CN104826137B - 组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法及其活体应用 - Google Patents
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Abstract
组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法及其活体应用，其特征在于：通过组氨酸多肽对上转换纳米颗粒的相转移反应，获得均一、稳定、并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，再用蛋白酶对荧光标记的组氨酸多肽上转换纳米颗粒进行酶切反应，用所得的上转换纳米颗粒荧光恢复作为信号，进行活体显影成像，根据显影的强弱来反映蛋白酶活性浓度的变化。本发明相转移的方法非常简单，能够一步制备出高稳定性、均一、单分散、转化效率接近100%的水溶性并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，同时，本发明在蛋白酶活体成像上的应用能够反映蛋白酶活性浓度的变化，对蛋白酶活性检测的灵敏度高，并且具有普遍适用性。
Description
技术领域
本发明涉及功能纳米材料和生物化学领域，具体涉及组氨酸多肽对上转换纳米颗粒进行相转移以及蛋白酶活体成像，本发明通过组氨酸多肽对上转换纳米颗粒的相转移反应，获得均一、稳定、并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，再用蛋白酶对荧光标记的组氨酸多肽上转换纳米颗粒进行酶切反应，用所得的上转换纳米颗粒的荧光恢复作为信号，进行活体显影成像，根据显影的强弱来反映蛋白酶活性浓度的变化。
背景技术
上转换纳米颗粒在近红外（980 nm或808 nm）被激发，发射出可调节的可见光（根据掺杂元素的不同，上转换纳米颗粒发射波长范围是可调的）。相比于传统的下转换材料比如量子点、荧光染料，上转换具有多色可调性、没有光漂白、深层成像、优异的信噪比、低毒性这些优势使它在应用过程中避免了生物体的自体荧光的干扰。从而能够被广泛的应用在生物成像、药物释放、细胞成像、酶检测、肿瘤靶向等生物纳米医学领域。然而制备水溶性、单分散、稳定、具有生物活性的上转换纳米颗粒仍然是具有挑战的。为了克服这个问题，科学家们想了很多办法来解决，比如说：一步热溶剂合成、配体交个、配体加成、硅壳、配体氧化等等。但是这些方法都有一个缺点--转化效率低下，并且需要进一步反应来链接生物分子使上转换纳米颗粒具有生物活性。日前有报道说：DNA修饰的上转换纳米颗粒，利用DNA中的磷酸基团与稀土元素耦合从而取代油相配体，但是DNA修饰的上转换颗粒容易积聚，修饰上DNA的上转换纳米颗粒转需要过0.22μm 的微孔滤膜，滤去大的沉淀颗粒。这样上转换纳米颗粒转相的效率就下降了，从而荧光强度就下降，在生物体内的应用范围就受到了一定的限制。因此，如何制备一种高效的、高稳定、均匀分散并具有生物活性的水溶性上转换纳米颗粒成为本发明研究的课题之一。
蛋白酶对蛋白质和多肽底物的特异性催化水解反应，对于生物体的正常生命活动发挥着极其重要的作用。检测酶含量及存在，很难直接用酶的量（例如质量、体积、浓度）来表示，而常用酶催化某一特定化学反应的能力来表示酶量，即用酶活性来表示。研究表明，蛋白酶活性的失调能够引起疾病，如癌症，炎症、退化性疾病等，这已经引起了科学家的广泛关注，因此在研究中需要检测蛋白酶的活性，检测蛋白酶的活性在蛋白酶活性相关疾病的医学诊断和工业生产方面都具有十分重要的意义。传统的酶活性检测方法，如免疫荧光吸附方法(简称ELISA)，Tothill提出免疫荧光吸附方法；Lamore S. D.提出虽然质谱和凝胶电泳方法；Lee J. S.等的研究表明荧光共振能量转移方法，虽然都可以检测蛋白酶活性，但是仅仅只是应用于体外，对于活体内部仍然没有一个可行的方案。因此，如何设计一种高效的、方便快捷、成本低的新型活体内蛋白酶活性检测方法成为本发明研究的又一课题。
发明内容
本发明目的是提供了一种以组氨酸多肽对上转换纳米颗粒进行相转移的方法，该方法能够非常简单的一步制备出高稳定性、均一、单分散、转化效率接近100%的水溶性并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，同时，转到水相的上转换纳米颗粒不聚集、均匀分散，并且具有上转换发光的能力，而上转换纳米颗粒表面的多肽仍然具有生物活性。本发明解决了目前水相中上转换纳米颗粒聚集、以及转相效率低的问题。
为达到上述目的，本发明采用的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法方案是：所述方法由下列步骤组成：
第一步，设计一段含有组氨酸的多肽；
所述含有组氨酸的多肽为一段由2~50个氨基酸构成的肽链，其中组氨酸的个数所占的百分比为15~100%；从亲水性上，所述肽链为水溶性，并且HLB > 10；在带电荷情况上，所述肽链具有正电荷或零电荷或负电荷；所述组氨酸位于所述肽链的氨基端，或位于所述肽链的羧基端，或位于所述肽链的中间，或位于所述肽链的两端；所述肽链在其氨基酸或者在羧基端标记荧光分子；所述荧光分子的吸收峰在上转换纳米颗粒发射峰-50 nm~50 nm处，所述荧光分子选自四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素、菁染料琥珀酰亚胺酯3、菁染料琥珀酰亚胺酯5.5、2,5-二特丁基对苯二酚中的任意一种；
第二步，用所述第一步设计的含有组氨酸的多肽对上转换纳米颗粒进行转相，得到水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒；
所述上转换纳米颗粒由主体材料和掺杂材料组成，主体材料在上转换纳米颗粒中的摩尔浓度为50~99%，剩余部分为所述掺杂材料，其中，所述主体材料为NaREF4、KYF4、YVO4、LaF3、Y2O3、CaF2、BaTiO3、Lu2O3、La2O3、BaGdF5、BaF2中的任意一种，所述RE为Y、Yb、Pr、Nd、Dy、Gd、Lu中的任意一种；所述掺杂材料由敏化剂和激活剂组成，所述敏化剂为Nd、Yb、Tb、Gd、Lu中的任意一种，所述激活剂为Er 、Tm、Ho、Sm、Dy、Tb、Eu中的任意一种；所述上转换纳米颗粒的表面配体选自油酸、油胺、1-十八（碳）烯中的至少一种；
所述转相为油相和水相；所述油相的溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、一氯甲烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯戊烷、己烷、辛烷环己酮、甲苯环己酮等、氯苯、二氯苯、环氧丙烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚、吡啶、苯酚中的任意一种；所述水相的溶剂为水或水的缓冲液；所述水的缓冲液是指pH在5 ~ 10之间的缓冲溶液；
所述转相是指在温度为0℃~100℃下震荡或搅拌0.5 h ~120 h，转相之后油相的上转换纳米颗粒转移到水相，相转移效率在70%~100%之间，其中，所述油相与水相的体积比为1:0.01~100；所述上转换纳米颗粒在油相中的浓度为0.05 ~500 mg/ml；向水相中投入的所述多肽中含有的组氨酸的摩尔浓度在100 ~1012 nmol/L之间，所述多肽直接溶解在水中；
所述水相稳定是指在水溶液或者水的缓冲液中在4 ~ 60℃下静置4小时~15天，取上层清液视为水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒，其中，所述组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒在水相中的沉降比例为0 % ~ 40 %，在水相中紫外可见光吸收下降比例在0 % ~ 40 %。
上述技术方案中的有关内容解释：
1、上述方案中，HLB表示亲水疏水平衡值，数值越大亲水能力越好。
2、上述方案中，四甲基罗丹明的英文名为TAMRA，菁染料琥珀酰亚胺酯3的英文名为Cy 3，菁染料琥珀酰亚胺酯5.5的英文名为Cy 5.5、2,5-二特丁基对苯二酚的英文名为BHQ。
3、上述方案中，油酸的英文名为Oleic acid，油胺的英文名为Oleylamine，1-十八（碳）烯的英文名为1-Octadecene。
4、上述方案中，所述相转移效率定义为100%减去转相反应之后油相剩余的上转换纳米颗粒荧光峰面积与转相反应之前的上转换纳米颗粒荧光峰面积强度之间的比值。
5、上述方案中，在结构上，所述上转换纳米颗粒为实心结构、壳核结构、中空结构以及软黄结构中的任意一种；在颗粒的形貌上，所述上转换纳米颗粒为球体、椭圆体、六面体、六棱柱、圆柱体、棒状体、不规则多面体以及规则多面体中的任意一种。
6、上述方案中，所述水的缓冲液选自磷酸盐缓冲液（英文缩写：PBS）、碳酸氢钠－碳酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（英文缩写：Tris-HCl）、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液（英文缩写：HEPES）、醋酸－醋酸铵缓冲液、氨－氯化铵缓冲液以及醋酸－醋酸钠缓冲液中的任意一种。
本发明还提供了一种以组氨酸转相的上转换纳米颗粒在蛋白酶检测以及活体成像方面的应用方法，该应用方法用于蛋白酶在活体中指示蛋白酶活性。
为达到上述目的，本发明采用的一种组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒在活体上的应用的方案是：用上述方案的方法得到的水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒进行蛋白酶活体成像，再根据活体中呈现出的显影的强弱来代表蛋白酶活性。
进一步的，所述应用的用法由下列步骤组成：
第一步，针对所需检测的蛋白酶的种类，设计一段标记荧光分子并含有该蛋白酶特异性切割位点的组氨酸多肽；
所述蛋白酶的种类是指具有特异性切割位点的胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、凝血酶、基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、氨基肽酶、羧肽酶中的任意一种；所述组氨酸多肽为权利要求1的第一步设计的含有组氨酸的多肽，并在此基础上含有蛋白酶特异性切割位点；所述荧光分子为权利要求1的第一步选择的荧光分子；
第二步，进行转相反应；
用所述第一步得到的标记荧光分子并含有蛋白酶特异性切割位点的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒进行转相，进而得到转相产物，即荧光标记的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒；其中，转相反应的方法根据权利要求1的第二步来进行；
第三步，生成被检测的蛋白酶
所述被检测的蛋白酶为活体本身已经具有的蛋白酶，或为在理化条件或生化条件的诱导下产生的蛋白酶；所述理化条件为撞击、电击或化学试剂；所述生化条件为生物试剂、刺激或运动；所述活体为裸鼠、小鼠、大鼠、鱼、兔子、田鼠以及青蛙中的任意一种；
第四步，进行活体成像；
在所述第三步的基础上，向活体中注射所述第二步得到的转相产物，以在生物体内进行酶切反应；然后在不同的时间段中用活体成像仪进行活体成像，收集信号；最终获得活体成像图；
所述活体成像是指在生物体中的一个特定部位进行显影；显影的强度代表了蛋白酶活性，显影的强度越强代表蛋白酶活性越高，蛋白酶活性的检测范围在10-1 pM-1010pM；
所述不同的时间段是指在注射所述转相产物之后的0 分钟 ~ 15天之间，所述信号是指在近红外980 nm或808 nm激发条件下一个特定时间下一个波长范围内活体成像仪收集到的显影。
上述技术方案中的有关内容解释：
1、上述方案中，所述不同的时间段是根据蛋白酶的活性（也叫浓度）和反应的快慢设定反应时间间隔。
2、上述方案中，所述信号可以是在980 nm激发下1个小时的450 nm ~ 600 nm波长范围内的显影。
3、上述方案中，所述生物体中的一个特定部位是指大腿、尾部、胃部、前肢、心、肝、脾、肺或肾。
本发明设计原理：
组氨酸多肽转相原理：利用组氨酸的咪唑基团能够与稀土元素耦合从而取代油相中与稀土元素耦合的配体如油酸（英文名：Oleic acid）、油胺（英文名：Oleylamine）、1-十八（碳）烯（英文名：1-Octadecene），从而使上转换纳米粒子转移到水相。同时转到水相的上转换纳米颗粒不聚集、均匀单分散，并且仍然具有上转换发光的能力，而上转换纳米颗粒上面的多肽仍然具有生物活性。
在本发明中的蛋白酶活体成像方法的核心在于利用组氨酸多肽来链接上转换纳米颗粒与荧光分子，构建一个体系，从而能量可以通过多肽发生共振转移，连接荧光分子的特定组氨酸多肽上转换纳米颗粒在与不同浓度的活性蛋白酶作用之后，部分荧光分子离开上转换纳米颗粒表面（距离d > 10 nm）从而使得上转换纳米颗粒的荧光强度发生变化，活体中呈现出来的就是显影的强弱变化，这样就可以显示出活性蛋白酶的浓度。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点和效果是：由于上转换在近红外激发（980 nm或808 nm），相比于传统的下转换材料比如量子点、荧光染料，上转换具有多色可调性、没有光漂白、深层成像、优异的信噪比、低毒性以及可以避免了生物体的自体荧光的干扰；利用本发明相转移的方法非常简单，能够一步制备出高稳定性、均一、单分散、转化效率接近100%的水溶性并具有生物活性的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒，同时，转到水相的上转换纳米颗粒不聚集、均匀分散，并且具有上转换发光的能力，而上转换纳米颗粒表面的多肽仍然具有生物活性。
并且，通过本发明的转相方法得到的上转换纳米颗粒能够应用在蛋白酶活体成像上，进而根据显影的强弱来指示所需蛋白酶的活性，也即对活体内蛋白酶活性进行检测，该活体内蛋白酶活性检测方法具有普遍应用性，即只需根据所需检测的蛋白酶的种类，相应改变多肽底物中的酶切位点，无需改变多肽底物中组氨酸及其他部分，也无需改变制备过程，便可实现对不同种类的蛋白酶的活性的检测。也就是说，本发明提供的蛋白酶活性检测方法、灵敏度高、并且具有普遍适用性。
附图说明
附图1为本发明组氨酸多肽对上转换纳米颗粒转相的流程图；
附图2为本发明实施例一的多肽对上转换纳米颗粒转相反应实物图一；
附图3为本发明实施例一的多肽对上转换纳米颗粒转相反应实物图二；
附图4为本发明实施例一的多肽对上转换纳米颗粒转相反应实物图三；
附图5为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒（β-NaYF4;25%Yb,0.5%Tm）荧光光谱图；
附图6为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒（β-NaYF4;20%Yb,2%Er）荧光光谱图；
附图7为本发明实施例一的不同梯度浓度的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒转相之后，多肽修饰的上转换纳米颗粒荧光光谱图；
附图8为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的荧光光谱峰面积强度与多肽底物浓度转相的相关曲线；
附图9为本发明实施例一的在相转移前上转换纳米颗粒（β-NaYF4；25% Yb，0.5%Tm）的透射电镜图；
附图10为本发明实施例一的经100 µmol/L 的(H)6ARAR转相后上转换纳米颗粒（β-NaYF4；25% Yb，0.5% Tm）的透射电镜图；
附图11为本发明实施例一的经600 µmol/L 的(H)6ARAR转相后上转换纳米颗粒（β-NaYF4；25% Yb，0.5% Tm）的透射电镜图；
附图12为本发明实施例一的在相转移前上转换纳米颗粒（β-NaYF4；20% Yb，2%Er）的透射电镜图；
附图13为本发明实施例一的经100 µmol/L 的(H)6ARAR转相后上转换纳米颗粒（β-NaYF4；20% Yb，2% Er）的透射电镜图；
附图14为本发明实施例一的转相之前十八碳烯修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图；
附图15为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图一；
附图16为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图二；
附图17为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图三；
附图18为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图四；
附图19为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图五；
附图20为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒的水合粒径图六；
附图21为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒在牛血清白蛋白中的光学性质图；
附图22为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒在不同氯化钠浓度中的光学性质图；
附图23为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒在不同pH值中的光学性质图；
附图24为本发明实施例一的多肽修饰的上转换纳米颗粒在各种缓冲溶液中的光学性质图；
附图25为本发明实施例二的荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗荧光图、不含荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗荧光图、四甲基罗丹明紫外可见吸收和四甲基罗丹明荧光图；
附图26为本发明实施例二的荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗荧光猝灭比例与多肽底物浓度的相关关系图；
附图27为本发明实施例二的荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗粒的细胞毒性图；
附图28为本发明实施二活体成像案例的肿瘤生长情况图；
附图29为本发明实施二活体成像案例的荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗粒用于裸鼠成像图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法
本实施例为含有6个组氨酸的多肽对上转换纳米颗粒进行相转移的方法，操作流程参见附图1所示。所述方法由下列步骤组成：
第一步，所述多肽底物中包含一段由10个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有6个带有咪唑基团的组氨酸（符号：H），然后分别根据带电荷情况的不同，设计不同序列的多肽，观察带电情况对上转换纳米颗粒的稳定性，分别用正电荷的精氨酸（符号：R）负电荷的天冬氨酸（符号：D）不带电荷的丝氨酸（符号：S）构建不同带电的多肽，中间用丙氨酸（符号：A）隔开；即为NH2-(H)6ARAR-COOH、NH2-(H)6ASAS-COOH、NH2-(H)6ADAD-COOH；为了进行对比设计两条不含组氨酸的多肽系列为：NH2-(D)6ADAD-COOH、NH2-ADAD-COOH；所述肽链为水溶性，并且HLB > 10。
第二步，进行转相反应
如附图2至附图4所示，在常温即10~30℃下将300 µL溶解600 µmol/L多肽底物的水溶液轻轻加入300 µL溶解5 mg/ml上转换纳米颗粒的三氯甲烷中，混合震荡8 h，然后静置40h；分别用980 nm的激光器（功率密度：6.6 W/cm2）照射转相反应前后的上层与下层，并用普通相机拍摄。附图2和附图3对比得出只有含有组氨酸的图组才能稳定、均匀分散在水相中，并且在静置48 h后依然稳定的分散在水中，不聚集沉淀；附图3自身对比得出带不同电荷的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒的转相没有影响，附图3和附图4代表不同的上转换纳米颗粒都可以被转移到水中，并且在组氨酸存在的条件下稳定性非常好。
附图5和附图6表示油相上转换纳米颗粒的荧光强度和组氨酸多肽底物转相反应后水相上转换纳米颗粒的荧光强度图谱，做法是将200 μL油相上转换纳米颗粒或者200 μL水相的组氨酸修饰的上转换纳米颗粒以980 nm激光器（生产厂家：上海 Dream LasersTechnology Co.,Ltd）功率密度6.6 W/cm2为激发光源，采用AvaSpec-ULS2048-USB2光纤光谱仪（生产厂家：荷兰Avantes公司）进行测试的一个结果。其中，横轴表示波长，单位为纳米（nm），纵轴表示相对荧光强度。从附图5和附图6可以看出，水相的上转换纳米颗粒的荧光强度要比油相的上转换纳米颗粒的荧光强度要弱约一倍。
附图7表示不同梯度浓度的组氨酸多肽对上转换纳米颗粒转相之后，组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒静置48小时后的荧光强度。做法是：300 µL溶解X µmol/L（所述X表示：1、25、50、75、100、1200）组氨酸多肽的水溶液分别轻轻加入各个装有300 µL溶解5 mg/ml上转换纳米颗粒的三氯甲烷溶液瓶中，混合震荡8 h，然后静置48h，取所述静置48小时后的组氨酸多肽上转换纳米颗粒水相溶液200 μL以980 nm激光器（生产厂家：ShanghaiDream Lasers Technology Co.,Ltd）功率密度6.6 W/cm2为激发光源，采用AvaSpec-ULS2048-USB2光纤光谱仪（生产厂家：荷兰Avantes公司）进行测试的结果，其中，横轴表示波长，单位为纳米（nm），纵轴表示相对荧光强度。从附图7中可以看出，随着组氨酸多肽浓度的增加上转换纳米颗粒的水相荧光强度增强，当NH2-(H)6ARAR-COOH浓度达到100 µmol/L的时候水相的荧光强度跟最大浓度1200 µmol/L的水相的荧光强度相差不足（3 %），可以认为NH2-(H)6ARAR-COOH这条组氨酸多肽要使5 mg/ml上转换纳米颗粒达到稳定，最低浓度要达到100 µmol/L；参见附图8所示，对附图7中的荧光光谱进行的一个转化，同时加入了另外4条多肽NH2-(H)6ASAS-COOH、NH2-(H)6ADAD-COOH、NH2-(D)6ADAD-COOH、NH2-ADAD-COOH对上转换纳米颗粒进行转相的数据，一起汇总在附图8中，其中，横轴是多肽底物浓度，单位为μmol/L，纵轴是对应的上转换纳米颗粒的荧光峰面积强度。从附图8可以看出不同的多肽对上转换纳米颗粒的稳定性是不一样的，带有组氨酸的多肽底物对上转换纳米颗粒稳定性都很好，但是不同的多肽对上转换纳米颗粒的荧光强度的影响以及使上转换纳米颗粒荧光稳定的最低浓度都有所不同，根据多肽带电荷情况的不同得出；对上转换纳米颗粒稳定能力：正电荷(H)6ARAR >零电荷 (H)6ASAS > 负电荷(H)6ADAD（对上转换纳米颗粒稳定能力判断依据是根据相同多肽浓度对相同的上转换纳米颗粒相转移后，静置相同时间，水溶液中上转换纳米颗粒的荧光强度的大小来判断）不带组氨酸的多肽底物稳定性差，荧光强度弱如：(D)6ADAD、ADAD；正是由于不带组氨酸的多肽不能使上转换纳米颗粒稳定在水中，所以不带组氨酸的多肽难以进行下一步的蛋白酶反应。
表1 本实施例的多肽修饰的上转换纳米颗粒的电动电势和水合平均粒径表
| 配体 | 电动电势(mV) | 平均水合粒径 (nm) |
| OA | - | 64.8 |
| (H)6ARAR | +44.0 | 89.9 |
| (H)6ADAD | -39.6 | 86.4 |
| (H)6ASAS | +0.02 | 88.6 |
| ADAD | - | 925 (聚集) |
| (D)6ADAD | - | 1352 (聚集) |
上述表1反映了转相反应后上转换纳米颗粒的电动电势（英文名：Zate potential）这和之前设计的多肽带电情况一致；附图14表示转相反应前上转换纳米颗粒的动态光散射图，附图15至附图20表示转相反应后上转换纳米颗粒的动态光散射图（英文名：Dynamiclight scattering ）以及平均水合粒径的大小。表1和附图14至附图20的做法是在Zetasizer Nano ZS90 (生产厂家：英国Malvern)测试下得到电动电势和水合粒径，附图14至附图20中，横轴表示粒径的大小，单位为纳米（nm），纵轴表示百分含量。附图21至附图24表示不同的理化环境下上转换纳米颗粒的光学性质，做法是在上转换纳米颗粒转相之后加入各种化学或生化试剂然后在980 nm激光器（生产厂家：上海 Dream Lasers TechnologyCo.,Ltd）功率密度6.6 W/cm2为激发光源，采用AvaSpec-ULS2048-USB2光纤光谱仪（生产厂家：荷兰Avantes公司）测试荧光强度的一个结果；其中，横轴表示波长，单位为纳米（nm），纵轴表示相对荧光强度。
附图9至附图11表示上转换纳米颗粒（NaYF4；25%Yb，0.5%Tm）的透射电镜图，附图12和附图13表示上转换纳米颗粒（NaYF4；20%Yb，2%Er）的透射电镜图。其中，附图9是油相中上转换纳米颗粒，附图10是(H)6ARAR 100 µmol/L转相后的透射电镜图，附图11是(H)6ARAR600 µmol/L转相后的透射电镜图，做法是在185KV的Tecnai G2 20透射电子显微镜（生产厂家：美国FEI公司）下拍摄，得到电镜图谱。对比(H)6ARAR 100 µmol/L、600 µmol/L透射电镜图可以得出，上转换纳米颗粒在(H)6ARAR 100 µmol/L浓度时已经能够稳定存在了，上转换纳米颗粒的表面被一层多肽底物覆盖，随着多肽底物浓度的增加，上转换纳米颗粒表面的多肽底物增加，表面层变厚。这点也被图15和图18的平均水合粒径值所证实，UCNP-(H)6ARAR 100 µmol/L平均水合粒径72.52 nm小于UCNP-(H)6ARAR 600 µmol/L的平均水合粒径89.91 nm，附图12是油相中上转换纳米颗粒，附图13是(H)6ARAR 100 µmol/L转相后的透射电镜图；做法是在185KV的Tecnai G2 20透射电子显微镜（生产厂家：美国FEI公司）下拍摄，得到电镜图谱。
实施例二：一种组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒在活体成像上的应用
本实施例为组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒用于半胱天冬酶-3（英文名称：caspase-3）活体成像。所述应用的用法由下列步骤组成：
第一步，针对半胱天冬酶-3，设计一段含有该蛋白酶特异性切割位点的多肽底物，所述多肽底物中包含一段由13个氨基酸构成的肽链，所述肽链中含有能够被半胱天冬酶-3特异性切割的肽键以及6个带有咪唑基团的组氨酸（符号：H），其特异性蛋白酶切位点是天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（符号：DEVD），用赖氨酸（符号：K）来链接四甲基罗丹明（英文名：TAMRA），在组氨酸与半胱天冬酶-3特异性切割位点之间用甘氨酸（符号：G）链接，即该多肽底物为NH2-(H)6GDEVDAK-TAMRA，其被半胱天冬酶-3切后的产物为NH2-(H)6GDE-COOH和NH2-VDAK-TAMRA。
第二步，进行转相反应
在第一步基础上，向2 mL上转换纳米颗粒油相中投入2 mL 150 µmol/L多肽底物。其中，转相中油相与水相的体积比为1:1；在室温下混合震荡，12小时，得到荧光标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒；将转相后的荧光标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒离心，弃上清液，加入新的2 mL 150 µmol/L多肽底物在PBS缓冲液中孕育24 h，接着离心去掉多余的多肽底物，重复两次加入新的2 mL 150 µmol/L多肽底物在PBS 缓冲液中孕育24 h，接着离心去掉多余的多肽底物，将离心后的沉淀分散在2 mL PBS中，在4℃中储存。附图25表示四甲基罗丹明标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒（标记：UCNP-TAMRA）的荧光光谱、四甲基罗丹明的紫外可见吸收（标记：TAMRA紫外吸收）、405 nm激发的四甲基罗丹明荧光图谱（标记：TAMRA 荧光）以及多肽底物转相反应后水相上转换纳米颗粒（标记：UCNP)的荧光强度，做法是将200 μL甲基罗丹明或水相上转换纳米颗粒以405 nm激光器或980 nm激光器（生产厂家：上海 Dream Lasers Technology Co.,Ltd）功率密度6.6 W/cm2为激发光源，采用AvaSpec-ULS2048-USB2光纤光谱仪（生产厂家：荷兰Avantes公司）测试，得到甲基罗丹明或水相上转换纳米颗粒的荧光光谱；将200 μL四甲基罗丹明在紫外可见分光光谱仪上（生产厂家：美国Agilent 8453）测试，得到甲基罗丹明的紫外吸收光谱。
附图26表示用不同梯度浓度的四甲基罗丹明标记的多肽底物对上转换纳米颗粒转相，静置48小时测量980 nm上转换纳米颗粒荧光强度将（500 nm-600 nm）的荧光光谱波峰面积进行转化得到荧光标记多肽底物修饰的上转换纳米颗荧光猝灭比例与多肽底物浓度的相关关系。做法是：300 µL溶解X µmol/L（所述X表示：1、5、15、25、50、75、100、150、200、300、600、1200）罗丹明修饰的多肽底物水溶液分别轻轻加入各个装有300 µL溶解5 mg/ml上转换纳米颗粒的三氯甲烷溶液瓶中，混合震荡8 h，然后静置48h，取所述静置48小时后的200 μL水相上转换纳米颗粒溶液以980 nm激光器（生产厂家：Shanghai Dream LasersTechnology Co.,Ltd）功率密度6.6 W/cm2为激发光源，采用AvaSpec-ULS2048-USB2光纤光谱仪（生产厂家：荷兰Avantes公司）进行测试的结果，将测试结果取（500 nm-600 nm）的荧光光谱波峰面积进行作图得到；其中，横轴表示连接四甲基罗丹明（英文缩写：TAMRA）多肽浓度，单位为 µmol/L，纵轴表示荧光猝灭比例；从表中可以看出四甲基罗丹明标记的多肽越多，连接上转换纳米颗粒的多肽越多，荧光能量共振转移越高，上转换纳米颗粒的绿光（500 nm-600 nm）猝灭的越多。其中荧光猝灭比例定义为四甲基罗丹明标记的多肽修饰的上转换纳米颗粒（500 nm-600 nm）的荧光光谱波峰面积除以相同浓度的不加荧光标记的多肽修饰的上转换纳米颗粒（500 nm-600 nm）的荧光光谱波峰面积再乘以100%。
第三步，诱导活体生成胰蛋白酶
如附图28所示在裸鼠肿瘤内注射磷酸盐缓冲液（英文名：PBS）或阿霉素（英文名：DOX）之后肿瘤的体积大小；做法是在6周大的裸鼠体内注射100 µL 含有1×106个人口腔上皮细胞（英文名：KB cells）的细胞培养液，当人口腔上皮肿瘤（标记：KB肿瘤）长到40 mm3（大约15～20天）时根据每只裸鼠的体重注射4 mg kg-1 磷酸盐缓冲液或阿霉素，间隔4天之后注射第二次，这期间每天测量肿瘤的长和宽，肿瘤体积=肿瘤长×肿瘤宽2/2；其中，横轴表示时间单位是天，纵轴表示肿瘤体积，单位是（mm3）；从附图28可以看出，注射阿霉素（英文名：DOX）的肿瘤生长速度变慢，说明注射阿霉素的裸鼠体内有一部分的肿瘤细胞已经凋亡；也说明诱导细胞凋亡的半胱天冬酶-3在注射阿霉素的裸鼠体内已经产生。
第四步，进行活体成像，
附图29包括两组图，一组注射阿霉素（英文名：DOX）另一组注射磷酸盐缓冲液（英文名：PBS），做法是在980 nm 激光（功率密度：0.3 W cm-2）激发下在Maestro in-vivoimaging system (生产厂家：美国Perkin Elmer)进行活体成像并收集450 nm-600 nm信号，从图中信号对比发现注射阿霉素（英文名：DOX）的信号明显比注射磷酸盐缓冲液（英文名：PBS）的信号强，注射阿霉素（英文名：DOX）的信号斑点逐渐加深加大，而注射磷酸盐缓冲液（英文名：PBS）的信号则没有看到明显的斑点，说明注射阿霉素（英文名：DOX）肿瘤细胞有凋亡，并且产生了半胱天冬酶-3（英文名：caspase-3）对多肽底物进行了剪切，使得四甲基罗丹明脱离上转换纳米颗粒表面，荧光能量共振转移消失，上转换纳米颗粒的的绿光（520nm-560 nm）恢复，450 nm-600 nm信号增强。这个半胱天冬酶-3（英文名：caspase-3）的活体成像实验证明了组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒仍具有生物活性并且能够检测活体中蛋白酶活性。
附图27表示四甲基罗丹明标记的上转换纳米颗粒的细胞毒性大小；做法是将100µL含有1.5×104是个人口腔上皮细胞（英文名：KB cells）或人子宫癌细胞（英文名：HeLacells）接种在96孔板中，在37 ℃，二氧化碳含量为5%的恒温箱中放置过夜，让细胞贴壁，细胞贴壁之后弃上层细胞培养液，并用1×的磷酸盐缓冲液洗涤三遍，然后分别用含有1、5、25、50、100、250、500 µg mL−1四甲基罗丹明标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒（标记：UCNPs-HDEVD-TAMRA）的100 µL细胞培养液加入到每个含有细胞的孔板中；在37 ℃，二氧化碳含量为5%的恒温箱中培养24 h；之后用100 µL含有5 mg mL-1 MTT的细胞培养液替换含有上转换纳米颗粒的培养液，细胞接着在37 ℃，二氧化碳含量为5%的恒温箱中培养4 h；再弃去含有MTT的细胞培养液，加入150 µL二甲基亚砜震荡10 min，在TECAN Infinite M200PRO plate reader中测量490 nm的吸收值。对照组为含有胎牛血清的细胞培养液培养的细胞做全活对照组，聚乙二醇辛基苯基醚（英文名：Triton X-100）培养的细胞做全死对照组。其中，横轴表示四甲基罗丹明标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒（标记：UCNPs-HDEVD-TAMRA）的浓度，单位为微克每毫升（µg mL−1），纵轴表细胞相对存活率。从图12可以看出，四甲基罗丹明标记的多肽底物修饰的上转换纳米颗粒（标记：UCNPs-HDEVD-TAMRA）的细胞毒性很小，即使在浓度达到500 µg mL−1的时候也有85%以上的细胞存活率。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法，其特征在于：所述方法由下列步骤组成：
第一步，设计一段含有组氨酸的多肽；
所述含有组氨酸的多肽为一段由2~50个氨基酸构成的肽链，其中组氨酸的个数所占的百分比为15~100%；从亲水性上，所述肽链为水溶性，并且HLB > 10；在带电荷情况上，所述肽链具有正电荷或零电荷或负电荷；所述组氨酸位于所述肽链的氨基端，或位于所述肽链的羧基端，或位于所述肽链的中间，或位于所述肽链的两端；所述肽链在其氨基酸或者在羧基端标记荧光分子；所述荧光分子的吸收峰在上转换纳米颗粒发射峰-50 nm~50 nm处，所述荧光分子选自四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素、菁染料琥珀酰亚胺酯3、菁染料琥珀酰亚胺酯5.5、2,5-二特丁基对苯二酚中的任意一种；
第二步，用所述第一步设计的含有组氨酸的多肽对上转换纳米颗粒进行转相，得到水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒；
所述上转换纳米颗粒由主体材料和掺杂材料组成，主体材料在上转换纳米颗粒中的摩尔浓度为50~99%，剩余部分为所述掺杂材料，其中，所述主体材料为NaREF4、KYF4、YVO4、LaF3、Y2O3、CaF2、BaTiO3、Lu2O3、La2O3、BaGdF5、BaF2中的任意一种，所述RE为Y、Yb、Pr、Nd、Dy、Gd、Lu中的任意一种；所述掺杂材料由敏化剂和激活剂组成，所述敏化剂为Nd、Yb、Tb、Gd、Lu中的任意一种，所述激活剂为Er 、Tm、Ho、Sm、Dy、Tb、Eu中的任意一种；所述上转换纳米颗粒的表面配体选自油酸、油胺、1-十八（碳）烯中的至少一种；
所述转相为油相和水相；所述油相的溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、一氯甲烷、环己烷、苯、甲苯、二甲苯戊烷、己烷、辛烷环己酮、甲苯环己酮等、氯苯、二氯苯、环氧丙烷、乙酸乙酯、乙酸丙酯、甲基丁酮、甲基异丁酮、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚、吡啶、苯酚中的任意一种；所述水相的溶剂为水或水的缓冲液；所述水的缓冲液是指pH在5 ~ 10之间的缓冲溶液；
所述转相是指在温度为0℃~100℃下震荡或搅拌0.5 h ~120 h，转相之后油相的上转换纳米颗粒转移到水相，相转移效率在70%~100%之间，其中，所述油相与水相的体积比为1:0.01~100；所述上转换纳米颗粒在油相中的浓度为0.05 ~500 mg/ml；向水相中投入的所述多肽中含有的组氨酸的摩尔浓度在100 ~1012 nmol/L之间，所述多肽直接溶解在水中；
所述水相稳定是指在水溶液或者水的缓冲液中在4 ~ 60℃下静置4小时~15天，取上层清液视为水相稳定的组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒，其中，所述组氨酸多肽修饰的上转换纳米颗粒在水相中的沉降比例为0 % ~ 40 %，在水相中紫外可见光吸收下降比例在0% ~ 40 %。
2.根据权利要求1所述的一种组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法，其特征在于：在结构上，所述上转换纳米颗粒为实心结构、壳核结构以及中空结构中的任意一种；在颗粒的形貌上，所述上转换纳米颗粒为球体、椭圆体、六面体、六棱柱、圆柱体以及棒状体中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种组氨酸多肽对上转换纳米颗粒相转移的方法，其特征在于：所述水的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠－碳酸钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、醋酸－醋酸铵缓冲液、氨－氯化铵缓冲液以及醋酸－醋酸钠缓冲液中的任意一种。
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