ES2210722T3 - Inmunoensayo y kit de uabaina y uabaina marcada con i125 o con un marcador fluorescente. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE LA UTILIZACION DE UN COMPUESTO REACTIVO EN ANALISIS INMUNOLOGICOS. EL COMPUESTO ES OUABAINA O SU ANALOGO AL CUAL SE ACOPLA OTRO COMPUESTO, MARCADO CON YODO RADIACTIVO O MEDIANTE FLUOROGENO. LA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN AL PROCEDIMIENTO PARA MEDIR OUABAINA O SU ANALOGO EN PLASMA PARA DIAGNOSTICAR ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES Y ENDOCRINAS Y OTRAS CONDICIONES PELIGROSAS.

Description

Inmunoensayo y kit de uabaína y uabaína marcada con I125 o con un marcador fluorescente.

La presente invención trata del uso como marcador de un compuesto reactivo en análisis inmunológicos, compuesto que comprende uabaína o un análogo de la misma unido a un compuesto marcado con radioyodo o con un fluorógeno detectable. La invención también se refiere a los procedimientos mediante los cuales se usan los compuestos reactivos en la medición de las concentraciones de uabaína, isómeros de uabaína, uabagenina o isómeros de uabagenina en los líquidos biológicos, especialmente en el plasma, para el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares y endocrinopatías y otras enfermedades.

La sodio-potasio-adenosina trifosfatasa (Na-K-ATPasa) es un enzima de la membrana celular cuya función principal es transportar el ion sodio al espacio extracelular. Dado que se sabe que los glucósidos cardíacos inhiben la Na-K-ATPasa (Goto y col., Pharmacol. Rev. 44:377-399, 1992), se ha asumido que los compuestos similares a los glucósidos actúan como hormonas natriuréticas fisiológicas. La búsqueda de hormonas natriuréticas ha llevado a la purificación y caracterización química de un glucósido cardíaco, uabaína, en el plasma humano (Hamlyn y col. Hypertension 10, [Suppl I]; I-71 - I-77, 1987; Hamlyn y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6259-6263, 1991; Ludens y col., Hypertension 17: 923-929, 1991). También se ha aislado uabaína o un compuesto con estructura muy similar a uabaína a partir de la corteza suprarrenal (Shaikh y col., J. Biol. Chem. 266: 13672-13678, 1991) y del hipotálamo (Alaghband y col., J. Endocrinol. 98:21-226, 1983) de mamíferos. Se han encontrarlo concentraciones elevadas de uabaína en las glándulas suprarrenales, y la suprarrenalectomía o las modificaciones de la ingesta de electrólitos dan lugar a modificaciones de la concentración plasmática de uabaína (Ludens y col., Hypertension 19:721-724, 1992; Hamilton y col., Current Opinion in Endocrin. and Diabetes 1:123-131, 1994; Laredo y col., Endocrin. 153:794-797, 1994). Sin embargo, los procedimientos de medición que se usan en los estudios arriba mencionados no han sido fiables. La uabaína aislada del plasma de los seres humanos o del hipotálamo bovino puede diferir ligeramente de la uabaína obtenida de plantas, aunque tienen características similares en la cromatografía líquida y en la espectroscopia de masas (Zhao y col., Biochemistry 34: 9893-9896, 1995).

La uabaína obtenida de plantas se ha usado como fármaco denominado estrofantina G para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. Puesto que también hay uabaína en el cuerpo humano, se asumió que la secreción de uabaína podría estar elevada en las enfermedades cardiovasculares, por ejemplo. Ahora está claro que las concentraciones plasmáticas de uabaína son muy bajas y que su medición fiable es problemática. Es posible alcanzar la sensibilidad necesaria con técnicas de análisis radioinmunológico, pero la elevada sensibilidad da lugar a reacciones inespecíficas. El primer radioinmunoensayo de uabaína se publicó en 1986 (Masugi y col., Biochem. Byophys. Res. Commun. 135:41-45, 1986). El procedimiento usó un antisuero policlonal y uabaína tritiada como marcador. Más tarde, varios investigadores han desarrollado un análisis para la medición de uabaína en los líquidos corporales (Hamlyn y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6259-6263; Naruse y col., Hypertension 23, [Suppl I]: I-102 - I-105, 1994; Harris y col., Hypertension 17:936-943, 1991). Sin embargo, las concentraciones plasmáticas de uabaína que se han descrito han variado considerablemente, desde menos de 5 (Lewis y col., Hypertension 24:549-555, 1994) a 440-530 pmol/l (Gottlieb y col., Circulation 86:420-425, 1992; Rossi y col., J. Hypertension 13(10):1181-1191, 1995), cuando las muestras se extraen mediante un sistema de fase sólida. La elevada variabilidad muestra claramente que es necesario un procedimiento de medición de uabaína sensible y fiable para los estudios clínicos y fisiológicos y con fines diagnósticos.

Zhao y col. (Biochemistry 34:9893-9896, 1995) mostraron recientemente que los compuestos similares a uabaína naftoilados aislados del plasma humano o del hipotálamo bovino difieren de la auténtica uabaína en la HPLC de fase inversa. Los compuestos naftoilados tuvieron un espectro CD diferente al de la uabaína auténtica naftoilada. Concluyeron que el compuesto aislado previamente es un nuevo isómero de la uabaína derivada de plantas, en la que hay una unión diferente a los grupos hidroxilo y/o una estereoquímica diferente en la porción de esteroide. Es de notar que el isómero nativo no difiere de la uabaína derivada de plantas en la espectroscopia de masa o en las características cromatográficas e inmunológicas, de donde el inmunoanálisis de uabaína se puede usar para la medición de un compuesto endógeno.

Cuando se aisló uabaína como candidato a hormona natriurética endógena, se midieron las concentraciones plasmáticas de uabaína mediante un procedimiento de ELISA (Hamlyn y col., referencia anterior). Usando este procedimiento se encontró que muestras de plasma humano extraídas con una resina contenían 138 pmol/I de inmunorreactividad de uabaína. Más tarde se han descrito concentraciones plasmáticas de uabaína incluso mayores, pero no se estudió la naturaleza de la inmunorreactividad (Gottlieb y col., Rossi y col., referencias anteriores). El material inmunorreactivo extraído de grandes volúmenes de plasma se comportó de manera idéntica a la uabaína auténtica en dos sistemas diferentes de HPLC de fase inversa (Harris y col., referencia anterior). Sin embargo, otros cuatro estudios posteriores no pudieron confirmar este resultado. No se pudo demostrar la presencia de uabaína cuando se extrajeron las muestras de plasma mediante procedimientos de fase sólida y se midió mediante dos procedimientos diferentes de ELISA con una sensibilidad de 30-60 pmol/I (Gomez-Sanches y col., Am. J. Hypertension 7:647-650, 1994) o mediante un radioinmunoensayo con una sensibilidad de 75 pmol/I (Doris y col., Hypertension 23(5):632-638, 1994). Tampoco los análisis de HPLC con mayores volúmenes plasmáticos pudieron dar datos de la presencia de uabaína en el plasma humano (Lewis y col., Doris y col., véase más arriba). También se han documentado concentraciones plasmáticas de uabaína muy bajas, pero las diluciones seriadas de los extractos de plasma no fueron comparables a las que se obtuvieron con uabaína (Worgall y col., Hypertension 14(5):623-628, 1996), y con análisis de HPLC no se pudieron mostrar cantidades detectables de inmunorreactivüdad cuando la solución de prueba se eluyó con uabaína auténtica (Worgall y col., Gomez-Sanches y col., véase más arriba). Basándose en los hechos presentados más arriba parece claro que la baja sensibilidad de los inmunoensayos que usan uabaína tritiada o los procedimientos de ELISA que se han usado hasta ahora es la principal razón por la que los resultados de los estudios arriba mencionados han llevado la conclusión de que no hay uabaína en el plasma humano.

El documento de Mita Chatterjee y col., Steroids vol. 60 (1995), p. 477-483, describe derivados yodados de uabagenina.

El documento US-A-3, 959,077 describe la antroiluabaína, en la que se puede unir yodo a la aglucona del glucósido mediante esterificación del grupo 3-hidroxi de la aglucona o de otros grupos hidroxi del glucósido.

En Biochemistry vol. 16 (1977), p. 532-540, un compuesto de antraceno está acoplado a la porción de ramnosa de uabaína y el complejo se usa como marcador en el ensayo del enzima Na-K-ATPasa.

El objetivo de la presente invención es conseguir un procedimiento sensible y fiable para medir la uabaína plasmática o su análogo, para ser usado en el inmunoanálisis de uabaína en el diagnóstico de, por ejemplo, enfermedades relacionadas con la insuficiencia cardíaca. El objetivo se ha cumplido de acuerdo con la invención usando antisueros policlonales de alta afinidad y compuestos de uabaína radioyodados o marcados con fluorógeno de alta actividad específica, y separación de fase inversa con resinas C_{18} para conseguir un inmunoanálisis muy sensible, que se pueda usar para las mediciones rutinarias de uabaína endógena o de su análogo.

Las características esenciales de la invención se han presentado en las reivindicaciones de patente adjuntas.

En el curso de la invención se encontró, de manera algo sorprendente, que el uso de radioyodo, especialmente de ^{125}I, o de un fluorógeno, especialmente de un lantánido como europio en lugar de ^{3}H, mejoraba mucho la sensibilidad del radioinmunoensayo de uabaína. También se pueden usar otros isótopos de yodo como ^{131}I, puesto que los isótopos son químicamente similares. El compuesto de uabaína marcado con ^{125}I o con quelato de Eu tuvo una sensibilidad claramente mejor, aproximadamente 100 veces mayor que los procedimientos de ELISA que se usaban previamente o que el radioinmunoensayo que usa marcadores con ^{3}H. Se pudieron usar quelatos de samario o de terbio en lugar del quelato de Eu, puesto que sus residuos de quelato son similares a los del quelato de Eu. El radioinmunoensayo que se presenta en la invención es capaz de detectar concentraciones de uabaína de 0,5 fmol/tubo de ensayo. Los procedimientos más sensibles que se habían descrito previamente detectan 10-20 fmol/tubo de ensayo o pozo (Harris, véase más arriba). El procedimiento que se presenta en la invención combinado con la separación de fase inversa con C_{18} es capaz de detectar una cantidad de uabaína inmunorreactiva tan baja como 10,8 pmol/I en el plasma de seres humanos sanos. La recuperación de la separación de fase sólida es próxima a 100% y las soluciones de los extractos de plasma son comparables a las de la uabaína auténtica en el radioinmunoensayo que se presenta en la invención. Además, la inmunorreactividad de los extractos de plasma eluyó de manera idéntica a la uabaína auténtica en dos sistemas diferentes de HPLC de fase inversa. Esto muestra claramente que uabaína o un compuesto íntimamente relacionado aparece en el plasma humano, pero a concentraciones que están por debajo de los límites de sensibilidad de los inmunoanálisis de uabaína previamente conocidos.

La invención propuesta muestra que, mediante el procedimiento presentado en la invención que usa un análogo de uabaína marcado con yodo radiactivo o con fluorógeno y separación de fase inversa, es posible detectar un compuesto del plasma humano que es inmunológica y cromatográficamente indistinguible de la uabaína auténtica. Las concentraciones de uabaína detectadas mediante el procedimiento que se presenta en la invención son considerablemente menores que las que se obtienen con los procedimientos anteriores. Se pueden medir concentraciones plasmáticas elevadas incluso de una muestra no extraída.

Lo siguiente es una representación de la invención mediante figuras.

En la Figura 1 la unión de diferentes marcadores (^{3}H, ^{125}I y Eu) se expresa como porcentaje de la unión máxima como función de las cantidades de uabaína (picogramos) o del volumen de plasma extraído (microlitros). Se observa que cuando se usa yodo-125 o europio, la sensibilidad es 100 veces mayor que cuando se usa ^{3}H. Las diluciones seriadas de los extractos de plasma humano también desplazan el marcador de la misma manera que uabaína diluida de una manera similar.

La figura 2 representa un análisis de la inmunorreactividad similar a uabaína del plasma humano (A y B) en una HPLC de fase inversa. Se purificaron 6-12 ml de plasma en el sistema de extracción Sep-Pak y el extracto se analizó en una columna Vydac C_{18} usando un gradiente de acetonitrilo desde 0% a 40% en ácido trifluoroacético al 0,1% durante 30 minutos (A) o en una columna Vydac pH stabile C_{8} usando un gradiente de acetonitrilo desde 5% a 50% en NH_{4}HCO_{3} 0,1 M durante 30 minutos (B). La tercera parte del principal compuesto inmunorreactivo de la serie A se transfirió a la columna usada en B. Se recogieron fracciones de 1 ml y se realizó el análisis de la inmunorreactividad similar a uabaína. La flecha señala la elución de uabaína auténtica.

Lo siguiente describe la invención en detalle mediante ejemplos.

Ejemplos 1. Materiales

El octahidrato de uabaína (estrofantina G), la uabagenina, la digoxina, la digitoxina y los esteroides relacionados (aldosterona, cortisona, hidrocortisona, progesterona, betaestradiol y testosterona), la tiroglobulina bovina, la poli-L-lisina y el cianoborohidruro de sodio se obtuvieron de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, EEUU). Se compró el adyuvante completo e incompleto de Freund a Difco Laboratories (Detroit, MI, EEUU), la L-tirosina y el polietilenglicol 6000 a Fluka AG (Buchs, Suiza), la ^{3}H-uabaína (21,22^{3}H-uabaína) y el Na^{125}I (IMS 300) a Amersham International plc (Buckinghamshire, Reino Unido), el quelato de Eu a Wallac (Turku, Finlandia) y el Stephadex G 50F a Pharmacia (Uppsala, Suecia). Todas las demás sustancias químicas se obtuvieron de E. Merck AG (Darmstadt, Alemania).

2. Preparación del antígeno de uabaína y de los antisueros frente a uabaína

Se acopló uabaína a la 1iroglobulina bovina usando el método de Masugi y col. (Biochem. Biophysics Res. Com. 135:41-45, 1986). El conjugado uabaína-tiroglobulina se purificó mediante filtración en gel (Sephadex G-50F en NaCl al 0,9%). El conjugado se emulsionó en el adyuvante completo de Freund y se inyectó por vía subcutánea a cinco conejos (1 mg/conejo). Se dieron inyecciones de refuerzo (0,5 mg/conejo en adyuvante incompleto de Freund) a intervalos mensuales.

3. Preparación del marcador de uabaína radioyodada

De acuerdo con la invención, uabaína se acopló a la L-tirosina mediante el procedimiento que se ha usado previamente para acoplar una proteína (albúmina, tiroglobulina) a uabaína. Uabaína (3,1 mg) reaccionó con NaIO_{4} en agua destilada (0,1 ml). Se añadió etanol a la solución y se ajustó el pH a 8 con NaOH. Se añadió L-tirosina (0,8 mg en 0,4 mg de fosfato sódico 0,5 M, pH 9) en gotas y se incubó durante 2 horas. Se añadió cianoborohidruro de sodio (0,25 mg en 0,2 ml de agua destilada) y la mezcla de la reacción se purificó mediante HPLC de fase inversa (columna Vydac C_{18} en ácido trifluoroacético al 0,5% usando un gradiente de metanol de 1%/min). Se estudiaron los picos UV (220 nm) obtenidos en la HPLC en busca de su inmunorreactividad y el pico que eluía a los 23,7 minutos era el análogo de uabaína tirosilado, porque se podía yodar y por lo tanto era inmunorreactiva. El compuesto tirosilado (1 \mug) fue radioyodado con Na^{125}I usando Chlroamine-T (5 \mug). Después de 30 segundos se interrumpió la reacción con metabisulfito sódico y se purificó el marcador mediante HPLC de fase inversa usando un gradiente de acetonitrilo de 12%-60% en ácido trifluoroacético al 0,1%. El marcador radioyodado se eluyó a los 22 minutos.

4. Preparación del marcador de uabaína fluorógeno

De manera análoga, según el Ejemplo 3, uabaína se acopló en primer lugar a poli-L-lisina mediante cianoborohidruro de sodio: después de hacer reaccionar uabaína (2,9 mg) con NaIO_{4} durante una noche a +4ºC en agua destilada (0,7 ml), se añadieron 0,7 ml de etanol y se ajustó el pH de la solución a 8 con NaOH. Posteriormente se añadió poli-L-lisina (0,5 mg en 0,1 mI de tampón de fosfato 0,05 M, pH 9) a la solución de la reacción y después de 2 horas se añadió cianoborohidruro sódico (0,25 mg en 0,1 ml de agua destilada). La mezcla de la reacción se fraccionó mediante HPLC de fase inversa (columna Vydac C_{18} en ácido trifluoroacético al 0,5%) usando un gradiente de metanol (desde 5% a 35%/min). Se analizó la inmunorreactividad de las fracciones en relación con la absorción UV (220 nm) en un RIA de uabaína ^{125}I. El pico que tenía la máxima inmunorreactividad (y al mismo tiempo la máxima UV) obtenido en la HPLC antes mencionada (fracción número 26) era uabaína-poli-L-lisina, que se eligió para su marcado con Eu^{3+}. Se hizo reaccionar esta cantidad de la fracción (alrededor de 12 \mug en 0,25 ml de NaHCO_{3} 0,1 M, pH 9) con el quelato de Eu (0,1 mg en 0,25 ml de NaHCO3 0,1 M, pH 9) durante una noche a +4ºC. La solución de la reacción se fraccionó mediante HPLC de fase inversa (columna Vydac C_{8} pH stabile en NH_{4}HCO_{3} 0,05 M a pH 7,8 usando un gradiente de metanol desde 5% a 35%). Se estudió la inmunorreactividad de uabaína de las fracciones fluorógenas. En el FIA (fluoroinmunoensayo) la fracción que eluía a los 20 minutos dio un título y una sensibilidad que eran comparables a los de la curva de desplazamiento del RIA (véase Figura 1). Como muestra la figura, la sensibilidad fue alrededor de 100 veces mayor que la curva que establecía el marcador ^{3}H.

5. Radioinmunoensayos

Los cinco conejos produjeron antisuero frente a uabaína conjugada con tiroglobulina después de la inmunización primaria. Después de tres inyecciones de refuerzo, los títulos que daban una unión de 30% estaban entre 1:3000 y 1:7000 usando el marcador de uabaína ^{3}H y entre 1:300.000 y 1:1.000.000 usando el marcador ^{125}I uabaína.

Los patrones de uabaína y las muestras que se usaron en los ensayos se pipetearon en duplicados de muestras de 0,1 ml. Se añadieron juntos el antisuero ("199", dilución final 1:1.000.000) y el marcador de uabaína (marcado con Eu, ^{125}I o ^{3}H) en 100 ml. Después de incubarlo durante una noche se separaron las fracciones unida y libre mediante doble precipitación con anticuerpos en presencia de polietilenglicol al 8%, y se hizo un contaje de la radiactividad de los precipitados. Cuando se utilizó ^{3}H-uabaína como marcador, los precipitados se disolvieron en el líquido de centelleo antes de hacer el contaje en un contador beta.

La sensibilidad del radioinmunoensayo de uabaína con todos los antisueros estuvo por debajo de 1 pg/tubo de ensayo y el desplazamiento de 50% tuvo lugar a 2-10 \mug/tubo de ensayo cuando se usaba como marcador un análogo de uabaína marcado con Eu o con radioyodo. El antisuero codificado con "199" se seleccionó para su uso posterior. La sensibilidad fue más de 100 veces mayor usando el marcador radioyodado en comparación con el marcador ^{3}H (0,3 y 32 pg/tubo o 0,5 y 57 fmol/tubo, respectivamente, véase la Figura 1). Los coeficientes de variación intra e interensayo fueron 3,8% y 3,7% a 10,8 pg/tubo y 22,2% y 9,1% a 49,2 pg/tubo, respectivamente (n = 12).

El antisuero "199" detectó específicamente el residuo de uabaína. De los compuestos que se estudiaron, uabagenina mostró la máxima reactividad cruzada, 52%, como cabría esperar considerando el procedimiento de conjugación. Digoxina y digitoxina dieron una ligera reacción cruzada (menor de 1,7%), mientras que no se vio ninguna reactividad cruzada detectable (por debajo de 0,001%) con los esteroides que aparecen de forma natural como aldosterona, progesterona, testosterona o betaestradiol.

6. Separación en fase sólida de las muestras de plasma

Uabaína se extrajo de muestras de plasma de 1-2 ml con cartuchos Sep Pak^{R} Vac 500 mg C_{18} (Waters, Milford, Ma, EEUU) usando un sistema automatizado Gilsopn 5100 Aspec. Los cartuchos se preacondicionaron con 2 ml de 2-propanol y 4 ml de ácido trifluoroacético (TFA) acuoso al 0,1%, y posteriormente se cargaron con la muestra de plasma, a la cual se añadieron 0,2 ml de HCl 1 M y 1,6% de glicina por ml. Posteriormente se lavó el cartucho con ácido trifluoroacético al 0,1% (2 ml). Se eluyó la uabaína del cartucho con 2 ml de acetonitrilo al 40% en TFA al 0,1%. Los eluatos se evaporaron y se disolvieron en 0,25 ml del tampón usado en el RIA de uabaína.

7. Análisis mediante HPLC de los extractos de plasma

Los extractos de plasma SepPak (véase más arriba) se disolvieron en ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%, se centrifugaron, se filtraron y se sometieron a HPLC de fase inversa usando una columna Vydac C_{18} 218TP (0,46 x 15 cm, Hesperia, CA, EEUU). Se llevó a cabo un gradiente lineal de 30 minutos desde 0% hasta 30% de acetonitrilo en TFA al 0,1% con una tasa de flujo de 1 ml/min. Se recogieron fracciones de 1 ml y se secaron en Speed Vac, se reconstituyeron con 250-500 \mul de tampón de RIA y se sometieron al radioinmunoensayo de uabaína. Se volvió a analizar la tercera parte del principal pico inmunorreactivo de la cromatografía en una columna Vydac C_{8} pH stabile (228TP, 0,46 x 25 cm) eluida con un gradiente lineal de 30 minutos desde 5% a 50% de acetonitrilo en NH_{4}HCO_{3} 0,1 M. La tasa de flujo fue 1 ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml. Las series testigo con tampón acuoso puro como muestra no mostraron ninguna inmunorreactividad de uabaína. Se realizaron análisis de recuperación (Sep-Pak) y de calibración (HPLC) añadiendo uabaína (50 o 100 pg) a extractos de plasma humano antes de la cromatografía. Los análisis de HPLC se repitieron tres veces.

8. Validación del radioinmunoensayo para su uso con muestras de plasma humano

Se usó la extracción de fase inversa con cartuchos C_{18} para concentrar y purificar la uabaína en las muestras de plasma. La recuperación de extracción de uabaína añadida a 1 ml de plasma humano fue 102,8 \pm 2,5% a 25 pg y 93,6 \pm 1,3% a 75 pg (media \pm ETM, n = 5). La inmunorreactividad endógena de los extractos de plasma se diluyó en paralelo al estándar de uabaína (Figura 1) y se eluyó de manera idéntica a la uabaína auténtica en dos sistemas de HPLC de fase inversa con diferentes selectividades (Figura 2). La recuperación de la HPLC de la uabaína añadida al extracto de plasma fue 89,6%.

9. Muestras de pacientes

Se tomaron en tubos de EDTA muestras de sangre de 20 mujeres gestantes en los trimestres 2º y 3º y de 31 pacientes hipertensos (varones y mujeres de 45-82 años) tratados con un betabloqueante, inhibidor del ECA, diurético y/o nitroprusiato. Se separó el plasma y se almacenó a -20ºC. Se recogieron muestras de sangre de 22 trabajadores de laboratorio (varones y mujeres de 25-56 años) para usarlos como controles normales. Todas las muestras se recogieron a las 9-12 de la mañana.

10. Uabaína inmunorreactiva en el plasma humano

La concentración plasmática de uabaína en mujeres sanas de 22-45 años fue 10,3 \pm 1,6 pmol/I (media \pm ETM;, n = 10) y en varones de 23-56 años fue 11,4 \pm 1,2 pmol/I (n = 12). La concentración plasmática media de uabaína en pacientes gestantes (trimestres 2º y 3º) fue 21,6 \pm 1,1 pmol/I (n = 20), es decir, significativamente mayor que en mujeres no gestantes. Los pacientes hipertensos tuvieron generalmente concentraciones de uabaína menores, 7,3 \pm 2,1 pmol/I (n = 31) que los controles, pero en dos pacientes las concentraciones plasmáticas fueron claramente mayores, 61 y 34 pmol/l. Estos pacientes tuvieron también concentraciones plasmáticas elevadas de BNP y del fragmento N-terminal de proANP, y evidentemente mostraron un aumento del volumen cardíaco y de la distensibilidad cardíaca. Puesto que en la muestra había otros tres pacientes hipertensos con elevación de las concentraciones de ANP, NT-proANP y/o BNP pero con una concentración normal de uabaína, esta observación se refiere a al hecho de que los pacientes con una concentración elevada de inmunorreactividad a uabaína en el plasma pueden tener una hipertensión de un nuevo tipo.

Recientemente se han publicado resultados de concentraciones muy elevadas de uabaína inmunorreactiva en el plasma de un paciente que tenía un cáncer microcítico de pulmón, síndrome de secreción ectópica de ACTH y tensión arterial elevada. La tensión arterial del paciente se correlacionó con la uabaína inmunorreactiva del plasma, lo que muestra que el compuesto de uabaína puede producir elevación de la tensión arterial (Goto y col., Hypertension 28:421-425. 1996). Durante la gestación, los niveles de inmunorreactividad de uabaína fueron el doble de los normales. Esto puede estar producido por un aumento del volumen plasmático durante la gestación. Este resultado podría relacionarse con las investigaciones previas en las que se detectó un aumento de la bioactividad de la Na-K-ATPasa durante la gestación (Graves, Hypertension 10:84-86, 1987).

Claims (7)

1. Un complejo inmunológicamente reactivo de tres miembros, uabaína, un compuesto acoplado a uabaína y un elemento unido a dicho compuesto, para ser usado como marcador en inmunoensayos de uabaína, caracterizado porque

a)

dicho compuesto es tirosina y dicho elemento es yodo radiactivo ^{125}I, o

b)

dicho compuesto es poli-L-lisina y dicho elemento es un lantánido fluorógeno.

2. Un complejo inmunológicamente reactivo de la reivindicación 1, caracterizado porque el lantánido fluorógeno se selecciona del grupo formado por europio, terbio y samario.

3. Un procedimiento de inmunoensayo, caracterizado porque en el procedimiento se usa el marcador de la reivindicación 1 para la determinación de uabaína en extractos de fase sólida de plasma para diagnosticar enfermedades cardiovasculares, endocrinopatías u otras enfermedades.

4. Un procedimiento de inmunoensayo de la reivindicación 3, caracterizado por las siguientes etapas:

a)

se separa el plasma de una muestra de sangre obtenida de un paciente,

b)

se concentra uabaína a partir de la muestra de plasma,

c)

un anticuerpo específico frente a uabaína se usa junto con el marcador de la reivindicación 1 y las muestras de plasma concentrado o cantidades conocidas de uabaína, se elimina el marcador no unido y se mide la concentración de marcador unido, y

d)

la muestra de uabaína de la etapa c) se compara con el patrón para determinar la concentración de uabaína en el plasma del paciente.

5. Un procedimiento de inrnunoensayos de la reivindicación 3, caracterizado porque la reactividad cruzada con los esteroides que aparecen de manera natural en el plasma humano es menor de 0,001%.

6. Un kit para determinar uabaína en el plasma, caracterizado porque comprende:

a)

un anticuerpo policlonal específico de uabaína, y

b)

un complejo inmunológicamente reactivo de tres miembros, uabaína, un compuesto acoplado a uabaína y un elemento unido a dicho compuesto, en el que dicho compuesto es tirosina y dicho elemento es yodo radiactivo ^{125}I, o dicho compuesto es poli-L-lisina y dicho elemento es un lantánido fluorógeno.

7. Un kit de la reivindicación 6, caracterizado porque el lantánido fluorógeno se selecciona del grupo formado por europio, terbio y samario.