CN103540311A - 一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法 - Google Patents

一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法 Download PDF

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Abstract

本发明方法具体是一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法。首先，将疏水性的环氧化上转换发光纳米晶分散在环己烷中；然后将其加入到半胱氨酸和二氯甲烷的混合溶液中，并在常温常压条件下反应一定的时间，形成功能化的纳米粒子；最后，将其酸化，即得到半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶。本发明方法具有工艺简单，操作方便，结构易控的优势。改性的纳米荧光材料不仅尺寸均一、结构稳定，并且具有上转换荧光较强、生物相容性好等优点，并且可用于不同稀土离子掺杂纳米晶的表面改性，所得半胱氨酸改性的纳米荧光材料在细胞或组织的上转换荧光标记、载药及肿瘤靶向治疗等领域具有潜在应用价值。

Description

一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法
技术领域
    本发明属于纳米生物材料技术领域，具体涉及一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法。
背景技术
光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点之一，它可以直接检测生物体内发生的生理过程和病理状态。稀土掺杂的上转换发光纳米材料是近些年来新兴的一种荧光材料，它是利用近红外光激发而发出可见光或近红外光，这一特性克服了传统荧光材料光穿透能力差以及信噪比差的不足，使其能很好地应用于生物学检测。并且稀土掺杂的上转换纳米材料合成工艺简单，形貌大小可控。
目前，合成的稀土上转换纳米材料绝大多数是油溶性的，因此必须要对其表面进行功能化，提高其水溶性及生物相容性，才能在生物体系得到应用。目前对其表面改性的方法主要有两大类，即无机表面改性和有机表面改性。其中，无机表面改性研究最多的是二氧化硅包覆，有机表面改性主要为高分子包覆或者有机表面小分子改性。但大多数改性上转换纳米晶的方法都有一些缺点，比如：（1）反应条件苛刻；（2）反应过程复杂；（3）二氧化硅或高分子包覆会使纳米粒子粒径增加，荧光强度降低；（4）反应过程中可能造成纳米粒子团聚，荧光强度下降等。这些都影响到上转换纳米材料在临床上的应用。
发明内容
针对上述方法的不足，本发明的目的在于提出一种对稀土上转换发光纳米材料的新的改性方法，制备具有良好生物相容性以及形貌大小适应于生物学应用的上转换发光纳米荧光材料。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案是：
一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法，其特征在于该方法包括以下工艺步骤：
a.将油溶性稀土上转换发光纳米晶表面油酸进行环氧化，然后分散到环己烷中，形成第一分散液；
a1.预备20～30 mg表面油酸环氧化的稀土上转换纳米晶，4 ~ 6mL环己烷；
a2.将所述二种物质混合均匀，制得第一分散液；
上述的稀土上转换纳米晶为六方相NaYF4:Yb,Er, 或六方相NaYF4:Yb,Tm。
b.将半胱氨酸加入二氯甲烷中充分混合，形成第二分散液；
b1.预备150 ~ 200 mg半胱氨酸、2 ~ 4 mL二氯甲烷； 
b2.将预备的半胱氨酸和二氯甲烷混合，并超声分散，形成第二分散液；
c.将第一、第二分散液混合，生成半胱氨酸功能化的纳米产物；
d.将纳米产物离心分离、酸化，制得生物相容性的半胱氨酸功能化的上转换发光纳米材料；
d1.预备8~12 mL 1.5mol/L盐酸溶液；
d2.将第三分散液离心分离，再将8~12 mL 1.5 mol/L盐酸溶液加入，形成第四分散液；
d3.将第四分散液离心,分离出纳米产物，然后用去离子水洗涤2～3次；
d4.将上述产物真空干燥，制得半胱氨酸功能化的稀土上转换发光纳米材料。
2、所述的半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的用途及其生物应用及使用方法；
A. 用于细胞成像；
A1预备10 mg半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Er纳米晶，5 mL去离子水，96孔板培养的Hela细胞；
A2.将预备的半胱氨酸改性的上转换纳米晶与去离子水混合，超声10分钟分散，形成第五分散液；
A3.取第五分散液不同的量加入96孔板中，随后置于恒温恒湿机箱中培养3小时，在激光共聚焦显微镜下观察。
B.应用于活体成像；
B1.预备4 mg半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶， 2 mL生理盐水，麻醉剂，裸鼠；
B2.将预备的半胱氨酸改性的上转换纳米晶与生理盐水混合，超声10分钟分散，形成第六分散液；
B3.用注射器通过尾静脉向裸鼠体内分别注射200 ??L第六分散液和麻醉剂；
B4.15分钟后，在活体成像仪器上对裸鼠进行观察。
本发明的有益效果为：提出的合成方法简单、易于重复，本发明方法的特点是利用半胱氨酸改性合成生物相容性的稀土上转换发光纳米晶，得到多功能纳米荧光材料，相比于传统表面改性方法，该方法具有很多突出的优点：（1）实验过程简单；（2）成本便宜；（3）不改变粒子的形貌；（4）表面可以进一步功能化，使其有望应用于靶向诊断和靶向药物的运输。
本发明方法具体是一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法。首先，将疏水性的稀土上转换发光纳米晶表面油酸进行环氧化后，分散在环己烷中；然后将其加入到半胱氨酸和二氯甲烷的混合溶液中，并在常温常压条件下反应一定的时间，形成功能化的纳米粒子；最后，将其酸化，即得到半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶。本发明方法具有工艺简单，操作方便，结构易控的优势。改性的纳米荧光材料不仅尺寸均一、结构稳定，并且具有上转换荧光较强、生物相容性好等优点，并且可用于不同稀土离子掺杂纳米晶的表面改性，产物可应用于上转换荧光成像、靶向载药等生物医学领域。
附图说明
图1是本发明实施例1所得样品的TEM照片；
图2是本发明实施例2所得样品在980 nm激光光源激发下的荧光光谱图；
图3是本发明应用试验例1所得样品的细胞成像图片；
图4是本发明应用试验例2所得样品的小鼠体内成像图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行详细说明：
实施例1：
本实施例提供一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法，其特征在于该方法包括以下工艺步骤：
a.将油溶性稀土上转换发光纳米晶表面油酸进行环氧化，然后分散到环己烷中，形成第一分散液；
a1.预备20～30 mg表面油酸环氧化的稀土上转换纳米晶NaYF4:Yb,Er，4 ~ 6mL环己烷；
a2.将所述二种物质混合均匀，制得第一分散液；
b.将半胱氨酸加入二氯甲烷中充分混合，形成第二分散液；
b1.预备150 ~ 200 mg半胱氨酸、2 ~ 4 mL二氯甲烷； 
b2.将预备的半胱氨酸和二氯甲烷混合，并超声分散，形成第二分散液；
c.将第一、第二分散液混合，生成半胱氨酸功能化的纳米产物；
d.将纳米产物离心分离、酸化，制得生物相容性的半胱氨酸功能化的上转换发光纳米材料；
d1.预备8~12 mL 1.5mol/L盐酸溶液；
d2.将第三分散液离心分离，再将8~12 mL 1.5 mol/L盐酸溶液加入，形成第四分散液；
d3.将第四分散液离心,分离出纳米产物，然后用去离子水洗涤2～3次；
d4.将上述产物真空干燥，制得半胱氨酸功能化的NaYF4:Yb,Er稀土上转换发光纳米材料。
实施例2：
本实施例一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法，其包括以下步骤：
a.预备20～30 mg 直径为20~30 nm表面油酸被环氧化的稀土上转换纳米晶NaYF4:Yb,Tm，4 ~ 6mL环己烷，并混合均匀制得第一分散液；
b.预备150 ~ 200 mg半胱氨酸、2 ~ 4 mL 二氯甲烷，将两种物质混合并超声分散，形成第二分散液；
c.将第一、第二分散液混合，并充分搅拌6～10小时，直到形成无色透明溶液，得第三分散液。
d.预备8~12 mL 1.5mol/L 盐酸溶液；将第三分散液离心分离，再将预备的盐酸溶液加入，形成第四分散液；将第四分散液离心分离出纳米产物，然后用去离子水洗涤2～3次；将上述产物真空干燥，制得半胱氨酸功能化的NaYF4:Yb,Tm纳米荧光材料。
现将本发明产物的应用试验叙述于后。
应用试验例1：
本应用试验例提供半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Er纳米晶应用于细胞成像实验，其包括以下步骤：
A1.配200~300??g/mL的半胱氨酸改性的纳米材料的RPMI. 1640溶液培养液；
A2.将Hela 细胞在上述培养液中培养3小时；
A3.用PBS缓冲液冲洗细胞3次，将没有被细胞吸收的培养液洗去；
A4.将培养后的细胞在共聚焦显微镜上进行成像，成像过程使用0~650 mW功率可调、连续波激发的稳态980 nm激光器作为激发光源，观测到位于520~560 nm和630~670 nm的发射光，可以观察到明显的绿光和红光信号。
应用试验例2:
本应用试验例提供半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶应用于活体成像实验，其包括以下步骤：
B1.将制备的半胱氨酸表面改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶用生理盐水配制成0.8~1mg/mL 的分散液；
B2.通过尾静脉注射进裸鼠内100??L，15分钟后将其放在活体成像仪器上进行成像观察，以980 nm激光器作为激发光源，可以在小鼠的肝脏和肺里面观察到明显的发光信号。
 
通过图1至图4可以看出，
图1是本发明实施例1所得样品半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Er纳米晶的TEM照片，从图中可以看出纳米粒子粒径分布均匀，与原料NaYF4:Yb,Er相比大小未发生改变，说明该方法适用于油溶性稀土上转换纳米晶的表面功能化。并且改性后的纳米粒子平均粒径约为30 nm，因为球形、小尺寸纳米粒子更容易被细胞内吞，这对于其用作生物探针在生物体内循环具有重要意义。
图2是本发明实施例2所得样品半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶在980 nm激光光源激发下的荧光光谱图，从图中可以观察到位于475 nm，700 nm，802 nm处的发射峰，分别对应于Tm3+的1G4→3H6，3F3/2→3H6，3H4→3H6能级的跃迁，表明半胱氨酸修饰后的上转换纳米材料仍然保持良好的荧光性能。
图3是本发明应用试验例1所得半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Er纳米晶的细胞成像图片，从图中可以看出细胞对半胱氨酸功能化的NaYF4:Yb,Er纳米晶内吞效果非常好，并且细胞内的荧光强度较强，证明该纳米材料适用于细胞荧光成像。
图4是本发明应用试验例2所得半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶的小鼠成像照片，通过该图片可知，纳米材料经静脉注射后主要被小鼠的肝脏和肺部吸收，并且荧光强度较强，信噪比大，说明该纳米材料可以应用于生物体的荧光成像。
按照本发明所提供的将半胱氨酸用于稀土上转换发光纳米晶表面修饰的方法，得到的产物不仅尺寸均一、结构稳定，并且具有上转换荧光较强等优点，特别是所得纳米材料可应用于细胞成像和生物体内成像。并且该产物表面可以进一步功能化，使其有望应用于靶向诊断和靶向药物的运输。
本发明方法具有工艺简单、操作方便的优势，具体是半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成及生物应用。特点是该发明使用半胱氨酸进行功能化，简化了合成过程，且制备工艺简易、成本低。首先，将疏水性的环氧化上转换发光纳米晶分散在环己烷中；然后将其加入到半胱氨酸和二氯甲烷的混合溶液中，并在常温常压条件下反应一定的时间，形成功能化的纳米粒子；最后，将其酸化，即得到半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶。本发明方法具有工艺简单，操作方便，结构易控的优势。改性的纳米荧光材料不仅尺寸均一、结构稳定，并且具有上转换荧光较强、生物相容性好等优点，并且可用于不同稀土离子掺杂纳米晶的表面改性，产物可应用于上转换荧光成像、靶向载药等生物医学领域。 

Claims (2)

1.一种半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的合成方法，其特征在于该方法包括以下工艺步骤：
a.将油溶性稀土上转换发光纳米晶表面油酸进行环氧化，然后分散到环己烷中，形成第一分散液；
a1.预备20～30 mg表面油酸环氧化的稀土上转换纳米晶，4 ~ 6mL环己烷；
a2.将所述二种物质混合均匀，制得第一分散液；
上述的稀土上转换纳米晶为六方相NaYF4:Yb,Er, 或六方相NaYF4:Yb,Tm；
b.将半胱氨酸加入二氯甲烷中充分混合，形成第二分散液；
b1.预备150 ~ 200 mg半胱氨酸、2 ~ 4 mL二氯甲烷； 
b2.将预备的半胱氨酸和二氯甲烷混合，并超声分散，形成第二分散液；
c.将第一、第二分散液混合，生成半胱氨酸功能化的纳米产物；
d.将纳米产物离心分离、酸化，制得生物相容性的半胱氨酸功能化的上转换发光纳米材料；
d1.预备8~12 mL 1.5mol/L盐酸溶液；
d2.将第三分散液离心分离，再将8~12 mL 1.5 mol/L盐酸溶液加入，形成第四分散液；
d3.将第四分散液离心,分离出纳米产物，然后用去离子水洗涤2～3次；
d4.将上述产物真空干燥，制得半胱氨酸功能化的稀土上转换发光纳米材料。
2.所述的半胱氨酸改性的稀土上转换发光纳米晶的用途及其生物应用及使用方法；
A. 用于细胞成像；
A1.预备10 mg半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Er纳米晶，5 mL去离子水，96孔板培养的Hela细胞；
A2.将预备的半胱氨酸改性的上转换纳米晶与去离子水混合，超声10分钟分散，形成第五分散液；
A3.取第五分散液不同的量加入96孔板中，随后置于恒温恒湿机箱中培养3小时，在激光共聚焦显微镜下观察；
B.应用于活体成像；
B1.预备4 mg半胱氨酸改性的NaYF4:Yb,Tm纳米晶， 2 mL生理盐水，麻醉剂，裸鼠；
B2.将预备的半胱氨酸改性的上转换纳米晶与生理盐水混合，超声10分钟分散，形成第六分散液；
B3.用注射器通过尾静脉向裸鼠体内分别注射200 ??L第六分散液和麻醉剂；
B4.15分钟后，在活体成像仪器上对裸鼠进行观察。
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