KR20060105054A - 거미줄 단백질을 포함하는 견사 및 상기 견사를 생산하는누에 - Google Patents

거미줄 단백질을 포함하는 견사 및 상기 견사를 생산하는누에 Download PDF

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료따 아사오까
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가쯔시게 야마다
죤 필립 오브라이언
스테판 알. 파네스톡
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도레이 가부시끼가이샤
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Abstract

트랜스포존의 기능을 이용하는 등의 수단에 의해, 누에 피브로인 H쇄 유전자를 손상시키지 않고, 고강도, 고신장도와 같은 원하는 성질을 갖는 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 유전자 재조합 누에를 이용하여 유전자 재조합 누에가 만드는 견사의 강도 및 신장도를 저하시키지 않고 원하는 성질을 갖는 거미줄 단백질을 유전자 재조합 누에에게 생산시켜 원하는 성질을 갖는 거미줄과 견사의 하이브리드 실크를 생산시킨다.
거미줄 단백질, 유전자 재조합 누에, 피브로인, 트랜스포존, 견사

Description

거미줄 단백질을 포함하는 견사 및 상기 견사를 생산하는 누에{SILK THREAD CONTAINING SPIDER THREAD PROTEIN AND SILK WORM PRODUCING THE SILK THREAD}
본 발명은 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지는 거미줄 단백질을 포함하는 견사, 상기 유전자 재조합 누에, 및 상기 유전자 재조합 누에에 의한 견사의 제조 방법에 관한 것이다.
강도 및 내구성을 손상시키지 않고 경량이면서 부드러움 모두를 겸비한 재료 및 천에 대한 수요는 항상 증가하고 있고, 거미줄이 원하는 많은 특성을 갖는다는 것이 나타나고 있다. 둥근그물을 만드는 종류의 거미는 6개의 다른 종류의 선조직으로부터 실크를 생산할 수 있고, 6개 섬유의 각각은 다른 기계적 특성을 갖는다고 알려져 있다. 대낭상 선(Major amullate gland)과 소낭상 선(Minor amullate gland)으로부터 만들어지는 거미줄(스파이더 실크)은 견인사, 드래그 라인이라 불리고 있다. 견인사는 높은 인장 강도와 높은 신장도를 나타내는 점에서(문헌[Science, 2002년, 제295권, p472-476]), 폭넓은 산업 용도로의 전개가 기대되고 있다(문헌[Nature, 2001년, 제410권, p541-548]). 또한, 편모상 선(Flagelliform gland), 취상 선(Aggregate gland)으로부터 만들어지는 거미줄은 일반적으로 가로실로 되어 점착성과 높은 신장도를 나타낸다(문헌[오오사키 시게요시, 거미줄의 화 학, 유기 합성 화학, (일본), 1985년, 제4권, 제9호, p828-835]).
이와 같이 거미줄은 강철보다 강한 인장 강도를 나타내는 것 및 양모보다도 강한 내굴곡성을 갖는 것이 있으며, 또한 케블러(KEVLAR, 등록상표)보다 큰 에너지 대 브레이크 한계를 특징으로 한다고 알려져 있다. 특히, 견인사는 200 ksi를 초과하는 인장 강도를 가지며, 거의 35％의 내굴곡성을 수반한다. 이들 특징이 부여된다고 하면, 거미줄을 다양한 직물에 적용하기 위한 경량 고강도 섬유로서 사용할 수 있다.
또한, 거미줄은 최고 100 ℃까지 안정하기 때문에 이들 섬유를 사용하여 열주입화 플라스틱을 보강할 수 있다. 이들 단백질은 필름 또는 코팅의 형태로도 가치가 있을 가능성이 있다. 또한, 거미줄은 아미노산을 구성 성분으로 하는 단백질이기도 하여 자연계에서 분해된다는 이점도 겸비하고 있다.
천연 거미줄 단백질로서는 스피드로인 1(spidroin1)(MaSpI)이나 스피드로인 2(spidroin2)(MaSpII)(문헌[Reviews in Molecular Biotechnology, 2000년, 제74호, p105-119]), ADF-3, ADF-4 등이 알려져 있다. 이들 거미줄 단백질이 갖는 특징적인 서열로서 알라닌, 세린, 및 글리신에 의해 대부분이 점유되는 아미노산으로 되어 있으면서 글루타민, 티로신, 로이신, 및 발린과 같은 다른 아미노산을 상당량 갖는 것을 들 수 있다. 스피드로인 1은 반복 서열을 갖고 있고, 반복 단위는 최대 34 아미노산 길이이고, 그리고 엄밀하게는 보존되지 않는다. 이 반복 단위는 2개의 다른 세그먼트, 즉 (i) 5 내지 7 잔기의 폴리알라닌 서열에 의해 대부분이 점유되는 10 아미노산 세그먼트, (ii) 서열 내에서 보존되지만, 단지 많은 반복 단위 중에 복수회의 3 아미노산의 결손을 갖는 24 아미노산 세그먼트로 이루어진다. 후자의 서열은 주로 Gly-Xaa-Gly 모티프로 이루어지고, Xaa는 알라닌, 티로신, 로이신, 또는 글루타민이다. 스피드로인 2도 반복 서열을 가지며, 반복 단위는 최대 51 아미노산 길이이고, 그리고 역시 엄밀하게는 보존되지 않는다. 이 반복 서열은 2개의 다른 세그먼트, 즉 (i) 6 내지 9 잔기의 폴리알라닌 서열에 의해 대부분이 점유되는 세그먼트, (ii) GlyGlyTyrGlyProGly 또는 GlyProGlyGlnGln과 같은 아미노산 서열을 포함하는 세그먼트로 이루어진다.
천연 거미줄 단백질, 특히 견인사의 주요 구성 단백질인 스피드로인 1은 글리신, 세린, 글루타민, 알라닌, 티로신, 로이신, 아르기닌, 이소로이신, 발린을 구성 성분으로 하는 폴리펩티드로 이루어진다고 알려져 있다. 부성분인 스피드로인 2의 서열 중에는 스피드로인 1과 비교하여 프롤린이 많이 포함된다고 알려져 있고, 프롤린은 턴 및 트위스트 구조에 기여한다고 생각되고 있다.
이들 특징을 유지한 인공적으로 합성, 디자인된 유전자로서 각각 DP-1B, DP-2A(문헌 [Reviews in Molecular Biotechnology, 2000년, 제74호, p105-119])이 알려져 있다.
그러나, 거미는 집단으로 사육하는 것이 곤란하여 직접 거미로부터 대량의 실을 제조하는 것은 곤란하다. 또한, 천연 거미줄을 가용화 및 정제하는 것도 또한 곤란하여, 거미줄은 예를 들면 LiSCN, LiClO4, 또는 88％(vol/vol)의 포름산과 같은 매우 가혹한 시약 이외에서는 불용성이다. 일단 용해되더라도, 투석하는 경 우 또는 전형적인 완충액으로 희석하는 경우에 거미줄을 구성하고 있는 거미줄 단백질은 침전된다. 또한, 거미에 의해 만들어지는 거미줄은 거미줄의 종류에 따라 실의 성질이 달라 원하는 성질을 갖는 거미줄을 분리하는 것은 여전히 곤란하다. 이러한 요인에 의해, 상업적으로 유용한 양의 거미줄 단백질을 천연원으로부터 적절한 비용으로 입수하는 것을 불가능하게 하고 있다.
이에, 최근에는 유전자 재조합 기술을 이용하여 몇 개의 생물을 거미줄 단백질을 만들기 위해 개변하는 시도가 이루어지고 있다. 예를 들면, 대장균이나 효모와 같은 미생물에게 거미줄 단백질을 만들도록 시도하거나(문헌[Reviews in Molecular Biotechnology, 2000년, 제74호, p105-119] 및 일본 특허 공표 (평)8-511426호 공보), 담배나 감자와 같은 식물을 이용하는 시도(문헌[Nature, 2001년, 제19권, p 573-577]), 포유류 세포를 이용하는 수법이나, 유전자 재조합 염소를 이용하여 젖 중이나 뇨 중에 생산시키는 수법(일본 특허 공표 제2002-506642호 공보)이 행해지고 있다. 그러나, 이들 유전자 재조합체를 이용한 거미줄 단백질의 생산에서는 생산된 거미줄 단백질을 추출, 정제하고, 인공적으로 방사할 필요가 있고(문헌[Science, 2002년, 제295권, p472-476]), 인공적인 방사에는 시간과 비용이 들고, 각종 용매를 이용함에 따른 환경 부하의 과제도 있다.
그러던 중, 정제 및(또는) 인공적인 방사 공정을 필요로 하지 않고, 거미줄을 구성하는 단백질을 포함하는 섬유를 직접 생산하기 위한 방법으로서 유전자 재조합 누에를 이용한 녹색 형광 단백질과 거미줄 단백질의 융합 단백질을 포함한 견사를 생산하는 수법이 개시되었다(국제 공개 제02/40528호 공보). 이 수법은 누에 알에 전기 천공에 의해 녹색 형광 단백질과 거미줄 단백질을 모방한 단백질의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하고, 상동 재조합에 의해 재조합체를 취득하는 것이다. 그러나, 이 수법으로는 유전자를 재조합하지 않은 누에가 만드는 견사와 비교하여 강도 및 신장도가 저하된 견사밖에 생산할 수 없다.
그 원인으로서, 1. 상동 재조합에 의해 유전자를 도입하기 때문에 누에가 갖는 본래의 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자의 적어도 한쪽이 파괴되고, 2. 재조합체 선발을 위해 녹색 형광 단백질을 융합 단백질로서 발현시킬 필요가 있어 거미줄 단백질의 성질을 손상시킬 가능성이 있고, 3. 디자인된 거미줄 단백질이 고강도, 고신장도와 같은 성질을 가질 수 없는 서열인 등의 가능성을 생각할 수 있다.
본 발명에서는 고강도, 고신장도와 같은 거미줄이 갖는 원하는 성질을 갖는 견사를, 각종 용매를 이용하지 않고, 또한 인공적인 방사 공정을 필요로 하지 않는 수법에 의해 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결할 수 있는 수단을 예의 검토한 결과, 트랜스포존의 기능을 이용함으로써 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 유전자 재조합 누에가 고강도, 고신장도와 같은 원하는 성질을 갖는, 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하는 것을 발견하여 본 발명에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1) 내지 (26)의 발명을 제공하는 것이다.
(1) 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지는, 거미줄 단백질을 포함하는 견사.
(2) 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지고, 견사의 피브로인 H쇄 단백질의 기본적인 구조를 본질적으로 유지하는 것을 특징으로 하는 거미줄 단백질을 포함하는 견사.
(3) 거미줄 단백질이 피브로인 단백질 중에 분산되어 존재하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (1) 또는 (2)에 기재된 견사.
(4) 거미줄 단백질이 피브로인 H쇄 단백질에 포함되는 폴리펩티드와 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(5) 거미줄 단백질이 피브로인 H쇄 단백질의 N 말단 부분과 C 말단 부분 사이에 삽입되어 있고, C 말단 부분에 포함되는 시스테인을 통해 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (4)에 기재된 견사.
(6) 거미줄 단백질의 함량이 0.1 내지 25 중량％인 상기 발명 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(7) 거미줄 단백질의 함량이 1 내지 15 중량％인 상기 발명 (6)에 기재된 견사.
(8) 거미줄 단백질의 함량이 1 내지 10 중량％인 상기 발명 (7)에 기재된 견사.
(9) 거미줄 단백질이 서열 번호 1의 펩티드 또는 서열 번호 1에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 거미줄 단백질의 특성을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(10) 상기 발명 (9)에 기재된 펩티드가 3 내지 30회 반복한 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (9)에 기재된 견사.
(11) 상기 발명 (9)에 기재된 펩티드가 4 내지 16회 반복한 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (10)에 기재된 견사.
(12) 거미줄 단백질이 서열 번호 2의 펩티드 또는 서열 번호 2에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 거미줄 단백질의 특성을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(13) 상기 발명 (12)에 기재된 펩티드가 3 내지 30회 반복한 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (12)에 기재된 견사.
(14) 상기 발명 (12)에 기재된 펩티드가 4 내지 16회 반복한 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (13)에 기재된 견사.
(15) 거미줄 단백질이 상기 발명 (9)에 기재된 펩티드 및 상기 발명 (12)에 기재된 펩티드의 양쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(16) 거미줄 단백질과 융합되는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분이 서열 번호 3의 펩티드 또는 서열 번호 3에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 2 또는 3개의 시스테인을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 발명 (5) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(17) 거미줄 단백질과 융합되는 피브로인 H쇄 단백질의 N 말단 부분이 서열 번호 4의 펩티드 또는 서열 번호 4에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드이며, 상기 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 의한 외래 단백질의 발현을 증강하는 기능을 유지하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 상기 발명 (5) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(18) 거미줄 단백질이 선택 마커가 되는 단백질과 융합하지 않은 상기 발명 (1) 내지 (17) 중 어느 한 항에 기재된 견사.
(19) 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖고, 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자가 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자 이외의 영역에 도입된 상기 발명 (1) 내지 (18) 중 어느 한 항에 기재된 견사를 만드는 유전자 재조합 누에.
(20) 유전자 재조합 누에에서의 거미줄 단백질을 발현시키기 위해 피브로인 H쇄 유전자 프로모터를 갖는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (19)에 기재된 유전자 재조합 누에.
(21) 유전자 재조합 누에에서의 거미줄 단백질을 발현시키기 위해 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 및 그 상류 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (19)에 기재된 유전자 재조합 누에.
(22) 피브로인 H쇄 프로모터 하류에 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론 전장 또는 그 일부·제2 엑손 영역의 일부가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 상기 발명 (20) 또는 (21)에 기재된 유전자 재조합 누에.
(23) 트랜스포존을 이용하는 상기 발명 (19) 내지 (22) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 누에의 제조법.
(24) 트랜스포존이 피기백(piggyBac) 트랜스포존인 것을 특징으로 하는 상기 발명 (23)에 기재된 유전자 재조합 누에의 제조법.
(25) 상기 발명 (19) 내지 (22) 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는 견사의 제조 방법.
(26) 상기 발명 (1) 내지 (18) 중 어느 한 항에 기재된 견사를 이용한 직물.
<발명의 효과>
본 발명에 의해, 강도, 신장도 및(또는) 인성이 향상되는 것과 같은 우수한 특성을 갖는 거미줄 단백질을 포함하는 견사가 얻어졌다. 또한, 상기 견사를 이용한 직물은 그 우수한 특성으로 인해 산업 용도, 예를 들면, 항공, 우주 용도, 피복 제조, 로프, 외과 수술용 봉합사와 같은 소정 종류의 고강도 사용을 위해, 및 이식술(예를 들면, 인공 인대 또는 대동맥용 붕대)용 생물 재료에도 적용할 수 있을 가능성이 있다.
도 1은 HP·DP16·HC, HP·DP12·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC 및 HP·AEX·HC 유전자 구조의 제조 수법을 나타내는 도면이다.
도 2는 HUP·DP8·HC 및 HUP·DP4·HC 유전자 구조의 제조 수법을 나타내는 도면이다.
도 3은 HP·DP8·HC(레인 1 내지 5), HP·DP4·HC(레인 6 내지 10) 유전자 구조를 갖는 유전자 재조합 누에를 랜덤하게 선발하고, 그 게놈을 EcoRI로 제한 효 소 처리한 것에 대하여 거미줄 단백질 유전자 DP를 표지하여 수행한 서던 혼성화의 결과를 나타낸 사진도이다.
도 4는 HP·DP16·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC, HP·AEX·HC, HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC 유전자 구조를 도입한 누에가 만드는 고치를 가용화하여 은 염색 및 항체를 이용한 웨스턴 해석에 의해 분석한 결과를 나타낸 사진도이다.
도 5는 비재조합 누에가 만드는 견사와, HP·DP8·HC 유전자를 도입한 재조합 누에가 만드는 견사의 정련 전 및 정련 후의 상태를 주사 전자 현미경(1500배)에 의해 촬영한 결과를 나타내는 사진도이다.
도 6은 비재조합 누에가 만드는 견사를 샘플로 하여 섬유축 방향으로 절편을 자르고, 거미줄 단백질 DP에 대한 항체를 이용하여 수행한 면역 전자 현미경 관찰 사진의 결과를 나타내는 사진도이다(배율 15000배).
도 7은 HP·DP8·HC 유전자를 도입한 재조합 누에가 만드는 견사를 샘플로 하여, 섬유축 방향으로 절편을 자르고, 거미줄 단백질 DP에 대한 항체를 이용하여 수행한 면역 전자 현미경 관찰 사진의 결과를 나타내는 사진도이다(배율 15000배).
<부호의 설명>
1: 세리신층
2: 피브로인층
3: 거미줄 단백질
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명에서의 그 밖의 용어나 개념은 발명의 실시 형태의 설명이나 실시예 에서 자세히 규정한다. 또한, 본 발명을 실시하기 위해 사용하는 다양한 기술은 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는 공지된 문헌 등에 기초하여 당업자라면 용이하면서 확실하게 실시 가능하다. 예를 들면, 유전자 공학 및 분자 생물학적 기술은 문헌 [Sambrook and Maniatis, Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989]; 및 문헌 [Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y, 1995] 등에 기재되어 있다.
본 발명에서의 견사란 누에 나방(Bombyx mori)에 의해 토사되는 고치를 구성하는 단백질을 주된 주성분으로 하는 섬유를 나타낸다. 바람직하게는 고치로부터 제조된 생사를 나타내고, 더욱 바람직하게는 생사를 정련하여 얻어진 견사를 나타내고, 가장 바람직하게는 2알 이상의 복수의 고치로부터 멀티필라멘트로서 조사된 견사를 나타낸다. 누에가 만드는 견사는 피브로인층과 이를 둘러싼 세리신층으로 구성되어 있다.
본 발명에서의 "거미"란 거미목으로 분류되는 동물, 바람직하게는 조망성의 거미목으로 분류되는 동물을 나타낸다. 더욱 바람직하게는 왕거미 또는 무당거미를 나타낸다.
본 발명에서의 "거미줄"이란 "거미"가 만드는 실, 즉 섬유상 단백질이고, 구체적으로는, 조망성 거미가 만드는 실, 즉 견인사, 테두리실, 계류사, 알주머니싸개실, 가로실, 포획대, 부착반, 안전실 등을 들 수 있지만, 보다 바람직하게는 세로실, 가로실, 테두리실, 견인사를 나타낸다.
본 발명에서의 거미줄 단백질이란 거미줄을 구성하는 단백질 또는 거미줄을 구성하는 단백질의 특징을 갖는 단백질을 말한다. 천연 거미줄 단백질과 완전히 동일 서열일 필요는 없고, 인공적으로 디자인, 합성된 단백질일 수도 있다. 천연 거미줄 단백질은 분자량이 거대하기 때문에 천연 거미줄 단백질을 만드는 유전자도 마찬가지로 거대하다. 효율적으로 취급하기 위해서는 유전자의 단축, 결실, 치환을 행하는 것이 바람직하다. 또한, 천연 거미줄 단백질이 갖는 특징적인 서열을 갖는 인공적인 유사 단백질을 만들도록 설계, 디자인된 인공적인 유전자일 수도 있다.
바람직하게는, DP-1B, DP-2A에 포함되는 적어도 아미노산 5 잔기 이상의 서열을 갖는 단백질을 거미줄 단백질로서 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 거미줄 견인사가 갖는 강도, 신장도와 같은 원하는 성질을 견사에 부여하기 위해서는, 주요 구성 단백질인 스피드로인 1의 아미노산 서열을 모방하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서의 거미줄 단백질은 글리신, 세린, 글루타민, 알라닌, 티로신, 로이신, 아르기닌, 이소로이신, 발린을 구성 성분으로 하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 DP-1B에 의해 코딩되는 서열 번호 1에 기재된 서열, 또는 "거미줄 단백질에 특유한 반복 서열"·"DP-2A의 공통 서열"·"견사 특유의 반복 서열"의 순으로 구성된 서열 번호 2에 기재된 서열을 포함하는 거미줄 단백질이 이용된다.
실질적으로 동등한 기능을 갖는 범위에 있어서의, 서열 번호 1 또는 2 또는 3 또는 4에 기재된 서열에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가를 갖는 것도 포함된다. 즉, 단백질은 다양한 방법에 의해 개변되더라도 그 기본적인 특징을 유지하는 것이 충분히 인식되어 있다. 이는 기본이 되는 폴리펩티드 서열과 비교하여 1개 또는 그 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가와 같은 변이가 존재하지만, 기본이 되는 무변위 서열과 동등한 기능, 즉 원하는 성질을 유지하고 있음을 의미한다.
또한, 유전자 재조합 누에를 이용하여 효율적으로 거미줄 단백질을 만들게 하기 위해서는 누에 견사선에서 발현하는 유전자의 코돈 이용 빈도에 가까운 유전자인 것이 바람직하다. 누에 견사선에서 발현하는 유전자의 예로서는 피브로인 H쇄 유전자, 피브로인 L쇄 유전자, P25 단백질 유전자 등을 들 수 있다. 누에 견사선에서 발현하는 유전자의 코돈 이용 빈도에 근접하도록 개변, 변이시킬 수 있고, 그 수단은 공지되어 있다. 구체적으로는, 단백질을 만드는 유전자를 개변하는 수법이 이용된다. 예를 들면, 랜덤 변이 도입법, 부위 특이적 변이 도입법, 유전자 상동 재조합법, 또는 중합 효소 연쇄 증폭법(PCR)을 단독 또는 적절히 조합하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 아황산수소나트륨을 이용한 화학적인 처리에 의해 시토신 염기를 우라실 염기로 치환하는 방법이나, 망간을 포함하는 반응액 중에서 PCR를 수행하여 DNA 합성시의 뉴클레오티드 조립의 정확성을 낮게 하는 방법, 부위 특이적 변이 도입을 위한 시판되는 각종 키트를 이용할 수도 있다. 예를 들면, 문헌 (Sambrook등 편[Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 제2판] Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, 무라마쯔 마사미편[연구실 메뉴얼 유전자 공학]마루젠 가부시끼가이샤, 1988, 에리히, HE.편[PCR 테크놀로지, DNA 증폭의 원리와 응용]스톡톤 프레스, 1989) 등의 서적에 기재된 방법에 준하거나 또는 이들 방법을 개변하 여 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 거미줄 단백질은 견사 구성 단백질인 피브로인 H쇄에 포함되는 폴리펩티드와 융합되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 거미줄 단백질은 피브로인 H쇄의 C 말단 부분과 융합되어 있다. 특히 바람직하게는, 거미줄 단백질은 피브로인 H쇄의 N 말단 부분과 피브로인 H쇄의 C 말단 부분 사이에 삽입되어 있다. 이와 같이 구성된 거미줄 단백질을 포함하는 융합 단백질은 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분에 포함되는 시스테인을 통해 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합을 형성한다.
본 발명에서 사용되는 거미줄 단백질의 분자량에 대해서는 특별히 제한은 없다. 거미줄이 갖는 원하는 성질을 부여하기 위해서는 분자량은 높은 것이 바람직하지만, 동시에 거미줄 단백질을 만드는 유전자의 취급을 곤란하게 한다. 따라서, 거미줄 단백질은 바람직하게는 분자량 30 kDa 내지 300 kDa의 범위, 더욱 바람직하게는 30 kDa 내지 160 kDa의 범위인 것이 바람직하다.
본 발명의 견사는 거미줄이 갖는 우수한 성질에 의해 개량된 성질을 갖는다. 보다 구체적으로는, 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에가 만드는 견사와 비교하여 높은 인장 강도나 고신장도, 고탄성률이나 신축성이 우수한 점, 내굴곡성, 큰 에너지 대 브레이크 한계, 즉 높은 인성, 점착성, 함수시의 수축성, 내후성이나 내광성이 우수한 점 등에서 선택되는 적어도 하나의 특징을 나타내지만, 이들 모두를 만족시키는 것을 의미하는 것은 아니다. 바람직하게는, 높은 인장 강도나 고신장도, 높은 인성 중에서 선택되는 하나 이상의 성질을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 누에에게 생산시키기 위해 이용하는 프로모터는 특별히 한정되지 않지만, 전사 활성이 높은 것이 바람직하다. 예를 들면, 일본 특허 공개 (평)6-261770이나 일본 특허 공개 (소)62-285787에 기재되어 있는 초파리의 열 쇼크 단백질 유전자의 프로모터나 누에 액틴 유전자의 프로모터(문헌 [Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000]) 등을 들 수 있지만, 피브로인 H쇄 유전자의 프로모터(진뱅크(GenBank) 등록 번호 V00094의 염기 번호 255 내지 574번째, 진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 62118 내지 62437번째), 피브로인 L쇄 유전자의 프로모터(Gene, 100: 151-158: 진뱅크 등록 번호 M76430), 세리신 유전자의 프로모터(진뱅크 등록 번호 AB007831의 염기 번호 599 내지 1656번째) 등 누에 견사선 세포 내에서 높은 전사 촉진 활성을 갖는 프로모터가 바람직하다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 및 그 상류 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 57444 내지 62437번째)를 이용함으로써 높은 전사 촉진이 보인다.
피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분은 프로모터에 의한 외래 단백질의 발현을 증강하는 작용을 갖는 DNA 서열이다. 이 DNA 서열은 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손과 제1 인트론 전장 또는 그 일부 및 제2 엑손의 일부를 포함한다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자의 5' 말단 부분은 서열 번호 4에 기재된 피브로인 H쇄 단백질 N 말단 부분의 폴리펩티드를 코딩한다.
누에의 형질 전환을 위해서는 곤충 세포를 유전자 재조합할 수 있는 곤충용 벡터이면 특별한 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 누에 핵다각체 바이러스 (BmNPV) 벡터나 곤충 유래 DNA형 트랜스포존을 조립한 플라스미드 벡터 등이지만 특히 후자가 바람직하다. 곤충 유래 DNA형 트랜스포존으로서는 피기백(piggyBac), 마리너(mariner)(문헌 [Insect Mol. Biol. 9, 145-155, 2000]), 및 미노스(Minos)(문헌 [Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 2000]) 등이 알려져 있지만, 본 발명에서는 피기백이 바람직하다.
피기백 트랜스포존이란 양단에 13 염기쌍의 역위 서열과, 내부에 약2.1k 염기쌍의 ORF를 갖는 DNA의 전위 인자이다. 본 발명에서 사용되는 피기백 트랜스포존은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 세포주내 트리코플루지아(Trichoplusia in cell line) TN-368, 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) NPV(AcNPV), 갤러리아 멜로니아(Galleria mellonea) NPV(GmMNPV) 유래의 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 세포주내 트리코플루지아 TN-368 유래 피기백의 일부를 갖는 플라스미드 pHA3PIG와 pPIGA3GFP(문헌 [Nature biotechnology 18, 81-84, 2000])를 트랜스포사제(transposase) 단백질을 생산하는 헬퍼 플라스미드로서 사용할 수 있다.
헬퍼 플라스미드에 의해 생산되는 이들 트랜스포존은 누에 세포내에서 전이 활성을 나타내기 때문에, 이들 DNA형 트랜스포존을 기초로 제조한 유전자 도입용 벡터에 의해 누에를 형질 전환시키는 것이 가능하다. 특히 피기백을 기초로 제조한 유전자 도입용 플라스미드 벡터는 누에란에 미량 주입함으로써, 실제로 누에를 형질 전환시키는 데에 성공하였다(문헌 [Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000]).
예를 들면, 피기백의 성질을 이용하여 이하의 방법에 의해 유전자 재조합 누 에를 제조할 수 있다. 우선, 누에 게놈 서열 내에 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자를 삽입한다. 이를 위해서는 타무라 등의 방법(문헌 [Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000])과 동일한 방법에 의해 수행할 수 있다. 즉, 피기백의 한 쌍의 역방향 반복 서열을 적당한 플라스미드 벡터에 조립하고, 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자를 한 쌍의 역방향 반복 서열로 끼우도록 삽입한다. 그리고, 이 유전자 도입용 플라스미드 벡터를 피기백의 트란스포사제 발현 벡터(헬퍼 플라스미드)와 함께 누에란에 미량 주입한다. 이 헬퍼 플라스미드는 피기백의 역방향 반복 서열의 한쪽 또는 양쪽을 결여한, 실질적으로는 피기백의 트란스포사제 유전자 영역만이 조립되어 있는 재조합 플라스미드 벡터이다. 이 헬퍼 플라스미드에 있어서, 트란스포사제를 발현시키기 위한 프로모터는 내재성의 트란스포사제 프로모터를 그대로 이용할 수도 있고, 또는 누에 액틴 프로모터나 초파리 HSP70 프로모터 등을 이용할 수도 있다. 차세대 누에의 스크리닝을 용이하게 하기 위해 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자를 부가한 거미줄 단백질 발현 벡터 내에 동시에 마커 유전자를 조립해 둘 수도 있다. 이 경우, 마커 유전자의 상류에 예를 들면 누에 액틴 프로모터나 초파리 HSP70 프로모터 등의 프로모터 서열을 조립하고, 그 작용에 의해 마커 유전자를 발현시키도록 한다.
거미줄 단백질 발현 벡터를 미량 주입한 누에란으로부터, 부화한 유충(G0 세대)을 사육한다. 이 G0 세대의 누에 중 일부 누에에게는 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 조립되어 있다. 그러나, 이 세대의 누 에에서는 누에 체내의 전체 세포 중 일부분의 세포에만 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 조립되어 있고, 전체 세포에 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 조립된 누에를 얻기 위해서는 G0 누에를 교배하고, 생식 세포를 통해, 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 전달된 유전자 재조합 누에를 얻어야만 한다. 즉, 얻어진 전체 G0 세대의 누에를 비재조합 누에와 교배하거나 또는 G0 누에끼리 교배하여 차세대(G1 세대)의 누에로부터 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에를 선발할 필요가 있다. G1 세대의 누에로부터의 유전자 재조합 누에의 선발은 예를 들면 PCR 법이나 서던 블롯법을 이용하여 수행한다. 또한, 마커 유전자를 조립한 경우에는 그 표현 형질을 이용하여 선발하는 것도 가능하다. 예를 들면, 마커 유전자로서 GFP 등의 형광 단백질 유전자를 이용한 경우에는 G1 세대의 누에란이나 유충에게 여기광을 조사하고, 형광 단백질이 발하는 형광을 검출함으로써 행할 수 있다.
이와 같이 하여 선발된 누에는 그 염색체 내에 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 조립되어 있는 유전자 재조합 누에이다. 또한, 이렇게 해서 얻어진 유전자 재조합 누에는 WO02/40528A1에 기재된 상동 재조합에 의해 얻어진 유전자 재조합 누에와 달리 정상적인 누에 피브로인 H쇄 유전자가 남겨진 채이며, 즉, 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에이다.
본 발명에 있어서, 견사에 포함되는 거미줄 단백질의 함량은 특별히 제한되는 것은 아니고, 중량비로 0.1％ 내지 30％의 범위일 수 있다. 이 때, 누에의 토 사 행동에 의한 섬유화를 방해하지 않는 범위인 것이 바람직하다. 그러나, 30％ 이상의 함량임에 따라 강도가 저하될 가능성이 있다. 이에, 강도 및(또는) 신장도를 유지하면서 거미줄이 갖는 원하는 성질을 부여하기 위해서는 보다 바람직하게는 0.1 내지 25％, 보다 바람직하게는 1 내지 15％, 더욱 바람직하게는 1 내지 10％의 범위로 포함되는 것이 바람직하다.
거미줄 단백질을 중량비 0.1％ 내지 25％의 범위 내에서 포함하는 견사는, 예를 들면 피브로인 H쇄 상류 프로모터·피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론 영역·제2 엑손 영역의 일부(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 57444 내지 63513번째)의 하류, 또는 피브로인 H쇄 프로모터·피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론·제2 엑손 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 62118 내지 63513번째)의 하류에 서열 번호 1로 표시되는 펩티드를 복수회 반복한 펩티드 서열 번호를 코딩한 염기를 연결하고, 또한 그 하류에 피브로인 H쇄 C 말단 영역 유전자·피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 79099 내지 79995번째)을 프레임이 맞도록 연결한 유전자 구조를, XhoI 처리 후 평활화한 pigA3GFP 플라스미드에 연결한다. 이 유전자 도입용 벡터 및 피기백 트란스포사제 단백질을 생산하는 DNA를 포함하는 헬퍼 플라스미드(pHA3PIG)를 각 200 ㎍/ml 포함한 0.5 mM 인산 완충액(pH 7.0)·5 mM KCl 용액을 제조하고, 3 내지 20 nl을 산란 후 4 시간 이내의 누에란에 대하여 마이크로 주입하여 유전자 재조합 누에를 만든다. 이와 같이 제조한 재조합 누에는 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산한다.
이 때, 유전자가 도입된 염색체 상의 위치의 차이로 인해 포함되는 거미줄 단백질의 함량에는 차이가 생긴다.
또한, 도입하는 거미줄 단백질의 펩티드 서열의 반복 횟수에 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 3 내지 30회, 더욱 바람직하게는 4 내지 16회이다.
거미줄 단백질의 함량은 고치를 가용화한 후에 SDS-PAGE에 부치고, 은 염색 키트(다이이치 가가쿠 야쿠힌 가부시끼가이샤 제조)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 거미줄 단백질의 검출을 행하고, 그 결과를 분자 이메이져(바이오래드(BioRad) 사 제조)를 이용하여 시그널 강도를 측정하고, 농도가 알려진 단백질, 예를 들면 고양이 인터페론의 시그널 강도와 비교함으로써 단백질 함량을 측정할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 DNA를 취득하는 방법에 특별히 제한은 없다. 알려진 유전자 정보에 기초하여 PCR법을 이용하여 필요한 유전자 영역을 증폭 취득하는 방법, 알려진 유전자 정보에 기초하여 게놈 라이브러리나 cDNA 라이브러리로부터 상동성을 지표로 하여 스크리닝하는 방법 등을 들 수 있다. 본 발명에서는 이들 유전자는 유전적 다형성이나 변이제 등을 이용한 인위적 변이 처리에 의한 변이형도 포함한다. 유전적 다형성이란 유전자 상의 자연 돌연 변이에 의해 유전자의 염기 서열 번호가 일부 변화된 것을 말한다.
거미줄 단백질을 견사선 세포 밖으로 대량으로 분비시키는 경우, 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분을 거미줄 단백질과 융합시킴으로써 견사 중에 거미줄 단백질을 생산하는 것이 가능해진다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자의 C 말단 부분은 거미줄 단백질의 N 말단측, C 말단측, 거미줄 단백질 중 어느 하나에 존재할 수 있다. 이 부분에는 적어도 시스테인 잔기가 하나 존재하고 있다. 피브로인 H쇄 단백질에서는 피브로인 L쇄와 디술피드 결합으로 결합하는 역할을 갖는 시스테인 잔기는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단으로부터 20번째에 위치하게 된다. 거미줄 단백질과 융합시키는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분의 길이는 피브로인 L쇄와의 디술피드 결합의 형성을 저해하지 않는 한 특별히 제한은 없다.
마찬가지로 거미줄 단백질을 견사선 세포 밖으로 대량으로 분비시키는 경우, 피브로인 H쇄 단백질과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 피브로인 L쇄 단백질을 융합시킴으로써 견사 중에 거미줄 단백질을 생산하는 것도 가능하다. 그러나, 고신장도, 고강도와 같은 원하는 성질을 거미줄 단백질을 포함하는 견사에 부여하기 위해서는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분을 융합시키는 편이 바람직하다.
본 발명에서의 "피브로인 H쇄 단백질에 포함되는 폴리펩티드"란 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분의 폴리펩티드 및(또는) 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손과 제2 엑손의 일부에 코딩되는 폴리펩티드를 나타낸다. 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분의 폴리펩티드로서, 바람직하게는 서열 번호 3에 기재된 폴리펩티드가 이용된다. 또한, 피브로인 H쇄 유전자의 제1 엑손과 제2 엑손의 일부에 코딩되는 폴리펩티드로 서, 바람직하게는 서열 번호 4에 기재된 폴리펩티드가 이용된다. 이 때, 실질적으로 동등한 기능을 갖는 범위에서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가를 갖는 것도 사용할 수 있다.
폴리 A 부가 영역에 대해서도 특별히 제한은 없지만, 피브로인 H쇄, 피브로인 L쇄, 세리신 등 견사선에서 대량으로 발현되고 있는 단백질 유전자의 폴리 A 부가 영역을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명에서의 유전자 재조합 누에란 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자 구조를 갖는 누에를 나타낸다. 재조합체의 선발을 용이하게 할 목적으로, 항생 물질 내성 유전자, 해파리 유래 형광 녹색 단백질 유전자 등 마커 유전자를 조립해 둘 수도 있다.
본 발명에서의 해파리 유래 녹색 형광 단백질(GFP)이란 평면 해파리 유래의 녹색 형광 단백질을 나타내고, 여기광에 의해 녹색 형광을 발하는 것이 특징이다. 형광 강도나 형광 파장이 개량된 유연체를 이용하는 것도 가능하다.
그러나, 거미줄 단백질이 갖는 고강도, 고신장도와 같은 특징을 발휘하기 위해서는, 이러한 선택 마커가 되는 단백질을 코딩하는 유전자와 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자를 프레임이 일련이 되도록 연결하고, 선택 마커가 되는 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 것은 바람직하지 않다. 결정성이 높은 섬유 단백질로서의 성질을 갖는 거미줄 단백질에, 결정성이 낮고 비섬유성의 GFP를 융합시키는 것은 견사의 결정화를 저해하여 고치의 중량 저하, 견사의 강도 저하를 야기할 가능성이 있기 때문이다. 따라서, "거미줄 단백질이 선택 마커가 되는 단백질과 융 합되지 않은"이란 것은 WO02/40528A1(국제 공개 제02/40528호 공보)에 개시되어 있는 실시예와 달리 강도, 신장도 및(또는) 인성을 저하시키지 않기 때문에 중요한 현상이다. WO02/40528A1(국제 공개 제02/40528호 공보)에 기재된 수법에서는 GFP 등의 선택 마커가 되는 단백질과 융합시키는 것이 실질적으로 필수이지만, 본 발명에서는 선택 마커가 되는 단백질을 융합시킬 필요는 없다.
본 발명에서의 "1쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에"란 내재성의 누에 피브로인 H쇄 유전자에 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자나 GFP 등의 형광 단백질 유전자와 같은 외래 유전자가 삽입되어 있지 않고, 정상적인 피브로인 H쇄 유전자를 갖고 있으면서 피브로인 H쇄 유전자 이외의 영역에 누에가 본래 갖고 있지 않은 외래 유전자가 도입된 유전자 재조합 누에를 나타낸다. 바람직하게는, 상동 염색체 상의 동일 유전자 자리에 존재하는 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에를 나타낸다.
한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자 이외에 외래 유전자가 도입된 것을 확인하기 위해서는, 우선 유전자 재조합 누에 게놈으로부터 외래 유전자가 삽입된 단편을, 인버스 PCR이나 누에 게놈을 다양의 제한 효소로 처리하여 외래 유전자를 프로브로 한 서던 혼성화법을 이용하여 통상적인 방법에 따른 클로닝을 행하는 수법에 의해 취득한다. 이렇게 해서 얻어진 단편의 염기 서열 번호를 확인함으로써, 피브로인 H쇄 유전자(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 57444 내지 79995) 이외에 외래 유전자가 도입된 것을 확인할 수 있다.
누에의 견사는 주로 피브로인 H쇄 단백질이 섬유화됨으로써 형성된다. 따라 서, 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 것은 유전자 재조합 누에가 만드는 견사에 있어서 강도나 신장도와 같은 물성을 저하시키지 않음에 있어서 중요한 현상이다.
본 발명에 있어서, 피브로인 H쇄 단백질의 구조를 기본적으로 유지한다고 함은, 피브로인 H쇄 단백질을 주요한 구성 성분으로 하는 피브로인층의 구조가 비유전자 재조합 누에가 토사하는 견사의 피브로인층과 동일한 형태임을 나타내고, 광학 또는 전자 현미경 관찰에 의해 확인할 수 있다. 피브로인 H쇄 단백질의 구조가 본질적으로 유지되는 것도 유전자 재조합 누에가 만드는 견사에 있어서 강도나 신장도와 같은 물성을 저하시키지 않음에 있어서 중요한 현상이다.
이들 누에를 비재조합 누에 또는 유전자 재조합 누에끼리 교배시켰을 경우, 자손에서도 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자는 소실되지 않고 전달되어, 세대를 통해 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산시킬 수 있다.
따라서, 재조합 누에를 계대하여 두수를 늘림으로써 거미줄 단백질을 포함하는 견사의 생산량을 용이하게 스케일 업하는 것이 가능하다. 교배시 상업용 누에 품종의 누에와 교배시킴으로써, 거미줄 단백질을 포함하는 견사의 생산량을 향상시키는 것도 가능하다. 이 경우, 목적하는 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자가 도입된 누에를 적절히 선발하면서 계대해 갈 필요가 생긴다. 이 경우, 임의의 조직으로부터 얻어진 세포의 DNA를 이용하여, 재조합 누에 선발에 사용한 마커 유전자나 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인 된 유전자의 존재나 구조를 PCR, 서던 블롯팅법 등으로 해석함으로써, 용이하게 재조합 누에의 유전자를 계승한 자손을 판별하는 것이 가능하다. 또한, GFP 등의 형광 단백질 유전자를 이용한 경우에는 누에알이나 유충에게 여기광을 조사하고, 형광 단백질이 발하는 형광을 검출함으로써 선발을 행할 수 있다.
누에 나방의 알에 포함되는 세포에 유전자를 도입하는 경우에는 마이크로 주입하는 방법이 바람직하다. 여기서 알에 마이크로 주입을 행하는 경우, 알 중의 세포에 직접 마이크로 주입할 필요는 없고, 알 중에 마이크로 주입하는 것만으로 유전자를 도입하는 것이 가능하다.
본 발명에서의 "유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교하여 강도가 향상되었다"란 거미줄이 갖는 원하는 성질인 고강도성이 반영된 것을 나타낸다. 구체적으로는, 견사에 가중을 가하여 파단하기까지의 파단 강도가 향상된 것을 나타낸다.
강도의 측정에는 인장 시험기(텐실론)를 이용하여 측정할 수 있다. 파단 강도는 파단점까지의 최대점하도(g)/섬도(d)로서 표시된다. 섬도 측정은 단위 길이에 있어서의 중량으로부터 산출할 수 있다. 유전자를 재조합한 누에가 만드는 고치로부터 얻어진 견사와, 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에가 만드는 고치로부터 얻어진 견사의 강도를 비교함으로써 향상 여부를 판정할 수 있다. 바람직하게는, 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교하여 강도가 1％ 이상 향상된 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 강도가 10％ 이상 향상되고, 더욱 바람직하게는 20％ 이상 향상된 것이 바람직하다.
본 발명에서의 "유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교하여 신장도가 향상되었다"란 거미줄이 갖는 원하는 성질인 고신장도성이 반영된 것을 나타낸다. 구체적으로는, 견사에 가중을 가하여 파단하기까지의 파단 신장도가 향상된 것을 나타낸다. 신장도의 측정에는 인장 시험기(텐실론)를 이용하여 측정할 수 있다. 유전자를 재조합한 누에가 만드는 고치로부터 얻어진 견사와, 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에가 만드는 고치로부터 얻어진 견사의 파단 신장도를 비교함으로써 향상 여부를 판정할 수 있다. 바람직하게는, 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교하여 신장도가 1％ 이상 향상된 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 신장도가 10％ 이상 향상되고, 더욱 바람직하게는 신장도가 30％ 이상 향상된 것이 바람직하다.
강도×(신장도)1/2로서 산출되는 인성을 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교한 경우, 바람직하게는 유전자를 재조합하지 않은 동종 누에에 의해 만들어지는 견사와 비교하여 인성이 1％ 이상 향상된 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 인성이 10％ 이상 향상되고, 더욱 바람직하게는 인성이 40％ 이상 향상된 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 "거미줄 단백질을 포함하는 견사를 이용한 직물"이란 거미줄 단백질이 세로실 및(또는) 가로실에 사용된 직물을 나타낸다. 거미줄 단백질을 포함하는 견사만으로 구성되는 직물일 수도 있고, 비재조합 누에의 견사와의 혼방사가 사용될 수도 있으며, 견사가 아닌 섬유와의 혼방사가 사용될 수도 있고, 가공 되어 표면 처리제로서 사용될 수도 있고, 가공되어 부직포로서 사용될 수도 있다. 또한, 편물인 니트에 사용될 수도 있다. 직물의 제조 방법은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 구체적으로는, 평직, 능직, 주자직, 익조직 등을 들 수 있다.
견사 중에서의 거미줄 단백질의 존재 형태로는 분산과 국재가 예측된다. 국재란 피브로인층에 있어서 재조합 단백질이 일부분에 집합하여 존재하는 것을 나타낸다. 국재해 있는 경우, 아세트산 우라닐과 납의 이중 염색에 의한 전자 현미경 관찰에 있어서 염색성이 다른 영역으로서 관찰된다. 또는, 견사를 글루타르알데히드로 고정, 에폭시 수지로 포매하여 제조한 절편 호일에 대하여 재조합 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 전자 현미경 관찰을 행함으로써, 재조합 단백질 유래의 시그널이 피브로인층 중에서 치우쳐 있는 것으로 판정할 수 있다. 재조합 단백질이 견사 중에 분산되어 있는 경우, 마찬가지로 면역 전자 현미경 관찰로 피브로인층 중에서의 재조합 단백질 유래의 시그널이 치우치지 않고 존재하고 있는 것을 나타낸다.
거미줄 단백질이 견사 중에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 본 발명에서의 견사는 견사를 구성하는 피브로인 단백질과 거미줄 단백질의 복수의 단백질(중합체)로 이루어지는 얼로이이다. 일반적으로, 2종의 중합체를 블렌드하더라도 양자의 성질 차이에 의해 분리되어 여러 물성이 저하된다. 견사에 있어서, 견사를 구성하는 피브로인 단백질과 피브로인 이외의 재조합 단백질을 혼합하여 인공적으로 섬유화시키는 경우, 양자의 결정성 차이에 의해 피브로인 단백질과 재조합 단백질은 균일하게 혼합되지 않고, 강신장도와 같은 여러 물성은 저하된다. 본 발명에 서 나타낸 수법에 의해, 견사를 구성하는 피브로인 단백질과 피브로인 이외의 재조합 단백질을 균일하게 혼합시킬 수 있고, 재조합 단백질이 견사 중에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 포함하는 견사를 얻을 수 있다. 상기 견사는 피브로인이 갖는 강신장도를 저하시키지 않고 재조합 단백질이 갖는 원하는 성질을 상기 견사에 부여하는 것이 가능해진다.
이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예의 기재에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕누에 나방의 게놈 DNA의 제조
5령 3일째의 누에를 해부하여 후부 견사선 조직을 잘라내었다. 1×SSC로 세정한 후, DNA 추출 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0, 100 mM NaCl) 200 ㎕를 가하였다. 프로티나제(Proteinase) K(최종 200 ㎍/ml)를 가하여 조직을 그라인더로 충분히 으깨고, 추가로 DNA 추출 완충액을 350 ㎕, 10％ SDS 60 ㎕를 가하여 혼합하였다. 50 ℃에서 2 시간 보온하였다. 트리스-HCl 포화 페놀(pH 8.0) 500 ㎕를 가하여 10분 혼합한 후, 10,000 rpm 5분 4℃에서 원심 분리하여 상청을 회수하였다. 상청을 페놀/클로로포름 처리하여 게놈 DNA를 에탄올 침전하였다. RNase 함유 멸균수로 100 ㎍/ml가 되도록 용해, 희석하여 게놈 DNA 용액을 제조하였다.
〔실시예 2〕유전자의 제조
이용한 유전자는 알려진 서열을 이용하여 그 양단 서열의 프라이머를 제조하 고, 적당한 DNA 소스를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 취득하였다. 프라이머 끝에는 나중의 유전자 조작를 위해 제한 효소 절단 부위를 부가하였다.
피브로인 H쇄 프로모터·피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론·제2 엑손 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 62118 내지 63513번째: 이하 HP 영역)은 누에 나방의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 5(서열 번호 5)와 프라이머 6(서열 번호 6)의 2종의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 취득하였다.
피브로인 H쇄 상류 프로모터·피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호, 57444 내지 62927번째: 이하 HUP 영역)은 누에 나방의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 7(서열 번호7)과 프라이머 8(서열 번호 8)의 2종의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 취득하였다.
피브로인 H쇄 C 말단 영역 유전자·피브로인 H쇄 폴리 A 시그널 영역(진뱅크 등록 번호 AF226688의 염기 번호 79099 내지 79995번째: 이하 HC 영역)은 누에 나방의 게놈 DNA를 주형으로 프라이머 9(서열 번호9)와 프라이머 10(서열 번호 10)의 2종의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 취득하였다.
PCR은 KOD플러스(KODplus, 도요보(주) 제조)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 행하였다. 즉, 누에 나방의 게놈 DNA를 주형으로 하는 경우에는 이를 100ng 가하고, 각 프라이머를 50 pmol, 첨부한 10×PCR 완충액을 10 ㎕, 1 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 2 단위 KOD플러스가 되도록 각 시약을 가하여 전량 100 ㎕로 한다. DNA의 변성 조건을 94 ℃, 15초, 프라이머의 어닐링 조건을 55 ℃, 30초, 신장 조건을 68 ℃, 60초 내지 300초의 조건으로 퍼킨 엘머사의 DNA 서멀 사이클러를 이용하여 30 사이클 반응시켰다.
이들 반응액을 1％ 아가로스 겔로 전기 영동하고, 각각 HP 영역에서는 약 1.4 kbp., HUP 영역에서는 약 5.5 kbp., HC 영역에서는 약 0.8 bp의 DNA 단편을 통상적인 방법에 따라 추출, 제조하였다. 이들 DNA 단편을 폴리뉴클레오티드 키나제(다까라츄조(주) 제조)에 의해 인산화한 후, BamHI로 절단한 후, T4 DNA 폴리머라제(DNApolymerase)를 이용하여 정법에 의해 평활화하고, 추가로 탈인산화 처리한 pUC19 벡터에 다까라츄조(주)의 DNA 연결 키트(DNA Ligation Kit) Ver.2를 이용하여 16 ℃에서 철야 반응을 수행하여 연결하였다. 이들을 이용하여 통상적인 방법에 따라 대장균을 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환체에 PCR 단편이 삽입되어 있음을, 얻어진 콜로니를 상술과 동일 조건으로 PCR함으로써 확인하고, PCR 단편이 삽입된 플라스미드를 통상적인 방법에 의해 제조하였다. 이들 플라스미드를 시퀀싱함으로써, 얻어진 단편이 각각의 유전자의 염기 서열 번호임을 확인하였다.
거미줄 유전자의 취득은 ATCC로부터 이하의 주로서 입수 가능하다. 대장균(E.coli) FP3227 69326 1993년 6월 15일, E.coli FP 2193 69327 1993년 6월 15일 E.coli FP 3350 69328 1993년 6월 15일.
또는, 문헌[Reviews in Molecular Biology 74(2000)105-109] 또는 문헌 [Appl. Microbiol. Biotechnol. 47(1997) 23-39]에 개시된 수법에 의해 인공 합성한 올리고뉴클레오티드를 기초로 제조하는 것이 가능하다. 즉, 인공 합성한 올리고뉴클레오티드의 양단에 BglII와 BamHI의 제한 효소 인식 부위를 동일 프레임이 되도록 디자인하고, 양자를 차례로 연결함으로써 다양한 크기의 거미줄 유전자를 제조하는 것이 가능하다. 본 실시예에서는 서열 번호 1에 기재된 DP-1B.33 폴리펩티드를 4회 반복한 DP4, DP-1B.33을 8회 반복한 DP8, DP-1B.33을 12회 반복한 DP12, DP-1B.33을 16회 반복한 DP16 유전자 단편을 제조하였다.
동일한 수법에 의해 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 이를 연결함으로써 서열 번호 2에 기재된 폴리펩티드가 8회 반복한 단백질을 코딩하는 플라스미드를 구축하고, 이를 BglII와 BamHI로 절단하여 AEX 유전자 단편을 제조하였다.
〔실시예 3〕유전자 도입용 플라스미드의 제조
유전자 도입용 플라스미드에는 pigA3GFP(문헌 [Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000])를 이용하였다. 즉, 미국 특허 제6218185호에 개시된 플라스미드 p3 E1.2로부터 트랜스포사제를 코딩하는 영역을 제거하고, 그 부분에 A3 프로모터(진뱅크 등록 번호 U49854의 염기 번호 1764 내지 2595번째) 및 pEGFP-N1 벡터(클론테크(Clontech)사 제조) 유래의 GFP 및 SV40 유래 폴리 A 부가 서열(진뱅크 등록 번호 U55762의 염기 번호 659 내지 2578번째)를 삽입한 벡터가 pigA3GFP이고, 이 벡터는 독립행정법인 농업생물자원연구소에서 분배 공급 가능하다. 그 A3 프로모터의 상류측에 있는 XhoI 부위를 평활화하여 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자를 삽입하였다.
본 실시예에 있어서의 거미줄 단백질을 포함하는 견사를 생산하도록 디자인된 유전자의 구성은 HP·DP16, 12, 8, 4·HC 및 HP·AEX·HC, 나아가 HUP·DP8, 4 ·HC이다.
이하에 구체적인 방법을 나타낸다.
도 1에는 HP·DP16, 12, 8, 4·HC 및 HP·AEX·HC의 제조 전략을 나타내었다. 실시예 2에서 제조한 HP 영역을 갖는 플라스미드와 HC 영역을 갖는 플라스미드를 BamHI와 SalI로 처리하고, 각각 약 1.4 kbp 단편과 3.6 kbp 단편을 연결하였다. 이것을 BamHI로 처리한 후, 탈인산화한 플라스미드와, 실시예 2에서 취득한 양단이 BglII 및 BamHI 부착 말단을 갖는 DP16 단편, DP12 단편, DP8 단편, DP4 단편 및 AEX 단편을 연결하였다. 연결부의 염기 서열 번호를 확인하여 연결부가 동일 프레임에서의 리드 프레임인 것, 순방향인 것을 확인하였다. 각 플라스미드를 AscI로 처리하고, 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, XhoI 처리한 후 평활화한 pigA3CFP 플라스미드에 연결하여 각종 유전자 구조 HP·DP16·HC, HP·DP12·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC, HP·AEX·HC를 갖는 각종 유전자 도입 벡터를 제조하였다.
도 2에는 HUP·DP8, 4·HC의 제조 전략을 나타내었다. 실시예 2에서 제조한 HUP 영역을 갖는 플라스미드를 SphI와 XhoI로 처리하여 약 5.5 kbp 단편을 얻었다. 이것을, 도 2에 나타낸 바와 같이, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC 제조 과정에서 얻어진 플라스미드를 SpHI와 XhoI로 처리하여 얻어진 단편과 연결하였다. 연결부의 염기 서열 번호를 확인하여 염기의 결실, 삽입이 일어나지 않았음을 확인하였다. 각 플라스미드를 AscI로 처리하고, 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, XhoI 처리한 후 평활화한 pigA3GFP 플라스미드에 연결하여 각종 유전자 구 조 HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC를 갖는 각종 유전자 도입 벡터를 제조하였다.
〔실시예 4〕유전자 재조합 누에의 제조
실시예 3에 기재된 유전자 도입용 벡터와 피기백 트랜스포사제 단백질을 생산하는 헬퍼 플라스미드 DNA(pHA3PIG)(문헌 [Nature biotechnology 18, 81-84, 2000], 농업생물자원연구소로부터 분배 공급 가능)를 각 200 ㎍/ml 포함한 0.5 mN 인산 완충액(pH 7.0)·5 mM KCl 용액으로 제조하고, 3 내지 20 nl을 산란 후 4 시간 이내의 누에란 500개에 대하여 마이크로 주입하였다. pHA3PIG는 피기백 트랜스포존의 한쪽의 역위 반복 서열과 5' 프랭킹 영역, 트란스포사제 유전자의 리더 서열을 결여하고 있고, 그 대신 누에 액틴 유전자의 5' 프랭킹 영역과 리더 서열이 조립되어 있다. pHA3PIG는 액틴 프로모터의 작용에 의해 피기백 트랜스포사제 단백질을 만드는 기능을 갖지만, 피기백 트랜스포존의 한쪽의 역위 반복 서열이 결손되어 있기 때문에 자신의 DNA는 전이하지 않는다. 그 누에란으로부터 부화된 유충을 사육하고, 얻어진 성충(G0)을 군 내에서 교배시켜 얻어진 차세대(Gl)를 해파리 녹색 형광 단백질(GFP)의 형광을 관찰함으로써, 해파리 녹색 형광 단백질 유전자가 염색체에 도입된 누에를 스크리닝하였다. 그 결과, 해파리 녹색 형광 단백질의 작용에 의해 형광을 발하는 유전자 재조합 누에가 얻어졌다. 유전자 재조합체의 선발은 내부 교배에 의해 얻어진 G1 유충에서의 GFP의 형광을 지표로 스크리닝하였다. 후부 견사선 조직에 있어서의 액틴 프로모터 제어화에서의 유전자 발현은 매우 낮고, 또한, 견사선 조직으로부터 견사 중에 분비됨에 있어서 중요한 피브로인 L쇄 단백질과의 결합을 형성하는 일이 없다. 즉, 본 발명에서의 거미줄 단백질을 포함하는 견사에는 GFP는 포함되지 않고, 본 발명에 있어서, 유전자 재조합 누에의 선발에는 고치 및 견사에서의 GFP에 의한 형광을 지표로 사용하지 않는다. 유전자 재조합 누에의 제조 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112006057595089-PCT00001
〔실시예 5〕 서던 혼성화에 의한 거미줄 단백질 유전자 도입의 확인
HP·DP8·HC, HP·DP4·HC 유전자를 도입한 G1 누에 중, GFP의 형광을 나타내는 누에를 랜덤하게 선발하고, 실시예 1에 기재된 방법으로 게놈 DNA를 제조하고, EcoRI로 제한 효소 처리를 수행하고, 전기 영동 후 멤브레인에 블롯팅하였다. 프로브는 아마샴 파마시아사 제조의 진-이미지 랜덤 프라임 라벨링 및 검출 모듈(Gene-ImageTM Random prime labelling and detection module)을 이용하여 DP8/BglII, BamHI 단편을 라벨링하여 이용하였다. 첨부한 프로토콜에 따라 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자의 검출을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다. 조사한 모든 GFP 형광을 나타내는 누에에 있어서 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자가 검출되었다(화살표로 나타냄). 또한, 시그널 크기가 다른 점에서 염색체 상에 랜덤하게 삽입되었다고 생각된다.
〔실시예 6〕유전자 재조합 누에가 제조하는 고치의 해석
다음으로 견사에 포함되는 거미줄 단백질을 검출하고 함량을 측정하였다. 유전자를 재조합하지 않은 누에(WT) 및 유전자 재조합 누에(HP·DP16·HC, HP·DP12·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC, HP·AEX·HC, HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC 유전자를 도입한 누에)의 고치를 각 10 mg 칭량하여 채취하고, 60％ LiSCN 4ml를 가하여 교반한 후, 철야 실온에 정치하여 고치를 용해시켰다. 이것을 8M 요소·2％ SDS·5％ 2-머캅토에탄올로 10배 희석한 것을 샘플로 하여 SDS-PAGE에 부친 후, 은 염색 키트(다이이치 가가쿠 야쿠힌 가부시끼가이샤 제조)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 거미줄 단백질의 검출을 행하였다. 그 결과를 분자 이메이져(바이오래드사 제조)를 이용하여 시그널 강도를 측정하고, 농도가 알려진 단백질로서는 고양이 인터페론을 이용하여 그 시그널 강도와 비교하여 단백질 함량을 측정하였다. 시그널 비교에는 바이오래드사 제조의 분자 이메이져 FXPro를 이용하였다.
또한, ECL 플러스 웨스턴 블로팅 키트(ECL P1usTM Western blotting Kit, 아마샴 파마시아사 제조)를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 거미줄 단백질의 검출을 행하였다. DP의 검출에는 서열 번호 11에 나타낸 CGAGQGGYGGLGSQAGRG 펩티드에 대한 충분한 항체가를 갖는 특이적인 펩티드 항체를, AEX의 검출에는 서열 번호 12에 나타낸 CGPGQQGPGGYGPGQQGPS 펩티드에 대한 충분한 항체가를 갖는 특이적인 펩티드 항체를, 모두 토끼를 이용하여 제조하고, 이들 항체를 이용하여 첨부한 프로토콜에 따라 검출하였다. 즉, 블롯팅한 멤브레인을 블록킹 용액(5％ 스킴 밀크·0.1％ 트윈(Tween) 20·PBS) 중에서 4℃ 철야 블록킹하였다. 멤브레인을 TPBS(0.1％ 트윈 20·PBS)로 2회 세정하고, TPBS로 1000배 희석한 항거미줄 단백질 항체로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, 추가로 TPBS로 5 분간 3회 세정하였다. 그 후, TPBS로 10000배 희석한 후, HRP 라벨 항토끼 IgG 항체로 실온에서 1 시간 처리하였다. 멤브레인을 TPBS로 2회 세정하고, 추가로 TPBS로 5분간 3회 세정한 후, ECL 플러스 웨스턴 블로팅 검출 시스템(ECL plusTM Western blotting Detection System, 아마샴 파마시아사 제조)의 검출 시약(용액 A＋용액 B)을 가하였다. 발광을 하이퍼필름(HyperfilmTM) ECLTM에 노광 및 현상하였다. HP·DP16·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC, HP·AEX·HC, HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC 유전자 구조를 도입한 누에가 만드는 고치를 분석한 결과를 도 4에 나타내었다. 거미줄 단백질의 분자량은 유전자 구조로부터 예측되는 분자량과 일치하였다. 또한, 거미줄 단백질이 차지하는 비율은 중량비로 약 0.1 내지 15％였다. 또한, 피브로인 L쇄 단백질의 분자량 상당의 크기가 증가한, 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합한 상태의 시그널(별표로 나타냄)이 검출되었다. HUP 유전자 구조를 갖는 것(HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC)은 HP 유전자 구조를 갖는 것(HP·DP8·HC, HP·DP4·HC)과 비교하여 거미줄 단백질의 함량이 증대하였다. 견사에 GFP가 포함되어 있는지를 GFP에 대한 항체(코스모바이오사 제조)를 이용한 웨스턴 해석에 의해 판정했지만, GFP는 검출되지 않았다.
HP·DP16·HC, HP·DP12·HC, HP·DP8·HC, HP·DP4·HC, HP·AEX·HC, HUP·DP8·HC, HUP·DP4·HC 유전자 구조를 도입한 누에가 만드는 고치(고치실＋번데기)의 평균 중량을 수컷 10알 암컷 10알 이용하여 측정 및 비교하였다. 또한, 거미줄 단백질의 함량(중량％)을 측정하였다. 이들 결과를 표 2에 나타내었다. HP·AEX·HC를 제외하고 고치 중량에 큰 변화는 보이지 않았다. 이는 DP 거미줄 단백질이 누에 피브로인의 섬유화를 저해하지 않았음을 나타낸다. 이는 유전자의 도입을 상동 재조합이 아닌 트랜스포존에 의해 수행함으로써, 누에 피브로인 H쇄 유전자에게 변이가 일어나지 않은 결과라고 생각된다.
Figure 112006057595089-PCT00002
〔실시예 7〕견사의 제조
대조구로서 비유전자 재조합 누에가 만드는 고치, 샘플로서 HP·DP8·HC 유전자 구조를 도입한 누에가 만드는 고치를, 중량이 40％가 될 때까지 80 ℃에서 건조시켰다. 3％ Na2C03 용액 중에서 95 ℃에서 2분, 이어서 60 ℃에서 3분, 이어서 95 ℃에서 3분 자견하였다. 40 ℃의 온수로 세정한 후, 제사(製絲) 조사기(사이토우기료)를 이용하여 항상 40알의 고치로부터 조사하였다. 비재조합 누에의 견사는 약 1100 m, 재조합 누에(HP·DP8·HC)의 견사는 약 1200 m 얻어졌다.
얻어진 견사를 0.1％ Na2CO3 용액 중에서 60 ℃로 가온하고, 이어서 1％ 마루셀 비누 수용액 중에서 1 시간 펄펄 끓이고, 0.1％ Na2CO3 용액으로 세정한 후, 수세하여 견사의 정련을 수행하였다. 60 ℃에서 건조하고, 정련된 비재조합 견사와 정련된 HP·DP8·HC 견사를 얻었다. 정련 전의 견사와 정련 후 견사의 주사 전자 현미경 사진을 도 5(1500배)에 나타내었다. 표면의 세리신 제거가 보인다. 또한, 정련 전후의 중량을 비교한 결과, 비재조합 견사와 HP·DP8·HC 견사 모두 감련율이 16％로서 세리신은 제거되었다고 생각된다.
〔실시예 8〕견사의 물성 측정
물성 측정에는 거미줄 단백질을 포함하는 견사로서 실시예 7에 기재된 수법에 의해 제조한 HP·DP8·HC 유전자 구조를 도입한 누에가 만드는 견사(HP·DP8·HC)와 비재조합 누에의 견사를 이용하여 각각의 정련 전, 및 정련 후의 물성을 측정하였다. 여기서, 견사 중에 포함되는 거미줄 단백질의 함량은 HP·DP8·HC에서는 5％, 비재조합 견사에서는 0％이다.
섬도 측정은 90 m당 중량을 기초로 산출하였다. 기계 물성의 측정은 인장 시험기(텐실론)를 이용하였고, 크램프 간격 20 ㎝, 인장 속도 20 ㎝/분, 각 10 검체의 평균으로부터 산출하였다. 물성 비교를 표 3에 나타내었다.
Figure 112006057595089-PCT00003
모든 시험 항목에 있어서, HP·DP8·HC 견사는 비재조합 견사와 비교하여 물성이 향상되었다. 특히, 정련을 위한 가온 처리를 거치더라도 강도는 30％ 이상, 신장도는 40％ 이상, 인성은 60％ 이상 향상되었다. 이는 정련 후에도 남아 있는 피브로인층에 포함되는 거미줄 단백질의 효과에 의한 것이라 생각된다.
〔실시예 9〕거미줄 단백질을 포함하는 견사를 이용한 직물의 제조
HP·DP8·HC 견사를 이용하여 천을 제조하였다. HP·DP8·HC 견사 2개를 200T/m로 치우치게 하여 능직으로 직물을 제조하였다.
〔실시예 10〕면역 전자 현미경 관찰
HP·DP8·HC 유전자를 도입한 유전자 재조합 누에와 비재조합 누에가 만드는 고치를 샘플로 하여 올리고펩티드 CGAGQGGYGGLGSQAGRG에 대한 충분한 항체가를 갖는 특이적인 펩티드 항체(DP 항체)를 이용하여 면역 전자 현미경 관찰을 수행하였다. 샘플을 2％ 글루타르알데히드 -0.1％ 카코딜산 완충액을 이용하여 실온에서 1 시간 고정하고, 다음으로 에폭시 수지 EPON812를 이용하여 60 ℃에서 48 시간 중합시켜 포매하였다. 울트라마이크로톰으로 초박 절편을 제조하였다. 1％ BSA/PBS＋1.5％ 염소 혈청을 이용하여 실온에서 30분간 블록킹하였다. 1차 항체로서 5000배 희석한 DP 항체를 이용하여 4℃에서 밤새 항체 처리하였다. 1％ BSA/PBS로 실온에서 10분 3회 세정하였다. 2차 항체로서 안티-래빗(anti-rabbit) IgG 고트-폴리(Goat-Poly) l0 nm 브리티쉬 바이오셀 인터내셔널(British biocell international, LTD 제조)을 이용하여 실온에서 1 시간 처리하였다. 1％ BSA/PBS로 실온에서 10분 3회 세정하였다. 아세트산우라닐과 납의 이중 염색을 실온에서 각 5분 수행하고, 전자 현미경 관찰을 수행하였다. 비재조합 누에가 만드는 견사의 종단면 절편을 이용한 결과를 도 6에 나타내었다. 견사 중의 피브로인층 및 세리신층에서는 거미줄 단백질의 존재를 확인할 수 없었다. 그리고, HP·DP8·HC 유전자를 도입한 유전자 재조합 누에가 만드는 견사의 종단면 절편을 이용한 결과를 도 7에 나타내었다. HP·DP8·HC 유전자를 도입한 유전자 재조합 누에가 만드는 견사의 종단면 절편을 이용한 경우에 있어서, 견사 중의 피브로인층에 흑색점으로서 거미줄 단백질이 분산되어 존재하고 있는 것이 확인되었다. 일부에 치우쳐 존재하고 있는 모습은 관찰되지 않았다.
본건 발명에 의해 제조되는 거미줄과 견사의 하이브리드 실크는 고강도, 고신장도와 같은 거미줄 단백질의 성질을 유지하고 있기 때문에, 항공, 우주 개발, 피복 제조, 견인 로프, 의료용실 등으로서 다양한 산업에 있어서 이용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> TORAY INDUSTRIES, INC. <110> E.I. DU PONT DE NEMOUS AND COMPANY <120> SILK THREAD CONTAINING SPIDER SILK THREAD PROTEIN AND SILKWORM PRODUCING SAID SILK THREAD <130> FP1085SUBARU <150> JP 2004-005489 <151> 2004-01-13 <160> 12 <210> 1 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly 1 5 10 15 Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala 35 40 45 Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln 50 55 60 Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gln 65 70 75 80 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly 85 90 95 Tyr Gly Gly Leu Gly 100 101 <210> 2 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly 35 40 45 Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly 50 55 60 Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly 85 90 95 96 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 3 Arg Ser Tyr Asp Tyr Ser Arg Arg Asn Val Arg Lys Asn Cys Gly Ile 1 5 10 15 Pro Arg Arg Gln Leu Val Val Lys Phe Arg Ala Leu Pro Cys Val Asn 20 25 30 Cys 33 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 4 Met Arg Val Lys Thr Phe Val Ile Leu Cys Cys Ala Leu Gln Tyr Val 1 5 10 15 Ala Tyr Thr Asn Ala Asn Ile Asn Asp Phe Asp Glu Asp Tyr Phe Gly 20 25 30 Ser Asp Val 35 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 aatggcgcgc cgggagaaag catgaag 27 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 catggatccg acatcactcc caaaatagtc 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 cccaatttgg cgcgcctcaa gacatccttg a 31 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 gaatgctacc tcgaggttat gaaaatg 27 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 gctggatccc gcagttacga ctattctcgt cgt 33 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 cttggcgcgc cacgacgtag acgtatagcc atcgg 35 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 11 Cys Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Ala Gly 1 5 10 15 Arg Gly 18 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 12 Cys Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Gly Pro Ser 19

Claims (26)

  1. 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖는 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는, 거미줄 단백질을 포함하는 견사.
  2. 제1항에 있어서, 견사의 피브로인 H쇄 단백질의 기본적인 구조를 본질적으로 유지하는 것을 특징으로 하는, 거미줄 단백질을 포함하는 견사.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 거미줄 단백질이 피브로인 단백질 중에 분산되어 존재하는 것을 특징으로 하는 견사.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질이 피브로인 H쇄 단백질에 포함되는 폴리펩티드와 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 견사.
  5. 제4항에 있어서, 거미줄 단백질이 피브로인 H쇄 단백질의 N 말단 부분과 C 말단 부분 사이에 삽입되어 있고, C 말단 부분에 포함되는 시스테인을 통해 피브로인 L쇄 단백질과 디술피드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 견사.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질의 함량이 0.1 내지 25 중량％인 견사.
  7. 제6항에 있어서, 거미줄 단백질의 함량이 1 내지 15 중량％인 견사.
  8. 제7항에 있어서, 거미줄 단백질의 함량이 1 내지 10 중량％인 견사.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질이 서열 번호 1의 펩티드 또는 서열 번호 1에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 거미줄 단백질의 특성을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  10. 제9항에 있어서, 상기 펩티드가 3 내지 30회 반복된 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  11. 제10항에 있어서, 상기 펩티드가 4 내지 16회 반복된 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질이 서열 번호 2의 펩티드 또는 서열 번호 2에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 거미줄 단백질의 특성을 갖는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드가 3 내지 30회 반복된 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩티드가 4 내지 16회 반복된 거미줄 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질이 제9항에 기재된 펩티드 및 제12항에 기재된 펩티드의 양쪽을 포함하는 것을 특징으로 하는 견사.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질과 융합되는 피브로인 H쇄 단백질의 C 말단 부분이 서열 번호 3의 펩티드 또는 서열 번호 3에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 2 또는 3개의 시스테인을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 견사.
  17. 제5항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질과 융합되는 피브로인 H쇄 단백질의 N 말단 부분이 서열 번호 4의 펩티드 또는 서열 번호 4에 있어서 1개 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 펩티드이며, 상기 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 의한 외래 단백질의 발현을 증강시키는 기능을 유지하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 견사.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 거미줄 단백질이 선택 마커가 되는 단백질과 융합되지 않은 견사.
  19. 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자를 갖고, 거미줄 단백질을 코딩하는 유전자가 한 쌍의 피브로인 H쇄 유전자 이외의 영역에 도입된 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 견사를 만드는 유전자 재조합 누에.
  20. 제19항에 있어서, 유전자 재조합 누에에서 거미줄 단백질을 발현시키기 위해 피브로인 H쇄 유전자 프로모터를 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에.
  21. 제19항에 있어서, 유전자 재조합 누에에서 거미줄 단백질을 발현시키기 위해 피브로인 H쇄 유전자 프로모터 및 그 상류 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 피브로인 H쇄 프로모터 하류에 피브로인 H쇄 유전자 제1 엑손·제1 인트론·제2 엑손 영역의 전장 또는 그 일부가 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에.
  23. 트랜스포존을 이용하는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 누에의 제조 방법.
  24. 제23항에 있어서, 트랜스포존이 피기백(piggyBac) 트랜스포존인 것을 특징으로 하는 유전자 재조합 누에의 제조 방법.
  25. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 유전자 재조합 누에에 의해 만들어지는 것을 특징으로 하는 견사의 제조 방법.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 견사를 이용한 직물.
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