FI112117B - Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa - Google Patents
Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa Download PDFInfo
- Publication number
- FI112117B FI112117B FI970801A FI970801A FI112117B FI 112117 B FI112117 B FI 112117B FI 970801 A FI970801 A FI 970801A FI 970801 A FI970801 A FI 970801A FI 112117 B FI112117 B FI 112117B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- ouabain
- plasma
- analog
- analogue
- compound
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
- Y10S436/817—Steroids or hormones
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/822—Identified hapten
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Description
112117
Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa
Esillä oleva keksintö koskee reaktiivista yhdistettä käytettäväksi merkkiaineena im-munoanalyysissä, joka yhdiste käsittää ouabaiinin tai sen analogin, johon on liitettv 5 detektoitavalla radiojodilla tai fluorogeenillä leimattu yhdiste. Keksintö koskee myös menetelmää, jossa näitä reaktiivisia yhdisteitä käytetään mitattaessa ouabaii-nin, ouabaiini-isomeerien, ouabageniinin tai ouabageniini-isomeerien tasoja biologisissa nesteissä, erityisesti plasmassa, sydänverisuonitautien, umpieritystautien ja muiden haitallisten tilojen diagnostisointia varten.
10 Natrium-kalium-adenosiinitrifosfataasi (Na-K-ATPaasi) on solukalvon entsyymi, jonka päätehtävänä on natriumin siirtäminen solun ulkopuolelle. Kun tiedetään, että sydänglykosidit estävät Na-K-ATPaasia (Goto et ai., Pharmacol. Rev. 44:377-399, 1992), niin on otaksuttu, että niiden kaltaiset aineet toimivat fysiologisesti endo-geenisinä natriureettisina hormoneina. Natriureettisten hormoneiden etsiminen on 15 johtanut sydänglykosidi ouabaiinin puhdistamiseen ja kemialliseen karakterisointiin ihmisen plasmasta (Hamlyn et ai., Hypertension 10 [Suppl. I]:I-71-I-77, 1987; Hamlyn et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:6259-6263, 1991; Ludens etal., Hypertension 17:923-929, 1991). Ouabaiinia tai sen rakenteellisesti läheistä yhdisteitä on myös eristetty nisäkkään lisämunuaiskuoresta (Shaikh et ai., J. Biol. Chem. 20 266:13672-13678, 1991) ja hypotalamuksesta (Alaghband et ai., J. Endocrinol.
98:21-226, 1983). Lisämunuaisrauhasissa on tavattu korkeita ouabaiinipitoisuuksia ja niiden poistaminen tai vaihtelut elektrolyyttien annossa aiheuttavat muutoksia plasman ouabaiinitasoissa (Ludens et ai., Hypertension 19:721-724, 1992; Hamilton :V: et ai., Current Opinion in Endocrin. and Diabetes 1:123-131, 1994; Laredo et ai., ;"25 Endocrin. 153:794-797, 1994). Kuitenkaan näissä tutkimuksissa käytetyt mittaus-:·. menetelmät eivät ole olleet luotettavia. Ihmisen plasmasta ja naudan hypotalamuk-sesta eristetty ouabaiini saattaa erota hieman rakenteeltaan kasvista eristetystä oua-baiinista, vaikkakin niillä on samanlaiset ominaisuudet nestekromatografialla ja massaspektrometrillä mitattuna (Zhao et ai., Biochemistry 34:9893-9896, 1995).
• “ 30 Kasvista eristettyä ouabaiinia on käytetty lääkkeenä nimellä G-strofantiini sydämen . vajaatoiminnan hoidossa. Koska ouabaiinia esiintyy myös ihmisessä, oletettiin, että sen eritys saattaisi olla kohonnut mm. eri sydäntaudeissa.
Nyt on selvää, että plasman ouabaiinitasot ovat parhaimmillaan hyvin alhaiset ja että .·. ; niiden luotettava mittaaminen ei ole ongelmatonta. Radioimmunoanalyyseillä on 112117 2 mahdollista saavuttaa tarvittava herkkyys, mutta hyvä herkkyys on altis ei-spesifi-sille häiriöille. Ensimmäinen ouabaiinin radioimmuloginen määritys julkaistiin vuonna 1986 (Masugi et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun 135:41-45, 1986) ja siinä käytettiin polyklonaalista vasta-ainetta ja tritioitua ouabaiinia merkkiaineena.
5 Myöhemmin useat tutkijat ovat kehittäneet immunoanalyysejä ouabaiinin määrittämiseksi kehon nesteissä (Hamlyn et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:6259-6263; Naruse et ai., Hypertension 23 [Suppl I]: I-102-I-105, 1994; Harris et ai., Hypertension 17:936-943, 1991). Ilmoitetut plasman ouabaiinitasot ovat kuitenkin vaihdelleet huomattavasti, alle 5:stä (Lewis et ai., Hypertension 24:549-555, 1994) 440-530:een 10 pmol/1 (Gottlieb et ai., Circulation 86:420-425, 1992; Rossi et ai., J. Hypertension 13(10):1181-1191, 1995), kun on käytetty näytteiden kiinteäfaasierotusta. Korkea vaihtelevuus selvästi osoittaa, että on tarvetta herkälle ja luotettavalle ouabaiinin määritysmenetelmälle kliinisiä ja fysiologisia tutkimuksia ja diagnostisointia varten.
Zhao et ai. Biochemistry 34:9893-9896, 1995, ovat äskettäin raportoineet, että naf-15 toylaation jälkeen ihmisen plasmasta tai naudan hypotalamuksesta eristetyt ouaba-iininkaltaiset yhdisteet eroavat autenttisesta ouabaiinista käänteisfaasi-HPLC.ssä. Naftoyloiduilla yhdisteillä oli erilainen CD-spektri kuin naftoyloidulla autenttisella ouabaiinilla. He päättelivät, että aikaisemmin eristetty yhdiste on kasviouabaiinin uusi isomeeri, jossa on mm. erilainen hydroksyyliryhmien kiinnityskohta ja/tai ste-20 reokemia steroiditähteessä. On huomattava, että natiivi isomeeri ei eroa kasvioua-baiinista massaspektriltään, kromatografisilta tai immunologisilta ominaisuuksiltaan, jolloin ouabaiinin immunoanalyysiä voidaan käyttää endogeenisen yhdisteen mit-...: taamisessa.
Eristettäessä ouabaiinia yhtenä ehdokkaana endogeeniseksi natriureettiseksi hor-’.125 moniksi käytettiin plasman ouabaiinin mittaamiseksi ELISA-menetelmää (Hamlyn et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:6259-6263, 1991). Tällä menetelmällä Cjg-• ’.· hartsilla uutettujen ihmisen plasmanäytteiden havaittiin sisältävän 138 pmol/1 oua-baiini-immunoreaktiivisuutta. Myöhemmin on raportoitu jopa korkeampia plasman ouabaiinitasoja, mutta immunoreaktiivisuuden luonnetta ei ole tutkittu (Gottlieb ja ...30 Rossi, yllä). Suuresta plasmamäärästä saatu immunoreaktiivinen materiaali käyttäy-.···, tyi identtisesti autenttisen ouabaiinin kanssa kahdessa erilaisessa käänteisfaasi HPLC-systeemissä (Harris et ai., Hypertension 17:936-943, 1991). Neljä muuta seu-:.’·: raavaa tutkimusta eivät kuitenkaan pystyneet vahvistamaan tätä tulosta. Ouabaiinia ei pystytty osoittamaan kun plasmanäytteitä uutettiin kiinteäfaasimenetelmillä ja ....35 mitattiin joko kahdella erilaisella ELISAlla herkkyyksillä 30-60 pmol/L (Gomez-,·. : Sanches et ai., Am. J. Hypertension 7:647-650, 1994) tai radioimmunoanalyysillä 112117 3 herkkyydellä 75 pmol/L (Doris et ai., Hypertension 23(5):632-638, 1994). Myöskään HPLC-kokeet suuremmilla plasmatilavuuksilla eivät antaneet mitään näyttöä ouabaiinista ihmisen plasmassa (Lewis ja Doris, yllä). Hyvin alhaisia plasman oua-baiinipitoisuuksia on myöskin raportoitu, mutta plasmauutteiden sarjalaimennokset 5 eivät olleet rinnastettavissa ouabaiiniin (VVorgall et ai., J. Hypertension 14(5):623-628, 1996) ja HPLC-analyysit eivät kyenneet osoittamaan detektoitavia määriä im-munoreaktiivisuutta koeluoitaessa autenttisen ouabaiinin kanssa (Worgall ja Gomez-Sanches, yllä). Edellä olevaan perustuen näyttää selvältä, että tähän mennessä käytettyjen tritioitujen immunomääritysten tai ELISA-menetelmien alhainen herkkyys 10 on suurin syy, miksi useiden edellä mainittujen tutkimusten tulokset ovat johtaneet päätelmään, että ihmisen plasmassa ei ole läsnä ouabaiinia.
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan herkkä ja luotettava määritysmenetelmä plasman ouabaiinille tai sen analogeille käytettäväksi ouabaiinin im-munoanalyysissä diagnostisoitaessa mm. sydämen vajaatoimintaan liittyviä sairauk-15 siä. Tämä on saatu aikaan keksinnön mukaisesti siten, että on käytetty korkean affiniteetin omaavia polyklonaalisia vasta-aineita ja korkean spesifisen aktiivisuuden omaavaa radiojodattua tai fluorogeenilla merkittyä ouabaiini-yhdistettä merkkiaineena ja C18-käänteisfaasierotusta erittäin herkän immunoanalyysin aikaansaamiseksi, joka soveltuu endogeenisen ouabaiinin tai sen analogin immunoreaktiivisuuden ru-20 tiininomaiseen mittaamiseen ihmisen plasmasta.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Keksinnön yhteydessä on yllättäen havaittu, että radiojodin, erityisesti 125i;n tai : .· fluorogeenin, erityisesti lantanidin, kuten europium, käyttäminen ^H:n sijasta paran- taa dramaattisesti ouabaiinin radioimmunoanalyysin herkkyyttä. Myös muita jodi-;" 25 isotooppeja, kuten ^If voidaan käyttää samalla tavalla johtuen isotooppien kemi-;·. allisesta yhtenevyydestä. tai Eu-kelaatilla leimatulla ouabaiiniyhdisteellä herkkyys oli selvästi - noin 100 kertaa - parempi verrattuna aikaisemmin käytettyihin ELISA- tai radioimmunoanalyyseihin, joissa käytettiin ^H-leimattua merkkiai-. netta. Eu-kelaatin ohella voidaan käyttää myös samarium- tai terbium-kelaattia, kos- ' _ 3‘0 ka niiden kelaattiosat ovat samanlaiset kuin Eu-kelaatilla. Keksinnön mukaisella radioimmunoanalyysillä kyetään detektoimaan ouabaiini pitoisuutena noin 0,5 finol/putki verrattuna herkimpien aikaisemmin kuvattujen menetelmien 10-20 finol/putki tai kuoppa (Harris et ai., Hypertension 17:936-943, 1991). Terveen ihmi-* . sen plasmasta voidaan keksinnön mukaisella menetelmällä yhdessä Ci8-käänteis-35 faasierotuksen kanssa detektoida niinkin pieni määrä kuin 10,8 pmol/L immunore-
• · I
• aktiivista ouabaiinia. Kiinteäfaasimenetelmässä saanti oli lähes 100% ja plasma- 4 112117 uutelaimennokset olivat rinnastettavissa synteettisen ouabaiinin kanssa keksinnön mukaisessa radioimmunoanalyysissa. Lisäksi ihmisen plasmauutteiden ouabaiini-inmiunoreaktiivisuus eluoitui identtisesti autenttisen ouabaiinin kanssa kahdessa erilaisessa käänteisfaasi-HPLC-systeemissä. Tämä osoittaa selvästi, että ouabaiinia 5 tai läheistä yhdistettä esiintyy ihmisen plasmassa, mutta tasoina, jotka ovat alle aikaisemmin tunnettujen ouabaiinianalyysimenetelmien herkkyysrajojen.
Esillä oleva keksintö osoittaa, että käytettäessä keksinnön mukaista menetelmää käsittäen radioaktiivisella jodilla tai fluorogeenilla merkityn ouabaiinianalogin ja käänteisfaasierotuksen voidaan ihmisen plasmasta detektoida autenttisesta ouabaii-10 nista immunologisesti ja kromatografisesti erottamattomissa oleva yhdiste. Keksinnön mukaisella menetelmällä havaittavissa olevat ouabaiinitasot ovat huomattavasti alhaisemmat kuin aikaisemmilla menetelmillä saadut. Korkeita plasmapitoisuuksia voidaan mitata käsittelemättömästäkin näytteestä.
Seuraavassa keksintöä on havainnollistettu kuviin viittaamalla.
15 Kuvassa 1 on eri merkkiaineiden (¾ 1^1 ja. Eu) sitoutuminen ilmaistu prosentteina maksimisitoutumisesta ouabaiinimäärän (pikogrammaa) tai uutetun plasmamää-rän (mikrolitraa) funktiona. Huomataan, että kun merkkiaineena käytetään jodi-125 :tä tai europiumia, niin herkkyys on noin 100 kertaa suurempi kuin ^H:ta käytettäessä. Myös ihmisen plasmauutteen sarjalaimennokset syrjäyttävät merkkiainetta 20 samoin kuin ouabaiinin vastaavat laimennokset.
:··; Kuvassa 2 on esitetty ihmisen (A ja B) plasmauutteiden ouabaiini-immunoreaktiivi-. · · ·. suuden käänteisfaasi-HPLC-analyysi. 6-12 ml plasmaa puhdistettiin SepPak-uutossa . v. ja uutetta analysoitiin Vydac C^g -kolonnissa asetonitriiligradientilla 0-40 % 0,1 % trifluoroetikkahapossa 30 minuutin ajan (A) tai Vydacin pH-stabiilissa Cg-kolonnis-.'.25 sa asetonitriiligradientilla 5-50 % 0,1 M NH^HCC^issa 30 minuuttia (B). Yksi koi· • ” masosa ajon A immunoreaktiivisuuden pääkomponentista vietiin kolonniin B. Yh- *·’ ’ den millilitran fraktioita kerättiin ja analysoitiin ouabaiini-immunoreaktiivisuus.
Nuoli osoittaa autenttisen ouabaiinin eluutiokohdan.
I I
. · · ·, Seuraavassa on keksintöä kuvattu lähemmin esimerkkien avulla.
• * » 5
Esimerkit 112117 1. Materiaalit
Ouabaiini(G-strofantiini)oktahydraattia, ouabageniinia, digoksiinia, digitoksiinia ja samankaltaisia steroideja (aldosteronia, kortisonia, hydrokortisonia, progesteronia, 5 beta-estradiolia, testosteronia), naudan tyroglobuliinia, poly-L-lysiiniä ja natrium-syanoborohydridiä saatiin Sigma Chemical Companyltä (St. Louis, MO, USA) Freundin epätäydellistä ja täydellistä adjuvanttia hankittiin Difco Laboratoriesilta (Detroit, MI, USA). L-tyrosiinia ja polyetyleeniglykoli 6000:ta Fluka AGiltä (Buchs, Sveitsi), ^H-ouabaiinia (21,22-^H-ouabaiini) ja Na^5j (IMS 300) Amer-10 sham International plc:ltä (Buckinghamshire, U.K.), Eu-kelaatti Wallacilta (Turku, Suomi), Sephadex G-50F Pharmacialta (Uppsala, Ruotsi). Kaikki muut kemikaalit saatiin E. Merck AG:ltä.
2. Ouabaiiniantigeenin ja -antiseerumin valmistus
Ouabaiini liitettiin naudan tyroglobuliiniin käyttäen menetelmää Masugi et ai. Bio-15 chem. Biophys. Res. Commun 135:41-45, 1986. Ouabaiini-tyroglobuliinikonjugaatti puhdistettiin geelisuodattamalla (Sephadex G-50F, 0,9 % NaClissä). Konjugaatti emulgoitiin Freundin täydelliseen adjuvanttiin ja injektoitiin ihonalaisesti viiteen kaniin (1 mg/kani). Tehoinjektioita (0,5 mg/kani Freundin epätäydellisessä adjuvan-tissa) annettiin kuukauden välein.
20 3. Radiojoditetun ouabaiinimerkkiaineen valmistus
Keksinnön mukaisesti ouabaiini liitettiin ensin L-tyrosiiniin menetelmällä, jota ai- kaisemmin on käytetty proteiinin (albumiini, tyroglobuliini) liittämiseksi ouabaii- : *''; niin. Ouabaiinin (3,1 mg) annettiin reagoida NalO^n kanssa tislatussa vedessä (0,1 ml). Etanolia lisättiin liuokseen ja pH säädettiin NaOH:lla 8:ksi. L-tyrosiinia (0,8 .-:25 mg 0,4 ml:ssa 0.05 M natriumfosfaattia, pH 9) lisättiin tipoittain ja inkuboitiin 2 tuntia. Natriumsyanoborohydridiä (0,25 mg 0,2 mlissa tislattua vettä) lisättiin ja re- aktioseos puhdistettiin käänteisfaasi-HPLCillä (Vydac Cig -kolonni 0,05 % tri- fluorietikkahapossa) käyttäen metanoligradienttia (1 %/min). UV(220 nm) piikit HPLCissä tutkittiin immunoreaktiivisuuden suhteen ja 23,7 minuutin kohdalla eluoi- :’·30 tanut piikki oli tyrosyloita ouabaiinianalogi, koska se kyettiin jodittamaan ja se oli immunoreaktiivinen. Tyrosyloita yhdiste (1 pg) radiojoditettiin Namina Chlora- • . mine-T:n (5 pg) avulla. 30 sekunnin jälkeen reaktio pysäytettiin natriummetabi- ’ sulfiitilla ja merkkiaine puhdistettiin käänteisfaasi-HPLCillä käyttäen 12-60% as? · • · · 112117 6 tonitriiligradienttia 0,1 %:ssa trifhiorietikkahappoa. Radiojoditettu merkkiaine eluoi-tui 22 minuutin kohdalla.
4. Fluorogeenisen ouabaiinimerkkiaineen valmistus
Analogisesti esimerkin kolme mukaisesti ouabaiini liitettiin ensin poly-L-lysiiniin 5 natriumsyanoborohydridin avulla: ouabaiinin (2,9 mg) reagoitua NalO^n kanssa yön yli +4 °C:ssa tislatussa vedessä (0,7 ml). Etanolia lisättiin 0.7 ml ja liuoksen pH säädettiin NaOH:lla 8:ksi, minkä jälkeen poly-L-lysiini (0,5 mg 0,1 ml:ssa 0,05 M fosfaattipuskuria, pH 9) lisättiin reaktioliuokseen ja kahden tunnin kuluttua natrium-syanoborohydridi (0,25 mg 0,1 ml:ssa tislattua vettä). Reaktioseos fraktioitiin kään-10 teisfaasi-HPLC: llä (Vydacin Ci8-kolonni 0,05 % trifluorietikkahapossa) käyttäen metanoligradienttia (5-35 %/min). Fraktioiden immunoreaktiivisuus suhteessa UV-absorptioon (220 nm) testattiin ouabaiini-125i_RiA:ssa. Mainitun HPLC-ajon suurimman immunoreaktiivisuuden (ja samalla suurimman UV-piikin) antama fraktio (no 26) oli ouabaiini-poly-L-lysiini, joka sitten valittiin Eu^+-leimaukseen. Tässä 15 ko. fraktion ainemäärän (noin 12 μg 250 piissä 0,1 M NaHCC>3, pH 9) annettiin reagoida Eu-kelaatin (0,1 mg 250 piissä 0,1 M NaHCC>3, pH 9) kanssa yön yli +4 °C:ssa. Reaktioliuos fraktioitiin käänteisfaasinestekromatografisesti (Vydacin pH-stabiili Cg-kolonni 0,05 M NH4HC03:ssa pH 7,8 / metanoligradientti 5-35 %). Fluorogeeniset fraktiot testattiin ouabaiini-immunoreaktiivisuuden suhteen. FIA:ssa 20 (fluoroimmunoassay) 20 minuutin kohdalla eluoituva fraktio antoi tiitteriltään ja herkkyydeltään RIA:aan nähden vertailukelpoisen syrjäytymiskäyrän (ks. kuva 1).
. Kuvasta nähdään, että herkkyys on noin 100 kertaa herkempi kuin ^H-leimalla aikaansaatu käyrä.
: Y: 5. RIA-menetelmät • · ..'25 Kaikki viisi kania tuottivat antiseerumia tyroglobuliiniin konjugoitua ouabaiinia vastaan primaarisen immunisoinnin jälkeen. Kolmen tehosteinjektion jälkeen ’·' 30 %:n sitoutumisen antavat tiitterit olivat välillä 1:3000 ja 1:7000 ^H-ouabaiini- merkkiaineella ja välillä 1 : 300 000 ja 1 : 1 000 000 125i.oua|3aiiniiner]ij:iaineeiia . · · . Ouabaiinin radioimmunoanalyysistandardit ja -näytteet kiinteäfaasierotuksesta pipe-•30 toitiin 100 μ1:η kaksinkertaisena näytteenä. Antiseerumi ("199", lopullinen laimen-• ·' nos 1 : 1 000 000) ja ouabaiinimerkkiaine (Eu-, 125j_ tai ^H-leimattu) lisättiin yh-dessä 100 pl:na. Yli yön kestäneen inkuboinnin jälkeen sitoutunut ja vapaa fraktio •;: erotettiin kaksoisvasta-ainesaostuksella 8 % polyetyleeniglykolin läsnäollessa, ja sa- 112117 7 koista mitattiin radioaktiivisuus. Käytettäessä ^H-ouabaiinia merkkiaineena sakat liuotettiin tuikenesteeseen ennen mittausta β-laskurissa.
Kaikilla antiseerumeilla ouabaiinin radioimmunoanalyysin herkkyys oli alle 1 pg/putki ja 50 %:n syrjäytyminen tapahtui 2-10 pg/putki kohdalla käytettäessä Eu-5 merkattua tai radiojoditettua ouabaiiniyhdistettä merkkiaineena. Antiseerumi, jonka koodi oli "199", valittiin jatkokäyttöön. Sen herkkyys oli noin 100 kertaa korkeampi käytettäessä radiojodattua merkkiainetta verrattuna ^H-markkeriin (0,3 ja 32 pg/putki tai 0,5 ja 57 fmol/putki, vastaavasti, katso kuva 1). Vaihtelukertoimena analyysin sisällä oli 3,8 % ja 3,7 % 10.8 pg/putki ja analyysien välillä 22,2 % ja 9,1 % 49,2 10 pg/putki, vastaavasti (n=12).
Antiseerumi "199" detektoi ouabaiinitähteen spesifisesti. Testatuista yhdisteistä oua-bageniini osoitti korkeinta ristireaktiivisuutta, 52 %, kuten saattoi konjugointitavasta odottaa. Digoksiini ja digitoksiini ristireagoivat hieman (alle 1,7 %), kun taas havaittavaa (alle 0,001 %) ristireaktiivisuutta ei havaittu luonnollisesti esiintyvillä steroi-15 deilla, kuten aldosteroni, progesteroni, testosteroni, beta-estradioli.
6. Plasmanäytteiden kiinteäfaasierotus
Ouabaiini erotettiin 1-2 ml:n plasmanäytteistä SepPak^Vac 500 mg C18 -patruunoilla (Waters, Milford, MA, USA) käyttäen automaattista Gilson 5100 Aspec -systeemiä. Patruunat esikäsiteltiin 2 ml:lla 2-propanolia ja 4 ml:lla 0,1 % vesipitoista 20 trifluorietikkahappoa (TFA). Tämän jälkeen lisättiin plasmanäyte (1 ml), johon oli :··· lisätty 0,2 ml 1 M HCl:ää ja 1,6 % glysiiniä. Patruuna pestiin 0,1 % trifluorietikka-; hapolla (2 ml). Ouabaiini eluoitiin patruunasta 2 ml:lla 40 % asetonitriiliä 0,1 %:ssa TFAissa. Haihdutuksen jälkeen näytteet liuotettiin 250 pilaan ouabaiinin radioim-_··! munoanalyy sipuskuria.
: '2-5 7. Plasmaekstraktien HPLC-analyysi
SepPak-plasmaekstraktit (katso yllä) liuotettiin 0,1 % trifluoroetikkahappoon (TFA),
. sentrifugoitiin, suodatettiin ja analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:ssä käyttäen Vydatin C ig-218TP-kolonnia (0,46 x 15 cm, Hesperia, CA, USA). 30 minuutin lineaarista ·;·’ gradienttia 0-50 % asetonitriiliä 0,1 % TFA:ssa ajettiin virtausnopeudella 1 ml/min. :/J0 1 ml:n fraktioita kerättiin ja kuivattiin Speed Vac:ssa, liuotettiin 250-500 pkaanRIA
: ’": puskuria ja niille suoritettiin ouabaiinin radioimmunoanalyysi. Yksi kolmannes kro- ’ . matografian immunoreaktiivisesta pääpiikistä analysoitiin uudelleen Vydacin pH-. , stabiilissa Cg-kolonnissa (228TP, 0,46 x 25 cm) ja eluoitiin 30 minuutin lineaari- • ’· sella gradientilla 5-50% asetonitriilillä 0,1 M NH4HC03:ssa. Virtausnopeus oli 112117 8 1 ml/min ja 1 ml:n fraktioita kerättiin. Sokkoajot käyttäen näytteenä puhdasta vesipitoista puskuria eivät osoittaneet lainkaan ouabaiini-immunoreaktiivisuutta. Kalibrointi ja saalisanalyysit suoritettiin lisäämällä ouabaiinia (50 tai 100 pg) ihmisen plasmaekstrakteihin ennen kromatografiointia. HPLC-analyysit toistettiin kolme 5 kertaa ja sokkoajot kerran samanlaisilla tuloksilla.
8. Ihmisten plasmanäytteiden radioimmunoanalyysin varmistaminen Käytettiin kiinteäfaasierotusta Cjg-patruunoita käyttäen ouabaiini-plasmanäytteiden konsentroimiseksi ja puhdistamiseksi. Ouabaiinierotuksen saanto 1 ml:sta ihmisen plasmaa oli 102,8 ± 2,5 % 25 pg:llä ja 93,6 ± 1,3 % 75 pg:llä (keskiarvo ± SEM, 10 n=5). Plasmaekstraktien endogeeninen immunoreaktiivisuus noudatti ouabaiinistan- dardia (kuva 1) ja eluoitui identtisesti autenttisen ouabaiinin kanssa kahdessa kään-teisfaasi-HPLC-systeemissä erilaisilla selektiivisyyksillä (kuva 2). Plasmaekstraktiin lisätyn ouabaiinin HPLC:n saanto oli 89,6 %.
9. Potilasnäytteet 15 Verinäytteet otettiin EDTA-putkiin rutiinikäynneillä 20 naiselta raskauden II- ja III-kolmanneksen aikana sekä 31 potilaalta, joilla oli korkea verenpaine (naisia ja miehiä, iät 45-82 vuotta) ja joita oli hoidettu β-salpaajalla, ACE-inhibiittorilla, diureet-teilla ja/tai nitroprussidilla. Plasma erotettiin ja varastoitiin -20 °C:ssa. 20 laboratorion työntekijältä (naisia ja miehiä, iät 25-56 vuotta) kerättiin verinäytteitä käytettä-20 viksi normaalikontrolleina. Kaikki näytteet otettiin klo 9-12 aamupäivällä.
10. Immunoreaktiivinen ouabaiini ihmisen plasmassa •«· : V: Terveiden naisten, ikä 22-45, plasman ouabaiinitaso oli 10,3 ± 1,6 pmol/1 (keskiarvo ± SEM, n=10) ja miesten, ikä 23-56, 11,4 ± 1,2 pmol/1 (n=12). Keskimääräinen ”.t> plasman ouabaiinin taso raskaana olevilla potilailla (trimesteri II ja III) oli 21,6 ± « . · :25 1,1 pmol/1 (n=20), ts. merkittävästi korkeampi kuin verrokeilla.
Korkean verenpaineen omaavilla potilailla oli yleensä alhaisempi plasman ouaba- iinitaso, 7,3±2,1 pmol/1 (n=31) kuin verrokeilla, mutta kahdella potilaalla taso oli ’.,,: selvästi noussut, 61 ja 34 pmol/1. Näillä kahdella potilaalla natriureettisten peptidien : BNP ja proANPm N-terminaalisen fragmentin tasot olivat myös korkeat, ilmeisesti • · ♦ • •30 osoittaen lisääntynyttä sydämen tilavuutta ja venytystä. Koska otoksessa oli kolme muuta verenpainepotilasta, joilla oli korkea plasman ANP, NT-proANP ja/tai BNP, mutta normaali ouabaiinitaso, havaintomme viittaa siihen, että potilailla, joilla on 112117 9 korkea plasman immunoreaktiivisen ouabaiinin taso, voi esiintyä uudentyyppinen verenpainetauti.
Vastikään julkaistiin havaintoja hyvin korkeista plasman immunoreaktiivisen ouabaiinin tasoista potilaalla, jolla oli pienisolukeuhkosyöpä, ektooppinen ACTH-synd-5 rooma ja verenpainetauti. Tällä potilaalla verenpaine korreloi plasman immunoreaktiivisen ouabaiinin kanssa osoittaen, että ouabaiiniyhdiste voi aiheuttaa korkeaa verenpainetta (Goto et ai., Hypertension 28:421-425, 1996). Raskauden aikana ouabaiinin immunoreaktiivisuustasot olivat noin kaksi kertaa korkeammat kuin muutoin. Tämä saattaa johtua lisääntyneestä plasman volyymistä raskauden aikana. Tällä ha-10 valimolla saattaa olla myös jotain yhteyttä aikaisempiin tutkimuksiin, joissa lisääntynyttä Na-K-ATPaasi bioaktiivisuutta on havaittu raskauden aikana (Graves, Hypertension 10:84-86, 1987).
• # * · 1 • · · · ·
Claims (12)
1. Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin määrittämiseksi plasmassa sydänveri-suonitautien, umpieritystautien ja muiden haitallisten tilojen diagnostisointia varten, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: 5 (a) otetaan tutkittavan kohteen verestä näyte, josta erotetaan plasma; (b) plasmanäytteestä rikastetaan ouabaiini tai sen analogi; (c) käytetään ouabaiinille spesifistä, ouabaiinin ja kantajaproteiinin, esimerkiksi tyroglobuliinin, konjugaatilla saatua vasta-ainetta, ja merkkiaineyhdistettä, joka käsittää ouabaiinin tai sen analogin, johon on liitetty yhdiste, joka on leimattu radiojo- 10 dilla tai lantanidilla, (d) mitataan immunologisesti ouabaiinin tai sen analogin taso rikastetussa plasma-näytteessä; ja (e) verrataan vaiheen (c) ouabaiinin tai sen analogin tasoa standardiin kohteen plasman ouabaiinin tai sen analogin tason määrittämiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine ris- tireagoi muiden ihmisen plasman sisältämien steroidien kanssa alle 0,001 %.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ouabaiinin analogi on ouabaiinin isomeeri, ouabageniini tai ouabageniinin isomeeri.
• : 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että radiojodi on 0 20 125L 1 t · I ·
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lantanidi on * · ;! ‘ ’ edullisesti europium. » I · i I I v
: 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ouabaiiniin tai sen analogiin liitetty yhdiste on L-tyrosiini tai poly-L-lysiini. » » · 25
7. Määrityskitti ouabaiinin tai sen analogin määrittämiseksi plasmassa, tunnettu '';' ‘ siitä, että se käsittää: I '.· (a) polyklonaalisen ouabaiinin ja kantajaproteiinin, esimerkiksi tyroglobuliinin, :'": konjugaatilla saadun vasta-aineen ouabaiinille tai sen analogille; , -. (b) merkkiaineyhdisteen, joka käsittää ouabaiinin tai sen analogin, johon on liitet- * · ,;'! 30 ty yhdiste, joka on leimattu radiojodilla tai lantanidilla. » ·
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kitti, tunnettu siitä, että vasta-aine ristireagoi muiden ihmisen plasman sisältämien steroidien kanssa alle 0,001 %. 112117
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kitti, tunnettu siitä, että ouabaiinin analogi on ouabaiinin isomeeri, ouabageniini tai ouabageniinin isomeeri.
10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kitti, tunnettu siitä, että radiojodi on ^5j
10 112117
11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kitti, tunnettu siitä, että lantanidi on edulli-5 sesti europium.
12. Patenttivaatimuksen 7 mukainen kitti, tunnettu siitä, että ouabaiiniin tai sen analogiin liitetty yhdiste on L-tyrosiini tai poly-L-lysiini.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI970801A FI112117B (fi) | 1997-02-26 | 1997-02-26 | Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa |
| AT98905437T ATE254284T1 (de) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Mit i125 oder fluoreszierenden markern markiertes ouabain und entsprechende immunoassays |
| US09/171,797 US6190921B1 (en) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Ouabain immunoassay and kit and ouabain labeled with 125I or fluorescent label |
| AU61018/98A AU6101898A (en) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Ouabain immunoassay and kit and ouabain labeled with i125 or fluorescent label |
| EP98905437A EP0950188B1 (en) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Ouabain immunoassay and kit and ouabain labeled with i125 or fluorescent label |
| PCT/FI1998/000167 WO1998038511A1 (en) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Ouabain immunoassay and kit and ouabain labeled with i125 or fluorescent label |
| ES98905437T ES2210722T3 (es) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Inmunoensayo y kit de uabaina y uabaina marcada con i125 o con un marcador fluorescente. |
| DE69819682T DE69819682T2 (de) | 1997-02-26 | 1998-02-25 | Mit i125 oder fluoreszierenden markern markiertes ouabain und entsprechende immunoassays |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI970801A FI112117B (fi) | 1997-02-26 | 1997-02-26 | Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa |
| FI970801 | 1997-02-26 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI970801A0 FI970801A0 (fi) | 1997-02-26 |
| FI970801A FI970801A (fi) | 1998-08-27 |
| FI112117B true FI112117B (fi) | 2003-10-31 |
Family
ID=8548282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI970801A FI112117B (fi) | 1997-02-26 | 1997-02-26 | Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6190921B1 (fi) |
| EP (1) | EP0950188B1 (fi) |
| AT (1) | ATE254284T1 (fi) |
| AU (1) | AU6101898A (fi) |
| DE (1) | DE69819682T2 (fi) |
| ES (1) | ES2210722T3 (fi) |
| FI (1) | FI112117B (fi) |
| WO (1) | WO1998038511A1 (fi) |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1063702A (en) * | 1911-11-08 | 1913-06-03 | Millers Falls Co | Chuck. |
| US1866302A (en) * | 1929-02-01 | 1932-07-05 | Gen Zeolite Company | Boiler control apparatus |
| US3959077A (en) * | 1970-12-30 | 1976-05-25 | The University Of Southern California | Enzyme preparation for serum cardiac glycoside assay |
| AU2467477A (en) * | 1976-05-10 | 1978-11-02 | Beckman Instruments Inc | 1125 imidazole steroid derivatives |
| US4517303A (en) | 1982-10-20 | 1985-05-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Specific binding assays utilizing analyte-cytolysin conjugates |
| ZA857256B (en) | 1984-10-25 | 1986-05-28 | Abbott Lab | Fluorescence polarization assay,reagents,and method of making reagents,for determination of digitoxin |
| EP0218010A3 (en) | 1985-07-10 | 1988-01-07 | Abbott Laboratories | Ligand detection method and substituted carboxyfluorescein tracers therefor |
| US4893932A (en) * | 1986-05-02 | 1990-01-16 | Particle Measuring Systems, Inc. | Surface analysis system and method |
| US5705402A (en) * | 1988-11-03 | 1998-01-06 | Igen International, Inc. | Method and apparatus for magnetic microparticulate based luminescence assay including plurality of magnets |
| US5164296A (en) * | 1990-08-31 | 1992-11-17 | University Of Maryland At Baltimore | Assay methods involving ouabain |
| US5206346A (en) | 1990-12-05 | 1993-04-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for iodination/purification |
| US5770376A (en) * | 1992-12-02 | 1998-06-23 | Biomedical Sciences Research Laboratories, Inc. | Method of diagnosing and treating myocardial infarction and hypertension |
-
1997
- 1997-02-26 FI FI970801A patent/FI112117B/fi not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-02-25 AU AU61018/98A patent/AU6101898A/en not_active Abandoned
- 1998-02-25 AT AT98905437T patent/ATE254284T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-25 ES ES98905437T patent/ES2210722T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-25 EP EP98905437A patent/EP0950188B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-25 DE DE69819682T patent/DE69819682T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-25 US US09/171,797 patent/US6190921B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-25 WO PCT/FI1998/000167 patent/WO1998038511A1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0950188B1 (en) | 2003-11-12 |
| FI970801A0 (fi) | 1997-02-26 |
| DE69819682T2 (de) | 2004-09-16 |
| ATE254284T1 (de) | 2003-11-15 |
| EP0950188A1 (en) | 1999-10-20 |
| US6190921B1 (en) | 2001-02-20 |
| AU6101898A (en) | 1998-09-18 |
| FI970801A (fi) | 1998-08-27 |
| WO1998038511A1 (en) | 1998-09-03 |
| DE69819682D1 (de) | 2003-12-18 |
| ES2210722T3 (es) | 2004-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6117644A (en) | Predicting and detecting cardiac allograft rejection | |
| Jensen et al. | A new, fast and reliable radioimmunoassay of brain natriuretic peptide in human plasma. Reference values in healthy subjects and in patients with different diseases | |
| Dockray et al. | Amino terminal gastrin fragment in serum of Zollinger-Ellison syndrome patients | |
| Nussberger et al. | True versus immunoreactive angiotensin II in human plasma. | |
| US5844091A (en) | Antibody having binding specificity for human ouabain | |
| Lawrence et al. | An alternative strategy for the radioimmunoassay of angiotensin peptides using amino-terminal-directed antisera: measurement of eight angiotensin peptides in human plasma | |
| Lindall et al. | Estimation of biologically active intact parathyroid hormone in normal and hyperparathyroid sera by sequential N-terminal immunoextraction and midregion radioimmunoassay | |
| Domin et al. | Characterization of neuromedin U like immunoreactivity in rat, porcine guinea-pig and human tissue extracts using a specific radioimmunoassay | |
| MXPA06014775A (es) | Metodo de diagnostico para trastornos utilizando copeptina. | |
| Inzitari et al. | HPLC‐ESI‐MS analysis of oral human fluids reveals that gingival crevicular fluid is the main source of oral thymosins β4 and β10 | |
| US7977072B2 (en) | Sandwich immunoassay for identifying partial proANP peptides | |
| Hartter et al. | Radioimmunoassay of atrial natriuretic peptides in human plasma. | |
| Hartmann et al. | Rapid quantification of C3a and C5a using a combination of chromatographic and immunoassay procedures | |
| DK2333552T3 (en) | New biomarkers for non-alcoholic fatty liver, and methods for the detection of non-alcoholic fatty liver using a biomarker | |
| Safieh et al. | A new radioimmunoassay for the thymic peptide thymulin, and its application for measuring thymulin in blood samples | |
| Vakkuri et al. | Radioimmunoassay of plasma ouabain in healthy and pregnant individuals | |
| EP0012768A1 (en) | QUANTITATIVE DETERMINATION OF VITAMIN B12. | |
| Thody et al. | A radioimmunoassay for β-melanocyte-stimulating hormone in human plasma | |
| Togashi et al. | Brain natriuretic peptide-like immunoreactivity is present in human plasma | |
| Manning et al. | Development of homologous immunological assays for human parathyroid hormone | |
| FI112117B (fi) | Menetelmä ouabaiinin tai sen analogin mittaamiseksi plasmassa | |
| Ahmed et al. | Identification of dynorphin 1–8 in human placenta by mass spectrometry | |
| Lijnen et al. | Endogenous angiotensin I concentration in human plasma | |
| EP0721105A1 (en) | Sandwich immunoassay for N-peptide | |
| Graf et al. | DSIP occurs in free form in mammalian plasma, human CSF and urine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |