CN1184313C - 衍生自黑眉蝮蛇的新型蛋白以及制备该蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黑眉素，其为一种衍生自韩国蛇黑眉蝮蛇毒液的蛋白质，还涉及制备黑眉素的方法以及黑眉素作为抗血小板凝集剂和抗肿瘤剂的药物应用。本发明从黑眉蝮蛇的毒液中纯化了黑眉素，克隆了其cDNA，用含有所述cDNA的重组表达载体转化微生物，通过培养该微生物制备了重组黑眉素。黑眉素有效抑制了肿瘤细胞的血小板凝集和血管发生，这使得其实际应用为抗血小板剂和抗肿瘤剂的活性成分成为可能。

Description

衍生自黑眉蝮蛇的新型蛋白以及制备该蛋白的方法

发明背景

发明领域

本发明涉及黑眉素(Saxatilin)(一种衍生自韩国黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)的蛋白)、黑眉素制备方法以及黑眉素的药物应用，更特定地涉及作为抗血小板凝集剂和抗肿瘤剂的黑眉素(一种衍生自韩国黑眉蝮蛇毒液的蛋白)、黑眉素制备方法以及黑眉素的药物应用。

现有技术说明

肿瘤侵入和转移定义为肿瘤细胞从原发性肿瘤向全身增生发展，其最终导致病人死亡。从原发性恶性肿瘤(绝大多数为内皮)分离的癌细胞穿透将癌细胞与其它组织分隔的基膜。由于一些透过细胞不及能侵入内皮而且能侵入包围血管的基膜，所以它们能自由地通过血管迁移并最终在毛细血管上定居下来。如果癌细胞再次穿透毛细血管，则它们能形成继发性肿瘤。传播和侵入后从原发性肿瘤转变为继发性肿瘤的可能性是千分之一以下(参见：Erkki R.，Scientific American，257∶72-77(1996))。

细胞和胞外基质(ECM)的相互作用对肿瘤侵入和转移是需要的。在转移过程中，肿瘤细胞诱导内皮细胞死亡，导致基膜暴露，使得肿瘤细胞更容易粘附在外围基质中的ECM蛋白上(参见：Hynes，R.O.，Cell，48∶549(1987))。这些底物蛋白通过与细胞表面受体结合促进了细胞粘着，受体包括整联蛋白家族。

依据结构，每个整联蛋白都是一个由α亚基和β亚基通过非共价结合形成的异二聚体。有报道说β1亚族在细胞-细胞直接相互作用以及在作为主要接触介质的细胞-ECM底物粘附中发挥了作用(参见：Larjava，H.等，J.Cell.Biol.，110∶803-815(1990))。分布在白细胞中的β2亚族包括细胞表面受体，其介导了细胞-细胞相互作用。β3亚族包括玻连蛋白受体以及血小板糖蛋白IIb/IIIa复合体，可能在肿瘤侵入和肿瘤由良性发展为恶性的过程中起作用(参见：Albelda，S.M.等，Cancer Res.，50∶6757-6764(1990))。

整联蛋白受体复合体横向跨越了细胞的细胞膜，在细胞骨架网络与胞外基质的连接中发挥作用。核心序列与细胞粘着分子样纤维蛋白原相同，玻连蛋白和层粘连蛋白已知对细胞粘着、扩散和整合负责。顺便说一句，这还暗示着癌的启动和转移与整联蛋白的作用密切相关(参见：Giancotti，F.G.和Rouslahti，E.，Cell，60∶849-859(1990)；Hynes，R.O.，Cell，69∶11-25(1992)；Nip，J.等，J.Clin.Invest.，96∶2096-2103(1995))。纤连蛋白受体α5β1的过量表达已知减少了CHO(中国仓鼠卵巢)中的突变表型以及降低了已突变为ras的啮齿动物细胞中整联蛋白α5β1的表达水平(参见：Plantefaben，L C.和Hynes，R.O.，Cell，56∶281-290(1989))。已有报道超级纤连蛋白(一种纤连蛋白聚合物)预防癌启动和转移(参见：Pasqualini，R.等，Nature Medicine，2∶1197-1203(1996))。

整联蛋白αVβ3能用作大多数恶性肿瘤细胞的标记，其显示了整联蛋白在人恶性黑素瘤的发展中的功用(参见：Albelda，S.M.等，CancerRes.，50∶6757-6764(1990))。整联蛋白αV基因的表达和粘着表型与体内人黑素瘤增生具有直接的相关性(参见：Felding-Habermann，J.Clin.Invest.，89∶2018-2022(1992))。

同时，血管发生是从现成血管萌发新血管从而形成新血管的过程(参见：Folkman，J.和D′Amore，P.A.，Cell，87∶1153-1155(1996))。血管发生在发育、伤口愈合和炎症过程中出现，其在肿瘤生长中是必需过程。细胞粘着分子调节平滑肌细胞和毛细管内皮细胞中的血管发生(参见：Nguyen，M.等，Nature，365∶267(1993))。

肿瘤血管发生量由介于刺激和抑制调节剂间的平衡变化确定。与此相关，血管发生的两个细胞因子依赖途径已经存在并由截然不同的血管细胞整联蛋白αVβ3和αVβ5相区别。这两个整联蛋白在新形成的血管中表达，并在由bFGF(碱性成纤维生长因子)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、VEGF(血管内皮生长因子)以及人肿瘤片段刺激的血管发生中起重要作用(参见：Friedlander，M.等，Science，270∶1500-1502(1995))。αVβ3整联蛋白的活化刺激了存活信号，诱导血管增生和分化，这表明细胞因子的信号传导和整联蛋白受体与血管发生相关(参见：Brooks，P.C.等，Cell，79∶1157-1164(1994))。

解联蛋白(disintegrin)已知是整联蛋白潜在的拮抗剂，为衍生自蛇毒液的小蛋白(参见：Niewiarowski，S.等，Semin.Hematol.，31∶289-300(1994))。大多数解联蛋白含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)或赖氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(KGD)基元，被血小板纤维蛋白原受体α2bβ3所识别。据报道含有RGD序列的解联蛋白抑制整联蛋白-介导的转移细胞与ECM的粘着并最终阻断转移(参见：Trikha，M.等，Cancer Res.，54(8)∶4993-4998(1994))。整联蛋白αVβ3已被鉴定为鸡胚和人细胞中生血管性血管的标记(参见：Brooks，P.C.等，Science，264∶569-571(1994))。整联蛋白αVβ3的单克隆抗体通过诱导新形成血管内皮细胞的编程性细胞死亡破坏了血管发生。合成的肽含有RGD序列，该序列已知可防止整联蛋白αVβ3与配体的结合，所述肽抑制肿瘤诱导的CAM(小鸡尿囊绒膜)血管发生(参见：Brooks，P.C.等，Cell，79∶1157-1164(1994))。此外，血管生成素作为一辅助因子已知帮助内皮细胞粘着和增生，也被合成的RGD肽抑制。最近，有报道蛇毒液衍生的解联蛋白三黄素(Triflavin)抑制TNF-α刺激的血管发生。这些结果为合成的RGD肽和抗αVβ3单克隆抗体这些解联蛋白提供了可被开发成抗癌药物的可能性。

另一方面，蛇毒液已知含有各种蛋白，这些蛋白影响血栓症和止血。由于异常血小板凝集所产生的血栓形成提高了致死血栓症，因此血小板凝集拮抗剂或激动剂可从蛇毒液中分离并鉴定出来。至于凝集机理，血小板凝集受到血小板GP IIb/IIIa受体中纤维蛋白原与糖蛋白结合的调节，已报道纤维蛋白原结合位点精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)的氨基酸序列对纤维蛋白原与GP IIb/IIIa受体的结合至关重要(参见：Rouslagti E.和Pierschbacher M.D.，Science，238∶491-497(1987))。因此，含有所述序列的蛋白质竞争性地抑制了纤维蛋白原与GP IIb/IIIa受体的结合，导致血小板凝集抑制。首先从蛇毒液中分离出的IIb/IIIa受体抑制剂是5kD到9kD的小蛋白(参见：Huang，T.F.等，J.Biol.Chem.，262∶16157-16163(1987))。其次各种血小板凝集抑制剂从蛇毒液中分离出来，其中包括大分子拮抗剂。这些抑制剂富含半胱氨酸，通常通过与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)氨基酸序列相互作用结合在GP IIb/IIIa受体上。此外，蝮蛇毒素(Kistrin)(参见：Alder，M.等，Science，253∶445-448(1991)；Alder，M.等，Biochemistry，32∶282-289(1993))、Flavoridine(参见：Klaus，W.等，J.Mol.Biol.，232∶897-906(1993)；Senn，H.和Klaus，W.，J.Mol.Biol.，232∶907-925(1993))、Albolabrin(参见：Jaseja，M.等，Eur.J.Biochem.，218∶853-860(1993))和锯鳞蝮蝰血抑环肽(参见：Chen，Y.等，Biochemistry，30∶11625-11636(1991)；Cooke，R.M.等，Eur.J.Biochem.，202∶323-328(1991)；Cooke，R.M.等，Protein Eng.，5∶473-477(1992)；Saudek，V.等，Biochemistry，30∶7369-7372(1991)；Dalvit，C.等，Eur.J.Biochem.，202∶315-321(1991))的结构已由核磁共振(NMR)光谱鉴定。并且这些拮抗剂抑制纤维蛋白原与GP IIb/IIIa受体的结合采用动物模型得到证实(参见：Collen，B.S.，J.Clin.Invest.，76∶101-108(1985)；Gold，H.K.等，Circulation，77∶670-677(1988)；Yasuda，T.等，J.Clin.Invest.，81∶1284-1291(1988)；Coller，B.S.等，Blood，68∶783-786(1986)；Hanson，S.R.等，J.Clin.Invest.，81∶149-158(1988))。

有关该点，已经对蝮蛇Agkistrodon halys brevicaudus或Caliginosus的毒液进行了深入的研究。衍生自蝮蛇Agkistrodon halys brevicaudus毒液的Salmosin是一个约7.5KD的蛋白，已建议作为有效的血小板凝集抑制剂(参见：韩国专利号142606)。然而由于与其它蛇比较黑眉蝮蛇很稀少，所以对其毒液了解不多。黑眉蝮蛇毒液有效的毒性和高的致死率可能和出血密切相关，基于上述假设获得了本发明。

发明概述

本发明人研究了韩国蛇黑眉蝮蛇毒液中有蛋白存在，该蛋白能作为血小板凝集抑制剂发挥作用，并因此发现了一种新型蛋白即黑眉素。然后将含有黑眉素cDNA的重组表达载体转化微生物，并从酵母细胞中大规模生产重组黑眉素。此外，本发明人发现重组黑眉素具有抗血小板凝集和血管发生的抑制活性，血管发生对肿瘤转移和增生是必要的，而对正常内皮细胞增生无任何副作用，这确信所述蛋白能开发成一种抗癌剂。

因此本发明的第一个目的是提供衍生自韩国蛇黑眉蝮蛇毒液的黑眉素。

本发明的第二个目的是提供编码黑眉素的cDNA。

本发明的第三个目的是提供从cDNA推导出的黑眉素的氨基酸序列。

本发明的第四个目的是提供重组表达载体，其在酵母细胞中生产黑眉素。

本发明的第五个目的是提供重组表达载体转化的重组微生物。

本发明的第六个目的是提供从转化的微生物中制备重组黑眉素的方法。

本发明的第七个目的是提供包含黑眉素的抗血小板凝集剂。

本发明的第八个目的是提供包含黑眉素的抗肿瘤剂。

具体而言，本发明涉及如SEQ ID NO：2的核苷酸序列所示的cDNA，其编码黑眉素，一种衍生自黑眉蝮蛇毒液的蛋白。

本发明涉及如SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示的黑眉素，其衍生自上述SEQ ID NO：2核苷酸序列所示的cDNA。

本发明涉及一种制备黑眉素的方法，其包括下列步骤：

(i)凝胶过滤从黑眉蝮蛇收集到的毒液以获得活性级分，所述活性级分含有分子量范围从7kD至10kD的蛋白并且显示对血小板凝集具有抑制作用；和，

(ii)将活性级分应用到高效液相色谱以纯化黑眉素。

本发明涉及一种表达载体pPSAX，其含有SEQ ID NO：2核苷酸序列所示的cDNA。

本发明涉及一种巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)Y/pPSAX(KCCM-10201)，其是将上述的表达载体pPSAX转化到巴斯德毕赤酵母GS115中获得的。

本发明涉及一种制备重组黑眉素的方法，其包括培养微生物以获得重组黑眉素的步骤，所述微生物是经含有SEQ ID NO：2核苷酸序列所示的cDNA的表达载体转化的微生物，其中表达载体优选pPSAX，转化的微生物优选巴斯德毕赤酵母Y/pPSAX(KCCM-10201)，而转化的微生物在pH5.5-6.5、25-35℃条件下培养12-24小时，离心收集并再次在含有0.5-1.5％(v/v)甲醇的培养基上在pH5.5-6.5、25-35℃条件下培养72-120小时，以及对含有经转化微生物的培养物进行疏水柱和高效液相层析以纯化黑眉素。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含黑眉素活性成分及其可药用载体，尤其是抗血小板剂和抗肿瘤剂。

附图简述

本发明的上述、其它目的和特征将从下列说明书及其附图中变得清楚，其中：

图1表示与那些已知的血小板凝集抑制剂比较黑眉素的抑制活性。

图2是重组黑眉素表达载体pPSAX的基因图谱。

图3表示与Salmosin比较重组黑眉素对HUVEC生长的作用。

图4a表示抗-αVβ3单克隆抗体、GRGDSP、GRGETP和重组黑眉素对玻连蛋白与HUVEC结合的影响。

图4b表示抗-αVβ3单克隆抗体、GRGDSP、GRGETP和重组黑眉素对黑眉素与HUVEC结合的影响。

图5a表示bFGF刺激的CAM(小鸡尿囊绒膜)血管发生。

图5b表示重组黑眉素对CAM血管发生的影响。

图6a表示没有路易斯肺癌细胞的正常肺组织。

图6b表示用路易斯肺癌细胞注射的肺组织和用PBS处理的对照肺组织。

图6c表示用路易斯肺癌细胞注射的肺组织和用重组黑眉素处理的肺组织。

发明详述

本发明人从韩国蛇黑眉蝮蛇毒液中分离出黑眉素，并克隆出编码黑眉素的cDNA、包含该cDNA的重组表达载体以及用该重组表达载体转化的重组微生物，并通过培养转化子生产重组黑眉素。

从黑眉蝮蛇分离黑眉素的方法以及用于制备重组黑眉素的方法以下文更详细说明。

收集黑眉蝮蛇毒液并采用凝胶过滤柱和反相HPLC纯化从而获得具有血小板凝集抑制活性的蛋白。该蛋白氨基酸序列的测定揭示出这是个新型蛋白并命名为黑眉素。本发明人从衍生自黑眉蝮蛇毒液的cDNA文库中克隆了编码黑眉素的cDNA。该黑眉素cDNA设计为含有Xho I限制性位点和在N端区域蛋白酶KEX2识别位点，并在表达载体pPIC9(8.0kb)α-因子分泌信号蛋白的C末端区域引入EcoR I/XhoI位点。编码黑眉素的该表达载体命名为pPSAX。该表达载体可转化到毕赤属(Pichia sp.)、汉逊属(Hansenula sp.)和酵母属(Saccharomycessp.)的酵母细胞中，优选毕赤属如巴斯德毕赤酵母GS115、SMD1168和KM71。

将构建的pPSAX转化到巴斯德毕赤酵母GS115，并将转化细胞命名为“巴斯德毕赤酵母Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)”，于2000年7月21日存放在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM，Hongie-1-dong 361-221，Seodaemun-gu，Seoul，Korea)，保藏号为KCCM-10201。

重组黑眉素的制备方法包括培养转化的微生物以获得重组黑眉素步骤：将转化细胞接种到甘油基础培养基中，培养至1.0 OD600单位，离心收集并悬浮在甲醇基础培养基中补料分批培养。甘油基础培养基(pH6.0)含有0.5-1.5％的酵母提取物或蛋白胨作氮源、0.5-2.5％的甘油、右旋糖或葡萄糖作碳源以及微量生物素。甲醇基础培养基为甘油基础培养基和0.1-1.0％(v/v)，优选0.3-0.8％(v/v)，更优选0.5％(v/v)的甲醇作碳源。细胞在甘油基础培养基中培养过程中，温度条件为25-35℃，优选28-32℃，更优选30℃，连续培养12-24小时，优选培养16-20小时，更优选18小时。细胞在甲醇基础培养基中培养过程中，温度条件为25-35℃，优选28-32℃，更优选30℃，连续培养72-120小时，优选培养84-108小时，更优选96小时。

对于重组黑眉素的纯化，从细胞肉汤通过离心获得的上清液施加到疏水柱和HPLC上，这里疏水柱装填苯基琼脂糖树脂并优选用0.5-2M的硫酸铵溶液洗脱，而HPLC采用Source 30 RPC柱并优选用0.01-0.2％(v/v)TFA的乙腈溶液洗脱。

将重组黑眉素的血小板凝集抑制活性与已知的血小板凝集抑制剂重组Salmosin比较。结果显示重组黑眉素对血小板凝集的抑制活性与重组Salmosin相似。此外，在酵母细胞内表达的情况下，黑眉素的表达效率优于Salmosin。将重组黑眉素的氨基酸序列与Salmosin比较，可确认两个蛋白第49位氨基酸的差异带来了两个蛋白不同的表达方式和效率。由于重组Salmosin第48位和第49位含有精氨酸，其容易受到酵母中存在的信号肽酶的破坏，该酶识别赖氨酸和精氨酸氨基酸序列，而重组黑眉素第49位为甲硫氨酸则很少受到同种酶的攻击。因此，可以理解重组黑眉素中的第49位氨基酸在提高表达效率和稳定性方面发挥了重要作用。

为了研究黑眉素是否抑制肿瘤转移，黑眉素对血管发生的作用由HUVEC(人脐静脉内皮细胞)分析和CAM(小鸡尿囊绒膜)分析测定，其已发展成用于研究血管发生的模型系统。结果显示黑眉素抑制由肿瘤诱导的血管发生。黑眉素抑制HUMEC增生是由于黑眉素与玻连蛋白受体的直接作用，玻连蛋白受体是位于HUVEC表面上的αVβ3整联蛋白。已知解联蛋白预防肿瘤细胞与内皮细胞的结合，导致抑制转移肿瘤形成集落。但对是否抑制已经侵入的转移肿瘤生长知之甚少。在这方面，对于黑眉素对转移肿瘤生长的作用进行了研究，揭示出黑眉素有效抑制转移肿瘤生长而没有细胞毒性。

本发明以下列实施例进一步说明，这些实施例不应看作是限制本

发明的范围。

实施例1：黑眉素的纯化

为从黑眉蝮蛇的毒液中分离出黑眉素，302.4mg的粗制蛇毒液加到已用PBS缓冲液平衡过的葡聚糖G-75凝胶过滤柱(1.8×100cm)上，以流速20ml/小时分级分离。黑眉素的活性由血小板凝集抑制分析测定：将从400ml人血中获得的富含血小板的浓血浆(PRP)稀释到浓度为300,000个血小板/μl。将稀释的PRP(450μl)和50μl的PBS混合然后在凝集器(aggregometer)(Chromo-Log，美国)中37℃培养3分钟。将胶原质(2nM)加入到PRP溶液中诱导血小板凝集，然后测定光透射的差异。

活性级分显示对血小板凝集具有抑制作用，含有在Native-PAGE胶中分子量范围从7kD到10kD的蛋白质。将活性级分集中加入到用含0.1％(v/v)TFA的蒸馏水平衡过的反相HPLC(C18)柱(7.8×300mm)中，用含0.1％(v/v)TFA的5-45％乙腈线性梯度洗脱。黑眉素在21％乙腈点洗脱下来，纯化产率为0.2％。

实施例2：黑眉素的氨基酸序列分析

为分析黑眉素的氨基酸序列，纯化的黑眉素在SDS-PAGE凝胶上还原条件下电泳并电印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biorad，美国)上。黑眉素N端氨基酸序列由全自动蛋白序列分析仪测定为GEECDCGAPANP(SEQ ID NO：9)。

实施例3：质谱仪测定黑眉素的分子量

采用质谱仪(Kratos Kompact Mold H，Kratos Analytical，Manchester，英国)测定黑眉素的分子量有三种形式：7444、7515和7647 Da，这归因于三种同种型，除‘GEE’外，还存在含有N端序列‘EAGEE’和‘AGEE’的同种型。

实施例4：编码黑眉素的DNA序列测定

为克隆黑眉素cDNA，mRNA使用寡脱氧胸苷酸纤维素从黑眉蝮蛇毒腺中抽提出来。应用从毒腺中获得的mRNA作模板以及寡脱氧胸苷酸引物和反转录酶构建cDNA文库。然后5′引物设计演绎自N端序列，其为5′-GGNGARGARTGYGAYTGYGG-3′(SEQ ID NO：3)：引物1。3′引物设计演绎自C端序列，在亚克隆过程中测定，其为5′-GGCATGGAAGGGATTTCTGG-3′(SEQ ID NO：4)：引物2。使用5′引物、3′引物和合成的毒腺cDNA文库作模板进行聚合酶链反应(PCR)。220bp的PCR产物在琼脂糖凝胶电泳上分离出来，并亚克隆到pGEM-T载体(Promega，美国)中用于分析编码黑眉素的DNA序列(SEQ ID NO：2)。黑眉素的总氨基酸序列(SEQ ID NO：1)演绎自克隆的cDNA序列。

实施例5：黑眉素的抑制作用与具有血小板凝集抑制活性的已知肽比较

为了将黑眉素的抑制作用与其它具有血小板凝集抑制活性的已知肽进行比较，如Salmosin(参见：韩国专利号142606，SEQ ID NO：10)和GRGDSP(SEQ ID NO：7)，血小板凝集抑制分析按下列进行：将225μl富含人血小板的血浆(300,000个血小板/升)与25μl PBS中血小板凝集抑制肽溶液混合，然后在凝集器(Chromo-Log，美国)中25℃培养5分钟。将ADP加入到每个PRP溶液中诱导血小板凝集，分别测定浊度(参见：图1)。图1中，(●)代表黑眉素血小板凝集抑制的程度；(○)代表Salmosin(SEQ ID NO：10)血小板凝集抑制的程度；以及(■)代表GRGDSP(SEQ ID NO：7)血小板凝集抑制的程度。如图1所示，黑眉素IC₅₀值为179nM，而对比Salmosin为173nM，黑眉素抑制效果比GRGDSP肽强1000倍。

实施例6：黑眉素DNA的克隆

使用实施例4制备的含有黑眉素cDNA的质粒为模板以及下列两个引物进行PCR(Robocycler^TM，Stratagene，美国)：

N端引物，含有Xho I限制位点和蛋白酶KEX2识别位点，5′-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCCGGAGAAGAATGT-3′(SEQ IDNO：5)。

C端引物，含有EcoR I限制位点和两个终止密码子，5′-CGGAATTCTCATTAGGCATGGAAGGGA-3′(SEQ ID NO：6)。

PCR进行30个循环，每个循环分别是94℃、1分钟(变性)，55℃、1分钟(退火)以及72℃、1分钟(聚合)。PCR产物大约250bp的DNA片段通过与T4 DNA连接酶克隆到pBluescriptKS(2.9kb，Stratagene，美国)中构建重组质粒。重组质粒用于转化E.coli XL-1Blue。转化的E.coli在含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB(LuriaBotani)平板上培养并挑选出白色菌落。从白色菌落中抽提的质粒使用限制性酶切图谱分析和DNA序列分析(ALF system，AmershamPharmacia Biotech，美国)进行研究，并因此证实通过PCR产生的250bp的DNA片段是黑眉素cDNA。将质粒EcoR I/Xho I片段克隆到表达载体pPIC9(8.0kb)的α-因子分泌信号蛋白的C端区域，生成包含编码黑眉素cDNA的表达载体pPSAX(8.3kb)(参见：图2)。

pPSAX以SalI消化产生线性DNA片段并溶解在TE缓冲液中，浓度为0.5μg/μl，然后与80μl的巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞(Invitrogen，美国)混合，采用电穿孔器(Bio-Rad Gene Pulser，美国)和1.5kV条件，以进行转化。转化细胞涂抹在缺乏组氨酸的琼脂板上30℃培养3天。将挑选的菌落接种到1升甘油基础培养基中(100mM磷酸钠pH6.0、酵母氮源1.34％、生物素4×10⁵％、甘油1％)，30℃培养直至OD₆₀₀达到1.0水平。在培养结束后，3000×g离心收集细胞，并重悬浮于甲醇基础培养基中(含有100mM磷酸钠pH6.0、酵母氮源1.34％、生物素4×10^-5％、甲醇0.5％)。将这些细胞置于30℃生长并诱导表达重组黑眉素。间隔24小时加入0.5％甲醇进一步培养细胞96小时，并证实培养期间培养基中有黑眉素积累。含有黑眉素表达载体pPSAX的转化细胞命名“巴斯德毕赤酵母Y/pPSAX(Pichia pastoris Y/pPSAX)”，于2000年7月21日存放在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(KCCM，Hongie-1-dong 361-221，Seodaemun-gu，Seoul，Korea)，保藏号为KCCM-10201。

对于黑眉素的纯化，将从细胞肉汤中通过5000×g离心获得的上清液加到经1.5M硫酸铵溶液平衡过的1.3×20cm苯基琼脂糖柱(Bio-Rad，美国)上，用1M硫酸铵溶液流速20ml/小时洗脱，获得黑眉素的活性级分。黑眉素活性的测定以实施例l中相似的方式进行。将活性级分铺装到经含0.1％(v/v)TFA的蒸馏水平衡的HPLC柱(source30RPC柱，7.8×300mm)中，并用0-50％(v/v)乙腈以线性梯度洗脱，产生纯黑眉素，纯化产率为107mg/L。

实施例7：重组黑眉素抑制血小板凝集

实施例6获得的重组黑眉素的分析采用实施例1所描述的血小板凝集抑制方法，并分别与实施例1中获得的野生型黑眉素和GRGDSP(SEQ ID NO：7)进行比较(参见：表1)。

如下表1所显示，重组黑眉素表现了与野生型黑眉素相当的血小板凝集抑制活性。

表1：由血小板凝集抑制分析测定的IC₅₀

抑制剂	IC50(nM)
		野生型黑眉素	136
重组黑眉素	139
		GRGDSP(SEQ ID NO：7)	270×103

实施例8：黑眉素抗血小板凝集活性

当胶原质和肾上腺素的混合物静脉内注射给小鼠时，肺动脉中形成血栓，这导致偏瘫、瞳孔扩大、呼吸困难和惊厥，并最终70％的小鼠不超过5分钟死亡。因此，研究了静脉内注射重组黑眉素是否能降低血栓症症状。

在黑眉素(按0、0.1、0.25和0.5mg/kg分别溶解在0.1ml的PBS中)静脉内注射给ICR小鼠的尾巴中10分钟后，胶原质和肾上腺素的混合物(120μg胶原质和12μg肾上腺素溶解在0.1ml的PBS中)也静脉内注射到ICR小鼠的尾巴中，并测定存活率(参见：表2)。

表2

如表2所示，基于黑眉素处理导致存活率增加的结果，推定黑眉素抑制了由胶原质和肾上腺素诱导的凝结，处理前比处理后具有更有效的抑制活性。

实施例9：重组黑眉素对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的作用

已知当解联蛋白含有RGD序列，RGD序列是重组黑眉素的一部分(氨基酸序列49-51)，可抑制bFGF刺激的内皮细胞生长。为研究含有RGD序列的重组黑眉素是否抑制内皮细胞增生，采用HUVEC进行增生抑制分析。黑眉素的活性与Salmosin(SEQ ID NO：10)进行比较，Salmosin已知抑制bFGF刺激的内皮细胞增生。

将HUVEC在用明胶包被的24孔微量培养板中5％的CO₂环境下37℃培养24小时。在培养基用0.25ml含有5％胎牛血清的DMEM替换后，分别以浓度0、20和30μg/ml加入实施例6获得的重组黑眉素和Salmosin。然后，细胞进一步培养20分钟并用lng/ml的bFGF溶液处理。培养72小时后，细胞用胰蛋白酶消化并计数测定细胞存活率(参见：图3)。如图3所示，黑眉素以与Salmosin相似的剂量依赖方式抑制HUVEC生长。

实施例10：黑眉素抑制HUVEC粘着

为证实黑眉素抑制HUVEC增生是由于黑眉素与玻连蛋白受体的直接作用，玻连蛋白受体为αVβ3整联蛋白，位于HUVEC表面上，研究黑眉素是否阻止HUVEC与玻连蛋白包被的96孔板结合。

96孔板用溶解在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的从实施例6获得的重组黑眉素(1μg/孔)以及玻连蛋白(0.5μg/孔)4℃包被16小时。洗涤板后，加入10mg/ml热处理的牛血清白蛋白(BSA)封闭未负载的蛋白结合位点。将板培养1小时并用PBS洗涤。HUVEC用胰蛋白酶消化并用PBS洗三次，然后重悬浮在无血清的DMEM中。将5×10⁴个细胞与抗αVβ₃单克隆抗体、合成的RGD肽GRGDSP(SEQ IDNO：7)、合成的RGE肽GRGETP(SEQ ID NO：8)和黑眉素混合，37℃预培养20分钟。然后将混合物加入到黑眉素和玻连蛋白包被的96孔板的孔中。5％CO₂环境下37℃培养1小时后，用PBS洗涤板去除未结合的细胞，并将结合细胞固定再用考马丝蓝染色。在540nm处测定孔的吸光度从而计算相对细胞数(参见：图4a和4b)。

如图4a和4b所示，bFGF刺激的HUVEC和GRGDSP(SEQ IDNO：7)、黑眉素和抗αVβ₃单克隆抗体的预培养可防止HUVEC同玻连蛋白(参见：图4a)和黑眉素(参见：图4b)的粘着，这表明黑眉素通过与HUVEC表面上的αVβ₃整联蛋白结合抑制了整联蛋白介导的细胞粘着。

实施例11：小鸡尿囊绒膜(CAM)分析黑眉素对血管发生的影响

进行体内模拟模型小鸡尿囊绒膜(CAM)分析，以测定黑眉素对bFGF刺激的血管发生的影响。小心打碎受精3天的鸡蛋外壳部分，并用透明带密封，在60％湿度环境下37℃培养10天。然后将bFGF应用到单个胚胎(6ng/胚胎)的小鸡尿囊绒膜(CAM)中诱导血管发生。进一步培养24小时，PBS作为阴性对照和从实施例6中获得的5μg重组黑眉素分别应用到CAM中。处理后72小时，观察胚胎血管(参见：图5a和图5b)。如图5a和5b所示，PBS未显示效果(参见：图5a)，而黑眉素对血管发生具有抑制作用(参见：图5b)。

实施例12：黑眉素对转移瘤生长的抑制作用

解联蛋白通过阻止肿瘤细胞与内皮细胞的粘着抑制肺肿瘤群落的形成。然而，从没有报道解联蛋白抑制转移瘤的启动。因此研究了黑眉素是否对转移瘤生长有效果。

1×10⁶个路易斯肺癌细胞(购自美国典型培养物保藏中心ATCC，Rockville，Md，美国)静脉内注射8周龄的雄性C57BL/6小鼠(Charlesriver，Japan)的尾巴中。注射后4天，将从实施例6获得的重组黑眉素以1.25mg/kg/天的量(每天一次)通过静脉内注射周期性地施用给小鼠。经过4周的周期性治疗后，将携带肿瘤的小鼠处死，使用立体显微镜给肿瘤群落计数。结果清楚地表明黑眉素有效地抑制了转移瘤生长(参见：表3)。

表3：黑眉素抑制转移路易斯肺癌生长

黑眉素(mg/kg小鼠)	测试小鼠数	平均群落数	抑制率(％)
				0	4	15±6	0
1.25	4	0.7±0.6	95

黑眉素抑制转移瘤生长归因于黑眉素的的抗血管发生效果，通过阻断对血管发生必要的αVβ3整联蛋白功用，其有效地抑制bFGF刺激的BCE细胞增生。此外，黑眉素对测试小鼠未显示毒性。

此外，为观察黑眉素对转移肺癌的直接作用，进行了组织化学的研究。将携带肿瘤的肺组织依据常规已知的方法固定在石蜡上，接着用布安氏溶液处理4小时。4μm厚的组织切片以胰蛋白酶37℃渗透10分钟，然后用PBS洗涤。组织切片用苏木精和曙红染色，然后封固(参见：图6a、6b和6c)。图6a表示没有路易斯肺癌细胞的肺组织；图6b表示将路易斯肺癌细胞植入的肺组织然后用PBS处理；和图6c表示将路易斯肺癌细胞植入的肺组织然后用黑眉素处理。如图6b和6c显示，在用PBS处理的对照组中观察到明显的转移瘤生长(参见：图6b)，而在施用黑眉素的组中未观察到(参见：图6c)。如上所说明，认定黑眉素处理的小鼠中转移瘤生长的抑制是由于黑眉素阻断了血管发生，而血管发生对继发性肿瘤生长是必要的。

给药和有效量

本发明的药物组合物包含黑眉素的活性成分和可药用载体，可以注射形式给药。该注射形式可进一步包含灭菌的等渗水溶液或悬浮液，以及可药用载体涵盖防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐或缓冲液。尽管黑眉素的有效量依赖病人的年龄和体重以及病情进展是可变的，但用于治疗血栓症时肠胃外给药每剂量优选20-52mg/60kg/天，而用于治疗癌症时每剂量为30-120mg/60kg/天，其可根据本领域专业技术人员的经验因人而异。

急性毒性

为测定黑眉素作为抗血小板凝集剂和抗肿瘤剂的急性毒性，将黑眉素皮下注射到雄性C57BL/6小鼠中，连续7天对死小鼠计数以测定LD₅₀。结果LD₅₀测定为约1100mg/kg，显示包含黑眉素的抗血小板凝集剂和抗肿瘤剂在有效量的范围内是足够安全的。

如上清晰地说明和显示，本发明提供了黑眉素，为一种衍生自韩国蛇黑眉蝮蛇毒液的蛋白质，还提供了制备黑眉素的方法以及包含黑眉素活性成分的抗血小板凝集剂和抗肿瘤剂。本发明从黑眉蝮蛇的毒液中纯化了黑眉素，克隆了编码黑眉素的cDNA，构建了包含cDNA的重组表达载体以及构建了用表达黑眉素的该重组表达载体转化的重组微生物，和通过培养重组微生物制备了黑眉素。

黑眉素有效抑制了肿瘤细胞的血小板凝集和血管发生，这使得其实际应用为抗血小板剂和抗肿瘤剂成为可能。

尽管本发明优选的实施方案为说明目的已经公开，但那些本领域的专业技术人员将理解各种修饰、添加和替代都是可能的，而不会背离如权利要求书所描述的本发明的范围和精神。

                   有关保藏的微生物或其它生物材料的说明

                            (PCT细则13之二)

A.下列标注是关于本说明书第 8页第 37行到第 9页第 6行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
	B.保藏物的识别                            另外的保藏物在另外的纸页上标明口
保藏单位的名称韩国微生物保藏中心(KCCM)
	保藏单位的地址(包括邮编和国别)韩国微生物保藏中心(KCCM)361-221，Yurim B/D，Hongje-1-dong，Seodaemon-gu汉城120-091，韩国
保藏日                                保藏编号2000年7月21日                                 KCCM-10201
	C.其它说明(如不适用，则为空白)                    此项信息接续在另附的纸页上□
	D.所做说明针对的指定国(如果所做的说明并不是针对所有指定国的话)
	E.说明的另外附送(如不适用，则为空白)
下列说明将随后提交给国际局(请具体指出所述说明的一般性质，例如，“保藏编号”)

仅供受理局使用
	□此页随国际申请一同收到
签字官员：

仅供国际局使用
	□此页由国际局于  日收到
签字官员：

表PCT/RO/134(1998年7月)

                           序列表

<110>郑光会(Kwang-Hoe CHUNG)

     金斗植(Doo-Sik KIM)

<120>衍生自黑眉蝮蛇的新型蛋白以及制备该蛋白的方法(Novel Protein

     Derived from Agkistrodon saxatilis emelianov and Process for

     Preparing the Same)

<160>10

<170>KOPATIN 1.5

<210>1

<211>71

<212>PRT

<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)

<400>1

 Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro Cys Cys

  1               5                  10

 Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Pro Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

 15                  20                  25                  30

 Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg

                 35                  40                  45

 Met Ala Arg Gly Asp Asp Met Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala

             50                  55                  60

 Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala

         65                  70

 <210>2

<211>213

<212>DNA

<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)

<400>2

ggagaagaat gtgactgtgg cgctcctgca aatccgtgct gcgatgctgc aacctgtaaa 60

ctgagaccag gggcgcagtg tgcagaagga ctgtgttgtg accagtgcag atttatgaaa 120

gaaggaacaa tatgccggat ggcaaggggt gatgacatgg atgattactg caatggcata 180

tctgctggct gtcccagaaa tcccttccat gcc                              213

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

 ggngargart gygaytgygg                                            20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ggcatggaag ggatttctgg                                             20

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

ccgctcgaga aaagagaggc cggagaagaa tgt                              33

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

 cggaattctc attaggcatg gaaggga                                    27

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>寡肽

<400>7

Gly Arg Gly Asp Ser Pro

 1             5

<210>8

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>寡肽

<400>8

Gly Arg Gly Glu Thr Pro

 1             5

<210>9

<211>12

<212>PRT

<213>黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)

<400>9

Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ala Pro Ala Asn Pro

 1             5                10

<210>10

<211>73

<212>PRT

<213>Agkistrodon halys brevicaudus

<400>10

Glu Ala Gly Glu Glu Cys Asp Cys Gly Ser Pro Gly Asn Pro Cys Cys

 1             5                10              15

Asp Ala Ala Thr Cys Lys Leu Arg Gln Gly Ala Gln Cys Ala Glu Gly

           20                25              30

Leu Cys Cys Asp Gln Cys Arg Phe Met Lys Glu Gly Thr Ile Cys Arg

        35                40              45

Arg Ala Arg Gly Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Cys Asn Gly Ile Ser Ala

    50                55                60

Gly Cys Pro Arg Asn Pro Phe His Ala

65                70

Claims (11)

1.如SEQ ID NO：2的核苷酸序列所示的cDNA，其编码黑眉素，一种衍生自黑眉蝮蛇(Agkistrodon saxatilis emelianov)毒液的蛋白。

2.如SEQ ID NO：1的氨基酸序列所示的黑眉素，其衍生自权利要求1的cDNA。

3.一种制备黑眉素的方法，其包括下列步骤：

(i)凝胶过滤从黑眉蝮蛇收集到的毒液以获得活性级分，所述活性级分含有分子量范围从7kD至10kD的蛋白并且显示对血小板凝集具有抑制作用；和，

(ii)将活性级分应用到高效液相色谱以纯化黑眉素。

4.一种表达载体pPSAX，其含有权利要求1的cDNA。

5.保藏编号为KCCM-10201的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoria)Y/pPSAX，其由将权利要求4的表达载体pPSAX转化到巴斯德毕赤酵母GS115中获得。

6.一种制备重组黑眉素的方法，其包括培养微生物以获得重组黑眉素的步骤，所述微生物是经含有权利要求1的cDNA的表达载体转化的微生物。

7.权利要求6的制备重组黑眉素的方法，其中表达载体是pPSAX。

8.权利要求6的制备重组黑眉素的方法，其中转化的微生物是保藏编号为KCCM-10201的巴斯德毕赤酵母Y/pPSAX。

9.权利要求8的制备重组黑眉素的方法，其中转化的微生物在pH5.5-6.5、25-35℃条件下培养12-24小时，离心收集并再次在含有0.5-1.5％(v/v)甲醇的培养基上在pH5.5-6.5、25-35℃条件下培养72-120小时。

10.权利要求8的制备重组黑眉素的方法，其中对含有经转化微生物的培养物进行疏水柱和高效液相层析以纯化黑眉素。

11.一种药物组合物，其包含黑眉素活性成分及其可药用载体。

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