JPS6214064A - 置換カルボキシフルオレセイン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物体液例えば血清、血漿、を髄液、羊水およ
び尿中のリガンドを測定するための方法および試薬なら
びに試薬の製造法に関する。本発明けまた螢光偏光免疫
定量法での試薬として使用し得る新規な群のフルオレセ
イン誘導体に関する。

リガンドを測定するための拮抗結合免疫定量法は、供試
試料中のリガンドと標識試薬（トレーサーと称する）と
の間のリガンドおよびトレーサーに特異的な抗体上の限
られた数の受容体結合部位に対する拮抗に基くものであ
る。試料中のりカントの濃度は抗体と特異的に結合する
トレーサーの量を定める。生成するトレーサー−抗体複
合体の量は定量的に測定することができ、そして供試試
料中のリガンドの量に反比例する。

螢光偏光免疫定量技法は、螢光標識化合物は平面偏光で
励起するとその回転速度と逆の関係を有する偏光度を有
する螢光を発する原理に基いている。殊に、分子例えは
螢光標識を有するトレーサー−抗体複合体を平面偏光で
励起すると１発した光は高度に偏光したま＼である。そ
の理由は、螢光団は光が吸収される時と発光される時と
の間の回転により拘束されるからである０「自由な」（
すなわち、抗体に結合されていない）トレーサー化合物
を平面偏光で励起されるとき、その回転は相当するトレ
ーサー−抗体複合体の回転よりも一層速くなる。従って
、発光した光はよシ大巾に脱偏光される。それで、螢光
偏光によυ拮抗結合免疫定量法で生じるトレーサー−抗
体複合体の量を定量する手段が提供される。

螢光偏光技術は本出願人のワンプ（Ｗａｎｇ）等の米国
特許第４，４２０，５６８号で適用されていて、それは
螢光団としてトリアジニルアミノ−フルオレセイン部分
の使用に係るものである。当該技術分野では種々の他の
螢光像−化合物が知られている。例えば、米国特許第３
．９９８．９４３号には、螢光標識としてフルオレセイ
ンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用する螢光標識
されたインシュリン誘導体および螢光標識として４−ア
ミノフルオレセイン塩酸塩を使用する螢光標識されたモ
ルフイン誘導体の製造が記載されている。カルボキシフ
ルオレセインもまた分析測定のために使用されている。

Ｒ，Ｃ，チェノ（Ｃｈｅｎ）によるアナリテイカル・レ
ターズ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ　）
、第１０巻、第７８７頁（１９７７年）には、ホスホリ
パーゼの活性を指示するのにカルボキシフルオレセイン
の使用が記載されている。カルボキシフルオレセインは
レシチンリポンームに包膜され、またレシチンの加水分
解により放出されるときに限り螢光を発すると記載され
ている。本出願人の出願に係る米国特許出願第３２９，
９７４号（１９８１年１２月１１日出願）には、リガン
ド類似体と直接結合されている一群のカルボキシフルオ
レセイン誘導体が記載されている。本出願人の出願に係
るフィン（Ｆｉｎｏ）等の米国特許出願第４，４７６，
２２９号には、螢光偏光免疫定量法で試薬として有用な
一連のカルボキシフルオレセインのアミノ酸誘導体が記
載さねている。

本発明によって、当該技術分野で前述したものを超える
進歩が提供され、本発明においては使用される環状ピペ
ラジノ部分がリガンド類似体と螢光標識との間に半硬質
で非回転のスペイサ−およびリンカ−が提供される。リ
ガンド類似体に対するカルボキシフルオレセインまたけ
アミノフルオレセインの直接カップリングにより製造さ
れるトレーサーは抗体または受容体に対して往々にして
弱い結合を示す。その理由はフルオレセイン分子のかさ
により結合部位への適切な結合が阻害されるからである
。フルオレセインが線状結合基を経てリガンド類似体に
カップリングしているトレーサー（ｔｒａｅｅｒ　）は
結合されていたとしても低度の偏光を示し得る。それは
このような結合アームでは回転および屈曲に対する抵抗
性がほとんどないからである。

本発明は試料中のリガンドを測定する方法を包含し、本
発明の方法は ａ）次の構造式で示されるトレーサーの生物学的に許容
され得る塩を試料と混合し 〔上式中、 Ｌｉｇは　リガンド類似体であり； Ｒは０〜１２個の炭素、硫黄、窒素または酸素原子から
なり、他に充足されない上記原子の原子価をに足するに
足る水素を伴う追加結合基であり、ピペラジン環の４−
位アミン窒素に結合された反応性官能基を世有し、リガ
ンド類−似体は共通抗体またけその他の受容体結合部位
により特異的に２識されるようなリガンドと共通する一
つのエピトープおよび前記リガンドおよび前記トレーサ
ーを特異的に認識し得る抗体の最大限度であり、これに
よりトレーサー・抗体複合体が形成される〕；そして ｂ）工程＆）で形成されたトレーサー・抗体複合体のり
を試料中のりカントの濃度の標準として螢光偏光技法に
よって測定することからなる。

本発明は更に上述の方法で試薬として有用なある杵の新
規なトレーサーおよびその生物学的に許容し得る塩を包
含する。

本文で使用される用語「リカンド」は、結合蛋白質例え
は受答体または抗体が入手または形成される分子、特に
低分子量ハプテンを称する。このよりなノ・ブテンは、
動物に注入されたときに抗体形成を誘起しないが抗体に
対して反応性を有する一般に恢分子量の蛋白質を含まな
い化合物である。ハプテンに対する抗体は一般にまずノ
・ブテンを蛋白質に共役させそして共役生成物を動物に
注入することにより産出される。得られた抗体は通常の
周知の抗体単離技術により単離される。

本文で使用される「リガンド類似体」なる用語は、その
実債的な部分が、受容体の結合部位に対するリガンドと
拮抗し得る決定因子もしくはエピトープ部位のｌｆｉま
たはそれ以上を定義するリガンドと同じ空間および極性
機構を有する一価または多価のラジカルを称する。この
ようなりガント類似体の特長Ｌ、このものはりカントに
対する抗体により認識されるように対象のりガントと十
分な構造類似性を有していることである。たいていの場
曾、リガンド類似体は分子表面の重要な部分について対
象となるリガンドと同一のまたは実質的に同一の構造お
よび荷電分布（空間および極性機構）を有している。往
々にして、・・ブテンに対する結合部位はりガントに対
して結合するためトレーサーで使用されているのと、抗
体生産のため抗原の製造において同一であるので、抗体
のための鋳型を提供するりガント類似体の１Ｆｒｊ一部
分がトレーサー中のリガンド類似体により曝される。

本文で使用される「フルオレセイン」なる用１ｔＦＦｉ
ｔ、本文中の構造式においてフルオレセイン部分が個々
の化合物としてまたはより大きい化合物の構成分として
存在する鳩舎で、閉環および一環型双方を包含し、螢光
に関連する点を除いて、特別な分子について存在してい
たときは、１記のとおりである。開環形態は螢光が生じ
るのに必要である。

リガンド、リガンド類似体およびフルオレセイン本発明
の方法により画定可能なりガントは広範囲にわたって変
化する。高分子量りガントも測定し得るが、鰍善の結果
を得るには、比較的低分子量、すなわち約５０〜４００
０ダルトンの範囲内のりガントを測定するのに本発明の
方法を使用するのが一般に好ましい。約１００〜２００
０の範囲の分子量を有するリガンドを本発明の方法によ
って測定するのが更に好ましい。

本発明の方法で測定可能なリガンドの代表的なものＫは
、ステロイド例えはエストリオール、エストロン、エス
トラジオール、コーチゾル、テストステロン、グロゲス
テロン、デオキシコール酸、リトコール酸およびそれら
のエステルおよびアミド誘導体；ビタミン例えばＢ−１
２およびＳ：酸；ホルモン例エバチロキシン、トリヨー
ドチロキシン、ヒス　／タミン、セロトニン；グロスタ
グランジン例えはＰＧＥ。

ＰＧＦ％ＰＧＡ；抗喘息剤例えはテオフィリン；抗カン
剤例ｔばドキソルビシン、およびメトトレキセート；抗
不整脈剤例えはジンビラマイト、リドカイン、プロ力イ
ンアミド、プロパノロール、キニジンおよびＮ−アセチ
ループロカインアミト奮抗けいれん剤例えばフエノバル
ビタール、フェニトイン、ピリミドン、バルプロン酸、
カルパムアゼビン、およびエトスフシイミド；抗生物質
例えばペニシリン、セファロスポリンおよびパン」マイ
シン；抗関節炎剤例えばサリチレート；抗うつ剤、二環
化合物例えばノルトリブチリン、アミトリブチリン、イ
ミプラミンおよびデスイブラミン；ならびに免役抑制剤
例えばシクロスポリン等、ならびにこれらの代謝物が包
含される。本発明の方法により測定可能な更に他のリガ
ンドには、所謂「濫用薬物」例えばモルヒネ、ヘロイン
、ヒドロモルホン、オキシモルホン、メタボン、コテイ
ン、ヒドロコドン、ジヒドロコディン、ジヒドロヒドロ
キシコデイノン、ホルコデイン、デキストロメトルファ
ン、フェンシフリジン、テトラヒドロカナピノール、フ
エナゾシンおよびデオニンならびにそれらの代謝物が包
含される。

一般に、式（１）でＬｉｇで示されるリガンド類似体の
組は対応するりガントからＲで示される基に結合する部
位で水素原子または水酸基を除去することによって誘導
される。

水素原子の除去に基いてＬｉｇで示されるリガンド類似
体を形成し得るリガンドの代表例には、例えばプロ力イ
ンアミド、エトスフシイミド、フエノバルピタールおよ
びキニジンが包含される。アミン誘導体がリガンド類似
体として有用であるリガンドの代表例には、テオフィリ
ン、ノ２ルブロン酸、フエノバルビタール、フェニトイ
ン、フリミドン、ジンビラマイト、ジゴキシン、クロラ
ムフェニコール、サリチレート、アセトアミノフェン、
カルパムアゼビン、デスイブラミンおよびノルトリブチ
リンが包含される。水酸基の除去により有用なリガンド
類似体を生成するりガントの代表例には、ジギトキシゲ
ニンおよびジゴキシゲニンが包含される。更に、リガン
ドは１個捷たはそれ以上の官能基の付加、除去または置
換をして抗体に結合するための必要なエピトープ部位を
保持するりガント類似体を形成させることにより構造変
形させてもよい。しかし７、このようｉ変形リガンド類
似体は普通非変形リガンド類似体のために使用される同
じ部位を経て結合基Ｒに縮合されている。結合基Ｒが比
較的短い、普通長さ０〜４原子の範囲にあるのが好まし
い。

本発明はフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の
使用を包含している。特にトレーサー化合物の有用性の
ために必要なフルオレセインおよびその誘導体の性質は
フルオレセインの螢光である。フルオレセインは周囲の
酸濃度（ｐＨ）に基いて次の式で示される２穐の互変異
性体の形態で存在している。

ラクトン　　　　　　　　　　　　　　醗開環（酸）形
態では、多数の共役二重結合が存在し、これにより該形
態のフルオレセイン（およびフルオレセイン部分を含有
する化合物）が青色光を吸収し、そして約４ノナ秒の励
起状態の寿命の後縁色螢光を発し得るようになる。

開環および閉環形が共存しているときは、開環および閉
環形での分子の相対濃度がｐＨ濃度を調節することによ
り容易にに更される。一般に、本発明のトレーサー化合
物は生物学的に許容し得る塩例えばナトリウム、カリウ
ム、アンモニウム等として溶液中に存在し、これによっ
て本発明の分析方法で使用する場合、該化合物が開環、
螢光形態で存在することか可能となる。存在する特定の
塩はｐＨ濃度を調節するのに用いる緩衝剤に左右され、
例えば、りん酸ナトリウム緩衝剤の存在下では本発明の
化合物は一般にナトリウム塩として開環形態で存在する
。

フルオレセイン分子の炭素原子の番号付けは分子の開環
もしくは閉環形態であるかどうかを考慮することに基い
て変る。従って、フルオレセインおよびその化合物に関
する文献は炭素原子の番号付けについては統一されてい
ない。

閉環形態では、フェニル環のラクトンのカルボニルに対
するパラ−炭素が６の番号である。開環形では、フェニ
ル壇上のカルボン酸基に対するパラ−炭素が５の番号で
ある（上記の式を参照）。この記載では、開環形態の番
号付けを採用する。それは合成に使用する市販の原料が
最も普通に該システムで番号が付けられているからであ
る。従って、カルボキシ基の反対にあるフルオレセイン
およびその化合物の炭素原子を本発明の説明のために“
６″の番号を付ける。

本発明の方法によって、測定すべきリガンドを含む試料
を式（１）のトレーサーの生物学的に許容し得る塩およ
びリガンドとトレーサーとに特異的な抗体と混和する。

試料中に存在するりガントおよびトレーサーが限られた
数の抗体部位について拮抗し、結果としてリガンド−抗
体およびトレーサー−抗体複合体が形成される。トレー
サーおよび抗体の濃度を一定に維持することにより、形
成されるリガンド−抗体複合体対トレーサー−抗体複合
体の比が試料中に存在するりガントの量に正比例する。

従って、混合物を偏光で励起し、そしてトレーサーおよ
びトレーサー−抗体複合体により発する螢光の偏光を測
定すると、試料中のりガントのｉｔ定全的に測定するこ
とが可能となる。

抗体に複合されていない溶液中のトレーサーは吸収に必
要な時間以下で自由に回転し、そして再発光される光は
比較的不規則に配向し、その結果抗体に複合されていな
いトレーサーの螢光偏光が低く、零に近く々る。特定の
抗体と複合させると、このようにして形成されたトレー
サー−抗体複合体は比較的小さいトレーサー分子の回転
よりも遅い抗体分子の回転を示し、これにより観察され
る偏光が増大する。従って、リガンドが抗体部位に対す
るトレーサーと拮抗する場合、自由トレーサーおよびト
レーサー−抗体複合体の得られた混合物の螢光のＩｌ！
察される偏光はトレーサーとトレーサー−抗体複合体と
の中間の値をとる。試料が高濃度のリガンドを含有する
ときは、観察された偏光値は自由リガンドの値に近くな
り、すなわち低くなる。供試試料が低濃度のリガンドを
含有するときは、偏光値は結合リガンドの値に近くなり
、すなわち高くなる。免疫定量法の反応混合物を垂偉次
いで水平に偏光された光で順次励起しそして発光された
光の垂直偏光成分のみを解析することにより、反応混合
物での螢光偏光が正確に測定し得る。偏光と測定すべき
りガントの濃度との正確な２停は既知の濃度の検量体の
偏光値を測定することにより確立される。リガンドの濃
度はこのようにして作成した標準曲線から内挿すること
ができる。

本発明の方法を実施するｐＨは式（１）のトレーサーを
イオン化状態で存在せしめるのに十分でなければならな
い。ｐＨは約３〜１２、更に普通には約５〜１０、最も
好ましくは約６〜９の範囲にある。検定操作中ｐＨを達
成、維持するのに種々の緩衝剤を使用することができる
。代表的な緩衝剤には、ホウ酸塩、酢酸塩、シん酸塩、
炭酸塩、トリス、バルピタール等が包含される。使用さ
れる特別な緩衝剤は本発明にとって限定的ではないが、
個々のアッセイにおいて使用される抗体および測定され
るリガンドに鑑み特定の緩衝剤が好ましいこともある。

緩衝剤のカチオン部分は一般に溶液中のトレーサー塩の
カチオン部分を決定する。

本発明の方法は適度の温度、好ましくは一定の温度で実
施される。温度は通常Ｏ℃〜約５０℃、更に通常には約
り５℃〜約４０℃の範囲にあろう 本発明に従って検定し得るリガンドの濃度は一般に約１
０−２〜約１０”Ｍ、更に通常には約１０−４〜約１０
−”Ｍに変り得る。当初の試料を希釈して高濃度のリガ
ンドを検定することができる。

対象となるリガンドの濃度範囲に加えて、例えば検定が
定量的、半定量的または定性的であるか否から構成され
る装置およびトレーサーおよび抗体の特徴などの考慮に
より、使用されるトレーサーおよび抗体の濃度が普通決
定される。

試料中のりガントの濃度範囲が他の試薬すなわちトレー
サ−および抗体の濃度範囲を定めて検定の感度を通常最
適なものとするが、個々の試薬濃度は経験的に定めらね
る。トレーサーおよび抗体の適切な濃度は当業者により
容易に確定される一 本発明の部分を形成するものではないが、螢光偏光免疫
定量法は本発明に従って試薬および検定操作を用いて米
国、−イリノイ（ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）、アボットバー
ク（Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ）、アボット・ラボラトリ
ーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）か
ら市販されているＴＤｘ−フルオレセンス・ポーラリゼ
ーション６アナライザー（ＴＤｘ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｃｅ　Ｐｏ１ａｒｉｚａｔｉｏｎＡｎａｌｙｚｅｒ）
　（その操作および特徴の細部は同社から入手可能であ
る）で特に有利に達成し得ることが理解されるべきであ
る。

試薬 本発明のトレーサーは式（１）で示される一般構造式で
表わすことができる。

本発明の好せしいトレーサーは５−カルボキシフルオレ
セインまたは６−カルボキシフルオレセインの誘ｅ’！
たけその混合物として特徴づけられ、そして次の式（３
）および（４）で表わされる。

これらの化合物は普通次の式（５）マたは（６）のカル
ボキシフルオレセイン出発物質から製造され、また次の
式（７）または＜８＞ヲ有するピペラジノカルボキシフ
ルオレセイン中間体を用いて合成することもできる。

５−カルボキシフルオレセイン ６−カルボキシフルオレセイン ５−ピペラジノヵルボキシフルオレセインリ ６−ピペラジノヵルボキシフルオレセインリガンド＠似
体をピペラジン埠の４−位窒素に結合させるのに穐々の
化学結合を使用することができる。式（９ａ）の如く、
水素または他の炭素原子にのみ結合している炭素原子に
窒素原子を結合させて３級アミンを形成させることがで
きる。４−位窒素原子をカルボニル基の一部を形成して
いる炭素原子に結合させることができる。この場合、こ
の炭素原子の残りの原子価が他の炭素原子に結合されて
いるときは、３級カルボキサミド結合が形成される（式
９ｂを参照）０残りの原子価が酸素原子に結合されてい
るときは、カーバメートまたはウレタン結合が形成され
る（式９Ｃを参照）。残留原子価が窒素に結合されてい
るときは、結合は尿素である（式９ｄを参照）っ４−位
窒素がチオカルボニル基の一部を形成する炭素原子に結
合されているときは、炭素の残りの原子価が別の炭素原
子または窒素に結合されているか否かＫよって、チオア
ミド（式９ｅ）またはチオ尿素（式９ｆ）結合が形成さ
れる。４−位窒素が窒素に対して二′Ｍｉ合でおる炭素
原子に結合して、炭素の残りの原子価が別の炭素原子ま
たは窒素に結合しているか否かによって、アミジン（式
９ｇ）またはグアニジン（式９ｈ）を形成し得る。ピペ
ラジン環の４−位窒素はまた＋６醒化状態で硫黄に結合
することもでき、硫黄の残りの原子価が炭素または別の
窒素原子に結合しているか否かによって、スルホンアミ
ド（式９ｊ）またはスルホニル尿素（式９ｋ）を形成さ
せることもできる。

ｂ）　　）レーサーの合成 本発明のトレーサーにおいて、カルボキシフルオレセイ
ンとピペラジン環窒素の一つとの間、式（１）の結合基
Ｒとピペラジン環窒素の他のものとの間およびリガンド
類似体Ｌｉｇと結合基Ｒとの間の化学結合は合成上都合
のよい任意の順序で行うことができる。５−またけ６−
カルボキシフルオレセインをピペラジンにカップリング
させて式（７）および（８）で示した先駆体を形成させ
、脱離基試薬例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１
−ヒドロキシペンゾチナゾール、ｐ−ニトロビエンド等
プラス活性化試薬例えはジシ（９ｍ）　　　　　　　　
　　　（ｃａｂ）（９ｃ）　　　　　　　　　　　（９
ａ）（９ｅ）　　　　　　　　　　　（ｃａｒ）（９ｇ
）　　　　　　　　　　　　（９ｈ）（９ｊ）（９ｋ） クロへキシルカルボジイミド、ジインプロピルカルボジ
イミド等との反応によりフルオレセインカルボン酸を活
性化し、次いでこの活性化形態をピペラジンと反応させ
るのが往々にして好ましい。これらのピペラジノカルボ
キシフルオレセインを大量で製造し、後日の使用のため
に保存する。

ピペラジンまたはピペラジノカルボキシフルオレセイン
の一種をリガンド類似体または追加の結合基にカップリ
ングさせて３級アミンを形成させるのは、いくつかの経
路の一つで実施することができる。リガンド類似体また
は結合基が脱離基とのアルキル化官能性例えはブロマイ
ド、アイオダイドまたはスルホネートエステルを担有し
ている時は、カップリングは、通常若干の塩基性または
アルカリ性試薬の存在下、アルキル化によシ実施される
。リガンド類似体または結合基がカルボニル官能性例え
ばケトンまたはアルデヒド等を担有しているときは、カ
ップリングはビベラジン窒素との縮合次いで水素および
触媒によるかまたは水素化物還元剤例えばホウ水素化物
捷たはシアノホウ水素化物による還元によって実施され
、ここで縮合および還元工程は単一の反応容器で実施す
ることができる。

リガンド類似体または結合基がカルボン酸を担有してい
る場合、ピペラジン窒素へのカルボキサミド結合が通常
確立される。カップリングは、フルオレセインカルボン
酸のピペラジンへのカップリングについて上述した方法
でカルホン酸ヲ醇ハライド例えば酸クロライドとしであ
るいは活性エステルとして活性化することによりあるい
は酸を対称もしくは混合無水物等に変換し、次いで活性
化された形態をピペラジンとまたはピペラジンカルボキ
シフルオレセインと反応させることにより実施される。

ピペラジンとりカント類似体または結合基との間のカー
バメート結合は普通ホスケンまたはホスゲン均等試薬例
えはトリクロロメチルクロロホルメートまたはカルボニ
ルジイミダゾール等の助けによってピペラジン窒素をア
ルコール性酸素に結合させることによって達成される。

理論上、出発物質のいずれか一方をホスゲン試薬と反応
させ次に他方にカップリングさせることが可能である。

実際には、まずアルコールをホスケン試薬と反応させ、
次に得られたクロロホルメートまたは均等物をピペラジ
ン部分と反応させるのが一般には好ましい。

ピペラジンとりカント類似体との間の尿素結合は、イン
シアネートまたはカルバモイルクロライドまたはりカン
ト類似体の均等誘導体をピペラジンまたはピペラジノカ
ルボキシフルオレセインと反応させることにより達成さ
れる。

インシアネートは１級アミンからホスケンまたはホスゲ
ン均等物例えばトリクロロメチルクロロホルメートまた
はカルボニルジイミダゾールで処理することにより製造
することができる。カルボニルクロライドまたはそれら
の均等物は同じ方法で２級アミンから製造される。リガ
ンド類似体がホスゲンまたはホスゲン反応の他の成分と
反応するかまたは破壊される追加の官能性を含有してい
るときは、まずホスゲンまたはホスゲン均等物をモノ保
護基を有するピペラジンまたけ保護されたピペラジノカ
ルボキシフルオレセインと反応させ、次いでこのように
して生成されたカルバモイルクロライドをリガンド類似
体のアミン誘導体と反応させ、そして最後に保護基を除
去することによって結合を確立するのが一般に好せしい
。

チオアミド結合は通常アミド（上記の製造）を適当な溶
媒中玉硫化りんと共に加熱することにより確立される。

ピペラジン窒素とりガント類似体の窒素との間のチオ尿
素結合は、ホスゲンの代りにチオホスゲンを使用する以
外は上記の尿素結合と同じ方法で製造される。

アミジン結合はリガンド類似体のニトリル誘導体を無水
アルコール例えばメタノールまたはエタノールで塩化水
素の存在下に処理することによって行われる。得られた
イミノエステルを次にピペラジンまたはピペラジノカル
ボキシフルオレセインと反応させる。

スルホンアミド結合を確立するには、リガンド類似体の
活性化スルホン酸誘導体例えばスルホニルクロライドを
ピペラジンまたはピペラジノカルボキシフルオレセイン
ト反応させる。スルホニルクロライドはスルホン酸から
塩素化試薬例えば五塩化りん、塩化チオニル、ホスホリ
ルクロライド等で処理することによって製造される。芳
香環にスルホニルクロライド基を直接導入するのはクロ
ロ硫酸での処理によって達成される。

実施例 実施例１〜９は本発明の思想に従って実施した実験を記
載し、そしてトレーサーおよび前駆物質の合成に関する
。

実施例１０〜１２は螢光偏光技術を用いる免疫定量法に
おける本発８１のトレーサーの適合性を説明している。

かかる免疫定量法は次の一般操作に従って行われる。

１）標準または供試血清の測定量を試験管に送り入れ、
そして緩衝液で希釈する。

２）界面活性剤を随意含有する本発明のトレーサー（濃
度既知）を各試験管に加える。

３）抗血清（ｍ度既知）を試験管に加える。

４）反応混合物を室温で培養する。

５）抗体と結合したトレーサーの量を試料中のりガント
の量の尺度として螢光偏光技術で測定する。

実施例１：６−ピペラジノカルボキシフルオレセイン乾
燥ピリジン１，２５−中の６−カルボキシフルオレセイ
ン３９ｑ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物
１７ｔｑ、およびジシクロへキシルカルボジイミド６２
１９の溶液を氷水浴温度で０．５時間かくはんし、そし
て室温で２５時間かくはんした。この溶液をグラスウー
ルを通して乾燥ピリジン０．１−中のピペラジン８６■
の溶液にｒし入れた６１５分間かくはんした後、生成物
の沈殿をエチルエーテルの添加によって完結させると式
（８）の構造を有する明るい赤色のピペラジノカルボキ
シフルオレセイン共役物が得られた。

実ｍｆｌ＋２　：　ｓ−ピペラジノカルボキシフルオレ
セイン式（７）の構造を有する化合物を実施例１の方法
に従って製造する。

ベンゼン中のホスゲン１０チ溶液５−中の５−フェニル
−５−（２−ヒドロキシエチル）バルビッール酸２５η
の実施例５：３−デオキシ−３−（Ｎ−ピペラジノ）ジ
ギトキシゲニン 無水メタノール１〇−中のジギトキシゲニンー３−オン
１８６．５＋１９、ピベラジンニｔｉｌ！塩５５７■お
よびシアノホウ水素化ナトリウム３６■の混合物を窒素
雰囲気下周囲の温黒で１４日間かくはんした。３Ｍ塩酸
二、二連を加えて反応を、や冷し、そして溶媒を除去し
た。残漬を０４５Ｍ塩酸にとり、そして濾過しだ。残留
溶液のｐＨを８．５に調節し、そしてジクロロメタンで
抽出し尽した。溶媒を乾燥、除去すると３−ピペラジノ
誘導体８０■が残った。

ピリジン０．２５−中の５−カルボキシフルオレセイン
１９７＋〜、シンクロヘキシルカルボジイミド２０．６
９およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド７ηの溶液を周
囲の温度で５時間放置した。出現した沈殿を除き、そし
て溶液を３−デオキシ−３−（Ｎ−ピペラジノ）ジギト
キシゲニン２２■に加えた。反応を周囲の温度で一夜進
行させ、そしてクロロホルム−メタノールで展開した厚
層シリカゲルクロマトグラフィーで次の構造式を有する
純粋な生成物を単実施例６の方法に従って次の構造を有
する化合物を製造した。

オキサゼパム（Ｏｘａｚｅｐａｍ　）を乾燥テトラヒド
ロフラン１．０−中に１５〜溶解し、ベンゼン中の１０
％ホスゲン０．４−およびピリジン０．００８ｍＪを加
え、そして周囲の温度で一夜かくはんしてオキサゼパム
を相当するクロロホルメートに変換した。溶媒および過
剰の試薬をロータリーエバポレーターで除去し、そして
残漬をジメチルホルムアミド０．２−にとった。ジメチ
ルホルムアミド０．２−中の６−ピペラジノカルボキシ
フルオレセイン（実施例１の方ＬＫ従って６−カルボキ
シフルオレセイン２０■から１１りにへ遺した）の溶液
を加え　次いでピリジン０．１　ｗｔｌを加え、そして
混合物を２．．５日周囲の温度でかくはんした。粗製物
質をクロロホルム−メタノールで展開したシリカゲル厚
層プレートでのクロマトグラフィーにより精製すると次
の構造を廟する火質的に純粋なトレーサーが得られた。

ジギトキシゲニン９．４岬を乾燥テトラヒドロフラン０
２．ｌに溶解シフ、セして宰温で３時間ベンゼン中の１
０％ホスゲン約０．１２−と反応させることにより、ジ
ギトキシゲニンを和尚するクロロホルメートに変撲した
。溶媒および過剰の試薬をロータリーエバポレーターで
除き、残漬を乾燥ジメチルホルムアミド０．１　ｍｌに
溶解し、そして別のジメチルホルムアミド０．１５−中
の６−ピペラジノカルボキシフルオレセイン（実施例１
の方法に従って６−カルボキシフルオレセイン１４．８
Ｈｉから新たに製造した）と混合した。

溶液を一夜周囲の温度で放置し、そして粗生成物１をヘ
キサン−アセトン−酢酸で展開するＩｎシリカゲルプレ
ートでのクロマトグラフィーにより精製すると次の構造
を有するトレーサーが得られた。

Ａ）所要材料 １）ＯＩＭりん酸ナトリウム、ｐＨ７，５；　０．０１
チ（−〜）牛γ−グロブリンおよび０．１％（Ｗ／ｖ）
アジ化ナトリウムを含むＢＧＧ緩衝液。

２）　　０．１Ｍトリス緩伽液、ｐＨ７，５中の約１２
０ｎＭの濃度の６−ビペラジノカルボキシフルオレセイ
ンーフエノバルビタールカーパメート共役物；ｏ、ｉｓ
（１７ｖ）アジ化ナトリウム；０．０１％（”’／）牛
γ−グロブリン；２５チ（橡４）ジメチルホルムアミド
および１００／ｊη−でのオレイン酸からなるトレーサ
ー。

３）２％エチレングリコールを含むＢＧＧ緩衝液で適宜
希釈したフェノパルビタールー牛ｒ−血清アルプミン共
役物に対して増力された抗血清からなる抗血清。

４）　　０．１Ｍ）リス、ｐＨ７，５；　０．１　％　
（”／Ｖ　）アジ化ナトリウム；０．０１％（ｖ／ｖ）
牛γ−グロブリンおよび０．１％　（＝／Ｖ　）ドデシ
ル硫酸ナトリウムを含む前処理溶液。

５）正常な人血清に溶解したフエノパルビタールの適宜
の濃度からなる検量体。

Ｂ）アッセイ・グロトコール １）検量体もしくは定量すべき未知の試料の小アリコー
ト（０，６ｐｔ）　を前処理溶液２５μｔと混合しそし
てＢＧＧ緩衝液１．０−で希釈する。この点で偏光螢光
ノくツクグラウンドを測定する。

２）工程１からの検定溶液に試料の第二の０．６μｔア
リコートを抗血清溶液２５μｔ、トレーサー溶液２５μ
ｔ　および最終容量２．０−とするだめの緩衝液と共に
加えた。最終偏光螢光を次に読み取る。

３）トレーサー結合に因子螢光偏光が、最終検定混合物
の偏光螢光からパックグラウンドの偏光螢光を差引くこ
とによって得られる。

４）未知の試料に対する螢光偏光値を検量体の使用によ
って構成した標準曲線と対比し、そして未知の濃＃金内
挿法によって求める。

Ｃ）結果 ０〜５０μ２〆一の濃度でフェノバルピタールを含も一
連の人血消検量体の代表的な結果を以下に示す。各濃度
をＴＤｘアナライザーで重複して検定し、そして偏光値
を平均した。

ｒ）　　　　　　　　　　　　　０．２１９５　　　　
　　　　　　　　　０．１９４１０　　　　　　　　　
　　　０．１６９２０　　　　　　　　　　　　０．１
３８４０　　　　　　　　　　　　０、１０８８０　　
　　　　　　　　　　　０．０８４平均偏光は、フエノ
バルビタール濃度が増加するにつれて、規則正しく減少
していくことがみられ、滑かな標準曲線の構成を可能に
し、壕だ血清試料中のフェノバルビタールの定量のため
のこのトレーサーの価値を実証している。

Ａ）所要材料 １）ＢＧＧ緩衝液（実施例１０参照）。

２）ＢＧＧ緩衝液中約８２　ｎＭの濃度の６−ビペラジ
ノカルポキシフルオレセインーエトスクシイミドからな
るトレーサー溶液。

３）ＢＧＧ緩衝液で適宜希釈されたエトスフシイミド−
蛋白質共役体に対して増力された抗血清溶液。

４）０．１％アジ化ナトリウムを含む０１Ｍトリス（ｐ
Ｈ５，５）緩衝液中５％（−〜）５−スルホサリチル酸
を含む前処理溶液。

５）正常な人血清に溶解した適宜な濃度のエトスフシイ
ミドからなる検量体。

Ｂ）アッセイ・プロトコール 検定は、試料５μｔアリコートを工程１および２で使用
する以外は、フエノパルピタール（実施例１０）につい
てのと実質的に同一の方法で行う。

Ｃ）結果 ０〜１５０μｆ／−の濃度でエトスフシイミドを含む一
連の人血清検量体についての代表的な結果を以下に示す
。各濃度は実施例１０に記依の如（ＴＤｘアナライザー
で重複して検定し、そして偏光値を平均した。

０　　　　　　　　　　０．１９６ １２５　　　　　　　　　０．１９２ ２５　　　　　　　　　　０．１８８ ５０　　　　　　　　　　０．１８２ １００　　　　　　　　　　０．１７８１５０　　　　
　　　　　　０．１７５平均倫光はエトスフシイミド！
度が増加するにつれて規則正しく減少していくことがみ
られ、滑らかな標準曲線の構成を可能にしかつ血清試料
中のエトスフシイミドの定量のためのこのトレーサーの
価イーを実証している。

実施例１２：ジギトキシン検定 Ａ）所要材料 １）ＢＧＧ緩衝液（実施例１０吃照）。

２）適当な添加により緩衝液中適宜の濃度に希釈された
フルオレセインービペラジンージギトキシゲニン共役体
からなるトレーサー。

３）２チエチレングリコールを含むＢＧＧ緩衝液中適当
に希釈され、そしてジギトキシー蛋色質共役体に体して
増力された抗血清からなる抗血清。

４）トリクロロ酢酸５％（−〜）水溶液からなる抽出剤
溶液。

５）ＢＧＧ緩衝剤中２０％（ｗ／ｖ）サリチル酸からな
る前処理溶液。

６）プールした正常人血清中のジギトキシンの０５．１
０．２０．３０および５０　ｎｔ／−からなる検量体。

７）適当な遠心管を伴う９，５００ＸｒＯ力を得ること
のできる遠心分離材。

１）各検量体もしくは未知の試料の２００μｔアリコー
トを遠心管にピペットで入れ、抽出剤溶液２ｏｏｐｔで
処理し、十分に混合しそして３分間遠心分離する。

２）この溶液１７５μｔアリコートを抗血清および前処
理溶液各２５μｔで予備希釈する。

３）工程１の遠心分離からの上澄液の６０μｔに等しい
予備希釈された試料の量をＢＧＧ緩衝液で１．０　ｍ／
ｉｔとなし、そして偏光螢光バックグラウンドを測定す
る。

４）工程３からのアッセイ溶液に、予備希釈された試料
の第二の等容量を、トレーサー溶液２５μｔと共に加え
、そして緩衝液を加えて最終容量２０−とする。最終偏
光螢光読みをとる。

５）未知の試料に対する螢光偏光値を検量体を用いて構
成した標準曲線と対比し、それらから未知のＷを内挿法
で求める。

Ｃ）結果 ０〜５０ｎｆ／−の濃度でジギトキシンを含有する一連
の人血清検量体に対する代表的が結果を層下に示すり各
濃度を前述の如くしてＴＤｘアナライザーを用いて重複
して検定し、そして偏光値を平均した。

０　　　　　　　０．１３４　　　　０．１２７５　　
　　　　０．１２４　　　　０．１１７１０　　　　　
　０．１１６　　　　０．１１２２０　　　　　　０．
１００　　　　０．０９８３０　　　　　　０．０８５
　　　　０．０８３５０　　　　　　０．０６３　　　
　０．０６５ジギトキシン濃度が増加するにつれて、平
均偏光が規則正しく減少することがみられ、滑らかな標
準曲線を構成することができ、また血清試料中のジギト
キシンの定量でのこれらのトレーサーの価値が実証され
る。

本文の発明の特定の記載から当業者は本発明の精神およ
び範囲を逸脱することなく種々の変形、変化をなし得る
ことが明らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｌｉｇはリガンドと共通する少くとも１個のエ
   ピトープを有して共通抗体または受容体結合部位により
   特異的に認識され得るようなリガンド類似体であり；そ
   して Ｒは０〜１２個の炭素、窒素、硫黄または酸素原子から
   なり、他に充足されていない上記原子の原子価を充足す
   るのに十分な水素原子を伴つている結合基である〕 を有するトレーサー、リガンドおよびトレーサーを特異
   的に認識し得る抗体の溶液を混合し；そして抗体に結合
   されたトレーサーの量を試料中のリガンドの量の標準と
   して螢光偏光により測定することからなる液体試料中の
   リガンドの存在またはその濃度を測定する方法。 ２、リガンドが５０−４０００の範囲内の分子量を有す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、リガンドが薬物またはホルモンあるいはその代謝物
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記薬物が抗けいれん剤、強心配糖体、トランキラ
   イザー、抗うつ剤、抗喘息剤、抗高血圧剤、抗ガン剤、
   抗関節炎剤、刺剤、麻薬、向精神剤、または同化剤であ
   る特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記薬物がフエノバルビタールである特許請求の範
   囲第４項記載の方法。 ６、前記薬物がエトスクシイミドである特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ７、前記薬物がジギトキシンである特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 ８、前記薬物がオキサゼパムである特許請求の範囲第４
   項記載の方法。 ９、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｌｉｇはリガンドと共通する少くとも１個のエ
   ピトープを有して共通抗体または受容体結合部位により
   特異的に認識され得るようなリガンド類似体であり；そ
   して Ｒは０〜１２個の炭素、窒素、硫黄または酸素原子から
   なり、他に充足されていない上記原子の原子価を充足す
   るのに十分な水素原子を伴つている結合基である〕 を有する液体試料中のリガンドの存在または量を測定す
   るための螢光偏光検定に有用な化合物およびその生物学
   的に許容し得る塩。 １０、Ｌｉｇがフエノバルビタールの類似体である特許
   請求の範囲第９項記載の化合物。