SARS-CoV-2抗体的存在下形成的复合物。
图4和5示意性地描绘了按照本公开构建的双重免疫测定形式的另一个非限制性实施方案。图4描绘了所利用的试剂，而图5描绘了在抗SARS-CoV-2抗体的存在下形成的复合物。
具体实施方式
在通过示例性语言和结果详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，本公开在其应用方面并不限于下述描述中阐述的构建细节和组分布置。本公开能够具有其它实施方案，或者能够以各种方式实践或进行。像这样，本文使用的语言意图给予最广泛的范围和含义；并且实施方案意欲是示例性的-而非详尽的。另外，应理解，本文采用的措辞和术语是用于描述的目的，并且不应被视为限制性的。
除非本文另有定义，否则与本公开结合使用的科学和技术术语应该具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另有要求，否则单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。前述技术和程序一般根据本领域众所周知，并且如在本说明书自始至终引用且讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法执行。与本文所述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学结合利用的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成和化学分析。
本说明书中提到的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物明确地通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个个别专利或出版物具体地和个别地指出通过引用并入。
按照本公开，无需过度实验可以制备且执行本文公开的所有物品、组合物、试剂盒和/或方法。虽然已按照特定实施方案描述了物品、组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文描述的物品、组合物、试剂盒和/或方法以及方法的步骤或步骤顺序应用变化，而不脱离本公开的概念、精神和范围。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改被认为在如由所附权利要求限定的本公开的精神、范围和概念内。
如按照本公开利用的，除非另有说明，否则下述术语应理解为具有下述含义：
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，术语“一个”或“一种”可以意指“一个/种”，但它也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义一致。像这样，除非上下文另有明确说明，否则术语“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“化合物”可以指一种或多种化合物、两种或更多种化合物、三种或更多种化合物、四种或更多种化合物、或者更多数目的化合物。术语“多个”指“两个或更多个”。
术语“至少一个”的使用应理解为包括一个以及多于一个的任何数目，包括但不限于2、3、4、5、1 0、15、20、30、40、50、100等。术语“至少一个”可以延伸直到100或1000或更多，这取决于它与之附着的术语；另外，100/1000的数量并不视为限制性的，因为更高的限制也可产生令人满意的结果。另外，术语“X、Y和Z中的至少一个”的使用应理解为包括单独的X、单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。例如，序数数字术语(即“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或多个项目的目的，并不意欲暗示项目超过另一个的任何顺序或次序或重要性或者任何添加次序。
权利要求中术语“或”的使用用于意指包含性的“和/或”，除非明确指出仅指替代物或除非替代物是互相排斥的。例如，条件“A或B”满足下述中的任一种：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且A和B均为真(或存在)。
如本文所用，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何提及意指与实施方案结合描述的特定元件、特征、结构或特性包括在至少一个实施方案中。例如，在说明书各处出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”并不一定都指相同的实施方案。进一步地，对一个或多个实施方案或实例的所有提及被解释为对权利要求是非限制性的。
本申请自始至终，术语“约”用于指示值包括组合物/仪器/装置的固有误差变化、用于确定值的方法、或研究物体中存在的变化。例如但不作为限制，当利用术语“约”时，指定值可以从指定值变化正或负百分之二十、或百分之十五、或百分之十二、或百分之十一、或百分之十、或百分之九、或百分之八、或百分之七、或百分之六、或百分之五、或百分之四、或百分之三、或百分之二或百分之一，如此类变化适于执行所公开的方法并且如本领域普通技术人员所理解的那样。
如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)、或“含有(contain)”(以及任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容或开放式，并且不排除另外未列举的要素或方法步骤。
如本文所用，术语“或其组合”指该术语之前列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”预期包括以下中的至少一种：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定背景下是重要的，则也是BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员应理解，除非根据上下文另外显而易见，否则通常对任何组合中的项目或术语的数目没有限制。
如本文所用，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况完全发生、或者随后描述的事件或情况在很大程度上或范围内发生。例如，当与特定事件或情况相关时，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况在至少80％的时间、或至少85％的时间、至少90％的时间、或至少95％的时间发生。术语“基本上相邻的”可以意指两个项目彼此100％相邻，或者两个项目彼此紧密相邻，但并非彼此100％相邻，或者两个项目之一的一部分与另一个项目并非100％相邻，而是与另一个项目紧密相邻。
如本文所用，短语“与……相关”和“与……偶联”包括两个部分彼此的直接相关/结合以及两个部分彼此的间接相关/结合两者。例如，相关/偶联的非限制性实例包括一个部分通过直接键或通过间隔基团与另一个部分的共价结合，一个部分直接或借助于与部分结合的特异性结合对成员与另一个部分的非共价结合，例如通过将一个部分溶解于另一个部分中或通过合成、并且将一个部分涂布到另一个部分上，将一个部分掺入另一个部分内。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且指这样的物质，其在其结构中包含与给定化合物相同的基本碳骨架和碳官能度，但也可以含有关于其的一个或多个取代。如本文所用，术语“取代”应理解为指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。
如本文所用，术语“样品”应理解为包括可以按照本公开利用的任何类型的生物样品。可以利用的流体生物样品的实例包括但不限于全血或其任何部分(即血浆或血清)、尿、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等等。
如本文在术语“生物素特异性结合配偶体”或“靶分析物特异性结合配偶体”中特别(但不作为限制)使用的，术语“特异性结合配偶体”应理解为指能够分别与生物素或靶分析物特异性相关的任何分子。例如但不作为限制，结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即无机基质)、其组合或衍生物、以及能够分别与生物素或靶分析物特异性结合的任何其它分子。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且指例如完整的单克隆抗体和多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、显示出分析物结合所需的生物活性的抗体片段及其缀合物(例如但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、双抗体、单链抗体和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其它抗体片段及其缀合物)、抗体替代蛋白或肽(即，改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。抗体可以具有任何类型或类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
如本文所用，术语“半抗原”指小蛋白质或非蛋白质抗原决定簇(或“表位”)，其能够被靶分析物特异性结合配偶体，例如(但不限于)抗体识别。如本文所用，术语“多半抗原(polyhapten)”应理解为指含有与其附着的多种表位/抗原决定簇的合成分子。
“分析物”是能够被分析物特异性结合配偶体，例如(但不限于)抗体识别的大分子。分析物和半抗原两者均包含至少一种抗原决定簇或“表位”，其是与分析物特异性结合配偶体(即抗体)结合的抗原或半抗原的区域。通常，半抗原上的表位是整个分子。
本公开的某些非限制性实施方案涉及用于检测样品中的抗SARS-CoV-2抗体的多重测定以及含有其的试剂盒及其使用方法。在一些测定实施方案中，信号产生系统(sps)成员包含敏化剂例如光敏剂，以及两种或更多种化学发光-荧光分子组合物(其中第一化学发光组合物生成与抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体的存在相关的信号，而至少第二化学发光组合物生成与抗SARS-CoV-2抗体的存在相关的信号，所述抗SARS-CoV-2抗体针对除刺突蛋白外的另一种SARS-CoV-2蛋白(例如但不限于SARS-CoV-2核衣壳蛋白、包膜蛋白或膜蛋白))；在这些测定实施方案中，敏化剂的激活导致激活化学发光组合物的产物，从而生成与待检测的结合的抗SARS-CoV-2抗体的量相关的可检测信号。本公开可以基于其的测定平台的示例性(但非限制性)实施方案是发光氧通道测定(Siemens Healthcare DiagnosticsInc.，Tarrytown，NY)。/>测定例如在美国专利号5,340,716(Ullman等人)中进行描述，所述美国专利的全部内容通过引用明确并入本文。
本公开的某些非限制性实施方案涉及用于执行多重测定的试剂盒，其利用化学发光检测系统用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度。试剂盒包括：(a)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物、以及由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；(b)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物、以及由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；(c)生物素化的第一靶抗原；(d)生物素化的第二靶抗原；以及(e)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；并且其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
SARS-CoV-2刺突蛋白的全部或任何部分可以用作按照本公开的第一靶抗原。在某些非限制性实施方案中，第一靶抗原包括SARS-CoV-2S1蛋白的至少一部分，例如(但不限于)S1蛋白的受体结合结构域(RBD)的至少一部分。
在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基的受体结合结构域(RBD)。RBD S1抗原可以从本领域已知的任何来源获得。例如(但不作为限制)，该特定抗原从GenScript(Piscataway，NJ)；Meridian Life Sciences，Inc.(Memphis，TN)；Sino Biological US Inc.(Wayne，PA)；ACROBiosystems(Newark，DE)；Biorbyt，LLC(St.Louis，MO)；Icosagen，AS(San Francisco，CA)；和Bios Pacific Inc.(Emeryville，CA)商购可得。
另一种SARS-CoV-2蛋白的全部或任何部分可以用作第二靶抗原。在某些非限制性实施方案中，第二靶抗原包括SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分、SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分、或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
化学发光化合物(化学发光剂)是可化学激活的化合物，并且作为此类激活的结果，发射以某一波长的光。作为说明性而非限制性的化学发光剂的实例包括：例如，能够与单线态氧或过氧化物反应，以形成氢过氧化物或二氧杂环丁烷(dioxetane)的烯烃，其可以分解为酮或羧酸衍生物；可以通过光的作用分解的稳定的二氧杂环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮的乙炔；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基的腙或酰肼，例如(但不限于)鲁米诺；以及可以形成内过氧化物的芳香族化合物。作为激活反应的后果，化学发光剂直接或间接引起光的发射。
在某些实施方案中，单线态氧可激活的化学发光化合物可以是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解。包含化学发光化合物的组合物可以直接被激活的化学发光化合物激发；可替代地，组合物可以进一步包含被激活的化学发光化合物激发的至少一种荧光分子。
敏化剂是一种分子，通常是一种化合物，其生成用于激活化学发光化合物的反应性中间体，例如单线态氧。在一些非限制性实施方案中，敏化剂是光敏剂。可以(通过例如酶和金属盐)化学激活的其它敏化剂包括，例如但不限于，可以伴随或不伴随通过外部光源的激活产生单线态氧的其它物质和组合物。例如，某些化合物已显示催化过氧化氢转换为单线态氧和水。其它敏化剂物质和组合物的非限制性实例包括：碱土金属Ca、Sr和Ba的氧化物；以d0构型的3A、4A、SA和6A族元素的衍生物；锕系元素和镧系元素的氧化物；以及氧化剂CIO-、BrO-、Au3+、IO3 -和IO4 -；以及特别地，钼酸根、过氧钼酸根、钨酸根和过氧钨酸根离子，以及乙腈。在此通过引用以其整体明确并入本文的下述参考文献，提供了关于也落入本公开的范围内的敏化剂物质和组合物的进一步公开内容：Aubry，J.Am.Chem.Soc.，107：5844-5849(1985)；Aubry，J.Org.Chem.，54：726-728(1989)；和Brauer，Inorg.Chem.，31：3468-3471(1992)；Niu和Foote，Inorg.Chem.，31：3472-3476(1992)；Nardello等人，Inorg.Chem.，34：4950-4957(1995)；Aubry和Bouttemy，J.Am.Chem.Soc.，119：5286-5294(1997)；以及Almeida等人，Anal.Chim.Acta，482：99-104(2003)；所述参考文献各自的全部内容在此通过引用明确并入本文。
还包括在光敏剂的范围内的是这样的化合物，其并非真正的敏化剂，但在通过热、光、电离辐射或化学激活的激发下，将释放单线态氧的分子。这类化合物的成员包括例如(但不作为限制)内过氧化物，例如1，4-双羧乙基-1，4-萘内过氧化物；9，10-二苯基蒽-9，10-内过氧化物；和5，6，11，12-四苯基萘5，12-内过氧化物。通过这些化合物的加热或直接吸收光释放单线态氧。
光敏剂是例如通过经由用光激发生成单线态氧，用于激活光活性化合物的敏化剂。光敏剂是光可激活的并且包括例如染料和芳香族化合物，并且通常是由共价键合的原子构成的化合物，通常具有多个共轭双键或三键。化合物应该吸收在约200nm至约1，100nm波长范围内的光，例如(但不限于)约300nm至约1，000nm范围或约450nm至950nm范围，具有在激发波长下在其吸光度最大值下大于500M-1cm-1、或大于5,000M-1cm-1、或大于50,000M- 1cm-1的消光系数。光敏剂应该是相对光稳定的，并且可能不与单线态氧有效反应。作为说明性而非限制性的光敏剂的实例包括：丙酮；二苯甲酮；9-噻吨酮；曙红；9，10-二溴蒽；亚甲蓝；金属卟啉，例如(但不限于)血卟啉；酞菁；叶绿素；孟加拉玫瑰红；和巴克敏斯特富勒烯(buckminsterfullerene)；以及这些化合物的衍生物。
可以按照本公开利用的化学发光化合物和光敏剂的特定的非限制性实例在美国专利号5,340,716(Ullman等人)中阐述，所述美国专利的全部内容在此通过引用明确并入本文。
本领域已知或本文另外考虑的任何生物素特异性结合配偶体可以按照本公开利用。在某些非限制性实施方案中，生物素特异性结合配偶体是针对生物素的抗体。在其它非限制性实施方案中，生物素特异性结合配偶体是抗生物素蛋白或其类似物。
本领域已知或本文另外考虑的任何抗生物素蛋白类似物都可以按照本公开利用，只要该抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类似物：(1)能够与敏化剂结合；(2)能够与生物素化的分析物特异性结合配偶体结合；并且(3)能够与样品中可能存在的生物素结合。可以按照本公开利用的抗生物素蛋白类似物的非限制性实例包括Kang等人(J Drug Target(1995)3：159-65)中公开的那些，其全部内容通过引用明确并入本文。抗生物素蛋白类似物的特定的非限制性实例包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、中性亲和素(Neutravidin)、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其它形式的修饰的或遗传改造的抗生物素蛋白、上文任一种的酯、盐和/或衍生物等等。
本领域已知的能够被激活的化学发光化合物激发，并且发射以特定的、可检测波长的光的任何荧光分子都可以按照本公开用作(a)和(b)的荧光分子(以及(e)，如果存在的话)，只要通过每个荧光分子产生的信号可从所利用的其它荧光分子产生的信号中检测到。即，(a)的荧光分子必须发射与(b)的荧光分子发射的光的波长充分不同的波长的光，使得当同时检测时，两个信号可以彼此区分开。在一个特定的(但非限制性的)实例中，按照本公开利用的每个荧光分子独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。例如(但不作为限制)，关于当同时检测时可以彼此区分的两种或三种信号的生成，铽发射以约545nm波长的光，铀发射以约612nm波长的光，并且钐发射以约645nm波长的光。
本公开的某些非限制性实施方案涉及与本文上文描述的试剂盒相同的试剂盒，不同之处在于(c)和(d)的生物素化的抗原被替换为至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白(Ig)抗体。因此，在该试剂盒中，试剂(a)和(b)是与上文试剂盒相同，然后试剂盒进一步包括(c)至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白(Ig)抗体；以及(d)包含敏化剂并具有与其结合的生物素特异性结合配偶体的组合物(即，与上文(e)相同的组合物)。如在上述试剂盒中，第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
抗人Ig抗体可以特异性地结合本领域已知或本文另外考虑的任何人免疫球蛋白分子的任何部分。例如(但不作为限制)，抗体可以针对人IgG、IgE、IgM、IgD和/或IgA，和/或其任何部分(例如但不限于抗人γ链、抗人H+L、抗人轻链等等)。抗人Ig抗体(包括但不限于抗人IgG、抗人IgM和/或抗人IgA抗体，以及识别两种或更多种人免疫球蛋白抗体的抗体)是本领域众所周知，广泛商购可得的，并且已得到广泛研究。例如(但不作为限制)，抗人IgG单克隆抗体和/或多克隆抗体的几个商业来源包括Rockland Immunochemicals，Inc.(Pottstown，PA)；USBiological Life Sciences(Swampscott，MA)；Santa CruzBiotechnology，Inc.(Dallas，TX)；Jackson Inmuno Research Labs，Inc.(West Grove，PA)；Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)；以及Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO)。然而，该列表并非包括一切的，并且存在可以按照本公开利用的抗人Ig抗体的许多另外的商业来源。因此，本领域普通技术人员将清楚且明确地能够鉴定且选择可以按照本公开利用的各种抗人Ig抗体，并且像这样，抗人Ig抗体或其特性的进一步描述被视为不必要的。
组合物/试剂盒/微流体装置/方法的测定组分/试剂可以以允许其按照本公开发挥功能的任何形式提供。例如但不限于，每种试剂可以以液体形式提供，并且以散装和/或单一等分试样形式设置在试剂盒内。可替代地，在一个特定的(但非限制性的)实施方案中，一种或多种试剂可以以单一等分试样冻干试剂的形式设置在试剂盒中。干燥试剂在微流体装置中的使用在美国专利号9，244，085(Samproni)中进行详细描述，所述美国专利的全部内容在此通过引用明确并入本文。
除本文上文详细描述的测定组分/试剂之外，试剂盒还可以进一步含有其它试剂，用于进行本文描述或另外考虑的任何特定测定。这些另外试剂的性质将取决于特定的测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技能内；因此，其进一步描述被视为不必要的。另外，取决于组分/试剂的交叉反应性和稳定性，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/区室中，或者各种组分/试剂可以组合在一个或多个容器/区室中。另外，试剂盒可以包括组分/试剂设置于其中的微流体装置。
试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以广泛变化，以提供组分/试剂的浓度，其基本上优化在测定方法期间需要发生的反应，并且进一步基本上优化测定的灵敏度。在适当的情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以作为干粉例如冻干粉末提供，并且试剂盒可以进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以这种方式，可以从这些组分获得具有适当浓度的试剂溶液，用于执行按照本公开的方法或测定。试剂盒中还可以包括阳性和/或阴性对照。另外，试剂盒可以进一步包括解释如何使用该试剂盒的一组书面说明书。这种性质的试剂盒可以用于本文描述或另外考虑的任何方法中。
本公开的某些另外的非限制性实施方案涉及微流体装置，其包括本文上文描述的任何试剂盒的组分。特别地，某些非限制性实施方案包括用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的微流体装置。微流体装置包括(i)通过其施加样品的入口通道；以及(ii)能够与入口通道流体连通的至少第一区室。(ii)的区室含有本文上文描述的第一试剂盒的试剂(a)-(e)(其中(c)和(d)是生物素化的抗原)或本文上文描述的第二试剂盒的试剂(a)-(d)(其中(c)是至少一种生物素化的抗人Ig抗体)。
本文上文详细描述的或本文另外考虑的任何单线态氧可激活的化学发光化合物、敏化剂、荧光分子、靶抗原、生物素特异性结合配偶体和抗人Ig抗体可以用于本公开的微流体装置中。
例如，在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，(a)和(b)的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，第一靶抗原是SARS-CoV-2S1蛋白的至少一部分，例如(但不限于)其RBD。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分、SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分、或SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，敏化剂是光敏剂。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，(iii)的生物素特异性结合配偶体是抗生物素蛋白或其类似物，或者是针对生物素的抗体。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。例如(但不作为限制)，铽发射以约545nm波长的光，铀发射以约612nm波长的光，并且钐发射以约645nm波长的光。
在某些非限制性实施方案中，(ii)的所有元件(a)-(e)或(a)-(d)(取决于试剂盒)存在于同一区室中。在替代的非限制性实施方案中，元件(a)-(e)或(a)-(d)(取决于试剂盒)在两个或更多个区室之间拆分。
装置可以具有允许该装置按照本公开发挥功能的区室的任何布置和各种组分在其间的分布。
微流体装置的任何区室都可以进行密封，以将设置于其中的试剂维持在基本上气密的环境中直到其使用；例如，含有冻干试剂的区室可以进行密封，以防止试剂的任何无意重构。入口通道和一个区室以及两个区室可以被描述为彼此“能够流体连通”；该短语指示每个区室可能仍是密封的，但这两个区室在其中或其间形成的密封刺穿后能够具有在其间的流体流动。
本公开的微流体装置可以具有本领域已知或本文另外考虑的任何其它所需的特征。例如但不限于，本公开的微流体装置可以进一步包括读取室；读取室可以是含有本文上文描述的试剂的任何区室，或者读取室可以与所述区室流体连通。微流体装置可以进一步包括一个或多个另外的区室，其含有其它溶液，例如(但不限于)洗涤溶液、稀释溶液、赋形剂、干扰溶液、阳性对照、阴性对照、质量控制等等。这些另外的区室可以与一个或多个其它区室流体连通。例如，微流体装置可以进一步包括含有洗涤溶液的一个或多个区室，并且这些区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。在另一个实例中，微流体装置可以进一步包括含有用于溶解一种或多种干燥试剂的赋形剂的一个或多个区室，并且该区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。在又一个进一步的实例中，微流体装置可以包括含有稀释溶液的一个或多个区室，并且该区室可能能够与装置的任何其它区室流体连通。
某些非限制性实施方案还涉及用于检测样品中的生物素和至少一种另外的靶分析物的存在和/或浓度的方法。方法包括下述步骤。
在第一步中，将疑似含有抗SARS-CoV-2抗体的样品与本文上述第一试剂盒的组合物(a)-(e)或本文上述第二试剂盒的组合物(a)-(d)同时或者全部或部分地序贯组合。
在第二步中，使组分一起温育，以允许(a)和(c)与样品中的抗SARS-CoV-2-刺突蛋白抗体(即，当第一靶抗原是S1的RBD时，抗SARS-CoV-2-RBD抗体)的结合，以允许(b)和(d)与样品中的针对第二靶抗原的抗SARS-CoV-2抗体的结合，并且允许(c)和(d)与(e)的结合。(a)与(e)的间接结合导致刺突蛋白复合物的形成，并且(b)与(e)的间接结合导致第二靶抗原复合物的形成。在刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物各自中，敏化剂与化学发光化合物非常接近。
在第三步中，激活敏化剂，以生成单线态氧，其中刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物中存在的敏化剂的激活引起每种复合物中存在的化学发光化合物的激活。
在第四步中，通过测量经由(a)的荧光分子发射的光量来确定通过刺突蛋白复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-刺突蛋白抗体的量与发射的光量成正比。
在第五步中，通过测量经由(b)的荧光分子发射的光量来确定通过第二靶抗原复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-第二靶抗原抗体的量与发射的光量成正比。
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，该方法可以进一步包括以下的第六步：基于步骤(4)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应疫苗接种而生成，并且基于步骤(5)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应感染而生成。
在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，步骤(2)-(5)可以重复一次或多次。
本文上文详细描述或本文另外考虑的任何单线态氧可激活的化学发光化合物、敏化剂、荧光分子、靶抗原、生物素特异性结合配偶体和抗人Ig抗体可以用于本公开的方法中。
例如，在某些特定的(但非限制性的)实施方案中，(a)和(b)的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，第一靶抗原是SARS-CoV-2S1蛋白的至少一部分，例如(但不限于)其RBD。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分、SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分、或SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，敏化剂是光敏剂，并且步骤(3)中敏化剂的激活包括用光照射(例如但不限于在约680nm处的照射)。
在特定的(但非限制性的)实施方案中，(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。例如(但不作为限制)，铽发射以约545nm波长的光，铀发射以约612mm波长的光，并且钐发射以约645nm波长的光。
对于其需要关于抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的测定的任何样品都可以用作按照本公开的方法的样品。样品的非限制性实例包括生物样品，例如但不限于全血或其任何部分(即血浆或血清)、尿、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。特定的非限制性实例包括裂解的全血细胞和裂解的红血细胞。
如上文提到的，该方法的各种组分以组合(同时或序贯地)提供。当序贯地添加该方法的各种组分时，组分的添加次序可以不同；本领域普通技术人员可以确定将不同组分加入测定中的特定所需次序。当然，最简单的添加次序是同时添加所有材料并确定由此产生的信号。可替代地，每种组分或组分组可以序贯地组合。在某些实施方案中，在一次或多次添加之后可以涉及温育步骤。
在一个替代的(但非限制性的)实施方案中，方法的步骤(1)包括首先将样品与生物素化的试剂(即，两种生物素化的靶抗原或至少一种生物素化的抗人Ig抗体)组合，并且在添加包含单线态氧可激活的化学发光化合物和包含敏化剂的组合物之前使其温育。可替代地，方法的步骤(1)可以包括首先将样品、生物素化的试剂(即，两种生物素化的靶抗原或至少一种生物素化的抗人Ig抗体)和包含单线态氧可激活的化学发光化合物的组合物组合，并且在添加包含敏化剂的组合物之前使其温育。
虽然本公开的特定实施方案被描述为具有测定形式，但应理解，本公开还涉及其它测定形式(以及试剂盒、微流体装置和执行其的方法)，对于其需要响应疫苗接种生成的SARS-CoV-2抗体与响应感染生成的SARS-CoV-2抗体的区分。例如(但不作为限制)，本公开还包括这样的测定形式，其中可以利用不同的信号分子例如(但不限于)与在不同波长下生成信号的不同酶连接的不同抗体，以代替本文上文描述的含有化学发光化合物的组合物。
实施例
下文提供了实施例。然而，应理解本公开在其应用方面并不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。相反，实施例仅作为各个实施方案之一提供并且意欲为示例性的而非详尽的。
实施例1
在2020年6月，美国食品和药物管理局对于通过Siemens Healthineers(Malvern，PA)开发的基于实验室的总抗体测试颁发了紧急使用授权(EUA)，所述总抗体测试用于检测血液中的SARS-CoV-2抗体，包括IgM、IgA和IgG的存在。SARS-CoV-2病毒的表面上的刺突蛋白致使病毒能够穿透并感染多种器官和血管中发现的人细胞。Siemens Healthineers’Total Antibody COV2T测定显示于图1中，并且设计为检测针对刺突蛋白的RBD的抗体。这些抗体中的一些被认为中和SARS-CoV-2病毒，并且因此预防感染。处于开发中的用于SARS-CoV-2的多种潜在疫苗在其焦点内包括刺突蛋白。
图1的测定形式利用均含有SARS-CoV-2抗原的两种试剂：包含用荧光素标记的SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基的受体结合结构域(S1的RBD)预先形成的抗FITC发光珠的第一试剂，以及通过通用链霉抗生物素蛋白包被的感光珠与生物素化的S1的RBD的结合而形成的第二试剂。
本公开的免疫测定形式添加了(i)第二发光珠，其具有来自与其附着的不同SARS-CoV-2蛋白的第二抗原以及与之相关的不同荧光分子，和(ii)用于与链霉抗生物素蛋白包被的感光珠相互作用的生物素化的第二抗原。以这种方式，两次免疫测定在具有样品的单一反应中发生。
在该实施例中，描述了双重免疫测定的使用，以同时检测患者的样品中来自SARS-CoV-2的抗核衣壳(NC)和抗刺突蛋白抗体。还已开发了一种软件算法，以报告患者的样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体是否由于感染和/或疫苗接种而生成，以及每种抗体的滴度。
在该实施例中且如图2中所示的，LOCI测定用下述试剂进行构建：
首先，以常规方式用链霉抗生物素蛋白包被的通用感光珠。
其次，产生两种类型的生物素化的SARS-CoV-2病毒抗原：生物素化的核衣壳蛋白或其一部分(生物素-NC)；以及生物素化的刺突蛋白或其一部分(可以是S1或其RBD＝生物素-RBD在本文中用于表示这种组分)。
第三，产生两种类型的发光珠(CB)：用铽染色(TCB)且用核衣壳蛋白或其一部分包被(NC-TCB)的CB；以及用铕染色(ECB)且用刺突蛋白或其一部分包被(RBD-ECB)的CB。应注意的是，染料和抗原的这些特定组合仅用于示例的目的。任何发光珠染料都可以与任何抗原蛋白一起使用。唯一的要求是存在的两种发光珠具有在不同波长下发荧光的不同染料。
具有抗原附着的发光珠可以以与上文提到的商购可得的总-SARS-CoV-2测定中利用的发光珠相同的方式形成(即，通过将荧光素标记的S1的RBD与抗FITC发光珠缀合)。可替代地，抗原可以直接缀合至发光珠的表面。
两种类型的发光珠的荧光分子(即，铽和铕、或其它荧光分子)彼此不同，并且发射以不同波长的光；以这种方式，可以在同一反应容器中同时执行关于针对两种SARS-CoV-2抗原的抗体的测定，因为含有针对第一靶抗原的抗体的复合物在与含有针对第二靶抗原的抗体的复合物不同的波长下进行检测。可替代地，两种抗体测定可以序贯执行，但在同一反应容器中(即，通过将单一反应容器传递到两个不同的检测器，用于在不同波长下的信号测量)。
在一个非限制性实施方案中，使用下述反应顺序。然而，应理解，试剂的添加次序可以通过本领域普通技术人员容易地改变且优化。因此，下述反应顺序仅用于示例的目的，并非本公开的方法的限制。
将生物素化的第一靶抗原和第二靶抗原(即，生物素-NC和生物素-RBD)与疑似含有抗SARS-CoV-2抗体(抗SC2 Ab)的患者样品组合。然后添加两种发光珠(即NC-TCB和RBD-ECB)，并且使反应混合物温育以允许夹心形成。当存在针对核衣壳蛋白的抗SARS-CoV-2抗体(aNC-Ab)时，形成下述夹心：
生物素-NC：：aNC-Ab：：NC-TCB。
当存在针对S1的RBD的抗SARS-CoV-2抗体(aRBD-Ab)时，形成下述夹心：
生物素-RBD：：aRBD-Ab：：RBD-ECB。
然后感光珠(SB)以过量添加，并且反应混合物这样进行温育，使得上文形成的夹心被感光珠捕获。当存在针对核衣壳蛋白的抗SARS-CoV-2抗体(aNC-Ab)时，形成下述复合物：
SB：：生物素-NC：：aNC-Ab：：NC-TCB。
当存在针对S1的RBD的抗SARS-CoV-2抗体(aRBD-Ab)时，形成下述复合物：
SB：：生物素-RBD：：aRBD-Ab：：RBD-ECB。
应注意的是，感光珠是具有与其结合的多种生物素特异性结合配偶体的通用试剂。因此，虽然紧上文的两种夹心复合物在本文上文描述为两种分开的、离散的夹心复合物，但理论上可能的是两种类型的夹心(即，生物素化的靶抗原：：抗SARS-CoV-2抗体：：靶分析物包被的发光珠)可以与相同的感光珠结合。
一旦使反应混合物温育足够的时间以允许在靶抗体的存在下形成上文两种复合物(如图3中所示的)，就通过在680nm下的激发光触发化学发光反应以释放单线态氧(1O2)。在反应混合物中，可以发生(i)和(ii)之一或两者：
(i)当存在SB：：生物素-NC：：aNC-Ab：：NC-TCB复合物时，由于空间接近，单线态氧从感光珠扩散到发光珠，并且触发在545nm处的光子释放，并且这可以通过定制为接收在545nm处的光的PMT进行检测(这可以与具有旋转滤光片一样)；和
(ii)当存在SB：：生物素-RBD：：aRBD-Ab：：RBD-ECB复合物时，由于空间接近，单线态氧从感光珠扩散到发光珠，并且触发在612nm处的光子释放，并且这可以通过定制为接收在612nm处的光的PMT进行检测(这是当前的LOCIPMT检测)。
通常，将检测到两种基本情形：来自单独的(ii)的信号或来自(i)和(ii)的信号的组合。如果检测到由单独的或与(ii)组合的(i)的复合物生成的信号，则抗体是由于感染。如果仅存在由(ii)的复合物生成的信号，则抗体是由于疫苗接种。
在一个非限制性实施方案中，由(i)和(ii)的两种类型的复合物生成的信号然后被馈送到仪器的软件中编程的下述算法内：
(a)如果仅接收到612nm信号，则测定仅检测到抗SARS-CoV-2RBD抗体，并且该抗体是由于疫苗接种。
(b)如果仅接收到545nm信号，则测定仅检测到抗SARS-CoV-2NC抗体，并且该抗体是由于感染，最可能是来自感染的早期阶段。
(c)如果检测到612nm和545nm信号两者，则至少一些抗体是由于感染。例如(但不作为限制)，可能存在下述情形：
1)如果612nm信号强于545nm信号，则患者可以具有由单独的感染或疫苗接种和感染两者生成的抗体。
2)如果612nm信号不像545nm信号一样强或弱于545nm信号，则患者具有感染。
在某些非限制性条件下，可能期望输出如上文的区分(b)和(c)的信息。在其它非限制性条件下，可能期望仅报告样品的“无感染”相对于“感染”状态，其仅分别区分(a)的信号与(b)/(c)的组合；即，样品中的任何抗SARS-CoV-2NC抗体的检测应该输出关于样品的“感染”状态的报告。
虽然本文上文描述了生物素化的靶抗原(即，生物素-NC和生物素-RBD)的使用，但应理解，这两种生物素化的试剂可以被替换为一种或多种生物素化的抗人Ig抗体作为以双重免疫测定形式的替代方案。
SARS-CoV-2S蛋白的RBD部分已用于上文实施例中，因为来自患者的中和抗体与RBD结合，以防止RBD与人细胞膜上的ACE2(受体)结合；因此，利用RBD作为病毒抗原的免疫测定正在检测针对刺突蛋白的RBD的患者抗体。2021年已在美国在紧急使用授权(EUA)下得到授权的Pfizer-BioNTech和Moderna COVID-19疫苗均由整个S蛋白制成。像这样，本公开的范围包括整个S蛋白作为本文所述的任何双重免疫测定中的抗原的用途。然而，由于整个S蛋白与其它病毒的同源性，使用CoV-2RBD而不是整个S蛋白作为抗原可能看到更特异性的信号。
虽然本文上文描述了含有铽和铕的发光珠，但应理解，可以使用在更宽的范围内不同的波长下发荧光的荧光分子的组合。例如，可以使用由钐染料(SCB)(其在645nm处释放光子)染色的发光珠来代替ECB，并且相应地定制PMT。
进一步地，本公开的多重测定可以适于同时检测针对三种或更多种SARS-CoV-2靶分析物的抗体。关于针对待检测的靶分析物的每种另外抗体，添加另外的组分如发光珠抗原和生物素化的抗原，其中另外的组分中存在的荧光分子与第一荧光分子和第二荧光分子的不同之处在于：它在与第一荧光分子和第二荧光分子不同且可分开检测的波长下发射光。以这种方式，可以在单一反应中检测到针对两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种SARS-CoV-2靶抗原的抗体，只要用于检测每种的发光珠含有不同的荧光分子，其各自在不同且可分开检测的波长下发射光；像这样，在单一反应中可以检测到多少种不同抗体的限制因素是如本文所述发挥功能的可用的荧光分子数目。
本公开的双重免疫测定形式可用于确定患者的抗SARS-CoV-2抗体是来自感染还是来自疫苗接种。这种检测形式还可用于确定疫苗接种是否不仅在无感染的人中有效，而且在具有过去COVID-19感染的人中也有效。
实施例2
该实施例的双重免疫测定类似于上文实施例1中描述的测定形式。然而，这种免疫测定形式的不同之处在于，不是利用生物素化的靶抗原，而是利用至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白抗体，以与样品中的抗SARS-CoV-2抗体结合，以与分别的发光珠形成夹心，然后捕获由感光珠形成的夹心。
在该实施例中且如图4中所示的，LOCI测定用下述试剂进行构建：
首先，如实施例1中所述的获得通用感光珠。
其次，如实施例1中所述的产生两种类型的发光珠(NC-TCB和RBD-ECB)。
第三，产生至少一种生物素化的抗人Ig抗体。
在一个非限制性实施方案中，使用下述反应顺序。然而，应理解，试剂的添加次序可以通过本领域普通技术人员容易地改变且优化。因此，下述反应顺序仅用于示例的目的，并非本公开的方法的限制。
将至少一种生物素化的抗人Ig抗体(抗hIg Ab)与疑似含有抗SARS-CoV-2抗体(抗SC2 Ab)的患者样品组合。然后添加两种发光珠(即NC-TCB和RBD-ECB)，并且使反应混合物温育以允许夹心形成。当存在针对核衣壳蛋白的抗SARS-CoV-2抗体(aNC-Ab)时，形成下述夹心：
生物素-抗hIg Ab：：aNC-Ab：：NC-TCB。
当存在针对S1的RBD的抗SARS-CoV-2抗体(aRBD-Ab)时，形成下述夹心：
生物素-抗hIg Ab：：aRBD-Ab：：RBD-ECB。
然后感光珠(SB)以过量添加，并且反应混合物这样进行温育，使得上文形成的夹心被感光珠捕获。当存在针对核衣壳蛋白的抗SARS-CoV-2抗体(aNC-Ab)时，形成下述复合物：
SB：：生物素-抗hIg Ab：：aNC-Ab：：NC-TCB。
当存在针对S1的RBD的抗SARS-CoV-2抗体(aRBD-Ab)时，形成下述复合物：
SB：：生物素抗hIg Ab：：aRBD-Ab：：RBD-ECB。
应注意的是，感光珠是具有与其结合的多种生物素特异性结合配偶体的通用试剂。因此，虽然紧上文的两种夹心复合物在本文上文描述为两种分开的、离散的夹心复合物，但理论上可能的是两种类型的夹心(即，生物素化的抗人Ig抗体：：抗SARS-CoV-2抗体：：靶分析物包被的发光珠)可以与相同的感光珠结合。
一旦使反应混合物温育足够的时间以允许在靶抗体的存在下形成上文两种复合物(如图5中所示的)，就通过在680nm下的激发光触发化学发光反应以释放单线态氧(1O2)。在反应混合物中，可以发生(i)和(ii)之一或两者：
(i)当存在SB：：生物素-抗hIg Ab：：aNC-Ab：：NC-TCB复合物时，由于空间接近，单线态氧从感光珠扩散到发光珠，并且触发在545nm处的光子释放，并且这可以通过定制为接收在545nm处的光的PMT进行检测(这可以与具有旋转滤光片一样)；和
(ii)当存在SB：：生物素-抗hIg Ab：：aRBD-Ab：：RBD-ECB复合物时，由于空间接近，单线态氧从感光珠扩散到发光珠，并且触发在612nm处的光子释放，并且这可以通过定制为接收在612nm处的光的PMT进行检测(这是当前的LOCIPMT检测)。
由(i)和(ii)的两种类型的复合物生成的信号然后被馈送到仪器的软件中编程的下述算法内：
(a)如果仅接收到612nm信号，则测定仅检测到抗SARS-CoV-2RBD抗体，并且该抗体是由于疫苗接种。
(b)如果仅接收到545nm信号，则测定仅检测到抗SARS-CoV-2NC抗体，并且该抗体是由于感染，最可能是来自感染的早期阶段。
(c)如果检测到612nm和545nm信号两者，则下述情形：
1)如果612nm信号强于545nm信号，则患者具有由疫苗接种和感染两者生成的抗体。
2)如果612nm信号不像545nm信号一样强或弱于545nm信号，则患者具有感染。
虽然本文上文描述了含有铽和铕的发光珠，但应理解，可以使用在更宽的范围内不同的波长下发荧光的荧光分子的组合。例如，可以使用由钐染料(SCB)(其在645nm处释放光子)染色的发光珠来代替ECB，并且相应地定制PMT。
因此，按照本公开，已提供了完全满足上文阐述的目标和优点的组合物、试剂盒和装置，以及其生产和使用方法。尽管本公开已与上文阐述的具体附图、实验、结果和语言结合进行描述，但明显的是许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，意图涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

Claims (44)

1.一种用于执行多重测定的试剂盒，其利用化学发光检测系统用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度，所述试剂盒包含：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)生物素化的第一靶抗原；
(d)生物素化的第二靶抗原；和
(e)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
2.权利要求1的试剂盒，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
3.权利要求1的试剂盒，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
4.权利要求1的试剂盒，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
5.权利要求1的试剂盒，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
所述敏化剂是光敏剂；和
(e)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
6.权利要求1的试剂盒，其中(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。
7.一种用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的微流体装置，所述微流体装置包括：
(i)通过其施加样品的入口通道；
(ii)至少第一区室，其能够与所述入口通道流体连通并且含有：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)生物素化的第一靶抗原；
(d)生物素化的第二靶抗原；和
(e)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
8.权利要求7的微流体装置，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
9.权利要求7的微流体装置，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
10.权利要求7的微流体装置，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
11.权利要求7的微流体装置，其中(a)-(e)存在于同一区室中。
12.权利要求7的微流体装置，其中(a)-(e)在两个或更多个区室之间拆分。
13.权利要求7的微流体装置，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
所述敏化剂是光敏剂；和
(e)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
14.权利要求7的微流体装置，其中(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。
15.一种用于检测样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将疑似具有SARS-CoV-2抗体的样品与以下同时或者全部或部分地序贯组合：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)生物素化的第一靶抗原；
(d)生物素化的第二靶抗原；和
(e)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分；
(2)允许(a)和(c)与样品中的抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体的结合，允许(b)和(d)与样品中的针对第二靶抗原的抗SARS-CoV-2抗体的结合，并且允许(c)和(d)与(e)的结合，其中(a)与(e)的间接结合导致刺突蛋白复合物的形成，并且其中(b)与(e)的间接结合导致第二靶抗原复合物的形成，并且其中在刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物各自中，敏化剂与化学发光化合物非常接近；和
(3)激活敏化剂，以生成单线态氧，其中刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物中存在的敏化剂的激活引起每种复合物中存在的化学发光化合物的激活；
(4)通过测量经由(a)的荧光分子发射的光量来确定通过刺突蛋白复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-刺突蛋白抗体的量与发射的光量成正比；和
(5)通过测量经由(b)的荧光分子发射的光量来确定通过第二靶抗原复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-第二靶抗原抗体的量与发射的光量成正比。
16.权利要求15的方法，其进一步包括以下步骤：
(6)基于步骤(4)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应疫苗接种而生成，并且基于步骤(5)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应感染而生成。
17.权利要求15的方法，其进一步包括重复步骤(2)-(5)。
18.权利要求15的方法，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
19.权利要求15的方法，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
20.权利要求15的方法，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
21.权利要求15的方法，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
(e)的敏化剂是光敏剂，并且其中步骤(3)中的敏化剂的激活包括用光照射；和
(e)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
22.权利要求15的方法，其中所述样品是选自以下的生物样品：全血或其任何部分、尿、唾液、痰、脑脊液、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。
23.一种用于执行多重测定的试剂盒，其利用化学发光检测系统用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度，所述试剂盒包含：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白(Ig)抗体；和
(d)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
26.权利要求23的试剂盒，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
27.权利要求23的试剂盒，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
所述敏化剂是光敏剂；和
(d)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
28.权利要求23的试剂盒，其中(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。
29.一种用于确定样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的微流体装置，所述微流体装置包括：
(i)通过其施加样品的入口通道；
(ii)至少第一区室，其能够与所述入口通道流体连通并且含有：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白(Ig)抗体；和
(d)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分。
30.权利要求29的微流体装置，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
31.权利要求29的微流体装置，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
32.权利要求29的微流体装置，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
33.权利要求29的微流体装置，其中(a)-(d)存在于同一区室中。
34.权利要求29的微流体装置，其中(a)-(d)在两个或更多个区室之间拆分。
35.权利要求29的微流体装置，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
所述敏化剂是光敏剂；和
(d)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
36.权利要求29的微流体装置，其中(a)和(b)的荧光分子各自独立地选自铽、铀、钐、铕、钆和镝。
37.一种用于检测样品中的多种抗SARS-CoV-2抗体的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将疑似具有SARS-CoV-2抗体的样品与以下同时或者全部或部分地序贯组合：
(a)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第一靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子；
(b)组合物，其包含：
具有与其直接或间接结合的第二靶抗原的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
由激活的化学发光化合物激发的荧光分子，其中所述荧光分子不同于(a)的荧光分子并且发射与(a)的荧光分子不同波长的光；
(c)至少一种生物素化的抗人免疫球蛋白(Ig)抗体；和
(d)包含敏化剂的组合物，所述敏化剂能够在其激发态下生成单线态氧，并且具有与其直接或间接结合的生物素特异性结合配偶体；和
其中所述第一靶抗原是SARS-CoV-2刺突蛋白的至少一部分，并且其中所述第二靶抗原是除刺突蛋白外的SARS-CoV-2蛋白的至少一部分；
(2)允许(a)和(c)与样品中的抗SARS-CoV-2刺突蛋白抗体的结合，允许(b)和(c)与样品中的针对第二靶抗原的抗SARS-CoV-2抗体的结合，并且允许(c)与(d)的结合，其中(a)与(d)的间接结合导致刺突蛋白复合物的形成，并且其中(b)与(d)的间接结合导致第二靶抗原复合物的形成，并且其中在刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物各自中，敏化剂与化学发光化合物非常接近；和
(3)激活敏化剂，以生成单线态氧，其中刺突蛋白复合物和第二靶抗原复合物中存在的敏化剂的激活引起每种复合物中存在的化学发光化合物的激活；
(4)通过测量经由(a)的荧光分子发射的光量来确定通过刺突蛋白复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-刺突蛋白抗体的量与发射的光量成正比；和
(5)通过测量经由(b)的荧光分子发射的光量来确定通过第二靶抗原复合物中激活的化学发光化合物生成的化学发光量，其中所述样品中的抗SARS-CoV-2-第二靶抗原抗体的量与发射的光量成正比。
38.权利要求37的方法，其进一步包括以下步骤：
(6)基于步骤(4)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应疫苗接种而生成，并且基于步骤(5)的结果，确定样品中存在的抗SARS-CoV-2抗体响应感染而生成。
39.权利要求37的方法，其进一步包括重复步骤(2)-(5)。
40.权利要求37的方法，其中所述第一靶抗原包含S1蛋白的受体结合结构域(RBD)。
41.权利要求37的方法，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2核衣壳蛋白的至少一部分。
42.权利要求37的方法，其中所述第二靶抗原是SARS-CoV-2膜蛋白的至少一部分或SARS-CoV-2包膜蛋白的至少一部分。
43.权利要求37的方法，其中以下至少一种：
(a)和(b)各自的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间体种类的物质，所述中间体种类可以伴随同时或后续光发射而分解；
(d)的敏化剂是光敏剂，并且其中步骤(3)中的敏化剂的激活包括用光照射；和
(d)的生物素特异性结合配偶体选自抗生物素蛋白、抗生物素蛋白类似物和针对生物素的抗体。
44.权利要求37的方法，其中所述样品是选自以下的生物样品：全血或其任何部分、尿、唾液、痰、脑脊液、皮肤、肠液、腹腔内液、囊液、汗、间质液、细胞外液、泪、粘液、膀胱冲洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。
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