JPS63216880A - テトラヒドロカンナビノイドの蛍光偏光イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、蛍光偏光イムノアッセイおよび、これに有用
な試薬に関する。さらに、詳しくは、テトラヒドロカン
ナピノイドの分析法、特に、テトラヒドロカンナピノイ
ドトレーサー、免疫原および抗体、ならびに、これらを
製造する方法に関する。

従来の技術 アサ科の植物、特に、タイマ（Ｃａｎｎａｂｉｓ　５ａ
ｌｉｖａ）は、多量のカンナピノイド（Ｃａｎｎａｂｉ
ｎｏｉｄｓ）を生成する。最も主要なカンナピノイドは
Δ８−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ’）であり
、これは、マリファナのもつ向精神性作用を生成する。

ＴＨＣｏの厳密な作用機序はまだ未知であるが、主とし
て、心血管系および中枢神経系に作用する。

マリファナの最も一般的な消費方法は、喫煙による。Δ
’ＴＨＣ’は急速に肺から血液中に吸収される。Ｔ　Ｉ
−Ｉ　Ｃ’は、急速に代謝されて、１１−ヒドロキシ−
Δ’Ｔ　ＨＣ’を経て、１１−ツルーΔ９ＴＩＩＣ’カ
ルボン酸が主な中間代謝物である一連の極性中間代謝物
になる。ＴＨＣ’の摂取量のおよそ８０％は、最初の５
日間に排出される。この場合、８０％は大便中に、残り
は尿中に排泄される。分析法の感度に応じて、カンナピ
ノイド中間代謝物は尿中に、一時的な喫煙者においては
、最高１０日まで、常習喫煙者においては３６日まで検
出される。　　　　′ 過去においては、カンナピノイドは、生物学的サンプル
において、薄層クロマトグラフィー、高圧液体クロマト
グラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）、ガスクロマトグラフィー
（ＧＣ）、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメ
トリー（ＧＣ／ＭＳ）、ラジオイムノアッセイまたは酵
素イムノアッセイにより検出されてきた。しかし、これ
らの検定法は欠点がないわけてはない。薄層クロマトグ
ラフィーは、労働集約的で、感度が悪い。ＨＰＬＣ，Ｇ
Ｃ，およびＧＣ／ＭＳは、労働集約的で、高度の技術者
でなければ生物学的マトリックスから分析物の抽出を行
なえず、一方、ＧＣおよびＧＣ／ＭＳは、誘導体生成の
工程も必要である。ラジオイムノアッセイ試薬は、自然
に分解し、関係者の保護および安全性をモニターする方
法が面倒で、危険な廃棄物が生じ、これは、安全な方法
で処分しなければならない。酵素イムノアッセイは、試
薬の熱安全性および酵素活性を変えるマトリックスの作
用により、変動性を免れない。

蛍光偏光イムノアッセイ法により、ホモジニアス競合結
合アッセイにおいて生成されるトレーサー抗体コンプレ
ックスの量を測定するための信頼できる定量法が得られ
る。典型的には、かかる競合結合イムノアッセイにおい
ては、リガンド（該技術により測定される生物学的対象
物質）は、標識された試薬、または「リガンドアナログ
」、または「トレーサー」と、リガンドおよびリガンド
アナログに対して特異的な抗体の少数のレセプター結合
部位に関して競合する。サンプル中のリガンド濃度によ
り、抗体に結合するりガントアナログの量が決まる。即
ち、リガンドおよびリガンドアナログは、各々、その濃
度に比例して抗体と結合するので、結合するりガントア
ナログの量は、サンプル中のりガント濃度に反比例する
。蛍光偏光技術は、根本的に、平面偏光で励起された場
合、蛍光標識された化合物がその回転速度に反比例した
偏光度を有する蛍光を放射することに基づ（。従って、
蛍光標識を有するトレーサー・抗体コンプレッサが平面
偏光により励起された場合、蛍光団は、光が吸収され放
出される間の時間は回転が抑制されるので、放出される
光は高度に偏光している。

これに対して、未結合のトレーサーが平面偏光により励
起された場合、その回転は、対応するトレーサー抗体結
合体よりもずっと速い。その結果、未結合のトレーサー
分子から放出される光は偏光解消されている。

かかる蛍光偏光技術き、ワンら（Ｗａｎｇ　ｅｔ　ａｌ
）の米国特許第４４２０５６８号において用いられてお
り、該特許は蛍光団として、トリアジニルアミノ・フル
オレセイン部分を用いるものである。

カンナピノイド抗原結合体および抗体は、ケイ・ファー
レンホルトおよびジェイ・ヘベラン（Ｋ。

Ｆａｈｒｅｎｈｏ！ｔ　ａｎｄ　Ｊ　、Ｈｅｖｅｒａｎ
）の米国特許第４４３８２０７号；ニス・グロス（Ｓ　
、　Ｇ　ｒｏｓｓ）の米国特許第４０２２８７８号：ロ
ーレイら（Ｒｏｗｌｅｙｅｔ　ａｌ）、　Ｎ　Ｉ　ＤＡ
リサーチモノグラフ（ＲｅｓｅａｒｃｈＭｏｎｏｇｒａ
ｐｈ）Ｎｏ、　７．２　Ｂ（１９７６）；　クックら（
Ｃｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｎ　Ｉ　ＤＡリサーチモノ
グラフＮｏ。

７．１５（＋　９７６）；ティールら（Ｔｅａｌｅ　ｅ
ｔ　ａｌ）。

ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、２４９，１５４（＋
９７４）ニゲラントら（Ｇｒａｎｔ　ｅｔ　ａｌ）、ネ
イチャー・ニュー・バイオロジイ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅ
ｗ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２３６．２１６（１９７２）；
ティールら（Ｔｅａｌｅ　ｅｔａｌ）、ジャーナル・オ
ブ・ファーマコロジイ・アンド・ファーマシューティク
ス（Ｊ　□ｕｒｎａｌ　ｏｆＰｈａｒｍａｃｏＬｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ）、２７．４６
５（１９７５）において記載されている。

本発明は、新規カンナピノイド誘導体化合物および蛍光
偏光分析において特に有用な新規試薬を提供する点で、
当該技術において改良されたちのである。本発明に従っ
て行なわれる分析法は、以下に説明する様に、特に正確
である。

灸胛ｑ漿炙 本発明は、テトラヒドロカンナピノイド（“ＴＨＣ“）
およびＴ　ＨＣ中間代謝物を、蛍光偏光技術を用いて測
定する方法に関する。特に、本発明では、式： ［式中、Ｒ７がｎ−ペンチル、Ｒ３が１１、Ｒ４がＲＺ
Ｑ、Ｘｈ（／Ｃ＼である場合、Ｒ１は！−１１または、
Ｒ７がｎ−ペンチル、Ｒ３がＲＺＱ−Ｒ４がＣＨ３、Ｘ
が４Ｃ＼の場合、ｒｔ、はＩ（、または、Ｒ１がｎ−ペ
ンチル、Ｒ３が１−１、Ｒ４がＣＨｓまたはＣ００ＨＳ
Ｘが４Ｃ＼の場合、Ｒ，はｒｌＺＱ、または、 Ｒ３が−ＣＨｔ　ＲＺ　Ｑ　、　ＲｓがＨＳＲ４がＣＨ
３またはＣ０ＯＨ，ＸがチＣ飄の場合、Ｒ１はＨｌまた
は、 Ｒ２が−ＣＨ，−ｒ（、Ｒ３が■］、Ｒ４がトＩまたは
ＲＺＱ、Ｘが−Ｎ−の場合、Ｒ７はＩ−１。

Ｒは、１２個以下のへテロ原子を含む、直鎖状または分
岐状に配列し、最高２個の環構造を有する、０〜２０個
の炭素原子およびヘテロ原子からなる結合基である。た
だし、４以上のへテロ原子が連続して結合することはな
く、また２個以上の硫黄原子または窒素原子または１個
以上の酸素原子も連続して結合しない； ＺはＮＨ１ＣＯ１Ｓｏ！またはＣ＝　Ｎ　ｉｆ　；Ｑは
Ｈ，ＯＨ，または脱離基またはフルオレセインまたはフ
ルオレセインの誘導体である］で示される新規トレーサ
ーおよびトレーサー前駆体化合物を用いる。

Ｑがフルオレセインまたはフルオレセインの誘導体であ
る場合、該化合物はトレーサーとして用いることができ
、ＱがＴ４、ＯＨまたは脱離基である場合、該化合物は
トレーサーの前駆体として用いることができろ。

トレーサーの好ましい具体例においては、フルオレセイ
ン誘導体は、官能基Ｚにより、Ｒ８の位置で結合基と結
合している。Ｒ３結合基によりＴ１（Ｃ誘導体と結合し
ているフルオレセインを有するトレーサーは、蛍光偏光
技術において用いた場合、非常に良好なスパンおよび強
度を示す。

本発明は、また、サンプルを式（Ｉ）のトレーサーの塩
およびＴＨＣおよびトレーサーを特異的に認識し、結合
する抗体とまぜ合わせることによりＴＨＣに関する蛍光
偏光イムノアッセイを行なう方法を提供する。抗体に結
合するトレーサーの量は、サンプル中のＴＨＣの量とし
て測定される。

本発明の方法において有用な抗体は、式（１）の化合物
［式中、Ｒ４およびＲ３がＨＳＸが＝Ｃ−およびＲ４が
Ｒ−Ｚ−Ｑの場合、Ｒ，はｎ−ペンチル；Ｒ７がＲ−Ｚ
−Ｑの場合、Ｒ４はＣＨｓ、ＣＨ！ＯＨまたはＣＯＯ１
１（ただし、Ｑ７’１４０１１の場合、ＺはＣＯでない
）； Ｒは、１２個以下のへテロ原子を含む、０〜２０個の炭
素原子およびヘテロ原子からなり、直鎖状または分枝鎖
状で、最高２個までの環構造を有する結合基である。た
だし、４個以上のへテロ原子が連続して結合することは
なく、また、２個以上の硫黄原子または窒素原子または
１個以上の酸素原子ら連続して結合しない； Ｚは、Ｃ＝０、Ｃ＝ＮＨ％ＳＯ７、ＮＨｌＮＣＨ，また
はＣＨｔ　： Ｑは、水素、ヒドロキシルまたは脱離基（たたし、Ｚが
ＣＨｔの場合、Ｑは水素でない）］を、巨巨大子または
粒状キャリヤー、例えば、ポリアミノ酸、ポリアミノ酸
誘導体または他の巨大分子キャリヤーまたは表面に反応
性官能基を有する合成ポリマービーズと化学的に結合さ
せることにより得た免疫原に対して生成させたものであ
る。

自動化された計量分配手段、例えば、ピペットまたはプ
ローブを用いた自動化蛍光偏光技術の場合、本発明では
、サンプルが計量分配手段に付着する結果起こるサンプ
ルのキャリーオーバーを最小にするため、計量分配手段
の洗浄に、ジメチルスルホキシドおよび塩化ナトリウム
溶液を用いる。

好ましい水性洗浄溶液は、ジメチルスルホキシド約５０
％および塩化ナトリウムの０．４５％である。

更に、本発明は、リボフラビンによる潜在的蛍光干渉の
排除に関する。リボフラビン結合タンパク質（ＲＢＰ）
は、直接、各サンプルに添加されるか、または、分析に
おいて用いるｌまたはそれ以上の試薬に添加される。こ
の場合、これは、存在する全てのりボフラピンと結合し
てＲＢＰ−リボフラビンコンプレックスとなり、蛍光干
渉をなくす。他の連続消光物質も、この目的のために用
いることができる。

本発明の他の目的および付随する利点は、以下の詳細な
説明ならびに図面および実施例により、よく理解される
。

発明の構成および効果 本明細書において用いる「リガンド」なる語は、レセプ
ターまたは抗体などの結合タンパク質が形成される分子
を表わす。本発明において対象となるリガンドは、テト
ラヒドロカンナピノイド（“Ｔ’ＨＣ”）およびその中
間代謝物である。リガンドは、タンパク質を含まない化
合物で、一般的に低分子量であり、動物に注射された場
合、抗体形成を誘起しないが、抗体と反応性の化金物で
ある。キャリヤータンパク質との結合に関して化学的に
修飾されたリガンドは、ハプテンと称する。ハプテンに
対する抗体は、一般に、まずハプテンをタンパク質キャ
リヤーと結合させ、結合生成物を動物に注射することに
より得られる。得られた抗体は、通常の公知の抗体単離
技術により単離することができる。

本明細書において用いる「リガンド・アナログ」なる語
は、１価または多価基であって、その実質的な部分が、
リガンドと同じ立体または極性構造を有し、レセプター
の結合部位に関して、リガンドと競合し得る１以上の決
定因子またはエピトピッフサイトを決定するものを表わ
す。かかるリガンド・アナログの特徴は、リガンドに対
する抗体により認識される程度に対象となるリガンドと
構造的に類似していることである。大部分において、リ
ガンド・アナログは、分子表面の大部分に関して、対象
となるリガンド（本発明の目的に関しては、ＴＨＣおよ
び中間代謝物）と同じかまたは実質的に同じ構造および
電荷分布（立体および極性構造）を存する。ハブテンの
結合部位は、抗体生成のための抗原の調製において、リ
ガンドに結合するトレーサーにおいて用いられるのと同
じであることが多く、抗体の鋳型を提供するリガンド・
アナログの同じ部分が、トレーサーにおけろリガンド・
アナログにさらされている。

本発明では、フルオレセインおよびフルオレセインの誘
導体を用いる。特に、トレーサー化合物が有用であるた
めに必須のフルオレセインおよびその誘導体の性質は、
フルオレセインの蛍光である。フルオレセインは、環境
の酸濃度（ｐＨ）に応じて、以下の（ｎ）に示す２つの
互変異性体で存在する。

ラクトン　　　　　　　　酸 開環形（酸）においては、多くの兵役二重結合が存在し
、これにより、この形態のフルオレセイン（およびフル
オレセイン部分を含有する化合物）は、約４ナノ秒の励
起状態寿命の後、青色光を吸収し、緑色蛍光を発光する
ことができる。開環形および閉環形が共存する場合、開
環形および閉環形の分子の相対的濃度は、ｌ）Ｈレベル
の調節により容易に変わる。一般に、本発明のトレーサ
ー化合物は、溶液中、ナトリウム、カリウム、アンモニ
ウムなどの生物学的に許容しうる塩として存在し、これ
により、本発明の分析法において用いられた場合、開環
の蛍光形で存在できる。存在する特定の塩は、ｐＨレベ
ルを調節するのに用いる緩衝液に依存する。例えば、リ
ン酸ナトリウム緩衝液の存在下で、本発明の化合物は開
環形でナトリウム塩として存在する。

本明細書で用いる「フルオレセイン」なる語は、独立し
た化合物として、またはもっと大きな化合物の一部分と
して、蛍光の場合を除いて、特定の分子に存在する場合
、開環形および閉環形の両方を意味する。開環形は蛍光
が起こるために必要である。

フルオレセイン分子の炭素原子の番号は、開環形または
閉環形の分子のどちらを考えるかによって変わる。従っ
て、フルオレセインおよびその化合物に関する文献は、
炭素原子の番号に関して統一されていない。閉環形にお
いては、フェニル環のラクトンのカルボニルに対してパ
ラ位の炭素は“６”である。開環形においては、フェニ
ル環のカルボン酸基に対するパラ位の炭素は“５°であ
る。

本明細書においては、閉環形の番号のつけ方を採用する
。合成において用いる原料が、最も一般的にはこの方法
で番号がつけられているからである。

カルボキシル基の反対側のフヱニルおよびその化合物の
炭素は、本明細書においては、従って“６”である。

抗体とコンプレックスを形成しない溶液中のトレーサー
は、蛍光の吸収および再発光に要する時間以内は自由に
回転できる。従って、再発光された光は、比較的ランダ
ムに配向しているので、抗体とコンプレックスを形成し
ていないトレーサーの蛍光偏光は低く、０に近い。特定
の抗体とコンプレックスを形成することにより、かくし
て形成されたトレーサー抗体コンプレックスは、比較的
小さいトレーサー分子よりも抗体分子の回転が遅く、従
って、偏光の増加が観察される。従って、リガンドが、
抗体サイトに関してトレーサーと競合した場合、得られ
るフリーなトレーサーおよびトレーサー・抗体コンプレ
ックスの混合物の観察される蛍光の偏光は、トレーサー
の値とトレーサー・抗体コンプレックスの値の中間の値
を有する。

サンプルが高濃度のリガンドを含有する場合、観測され
る偏光の値は、フリーなリガンドの値に近く、即ち、低
い。テストサンプルが低濃度のりガンドを含有する場合
、偏光値は、結合したリガンドの値に近く、即ち、高い
。垂直方向および水平方向の偏光を用いたイムノアッセ
イの反応混合物を連続して励起し、放出される光の垂直
方向の偏光成分のみを分析することにより、反応混合物
における蛍光の偏光を正確に測定することができる。

測定されるリガンドの偏光および濃度間の正確な関係は
、濃度が既知のカリブレーターの偏光値を測定すること
により確立される。リガンドの濃度は、この方法で作成
した標学曲線から補間することができる。

本発明に従って形成される特定の抗体およびトレーサー
により、後述する如く、非常に良好な分析ができること
が判明している。

ス漿 ＴＨＣおよび中間代謝物の蛍光偏光イムノアッセイを行
なうためには、Ｔ　Ｉ−Ｉ　ＣおよびＴＨＣ中間代謝物
およびトレーサー間の抗体認識サイトに関して競合させ
る。ハブテンおよびトレーサーの構造が大きく異なるこ
とにより、この目的が達成される。本発明の目的におい
て、「ハブテン」は、免疫原またはトレーサーの前駆体
で、一般的に、置換Ｔ　Ｉ−Ｉ　Ｃ誘導体およびプロテ
ィンキャリヤーまたはフルオレセイン化合物の結合基か
らなる。

トレーサー （ａ）トレーサーの構造 本発明のトレーサ・−は、一般式（Ｉ）［式中、Ｑはフ
ルオレセイン部分またはフルオレセイン誘導体を表わす
］で示される構造を有する。あるいは、トレーサーは、
式： ］ で示される構造を有してもよい。

本発明の好ましい形態においては、トレーサーは、以下
の構造式： ［式中、Ｑ、Ｒは前記と同じ、Ｚは後記の結合基である
］ を有する。最も好ましくは、トレーサーは、以下の構造
を有するニ トレーサーは、例えば、アミド、アミジノ、トリアジニ
ルアミノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイル
、チオカルバモイル、またはスルホニルカルバモイル基
によりフルオレセイン誘導体に結合するＴＨＣ誘導体で
ある。トレーサーは、適当なフルオレセイン誘導体を、
以下の合成法および実施例において記載する様に、アミ
ノ、カルボン酸、スルホン酸、メルカプト、ヒドロキシ
、イミデート、ヒドラジド、イソシアナート、チオイソ
シアナート、クロロホルメート、クロロチオホルメート
、クロロスルホニルカルバモイルなどの基を含有するＴ
　ＨＣ誘導体と結合させることにより製造する。

実施例において、以下に挙げるいずれのフルオレセイン
誘導体も用いることができる。

Ｆ’１２−ＮＨｌ　　　　　　　フルオレセインアミン
Ｆ　Ｑ−ＣＯｆｆ１ＨカルボキシフルオレセインＦ’Ｑ
−ＮＨＣＯＣＨ＊Ｉ　　α−ヨードアセトアミドフルオ
レセイン ＦＱ−ＮＨＣＯＣＨ＊Ｂｒ　ａ−ブロモアセトアミドフ
ルオレセイン ルオレセイン フルオレセイン Ｆ　Ｑ−Ｎ　ＣＳ　　　　　　　フルオレセインチオイ
ソシアナート Ｆ　Ｑ−ＣＨｔＮ　Ｈ２１１−アミノメチルフルオレセ
イン （ｂ）トレーサーの合成 本発明のトレーサーは、フルオレセイン部分、またはフ
ルオレセインの誘導体を、式（Ｉ）の−殻構造式の化合
物とカップリングさせることにより得られる。フルオレ
セイン部分は、アミド、アミジン、尿素、チオ尿素、カ
ルバメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノ、
またはスルホニルカルバメート結合により、アミノ、カ
ルボキシル、イミデート、またはアルコキシ官能基と結
合することができる。本発明の好ましい具体例において
は、フルオレセイン誘導体は、カルボキシフルオレセイ
ン（ｖｉ）であり、これは、例えば、のような前駆体と
カップリングさせる。

アミノ、ヒドラジニル、ヒドラジドなどのような末端ア
ミノ基を有するＴ　ＨＣ誘導体は、いずれも、活性エス
テル法または混合無水物法によりカルボキシフルオレセ
インと結合し、溶液中で混ぜあわ仕るだけで、フルオレ
セインイソチオシアナート、ＤＴＡＦまたはアルコキシ
ＤＴＡＰと結合する。アミノ基は、ホスゲンおよびチオ
ホスゲンとの反応により、それぞれ、イソシアナートお
よびチオイソシアナートに変換することができる。

これらを次にアミノフルオレセインと縮合して、トレー
サーを得る。

カルボン酸（アミノヒドロキシ）アルキルカルボン酸な
どの末端カルボン酸を有する全てのＴ　ＨＣ誘導体は、
活性エステル法によりアミノフルオレセインまたはアミ
ノメチルフルオレセインと結合する。

末端ヒドロキシル基を有するＴＨＣｉ導体は全て無水ア
ルコール中、塩化水素ガスの存在下に、ＤＴＡＦ、　α
−ヨードアセトアミドフルオレセイン、α−ブロモアセ
トアミドフルオレセインまたはフルオレセインイソチオ
シアナートと反応させることによりフルオレセインと結
合させることができる。イミデートを次に溶液中フルオ
レセインアミンと結合させてトレーサーを製造する。

末端ニトリル基を有するＴＨＣ誘導体は、ハロゲン化物
またはスルホン酸エステルから製造することができる。

これらは、無水アルコール中塩化水素ガスの存在下でイ
ミデートに変換される。イミデートを次に溶液中でフル
オレセインと結合させてトレーサーを製造する。

Ｔ　ＨＣｌ導体の種々のアミノ、ヒドロキシおよびメル
カプト誘導体の製造は、本明細書においては免疫原製造
の項に記載する。

好ましいトレーサーは、５段階で、式：を有する酢酸エ
ステルから製造することができる。

二重結合を３−クロロ過安息香酸でエポキシ化すること
により、エポキシド： を得、これを三フッ化ホウ素エーテラートで処理するこ
とにより転位させて、以下の構造式：のα−メチルケト
ンを得る。還元的アミノ化によリアミノ基を導入する。

酢酸保護基を除去した後、第一アミンをフルオレセイン
カルボッ酸と結合さ仕る。

２．抗体 本発明の抗体は、前記の免疫原に対するヒツジにおける
応答を誘起することにより調製する。免疫原は、当業者
に周知の方法で、動物または一連の接種による免疫適格
細胞のインビトロ培地に投与される。

用いられる抗体は、種々のＴ　ＨＣ誘導体から調製する
ことができる。式（Ｉ）に関しては、環の２．５°また
は９位のいずれかに官能基を有する化合物から調製され
る免疫原は、動物において抗体を産生でき、かかる抗体
は、適当なトレーサーと結合した場合、本発明に従った
Ｔ　ＨＣおよび中間代謝物分析において有用である。

ａ、免疫原の構造 本発明の免疫原は、本明細書中免疫原に関して定義した
式（１）に示す一般構造式を有する。免疫原は、式（１
）に示す種類の化合物をポリアミノ酸またはポリアミノ
酸の誘導体または後記合成法および実施例に記載する他
の免疫学的に活性なキャリヤーとカップリングさせるこ
とにより調製することができる。

免疫原の好ましい形態において、構造上、出発物質の入
手可能性、化学合成法の簡便さ、および所定の動物から
有用な抗血清を得やすいことから、９位に置換基を有す
ることが好ましい。従って、本発明のこの点に関する好
ましい具体例は、一般式（Ｉ）（式中、ｎ、ｎ、％Ｒ２
、Ｒ３およびＲ４は、発明の概要において定義したとお
りであり、ＺはＣ＝Ｏ１Ｃ＝ＮＨ，Ｓｏｗ、Ｎ　ＣＨ３
またはＣ１（２、Ｑは免疫原キャリヤーである）で示さ
れる９−置換誘導体である。本発明のこの見地からの最
も好ましい形態においては、免疫原は、式：で示される
。この構造では、抗血清が広範囲のＴＨＣおよびＴＨＣ
中間代謝物に対する感度を付与され、他の薬剤および内
因性物質を排除するので好ましい。

ウシチログロブリンは、最も好ましい形態のポリアミノ
酸であるが、アルブミン、血清タンパク質、例えば、グ
ロブリン、水晶体タンパク質、リポタンパク質などを含
めた種々のタンパク質を用いることができる。タンパク
質キャリヤーの例としては、ウシ血清アルブミン、アオ
ガイヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシクーグロブリ
ン、チロキシン結合性グロブリンなどが挙げられる。あ
るいは、十分な数の利用可能なアミン基、例えば、リシ
ンまたはオルニチン残基上のアミノ基を有する合成ポリ
アミノ酸を用いることができ、同様に、反応性官能基を
有する他の多くの合成または天然高分子物質も用いるこ
とができる。更に、炭水化物、酵母、多糖類または免疫
原キャリヤーとして用いることができる他のいかなる物
質もハプテンと結合させて免疫原を得ることができる。

ｂ、免疫原の合成 本発明の免疫原は、一般式（１）で示されるようなハプ
テンを、ポリアミノ酸とカップリングさせることにより
得られる。ポリアミノ酸は、アミド、アミジン、アルキ
ル、尿素、チオ尿素、カルバメート、またはチオカルバ
メート結合により、ハプテンと結合させることができる
。好ましい具体例においては、ハプテンと結合したポリ
アミノ酸は、ウシチログロブリンである。ハプテンは、
好ましくは、アミド結合を形成するのに通常用いられる
条件下でカップリングし、かがる条件は、当業者に公知
である。免疫原は、−Ｎ　Ｈ！、　ＣＯｔ　Ｈ。

ＣＯＮ　ＨＮ　Ｈｔ、　　ＣＮ　Ｏｎ　、　　ＣＨＯ、
Ｂ　ｒ、−１，−ＮＣＯ，−ＮＣ８，−０ＣＯＣＱ、　
−８Ｏ＊Ｃａまたは一〇Ｃ３ＣＱを有するハプテンをポ
リアミノ酸と結合させることにより得る。ＮＨ２基を有
するハプテンは、ポリアミノ酸のカルボン酸基を、−Ｎ
　Ｈを基の存在下に活性化することにより、カップリン
グすることができる。芳香族アミンに関しては、ジアゾ
ニウム塩法を用いることができる。酸性溶液中、アミン
を亜硝酸ナトリウムと混合することにより製造したジア
ゾニウム塩を、ポリアミノ酸に添加する。ポリアミノ酸
上のカルボン酸基の活性化は、ハブテンおよびポリアミ
ノ酸を、ｌ−エヂルー３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ、Ｎ’−シンクロヘ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｉ−シクロへキシル
−５−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメトキ
シ−ｐ−トルエンスルホネートなどと混合することによ
り行なうことができる。

カルボン酸を含有するハプテンは、また、前記のトレー
サーの合成の項で記載した様な活性化法（ＥＤＣ）また
は活性エステル法によりカップリングすることができる
。−〇　〇　Ｎ　ＨＮ　Ｉｌ　２に関しては、カップリ
ングは、芳香族でないアミノ酸について行なわれる。対
応するシアノ化合物から製造される一〇Ｎ］’を化合物
は、直接、ポリアミノ酸とカップリングする。−〇　）
（Ｏ化合物は、還元的アミノ化により、ポリアミノ酸と
カップリングする。ポリアミノ酸を一〇ＨＯハブテンと
混合し、得られたイミンを、シアノホウ素水素化ナトリ
ウムなどのホウ素水素化物還元剤で還元して、ポリアミ
ノ酸のアルキル化アミンを得る。対応するアミノ化合物
から製造されるイソシアナート（−ＮＧＯ）およびイソ
チオシアナート（−ＮＳＣ）化合物、対応するアルコー
ルから製造されるクロロホルメート（−０ＣＯＣＱ）お
よびクロロチオホルメート（−〇〇５ＣＣ）化合物は、
それぞれ、尿素、チオ尿素、カルバメートおよびチオカ
ルバメート結合を生成する。これは、ハブテンを直接ポ
リアミノ酸とカップリングすることにより行なう。

前記ハプテン（免疫原前駆体）の合成は、よく似た方法
で行なわれる。後記式（Ｘ）は、本発明の方法の好まし
い具体例による免疫原前駆体を表わす。

一般に、９−位が置換されたハブテンは、Δ６−ＴＨＣ
のフェノール基を保護し、続いて、二酸化セレンを用い
てＣ−９メチル基をアリル酸化することにより製造され
る。得られたアリルアルコールを次にピリジニウムクロ
ロクロメートにより酸化してアルデヒドにする。アルデ
ヒドの還元的アミノ化により、第■アミンを得、これを
、ポリアミノ酸または他のキャリヤーとカップリングさ
せる。

長鎖のハプテンに関しては、アルデヒドを、ＮＨ，０Ｃ
０２Ｇｏ、Ｈなどの（アミノヒドロキシ）アルキルカル
ボン酸と縮合して、置換オキシム誘導体を得る。このオ
キンムアルキルカルボン酸誘導体を部分的に還元して、
対応する（アミノヒドロキシ）アルキルカルボン酸誘導
体にすることができる。最後に、保護基を除去し、化合
物を、ポリアミノ酸または他のキャリヤーとカップリン
グする。

あるいは、アルデヒドを、亜塩素酸ナトリウムを用いて
、リン酸緩衝液およびハロゲンスカベンジャーの存在下
に、さらに酸化して、対応するカルボン酸にすることが
できる。フェノールと保護したカルボン酸を、Ωジアミ
ンとカップリングさせて、末端アミノ基を生成し、保護
基を除去した後、これをアミド結合により、ポリアミノ
Ｉｅ２枯合させる。

アルデヒドまたはケトンを公知の方法により、キャリヤ
ータンパク質とのカップリング、例えば、ウィツテイヒ
反応、ヒドラジン化合物との縮合、アミノ化合物を用い
た還元的アミノ化などに有用な適当な基を含有する種々
の化合物誘導体にすることができる。

ニトリル誘導体は、ニトリルを無水アルコールおよび塩
化水素ガスで処理することにより、アルコキシイミデー
トに変換することができる。ヒドラジド誘導体は、対応
するカルボン酸誘導体からヒドラジンを用いた活性エス
テルカップリングによるか、または、ヒドラジンを対応
するカルボン酸エステルと反応させることにより、製造
することができる。アミンまたはアルコールとホスゲン
またはチオホスゲンとの反応により、アミンはイソシア
ナートまたはチオイソシアナート誘導体に変換すること
ができ、アルコールは、クロロホルメートまたはクロロ
チオホルメートに変換することができる。

３、洗浄剤 Ｔ　ＨＣ蛍光分析に水性／有機洗浄剤を用いろことによ
り、分析の信頼性および精度が向上することが判明して
いる。特に、洗浄液として、約２０％ＤＭＳＯ〜約８０
％ＤＭＳＯ（最も好ましくは、５０％ジメチルスルホキ
シド）および約０．４５％ＮａＣ（！〜約０．９％Ｎａ
Ｃ１２（最も好ましくは、０゜４５％塩化ナトリウム）
を含む水性溶液を用いることにより、Δ”−ＴＨＣ中間
代謝物が、プローブ、ピペットまたはシリンジなどの計
量分配手段に付着するのを防止する。尿が計量分配手段
に付着することにより、サンプルが汚染され、Ｔ　ｔｌ
　Ｃ含有サンプルに続いて試験しｔニサンプルに関して
誤って正の結果が得られると考えられる。連続して多数
のサンプルを試験する、ＡＢＯＴＴ　ＴＤｘ＠などの高
度に自動化された分析装置の場合、サンプル間の尿の「
キャリーオーバー」をなくすことが非常に望ましい。

本発明の分析法、即ち、本発明のトレーサーおよび抗体
化合物を用いる蛍光偏光イムノアッセイ法によるカンナ
ピノイド検出法に従って、Δ８−テトラヒドロカンナビ
ノールまたは中間代謝物を含有するか、または含有する
と思われるサンプルを、カンナピノイドおよびトレーサ
ーに対して特異的な抗体およびトレーサーの生物学的に
許容しうる塩と混合する。カンナピノイド中間代謝物お
よびトレーサーは、少数の抗体サイトに関して競合し、
その結果、コンプレックスが形成される。

トレーサーおよび抗体の濃度は一定に保持されるので、
形成されたトレーサー・抗体コンプレックスに対するカ
ンナピノイド・抗体コンプレックスの比は、サンプル中
のカンナピノイドの量に正比例する。従って、混合物を
直線偏光で励起し、トレーサーおよびトレーサー・抗体
コンプレックスにより放出された蛍光の偏光を測定する
ことにより、サンプル中にカンナピノイドが存在するか
どうか定量的に測定することができる。

結果は、正味ミリ偏光単位、スパン（ミリ偏光単位）お
よび相対強度により定量化することができる。ミリ偏光
単位の測定により、最大量のトレーサーがカンナピノイ
ドの非存在下で抗体と結合した場合の最大偏光が示され
る。正味ミリ偏光単位が高くなる程、トレーサーの抗体
に対する結合がよくなる。スパンは、抗体に結合するト
レーサーが最大量となる点および最小となる点の間の正
味ミリ偏光の差を示すものである。スパンが大きくなる
と、より良好な分析値が得られる。強度は、バックグラ
ウンドに対するシグナルの強さである。

従って、強度が高い程、測定が正確になる。強度は、本
発明の好ましいトレーサーに関して、垂直方向の偏光強
度と平行方向の偏光強度の２倍の和として、約０．５〜
２．０ナノモルである。トレーサーシグナルの強度は、
トレーサーおよび他の分析変数の濃度によって、バック
グラウンドノイズの約５倍から約５０倍の範囲である。

本発明の目的に関しては、バックグラウンドノイズの少
なくとも５倍の強度が好ましい。

第１表〜第■表は、本発明の種々の具体例に関して得ら
れた結果を、スパン、ミリ偏光単位および強度で示すも
のである。第１表〜第■表のいずれにおいても、用いた
抗血清は、ヒツジにおいて得られたものである。このデ
ータかられかる如く、式■のトレーサーを用いた分析に
より、すぐれた結果が得られ、従って、最も好ましい。

更に、次式（刈）および（Ｘ［）で示されろトレーサー
によっても、許容し得る結果が得られ、従って、どちら
も好ましいトレーサーである。

（ＸＩ） 第■表 第１表 （ヒツジ！３０） 第ｍ表 （ヒツジ１２８） 第■表 （ヒツジ１２７） 本発明の方法を実施するｐＴ（は、トレーサーのフルオ
レセインが、開環形で存在するのに十分な乙のでなけれ
ばならない。Ｉ）Ｈは、約３〜１２の範囲、より好まし
くは、約５〜ＩＯ１最も望ましくは、約６〜９の範囲で
ある。分析の間、ｐ）ｌの値を調節し、保持するために
、種々の緩衝液を用いることができる。代表的な緩衝液
としては、ホウ酸、クエン酸、酢酸、リン酸、炭酸、ト
リス、バルビツールなどが挙げられる。用いろ緩衝液は
、本発明に関しては重要ではないが、トリスおよびリン
酸緩衝液が好ましい。緩衝液のカヂオン部分は、一般に
溶液中のトレーサー塩のカヂオンを決定する。

本発明の改良された分析の好ましい方法は、実施例５に
おいて詳細に記載する。この分析は、「ホモジニアス・
アッセイ」である。つまり、最終的な偏光の読みは、結
合したトレーサーが未結合のトレーサーから分離されて
いない溶液から読み取るものである。これが、測定をす
る前に、未結合のトレーサーから結合したトレーサーを
分離しなければならないヘテロジニアスなイムノアッセ
イに対する明らかな利点である。

本発明の蛍光偏光アッセイのための試薬は、Δ８テトラ
ヒドロカンナビノールおよびその中間代謝物に関して選
択的な抗体およびトレーサーからなる。さらに、カンナ
ピノイド特異性予備処理溶液、希釈緩衝液、カンナピノ
イドカリブレーターおよびカンナビノールコントロール
を含有する通常の溶液を製造するのが望ましい。これら
の試薬の典型的な溶液のうちのいくつかは、本明細書中
に記載するが、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔ
ｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａ
ｒｋ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）から分析用「キット」として
市販されている。

好ましい方法は、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏ
ｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｒｖｉｎｇ、　
Ｔｅｘａｓ）から入手可能なＡｂｂｏｔｔ　ＴＤＸ■ア
ナライザーを用いる。

Ａｂｂｏｔｔ　ＴＤｘ＠アナライザーを用いる場合、分
析は、予備処理から最終の測定まで完全に自動化されて
いる。しかし、手操作の分析も行うことができる。

自動および手動の分析においては、サンプルを希釈緩衝
液中予備処理溶液と混合し、バックゲラランドの値を読
み取る。次に、トレーサーを分析物と混合する。最後に
、抗体を試験溶液と混合する。

最後に、抗体を試験溶液と混合する。インキュベーショ
ンの後、蛍光偏光の値を読み取り、処理する。

前記の発明の詳細な説明および以下の実施例は例示的な
ものであって、本発明の範囲を制限するものではない。

種々の変更は当業者には明らかとなるが、本発明の範囲
は、特許請求の範囲で定義されるものおよびその均等物
を含む。

実施例１ 灸宰凰Δ黙蒐 （ａ）ハプテンの製造： ６ａＲ−トランス−１−（アセデルオキシ）−６ａ。

？、Ｉ　Ｇ、１０ａ−テトラヒトｏ−６，６，９−トリ
メチル−３−ペンチルー６１■−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ビ
ランの製造： ６ａＲ−）ランス−６ａ、７，１０，１０ａ−テトラヒ
ドロ−６，６，９−トリメチル−３−ペンチル−６１−
１−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ビラン−１−オール（△８−Ｔ
＋−ｔｃＸｌｙ、３．１８ミリモル）、無水酢酸（９１
）およびピリジン（１３ｆｆ！２）の混合物を、室温に
て１６時間撹拌する。揮発成分を真空下に蒸発させて除
去し、１．０５９の粗生成物を得る。

６ａＲ−トランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７．１０．１０ａ−テトラヒドロ−６，６−シメチルー
３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ピラン−９−
メタノールの製造： 前記で得た粗酢酸エステル（１，０５１ｉ１）の無水エ
タノール（１８ｉ９）中溶液に二酸化セレン（６５０清
９．５．８６　ミリモル）を添加する。得られた混合物
を還流温度にて、窒素雰囲気下、撹拌しながら、７時間
加熱する。室温に冷却した後、黒色沈澱を濾過により除
去し、濾液をロータリーエバポレーターで蒸発させて粗
生成物を得、これをシリカゲル（１２５ｉの上フラッシ
ュクロマトグラフィーに付す。ヘキサン／酢酸エチル（
２：１）で溶出して、２３０１１ｇの粘稠液体を得る。

（Δ”−ＴＨＣから２段階での収率：２０％） ６ａＲ−トランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７．１０，１０ａ−テトラヒトｏ−６，６−ジメチル−
３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｄ］−ピラン−９
−カルボキシアルデヒドの製造： 前記の如く得たアリルアルコール（２３０ｍｇ、０．６
２ミリモル）、酢酸ナトリウム（２３肩９．０゜２８ミ
リモル）および塩化メチレン（１１３１１２）の撹拌混
合物に、ピリジニウム・クロロクロメート（ＰＣＣ１２
３０ｙ、１．０７ミリモル）を添加する。

室温にて２時間撹拌した後、混合物をエーテル（５０Ｉ
Ｑ）で希釈し、１０分間撹拌を続ける。次に、懸濁液を
、シリカゲル（６０＋Ｃ，メルク６０〜２００メッシ：
Ｌ）のショートカラムを通して濾過する。更に何度かエ
ーテルを通し、洗液がＵｖテストで陰性になるまでカラ
ムを洗浄する。溶離剤を合し、ロータリーエバポレータ
ーで蒸発させて、２２０ｏ（収率９６％）の所望のアル
デヒドを得る。

６ａＲ−）ランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７、Ｉ　Ｑ、１０ａ−テトラヒドロ−６，６−ジメチル
−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ピラン−９
−カルボン酸の製造： 前記の如く製造したアルデヒド（１６８ｍ９．０゜４５
ミリモル）、２−メチル−２−ブテン（０，３８ｙｔＱ
＞およびｔ−ブタノール（１５ｆｆ１２）の混合物に、
亜塩素酸ナトリウム（３６６１９，４，９５ミリモル）
およびリン酸二水素ナトリウム−水和物（３６６巧、２
．８９　ミリモル）の水（３１１２）中溶液を添加する
。混合物を室温にて１６時間撹拌する。真空下に揮発成
分を除去した後、残渣をエーテルおよび水門で分配する
（３回）。エーテル層を合し、食塩水で洗浄し、乾燥（
硫酸マグネシウム）して、１７６１１ｇ（収率１００％
）の油状物を得る。

６ａＲ−トランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７．１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６
，６−シメチルー３−ペンチル−６！（−ジベンゾ［ｂ
、ｄ］ピラン−９−カルボン酸の製造：前記カルボン酸
（２０９ｍ９．０．５４ミリ°モル）、無水炭酸カリウ
ム（３１６１９，２，２８ミリモル）およびメタノール
（１２１１２）の混合物を、室温にて１６時間撹拌する
。水を添加し、この水性溶液を希塩酸で酸性（ｐＨ３）
にする。遊離酸を次に酢酸エチルで抽出しく３回）、合
した抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥する（硫酸ナトリウ
ム）。溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させ、続
いて、真空下でさらに乾燥して、１９０１９の粗生成物
を得る。

（ｂ）免疫原の製造 免疫原： ５°−アミノ−１１−ツルーΔ８−テトラヒドロカンナ
ビノール−９−カルボン酸（２１ｇ）を５０％ＤＭＳＯ
／水（ｖ／　ｖ）　（４ａＱ）中に溶かす。これを、グ
ルタルアルデヒド活性化牛血清アルブミン（６６Ｒ９）
を含有する５０％ＤＭＳＯ／水の激しく撹拌した溶液に
添加する。混合物を４℃にて１８時間撹拌し、その後、
リン酸緩衝液に対して透析して、未結合のハプテンを除
去する。

免疫原： 標記＋１弯造式の化合物（３７ｍｇ）をメタノール（０
゜５ｚ（り中に溶解する。このメタノール溶液を、グル
タルアルデヒド活性化牛血清アルブミン（３３ｍｇ＞を
含有する５０％ＤＭＳＯ／水（ｖ／ｖ）の激しく撹拌し
た溶液に添加する。この混合物を室温にて１８時間撹拌
し、次に、リン酸緩衝液に対して透析して、未結合のハ
プテンを除去する。

式（Ｘ）の免疫原： ＋１−ツルー△８−テトラヒドロカンナビノール−９−
カルボン酸（２９，５ｍｇ）をＤＭＳＯ（＋　。

ＯｍＱ）中に溶解する。撹拌しながら、Ｎ−ヒドロキン
スクシンイミド（１７，２ｕ）およびジシクロへキシル
カルボジイミド（３２ｘｇ）を添加し、室温にて９０分
間反応させる。濾過により沈澱を除去し、ａ液を、牛チ
ログロブリン（１００１９）を含有する６０％ＤＭＳＯ
／水（Ｖ／Ｖ）の激しく撹拌した溶液に添加する。室温
にて３時間撹拌し、次にリン酸緩衝液に対して透析して
、未結合ハプテンを除去ずろ。

免疫原： △”　−Ｔ　１−Ｉ　Ｃ−オキシム酸化合物（３６ｍｇ
）をＤＭＳＯ（１，５ａ＋＋２）中に溶解する。Ｎ−ヒ
ドロキンスクシンイミド（１５，５ｍｇ）およびジシク
ロへキシルカルボジイミド（２６，５Ｒ９）を添加する
。室温にて２．５時間撹拌する。濾過して沈澱を除去し
、濾液を、牛チログロブリン（１１０ｍ９）を含有する
６５％ＤＭＳＯ／水（ｖ／ｖ）の激しく撹拌した溶液に
添加する。室温にて２．５時間撹拌し、リン酸緩衝液に
対して透析し、未結合のハプテンを除去する。

実施例２ （ａ）トレーサー製造の一般的方法 １、ＤＴＡＦ）レーサー（Ｇｌ） アミン（０，０１ミリモル）、ＤＴＡＦ’（ｒまたはｌ
ｌＸ０．Ｏｌミリモル）、トリエチルアミン（２滴）お
よびメタノール（０，１Ｘ１２）の混合物を、室温にて
１６時間撹拌する。混合物を、プレバラティブシリカゲ
ルＴＬＣプレート上に塗りつける。Ｃｌ−１ｃｃｔ／Ｍ
ｅＯＨ（３：１または４：１）で展開して、蛍光帯を得
、これをプレートからかきとり、別々にメタノールで溶
出する。特別な場合には、比較的純粋なトレーサーを、
さらに逆相プレパラティブＴＬＣプレート（ワットマン
（Ｗｈａｔｍａｎ）４８０３−８００、ＫＣ−１８Ｆ２
５４）上で、アセトニトリル１０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ５，３）（１：　１　、　ｖ／ｖ）を展開液とし
て用いて精製する。

２、カルボキンフルオレセイントレーサー（Ｇ■） アミン（０，０１ミリモル）、フルオレセインカルボン
酸（■またはＶｌ）−０−スクシンイミドエステル（０
，０１ミリモル）およびピリジン（０，ｌｆｆ＆）の混
合物を、室温にて１６時間撹拌する。混合物をプレパラ
ティブＴＬＣプレートに塗りつける。

ＣｌＩＣ１２ｉ／ＭｅＯＩ（（３：ｌまなは４：１）で
展開して、蛍光バンドを得、これをプレートからかきと
り、別々にメタノールで溶出する。

３、フルオレセインアミントレーサー（Ｇｍ）カルボン
酸（０，０１ミリモル）、ジシクロへキシルカルボジイ
ミド（０，０２ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（０，０１２モル）の乾燥ピリジン（０，１ｘ
Ｃ）中温合物を室温にて１時間撹拌する。形成された活
性エステルを、次いで、同じ温度にて、フルオレセイン
アミン（異性体Ｉまたは■）で１６時間処理する。反応
混合物をプレバラティブシリカゲルＴＬＣプレート（２
０ｃｍＸ２０ＣＩＸ０．５ＣＩ）に付ず。ＣＨＣ（！３
／ＭｅＯＨ（基質の極性に応じて、３：ｌまたは４：１
）で展開して、蛍光バンドを得、これをプレートからか
きとる。各バンドをメタノールで溶出し、溶離液を集め
る。

（ｂ）好ましいトレーサー前駆体の製造：６ａＲ−トラ
ンス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７，８，９，１０，１０ａ−へキサヒドロ−６，６，９
＝トリメチル−３−ペンチルー６１（−ジベンゾ［ｂ。

ｄ］ピラノ［８，９−ｂ］オキシレンの製造：６ａＲ−
トランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７．１０．１０ａ−テトラヒトｏ−６，６，９−）ウメ
チル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ピラン
（２１２３ＩＩＦ、０．５９ミリモル）の塩化メチレン
（５πＱ）中水冷溶液に、予め洗浄した８０％メタクロ
ロ過安息香酸（１５７ｍ９．０．７３ミリモル）を撹拌
しながら添加する。反応混合物を０℃にて１時間撹拌し
、次に水および塩化メチレン間で分配（３回）すること
により仕上処理する。合した有機層を、１０％炭酸水素
ナトリウム溶液（２回）、水（１回）で洗浄し、乾燥す
る（硫酸マグネシウム）。

溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させて、２４４
ＪＩ９の淡黄色液体を得る。

６ａＲ−）ランス−１−（アセチルオキシ）−６ａ。

７．８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−６，６，９
−トリメチル−８−オキソ−３−ペンチル−６Ｈ−ジベ
ンゾ［ｂ、ｄｌビランの製造： 粗エポキシド（６４ｍｇ、０．１７ミリモル）のベンゼ
ン（２酎、モレキュラ・シーブで乾燥）中溶液に、シリ
ンジで、３ｍＣ３０ｍｇ）の三フッ化ホウ素エーテラー
トを添加する。混合物を室温にて５分間撹拌した後、水
を添加し、水性層合物を、酢酸エチルで抽出する（２回
）、合した抽出物を食塩水で洗浄しく１回）、乾燥しく
ＭｇＳ　０４）、濾過する。濾液を、ロータリーエバポ
レーターで蒸発させて、６０次９（収率９４％）の所望
の生成物を得る。

６ａＲ−）ランス−１−（アセチルオキシ）−８ドロー
６．６．９−）ウメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベン
ゾ［ｂ、ｄ］ピランの製造：前記の如く得られたケトン
（６０ａｙ、０．１６ミリモル）、酢酸アンモニウム（
１２３ＪＩ９．０．１６ミリモル）およびメタノール（
２吋）の混合物を、室温にて１時間撹拌する。シアノ硼
水素化ナトリウムを添加し、得られた混合物を室温にて
１６時間撹拌する。水を添加し、水性混合物を、酢酸エ
チルで抽出する（３回）。合した抽出液を食塩水で洗浄
しく１回）、乾燥する（硫酸マグネシウム）。溶液を真
空下に蒸発させて、６２Ｒ９の粗生成物を得、これをシ
リカゲル上プレパラティブ薄層クロマトグラフィーによ
り精製する。メタノール／水酸化アンモニウム（９９：
ｌ）で展開して、２２所の標記化合物および対応するジ
アセチル化生成物の混合物（１：ｌ）を得る。

６ａＲ−トランス−１−（アセチルオキシ）−８−アミ
ノ−６ａ、？、８，９，１０，１０ａ−ヘキサヒドロ−
１−ヒドロキシ−６、、６、９−トリメチル−３−ペン
チルー６Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｄ］ピランの製造： 前記の如く得られた混合物（２２ｏ）を、無水炭酸カリ
ウム（２６＊ｆ、０．１９ミリモル）とともに、メタノ
ール（０，５工１２）中、室温にて１８時間撹拌する。

水を添加し、水性混合物を酢酸エチルで抽出する（３回
）。合した抽出物を食塩水で洗浄しく２回）、乾燥する
（硫酸マグネシウム）。溶液をロータリーエバポレータ
ーで蒸発させて、粗生成物を得、これを、さらに、真空
下で乾燥して、１９１１９の所望の生成物を得る（ケト
ンから２段階反応での収率３４％）。

（Ｃ）最も好ましいトレーサーの製造および精製：アミ
ン（３，３１９，０，００１ミリモル）、スクシンイミ
ジルオキシカルボニルフルオレセイン（ｖｉ）（４，３
ｍｇ、０．Ｏｌミリモル）、ピリジン（１滴）およびＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド（０，１ｘＱ）の混合物を
室温にて１８時間撹拌する。混合物を、次に、シリカゲ
ルプレート（２０ｃｘＸ　２０ｃｉＸ　Ｏ，５ｍ１１）
上ブレパラティブ薄層クロマトグラフィーで分画する。

クロロホルム／メタノール（３：１）で展開して、主蛍
光バンド（Ｒｆ＝０．７５）を得、これをプレートから
かきとり、メタノールで溶出する。トレーサーの再純化
は次の様に行なう：メタノール溶液をロータリーエバポ
レーターで蒸発乾固し、固体残渣を新しいメタノール（
１ｘＱ）中に溶かす。調製したＴＬＣプレート（２０ｃ
ｘｘ　２０ｃｙｒＸ０．５ｍｍ）に塗付けた後、クロロ
ホルム／メタノール（４：１）で展開して、２つのバン
ドを得る。

主バンド（Ｒｆ値の小さい方）をプレートからかきとり
、メタノールで溶出する。

実施例３ △８−ＴＨＣ（Ｎ？）を還流温度にて、臭化アリル（ｌ
ｙ）とともにアセトン（３７，５ｍ（り中、Ｋ　ｔ　Ｃ
Ｏ３（１，７ｇ）の存在下に、１８時間撹拌する。無機
塩を濾去し、濾液を濃縮して、粗残渣（１，０５１？）
を得、これを次にＬＯｘＱのジエチルアニリンとともに
２００℃にて３時間窒素雰囲気下に加熱する。

反応混合物をエーテル中に溶解し、このエーテル性溶液
を、連続して希塩酸（３回）、Ｈｔｏ’ｂよび食塩水（
各１回）で洗浄する。乾燥（ＭｇＳＯ，）した溶液を真
空下に蒸発させて組物質（５４３ｆｆ９）を得る。

前記の如く得られた粗フェノールの一部（２７６ｍ９）
を、室温にて、塩化メチレン（４＋１１Ｃ）中、２−（
トリメチルシリル）エトキシメチルクロリド（ＳＥＭ−
Ｃ１２，５０２１１９）およびジイソプロピルエチルア
ミン（４９７ｍ□で２４時間処理する。混合物をエーテ
ルで希釈し、エーテル性溶液をＨｔ　Ｏで洗浄する。洗
液をエーテルで再抽出し、有機層を合する。ロータリー
エバポレーションに続いて、更に真空下で乾燥して、４
３１１１９の所望の生成物を得る。

オレフィン（４３０ｚｙ）のテトラヒドロフラン（７村
）中溶液に、９−ボラビシクロ［３，３，１］ノナン（
９−ＢＢＮ）、０．５Ｍ　ＴＨＦＨＦ液溶液、８１）を
添加する。室温にて１８時間撹拌した後、３ＭＮａＯＨ
溶液（１４ｊ１１２）を添加しく若干冷却しながら）、
続いて３０％Ｈ＊　Ｏを溶液（１４ｆｆ１２）を添加す
る。水性混合物を４５℃にて２時間撹拌する。抽出的仕
−ヒ処理（酢酸エチル）により、粗生成物（１、７ｇ）
を得、これを、シリカゲル上フラッシュクロマトグラフ
ィーに付す。ヘキサン／酢酸エチル（５：　ｌ　）で溶
出して、２４１１１１９の油状物を得る。

酢酸ナトリウム（ｓｅｎ：＋で緩衝したアルコール（６
６ａｌｌＩ！？）の塩化メチレン（１２だ＋２）中溶液
に、ピリジニウムクロロクロメート（６６３１１９）を
添加する。室温にて撹拌した後、エーテルを添加する。

ガム状混合物をシリカゲルの類パッドを通して濾過し、
濾液をロータリーエバポレーターで蒸発させて、６０５
ｍｇの油状物を得ろ。

トリメチルシリル誘導体（３００ｍ９）の８０％酢酸中
溶液を８５℃にて１５分間撹拌しながら加熱する。溶媒
をロータリーエバポレーターで蒸発させ、得られた粘稠
残渣を、シリカゲルを充填したフラッシュカラムに付す
。ヘキサン／酢酸エチル（ｔｏ：１）で溶出して、６０
３１１？の所望の生成物を得る。

実施例４ トレーサー（１）の製造 （ａ）前駆体の製造： １．３−ジヒドロキシ−２−（５−メチルブト−２−エ
ン−１−イル）−４−ベント−１−イルベンゼンの製造
： オリベトール（１，４９９）を、蒸留水（６，６肩０．
）および８８％蟻酸（３，５ｍの中に溶解し、水浴中８
０℃まで加熱する。３−メチル−３−ブテンー２−オー
ル（３，５酎）を、撹拌しながら、１０分かけて滴下す
る。反応物を室温まで冷却すると白濁する。反応物を、
蒸留水（５０ｊ１１２）中に注ぎ、塩化メチレンで抽出
する。塩化メチレンを、真空下に除去する。残渣をシリ
カゲル上クロマトグラフィーに付し、クロロホルムで溶
出する。適当なフラクションを合しくＴＬＣ［０，９、
酢酸エチル：石油エーテル（１：４））、精生成物（０
，２５２９）を得る。

３．６−ジヨードー２．２−ジメチル−５−ヒドロキシ
−７−ベント−１−イルクロマンの製造＝１．３−ジヒ
ドロキシ−２−（５−メチルブト−２−エン−１−イル
）−４−ベント−１−イ゛ルベンゼン（０，４９７９）
を、塩化メチレン（５酎）中に溶かし、Ｎ−ヨードスク
シンイミド（０，９０２９）を、撹拌しながら、室温に
て、窒素雰囲気下で添加する。反応物を２８時間撹拌し
、シリカゲルカラム上クロロホルム／ヘキサン混合物で
溶出してクロマトグラフィーに付す（ＴＬＣＲｆ＝０．
６、クロロホルム：ヘキサン（１：４））。適当なフラ
グジョンを合して、０．２９３９の精生成物を得る。

３−シアノ−２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−６−
ヨートー７−ベントー１−イルクロマンの製造： ３．６−ジヨードー２．２−ジメチル−５−ヒドロキシ
−７−ベント−１−イルクロマン（０，２９３９）およ
びシアン化カリウム（５０ＪＩ９）を、無水エタノール
（１５３１の中に溶かし、還流温度まで加熱する。４．
５時間後、反応物を室温まで冷却する。

溶媒を真空下に除去する。水を添加し、塩化メチレンで
抽出する。塩化メチレンを真空下に除去する。残渣をシ
リカゲルカラム上クロマトグラフィーに付し、クロロホ
ルムで溶出する（ＴＬＣＲｆ＝０．２、クロロホルム）
。適当なフラクションを合して、５１１９の生成物を得
る。

３−（アミノメチル）−２，２−ジメチル−５−ヒドロ
キシ−７−ベント−１−イルクロマンの製造： ３−シアノ−２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−６−
ヨートー７−ベントー１−イルクロマン（５１ｍ９）お
よび水素化リチウムアルミニウム（４５ｇ）を、窒素雰
囲気下に、乾燥テトラヒドロフラン（２２ｆｆｅ）中に
溶かし、還流温度に加熱する。１日後、反応物を室温に
まで冷却する。蒸留水（ｌｊ！Ｑ）を滴下し、その後、
さらに２０ｍＱ添加する。

水をエチルエーテルで抽出する。エーテル層を乾燥しく
Ｍｇ５ＯＪ、真空下に除去する。褐色油状物（３８１ｇ
）を得、これをシリカゲルＴＬＣ上にスポットする（Ｒ
ｆ＝０．８、メタノ−Ｊし；クロロホルム；水酸化アン
モニウム（２：ｆＳ：０．１））。

（ｂ）トレーサーの製造： ３−［（フルオレセイン−６−イルカルボニル）アミノ
メチル］−２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−７−ベ
ント−１−イルクロマンの製造：３−（アミノメチル）
−２，２−ジメチル−５−ヒドロキシ−７−ベント−１
−イルクロマン（５肩９）を、６−カルボキシフルオレ
セイン（７１９）、ジシクロへキシルカルボジイミド（
７３１９）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（３ｍ
９）を含有するピリジン溶液（１次Ｑ’）に添加する。

栓付フラスコ内で室温にて１６時間撹拌した後、シリカ
ゲルプレパラティブプレート上、適当なメタノールおよ
びクロロホルムの混合物で溶出して、生成物を単離する
（ＴＬＣ１１ｒ＝０．７、エタノール：クロロホルム（
１：３））。

実施例４ａ トレーサー（２）の製造 ５．５−ジメチル−３−（１，２−ジメチルヘプチル）
−１０−ヒドロキシ−２−（フルオレセイン−６−イル
カルボニル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−５８［
１］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］ピリジンの製造： ５．５−ジメチル−３−（１，２−ジメチルへブチル）
−１０−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロ−
５Ｈ［ｌ　］ベンゾピラノ［４，３−ｃ］ピリジン（５
ｍｇ）［バーズら、ジャーナル・オブ・メディカル・ケ
ミストリー（Ｐａｒｓ　　ｅｔ　　ａｌ、　、Ｊ　、Ｍ
ｅｄ。

Ｃｈｅｗ、　）、上１．４４５（１９７６）の方法によ
り製造］を、６−カルボキシフルオレセイン（６１ｇ）
、−アミノ−６ａ、７，８．９，１０，１０ａ−ヘキサ
ヒジシクロへキシルカルボジイミド（６ｘ９）およびＮ
−ヒドロキシスクシンイミド（２ｊ！９）を含有するピ
リジン溶液（１，５ｆｆ１２）に添加する。栓付フラス
コ内で室温にて２日間撹拌した後、生成物を、シリカゲ
ルプレパラティブプレート上、適当なメタノールおよび
クロロホルムの混合物で溶出することにより単離する（
′ｒＬｃ　　ｒｕ＝ｏ、３、メタノール：クロロホルム
（ｌ・４））。

実施例５ Ｔ１１０組 Ａ、試薬 本文中用いるパーセンテージは、特記しない限り、全て
、重量／容積である。

（１）予備処理溶液：Ｏ，１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７。

５　：　１０　ｍ９／ｘ（ｌリボフラビン結合タンパク
質；０゜１％ナトリウムアジド （２）トレーサー：０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６゜
３）中成（ＩＶ）の化合物（１１１ナノモル）および０
゜１％アジ化ナトリウムからなる （３）抗体：０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中適
当に希釈した好ましいイムノゲンに対して得られた抗血
清；０．１％アジ化ナトリウムを含有するヒツジ抗血清
および２％エチレングリコール、０５％ウシγ−グロブ
リン （４）希釈緩衝液：０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ　１
１７．５）、０．０１％ウシγ−グロブリンおよび０゜
１％ナトリウムアジド （５）カリブレークー：正常ヒトの尿（５％ＤＭＳＯ１
０，５％１３ＳＡおよび０．９％ＮａＣ（２含有）中、
０．０．２５．４０，６０．８０および２００μ９／Ｑ
の鼎度で０．１％アジ化ナトリウムとともに保存したｔ
ｉ−ツルー△８−テトラヒドロカンナビノール−９−カ
ルボン酸 （６）対照：正常ヒトの尿（５％ＤＭＳＯ１０，５％Ｂ
ＳＡおよび０，９％Ｎａ（Ｊ！金含有中、３５．５０お
よび１２０μ９／Ｑの濃度で０．１％アジ化ナトリウム
とともに保存した１１−ツルー△８−テトラヒドロカン
ナビノール−９−カルボン酸（７）洗液：約５０％ジメ
チルスルホキシドおよび０．４５％塩化ナトリウムを含
有する溶液偏光蛍光測定は全て、Ａｂｂｏｔｔ　　ＴＤ
Ｘアナライザーを用いて行なう。

Ｂ１分析法 ５０μｇの尿、血清または血漿を用いる。カリブレーク
−１対照サンプル、または未知のサンプルを、直接、Ｔ
Ｄｘサンプルカートリッジのサンプルウェルにピペット
で移す。この方法の特長の１つは、特別な試料の製造の
必要がないことである。試料を直接、サンプル・カラセ
ル（ｓａｍｐｌｅｃａｒｏｕｓｅｌ）に入れ、キットの
４つの試薬容器の各々のキャップをはずし、ＴＤＫアナ
ライザー内の所定のウェル内に入れる。この時点からの
分析手順は、完全に自動化されている。

（１）５μＱの未知のサンプル、半分の予備処理物およ
び抗血清全部をキュベツトに添加する。希釈剤を添加し
て、容積を１．０１１Ｑにする。

（２）バックグラウンド強度を読みとる。

（３）残りのサンプル、および予備処理溶液＋２５μＱ
のトレーサー溶液をキュベツトに添加する。

希釈剤を添加して、容積を２　、　Ｏｙ、Ｑにずろ。

（４）トレーサーの抗体に対する結合による蛍光偏光を
、混合物の最終偏光蛍光強度から、バックグラウンドの
偏光蛍光強度を差引いて求める。

（５）得られた偏光値は、各サンプルのＴＩ（４度に反
比例する。

（６）サンプルの偏光値を、Ｔ　ＨＣ含量が既知のカリ
ブレーク−を用いて作成した標準曲線と比較する。

前記の好ましい方法に関して、トレーサー、抗体、予備
処理溶液、カリブレーク−および比較サンプルは、約２
および約８℃の間で貯蔵し、一方、希釈緩衝液は、周囲
温度で貯蔵しなければならない。標準曲線の作成および
対照実験は、２週問おきに行ない、各カリブレーターお
よび対照実験は２回ずつ試験する。対照実験は毎日行な
い、必要があれば、全てのサンプルは、複数回試験する
。

実施例６ 鎮 種々の洗液を、ＴＤｘアナライザーのプローブに対する
カンナヒノイドの付着性を最小にする能力に関して評価
する。キャリーオーバーは以下の様にして測定する：Ｔ
ＤＸカラセルポジション１〜５には、へカリブルーター
（定義により、Ｏ、Ｏｍ９／ｍＱのＴＨＣを含有）。ポ
ジション６〜１５には、１０μ９／１１（ｌの△”−Ｔ
ＨＣ−９−カルボン酸を含有する尿のサンプル。ポジシ
ョン１６〜２０も、へカリブレーク−。キャリーオーバ
ーは、ポジション１６で測定された薬物の濃度をＩθμ
９／ｙ、（ｌでわって得る。許容し得るキャリーオーバ
ーは、０゜０５％未満と定義する。結果は以下の第１表
に示す。

第　　１　　表

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿２がｎ−ペンチル、Ｒ＿３がＨ、Ｒ＿４が
   Ｒ−Ｚ−Ｑ、およびＸが▲数式、化学式、表等がありま
   す▼である場合、Ｒ＿１はＨ、または、Ｒ＿２がｎ−ペ
   ンチル、Ｒ＿３がＲ−Ｚ−Ｑ、Ｒ＿４がＣＨ＿３および
   Ｘが▲数式、化学式、表等があります▼の場合、Ｒ＿１
   はＨ、または、Ｒ＿２がｎ−ペンチル、Ｒ＿３がＨ、Ｒ
   ＿４がＣＨ＿３またはＣＯＯＨ、Ｘが▲数式、化学式、
   表等があります▼の場合、Ｒ＿１はＲＺＱ、または、Ｒ
   ＿２が−ＣＨ＿２ＲＺＱ、Ｒ＿３がＨ、Ｒ＿４がＣＨ＿
   ３またはＣＯＯＨ、Ｘが▲数式、化学式、表等がありま
   す▼の場合、Ｒ＿１はＨ、または、Ｒ＿２が−ＣＨ＿２
   −Ｒ、Ｒ＿３がＨ、Ｒ＿４がＨまたはＲＺＱ、Ｘが−Ｎ
   −の場合、Ｒ＿１はＨ；Ｒは、０〜２０個の炭素原子お
   よびヘテロ原子からなる結合基であって、１２個以下の
   ヘテロ原子を含有し、直鎖または分枝状鎖の構造で、２
   個までの環状構造を有する。ただし、４個以上のヘテロ
   原子は連続して結合せず、２個以上の硫黄または窒素ま
   たは１個以上の酸素原子は連続して結合しない； Ｚは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝ＮＨ、ＮＨ、ＳＯ＿２；Ｑは、水素
   、ヒドロキシ、ハロゲン、アシルオキシ、Ｎ−スクシン
   イミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ、アルコキ
   シ、フェノキシ、置換フェノキシ、Ｎ−イミダゾリル、
   １−ベンゾトリアゾリルオキシ、または、フルオレセイ
   ンのアミノ、アミド、アミジノ、尿素、チオ尿素、カル
   バメート、チオカルバメート、トリアジニルアミノ、ま
   たは（カルボキシアミノ）スルホンアミド誘導体である
   ］ で示される化合物。
2. （２）Ｑがフルオレセインのトリアジニルアミノ誘導体
   である特許請求の範囲第１項記載の化合物。
3. （３）Ｑが、４−クロロ−６−（フルオレセイン−６−
   イルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イルであ
   る特許請求の範囲第１項記載の化合物。
4. （４）Ｑが、フルオレセイン−５−イルカルボニルまた
   はフルオレセイン−６−イルカルボニルから選択される
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。
5. （５）Ｑが、（フルオレセイン−５−イルアミノ）カル
   ボニルまたは（フルオレセイン−６−イルアミノ）カル
   ボニルから選択される特許請求の範囲第１項記載の化合
   物。
6. （６）Ｑが、（フルオレセイン−５−イル）アミノまた
   は（フルオレセイン−６−イル）アミノから選択される
   特許請求の範囲第１項記載の化合物。
7. （７）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ で示される、テトラヒドロカンナビノイドを検出するた
   めの蛍光偏光アッセイにおいて用いる、トレーサー化合
   物。
8. （８）（ａ）テストサンプルを、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１はＨ、Ｒ＿２はネオペンチル、Ｒ＿４は
   ＣＨ＿３、Ｒ＿３はＲＺＱ； Ｒは、１２以下のヘテロ原子を含み、直鎖状または分枝
   状に配列し、最高２個の環構造を有する０〜２０個の炭
   素原子およびヘテロ原子からなる結合基である。ただし
   、４個以上のヘテロ原子は連続して結合せず、２個以上
   の硫黄または窒素原子または１個以上の酸素原子は連続
   して結合しない； Ｚは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝ＮＨ、ＮＨ、およびＳＯ＿２から選
   択される結合基であり、Ｑは、フルオレセインまたはフ
   ルオレセイン誘導体である］ で示されるトレーサーの塩、およびテトラヒドロカンナ
   ビノイドおよびその前記トレーサーを特異的に認識し、
   結合し得る抗体と混合し、 （ｃ）前記抗体に結合したトレーサーの量を、蛍光偏光
   技術により、サンプル中のテトラヒドロカンナビノイド
   およびテトラヒドロカンナビノイド中間代謝物の量とし
   て測定する工程からなる、蛍光偏光アッセイにより生物
   学的液体のテストサンプル中のテトラヒドロカンナビノ
   イドおよびテトラヒドロカンナビノイド中間代謝物の測
   定方法。
9. （９）前記トレーサーが、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）（ａ）サンプルを、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＿１はＨ、Ｒ＿２はネオペンチル、Ｒ＿４は
    メチル、Ｒ＿３はＲ−Ｚ−Ｑ； Ｒは、１２個以下のヘテロ原子を含み、直鎖状または分
    枝状に配列し、最高２個までの環構造を有する０〜２０
    個の炭素原子およびヘテロ原子からなる結合基である。 ただし、４個以上のヘテロ原子は連続して結合せず、２
    個以上の硫黄または窒素または１個以上の酸素原子も連
    続して結合しない； Ｚは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝ＮＨ、ＮＨおよびＳＯ＿２から選択
    される結合基であり、Ｑは、フルオレセインまたはフル
    オレセイン誘導体である］ で示されるトレーサーの塩およびテトラヒドロカンナビ
    ノイドおよび前記トレーサーと選択的に結合する抗体を
    混合し、 （ｂ）前記工程に結合する前記トレーサーの量を、蛍光
    偏光技術により、サンプル中のテトラヒドロカンナビノ
    イドおよびテトラヒドロカンナビノイド中間代謝物の量
    として測定し、 （ｃ）計量分配手段を５０％ジメチルスルホキシドおよ
    び０．４５％塩化ナトリウム水溶液中で洗浄する 工程からなる、サンプルおよび試薬計量分配手段を有す
    る自動アッセイ装置を用いる、蛍光偏光アッセイによる
    生物学的液体のテストサンプル中のテトラヒドロカンナ
    ビノイドおよびテトラヒドロカンナビノイド中間代謝物
    を測定する方法。
11. （１１）前記抗体に結合するトレーサーの測定に、ｌｌ
    −ノル−Δ＾９−テトラヒドロカンナビノールカルボン
    酸カリブレーターおよびコントロールを用いる特許請求
    の範囲第１０項記載の方法。