CN112945923B - 一种界面增敏型检测试剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种界面增敏型检测试剂及其制备方法和应用，该界面增敏型检测试剂包括载有第二抗体的荧光传感器、乙酰胆碱酯酶标抗原、酶的底物和第一抗体，所述荧光传感器以UCNPs作为能量供体、FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer，异硫氰酸荧光素)作为能量受体，能量供体和能量受体之间通过共价键结合。本发明克服了现有的增敏策略存在的增敏效果不佳、检测目标单一、稳定性差、检测效果不佳等缺陷，将荧光传感器和酶联反应相结合，不仅实现多种目标物的高灵敏检测，而且稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及荧光传感器领域，更具体地，涉及一种界面增敏型检测试剂及其制备方法和应用。
背景技术
作为一种新兴的传感技术，荧光共振能量转移(FRET)被广泛应用于医学成像、生物传感、生物分析等领域，但是能量转移效率低是FRET普遍存在的现象，导致基于FRET的荧光传感器的灵敏度不高。因此，需要采取一系列措施来提高FRET的能量转移效率，增强基于FRET的荧光传感器的灵敏度。目前，现有的荧光传感器增敏策略主要包括：重金属靶调增敏、染料靶调增敏、纳米材料增敏和DNA增敏四种策略。
但是上述的四种荧光传感器增敏策略都存在缺陷，如：重金属靶调增敏策略的荧光传感器检测的目标物单一，只能用于检测重金属离子和生物硫醇；染料增敏策略中染料分子与上转换纳米粒子(UCNPs)的结合不稳定、有机染料的光稳定性差、有机染料的自我淬灭会影响染料增敏后UCNPs的光吸收；常见的纳米材料增敏使用金纳米粒子(AuNPs)和氧化石墨烯(GO)，AuNPs由于其紫外吸收峰范围有限、荧光淬灭效率低导致基于AuNPs的传感器无法被用于检测核酸、蛋白质和小分子，GO较大的粒径可以获得较高的荧光猝灭效率，但是其相对较大的尺寸会引入空间位阻，从而阻碍其检测性能以及传感设计的灵活性；DNA增敏策略中复杂的DNA结构会产生空间位阻，不利于传感器对目标物的检测。
发明内容
基于现有技术中存在的上述技术问题，本发明的目的之一在于提供一种界面增敏型检测试剂，该界面增敏型检测试剂将荧光传感器和酶联催化反应进行结合，不仅使荧光传感器具有较高的灵敏度，还克服了现有的荧光传感器增敏策略存在的增敏效果不佳、检测目标物单一、稳定性差、检测效果不佳等缺陷。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种界面增敏型检测试剂，包括载有第二抗体的荧光传感器、酶标抗原、酶的底物和第一抗体，所述荧光传感器以UCNPs作为能量供体、异硫氰酸荧光素(FITC)作为能量受体，能量供体和能量受体之间通过共价键结合；所述酶和酶的底物分别为乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱。
在一些实施方式中，所述UCNPs为NaYF4:Yb3+,Tm3+。
本发明的目的之二在于提供上述任一实施方式的界面增敏型检测试剂的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
S1、制备载有第二抗体的荧光传感器；
S2、制备酶标抗原；
S3、将载有第二抗体的荧光传感器与酶的底物溶液混合，然后加入酶标抗原溶液和第一抗体，即制成所述界面增敏型检测试剂。
在一些实施方式中，所述载有第二抗体的荧光传感器的制备包括以下步骤：
S11、制备油酸修饰的UCNPs；
S12、通过配体交换法制备水溶性UCNPs；
S13、制备以UCNPs为能量供体、异硫氰酸荧光素为能量受体的荧光传感器；
S14、制备载有第二抗体的荧光传感器。
在一些实施方式中，步骤S11中，具体为：将YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O、OA(油酸)、1-ODE(1-十八烯)加入到反应容器中，在氮气保护下升温至150℃，抽真空除去反应溶液中的水分，继续升温至160℃并恒温反应直至溶液澄清透明，降温至室温；将NaOH、NH4F(氟化铵)溶解在甲醇溶液中配制A溶液，室温下将A溶液滴入所述反应容器中混合均匀，升温至100℃除去多余的甲醇气体，再升温至300℃反应，反应完成后冷却至室温，将乙醇溶液和环己烷溶液混合加入反应液中，离心得到油酸修饰的UCNPs。
在一些实施方式中，步骤S12中，具体为：将所述油酸修饰的UCNPs分散在氯仿溶液中，然后将PAA(聚丙烯酸)分散在乙醇溶液中，最后，将含有油酸修饰的UCNPs的氯仿溶液滴加到PAA分散的乙醇溶液中，避光反应得到PAA修饰的UCNPS；将所述PAA修饰的UCNPs分散在超纯水中，将PAH(聚(烯丙胺盐酸盐))溶解在乙醇溶液中，在超声条件下将PAA修饰的UCNPs溶液滴加入含PAH的乙醇溶液中进行反应，得到水溶性UCNPs。
在一些实施方式中，步骤S13中，具体为：将所述PAH修饰的UCNPs分散在超纯水中，将FITC溶解在无水乙醇溶液中，将FITC乙醇溶液加入PAH修饰的UCNPs溶液中，室温下避光进行反应，得到所述荧光传感器。
在一些实施方式中，步骤S14中，具体为：将所述荧光传感器分散在PBS溶液中，将第二抗体分散在抗体稀释液中，将含有所述荧光传感器的PBS溶液加入含有第二抗体的抗体稀释液中，之后加入EDC溶液和NHS溶液，室温下反应得到载有第二抗体的荧光传感器。
本发明的目的之三在于提供上述任一实施方式的界面增敏型检测试剂或任一实施方式的制备方法制成的界面增敏型检测试剂在检测黄曲霉毒素的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明将荧光传感器和酶联催化反应相结合，在界面增敏型检测试剂中引入以UCNPs作为能量供体、FITC作为能量受体的荧光传感器。首先，FITC和第二抗体预先与UCNPs结合形成功能性UCNPs，此时功能性UCNPs已预先形成荧光共振能量转移(FRET)体系，能量受体FITC已接收到能量供体UCNPs的能量，此时荧光淬灭。如图1A，当体系中不含有目标物的情况下，乙酰胆碱酯酶标抗原通过免疫识别作用特异性地结合在功能性UCNPs界面形成组装体。乙酰胆碱酯酶在UCNPs界面通过乙酰胆碱产生乙酸降低UCNPs界面微环境的pH值，降低其界面上修饰的异硫氰酸荧光素的紫外吸收峰强度，进而破坏了功能化UCNPs上原有的FRET体系，导致UCNPs的荧光恢复(如图1B)。反之，当体系中加入目标物，目标物分子和乙酰胆碱酯酶标抗原竞争性的与功能性UCNPs结合，阻止乙酰胆碱酯酶标抗原结合于功能性UCNPs界面，功能性UCNPs仍然维持原有的FRET体系。通过少量的目标物可以调控乙酰胆碱酯酶酶结合于功能化UCNPs界面，利用乙酰胆碱酯酶界面微环境的pH值，可以破坏大量酶周边的大部分FRET体系，从而放大FRET的调控过程，实现荧光传感器的增敏策略，以实现对目标物的高灵敏度检测。
本发明克服了重金属靶调增敏策略存在的目标物单一的缺陷，选择抗原抗体作为生物识别单元，可通过改变抗原抗体的类型实现多种目标物的高灵敏检测；克服了染料靶调策略中染料和UCNPs结合不稳定的缺陷，酶标抗原中的酶通过抗原抗体特异性结合在能量供体UCNPs界面，能量供体UCNPs和能量受体FITC之间通过共价键结合，荧光传感器具有较好的稳定性；克服纳米材料AuNPs作为能量受体时能量转移效果不明显以及纳米材料GO(graphene oxide)作为能量受体时因空间位阻导致传感器检测效果不佳的缺陷，本发明的界面增敏型检测试剂将荧光传感器结合酶联催化反应改变荧光传感器界面微环境，将信号放大以达到增敏的效果，FITC和UCNPs之间具有较好的光谱重合，可进一步提高传感器的灵敏度。
以乙酰胆碱酯酶(AChE)作为标记酶，因能量供体UCNPs、能量受体FITC和AChE具有较小的粒径，可以避免由空间位阻导致的传感器检测效果不佳的问题，克服DNA增敏策略中复杂的DNA结构带来空间位阻的缺陷，AChE催化ACh改变传感器界面微环境，将传感器信号进行放大达到提高检测灵敏度的效果，可以避免因结构复杂而引入空间位阻，导致传感器检测效果不佳的问题。
本发明的界面增敏型检测试剂，可检测溶液中痕量的黄曲霉毒素B1(AFB1)，具有良好的检测效果和较高的灵敏度，对黄曲霉毒素B1的检测限可达0.035nM。
附图说明
图1本发明的界面增敏型检测试剂的检测原理图；
图2为不同pH缓冲液中FITC的紫外吸收光谱以及UCNPs的荧光光谱图；
图3本发明的界面增敏型检测试剂检测黄曲霉毒素B1的标准曲线。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
FITC荧光光谱表征
将FITC分散在pH为3，4，5，6，7，8的磷酸缓冲液中，不同pH的缓冲液中FITC的浓度一致，测定不同pH缓冲液中FITC的紫外光谱，同时测定了UCNPs(本实施例中的UCNPs为NaYF4:Yb3+,Tm3+)的荧光光谱，测定结果如图2所示。
实施例1
1、功能化UCNPs的制备
(1)油溶性UCNPs的制备
准确称量YCl3·6H2O(0.4550g)、YbCl3·6H2O(0.19145g)、TmCl3·6H2O(0.0023g)、OA(6mL)、1-ODE(15mL)加入到100mL三颈烧瓶中并在室温下高速(1500r/min)搅拌20min。在氮气保护下缓慢升温至150℃，抽真空除去反应溶液中的水分。升温至160℃并恒温高速搅拌30min直至形成澄清透明的溶液，停止加热并降温至25℃。将NaOH(0.20g)、NH4F(0.29632g)充分溶解在20mL的甲醇溶液中形成A液。室温下将A液逐滴加入三颈烧瓶中，高速搅拌30min。将反应溶液升温至100℃，恒温搅拌30min除去多余的甲醇气体，之后升温至300℃恒温高速搅拌60min。停止加热并将反应溶液冷却至室温，将乙醇溶液和环己烷溶液以1：1的比例混合加入反应液中，经过高速离心将合成的油酸修饰的UCNPs沉淀下来，并用环己烷清洗三次，最后将材料分散在环己烷中。
(2)水溶性UCNPs的制备
将油酸修饰的UCNPs分散在10mL的氯仿溶液中，浓度为50mg/mL。然后将PAA分散在乙醇溶液中，浓度为300mg/mL。最后，将含有油溶性的UCNPs的氯仿溶液逐滴加入到PAA分散的乙醇溶液中。室温下避光搅拌24h得到PAA修饰的UCNPs。PAA修饰的UCNPs用乙醇和超纯水交叉清洗3遍后分散在超纯水中待用；
将PAA修饰的UCNPs分散在超纯水中，浓度为0.5mg/mL。将PAH溶解在1mL乙醇溶液中，浓度为1mg/mL。在超声条件下将PAA修饰的UCNPs逐滴加入PAH溶液中，室温下搅拌4h。离心除去多余的PAH，将PAH修饰的UCNPs用超纯水清洗3次后分散在超纯水中待用。
(3)功能化UCNPs的制备
将PAH修饰的UCNPs分散在超纯水中，浓度定为1mg/mL。将FITC溶解在无水乙醇溶液中，浓度为1mg/mL。取1mL FITC加入PAH修饰的UCNPs溶液中，室温下在摇床上避光反应24h。离心清洗材料，除去多余未反应的FITC，得到UCNPs@FITC荧光传感器，将UCNPs@FITC分散在超纯水中；
将UCNPs@FITC分散在PBS溶液(1mM，pH 7.4)溶液中，浓度为2mg/mL。将羊抗鼠IGg(Secondary antibody，Ab2)分散在抗体稀释液中，浓度为0.1mg/mL。将含有UCNPs@FITC的PBS溶液逐滴加入Ab2溶液中，之后加入500μL的EDC(0.2mg/mL)溶液和250μL NHS溶液(0.2mg/mL)。室温下在摇床上反应2h得到Ab2修饰的UCNPs(UCNPs@Ab2，载有Ab2的荧光传感器)，离心去除多余的EDC和NHS，UCNPs@Ab2用PBS溶液(1mM，pH7.4)清洗2次后分散在PBS溶液中待用。
2、乙酰胆碱酯酶标记的抗原的制备
将乙酰胆碱酯酶(AChE)溶解在PBS(1mM，pH 6.8)溶液中，浓度为1mg/mL。用稀释液将AFB1半抗原稀释至0.01mg/mL。将1mL AFB1半抗原(0.01mg/mL)以及50μL戊二醛溶液(25％)加入AChE溶液中，室温下在摇床上反应2h。之后在4℃环境下经过透析除去多余的戊二醛，得到AChE标记的AFB1半抗原，亦可称为酶标抗原。
3、检测黄曲霉毒素B1
取490μL UCNPs@Ab2(1mg/mL)加入含有乙酰胆碱溶液的离心管中，之后加入490μL的酶标抗原溶液、10μL的AFB1抗体(1mg/mL)以及10μL不同浓度的AFB1标准溶液，室温下在摇床上避光反应8min。之后检测加入不同浓度AFB1标准溶液的检测体系的荧光强度。
如图3所示，以黄曲霉毒素B1的浓度为横坐标，传感器荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，结果表明二者间呈完美的线性关系，其线性方程式为：y＝-1.134ln(x)+2.6088，相关系数为0.9864。
4、确定界面增敏型检测试剂检测黄曲霉毒素B1的最佳检测条件
在酶催化底物的不同反应温度、不同反应时间以及不同浓度FITC下对黄曲霉毒素B1进行检测，确定对黄曲霉毒素B1的最佳检测条件为：
FITC的浓度为40μg/mL、AChE催化ACh的反应温度为35℃、反应时间为8min。在最佳检测条件下，界面增敏型检测试剂对黄曲霉毒素B1的检测限为0.035nM。
需要说明的是，本申请可根据实际目标物选择不同的抗原抗体进行特异性识别，以实现对不同目标物的检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种界面增敏型检测试剂，其特征在于，包括载有第二抗体的荧光传感器、酶标抗原、酶的底物和第一抗体，所述荧光传感器以UCNPs作为能量供体、异硫氰酸荧光素作为能量受体，能量供体和能量受体之间通过共价键结合；酶和酶的底物分别为乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱；UCNPs的发射波长为450～500nm。
2.根据权利要求1所述的界面增敏型检测试剂，其特征在于，所述 UCNPs为NaYF4:Yb 3+ ,Tm3+。
3.权利要求1或2所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备载有第二抗体的荧光传感器；S2、制备酶标抗原；S3、将载有第二抗体的荧光传感器与酶的底物溶液混合，然后加入酶标抗原溶液和第一抗体，即制成所述界面增敏型检测试剂。
4.根据权利要求3所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，所述载有第二抗体的荧光传感器的制备包括以下步骤：
S11、制备油酸修饰的UCNPs；
S12、通过配体交换法制备水溶性UCNPs；
S13、制备以UCNPs为能量供体、异硫氰酸荧光素为能量受体的荧光传感器；
S14、制备载有第二抗体的荧光传感器。
5.根据权利要求4所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤S11中，具体为：将YCl3·6H2O、YbCl3·6H2O、TmCl3·6H2O、 OA、1-ODE加入到反应容器中，在氮气保护下升温至150℃，抽真空除去反应溶液中的水分，继续升温至160℃并恒温反应直至溶液澄清透明，降温至室温；将NaOH、NH4F溶解在甲醇溶液中配制A溶液，室温下将A溶液滴入所述反应容器中混合均匀，升温至100℃除去多余的甲醇气体，再升温至300℃反应，反应完成后冷却至室温，将乙醇溶液和环己烷溶液混合加入反应液中，离心得到油酸修饰的 UCNPs。
6.根据权利要求4所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤S12中，具体为：将所述油酸修饰的UCNPs分散在氯仿 溶液中，然后将PAA分散在乙醇溶液中，最后，将含有油酸修饰的 UCNPs的氯仿溶液滴加到PAA分散的乙醇溶液中，避光反应得到 PAA修饰的UCNPS；将所述PAA修饰的UCNPs分散在超纯水中，将PAH溶解在乙醇溶液中，在超声条件下将PAA修饰的UCNPs溶液滴加入含PAH的乙醇溶液中进行反应，得到水溶性UCNPs。
7.根据权利要求4所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤S13中，具体为：将PAH修饰的UCNPs分散在超纯水 中，将FITC溶解在无水乙醇溶液中，将FITC乙醇溶液加入PAH修饰的UCNPs溶液中，室温下避光进行反应，得到所述荧光传感器。
8.根据权利要求4所述的界面增敏型检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤S14中，具体为：将所述荧光传感器分散在PBS溶液中， 将第二抗体分散在抗体稀释液中，将含有所述荧光传感器的PBS溶液滴加入含有第二抗体的抗体稀释液中，之后加入EDC溶液和NHS溶液，室温下反应得到载有第二抗体的荧光传感器。
9.权利要求1或2所述的界面增敏型检测试剂或者权利要求3-8任一项所述的制备方法制得的界面增敏型检测试剂在检测黄曲霉素的 应用。
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