JPH10179171A - ペプチドグリカン認識蛋白質およびその製造法 - Google Patents
ペプチドグリカン認識蛋白質およびその製造法Info
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- JPH10179171A JPH10179171A JP9250190A JP25019097A JPH10179171A JP H10179171 A JPH10179171 A JP H10179171A JP 9250190 A JP9250190 A JP 9250190A JP 25019097 A JP25019097 A JP 25019097A JP H10179171 A JPH10179171 A JP H10179171A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ペプチドグリカン認識蛋白質（ＰＧＲＰ）を大
量に高純度で得る方法を提供する。 【解決手段】ＰＧＲＰをコードする遺伝子のクローン
化、該遺伝子を組み込んだ組換えベクターを得て、該組
換えベクターにより形質転換した形質転換体の培養によ
りＰＧＲＰを製造した。
量に高純度で得る方法を提供する。 【解決手段】ＰＧＲＰをコードする遺伝子のクローン
化、該遺伝子を組み込んだ組換えベクターを得て、該組
換えベクターにより形質転換した形質転換体の培養によ
りＰＧＲＰを製造した。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はペプチドグリカン認
識蛋白（ペプチド・グリカン・リコグニション・プロテ
イン、以下ＰＧＲＰと略称することもある）、それをコ
ードする遺伝子、その遺伝子を含有する組み換えベクタ
ー、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、
該形質転換体を培養することによるＰＧＲＰの製造法に
関する。
識蛋白（ペプチド・グリカン・リコグニション・プロテ
イン、以下ＰＧＲＰと略称することもある）、それをコ
ードする遺伝子、その遺伝子を含有する組み換えベクタ
ー、該組み換えベクターで形質転換された形質転換体、
該形質転換体を培養することによるＰＧＲＰの製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプチドグリカン（以下ＰＧと略称する
こともある）は、Ｎ−アセチルムラミン酸またはＮ−グ
リコリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含むことを特徴と
する糖ペプチドのポリマーで、細菌の細胞壁成分として
菌の形状の保持に重要な働きをしている。エンドトキシ
ンがグラム陰性菌のみに存在するのに対して、ペプチド
グリカンはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に存在
し、グラム陽性菌では細胞壁の最外殻に分厚い層を、グ
ラム陰性菌では外膜の内側に薄い層を形成している。エ
ンドトキシンもペプチドグリカンも持っていない古細菌
（メタン細菌、高度好酸性好熱菌等）を除くと、ほとん
どの原核生物がペプチドグリカンをその細胞壁に持って
おり、細菌が存在するところにはペプチドグリカンが存
在すると考えられる。一方、哺乳動物等、真核生物はペ
プチドグリカンをその細胞成分として含有していない。
したがってペプチドグリカンの検出、測定は、ＰＧを細
胞壁の構成成分としている真菌類及び微生物の微量検出
に有用であり、医薬品等の安全性試験、水や食品等の微
生物試験、感染症の診断などへの応用が期待される。ペ
プチドグリカンの化学構造は、各細菌によって異なるも
のの、いくつかの種類に分類され、例えばβ−１，４結
合したＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸の繰り返し構造を持つ糖鎖に、ムラミン酸のカルボ
キシル基を介して、３ないし４個のアミノ酸からなるペ
プチドサブユニットが結合し、このペプチドユニットが
直接または他のペプチドによって架橋されることにより
網目様の構造をとり、全体としては袋状になっている。
ペプチドグリカンは種々の生物活性を持っており、その
例を挙げると、ｉｎｖｉｔｒｏでは、マクロファージ、
Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等の免疫応答細胞に対する種々
の作用、血小板の破壊、繊維芽細胞の増殖促進、骨吸収
の促進、補体の活性化等が、ｉｎ ｖｉｖｏでは、体液
性免疫応答の増進または抑制、細胞性免疫の増強、細胞
内皮系の刺激、一過性の白血球減少ならびにその後の白
血球増加、インターフェロン誘導因子の作用を高める作
用、自然抵抗力の強化、実験自己免疫疾患の誘導、発熱
作用、エンドトキシンの毒性に対する感受性を高める作
用、睡眠の促進ないし抑制、類上皮肉芽腫形成、結核菌
等で処理した部位に出血壊死性炎を惹起する作用、急性
並びに慢性の毒性等がある。これらの活性の多くはエン
ドトキシンの作用と共通しており、その活性の強さは、
エンドトキシンに比べると弱い。しかしながら、このよ
うな活性を有していることから、例えば医薬品、食品中
のペプチドグリカンの検出・定量は、今後一層その重要
性を増してくると考えられている。ＰＧの検出・定量方
法としては、本発明者らによって開発された、蚕体液由
来の試薬を用いる方法（特公平７−１１４７０７号）が
報告されている。この方法では、試料中の総ＰＧ量を測
定することは可能であるが、例えば組織切片等の固体中
のＰＧの分布の検査や、組織切片中の細菌の特異的染色
等を行なうことはできなかった。そのため、この様な目
的に使用可能なＰＧの特異的検出・定量方法の開発が望
まれていた。このようなＰＧの特異的検出・定量方法は
ＰＧに特異的に結合する物質を用いることにより達成し
得ると考えられているが、好ましい性質を有する物質を
安価に且つ大量に入手することができないために未だ実
用的な方法は開発されていないのが現状である。即ち、
ＰＧに特異的に反応する物質としては、例えばリゾチー
ムや本発明者らが見出したペプチドグリカン認識蛋白
〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Bio.Chem.）vol.271,No.23,pp.13854-13860(199
2)〕等が知られているが、リゾチームはＰＧと結合して
これを分解する性質を有する酵素であるためこの様な目
的に使用するには不向きなものであり、また、ペプチド
グリカン認識蛋白は蚕等の昆虫体液から精製しなければ
得られないが体液中には僅かしか含まれていないため、
これを用いた試薬も価格的な面から実用的なものとは言
い難いものであった。そのため、ペプチドグリカン認識
蛋白を安価に且つ大量に得られる方法の開発が望まれて
いる現状にある。
こともある）は、Ｎ−アセチルムラミン酸またはＮ−グ
リコリルムラミン酸とＤ−アミノ酸を含むことを特徴と
する糖ペプチドのポリマーで、細菌の細胞壁成分として
菌の形状の保持に重要な働きをしている。エンドトキシ
ンがグラム陰性菌のみに存在するのに対して、ペプチド
グリカンはグラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に存在
し、グラム陽性菌では細胞壁の最外殻に分厚い層を、グ
ラム陰性菌では外膜の内側に薄い層を形成している。エ
ンドトキシンもペプチドグリカンも持っていない古細菌
（メタン細菌、高度好酸性好熱菌等）を除くと、ほとん
どの原核生物がペプチドグリカンをその細胞壁に持って
おり、細菌が存在するところにはペプチドグリカンが存
在すると考えられる。一方、哺乳動物等、真核生物はペ
プチドグリカンをその細胞成分として含有していない。
したがってペプチドグリカンの検出、測定は、ＰＧを細
胞壁の構成成分としている真菌類及び微生物の微量検出
に有用であり、医薬品等の安全性試験、水や食品等の微
生物試験、感染症の診断などへの応用が期待される。ペ
プチドグリカンの化学構造は、各細菌によって異なるも
のの、いくつかの種類に分類され、例えばβ−１，４結
合したＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミ
ン酸の繰り返し構造を持つ糖鎖に、ムラミン酸のカルボ
キシル基を介して、３ないし４個のアミノ酸からなるペ
プチドサブユニットが結合し、このペプチドユニットが
直接または他のペプチドによって架橋されることにより
網目様の構造をとり、全体としては袋状になっている。
ペプチドグリカンは種々の生物活性を持っており、その
例を挙げると、ｉｎｖｉｔｒｏでは、マクロファージ、
Ｂリンパ球、Ｔリンパ球等の免疫応答細胞に対する種々
の作用、血小板の破壊、繊維芽細胞の増殖促進、骨吸収
の促進、補体の活性化等が、ｉｎ ｖｉｖｏでは、体液
性免疫応答の増進または抑制、細胞性免疫の増強、細胞
内皮系の刺激、一過性の白血球減少ならびにその後の白
血球増加、インターフェロン誘導因子の作用を高める作
用、自然抵抗力の強化、実験自己免疫疾患の誘導、発熱
作用、エンドトキシンの毒性に対する感受性を高める作
用、睡眠の促進ないし抑制、類上皮肉芽腫形成、結核菌
等で処理した部位に出血壊死性炎を惹起する作用、急性
並びに慢性の毒性等がある。これらの活性の多くはエン
ドトキシンの作用と共通しており、その活性の強さは、
エンドトキシンに比べると弱い。しかしながら、このよ
うな活性を有していることから、例えば医薬品、食品中
のペプチドグリカンの検出・定量は、今後一層その重要
性を増してくると考えられている。ＰＧの検出・定量方
法としては、本発明者らによって開発された、蚕体液由
来の試薬を用いる方法（特公平７−１１４７０７号）が
報告されている。この方法では、試料中の総ＰＧ量を測
定することは可能であるが、例えば組織切片等の固体中
のＰＧの分布の検査や、組織切片中の細菌の特異的染色
等を行なうことはできなかった。そのため、この様な目
的に使用可能なＰＧの特異的検出・定量方法の開発が望
まれていた。このようなＰＧの特異的検出・定量方法は
ＰＧに特異的に結合する物質を用いることにより達成し
得ると考えられているが、好ましい性質を有する物質を
安価に且つ大量に入手することができないために未だ実
用的な方法は開発されていないのが現状である。即ち、
ＰＧに特異的に反応する物質としては、例えばリゾチー
ムや本発明者らが見出したペプチドグリカン認識蛋白
〔ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Bio.Chem.）vol.271,No.23,pp.13854-13860(199
2)〕等が知られているが、リゾチームはＰＧと結合して
これを分解する性質を有する酵素であるためこの様な目
的に使用するには不向きなものであり、また、ペプチド
グリカン認識蛋白は蚕等の昆虫体液から精製しなければ
得られないが体液中には僅かしか含まれていないため、
これを用いた試薬も価格的な面から実用的なものとは言
い難いものであった。そのため、ペプチドグリカン認識
蛋白を安価に且つ大量に得られる方法の開発が望まれて
いる現状にある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ペプチドグリカン認識
蛋白（ＰＧＲＰ）を大量に高純度で得る方法を提供する
ことが本発明の課題である。
蛋白（ＰＧＲＰ）を大量に高純度で得る方法を提供する
ことが本発明の課題である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＧＲＰの一次構造
を解明してこれをコードするｃＤＮＡのクローン化に成
功し、このｃＤＮＡの塩基配列に基きＰＧＲＰのアミノ
酸配列の決定に成功し、そしてこのＤＮＡを用いた遺伝
子組換え技術によりＰＧＲＰを製造することによって上
記課題を解決することに成功したものである。即ち、本
発明は （１）以下の（ａ）（配列番号：１）または（ｂ）のア
ミノ酸配列を含有する組換えタンパク質： （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質、 （２）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコード
する遺伝子： （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質、 （３）以下の（ｃ）（配列番号：２）または（ｄ）のタ
ンパク質をコードする遺伝子： （ｃ） Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識蛋白のアミノ酸配列を
有するタンパク質、 （４）以下の（ｅ）（配列番号：３）又は（ｆ）のＤＮ
Ａからなる遺伝子： （ｅ） GATTGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCC GTGAGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTG CGGAATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGT AACGGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCC ATCGGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCG CTGCTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATT GCCTCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGAC TCCATCAAGAACGCGTAA （ｆ）（ｅ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ、 （５）以下の（ｇ）（配列番号：４）又は（ｈ）のＤＮ
Ａからなる遺伝子： （ｇ） ATGGCCCGCCTCCACTCGGCAGTTGTACTCGCGCTCGCTCTCAGCTCGCTTCTCACAGAAATAGCAGCCGAT TGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCCGTG AGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTGCGG AATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGTAAC GGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCCATC GGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCGCTG CTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATTGCC TCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGACTCC ATCAAGAACGCGTAA （ｈ）（ｇ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ、 （６）（２）、（３）、（４）又は（５）記載の遺伝子
を含有する組み換えベクター、 （７）（６）記載の組み換えベクターで形質転換してな
る形質転換体、および （８）（７）記載の形質転換体を培地で培養し、得られ
る培養物からペプチドグリカン認識蛋白質を回収するこ
とを特徴とするペプチドグリカン認識蛋白質の製造法、
に関するものである。本発明のＰＧＲＰは配列番号１の
アミノ酸を含有するタンパク質であり、その具体例とし
て配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドの他、ペ
プチドグリカン認識活性を有するポリペプチドであれ
ば、配列番号１におけるアミノ酸の１又は数個のアミノ
酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸からなるものも本
発明の範疇に含まれるものである。またその由来につい
ても特に限定されるものではなく、蚕以外の昆虫由来の
ＰＧＲＰも本発明の範疇に含まれる。この蚕以外の昆虫
としては、例えばタバコスズメガ等の鱗翅類、センチニ
クバエ、イエバエ等の双翅類、トノサマバッタ、エンマ
コオロギ等の直翅類、センノキカミキリ等の甲虫類等が
挙げられる。なお、ここでいうペプチドグリカン認識活
性とは、ペプチドグリカンと特異的に結合する能力のこ
とを言い、その測定は、例えば J.Bio.Chem.,vol.271,N
o.23,p.13855(1992)等に記載された方法（後述の参考例
参照）に準じて行なえばよい。本発明のＰＧＲＰをコー
ドする遺伝子としては上記アミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡであれば如何なるものでもよ
く更にその転写産物であるｍＲＮＡをも包含するもので
ある。具体例としては配列番号３で表されるＤＮＡ配列
を含有するものが挙げられ、配列番号３で表されるＤＮ
Ａ配列からなるものの他、配列番号４で表されるＤＮＡ
配列（後述の、プロ部分を有する配列番号２のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列）を有
するものが挙げられる。また上記塩基配列からなるＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つペプチドグリカン認識活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡも本発明の範疇に含まれるものである。本
発明で用いられるストリンジェントな条件とは、５０％
ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、２×ＰＩＰＥＳ（０．
８Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．
５）中、４２℃でハイブリダイズし、好ましくは０．１
％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ−クエン酸緩
衝液）中、５８℃で洗浄した後でさえもハイブリゼーシ
ョンがまだ起こる条件を意味する。またその由来につい
ても特に限定されるものではなく、蚕以外の昆虫由来の
ＰＧＲＰをコードする遺伝子も本発明の範疇に含まれる
ものである。この蚕以外の昆虫としては、例えばタバコ
スズメガ等の鱗翅類、センチニクバエ、イエバエ等の双
翅類、トノサマバッタ、エンマコオロギ等の直翅類、セ
ンノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられる。本発明のＤ
ＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。
例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成に
よって得られるＤＮＡ、およびこれらを適当に組み合わ
せて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。Ｐ
ＧＲＰのｍＲＮＡはＰＧＲＰをコードするＤＮＡの塩基
配列に対応するＲＮＡ配列を有するもので、該ＤＮＡの
塩基配列中、チミンがウラシルに置換した配列を有する
ものである。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ＰＧＲＰの一次構造
を解明してこれをコードするｃＤＮＡのクローン化に成
功し、このｃＤＮＡの塩基配列に基きＰＧＲＰのアミノ
酸配列の決定に成功し、そしてこのＤＮＡを用いた遺伝
子組換え技術によりＰＧＲＰを製造することによって上
記課題を解決することに成功したものである。即ち、本
発明は （１）以下の（ａ）（配列番号：１）または（ｂ）のア
ミノ酸配列を含有する組換えタンパク質： （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質、 （２）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコード
する遺伝子： （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質、 （３）以下の（ｃ）（配列番号：２）または（ｄ）のタ
ンパク質をコードする遺伝子： （ｃ） Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識蛋白のアミノ酸配列を
有するタンパク質、 （４）以下の（ｅ）（配列番号：３）又は（ｆ）のＤＮ
Ａからなる遺伝子： （ｅ） GATTGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCC GTGAGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTG CGGAATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGT AACGGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCC ATCGGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCG CTGCTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATT GCCTCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGAC TCCATCAAGAACGCGTAA （ｆ）（ｅ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ、 （５）以下の（ｇ）（配列番号：４）又は（ｈ）のＤＮ
Ａからなる遺伝子： （ｇ） ATGGCCCGCCTCCACTCGGCAGTTGTACTCGCGCTCGCTCTCAGCTCGCTTCTCACAGAAATAGCAGCCGAT TGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCCGTG AGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTGCGG AATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGTAAC GGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCCATC GGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCGCTG CTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATTGCC TCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGACTCC ATCAAGAACGCGTAA （ｈ）（ｇ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ、 （６）（２）、（３）、（４）又は（５）記載の遺伝子
を含有する組み換えベクター、 （７）（６）記載の組み換えベクターで形質転換してな
る形質転換体、および （８）（７）記載の形質転換体を培地で培養し、得られ
る培養物からペプチドグリカン認識蛋白質を回収するこ
とを特徴とするペプチドグリカン認識蛋白質の製造法、
に関するものである。本発明のＰＧＲＰは配列番号１の
アミノ酸を含有するタンパク質であり、その具体例とし
て配列番号１のアミノ酸からなるポリペプチドの他、ペ
プチドグリカン認識活性を有するポリペプチドであれ
ば、配列番号１におけるアミノ酸の１又は数個のアミノ
酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸からなるものも本
発明の範疇に含まれるものである。またその由来につい
ても特に限定されるものではなく、蚕以外の昆虫由来の
ＰＧＲＰも本発明の範疇に含まれる。この蚕以外の昆虫
としては、例えばタバコスズメガ等の鱗翅類、センチニ
クバエ、イエバエ等の双翅類、トノサマバッタ、エンマ
コオロギ等の直翅類、センノキカミキリ等の甲虫類等が
挙げられる。なお、ここでいうペプチドグリカン認識活
性とは、ペプチドグリカンと特異的に結合する能力のこ
とを言い、その測定は、例えば J.Bio.Chem.,vol.271,N
o.23,p.13855(1992)等に記載された方法（後述の参考例
参照）に準じて行なえばよい。本発明のＰＧＲＰをコー
ドする遺伝子としては上記アミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡであれば如何なるものでもよ
く更にその転写産物であるｍＲＮＡをも包含するもので
ある。具体例としては配列番号３で表されるＤＮＡ配列
を含有するものが挙げられ、配列番号３で表されるＤＮ
Ａ配列からなるものの他、配列番号４で表されるＤＮＡ
配列（後述の、プロ部分を有する配列番号２のアミノ酸
配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列）を有
するものが挙げられる。また上記塩基配列からなるＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つペプチドグリカン認識活性を有するタンパク質をコー
ドするＤＮＡも本発明の範疇に含まれるものである。本
発明で用いられるストリンジェントな条件とは、５０％
ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、２×ＰＩＰＥＳ（０．
８Ｍ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液ｐＨ６．
５）中、４２℃でハイブリダイズし、好ましくは０．１
％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ（ＮａＣｌ−クエン酸緩
衝液）中、５８℃で洗浄した後でさえもハイブリゼーシ
ョンがまだ起こる条件を意味する。またその由来につい
ても特に限定されるものではなく、蚕以外の昆虫由来の
ＰＧＲＰをコードする遺伝子も本発明の範疇に含まれる
ものである。この蚕以外の昆虫としては、例えばタバコ
スズメガ等の鱗翅類、センチニクバエ、イエバエ等の双
翅類、トノサマバッタ、エンマコオロギ等の直翅類、セ
ンノキカミキリ等の甲虫類等が挙げられる。本発明のＤ
ＮＡは、いかなる方法で得られるものであってもよい。
例えばｍＲＮＡから調製される相補ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）、ゲノムＤＮＡから調製されるＤＮＡ、化学合成に
よって得られるＤＮＡ、およびこれらを適当に組み合わ
せて構築されるＤＮＡをも全て包含するものである。Ｐ
ＧＲＰのｍＲＮＡはＰＧＲＰをコードするＤＮＡの塩基
配列に対応するＲＮＡ配列を有するもので、該ＤＮＡの
塩基配列中、チミンがウラシルに置換した配列を有する
ものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明のＰＧＲＰをコードするＤ
ＮＡは、該ポリペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクロ
ーン化する方法、ＰＧＲＰゲノムＤＮＡから単離する方
法、化学合成する方法等により取得することができる。 （１）例えばＰＧＲＰのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクロー
ン化する方法としては、以下の方法が例示される。ま
ず、蚕幼虫より脂肪体を採取し、その脂肪体から蚕ＰＧ
ＲＰをコードするｍＲＮＡを例えばグアニジンチオシア
ネート法〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８， ５２９４（１９７
９）〕などの公知の方法や市販のキット〔例えば、
（株）ニッポンジーン製のＩＳＯＧＥＮ〕等を利用して
調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転
写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama, H.ら
の方法｛Okayama, H. et al., Mol.Cell.Biol.,2,161(1
982)および同誌3,280 (1983)｝やGubler, U.とHoffman,
B.J.の方法｛Gubler, U.and Hoffman,B.J.,Gene, 25,26
3 (1983)｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃ
ＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行なう〔Maniatis,
Y.ら、Cell, 8, 163 (1976)〕。このｃＤＮＡをプラス
ミドベクターもしくはファージベクターに組み込むこと
によって蚕脂肪体ｃＤＮＡライブラリーを構築する。な
お、これらの工程は市販のキット〔例えば、ストラタジ
ーン社製のZAP cDNA Synthesis kit等〕を利用して行な
ってもよい。ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で自己増殖できるものであればよい。ただし、後述の免
疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内でＰＧＲ
Ｐ遺伝子を発現させ得るプロモーターを有したベクター
である必要がある。
ＮＡは、該ポリペプチドのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクロ
ーン化する方法、ＰＧＲＰゲノムＤＮＡから単離する方
法、化学合成する方法等により取得することができる。 （１）例えばＰＧＲＰのｍＲＮＡからｃＤＮＡをクロー
ン化する方法としては、以下の方法が例示される。ま
ず、蚕幼虫より脂肪体を採取し、その脂肪体から蚕ＰＧ
ＲＰをコードするｍＲＮＡを例えばグアニジンチオシア
ネート法〔Ｃｈｉｒｇｗｉｎ， Ｊ．Ｍ． ｅｔ ａ
ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８， ５２９４（１９７
９）〕などの公知の方法や市販のキット〔例えば、
（株）ニッポンジーン製のＩＳＯＧＥＮ〕等を利用して
調製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として、例えば逆転
写酵素を用いる等の公知の方法〔例えばOkayama, H.ら
の方法｛Okayama, H. et al., Mol.Cell.Biol.,2,161(1
982)および同誌3,280 (1983)｝やGubler, U.とHoffman,
B.J.の方法｛Gubler, U.and Hoffman,B.J.,Gene, 25,26
3 (1983)｝が例示される。〕でｃＤＮＡ鎖を合成し、ｃ
ＤＮＡの二本鎖ｃＤＮＡへの変換を行なう〔Maniatis,
Y.ら、Cell, 8, 163 (1976)〕。このｃＤＮＡをプラス
ミドベクターもしくはファージベクターに組み込むこと
によって蚕脂肪体ｃＤＮＡライブラリーを構築する。な
お、これらの工程は市販のキット〔例えば、ストラタジ
ーン社製のZAP cDNA Synthesis kit等〕を利用して行な
ってもよい。ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主内で複製保持されるものであれば特に制限さ
れず、また用いられるファージベクターとしても宿主内
で自己増殖できるものであればよい。ただし、後述の免
疫学的スクリーニングに供する場合は、宿主内でＰＧＲ
Ｐ遺伝子を発現させ得るプロモーターを有したベクター
である必要がある。
【０００６】プラスミドに、ＤＮＡを組み込む方法とし
ては、例えばManiatis,T.ら，モレキュラークローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル〔モレキュラー・ク
ローニング（Moleculer Cloning）、A Laboratory Manu
al）,Cold Spring Harbor Laboratory,1,82 (1982)〕
に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクタ
ーにＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunh,T.V.らの方
法〔Hyunh,T.V.,ＤＮＡクローニング・プラクティカル
・アプローチ（DNA Cloning．a practical approach）
1,49(1985)〕などが挙げられる。このようにして得られ
る組換えプラスミドやファージベクターを原核細胞や真
核細胞の適当な宿主に導入する。プラスミドを宿主に導
入する方法としては、Maniatis,T.ら，モレキュラーク
ローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル〔モレキュ
ラー・クローニング（Moleculer Cloning）、A Laborat
ory Manual）,Cold Spring Harbor Laboratory,1,82
(1982)〕に記載のカルシウムクロライド法またはカルシ
ウムクロライド法／ルビジウムクロライド法等が挙げら
れる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法と
してはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした
後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。
ては、例えばManiatis,T.ら，モレキュラークローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル〔モレキュラー・ク
ローニング（Moleculer Cloning）、A Laboratory Manu
al）,Cold Spring Harbor Laboratory,1,82 (1982)〕
に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクタ
ーにＤＮＡを組み込む方法としては、Hyunh,T.V.らの方
法〔Hyunh,T.V.,ＤＮＡクローニング・プラクティカル
・アプローチ（DNA Cloning．a practical approach）
1,49(1985)〕などが挙げられる。このようにして得られ
る組換えプラスミドやファージベクターを原核細胞や真
核細胞の適当な宿主に導入する。プラスミドを宿主に導
入する方法としては、Maniatis,T.ら，モレキュラーク
ローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル〔モレキュ
ラー・クローニング（Moleculer Cloning）、A Laborat
ory Manual）,Cold Spring Harbor Laboratory,1,82
(1982)〕に記載のカルシウムクロライド法またはカルシ
ウムクロライド法／ルビジウムクロライド法等が挙げら
れる。また、ファージベクターを宿主に導入する方法と
してはファージＤＮＡをインビトロパッケージングした
後、増殖させた宿主に導入する方法等が例示される。
【０００７】上記の方法によって構築されたＤＮＡライ
ブラリーから該ＰＧＲＰをコードするＤＮＡを単離する
方法としては、下記の方法が例示される。例えば、ＰＧ
ＲＰの部分アミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した後、これを32Ｐでラベルし
てプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法〔Crunstein,M.and Hogness,D.S.:プロシージン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）72:3
961(1975)〕またはプラークハイブリダイゼーション法
〔モレキュラー・クローニング（Moleculer Cloning）,
A Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory,
1,82 (1982)〕により、目的のＤＮＡを含有するクロー
ンを選択する。またＰＧＲＰに対する抗体により抗原抗
体反応を利用して目的のＤＮＡを有するクローンを選択
する方法、或いはＰＧＲＰ遺伝子の特定領域をポリメラ
ーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ＰＧＲ
Ｐ遺伝子を単離する方法などがある。単離した結果、該
遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離したＤ
ＮＡ断片もしくはその一部をプローブとして用いたコロ
ニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダ
イゼーションによって再度ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、最終的には全遺伝子領域を
取得することができる。この様にして得られたＤＮＡの
塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam,A.M.and Gi
lbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560(1977)〕ある
いはジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔Messing,J
らヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid R
es）9,309(1981)〕によって決定し、ＰＧＲＰ遺伝子の
存在を確認することができる。かくして得られるクロー
ンからＰＧＲＰ遺伝子を制限酵素によって切り出すこと
により取得できる。
ブラリーから該ＰＧＲＰをコードするＤＮＡを単離する
方法としては、下記の方法が例示される。例えば、ＰＧ
ＲＰの部分アミノ酸配列に対応すると考えられるオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した後、これを32Ｐでラベルし
てプローブとなし、公知のコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法〔Crunstein,M.and Hogness,D.S.:プロシージン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）72:3
961(1975)〕またはプラークハイブリダイゼーション法
〔モレキュラー・クローニング（Moleculer Cloning）,
A Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory,
1,82 (1982)〕により、目的のＤＮＡを含有するクロー
ンを選択する。またＰＧＲＰに対する抗体により抗原抗
体反応を利用して目的のＤＮＡを有するクローンを選択
する方法、或いはＰＧＲＰ遺伝子の特定領域をポリメラ
ーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ＰＧＲ
Ｐ遺伝子を単離する方法などがある。単離した結果、該
遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離したＤ
ＮＡ断片もしくはその一部をプローブとして用いたコロ
ニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダ
イゼーションによって再度ｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングすることにより、最終的には全遺伝子領域を
取得することができる。この様にして得られたＤＮＡの
塩基配列はマキサム・ギルバート法〔Maxam,A.M.and Gi
lbert,W.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:560(1977)〕ある
いはジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔Messing,J
らヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acid R
es）9,309(1981)〕によって決定し、ＰＧＲＰ遺伝子の
存在を確認することができる。かくして得られるクロー
ンからＰＧＲＰ遺伝子を制限酵素によって切り出すこと
により取得できる。
【０００８】（２）また蚕脂肪体のゲノムＤＮＡからＰ
ＧＲＰをコードするＤＮＡを単離することによる調製方
法としては、例えば以下の方法を挙げることができる。
蚕脂肪体を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を
用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡ
の脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはＲＮアーゼによ
り消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部
分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたは
コスミド中で増幅し、そして目的の配列を有するクロー
ンを例えば放射線標識されたＤＮＡプローブを用いる方
法等により検出し、該クローンからＰＧＲＰの遺伝子を
制限酵素等により切り出し取得する。
ＧＲＰをコードするＤＮＡを単離することによる調製方
法としては、例えば以下の方法を挙げることができる。
蚕脂肪体を好ましくはＳＤＳまたはプロテナーゼＫ等を
用いて溶解し、フェノールによる抽出を反復してＤＮＡ
の脱蛋白質を行う。ＲＮＡを好ましくはＲＮアーゼによ
り消化する。得られるＤＮＡを適当な制限酵素により部
分消化し、得られるＤＮＡ断片を適当なファージまたは
コスミド中で増幅し、そして目的の配列を有するクロー
ンを例えば放射線標識されたＤＮＡプローブを用いる方
法等により検出し、該クローンからＰＧＲＰの遺伝子を
制限酵素等により切り出し取得する。
【０００９】（３）さらに、ＰＧＲＰの部分アミノ酸配
列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合
成した後、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、上
記（２）と同じく調製されたＰＧＲＰゲノムの例えばＢ
ａｍＨＩ等の制限酵素消化産物とサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行い、目的とする遺伝子付近の制限
酵素地図を作製する。調製したＰＧＲＰゲノムＤＮＡを
適当な制限酵素で消化しＤＮＡを断片化する。ＤＮＡ片
をゲル電気泳動またはゲルろ過等の分子量分画法により
分画し、作製した制限酵素地図を参考にして目的の遺伝
子を含むＤＮＡ片が含まれる画分を分取する。分取した
ＤＮＡ片群をプラスミドベクターもしくはファージベク
ターに組み込むことにより、限定的なＰＧＲＰゲノムＤ
ＮＡライブラリーを構築する。ＰＧＲＰをコードするＤ
ＮＡを含むクローンは、前述の32Ｐでラベルしたプロー
ブによるコロニーハイブリダイゼーション法またはプラ
ークハイブリダイゼーション法により選択する。また該
ポリペプチドに対する抗体により抗原抗体反応を利用し
て目的のＤＮＡを有するクローンを選択する方法、或い
は該ポリペプチド遺伝子の特定領域をポリメラーゼ連鎖
反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ポリペプチド遺
伝子を単離する方法などがある。単離した該ポリペプチ
ド遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離した
ＤＮＡ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとし
て、前述の様にＰＧＲＰゲノムＤＮＡのサザンブロット
ハイブリダイゼーションを行い、他の様々な制限酵素消
化により得られるＤＮＡ断片群から目的の遺伝子の残り
の部分を含むＰＧＲＰゲノムＤＮＡ断片を推測する。こ
れを前述の方法で分画し分取したＤＮＡ片群で再度ＰＧ
ＲＰゲノムＤＮＡライブラリーを構築し、単離したＤＮ
Ａ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして目
的のＤＮＡを含有するクローンを選択することにより、
最終的に全遺伝子領域を取得することができる。かくし
て得られるクローンからＰＧＲＰポリペプチド遺伝子を
制限酵素によって切り出すことにより取得できる。
列に対応すると考えられるオリゴヌクレオチドを化学合
成した後、これを32Ｐでラベルしてプローブとなし、上
記（２）と同じく調製されたＰＧＲＰゲノムの例えばＢ
ａｍＨＩ等の制限酵素消化産物とサザンブロットハイブ
リダイゼーションを行い、目的とする遺伝子付近の制限
酵素地図を作製する。調製したＰＧＲＰゲノムＤＮＡを
適当な制限酵素で消化しＤＮＡを断片化する。ＤＮＡ片
をゲル電気泳動またはゲルろ過等の分子量分画法により
分画し、作製した制限酵素地図を参考にして目的の遺伝
子を含むＤＮＡ片が含まれる画分を分取する。分取した
ＤＮＡ片群をプラスミドベクターもしくはファージベク
ターに組み込むことにより、限定的なＰＧＲＰゲノムＤ
ＮＡライブラリーを構築する。ＰＧＲＰをコードするＤ
ＮＡを含むクローンは、前述の32Ｐでラベルしたプロー
ブによるコロニーハイブリダイゼーション法またはプラ
ークハイブリダイゼーション法により選択する。また該
ポリペプチドに対する抗体により抗原抗体反応を利用し
て目的のＤＮＡを有するクローンを選択する方法、或い
は該ポリペプチド遺伝子の特定領域をポリメラーゼ連鎖
反応法（ＰＣＲ法）を用いて増幅し、該ポリペプチド遺
伝子を単離する方法などがある。単離した該ポリペプチ
ド遺伝子の全領域が取得されていない場合は、単離した
ＤＮＡ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとし
て、前述の様にＰＧＲＰゲノムＤＮＡのサザンブロット
ハイブリダイゼーションを行い、他の様々な制限酵素消
化により得られるＤＮＡ断片群から目的の遺伝子の残り
の部分を含むＰＧＲＰゲノムＤＮＡ断片を推測する。こ
れを前述の方法で分画し分取したＤＮＡ片群で再度ＰＧ
ＲＰゲノムＤＮＡライブラリーを構築し、単離したＤＮ
Ａ片もしくはその一部のＤＮＡ断片をプローブとして目
的のＤＮＡを含有するクローンを選択することにより、
最終的に全遺伝子領域を取得することができる。かくし
て得られるクローンからＰＧＲＰポリペプチド遺伝子を
制限酵素によって切り出すことにより取得できる。
【００１０】さらに本発明は、上述のＰＧＲＰポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターであ
る。当該組換えベクターは、上述のＰＧＲＰポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含有し、原核細胞および／また
は真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖で
きるものであれば特に限定されず、自体公知の組換えベ
クターの構築方法〔例えばモレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）, A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, 1, 82 (1982)等〕により構
築されたもの等が挙げられる。本発明の組換えベクター
を構築する際に使用されるベクターとしては、プラスミ
ドベクター及びファージベクター等の原核細胞および／
または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増
殖できるものであれば特に限定されず、天然のプラスミ
ド，人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミド
から調製されたＤＮＡフラグメント），合成プラスミド
等が用いられる。また、本発明の組換えベクターは、簡
便には当業界において入手可能なベクターに、該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを常法により組み込むことに
より調製することもできる。かかるベクターとして具体
的には、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ
１２，ｐＵＣ１３，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の大腸菌
由来のプラスミド、例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５等の
酵母由来プラスミド、例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，
ｐＣ１９４等の枯草菌由来プラスミド等が例示される。
また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオフ
ァージが、更にレトロウイルス、ワクシニアウィルス、
バキュロウィルスなどの核多角体ウィルス等の動物や昆
虫に寄生するウィルスが例示されるが、好ましくはプラ
スミドベクター、バクテリオファージベクター、バキュ
ロウィルスベクターが挙げられる。また、ＰＧＲＰポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを発現させ、これらタンパ
ク質を生産させる目的を達成するためには、本発明の組
換えベクターを構築する際に、当該ＤＮＡを発現ベクタ
ーに組み込むことが望ましい。これら発現ベクターとし
ては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内
で複製保持または自己増殖できるものであって、原核細
胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でＰＧＲ
ＰＤＮＡを発現させる機能、換言すれば、目的のタンパ
ク質を生産させる機能を有するものであれば特に限定さ
れない。当業界において入手可能なかかる発現ベクター
としては、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉの場合は、例えばｐ
ＢＲ３２２，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＴｒｃＨｉ
ｓ，ｐＭＡＬ−ｃ２，ｐＭＡＬ−ｐ２、もしくはその人
工的修飾物（該ベクターを適当な制限酵素で処理して得
られるＤＮＡフラグメント）等が、宿主細胞が酵母の場
合は、例えばプラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，
ｐＲＳ４１３，ｐＲＳ４１４，ｐＹＥＳ２等が、また宿
主細胞が動物細胞の場合は、例えばプラスミドｐＲＳＶ
ｎｅｏ ＡＴＣＣ ３７１９８，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ Ａ
ＴＣＣ ３７１４５，ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ ＡＴ
ＣＣ ３７２２４，ｐＳＶ２ｎｅｏＡＴＣＣ ３７１４
９等が，宿主細胞が昆虫細胞の場合は、例えばオートグ
ラフィカル カリホルニカ（Autographica californic
a）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、ボンビックス モ
リ（Bombyx mori）核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）等
が好ましく挙げられる。宿主細胞として細菌、特にＥ．
ｃｏｌｉを用いる場合、本発明の組換えベクターは、プ
ロモーター−オペレーター領域，開始コドン，本発明Ｐ
ＧＲＰをコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネータ
ー領域等を含んでなるものが一般的である。また、宿主
細胞として酵母または動物細胞を用いる場合、本発明の
組換えベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明
ＰＧＲＰをコードするＤＮＡ，終止コドン等を含んでな
るものが一般的である。尚、シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明のＰＧＲＰの
５’側及び３’側の非翻訳領域を組換えベクターに組み
込むことは任意である。
チドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターであ
る。当該組換えベクターは、上述のＰＧＲＰポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含有し、原核細胞および／また
は真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増殖で
きるものであれば特に限定されず、自体公知の組換えベ
クターの構築方法〔例えばモレキュラー・クローニング
（Molecular Cloning）, A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, 1, 82 (1982)等〕により構
築されたもの等が挙げられる。本発明の組換えベクター
を構築する際に使用されるベクターとしては、プラスミ
ドベクター及びファージベクター等の原核細胞および／
または真核細胞の各種の宿主内で複製保持または自己増
殖できるものであれば特に限定されず、天然のプラスミ
ド，人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミド
から調製されたＤＮＡフラグメント），合成プラスミド
等が用いられる。また、本発明の組換えベクターは、簡
便には当業界において入手可能なベクターに、該ポリペ
プチドをコードするＤＮＡを常法により組み込むことに
より調製することもできる。かかるベクターとして具体
的には、例えば、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ
１２，ｐＵＣ１３，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の大腸菌
由来のプラスミド、例えばｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５等の
酵母由来プラスミド、例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，
ｐＣ１９４等の枯草菌由来プラスミド等が例示される。
また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオフ
ァージが、更にレトロウイルス、ワクシニアウィルス、
バキュロウィルスなどの核多角体ウィルス等の動物や昆
虫に寄生するウィルスが例示されるが、好ましくはプラ
スミドベクター、バクテリオファージベクター、バキュ
ロウィルスベクターが挙げられる。また、ＰＧＲＰポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを発現させ、これらタンパ
ク質を生産させる目的を達成するためには、本発明の組
換えベクターを構築する際に、当該ＤＮＡを発現ベクタ
ーに組み込むことが望ましい。これら発現ベクターとし
ては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主内
で複製保持または自己増殖できるものであって、原核細
胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中でＰＧＲ
ＰＤＮＡを発現させる機能、換言すれば、目的のタンパ
ク質を生産させる機能を有するものであれば特に限定さ
れない。当業界において入手可能なかかる発現ベクター
としては、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉの場合は、例えばｐ
ＢＲ３２２，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＴｒｃＨｉ
ｓ，ｐＭＡＬ−ｃ２，ｐＭＡＬ−ｐ２、もしくはその人
工的修飾物（該ベクターを適当な制限酵素で処理して得
られるＤＮＡフラグメント）等が、宿主細胞が酵母の場
合は、例えばプラスミドｐＲＳ４０３，ｐＲＳ４０４，
ｐＲＳ４１３，ｐＲＳ４１４，ｐＹＥＳ２等が、また宿
主細胞が動物細胞の場合は、例えばプラスミドｐＲＳＶ
ｎｅｏ ＡＴＣＣ ３７１９８，ｐＳＶ２ｄｈｆｒ Ａ
ＴＣＣ ３７１４５，ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ ＡＴ
ＣＣ ３７２２４，ｐＳＶ２ｎｅｏＡＴＣＣ ３７１４
９等が，宿主細胞が昆虫細胞の場合は、例えばオートグ
ラフィカル カリホルニカ（Autographica californic
a）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、ボンビックス モ
リ（Bombyx mori）核多角体ウイルス（ＢｍＮＰＶ）等
が好ましく挙げられる。宿主細胞として細菌、特にＥ．
ｃｏｌｉを用いる場合、本発明の組換えベクターは、プ
ロモーター−オペレーター領域，開始コドン，本発明Ｐ
ＧＲＰをコードするＤＮＡ，終止コドン，ターミネータ
ー領域等を含んでなるものが一般的である。また、宿主
細胞として酵母または動物細胞を用いる場合、本発明の
組換えベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明
ＰＧＲＰをコードするＤＮＡ，終止コドン等を含んでな
るものが一般的である。尚、シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ，エンハンサー配列，本発明のＰＧＲＰの
５’側及び３’側の非翻訳領域を組換えベクターに組み
込むことは任意である。
【００１１】細菌中で本発明のＰＧＲＰを発現させるた
めのプロモーター−オペレーター領域は、プロモータ
ー，オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例え
ば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば、宿主が
エシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｃ（ｔｒｐ−ｌ
ａｃ）プロモーター，Ｔａｃプロモーター，Ｔｒｐプロ
モーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモータ
ー，λＰＬプロモーター，１ｐｐプロモーターなどを含
むものが例示される。酵母中で本発明ＰＧＲＰを発現さ
せるためのプロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモータ
ー，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨ
プロモーター，ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられ、宿
主がバチルス属菌の場合は、ＳＬＯ１プロモーター，Ｓ
Ｐ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げ
られる。また宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、
ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモ
ーター，核多角体ウイルスのプロモーターなどが挙げら
れる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
シド（ＩＰＴＧ）やメタノール等を添加して発現を誘導
する方法やエンハンサーの利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴ
Ｇ）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コ
ドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。タ
ーミネーター領域としては、天然または合成のターミネ
ーターが挙げられる。 エンハンサー配列としては、Ｓ
Ｖ４０のエンハンサー配列（７２ｂｐ）、ポリオーマ，
アデノ，パピローマ等のＤＮＡ腫瘍ウイルス、レトロウ
イルスＬＴＲ（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリ
ンＨ鎖，Ｌ鎖遺伝子に由来するものなどが例示される。
発現ベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明の
ＰＧＲＰをコードするＤＮＡ，終始コドンおよびターミ
ネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に
連結することにより調製することができる。またこの
際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフ
ラグメント（例えば、リンカーなど）を用いることがで
きる。
めのプロモーター−オペレーター領域は、プロモータ
ー，オペレーターおよびShine-Dalgarno(SD)配列（例え
ば、ＡＡＧＧなど）を含むものである。例えば、宿主が
エシェリキア属菌の場合、好適にはＴｒｃ（ｔｒｐ−ｌ
ａｃ）プロモーター，Ｔａｃプロモーター，Ｔｒｐプロ
モーター，ｌａｃプロモーター，ｒｅｃＡプロモータ
ー，λＰＬプロモーター，１ｐｐプロモーターなどを含
むものが例示される。酵母中で本発明ＰＧＲＰを発現さ
せるためのプロモーターとしては、ＰＨＯ５プロモータ
ー，ＰＧＫプロモーター，ＧＡＰプロモーター，ＡＤＨ
プロモーター，ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられ、宿
主がバチルス属菌の場合は、ＳＬＯ１プロモーター，Ｓ
Ｐ０２プロモーター，ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げ
られる。また宿主が動物細胞等の真核細胞である場合、
ＳＶ４０由来のプロモーター，レトロウイルスのプロモ
ーター，核多角体ウイルスのプロモーターなどが挙げら
れる。しかし、特にこれらに限定されるものではない。
また、発現には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
シド（ＩＰＴＧ）やメタノール等を添加して発現を誘導
する方法やエンハンサーの利用も効果的な方法である。
好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴ
Ｇ）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コ
ドン（例えば、ＴＡＧ，ＴＧＡなど）が例示される。タ
ーミネーター領域としては、天然または合成のターミネ
ーターが挙げられる。 エンハンサー配列としては、Ｓ
Ｖ４０のエンハンサー配列（７２ｂｐ）、ポリオーマ，
アデノ，パピローマ等のＤＮＡ腫瘍ウイルス、レトロウ
イルスＬＴＲ（Long Terminal Repeat）、免疫グロブリ
ンＨ鎖，Ｌ鎖遺伝子に由来するものなどが例示される。
発現ベクターは、プロモーター，開始コドン，本発明の
ＰＧＲＰをコードするＤＮＡ，終始コドンおよびターミ
ネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に
連結することにより調製することができる。またこの
際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフ
ラグメント（例えば、リンカーなど）を用いることがで
きる。
【００１２】本発明の形質転換体（以下、形質移入体を
包含する概念で用いる）は、上述の発現ベクターを宿主
細胞に導入することにより調製することができる。宿主
細胞としては原核細胞および真核細胞がある。宿主細胞
としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア
属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマイセ
ス属、Pichia属など），動物細胞および昆虫細胞など〕
が挙げられる。具体的には、エシェリキア属ではエシェ
リキア・コリ（Escherichia coli）DH1，M103，JA221，
HB101，C600，XL-1 Blue，JM109，TOP10などが例示され
る。バチルス属菌ではバチルス・サブチリス（Bacillus
subtilis ）MI114，207-21などが挙げられる。酵母とし
てはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cer
evisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，ピチア・
パストリス（Pichia pastoris）GS115，KM71などが挙げ
られる。動物細胞としてはサル細胞COS-7，Vero，チャ
イニーズハムスター細胞CHO，マウスＬ細胞，ヒトＬ細
胞などがあげられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9など
が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではな
い。なお、ＰＧＲＰは、細胞壁に存在するペプチドグリ
カンに結合する性質を有するので、宿主細胞への影響や
ＰＧＲＰの産生効率を考慮すると、ＰＧＲＰを発現させ
る際に使用される宿主細胞としては、上記の如き宿主細
胞の内ペプチドグリカンを有さないものを使用すること
が望ましい。発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転
換（形質導入を含む）〕は従来公知の方法を用いて行う
ことができる。細菌（例えば、E.coliやBacillus subut
ilis）の場合は、例えばCohenらの方法〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA，(1972)69，2110〕、プロトプラスト法〔モ
レキュラー・ジーン・オブ・ジュネティクス（Mo1.Gen
e.Genet.），(1979)168，111〕またはコンピテント法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.），(1971)56，209〕等によって、Saccharomy
ces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA，(1978)75，1927〕やリチウム法
〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.），(1983)153，163〕等によって、動物細胞の場合
は、例えばGrahamの方法〔ウィロロジー（Virology），
(1973)52，456〕等によって、昆虫細胞の場合はリン酸
カリウム沈降法〔Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｅ．ら、ジャーナル・
オブ・ウィロロジー（J.Viro),46,584-593(1983)〕等に
よって、それぞれ形質転換することができるが、特にこ
れらに限定されるものではない。
包含する概念で用いる）は、上述の発現ベクターを宿主
細胞に導入することにより調製することができる。宿主
細胞としては原核細胞および真核細胞がある。宿主細胞
としては、例えば微生物〔細菌（例えば、エシェリキア
属菌、バチルス属菌），酵母（例えば、サッカロマイセ
ス属、Pichia属など），動物細胞および昆虫細胞など〕
が挙げられる。具体的には、エシェリキア属ではエシェ
リキア・コリ（Escherichia coli）DH1，M103，JA221，
HB101，C600，XL-1 Blue，JM109，TOP10などが例示され
る。バチルス属菌ではバチルス・サブチリス（Bacillus
subtilis ）MI114，207-21などが挙げられる。酵母とし
てはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cer
evisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，ピチア・
パストリス（Pichia pastoris）GS115，KM71などが挙げ
られる。動物細胞としてはサル細胞COS-7，Vero，チャ
イニーズハムスター細胞CHO，マウスＬ細胞，ヒトＬ細
胞などがあげられる。昆虫細胞としてはBmN4，Sf9など
が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではな
い。なお、ＰＧＲＰは、細胞壁に存在するペプチドグリ
カンに結合する性質を有するので、宿主細胞への影響や
ＰＧＲＰの産生効率を考慮すると、ＰＧＲＰを発現させ
る際に使用される宿主細胞としては、上記の如き宿主細
胞の内ペプチドグリカンを有さないものを使用すること
が望ましい。発現ベクターの宿主細胞への導入〔形質転
換（形質導入を含む）〕は従来公知の方法を用いて行う
ことができる。細菌（例えば、E.coliやBacillus subut
ilis）の場合は、例えばCohenらの方法〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA，(1972)69，2110〕、プロトプラスト法〔モ
レキュラー・ジーン・オブ・ジュネティクス（Mo1.Gen
e.Genet.），(1979)168，111〕またはコンピテント法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.），(1971)56，209〕等によって、Saccharomy
ces cerevisiaeの場合は、例えばHinnenらの方法〔Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA，(1978)75，1927〕やリチウム法
〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l.），(1983)153，163〕等によって、動物細胞の場合
は、例えばGrahamの方法〔ウィロロジー（Virology），
(1973)52，456〕等によって、昆虫細胞の場合はリン酸
カリウム沈降法〔Ｓｍｉｔｈ Ｇ．Ｅ．ら、ジャーナル・
オブ・ウィロロジー（J.Viro),46,584-593(1983)〕等に
よって、それぞれ形質転換することができるが、特にこ
れらに限定されるものではない。
【００１３】本発明のＰＧＲＰは、上記の如く調製され
る発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養する
ことにより製造することができる。栄養培地は、宿主細
胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源も
しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源
としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デ
ンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源
としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ
酸，コーンスターチ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉
エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。
また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩類（例えば
塩化カルシウム，リン酸ニ水素ナトリウム，塩化マグネ
シウム），ビタミン類，抗生物質（例えばアンピシリ
ン，カナマイシン等）など〕を含んでもよい。培養は当
業界において知られている方法に従って行われる。培養
条件、例えば温度，培地のｐＨおよび発酵時間は、該蛋
白質のペプチドグリカン認識活性としての最高力価が得
られるように適宜選択される。なお、下記に宿主に応じ
て用いられる具体的な培地および培養条件を例示する
が、何らこれに限定されるものではない。宿主が細菌，
放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養源を
含有する液体培地が適当である。その際、ｐＨは５〜８
であるほうが望ましい。宿主がE.coliの場合、好ましい
培地としてＬＢ培地、ＹＴ培地、ＳＯＢ培地〔モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1, 82
(1982)〕、Ｍ９培地〔Miller.ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・モレキュラー・ジュネティクス（J.Ex
p.Mol.Genet.）,(1972)p.431,Cold Spring Harbor Labo
ratory,New York〕が例示される。かかる場合、培養
は、必要により通気，撹拌をしながら、通常１４〜４２
℃、好ましくは２８から３９℃、約３〜２４時間行うこ
とができる。宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気，撹拌をしながら、通常１４〜４２℃好ましくは２８
〜３９℃、約３〜９６時間行うことができる。宿主が酵
母である場合、培地として、例えばバスチアン等によっ
て開発された培地〔Bostian.K.L.et.al(1980)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505〕が挙げられ、ｐＨは５〜
８であることが望ましい。培養は通常１４〜４２℃、好
ましくは２０〜３５℃で約１２時間〜１０日間行われ、
必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が動物
細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の牛胎児血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）(1952)12
2,501〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,(1959)8,396〕、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（J.Am.Med.Assoc.）,(1
967)199,519〕，１９９培地〔プロシージングス・オブ
・ソサイエティ・オブ・エクスペリメンツ・オブ・バイ
オロジカル・メディスン（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）,
(1950)73,1〕等を用いることができる。培地のｐＨは約
６〜８であることが好ましく、培養は通常約３０〜４０
℃で好ましくは３４〜３８℃約１２〜７２時間行われ、
必要に応じて通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆
虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地〔P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が挙げら
れ、そのｐＨは約５〜８であることが好ましい。培養は
通常約２０〜４０℃好ましくは２５〜３０℃で約１２時
間〜１０日間行われ、必要に応じて通気や撹拌を行うこ
ともできる。なお、本発明の形質転換体を使用してＰＧ
ＲＰを製造する方法としては、本発明のＤＮＡを組み込
んだバキュロウィルスを例えば蚕等の昆虫に感染させた
後にこれを飼育し、その体液（hemolymph）からＰＧＲ
Ｐを回収する方法も挙げられる。
る発現ベクターを含む形質転換体を栄養培地で培養する
ことにより製造することができる。栄養培地は、宿主細
胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源も
しくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源
としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デ
ンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源
としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ
酸，コーンスターチ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉
エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。
また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩類（例えば
塩化カルシウム，リン酸ニ水素ナトリウム，塩化マグネ
シウム），ビタミン類，抗生物質（例えばアンピシリ
ン，カナマイシン等）など〕を含んでもよい。培養は当
業界において知られている方法に従って行われる。培養
条件、例えば温度，培地のｐＨおよび発酵時間は、該蛋
白質のペプチドグリカン認識活性としての最高力価が得
られるように適宜選択される。なお、下記に宿主に応じ
て用いられる具体的な培地および培養条件を例示する
が、何らこれに限定されるものではない。宿主が細菌，
放線菌，酵母，糸状菌である場合、例えば上記栄養源を
含有する液体培地が適当である。その際、ｐＨは５〜８
であるほうが望ましい。宿主がE.coliの場合、好ましい
培地としてＬＢ培地、ＹＴ培地、ＳＯＢ培地〔モレキュ
ラー・クローニング（Molecular Cloning）, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1, 82
(1982)〕、Ｍ９培地〔Miller.ジャーナル・オブ・エク
スペリメンタル・モレキュラー・ジュネティクス（J.Ex
p.Mol.Genet.）,(1972)p.431,Cold Spring Harbor Labo
ratory,New York〕が例示される。かかる場合、培養
は、必要により通気，撹拌をしながら、通常１４〜４２
℃、好ましくは２８から３９℃、約３〜２４時間行うこ
とができる。宿主がBacillus属菌の場合、必要により通
気，撹拌をしながら、通常１４〜４２℃好ましくは２８
〜３９℃、約３〜９６時間行うことができる。宿主が酵
母である場合、培地として、例えばバスチアン等によっ
て開発された培地〔Bostian.K.L.et.al(1980)Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.,77,4505〕が挙げられ、ｐＨは５〜
８であることが望ましい。培養は通常１４〜４２℃、好
ましくは２０〜３５℃で約１２時間〜１０日間行われ、
必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が動物
細胞の場合、培地として例えば約５〜２０％の牛胎児血
清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Science）(1952)12
2,501〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,(1959)8,396〕、Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地〔ジャーナル・オブ・アメリカン・
メディカル・アソシエーション（J.Am.Med.Assoc.）,(1
967)199,519〕，１９９培地〔プロシージングス・オブ
・ソサイエティ・オブ・エクスペリメンツ・オブ・バイ
オロジカル・メディスン（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）,
(1950)73,1〕等を用いることができる。培地のｐＨは約
６〜８であることが好ましく、培養は通常約３０〜４０
℃で好ましくは３４〜３８℃約１２〜７２時間行われ、
必要に応じて通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆
虫細胞の場合、例えば胎児牛血清を含むGrace's培地〔P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,8404〕等が挙げら
れ、そのｐＨは約５〜８であることが好ましい。培養は
通常約２０〜４０℃好ましくは２５〜３０℃で約１２時
間〜１０日間行われ、必要に応じて通気や撹拌を行うこ
ともできる。なお、本発明の形質転換体を使用してＰＧ
ＲＰを製造する方法としては、本発明のＤＮＡを組み込
んだバキュロウィルスを例えば蚕等の昆虫に感染させた
後にこれを飼育し、その体液（hemolymph）からＰＧＲ
Ｐを回収する方法も挙げられる。
【００１４】本発明のＰＧＲＰを、上記培養により得ら
れる培養物より取得する方法として、例えば以下の方法
が挙げられる。すなわち、本発明のＰＧＲＰが、培養物
のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾
過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該
培養液から天然または合成タンパク質を精製並びに単離
するために一般に用いられる常法に従って該蛋白質を精
製，単離する。単離，精製法としては、例えば塩析，溶
媒沈澱法等の溶解度を使用する方法、透析，限外濾過，
ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法等の分子量の差
を利用す方法、アフィニティークロマトグラフィーなど
の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマト
グラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電
気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。一方、本発明のＰＧＲＰが培養された形質転換体の
ペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物
を遠心分離法などの常法に従って菌体あるいは細胞を集
め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム
および凍結融解などの方法により細胞等の細胞壁および
／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方
法で該ポリペプチドを含有する粗精製画分を得る。そし
て、当該粗精製画分を、先に示した常法に従い、単離，
精製することができる。
れる培養物より取得する方法として、例えば以下の方法
が挙げられる。すなわち、本発明のＰＧＲＰが、培養物
のうち培養液中に存在する場合は、得られた培養物を濾
過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該
培養液から天然または合成タンパク質を精製並びに単離
するために一般に用いられる常法に従って該蛋白質を精
製，単離する。単離，精製法としては、例えば塩析，溶
媒沈澱法等の溶解度を使用する方法、透析，限外濾過，
ゲル濾過，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法等の分子量の差
を利用す方法、アフィニティークロマトグラフィーなど
の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマト
グラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電
気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。一方、本発明のＰＧＲＰが培養された形質転換体の
ペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物
を遠心分離法などの常法に従って菌体あるいは細胞を集
め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム
および凍結融解などの方法により細胞等の細胞壁および
／または細胞膜を破壊した後、遠心分離や濾過などの方
法で該ポリペプチドを含有する粗精製画分を得る。そし
て、当該粗精製画分を、先に示した常法に従い、単離，
精製することができる。
【００１５】
【発明の効果】本発明はＰＧＲＰのアミノ酸配列、該配
列をコードする塩基配列を初めて解明したものであり、
これにより本発明では遺伝子工学的手法によるＰＧＲＰ
の製造法およびこれに関連する発現系を提供するもので
ある。本発明の方法により、従来取得の困難であったＰ
ＧＲＰを容易にかつ大量に、しかも高純度で得られるよ
うになったものである。このようにして得られた本発明
のＰＧＲＰは次のような有用性を有するものである。 標識したＰＧＲＰとの結合を観察することによりペプ
チドグリカンの検出が可能、ひいては細菌の検出が可能
である。 固定化したＰＧＲＰを用いてペプチドグリカンの濃縮
が可能、ひいては細菌の濃縮が可能であり、高感度に、
また塩等の試料中に共存する各種共存物質の影響を受け
ない。 上記で集めたペプチドグリカンや細菌を昆虫体液試
薬（特公平７−１１４７０７号）で効率よく測定するこ
とができる。そして本発明により次のような効果が奏せ
られるものである。 細菌の迅速な検出が可能である、 組織等の固体中のペプチドグリカンが検出でき、 組織等の固体中の細菌検出が高感度に行なえること、 昆虫体液試薬を用いたペプチドグリカン測定法におい
て、細菌そのものはフィルターを用いて集められるが、
分子量の小さいペプチドグリカンはフィルターでは除去
できず、注射剤等血流中に入れる薬剤の製造に当っては
それが問題であった。一方、本願発明では従来フィルタ
ーでは除去できなかった分子量の小さいペプチドグリカ
ンも捕捉、濃縮することができ、発熱物質等の不純物の
ない注射剤を製造する際に有用である。
列をコードする塩基配列を初めて解明したものであり、
これにより本発明では遺伝子工学的手法によるＰＧＲＰ
の製造法およびこれに関連する発現系を提供するもので
ある。本発明の方法により、従来取得の困難であったＰ
ＧＲＰを容易にかつ大量に、しかも高純度で得られるよ
うになったものである。このようにして得られた本発明
のＰＧＲＰは次のような有用性を有するものである。 標識したＰＧＲＰとの結合を観察することによりペプ
チドグリカンの検出が可能、ひいては細菌の検出が可能
である。 固定化したＰＧＲＰを用いてペプチドグリカンの濃縮
が可能、ひいては細菌の濃縮が可能であり、高感度に、
また塩等の試料中に共存する各種共存物質の影響を受け
ない。 上記で集めたペプチドグリカンや細菌を昆虫体液試
薬（特公平７−１１４７０７号）で効率よく測定するこ
とができる。そして本発明により次のような効果が奏せ
られるものである。 細菌の迅速な検出が可能である、 組織等の固体中のペプチドグリカンが検出でき、 組織等の固体中の細菌検出が高感度に行なえること、 昆虫体液試薬を用いたペプチドグリカン測定法におい
て、細菌そのものはフィルターを用いて集められるが、
分子量の小さいペプチドグリカンはフィルターでは除去
できず、注射剤等血流中に入れる薬剤の製造に当っては
それが問題であった。一方、本願発明では従来フィルタ
ーでは除去できなかった分子量の小さいペプチドグリカ
ンも捕捉、濃縮することができ、発熱物質等の不純物の
ない注射剤を製造する際に有用である。
【００１６】本発明の方法により得られたＰＧＲＰに適
当な標識物質を結合させたものを用いれば、資料中のペ
プチドグリカンや菌体中のペプチドグリカンを高感度且
つ高精度に検出することができる。この様な目的のため
にＰＧＲＰを標識するために用いられる標識物質として
は試料中或いは菌体中のペプチドグリカンを検出するの
に使用可能なものであれば良く特に限定されないが、例
えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアル
カリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，パーオキ
シダーゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキ
シダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，アセチ
ルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェ
ラーゼ等の酵素類、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）で用いられる99mＴｃ，131Ｉ，12 5Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等
の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で
用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミ
ン，クマリン，ナフチルアミン或いはこれらの誘導体等
の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，
ルミノール，ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）
オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフ
トール，アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部
に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，
６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル，３−アミ
ノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オ
キシル，２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−
ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン
−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基
を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての
性質を有する物質等が好ましく挙げられる。
当な標識物質を結合させたものを用いれば、資料中のペ
プチドグリカンや菌体中のペプチドグリカンを高感度且
つ高精度に検出することができる。この様な目的のため
にＰＧＲＰを標識するために用いられる標識物質として
は試料中或いは菌体中のペプチドグリカンを検出するの
に使用可能なものであれば良く特に限定されないが、例
えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアル
カリホスファターゼ，β−ガラクトシダーゼ，パーオキ
シダーゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキ
シダーゼ，グルコース−６−リン酸脱水素酵素，アセチ
ルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェ
ラーゼ等の酵素類、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）で用いられる99mＴｃ，131Ｉ，12 5Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等
の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）で
用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミ
ン，クマリン，ナフチルアミン或いはこれらの誘導体等
の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，
ルミノール，ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）
オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフ
トール，アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部
に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，
６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル，３−アミ
ノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オ
キシル，２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−
ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン
−１−イリデン）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基
を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての
性質を有する物質等が好ましく挙げられる。
【００１７】ＰＧＲＰに、上記した如き標識物質を結合
（標識）させる方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩ
Ａ或いはＦＩＡ等に於いて、一般に行われている自体公
知の蛋白質とこれら標識物質との結合方法（例えば、医
化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書
店、１９７１；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、
（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定
法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、
１９８２等に記載された方法）が何れも例外なく挙げら
れ、これらに準じて行えばよい。また、標識方法とし
て、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの
反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでも
ない。本発明に係る標識物質が結合したＰＧＲＰ（以
下、標識ＰＧＲＰと略記する。）を用いて試料中或いは
菌体中のペプチドグリカンを測定するには、標識ＰＧＲ
Ｐとペプチドグリカンとの複合体中の標識物質を測定す
ることにより行えば良く、その測定方法としては、標識
物質が有している、何らかの方法により検出し得る性質
に応じて夫々所定の方法に従って実施される。例えば、
その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡの常法、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊Ｎｏ.３
１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１
〜６３頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０日発
行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検
出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従い、該
放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型
ＧＭカウンター、液体シンチレーションカウンター、井
戸型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンタ
ー等の測定機器を適宜選択して使用し測定を行えばよい
（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１
版、中山書店、１９７１等参照。）。また、その性質が
蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩ
Ａの常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第１
版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３」等に記載さ
れた方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性
の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常
法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素 別冊
Ｎｏ.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編
集、252〜263頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０
日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
い。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合
には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定
を行えばよく、検出物質がスピンの性質を有する物質の
場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵
素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊Ｎｏ.３１、
北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271
頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０日発行」等に
記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。なお、
例えば蛍光性標識物質が結合した標識ＰＧＲＰとフロー
サイトメトリーとを組み合わせて用いれば、ペプチドグ
リカンを有する菌体と、夾雑物（例えば、カビ、酵母等
のペプチドグリカンを有さない微生物や、ペプチドグリ
カンを有さない不溶物等）とを分別することも可能であ
る。
（標識）させる方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩ
Ａ或いはＦＩＡ等に於いて、一般に行われている自体公
知の蛋白質とこれら標識物質との結合方法（例えば、医
化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書
店、１９７１；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、
（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定
法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第２版、医学書院、
１９８２等に記載された方法）が何れも例外なく挙げら
れ、これらに準じて行えばよい。また、標識方法とし
て、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの
反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでも
ない。本発明に係る標識物質が結合したＰＧＲＰ（以
下、標識ＰＧＲＰと略記する。）を用いて試料中或いは
菌体中のペプチドグリカンを測定するには、標識ＰＧＲ
Ｐとペプチドグリカンとの複合体中の標識物質を測定す
ることにより行えば良く、その測定方法としては、標識
物質が有している、何らかの方法により検出し得る性質
に応じて夫々所定の方法に従って実施される。例えば、
その性質が酵素活性の場合にはＥＩＡの常法、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊Ｎｏ.３
１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、５１
〜６３頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０日発
行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検
出物質が放射性物質の場合にはＲＩＡの常法に従い、該
放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型
ＧＭカウンター、液体シンチレーションカウンター、井
戸型シンチレーションカウンター、ＨＰＬＣ用カウンタ
ー等の測定機器を適宜選択して使用し測定を行えばよい
（例えば医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１
版、中山書店、１９７１等参照。）。また、その性質が
蛍光性の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるＦＩ
Ａの常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第１
版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３」等に記載さ
れた方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性
の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常
法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素 別冊
Ｎｏ.３１、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編
集、252〜263頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０
日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
い。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合
には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定
を行えばよく、検出物質がスピンの性質を有する物質の
場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵
素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊Ｎｏ.３１、
北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271
頁、共立出版（株）、１９８７年９月１０日発行」等に
記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。なお、
例えば蛍光性標識物質が結合した標識ＰＧＲＰとフロー
サイトメトリーとを組み合わせて用いれば、ペプチドグ
リカンを有する菌体と、夾雑物（例えば、カビ、酵母等
のペプチドグリカンを有さない微生物や、ペプチドグリ
カンを有さない不溶物等）とを分別することも可能であ
る。
【００１８】本発明の方法により得られたＰＧＲＰを適
当な担体に固定化させたものを用いれば、試料中のペプ
チドグリカンやペプチドグリカン含有菌体を濃縮するこ
とも可能である。従って、このような方法を利用すれ
ば、試料中のペプチドグリカンやペプチドグリカン含有
菌体の検出感度を飛躍的に増加させることも可能とな
る。ＰＧＲＰを固定化させるために用いられる担体とし
ては、アフィニティクロマトグラフィーの分野で通常用
いられるものであれば良く、特に限定されず、例えばセ
ルロファイン（チッソ（株）製）等のセルロース系担
体、例えばセファローズ（ファルマシア社商品名）、バ
イオゲルＡ（バイオラッド社商品名）等のアガロース系
担体、例えばセファデックス（ファルマシア社商品
名）、セファクリル（ファルマシア社商品名）等のデキ
ストラン系担体、エンザフィックスＰ（和光純薬工業
（株）製）、バイオゲルＰ（バイオラッド社商品名）等
のポリアクリルアミド系担体、多孔性ガラス、例えばポ
リスチレン、ポリプロピレン等の合成高分子から成る担
体等が好ましく挙げられる。また、これら担体の形状と
しては、通常この分野で使用されているものであれば特
に限定されないが、例えばシート（膜）、チューブ、ビ
ーズ、ディスク片、プレート、微粒子等の形状のものが
挙げられる。
当な担体に固定化させたものを用いれば、試料中のペプ
チドグリカンやペプチドグリカン含有菌体を濃縮するこ
とも可能である。従って、このような方法を利用すれ
ば、試料中のペプチドグリカンやペプチドグリカン含有
菌体の検出感度を飛躍的に増加させることも可能とな
る。ＰＧＲＰを固定化させるために用いられる担体とし
ては、アフィニティクロマトグラフィーの分野で通常用
いられるものであれば良く、特に限定されず、例えばセ
ルロファイン（チッソ（株）製）等のセルロース系担
体、例えばセファローズ（ファルマシア社商品名）、バ
イオゲルＡ（バイオラッド社商品名）等のアガロース系
担体、例えばセファデックス（ファルマシア社商品
名）、セファクリル（ファルマシア社商品名）等のデキ
ストラン系担体、エンザフィックスＰ（和光純薬工業
（株）製）、バイオゲルＰ（バイオラッド社商品名）等
のポリアクリルアミド系担体、多孔性ガラス、例えばポ
リスチレン、ポリプロピレン等の合成高分子から成る担
体等が好ましく挙げられる。また、これら担体の形状と
しては、通常この分野で使用されているものであれば特
に限定されないが、例えばシート（膜）、チューブ、ビ
ーズ、ディスク片、プレート、微粒子等の形状のものが
挙げられる。
【００１９】この様な担体にＰＧＲＰを固定化する方法
としては、通常アフィニティクロマトグラフィーの分野
で用いられている方法であって、上記した如き担体と蛋
白質とを結合させる為の方法であれば特に限定されな
い。例えば、担体が糖を含有するものである場合、より
具体的にはセルロース系担体、アガロース系担体、デキ
ストラン系担体等の場合には、これらを活性型とした後
にＰＧＲＰと反応させることによりＰＧＲＰ固定化担体
を容易に得ることができる。この様な担体を活性化する
方法としては、通常この分野で広く知られている糖化合
物の活性化方法は全て使用可能であり、具体的には例え
ば塩化シアヌルによる水酸基の活性化方法（例えば、
Ｊ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４
巻，２１２８頁，１９７６年等）、メタ過沃素酸による
アルデヒド基の酸化活性化法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７３巻，２１
２８頁，１９７６年等）、ブロムシアンによる水酸基の
活性化法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻、１３０２
頁、１９６７年等）、エピクロルヒドリンによる水酸基
の活性化法（例えば、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５１
巻，４７９頁，１９７０年等）等が挙げられる。上記し
た如き方法により活性化された担体は、ＰＧＲＰと接触
させることにより容易にこれらと共有結合するが、ＰＧ
ＲＰと反応させる前に、これら担体にＰＧＲＰと結合さ
せるリガンドとなり得る化合物を更に結合させた後にこ
れら酵素との反応に供しても何れにても良い。
としては、通常アフィニティクロマトグラフィーの分野
で用いられている方法であって、上記した如き担体と蛋
白質とを結合させる為の方法であれば特に限定されな
い。例えば、担体が糖を含有するものである場合、より
具体的にはセルロース系担体、アガロース系担体、デキ
ストラン系担体等の場合には、これらを活性型とした後
にＰＧＲＰと反応させることによりＰＧＲＰ固定化担体
を容易に得ることができる。この様な担体を活性化する
方法としては、通常この分野で広く知られている糖化合
物の活性化方法は全て使用可能であり、具体的には例え
ば塩化シアヌルによる水酸基の活性化方法（例えば、
Ｊ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４
巻，２１２８頁，１９７６年等）、メタ過沃素酸による
アルデヒド基の酸化活性化法（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７３巻，２１
２８頁，１９７６年等）、ブロムシアンによる水酸基の
活性化法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻、１３０２
頁、１９６７年等）、エピクロルヒドリンによる水酸基
の活性化法（例えば、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５１
巻，４７９頁，１９７０年等）等が挙げられる。上記し
た如き方法により活性化された担体は、ＰＧＲＰと接触
させることにより容易にこれらと共有結合するが、ＰＧ
ＲＰと反応させる前に、これら担体にＰＧＲＰと結合さ
せるリガンドとなり得る化合物を更に結合させた後にこ
れら酵素との反応に供しても何れにても良い。
【００２０】また、上記した如き担体が反応性の基を有
している場合には、以下のような方法によってもＰＧＲ
Ｐ固定化担体を得ることができる。即ち、例えば、担体
が有する反応性基とＰＧＲＰ反応性基との組み合わせ
が、アミノ基とカルボキシル基の場合には、例えばカル
ボジイミド法（例えば、J.Biol.Chem.，２４５巻，３０
５９頁，１９７０年等）、活性化エステル法（例えば、
Cancer Biochem.，７巻，１７５頁，１９８４年等）、
酸無水物法（例えば、J.Biol.Chem.，２３７巻，１８２
５頁，１９６２年等）、アジド法（例えば、Eur.J.Bioc
hem.，２５巻，１２９頁，１９７２年等）、カルボニル
クロリド法（例えば、Angew.Chem.，６７巻，６６１
頁，１９５５年等）、イソシアナート法（例えば、Natu
re，２１０巻，３６７頁，１９６６年等）、ウッドワー
ド試薬法（例えば、Biochim.Biophys.Acta，１７８巻，
６２６頁，１９６９年等）、ウギ（Ｕｇｉ）反応（例え
ば、Angew.Chem.，７４巻，９頁，１９６２年等）等が
挙げられ、該反応性基がアミノ基とアミノ基の場合に
は、例えばグルタルアルデヒド法（例えば、Experienti
a，２８巻，９５８頁，１９７３年等）、アルキル化法
（例えば、Biochem.Biophys.Acta，１９８巻，２７６
頁，１９７０年等）等が挙げられ、該反応性基が水酸基
とアミノ基の場合には、例えばアルキル化法（例えば、
Biochem.Biophys.Acta，１９８巻，２７６頁，１９７０
年等）等が挙げられる。また、ＰＧＲＰを担体に固定化
する場合には、アビジン・ビオチン反応を利用して行っ
ても良い。
している場合には、以下のような方法によってもＰＧＲ
Ｐ固定化担体を得ることができる。即ち、例えば、担体
が有する反応性基とＰＧＲＰ反応性基との組み合わせ
が、アミノ基とカルボキシル基の場合には、例えばカル
ボジイミド法（例えば、J.Biol.Chem.，２４５巻，３０
５９頁，１９７０年等）、活性化エステル法（例えば、
Cancer Biochem.，７巻，１７５頁，１９８４年等）、
酸無水物法（例えば、J.Biol.Chem.，２３７巻，１８２
５頁，１９６２年等）、アジド法（例えば、Eur.J.Bioc
hem.，２５巻，１２９頁，１９７２年等）、カルボニル
クロリド法（例えば、Angew.Chem.，６７巻，６６１
頁，１９５５年等）、イソシアナート法（例えば、Natu
re，２１０巻，３６７頁，１９６６年等）、ウッドワー
ド試薬法（例えば、Biochim.Biophys.Acta，１７８巻，
６２６頁，１９６９年等）、ウギ（Ｕｇｉ）反応（例え
ば、Angew.Chem.，７４巻，９頁，１９６２年等）等が
挙げられ、該反応性基がアミノ基とアミノ基の場合に
は、例えばグルタルアルデヒド法（例えば、Experienti
a，２８巻，９５８頁，１９７３年等）、アルキル化法
（例えば、Biochem.Biophys.Acta，１９８巻，２７６
頁，１９７０年等）等が挙げられ、該反応性基が水酸基
とアミノ基の場合には、例えばアルキル化法（例えば、
Biochem.Biophys.Acta，１９８巻，２７６頁，１９７０
年等）等が挙げられる。また、ＰＧＲＰを担体に固定化
する場合には、アビジン・ビオチン反応を利用して行っ
ても良い。
【００２１】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン 以下の参考例および実施例において使用されるプラスミ
ド，制限酵素等の酵素及びその他の物質については以下
の参考例および実施例で説明しているが、市販のものを
用いることができ、その使用方法についても常法に従う
ことができる。また、ＤＮＡのクローニング，宿主細胞
の形質転換，形質転換体の培養，得られる培養物からの
ＰＧＲＰの採取，精製等における操作方法は、当業界で
よく知られているもの、或いは文献等により知ることが
できる方法である。以下に参考例、実施例を挙げるが、
本発明はかかる記載により何ら限定されるものではな
い。
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミン 以下の参考例および実施例において使用されるプラスミ
ド，制限酵素等の酵素及びその他の物質については以下
の参考例および実施例で説明しているが、市販のものを
用いることができ、その使用方法についても常法に従う
ことができる。また、ＤＮＡのクローニング，宿主細胞
の形質転換，形質転換体の培養，得られる培養物からの
ＰＧＲＰの採取，精製等における操作方法は、当業界で
よく知られているもの、或いは文献等により知ることが
できる方法である。以下に参考例、実施例を挙げるが、
本発明はかかる記載により何ら限定されるものではな
い。
【００２２】
（１）実験に用いた材料および方法ＰＧＲＰの精製法 第５齢、５または６日目の蚕幼虫の腹部節の足をはさみ
で切断し出血死させた。ヘモリンフ（ｈｅｍｏｌｙｍｐ
ｈ）を採取し、これを直ちにｐＨ６．５の飽和硫酸アン
モニウムと激しく攪拌しながら混合した。約４００匹の
蚕から得られた２５０ｍｌのヘモリンフを４００ｍｌの
飽和硫酸アンモニウム中に集収し、使用するまで４℃で
貯蔵した。この後に続く工程は０〜４℃で行ない、遠心
分離は特別に記載しない限り１２，０００×ｇで２０分
間行なった。生成物を遠心分離し、沈殿物を、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ １，１０−フェナンスロリン、１ｍ
Ｍ フェニルメタンスルホニルフルオライド、５ｍＭ フ
ェニルチオ尿素および１％エタノールを含有するｐＨ
６．５の０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液３９０ｍｌ中
に懸濁した。この懸濁液を２時間攪拌し、ついで４，８
００×ｇで２０分間遠心分離した。硫酸アンモニウムを
上清に添加し（６９ｇ／５００ｍｌの上清）、そしてこ
の混合物を２時間攪拌した。次いで沈殿物を遠心分離に
より回収し、上記添加物を含有するｐＨ６．５の０．１
Ｍ リン酸カリウム緩衝液１００ｍｌ中に融解した。こ
の溶液を上記０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液（１．９
リットル）に対して３０時間透析し、更にｐＨ６．５の
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液を２回交換して透析し
た。この透析溶液を、リゾチーム消化ペプチドグリカン
をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５上でのカラムクロマトグラ
フィーにより分画することなく使用する以外はＹｏｓｈ
ｉｄａ等の方法により調製したペプチドグリカン−セフ
ァロース４Ｂカラム（５×２．５ｃｍ内径）に２０ｍｌ
／ｈの流速でかけた。このカラムを次の流出液により２
０ｍｌ／ｈで連続的に溶出した：５０ｍｌのｐＨ６．５
の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液；総量１２０ｍｌのｐ
Ｈ６．５の０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液を用いての
０から２ＭへのＫＣｌ直線濃度勾配；２Ｍ ＫＣｌを含
有するｐＨ５．５の５ｍＭ ＭＥＳ ６０ｍｌ。最終の溶
出は２Ｍ ＫＣｌを含有するｐＨ４．５の５ｍＭ アセテ
ート緩衝液１５０ｍｌを用いて２２０ｍｌ／ｈの流速で
行なった。ｐＨ７．０の０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ １．２ｍ
ｌを含有するコンテナ中に３０ｍｌのフラクションを集
めた。全ての分画を各々別個に３リットルの１０ｍＭ
リン酸カリウム、ｐＨ６．５に対して緩衝液を交換しな
がら１８時間透析した。 次のカラムクロマトグラフィ
ーを室温で高速プロテイン液体クロマトグラフィー系
（ＦＰＬＣ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて行なった。先の工
程で得られた活性分画を１ｍｌ／分の流速で、予めｐＨ
６．５の１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液で平衝化し、
１０ｍｌの同一緩衝液で洗浄したヒドロキシアパタイト
カラム（１００×７．８ｍｍ内径：Ｋｏｋｅｎ Ｌｔ
ｄ．Ｔｏｋｙｏ）を用いた高圧液体クロマトグラフィー
を行なった。吸着された蛋白質を、２つの連続した直線
濃度勾配、即ちｐＨ６．５で１０→１４４ｍＭおよび１
４４ｍＭ→１Ｍ リン酸カリウム緩衝液の直線勾配を各
々濃度の増加割合２．４８および９３ｍＭ／分で用い、
１．０ｍｌ／分の流速で溶出した。１分画の容積は１．
５ｍｌであった。リン酸塩勾配を適用してから１９０〜
１９８分の間に溶出された分画をプールし、次いで２リ
ットルの１０ｍＭ トリエタノールアミン−塩酸緩衝
液、ｐＨ７．５に対し一晩塩析を行なった。透析分画
を、塩析に用いたものと同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎ
ｏ Ｑカラム（ＨＲ ５／５）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）にかけ
た。吸着された蛋白質を、同じ緩衝液による直線塩勾配
で溶出した。流速を１ｍｌ／分に保持し、分画を１．５
ｍｌづつ集めた。最大のＰＧＲＰ活性をもつ分画を解析
のためのＰＧＲＰ試料とした。ＰＧＲＰ試料を逆相シア
ノプロピル由来シリカ高速液体クロマトグラフィーカラ
ム（４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ、ポアサイズ＝３００
Å）に次のようにして通過させた。即ち、０．５ｍｌの
ＰＧＲＰ溶液（約４０μｇ／ｍｌの蛋白質を含み、０．
１ＭのＮａＣｌを含有する、１０ｍＭ トリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ７．５）を上記カラムにかけ、次いで０．１
％ ＣＦ3ＣＯＯＨ／Ｈ2Ｏ中３０〜７０％のＣＨ3ＣＮ勾
配を用いて流速０．４ｍｌ／分で溶出した。この勾配を
終了するまで５０分かかった。唯一の蛋白質ピークが、
勾配溶出の開始から２９．６９分の所に出現した。この
ピークに含有される蛋白質をプールし凍結乾燥した（蛋
白質含量２８３μｇ）。ＰＧＲＰのＮ−末端アミノ酸配列の決定 逆相シアノプロピル由来シリカＨＰＬＣカラムを用いて
精製したＰＧＲＰを自動エドマン分解法により蛋白質シ
ークエンサー（ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ、アプライド バ
イオシステムズ）にかけて、Ｎ末端から２０個のアミノ
酸配列を分析した。その結果、ＰＧＲＰのＮ末端の２０
個のアミノ酸は次のように分析された。 Ｈ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ
−Ｔｙｒ−ペプチドグリカン認識活性の測定 J.Bio.Chem. vol.271,No.23,pp.13854-13860(1992)の記
載に準じて以下のように行なった。ペプチドグリカン認
識活性を測定する試料を連続的に希釈し、希釈液各１０
μｌを、５μｌの８０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０μｌのプ
ラズマ−ＰＧ、および５μｌのペプチドグリカンの混合
物（蒸留脱イオン水１ｍｌにつき１ｍｇのペプチドグリ
カン、吉田らの方法により調製、Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 141, 1177-1184）に加え、２５℃で１２０
分間インキュベートした。インキュベーションの終了時
に、反応混合物のフェノールオキシダーゼ活性を分光光
度分析により測定した。観察されたフェノールオキシダ
ーゼ活性化がペプチドグリカン作用と別のものであるこ
とを避けるために、常にペプチドグリカンを有さない反
応混合物のフェノールオキシダーゼ活性をインキュベー
ト後にチェックした。１２０分のインキュベーションに
より反応混合物に３０ユニットより大なるフェノールオ
キシダーゼ活性を与える最大の希釈度を決定し、この希
釈ファクターをペプチドグリカン認識活性を定量する試
験手段として使用した。このファクターは試料溶液１ｍ
ｌに対するペプチドグリカン認識活性のユニット数とし
て表わされる。
で切断し出血死させた。ヘモリンフ（ｈｅｍｏｌｙｍｐ
ｈ）を採取し、これを直ちにｐＨ６．５の飽和硫酸アン
モニウムと激しく攪拌しながら混合した。約４００匹の
蚕から得られた２５０ｍｌのヘモリンフを４００ｍｌの
飽和硫酸アンモニウム中に集収し、使用するまで４℃で
貯蔵した。この後に続く工程は０〜４℃で行ない、遠心
分離は特別に記載しない限り１２，０００×ｇで２０分
間行なった。生成物を遠心分離し、沈殿物を、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ １，１０−フェナンスロリン、１ｍ
Ｍ フェニルメタンスルホニルフルオライド、５ｍＭ フ
ェニルチオ尿素および１％エタノールを含有するｐＨ
６．５の０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液３９０ｍｌ中
に懸濁した。この懸濁液を２時間攪拌し、ついで４，８
００×ｇで２０分間遠心分離した。硫酸アンモニウムを
上清に添加し（６９ｇ／５００ｍｌの上清）、そしてこ
の混合物を２時間攪拌した。次いで沈殿物を遠心分離に
より回収し、上記添加物を含有するｐＨ６．５の０．１
Ｍ リン酸カリウム緩衝液１００ｍｌ中に融解した。こ
の溶液を上記０．２Ｍ リン酸カリウム緩衝液（１．９
リットル）に対して３０時間透析し、更にｐＨ６．５の
０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液を２回交換して透析し
た。この透析溶液を、リゾチーム消化ペプチドグリカン
をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５上でのカラムクロマトグラ
フィーにより分画することなく使用する以外はＹｏｓｈ
ｉｄａ等の方法により調製したペプチドグリカン−セフ
ァロース４Ｂカラム（５×２．５ｃｍ内径）に２０ｍｌ
／ｈの流速でかけた。このカラムを次の流出液により２
０ｍｌ／ｈで連続的に溶出した：５０ｍｌのｐＨ６．５
の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液；総量１２０ｍｌのｐ
Ｈ６．５の０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液を用いての
０から２ＭへのＫＣｌ直線濃度勾配；２Ｍ ＫＣｌを含
有するｐＨ５．５の５ｍＭ ＭＥＳ ６０ｍｌ。最終の溶
出は２Ｍ ＫＣｌを含有するｐＨ４．５の５ｍＭ アセテ
ート緩衝液１５０ｍｌを用いて２２０ｍｌ／ｈの流速で
行なった。ｐＨ７．０の０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ １．２ｍ
ｌを含有するコンテナ中に３０ｍｌのフラクションを集
めた。全ての分画を各々別個に３リットルの１０ｍＭ
リン酸カリウム、ｐＨ６．５に対して緩衝液を交換しな
がら１８時間透析した。 次のカラムクロマトグラフィ
ーを室温で高速プロテイン液体クロマトグラフィー系
（ＦＰＬＣ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を用いて行なった。先の工
程で得られた活性分画を１ｍｌ／分の流速で、予めｐＨ
６．５の１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液で平衝化し、
１０ｍｌの同一緩衝液で洗浄したヒドロキシアパタイト
カラム（１００×７．８ｍｍ内径：Ｋｏｋｅｎ Ｌｔ
ｄ．Ｔｏｋｙｏ）を用いた高圧液体クロマトグラフィー
を行なった。吸着された蛋白質を、２つの連続した直線
濃度勾配、即ちｐＨ６．５で１０→１４４ｍＭおよび１
４４ｍＭ→１Ｍ リン酸カリウム緩衝液の直線勾配を各
々濃度の増加割合２．４８および９３ｍＭ／分で用い、
１．０ｍｌ／分の流速で溶出した。１分画の容積は１．
５ｍｌであった。リン酸塩勾配を適用してから１９０〜
１９８分の間に溶出された分画をプールし、次いで２リ
ットルの１０ｍＭ トリエタノールアミン−塩酸緩衝
液、ｐＨ７．５に対し一晩塩析を行なった。透析分画
を、塩析に用いたものと同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎ
ｏ Ｑカラム（ＨＲ ５／５）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）にかけ
た。吸着された蛋白質を、同じ緩衝液による直線塩勾配
で溶出した。流速を１ｍｌ／分に保持し、分画を１．５
ｍｌづつ集めた。最大のＰＧＲＰ活性をもつ分画を解析
のためのＰＧＲＰ試料とした。ＰＧＲＰ試料を逆相シア
ノプロピル由来シリカ高速液体クロマトグラフィーカラ
ム（４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ、ポアサイズ＝３００
Å）に次のようにして通過させた。即ち、０．５ｍｌの
ＰＧＲＰ溶液（約４０μｇ／ｍｌの蛋白質を含み、０．
１ＭのＮａＣｌを含有する、１０ｍＭ トリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ７．５）を上記カラムにかけ、次いで０．１
％ ＣＦ3ＣＯＯＨ／Ｈ2Ｏ中３０〜７０％のＣＨ3ＣＮ勾
配を用いて流速０．４ｍｌ／分で溶出した。この勾配を
終了するまで５０分かかった。唯一の蛋白質ピークが、
勾配溶出の開始から２９．６９分の所に出現した。この
ピークに含有される蛋白質をプールし凍結乾燥した（蛋
白質含量２８３μｇ）。ＰＧＲＰのＮ−末端アミノ酸配列の決定 逆相シアノプロピル由来シリカＨＰＬＣカラムを用いて
精製したＰＧＲＰを自動エドマン分解法により蛋白質シ
ークエンサー（ｍｏｄｅｌ ４７７Ａ、アプライド バ
イオシステムズ）にかけて、Ｎ末端から２０個のアミノ
酸配列を分析した。その結果、ＰＧＲＰのＮ末端の２０
個のアミノ酸は次のように分析された。 Ｈ−Ａｓｐ−Ｘ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ
−Ｔｙｒ−ペプチドグリカン認識活性の測定 J.Bio.Chem. vol.271,No.23,pp.13854-13860(1992)の記
載に準じて以下のように行なった。ペプチドグリカン認
識活性を測定する試料を連続的に希釈し、希釈液各１０
μｌを、５μｌの８０ｍＭ ＣａＣｌ2、５０μｌのプ
ラズマ−ＰＧ、および５μｌのペプチドグリカンの混合
物（蒸留脱イオン水１ｍｌにつき１ｍｇのペプチドグリ
カン、吉田らの方法により調製、Biochem. Biophys. Re
s. Commun. 141, 1177-1184）に加え、２５℃で１２０
分間インキュベートした。インキュベーションの終了時
に、反応混合物のフェノールオキシダーゼ活性を分光光
度分析により測定した。観察されたフェノールオキシダ
ーゼ活性化がペプチドグリカン作用と別のものであるこ
とを避けるために、常にペプチドグリカンを有さない反
応混合物のフェノールオキシダーゼ活性をインキュベー
ト後にチェックした。１２０分のインキュベーションに
より反応混合物に３０ユニットより大なるフェノールオ
キシダーゼ活性を与える最大の希釈度を決定し、この希
釈ファクターをペプチドグリカン認識活性を定量する試
験手段として使用した。このファクターは試料溶液１ｍ
ｌに対するペプチドグリカン認識活性のユニット数とし
て表わされる。
【００２３】
実施例１ ＰＧＲＰをコードするＤＮＡの塩基配列、及
びＰＧＲＰのアミノ酸配列の決定 （１）蚕脂肪体ｃＤＮＡライブラリーの作製 蚕５齢幼虫（脱衣４日目）５頭より脂肪体を２５ｍｌ採
取し、総ＲＮＡ調製用試薬であるＩＳＯＧＥＮ（日本ジ
ーン）を用いて総ＲＮＡ（約８００μｇ）を調製した。
また、このときアガロース電気泳動により、リボゾーム
２８ＳＲＮＡのバンドを確認し、ＲＮＡの分解のないこ
とも確認した。この総ＲＮＡよりｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いて
ｍＲＮＡ（約２０μｇ）を精製し、ＺＡＰ ｃＤＮＡ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を
用いてｃＤＮＡの合成及びｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ
ングを行ない、その結果１×１０7プラークフォーミン
グユニット（ＰＦＵ）のｃＤＮＡライブラリーを得た。 （２）スクリーニング用プローブの調製 参考例で得られたＰＧＲＰ精製品（約５００ｐｍｏｌ）
をトリプシン消化（ＰＧＲＰ：トリプシン＝５０：１，
３７℃，１６時間，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０）し、ＯＤＳカラムによりペプチドマッピング
し、アミノ酸配列解析（島津ＰＳＱ１０）によって ＫＫＱＷＤＧ・・・ ＷＰＥＷＬＥ・・・ の配列を得た。この配列を基に次のようなＰＣＲ用プラ
イマーを合成した。
びＰＧＲＰのアミノ酸配列の決定 （１）蚕脂肪体ｃＤＮＡライブラリーの作製 蚕５齢幼虫（脱衣４日目）５頭より脂肪体を２５ｍｌ採
取し、総ＲＮＡ調製用試薬であるＩＳＯＧＥＮ（日本ジ
ーン）を用いて総ＲＮＡ（約８００μｇ）を調製した。
また、このときアガロース電気泳動により、リボゾーム
２８ＳＲＮＡのバンドを確認し、ＲＮＡの分解のないこ
とも確認した。この総ＲＮＡよりｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用いて
ｍＲＮＡ（約２０μｇ）を精製し、ＺＡＰ ｃＤＮＡ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を
用いてｃＤＮＡの合成及びｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージ
ングを行ない、その結果１×１０7プラークフォーミン
グユニット（ＰＦＵ）のｃＤＮＡライブラリーを得た。 （２）スクリーニング用プローブの調製 参考例で得られたＰＧＲＰ精製品（約５００ｐｍｏｌ）
をトリプシン消化（ＰＧＲＰ：トリプシン＝５０：１，
３７℃，１６時間，０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８．０）し、ＯＤＳカラムによりペプチドマッピング
し、アミノ酸配列解析（島津ＰＳＱ１０）によって ＫＫＱＷＤＧ・・・ ＷＰＥＷＬＥ・・・ の配列を得た。この配列を基に次のようなＰＣＲ用プラ
イマーを合成した。
【００２４】
【化１】
【００２５】上記ライブラリーを鋳型に９４℃（１秒）
−６０℃（２分）−７２℃（３分）のユニットで４０サ
イクルすることによるＰＣＲを行なった。その結果、約
０．５Ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドをｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ ｓｉ
ｔｅへサブクローニングしてＤＮＡ配列解析を行ない、
ＰＧＲＰに由来するアミノ酸配列を認識するＤＮＡ配列
と一致することを確認した。ＥｃｏＲＩ切断後、０．５
ＫｂｐのＤＮＡを抽出し、スクリーニング用プローブと
した。 （３）スクリーニング プラーク１×１０4／ｐｌａｔｅ（φ８２ｍｍ）３０枚
を上記スクリーニング用プローブとハイブリダイセーシ
ョン（４２℃、１６時間、５０％ホルムアミド）させる
ことによって、８個の陽性クローンを得た。このクロー
ンをヘルパーファージによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ I
I ＳＫ（−）へサブクローニングし、ＤＮＡ配列解析
（ＡＢＩ ３７７）を行なった。その結果、図１（配列
番号：５）に示される完全長０．７５ＫｂｐのＰＧＲＰ
ｃＤＮＡクローンを得た。このクローンの塩基配列
と、蚕体液中のＰＧＲＰのＮ末端アミノ酸２０個をコー
ドする塩基配列との相同性を検討し、ＰＧＲＰをコード
するｃＤＮＡの塩基配列は、５’末端から数えて１００
塩基目から始まる、と判定された。この結果、７５３ｂ
ｐの塩基数からなるこのクローンから、５’末端から数
えて３１塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とし、
６２１番目を翻訳終止配列とする１９６アミノ酸残基か
らなるＰＧＲＰ関連アミノ酸配列（配列番号：２）が解
明された。なお、蚕体液中のＰＧＲＰのＮ末端アミノ酸
配列の分析結果から、この１〜１９６アミノ酸の内、１
番目のメチオニンから２３番目のアスパラギン酸までが
ｐｒｏ部分で、２４番目のアスパラギンから１９６番目
のアスパラギン酸までが成熟ＰＧＲＰ（配列番号：１）
であると判断される。
−６０℃（２分）−７２℃（３分）のユニットで４０サ
イクルすることによるＰＣＲを行なった。その結果、約
０．５Ｋｂｐのバンドが検出された。このバンドをｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（＋）のＥｃｏＲＩ ｓｉ
ｔｅへサブクローニングしてＤＮＡ配列解析を行ない、
ＰＧＲＰに由来するアミノ酸配列を認識するＤＮＡ配列
と一致することを確認した。ＥｃｏＲＩ切断後、０．５
ＫｂｐのＤＮＡを抽出し、スクリーニング用プローブと
した。 （３）スクリーニング プラーク１×１０4／ｐｌａｔｅ（φ８２ｍｍ）３０枚
を上記スクリーニング用プローブとハイブリダイセーシ
ョン（４２℃、１６時間、５０％ホルムアミド）させる
ことによって、８個の陽性クローンを得た。このクロー
ンをヘルパーファージによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ I
I ＳＫ（−）へサブクローニングし、ＤＮＡ配列解析
（ＡＢＩ ３７７）を行なった。その結果、図１（配列
番号：５）に示される完全長０．７５ＫｂｐのＰＧＲＰ
ｃＤＮＡクローンを得た。このクローンの塩基配列
と、蚕体液中のＰＧＲＰのＮ末端アミノ酸２０個をコー
ドする塩基配列との相同性を検討し、ＰＧＲＰをコード
するｃＤＮＡの塩基配列は、５’末端から数えて１００
塩基目から始まる、と判定された。この結果、７５３ｂ
ｐの塩基数からなるこのクローンから、５’末端から数
えて３１塩基目から始まるＡＴＧを翻訳開始配列とし、
６２１番目を翻訳終止配列とする１９６アミノ酸残基か
らなるＰＧＲＰ関連アミノ酸配列（配列番号：２）が解
明された。なお、蚕体液中のＰＧＲＰのＮ末端アミノ酸
配列の分析結果から、この１〜１９６アミノ酸の内、１
番目のメチオニンから２３番目のアスパラギン酸までが
ｐｒｏ部分で、２４番目のアスパラギンから１９６番目
のアスパラギン酸までが成熟ＰＧＲＰ（配列番号：１）
であると判断される。
【００２６】実施例２ ＰＧＲＰ蛋白質の発現 実施例１で得られた完全長のＰＧＲＰをコードするＤＮ
Ａを含むクローンをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより切断
し、０．７５ＫｂｐのＤＮＡを抽出した。次いで、得ら
れたＤＮＡ断片のＸｈｏＩ切断末端にＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加した。これをPichia Expression Kit(Invitrog
en社製) を用いて、発現ベクターｐＨＩＬ−Ｄ２のＥｃ
ｏＲＩ ｓｉｔｅへクローニングし、これで酵母（Pichi
a pastoris）を形質転換した。得られた形質転換体をＹ
ＰＤ培地でＯＤ600が２〜６になるまで培養し、遠心分
離により該形質転換体を採集した後、メタノールを０．
５％（最終濃度）含有するＳＯＳ培地にＯＤ600が１．
０になるように再懸濁し、３０℃で９６時間振とう培養
した。培養液を遠心分離して沈殿を採集し、これをＰＢ
Ｓに再懸濁した。これを再度遠心分離し得られた沈殿
を、Stabilizing Buffer A〔1M Sorbitol, 10mM MgCl2,
2mM ジチオスレイトール(DTT), 50mM リン酸Ｋ（pH7.
8), 100μｇ／ml Phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMS
F) 〕中に懸濁させて、30℃で10分間加温した。遠心分
離後、得られた沈殿を、Stabilizing Buffer B〔1M Sor
bitol, 10mM MgCl2, 2mM DTT, 25mM リン酸Ｋ（pH7.8),
25mM コハク酸Ｎａ（pH5.5), 100μｇ／ml PMSF〕に再
懸濁し、30℃で２分間加温した。これに10mg/mlザイモ
レス(zymolase)を0.25倍量添加し、30℃で30分間処理し
た。処理後、更に遠心分離して得られた沈殿を、Lysis
Buffer 〔50mM HEPES（pH7.0), １％ NP-40, 1μｌ／ml
aprotinin, 100μｇ／ml PMSF〕に懸濁し、0℃で30分
間放置した後、遠心分離により上清を採取した。得られ
た上清中のペプチドグリカン認識活性を、J.Bio.Chem.v
ol.271,No.23,p.13855(1992)に記載された方法（前記参
考例をも参照されたい）に準じて測定した。その結果、
上清中にペプチドグリカン認識活性が確認され、ＰＧＲ
Ｐが発現していることが確認された。
Ａを含むクローンをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩにより切断
し、０．７５ＫｂｐのＤＮＡを抽出した。次いで、得ら
れたＤＮＡ断片のＸｈｏＩ切断末端にＥｃｏＲＩリンカ
ーを付加した。これをPichia Expression Kit(Invitrog
en社製) を用いて、発現ベクターｐＨＩＬ−Ｄ２のＥｃ
ｏＲＩ ｓｉｔｅへクローニングし、これで酵母（Pichi
a pastoris）を形質転換した。得られた形質転換体をＹ
ＰＤ培地でＯＤ600が２〜６になるまで培養し、遠心分
離により該形質転換体を採集した後、メタノールを０．
５％（最終濃度）含有するＳＯＳ培地にＯＤ600が１．
０になるように再懸濁し、３０℃で９６時間振とう培養
した。培養液を遠心分離して沈殿を採集し、これをＰＢ
Ｓに再懸濁した。これを再度遠心分離し得られた沈殿
を、Stabilizing Buffer A〔1M Sorbitol, 10mM MgCl2,
2mM ジチオスレイトール(DTT), 50mM リン酸Ｋ（pH7.
8), 100μｇ／ml Phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMS
F) 〕中に懸濁させて、30℃で10分間加温した。遠心分
離後、得られた沈殿を、Stabilizing Buffer B〔1M Sor
bitol, 10mM MgCl2, 2mM DTT, 25mM リン酸Ｋ（pH7.8),
25mM コハク酸Ｎａ（pH5.5), 100μｇ／ml PMSF〕に再
懸濁し、30℃で２分間加温した。これに10mg/mlザイモ
レス(zymolase)を0.25倍量添加し、30℃で30分間処理し
た。処理後、更に遠心分離して得られた沈殿を、Lysis
Buffer 〔50mM HEPES（pH7.0), １％ NP-40, 1μｌ／ml
aprotinin, 100μｇ／ml PMSF〕に懸濁し、0℃で30分
間放置した後、遠心分離により上清を採取した。得られ
た上清中のペプチドグリカン認識活性を、J.Bio.Chem.v
ol.271,No.23,p.13855(1992)に記載された方法（前記参
考例をも参照されたい）に準じて測定した。その結果、
上清中にペプチドグリカン認識活性が確認され、ＰＧＲ
Ｐが発現していることが確認された。
【００２７】
【００２８】
【配列番号：１】 配列の長さ：173 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val 1 5 10 15 His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His 20 25 30 Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val 35 40 45 Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile 50 55 60 Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser 65 70 75 80 Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser 85 90 95 Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly 100 105 110 Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg 115 120 125 Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile 130 135 140 Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp 145 150 155 160 Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 165 170
【００２９】
【配列番号：２】 配列の長さ：196 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln 20 25 30 Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val 35 40 45 Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp 50 55 60 Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu 65 70 75 80 Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn 85 90 95 Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr 100 105 110 Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe 115 120 125 Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu 130 135 140 Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val 145 150 155 160 Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu 165 170 175 Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser 180 185 190 Ile Lys Asn Ala 195
【００３０】
【配列番号：３】 配列の長さ：522 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記載：CDS 存在位置： 1..522 配列 GAT TGC GAC GTC GTC AGT AAA AAG CAA TGG GAC GGT TTG ATC CCG GTG 48 Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val 1 5 10 15 CAC GTG TCG TAC CTG GCG CGG CCC GTG AGC CTC GTC ATC GTC CAG CAC 96 His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His 20 25 30 ACA GTC ACA CCC TTC TGC AGG ACG GAC GCT GGC TGC GAG GAG CTC GTG 144 Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val 35 40 45 CGG AAT ATC CAG ACC AAC CAC ATG GAG GCC TTG CAA TAC TGG GAC ATC 192 Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile 50 55 60 GGA CCC TCG TTC CTG GTG GGA GGT AAC GGC AAG GTG TAC GAG GGC TCC 240 Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser 65 70 75 80 GGC TGG CTG CAC GTC GGC GCG CAC ACC TAC GGG TAC AAC TCG AGG TCC 288 Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser 85 90 95 ATC GGA GTC GCA TTC ATC GGC AAC TTC AAC ACG GAC GAG CCG AGC GGC 336 Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly 100 105 110 GCG ATG CTG GAG GCG CTG CGG TCG CTG CTG CGC TGC GGC GTG GAG CGC 384 Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg 115 120 125 GGC CAC CTC GCG GGG GAC TAC CGC GTC GTG GCG CAC CGA CAG CTC ATT 432 Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile 130 135 140 GCC TCT GAG AGC CCC GGC CGG AAG CTC TAC AAC CAG ATA CGA CGC TGG 480 Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp 145 150 155 160 CCT GAG TGG CTG GAG AAC GTG GAC TCC ATC AAG AAC GCG TA 522 Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 165 170
【００３１】
【配列番号：４】 配列の長さ：591 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記載：CDS 存在位置： 1..591 配列 ATG GCC CGC CTC CAC TCG GCA GTT GTA CTC GCG CTC GCT CTC AGC TCG 48 Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser 1 5 10 15 CTT CTC ACA GAA ATA GCA GCC GAT TGC GAC GTC GTC AGT AAA AAG CAA 96 Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln 20 25 30 TGG GAC GGT TTG ATC CCG GTG CAC GTG TCG TAC CTG GCG CGG CCC GTG 144 Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val 35 40 45 AGC CTC GTC ATC GTC CAG CAC ACA GTC ACA CCC TTC TGC AGG ACG GAC 192 Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp 50 55 60 GCT GGC TGC GAG GAG CTC GTG CGG AAT ATC CAG ACC AAC CAC ATG GAG 240 Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu 65 70 75 80 GCC TTG CAA TAC TGG GAC ATC GGA CCC TCG TTC CTG GTG GGA GGT AAC 288 Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn 85 90 95 GGC AAG GTG TAC GAG GGC TCC GGC TGG CTG CAC GTC GGC GCG CAC ACC 336 Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr 100 105 110 TAC GGG TAC AAC TCG AGG TCC ATC GGA GTC GCA TTC ATC GGC AAC TTC 384 Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe 115 120 125 AAC ACG GAC GAG CCG AGC GGC GCG ATG CTG GAG GCG CTG CGG TCG CTG 432 Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu 130 135 140 CTG CGC TGC GGC GTG GAG CGC GGC CAC CTC GCG GGG GAC TAC CGC GTC 480 Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val 145 150 155 160 GTG GCG CAC CGA CAG CTC ATT GCC TCT GAG AGC CCC GGC CGG AAG CTC 528 Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu 165 170 175 TAC AAC CAG ATA CGA CGC TGG CCT GAG TGG CTG GAG AAC GTG GAC TCC 576 Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser 180 185 190 ATC AAG AAC GCG TA 591 Ile Lys Asn Ala 195
【００３２】
【配列番号：５】 配列の長さ：753 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記載：CDS 存在位置： 31..621 配列 CTGACGTGCT GGCACGCGCC GCTCCTCGAC ATG GCC CGC CTC CAC TCG GCA GTT 54 Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val 1 5 GTA CTC GCG CTC GCT CTC AGC TCG CTT CTC ACA GAA ATA GCA GCC GAT 102 Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp 10 15 20 TGC GAC GTC GTC AGT AAA AAG CAA TGG GAC GGT TTG ATC CCG GTG CAC 150 Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His 25 30 35 40 GTG TCG TAC CTG GCG CGG CCC GTG AGC CTC GTC ATC GTC CAG CAC ACA 198 Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr 45 50 55 GTC ACA CCC TTC TGC AGG ACG GAC GCT GGC TGC GAG GAG CTC GTG CGG 246 Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg 60 65 70 AAT ATC CAG ACC AAC CAC ATG GAG GCC TTG CAA TAC TGG GAC ATC GGA 294 Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly 75 80 85 CCC TCG TTC CTG GTG GGA GGT AAC GGC AAG GTG TAC GAG GGC TCC GGC 342 Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly 90 95 100 TGG CTG CAC GTC GGC GCG CAC ACC TAC GGG TAC AAC TCG AGG TCC ATC 390 Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile 105 110 115 120 GGA GTC GCA TTC ATC GGC AAC TTC AAC ACG GAC GAG CCG AGC GGC GCG 438 Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala 125 130 135 ATG CTG GAG GCG CTG CGG TCG CTG CTG CGC TGC GGC GTG GAG CGC GGC 486 Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly 140 145 150 CAC CTC GCG GGG GAC TAC CGC GTC GTG GCG CAC CGA CAG CTC ATT GCC 534 His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala 155 160 165 TCT GAG AGC CCC GGC CGG AAG CTC TAC AAC CAG ATA CGA CGC TGG CCT 582 Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro 170 175 180 GAG TGG CTG GAG AAC GTG GAC TCC ATC AAG AAC GCG TAACATTATC 628 Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 185 190 195 ACAGCGTATC GCATAGCGCC GTTCTTGTTG TGTTCAGATC TTGGACAAGT GTCAACTCAT 688 ATAGTATTTA CGCGTAATAT AATTTAAACT ACTTATAAAT TAAAATTAAA AAAAAAAAAA 748 AAAAA 753
【図１】本発明で得られたＰＧＲＰ ｃＤＮＡクローン
の塩基配列およびそれから解明されるアミノ酸配列を示
す図である。
の塩基配列およびそれから解明されるアミノ酸配列を示
す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84）
Claims (8)
- 【請求項１】以下の（ａ）（配列番号：１）または
（ｂ）のアミノ酸配列を含有する組換えタンパク質： （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質。 - 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質を
コードする遺伝子。 （ａ） Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala 、 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識活性を有するタンパク
質。 - 【請求項３】以下の（ｃ）（配列番号：２）または
（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子。 （ｃ） Met Ala Arg Leu His Ser Ala Val Val Leu Ala Leu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Thr Glu Ile Ala Ala Asp Cys Asp Val Val Ser Lys Lys Gln Trp Asp Gly Leu Ile Pro Val His Val Ser Tyr Leu Ala Arg Pro Val Ser Leu Val Ile Val Gln His Thr Val Thr Pro Phe Cys Arg Thr Asp Ala Gly Cys Glu Glu Leu Val Arg Asn Ile Gln Thr Asn His Met Glu Ala Leu Gln Tyr Trp Asp Ile Gly Pro Ser Phe Leu Val Gly Gly Asn Gly Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Leu His Val Gly Ala His Thr Tyr Gly Tyr Asn Ser Arg Ser Ile Gly Val Ala Phe Ile Gly Asn Phe Asn Thr Asp Glu Pro Ser Gly Ala Met Leu Glu Ala Leu Arg Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Glu Arg Gly His Leu Ala Gly Asp Tyr Arg Val Val Ala His Arg Gln Leu Ile Ala Ser Glu Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Gln Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Ile Lys Asn Ala （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有し、かつペプチドグリカン認識蛋白のアミノ酸配列を
有するタンパク質。 - 【請求項４】以下の（ｅ）（配列番号：３）又は（ｆ）
のＤＮＡからなる遺伝子。 （ｅ） GATTGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCC GTGAGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTG CGGAATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGT AACGGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCC ATCGGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCG CTGCTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATT GCCTCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGAC TCCATCAAGAACGCGTAA （ｆ）（ｅ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ。 - 【請求項５】以下の（ｇ）（配列番号：４）又は（ｈ）
のＤＮＡからなる遺伝子。 （ｇ） ATGGCCCGCCTCCACTCGGCAGTTGTACTCGCGCTCGCTCTCAGCTCGCTTCTCACAGAAATAGCAGCCGAT TGCGACGTCGTCAGTAAAAAGCAATGGGACGGTTTGATCCCGGTGCACGTGTCGTACCTGGCGCGGCCCGTG AGCCTCGTCATCGTCCAGCACACAGTCACACCCTTCTGCAGGACGGACGCTGGCTGCGAGGAGCTCGTGCGG AATATCCAGACCAACCACATGGAGGCCTTGCAATACTGGGACATCGGACCCTCGTTCCTGGTGGGAGGTAAC GGCAAGGTGTACGAGGGCTCCGGCTGGCTGCACGTCGGCGCGCACACCTACGGGTACAACTCGAGGTCCATC GGAGTCGCATTCATCGGCAACTTCAACACGGACGAGCCGAGCGGCGCGATGCTGGAGGCGCTGCGGTCGCTG CTGCGCTGCGGCGTGGAGCGCGGCCACCTCGCGGGGGACTACCGCGTCGTGGCGCACCGACAGCTCATTGCC TCTGAGAGCCCCGGCCGGAAGCTCTACAACCAGATACGACGCTGGCCTGAGTGGCTGGAGAACGTGGACTCC ATCAAGAACGCGTAA （ｈ）（ｇ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつペプチドグリカ
ン認識活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を
含有するＤＮＡ。 - 【請求項６】請求項２、３、４または５記載の遺伝子を
含有する組み換えベクター。 - 【請求項７】請求項６記載の組み換えベクターで形質転
換してなる形質転換体。 - 【請求項８】請求項７記載の形質転換体を培地で培養
し、得られる培養物からペプチドグリカン認識蛋白質を
回収することを特徴とするペプチドグリカン認識蛋白質
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9250190A JPH10179171A (ja) | 1996-09-17 | 1997-09-16 | ペプチドグリカン認識蛋白質およびその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24451296 | 1996-09-17 | ||
| JP8-244512 | 1996-09-17 | ||
| JP9250190A JPH10179171A (ja) | 1996-09-17 | 1997-09-16 | ペプチドグリカン認識蛋白質およびその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179171A true JPH10179171A (ja) | 1998-07-07 |
Family
ID=26536774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9250190A Withdrawn JPH10179171A (ja) | 1996-09-17 | 1997-09-16 | ペプチドグリカン認識蛋白質およびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10179171A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009524413A (ja) * | 2006-01-13 | 2009-07-02 | ユーハン・コーポレイション | チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を分離する方法 |
| WO2012050919A3 (en) * | 2010-09-28 | 2012-12-27 | The University Of Notre Dame | Chimeric spider silk and uses thereof |
| CN114921470A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-19 | 江苏科技大学 | 亚洲玉米螟肠道免疫关键基因OfPGRP6及其应用 |
-
1997
- 1997-09-16 JP JP9250190A patent/JPH10179171A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009524413A (ja) * | 2006-01-13 | 2009-07-02 | ユーハン・コーポレイション | チャイロゴミムシダマシ幼虫の体液からペプチドグリカン認識蛋白質を分離する方法 |
| WO2012050919A3 (en) * | 2010-09-28 | 2012-12-27 | The University Of Notre Dame | Chimeric spider silk and uses thereof |
| CN114921470A (zh) * | 2022-04-25 | 2022-08-19 | 江苏科技大学 | 亚洲玉米螟肠道免疫关键基因OfPGRP6及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20041207 |