CN104288835B - 一种可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架，组成材料包括丝素蛋白、角蛋白、明胶和自产氧物，其中，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为（3-9）:（2-6），所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（1-5）:15，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（0.2-3）:15。本发明提供的可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架复合了角蛋白、丝素蛋白、明胶和自产氧物，物理强度要优于利用单纯丝素蛋白溶液和单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，同时明胶成份对自产氧物构成一定的包裹作用，使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒速且高水平的释放氧气，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白复合支架，尤其涉及一种可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架及其制备方法。
背景技术
由于各种原因所导致的复杂性尿道疾病，历来是泌尿外科临床治疗中的一个难题。虽然多种自体组织作为替代材料已经在尿道修复重建中获得理想的效果，但相比而言组织工程技术没有前者“牺牲正常组织为代价，以手术创伤修复组织缺损”的固有缺陷，因而更可作为未来尿道重建发展的主要方向。现有国内外文献报道中对于各种组织工程材料或者材料-种子细胞复合体在尿道修复重建中的研究已逐渐从实验室向临床拓展。其中不乏有小范围实际尿道疾病临床治疗的案例，并且获得另人满意的初步疗效。
但是相对于种子细胞研究的日趋完善，在尿道组织工程修复重建中选择何种支架材料最为理想却始终未能达成共识。目前在尿道的组织工程研究中主要采用两大类支架：天然脱细胞胶原基质（SIS、BAMG、脱细胞真皮基质等）和人工合成材料（聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物）。前者虽然制备方便，适合商品化的生产，但由于多取材于异种乃至异体生物组织，因而在生物安全性方面一直受到部分学者质疑，很难被所有患者所接受。同时其在空间结构，生物力学特性以及促进微血管和细胞渗透方面也同时存在着固有缺陷。后者虽然将生物安全性方面的风险降到了最低，但支架在降解过程中的代谢产物对周围的细胞以及微环境会造成不可避免的负面影响，另外人工合成类支架因缺乏相应的生长因子，在促进种子细胞黏附，增殖方面也有着先天的不足。
人发提取角蛋白是一类广泛存在于人毛发以及指甲内的结构蛋白质。因其含有丰富的半胱氨酸残基，其彼此之间通过氧化作用形成大量分子内和分子间的二硫键，从而使得制备的生物支架材料拥有了相应的生物弹性。在生物相容性方面，现有的研究结果显示不同种子细胞均能在该类蛋白支架上很好的生长。同时由于还原型的角蛋白不含极性，在水中的溶解度较小且能耐受极端的PH环境，因而拥有相对较慢的降解速率，可作为替代支架在体内发挥作用长达3－6月之久。
虽然角蛋白拥有着上述的诸多优点，但单纯采用此种蛋白进行支架材料制备时，不可避免的会遇到生物力学特性不足的问题。因此在制备支架的过程中将角蛋白和其余天然材料进行有效结合可以进一步提升材料的力学性能，从而更能够满足类似尿道组织修复重建的需要。相比而言，自蚕丝内获取的丝素蛋白拥有提取简易，制作成本低的优势。不仅如此，丝素蛋白极佳的弹性以及较好的抗拉强度也为其与角蛋白的结合提供了理论基础。
制备完成的角蛋白-丝素蛋白复合支架如同其它合成的尿道组织工程修复材料一样会拥有一定的厚度，而支架材料的厚度势必会对微血管的长入、氧气以及营养补给起到限制作用。而这一问题也是导致利用组织工程材料进行尿道重建术后出现狭窄复发的主要原因之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种具有自体供氧能力的可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架及其制备方法。
本发明的第一个方面是提供一种可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架，所述蛋白复合支架的组成材料包括丝素蛋白、角蛋白、明胶和自产氧物。
优选地，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为（3-9）:（2-6），更优选为（3.5-8.5）:（2.5-5.5），更优选为（4-8）:（3-5.2），更优选为（5-7）:（3-5），更优选为（5.5-6.5）:（3.5-4.5），例如6:4或6:4.2。
优选地，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（1-5）:15，更优选为（1.5-4.5）:15，更优选为（2-4）:15，更优选为（2.5-3.5）:15，例如2.8:15或3:15。
优选地，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（0.2-3）:15，更优选为（0.5-2.5）:15，更优选为（0.5-2）:15，更优选为（0.8-1.5）:15，更优选为（0.9-1.2）:15，例如0.95:15或1:15。
其中，所述自产氧物优选为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲等中的一种或几种的混合物，更优选为过氧化钙。
其中，所述角蛋白优选为还原型人发角蛋白。
本发明的第二个方面是提供一种上述用于尿道修复重建的蛋白复合支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将角蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制丝素蛋白和角蛋白的质量比为（3-9）:（2-6），且蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度为0.05-0.2g/mL；
步骤2，将明胶加入到蛋白混合液中，待明胶完全溶解后，加入自产氧物，溶解完全，其中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（1-5）:15，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为（0.2-3）:15；
步骤3，将步骤2得到的混合溶液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架。
步骤1中，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比优选为（3.5-8.5）:（2.5-5.5），更优选为（4-8）:（3-5.2），更优选为（5-7）:（3-5），更优选为（5.5-6.5）:（3.5-4.5），例如6:4或6:4.2。
步骤1中，蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度优选为0.06-0.17g/mL，更优选为0.07-0.15g/mL，更优选为0.08-0.13g/mL，更优选为0.09-0.11g/mL，例如0.1g/mL或0.105g/mL。
步骤2中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比优选为（1.5-4.5）:15，更优选为（2-4）:15，更优选为（2.5-3.5）:15，例如2.8:15或3:15。
步骤2中，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比优选为（0.5-2.5）:15，更优选为（0.5-2）:15，更优选为（0.8-1.5）:15，更优选为（0.9-1.2）:15，例如0.95:15或1:15。
步骤2中，所述自产氧物优选为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲等中的一种或几种的混合物，更优选为过氧化钙。
步骤1中，所述角蛋白优选为还原型人发角蛋白，制备方法如下：将人头发置于提取液中，50-150℃（优选为70-130℃，更优选为80-120℃，更优选为100-110℃）下浸泡10-60min（优选为15-50min，更优选为25-35min），过滤，将滤液透析，浓缩，得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为（0.5-4g）:（5-20mL）。
进一步优选地，人头发的质量与提取液的体积的比为（1-3g）:（8-15mL），更优选为（1.5-2g）:（10-12mL）。
优选地，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、Na2S2O5的混合水溶液。
进一步优选地，所述提取液中，每100mL水中，含有30-70g（优选为35-60g，更优选为45-50g）尿素、40-80g（优选为45-70g，更优选为50-60g）十二烷基硫酸钠、80-120g（优选为88-110g，更优选为92-100g）Na2S2O5。
步骤1中，所述丝素蛋白的制备方法如下：将脱胶蚕丝溶于MX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属（例如Li、Na、K等），X为卤素（例如F、Cl、Br、I等）。
优选地，步骤3中，凝胶化后，敞口自蒸发8-16h（优选为10-14h，更优选为11-12h）后，倒入无水酒精0.5-2h（优选为0.8-1.5h，更优选为1-1.2h）后取出得到蛋白复合支架。
本发明提供的可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架复合了角蛋白、丝素蛋白、明胶和自产氧物，物理强度要优于利用单纯丝素蛋白溶液和单纯蛋白组合溶液所构建的膜结构材料，同时明胶成份对自产氧物构成一定的包裹作用，使得本发明提供的蛋白复合支架能够恒速且高水平的释放氧气，更适合于实际手术操作的需要，最终提高尿道修复重建的成功率。
附图说明
图1为本发明提供的用于尿道修复重建的蛋白复合支架的HE染色图；
图2为本发明提供的用于尿道修复重建的蛋白复合支架的扫描电镜图。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的描述，以更好地理解本发明。
实施例1
1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液（每1000ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S2O5）中，浸没后在100℃油浴加热30min。
4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5。
5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量10000）水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
7、将100g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60℃。
8、将自市场上购置的脱胶蚕丝10g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5，每天换水一次。
10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量20000）水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.1g/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
11、将得到的丝素蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比6:4进行混合。
13、取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37℃，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙0.1g，高速搅拌30s后置入方型模具中。
14、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精1h后取出，得到蛋白复合支架。
最终获取的蛋白复合支架大体外观为褐色半透明膜状材料。其HE染色提示该材料为一伊红染色阳性膜状物（图1所示）。扫描电镜显示支架表面存在散在分布的颗粒状过氧化钙，部分区域可见明胶包被过氧化钙表现（图2所示）。
经力学拉伸检测，该蛋白复合支架的最大伸长率52.43%，弹性模量0.202MPa。释氧能力检测提示每1cm2该种材料浸没于8ml蒸馏水溶液中可使得该溶液的氧含量在2周之内维持在140-100mmHg之间。
实施例2
1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液（每1000ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S2O5）中，浸没后在100℃油浴加热30min。
4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5。
5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量10000）水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
7、将100g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60℃。
8、将自市场上购置的脱胶蚕丝10g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5，每天换水一次。
10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量20000）水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.1g/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
11、将得到的丝素蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比4:6进行混合。
13、取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37℃，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.02g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙0.4g，高速搅拌30s后置入方型模具中。
14、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精1h后取出，得到蛋白复合支架。
实施例3
1、自理发店中获取无染色的正常黑发，常规洗发精清洗1-2次，置放于常规室温中进行干燥。
2、将干燥处理后的头发浸泡于乙酸乙酯与甲醇的混合溶液中24小时，其中乙酸乙酯与甲醇的体积比为3:1。
3、头发再次干燥后，充分剪碎，将其按1.5g/10ml比例加入提取液（每1000ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸钠SDS、95.045gNa2S2O5）中，浸没后在100℃油浴加热30min。
4、真空抽滤，将黑色提取液置于透析袋中，透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5。
5、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量10000）水溶液中，浓缩6小时，调节还原型人发角蛋白的的浓度为0.1g/mL后，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在45-60kD左右，说明得到还原型人发角蛋白。
6、将得到的还原型人发角蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
7、将100g溴化锂溶于60ml水中，配制成溴化锂水溶液，搅拌溶液同时加热至60℃。
8、将自市场上购置的脱胶蚕丝10g溶液溴化锂水溶液中，5h后，多层纱布过滤，过滤后溶液置于透析袋中。
9、透析5d，透析袋周围水溶液中含有0.1wt%的Na2S2O5，每天换水一次。
10、完成透析后将透析带置于20wt%PEG（分子量20000）水溶液中，浓缩6h，调节至丝素蛋白的浓度为0.1g/mL，行SDS蛋白电泳检测提示蛋白电泳带在25-30kD左右，说明得到丝素蛋白。
11、将得到的丝素蛋白溶液在4℃环境下予以保存。
12、将得到的还原型人发角蛋白溶液和丝素蛋白溶液按体积比7:3进行混合。
13、取步骤12得到的混合液15ml，将其融合搅拌并加热至37℃，加入明胶，控制混合液中明胶的浓度为0.01g/mL。待明胶完全溶解后，加入过氧化钙0.2g，高速搅拌30s后置入方型模具中。
14、混合溶液在方型模具中，模具加盖，室温下放置12h小时，带凝胶化后，开盖，自然蒸发12h，倒入酒精1h后取出，得到蛋白复合支架。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种可以用于尿道修复重建的蛋白复合支架，其特征在于，组成材料包括丝素蛋白、角蛋白、明胶和自产氧物，其中，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为(3-9):(2-6)，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(1-5):15，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.2-3):15；
所述自产氧物为过氧化钙、过碳酸钠、过碳酸钾、过氧化硫脲中的一种或几种的混合物。
2.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述丝素蛋白和角蛋白的质量比为(5-7):(3-5)。
3.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(2-4):15。
4.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.5-2):15。
5.根据权利要求1所述的蛋白复合支架，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白。
6.一种如权利要求1所述的用于尿道修复重建的蛋白复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将角蛋白溶液与丝素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制丝素蛋白和角蛋白的质量比为(3-9):(2-6)，且蛋白混合液中角蛋白与丝素蛋白的总浓度为0.05-0.2g/mL；
步骤2，将明胶加入到蛋白混合液中，待明胶完全溶解后，加入自产氧物，溶解完全，其中，所述明胶和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(1-5):15，所述自产氧物和角蛋白与丝素蛋白总量的质量比为(0.2-3):15；
步骤3，将步骤2得到的混合溶液密封静置，直至凝胶化，敞口自蒸发，得到蛋白复合支架。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述角蛋白为还原型人发角蛋白，制备方法如下：
将人头发置于提取液中，50-150℃下浸泡10-60min，过滤，将滤液透析，浓缩，得到还原型人发角蛋白，其中，人头发的质量与提取液的体积的比为(0.5-4g):(5-20mL)。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述提取液为尿素、十二烷基硫酸钠、Na2S2O5的混合水溶液，其中，每100mL水中，含有30-70g尿素、40-80g十二烷基硫酸钠、80-120gNa2S2O5。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述丝素蛋白的制备方法如下：
将脱胶蚕丝溶于MX溶液中，过滤，将滤液透析，浓缩，得到纯化的丝素蛋白，其中，M为碱金属，X为卤素。
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