CN105031723B - 基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，通过将人工设计蜘蛛丝蛋白的羧基端结构域(CTD)及其衍生肽段的核苷酸序列，再将其无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后分离纯化，最后通过对应的温度控制形成水凝胶。本发明利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段制备得到孔径致密且弹性模量高达105Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种可用于制备水凝胶的蛛丝蛋白材料，具体是将一种生物合成的蜘蛛牵引丝蛋白的羧基端结构域(CTD)及其衍生肽段制备成水凝胶。
背景技术
水凝胶是由亲水性物质交联形成的三维空间网络结构。较高的含水量使其可以模拟天然生物生存的环境，并赋予其较好的生物相容性。另外，水凝胶多孔的微结构使其具有一定的可渗透性，而三维网状结构可以提供一定的机械支撑，所以水凝胶在医学，药学，生物材料方面有着广泛的用途，例如隐形眼镜，人造器官材料，及药物传输载体等。根据对外界环境刺激的响应情况，水凝胶可被分为传统型和智能型两大类。其中，智能型水凝胶是现今研究的热点，主要包括温敏型水凝胶、pH敏感型水凝胶、生物分子敏感型水凝胶、电场敏感型水凝胶等。
目前，用于制备智能型水凝胶的分子大多是化学合成的多聚物，虽然这种多聚物的机械性能较好，但生物相容性较差，降解耗时太长，另外不利于细胞粘附。所以，科学家们把目光转向了生物聚合物，主要是一些天然存在的蛋白多肽类物质(如胶原蛋白，丝蛋白和明胶等)。这些多肽类物质具有很好的生物相容性和可降解性，且细胞毒性较低，被认为是制备水凝胶的理想材料。
蜘蛛丝蛋白以其优越的机械性能(强度、弹性等)和生物相容性成为最近水凝胶研究的热点(Schacht K,Scheibel T.Biomacromolecules.2011,12(7):2488‐95.)。大部分的蜘蛛可以产七种丝，如牵引丝、小壶状腺丝、鞭毛状腺丝等。其中牵引丝作为蜘蛛网的主要骨架及逃生的生命线，因此具有其他纤维无法比拟的机械性能。牵引丝主要由牵引丝蛋白1和牵引丝蛋白2(MaSp1&2)组成(Gosline,J.M.；Guerette,P.A.；Ortlepp,C.S.；Savage,K.N.J.Exp.Biol.1999,202(Pt.23),3295‐3303.Hinman,M.B.；Jones,J.A.；Lewis,R.V.Trends Biotechnol.2000,18,374‐379.)；前人的研究表明，MaSP1强度较高，而MaSP2弹性较好。牵引丝蛋白的结构具有一定的相似性，它们主要由重复片段结构域(Rep)和两端的氨基端结构域(NTD)、羧基端结构域(CTD)组成。其中Rep不断串联重复(大概100个)形成中间的部分，且被认为对纤维的机械性能比较重要；而两端的末端结构域(NTD和CTD)是非重复且较为保守的氨基酸序列，被认为对蛛丝蛋白的组装和排列做了重要贡献(SponnerA,Schlott B,Vollrath F,Unger E,Grosse F,Weisshart K.2005a.Biochemistry 44:4727‐4736.Rising A,Hjalm G,Engstrom W,Johansson J.2006.Biomacromolecules7:3120‐3124.Gaines WA,Marcotte WR,Jr.2008.Insect Mol Biol17:465‐474.)。其中关于CTD的研究还是较多的，结果表明其可促进蛛丝蛋白的溶解以利于高浓度蛋白溶液的储存；对pH、盐离子和剪切力(蜘蛛腺体中成丝过程的不断变化的物理化学因素)较为敏感，且可在剪切力作用下形成连接较好的纤维(Hagn,F.；Eisoldt,L.；Hardy,J.G.；Vendrely,C.；Coles,M.；Scheibel,T.；Kessler,H.Nature 2010,465(7295),239-42.Askarieh,G.；Hedhammar,M.；Nordling,K.；Saenz,A.；Casals,C.；Rising,A.；Johansson,J.；Knight,S.D.Nature2010,465(7295),236-8.)。
经过对现有技术的检索发现，PCT专利文献号WO2007/078239公开了一种分离富含Ala和Gly的重复片段和C端结构域的微型蜘蛛丝蛋白及可溶性蛋白的方法，并且提供了制备大壶腹腺蛛丝蛋白纤维的方法。
PCT专利文献号WO2010/123450公开了一种构建并获得了既包含重复片段，又含有C端结构域和N端结构域的蜘蛛丝蛋白，并提供了一种分离以上所述的蛋白聚合物的方法。通过调节所用液体介质的pH、离子浓度等条件，获得了肉眼可见的纤维。
中国专利文献号CN104045841A公开了一种通过将废蚕丝脱胶、溶解、透析处理后得到低浓度的丝素蛋白溶液，然后在常温下采用高速搅打匀质处理的方法得到凝胶化时间较短的丝素蛋白水凝胶。
Kristin Schacht等，Biomacromolecules.2011,12,2488‐2495.表达了园蛛科蜘蛛(Araneus diadematus)的富含Ala和Gly的重复片段的蜘蛛丝蛋白，并通过提高浓度和化学交联的手段将其制备形成水凝胶。但该蛋白材料中不包含CTD。
虽然关于CTD的研究日益深入，但到目前为止，还没有关于其能够形成水凝胶的报道。通过我们的研究，发现不同种属的蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段对温度较为敏感，且可在高温和低温条件下形成水凝胶。
作为蜘蛛丝蛋白的一部分，CTD形成的水凝胶既具有多肽类水凝胶的生物相容性、可降解性、细胞毒性低等优势，又具有蛛丝蛋白部分优越的机械性能，这将为水凝胶在组织工程，药物传输等医学工程中的应用提供更好的选择。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足提出一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，通过利用公开的CTD及Rep的氨基酸序列设计和优化对应的核苷酸序列，在大肠杆菌中实现表达和生产，最终利用其温敏性制备形成水凝胶。利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段制备得到孔径致密且弹性模量高达105Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶。
所述的多肽为(Rep)x‐(CTDn)y，其中：整数x代表Rep，即络新妇属蜘蛛(Nephilaclavipes)牵引丝蛋白1(MaSP1)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16]；整数y代表CTD，即络新妇属蜘蛛(Nephila clavipes)、园蛛科蜘蛛(Araneus diadematus)或非洲育儿网蛛(Euprosthenops australis)的MaSP1的羧基末端结构域(CTD)序列重复的次数，取值范围为[1,8]；整数n代表CTD的种类，当n取1、2、3时，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD。
所述的多肽中，x、y和n在相应区间内自由组合，如x取4、y取1、n取1时，即(Rep)4‐CTD1,其中：CTD1即为NcCTD。
所述的Nephila clavipes牵引丝蛋白1(MaSP1)重复序列的单体氨基酸序列，如Seq ID No.1所示，即：
N’‐GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG‐C’，来自于文献Xu Ming and RandolphV.Lewis*.Structure of a protein superfiber:Spider draglinesilk.Proc.Natl.Acad.SCI.USA.1990,87,7120‐7124。
所述的NcCTD的氨基酸序列如Seq ID No.3所示，即：
N’‐GRGGLVGSGASAASAAASRLSSPQASSRVSSAVSNLVASGPTNSAALSSTISNVVSQIGASNPGLSGCDVLIQALLEVVSALIQILGSSSIGQVNYGSAGQATQIVGQSVYQALG‐C’，来源于文献Hinman,M.B.andLewis,R.V.Isolation of a clone encoding a second dragline silk fibroin.J BiolChem.1992,267:19320–19324.
所述的AdCTD的氨基酸序列如Seq ID No.4所示，即：
N’‐GPQSSSAPVASAAASRLSSPAASSRVSSAVSSLVSSGPTNQAALSNTISSVVSQVSASNPGLSGCDVLVQALLEVVSALVSILGSSSIGQINYGASAQYTQMVGQSVAQALAG‐C’，来源于文献Guerette,P.A.,Ginzinger,D.G.,Weber,B.H.F.and Gosline,J.M.Silk properties determined bygland‐specific expression of a spider fibroin gene family.Science.1996,272:112–115.
所述的EaCTD的氨基酸序列如Seq ID No.5所示，即：
N’‐SAAASAASTVANSVSRLSSPSAVSRVSSAVSSLVSNGQVNMAALPNIISNISSSVSASAPGASGCEVIVQALLEVITALVQIVSSSSVGYINPSAVNQITNVVANAMAQVMG‐C’，来源于文献Stark,M.,Grip,S.,Rising,A.,Hedhammar,M.,Engstrom,W.,Hjalm,G.,and Johansson,J.Macroscopicfibers self‐assembled from recombinant miniature spider silkproteins.Biomacromolecules.2007,8,1695–1701.
所述的人工设计核苷酸序列，包括：Rep、NcCTD、AdCTD和EaCTD的人工核苷酸序列。
所述的Rep的人工核苷酸序列如Seq ID No.2所示，即：
5’‐GGTCGCGGCGGTCTGGGTGGCCAGGGTGCAGGTGCGGCTGCGGCTGCAGGCGGTGCTGGCCAAGGTGGCTACGGCGGCCTGGGTTCTCAGGGT‐3’。
所述的NcCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.6所示，即：
5’‐GTGGGCAGCGGCGCGAGCGCGGCGAGCGCGGCGGCGAGCCGCCTGAGCAGCCCGCAGGCGAGCAGCCGCGTGAGCAGCGCGGTGAGCAACCTGGTGGCGAGCGGCCCGACCAACAGCGCGGCGCTGAGCAGCACCATTAGCAACGTGGTGAGCCAGATTGGCGCGAGCAACCCGGGCCTGAGCGGCTGCGATGTGCTGATTCAGGCGCTGCTGGAAGTGGTGAGCGCGCTGATTCAGATTCTGGGCAGCAGCAGCATTGGCCAGGTGAACTATGGCAGCGCGGGCCAGGCGACCCAGATTGTGGGCCAGAGCGTGTATCAGGCGCTGGGC‐3’。
所述的AdCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.7所示，即：
5’‐GGTCCGCAGAGCAGCAGCGCACCGGTTGCAAGCGCAGCAGCAAGCCGTCTGAGCAGCCCGGCAGCAAGCAGCCGTGTTAGCAGCGCAGTTAGCAGCCTGGTTAGCAGCGGTCCGACCAATCAGGCAGCACTGAGCAATACCATTAGCAGCGTTGTTAGCCAGGTTAGCGCAAGCAATCCGGGTCTGAGCGGTTGTGATGTTCTGGTTCAGGCACTGCTGGAAGTTGTTAGCGCACTGGTTAGCATTCTGGGTAGCAGCAGCATTGGTCAGATTAATTATGGTGCAAGCGCACAGTATACCCAGATGGTTGGTCAGAGCGTTGCACAGGCACTGGCAGGT‐3’。
所述的EaCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.8所示，即：
5’‐AGCGCAGCAGCAAGCGCAGCAAGCACCGTTGCAAATAGCGTTAGCCGTCTGAGCAGCCCTAGTGCAGTTAGCCGTGTTAGCAGCGCAGTTAGCAGCCTGGTTAGCAATGGTCAGGTTAATATGGCAGCACTGCCGAATATTATTAGCAATATTAGTAGCTCAGTTAGCGCAAGCGCACCGGGTGCAAGCGGTTGTGAAGTTATTGTTCAGGCACTGCTGGAAGTTATTACCGCACTGGTTCAGATTGTTAGCAGCAGCAGCGTTGGTTATATTAATCCGAGCGCAGTTAATCAGATTACCAATGTTGTTGCAAATGCAATGGCACAGGTTATGGGT‐3’。
所述的成胶温度控制，具体为：
a)对(Rep)x‐(CTDn)y中，x为0，y为1，n取1～3间的任意整数的多肽CTDn来说，温度设置为2℃～10℃时，可形成透明且可热回复的水凝胶；温度设置为65℃～85℃时，可形成透明且热不可回复的水凝胶；
b)对(Rep)x‐(CTDn)y中，x为0，y为4，n取1～3间的任意整数的多肽(CTDn)4来说，温度设置为50℃～80℃时，可形成白色且热不可回复的水凝胶；
c)对(Rep)x‐(CTDn)y中，x为4，y为1，n取1～3间的任意整数的多肽(Rep)4‐CTDn来说，温度设置为2℃～10℃时，可形成白色且热可回复的水凝胶。
本发明涉及制备得到的水凝胶，其物理化学表征为：孔径致密；弹性模量的范围是100～105Pa。
本发明涉及上述水凝胶的应用，将其用于组织工程等医学领域。
附图说明
图1为CTD1、CTD2、CTD3的SDS‐PAGE图及其特征；
图中：A为分离后重组蛋白的SDS‐PAGE图，箭头指示处为目标条带；B为重组蛋白的信息图。
图2为(Rep)4‐CTD1、(CTD1)4的SDS‐PAGE图及其特征；
图中：A为分离后重组蛋白的SDS‐PAGE图，箭头指示处为目标条带；B为重组蛋白的信息图。
图3为CTD1在升温和降温的过程中的倒置实验；
图4为CTD1在低温和高温下形成的水凝胶的扫描电子显微镜的形貌图；
图中：A和B是CTD1在低温下形成水凝胶的形貌图，C和D为CTD1在高温下形成水凝胶的形貌图；B和D分别为A和C中方框处的放大图。
图5为(CTD1)4在50℃时的正、倒置实验。
图6为(Rep)4‐CTD1在升温和降温的过程中的倒置实验。
图7为(Rep)4‐CTD1在低温下形成的水凝胶的扫描电子显微镜的形貌图。
图中：A是(Rep)4‐CTD1在低温下形成水凝胶的形貌图，B为A中方框处的放大图。
图8为CTD1在不断升温过程(0℃～80℃)的流变学实验。
图中G’为弹性模量；G”为损耗模量。
图9为(CTD1)2在不断升温过程(0℃～80℃)的流变学实验。
图中G’为弹性模量；G”为损耗模量。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例通过构建目标蛋白的表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中实现表达生产。
本实施例具体操作包括：利用NdeI和XhoI两个限制性内切酶，构建产生了CTD1、CTD2、CTD3的表达载体。尔后，将不同载体转化进入Escherichia.coli BL21(DE3)细胞中，将该菌株在含氨苄青霉素的4mL LB培养基中37℃培养至OD600为1.8～2.0时，以1％的接种量转入含氨苄青霉素的100mL LB培养基中37℃培养；当OD600为3.0～4.0时，将其全部转入含氨苄青霉素的800mL的TB培养基中37℃培养；当OD600为6.0～8.0时，加入1mM的IPTG16℃诱导12～16h后收菌。
本实施例上述操作中涉及到的菌株、质粒、酶、抗生素和培养基为：克隆宿主Escherichia.coliDH5，表达宿主Escherichia.coliBL21(DE3)；表达质粒pET‐19b；限制性内切酶，T4DNA连接酶；氨苄青霉素；LB培养基，TB培养基。
所述的限制性内切酶为NdeI和XhoI。
所述的LB培养基的成分包括：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
所述的TB培养基的成分包括：12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母粉、5g/L甘油及10％(v/v)TB盐溶液。
所述的TB盐溶液是指：23.1g/L磷酸二氢钾和125.4g/L磷酸氢二钾组成的混合溶液。
实施例2
本实施例构建产生了(Rep)4‐CTD1、(CTD1)4的表达载体，并通过实施例1中的方法，在大肠杆菌Escherichia.coliBL21(DE3)中进行表达生产。
本实施例得到浓度为150mg/mL的蛋白溶液。利用旋转流变仪(HAAKE MARS III)以1rad/s的频率、2℃/min的实验条件，测定0℃～80℃间的流变学性质。
结果显示，(CTD1)2在升温的过程中，在～40℃时发生了相变(G’>G”)，水凝胶形成，且弹性模量(G’)不断变化，最大可达到105Pa(见图9)。
实施例3
本实施例中，按照1g的湿菌体对应10mLBufferA的比例重悬实施例1中得到的菌体；以0.5mg/mL的比例加入溶菌酶37℃孵育30min；超声破碎后12000rpm离心得到上清，经0.45μm的滤膜过滤之后上样于填充了Ni‐Sepharose的柱子上。用BufferB洗去非特异性结合的蛋白后，再用BufferC洗脱目标蛋白。以截流量为10kDa的浓缩管将目标蛋白浓缩到130～150mg/mL，再通过不断的添加，不断离心的方式将目标蛋白的溶剂换为pH7.2的20mM的磷酸盐缓冲液。
将BufferC的洗脱液跑还原条件下的SDS‐PAGE(如图1‐2所示)。图中的箭头所示为相应的重组蛋白的主条带。
上述亲和层析所用的缓冲液如下：
实施例4
本实施例是(Rep)x‐(CTDn)y中x取0、y取1、n取1的CTD1(亦是NcCTD)的水凝胶的制备。
本实施例通过测定实施例2中浓缩后的NcCTD的蛋白浓度，并将其稀释到50～150mg/mL；然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况；再将形成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
结果发现，CTD1分别在2℃～4℃和65℃～85℃范围内均可以形成透明的水凝胶(见图3)。有趣的是，低温下形成的水凝胶在温度逐渐升高的过程中又恢复到之前的水溶液状态，但高温下形成的水凝胶在温度不断下降的过程中是不能恢复的；另外，低温下比高温下形成的水凝胶更为紧密(见图4)，这可能是因为，在高温下存在水蒸发的问题，使得孔径变大。所以，低温下形成的水凝胶可能具有更广泛的用途。
实施例5
本实施例是(Rep)x‐(CTDn)y中x取0、y取4、n取1的(CTD1)4的水凝胶的制备。
本实施例通过测定实施例2中浓缩后的(CTD1)4的蛋白浓度，并将其稀释到
50～150mg/mL；然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况；再将形成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
实验结果发现，(CTD1)4失去了低温成胶的性能，只能在50℃～80℃范围内形成白色的水凝胶(见图5)，这与CTD1形成的透明水凝胶是不同的，另外这种多肽形成的水凝胶在温度下降的时候是不可恢复的，说明成胶的机制可能有所不同。再者，重复了四次的CTD1的成胶的最低温度由65℃降到50℃，说明我们可以通过调节CTD1的重复数，来调节其成胶的温度，以适应不同领域的需要。
实施例6
本实施例是(Rep)x‐(CTDn)y中x取4、y取1、n取1的(Rep)4‐CTD1的水凝胶的制备。
本实施例通过测定实施例2中浓缩后的(Rep)4‐CTD1的蛋白浓度，并将其稀释到50～150mg/mL；然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况；再将形成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
结果显示，(Rep)4‐CTD1失去了高温成胶的性能，只能在2℃～10℃范围内形成白色的水凝胶(见图6)，且在温度升高时是可恢复的。这与(CTD1)4形成的水凝胶的颜色是一致的，虽然它们分别是在低温和高温条件下形成的，但可能其成胶机制有一定的相似性。另外，其在低温下形成的水凝胶的孔径更为紧密(见图7)，这可能是由于Rep存在的原因。
实施例7
本实施例是对由CTD1制备形成水凝胶的物理化学表征。
本实施例通过实施例2的方法，得到浓度为150mg/mL的蛋白溶液。利用旋转流变仪(HAAKE MARS III)以1rad/s的频率、2℃/min的实验条件，测定0℃～80℃间的流变学性质。
结果显示，CTD1在低温下的弹性模量(G’)要小于损耗模量(G”)，说明未形成水凝胶，这可能是由于低温维持的时间不足以使其形成水凝胶；另外，随着温度的上升，G’和G”出现交点，随后G’>G”，说明此温度下发生相变，形成水凝胶，且弹性模量的最大值可达到105Pa(见图8)。故，高温条件下形成的水凝胶具有很好的弹性，又因为这种水凝胶具有热不可恢复性，所以可应用于组织工程等医学应用。
Claims (3)
1.一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET-19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶；
所述的蛋白溶液中的多肽为(Rep)x-(CTDn)y，其中：整数x代表Rep，即络新妇属蜘蛛(Nephila clavipes)牵引丝蛋白1(MaSP1)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16]；整数y代表CTD，即络新妇属蜘蛛(Nephila clavipes)、园蛛科蜘蛛(Araneus diadematus)或非洲育儿网蛛(Euprosthenops australis)的MaSP1的羧基末端结构域(CTD)序列重复的次数，取值范围为[1,8]；整数n代表CTD的种类，n为1、2、3，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD；
所述的Nephila clavipes牵引丝蛋白1(MaSP1)重复序列的单体氨基酸序列，如Seq IDNo.1所示；所述的NcCTD的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；所述的AdCTD的氨基酸序列如Seq ID No.4所示；所述的EaCTD的氨基酸序列如Seq ID No.5所示；
所述的人工设计核苷酸序列，包括：Rep、NcCTD、AdCTD和EaCTD的人工核苷酸序列，其中：
所述的Rep的人工核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
所述的NcCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.6所示；
所述的AdCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.7所示；
所述的EaCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No.8所示；
所述的温度控制，具体为：
a)对(Rep)x-(CTDn)y中，x为0，y为1，n取1～3间的任意整数的多肽CTDn来说，温度设置为2℃～10℃时，可形成透明且可热回复的水凝胶；温度设置为65℃～85℃时，形成透明且热不可回复的水凝胶；
b)对(Rep)x-(CTDn)y中，x为0，y为4，n取1～3间的任意整数的多肽(CTDn)4来说，温度设置为50℃～80℃时，形成白色且热不可回复的水凝胶；
c)对(Rep)x-(CTDn)y中，x为4，y为1，n取1～3间的任意整数的多肽(Rep)4-CTDn来说，温度设置为2℃～10℃时，形成白色且热可回复的水凝胶。
2.一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，其特征在于，根据权利要求1所述方法制备得到。
3.根据权利要求2所述的基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，其特征是，所述的水凝胶弹性模量为100～105Pa。
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