JP3243526B2

JP3243526B2 - ニジマスガレクチン遺伝子

Info

Publication number: JP3243526B2
Application number: JP24720499A
Authority: JP
Inventors: 照幸中西; 充乙竹
Original assignee: 農林水産省水産庁養殖研究所長
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 1999-09-01
Publication date: 2002-01-07
Anticipated expiration: 2019-09-01
Also published as: JP2001069976A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ニジマスガレクチ
ン、該ガレクチンをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガレクチンはS-typeレクチンと呼ばれて
いる糖タンパク質であり、βガラクトースに結合する機
能を有する。現在、哺乳類においてはガレクチン１から
９まで９種類存在し、ファミリーを構成することが知ら
れている。いずれのガレクチンにおいても、そのアミノ
酸領域のうち、βガラクトースと結合する領域が存在す
る。

【０００３】βガラクトースと結合するレクチンの存在
については、海綿動物、線虫等の無脊椎動物から、カエ
ル、ニワトリ及びヒトを含む広範囲の脊椎動物に至るま
で各種動物において報告されている。哺乳類においては
多くの動物種から遺伝子として単離されているが、哺乳
類以外ではニワトリのみであり、他の動物においてはβ
ガラクトースと結合するレクチンの存在が報告されてい
るのみである。ガレクチンは構造によって４つに分類さ
れ、ガレクチン１、２及び７は同型２量体、ガレクチン
５は単量体、ガレクチン４、６、８及び９はリンカーペ
プチドにより繋がった２つの結合領域を有する一本鎖の
ポリペプチド、ガレクチン３は単一の結合領域を有し短
いＮ末端を持つタンパク質である。

【０００４】ガレクチンの種類によって、組織における
発現や分布は異なる。即ち、ヒトにおいては、ガレクチ
ン１は骨格筋、神経細胞、腎臓、胎盤及び胸腺、ガレク
チン２は腫瘍の肝臓、ガレクチン３は活性化マクロファ
ージ、好酸球、好中球、肥満細胞、小腸、呼吸器官の上
皮及び感覚神経細胞、ガレクチン４は腸や口腔の上皮、
ガレクチン５は赤血球や細網細胞、ガレクチン６は腸管
上皮、ガレクチン７はケラチノサイト、ガレクチン８は
肺、肝臓、腎臓、心臓及び脳、ガレクチン９は肝臓、小
腸、腎臓、リンパ組織、肺、心筋及び骨格筋において発
現している。

【０００５】ガレクチンの機能についてもその種類によ
って異なり、ガレクチン１は細胞接着の促進又は抑制に
関与し、ガレクチン３は細胞接着の抑制や炎症並びに腫
瘍細胞の転移に係わっており、また、ガレクチン３及び
９はマウスＴ細胞の移動やアポトーシスにも関与してい
ることが報告されている。ガレクチン９は、ヒトのホジ
キン病患者の脾臓やリンパ節では正常患者の１０倍も発
現していることが報告されている。さらに、発生の初期
に広範囲な組織に発現することから、発生初期の形態形
成に関与していることが示唆されている。このように、
ガレクチンは数多くの機能を有していると推察される。
しかしながら、ガレクチンの機能については、ほ乳類に
おいてもまだ充分明らかにされていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ニジマスガ
レクチン、該ガレクチンをコードする遺伝子を提供する
ことを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を行った結果、ニジマス頭腎cD
NAライブラリーから、ガレクチン遺伝子を単離すること
に成功し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
組換えタンパク質である。 (a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少な
くとも1個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつガレクチン活性を有するタン
パク質

【０００９】さらに、本発明は、以下の(a)又は(b)のタ
ンパク質をコードする遺伝子である。 (a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において少な
くとも１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列を含み、かつガレクチン活性を有するタン
パク質

【００１０】さらに、本発明は、以下の(c)又は(d)のDN
Aを含む遺伝子である。 (c) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA (d) 配列番号１の塩基配列を含むDNAとストリンジェン
トな条件下でハイブリイダズし、かつガレクチン活性を
有するタンパク質をコードするDNA

【００１１】さらに、本発明は、以下の(e)又は(f)のRN
Aを含む遺伝子である。 (c) 配列番号３で表される塩基配列を含むRNA (d) 配列番号３で表される塩基配列を含むRNAとストリ
ンジェントな条件下でハイブリイダズし、かつガレクチ
ン活性を有するタンパク質をコードするRNA

【００１２】さらに、本発明は、上記遺伝子を含有する
組換えベクターである。さらに、本発明は、上記組換え
ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、
上記形質転換体を培養し、得られる培養物からガレクチ
ンを採取することを特徴とするガレクチンの製造方法で
ある。さらに、本発明は、配列番号6及び7で表される塩
基配列を有するプライマーを用いて増幅される断片であ
って配列番号1に記載のニジマスガレクチンcDNAのN末端
側をコードする299bpの断片を含む、ニジマスガレクチ
ンの検出用試薬である。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、哺乳類において細胞接
着の抑制や炎症、腫瘍細胞の転移、Ｔ細胞の移動やアポ
トーシス等に関与していることが知られ、魚類免疫機構
の解明並びに魚病の診断及び制御において有用かつ新規
なニジマスガレクチンをコードする遺伝子に関するもの
である。

【００１４】本発明者らは、リポ多糖(LPS)をニジマス
の腹腔内に投与した後、頭腎を採取し、RNAを抽出・精
製し、cDNAライブラリーを調製した。このライブラリー
から得られたDNAについてPCRを行い、PCR産物の大きさ
からcDNAのサイズを調べた。本発明の遺伝子は、上記cD
NAのサイズが1kbp以上の単離クローンについて塩基配列
を決定し、クローニングしたものである。

【００１５】１．本発明の遺伝子のクローニング (1) cDNAライブラリーの作製及びスクリーニング mRNAの供給源としては、ニジマス頭腎、脾臓、胸腺など
の組織が挙げられる。mRNAの調製は、通常行われる手法
により行うことができる。例えば、上記組織又は細胞か
ら、グアニジウムチオシアネート-トリフルオロ酢酸セ
シウム法などにより全RNAを抽出した後、オリゴdT-セル
ロースやポリU-セファロース等を用いたアフィニティー
カラム法、あるいはバッチ法によりポリ(A)⁺RNA(mRNA)
を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等
によりポリ(A)⁺RNAをさらに分画してもよい。

【００１６】このようにして得られたmRNAを鋳型とし
て、オリゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖
cDNAを合成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成
する。次いで得られた二本鎖cDNAを適当なクローニング
ベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そし
てこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、
テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標とし
て形質転換体を選択することにより、cDNAのライブラリ
ーを得ることができる。

【００１７】ここで、大腸菌の形質転換は、Hanahanの
方法[Hanahan,D.： J. Mol. Biol. 166：557-580(198
3)]、すなわち塩化カルシウム、塩化マグネシウム又は
塩化ルビジウムを共存させて調製したコンピテント細胞
に、組換えベクターを加える方法等により行うことがで
きる。なお、ベクターとしてプラスミドを用いる場合は
テトラサイクリン、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を
含有することが必要である。また、プラスミド以外のク
ローニングベクター、例えばλファージ（λgt11等)を
用いることもできる。

【００１８】上記のようにして得られる形質転換体から
目的のDNAを有する株を選択するには、例えば、ガレク
チンタンパク質ファミリーのアミノ酸配列に対応する縮
重センスプライマー及び縮重アンチセンスプライマーを
合成し、これを用いてPCRを行い、得られた断片をプロ
ーブとして、cDNAライブラリーからスクリーニングする
方法、あるいはλファージ（λgt11等)を用いた場合
は、λgt11 インサート増幅用のプライマーを用いてPCR
を行う方法を採用することができる。但し、本発明にお
いてはこれらのプライマーに限定されるものではない。

【００１９】このようにして得られたDNA増幅断片を、
³²P、³⁵S又はビオチン等で標識してプローブとし、これ
を形質転換体のDNAを変性固定したニトロセルロースフ
ィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株
を検索することによりスクリーニングすることができ
る。

【００２０】(2) 塩基配列の決定本発明においては、上記スクリーニングにおいて得られ
たcDNAのサイズが1kbp以上の単離クローンについて、PC
R産物をテンプレートにしてcDNAの塩基配列を決定す
る。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾
法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常
は自動塩基配列決定機（例えばApplied Biosystems社製
Model 310蛍光シークエンサー等）を用いて配列決定が
行われる。

【００２１】配列番号１に本発明のガレクチン遺伝子の
塩基配列を、配列番号２に本発明のガレクチンのアミノ
酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるタンパ
ク質がガレクチン活性を有する限り、当該アミノ酸配列
において少なくとも１個、好ましくは1若しくは数個の
アミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。

【００２２】例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配
列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さらに好ま
しくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号
２で表わされるアミノ酸配列に少なくとも１個、好まし
くは１〜10個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が
付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミ
ノ酸配列の少なくとも１個、好ましくは１〜10個、さら
に好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換
してもよい。

【００２３】ここで、ガレクチン活性とは、βガラクト
シドと結合する活性を意味する。なお、本発明のタンパ
ク質の上記活性は、ラクトース等のβガラクトシドをカ
ラムに固定したアフィニティクロマトグラフィを行い、
本発明のタンパク質がカラムに吸着されることを確認す
ることでその有無を判断することができる。

【００２４】また、上記遺伝子と下記の条件下でハイブ
リダイズすることができるDNAであってガレクチン活性
を有するタンパク質をコードするDNAも本発明の遺伝子
に含まれる。すなわち、DNAを固定したフィルターを用
いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、68℃でハイブリダイゼ
ーションを行った後、0.1〜2倍濃度のSSC溶液（1倍濃度
のSSCとは150mM NaCl、15mM クエン酸ナトリウムからな
る）を用い、68℃で洗浄することにより同定することが
できる条件をいう。

【００２５】さらに、上記DNAに対するRNA(配列番号
3)、又は該RNAとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズすることができるRNAであってガレクチン活性を
有するタンパク質をコードするRNAも本発明に含まれ
る。ガレクチン活性及びストリンジェントな条件の意味
は前記と同様である。

【００２６】なお、遺伝子に変異を導入するには、Kunk
el法や Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ず
る方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用
した変異導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）
やMutant-G(TAKARA社製）)などを用いて、あるいは、TA
KARA社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキット
を用いて行うことができる。

【００２７】本発明の遺伝子は、N末端領域にβガラク
トースと結合する特徴的なアミノ酸の連続配列（配列番
号１の82位から88位）、及びＣ末端領域に同様なアミノ
酸の連続配列（配列番号１の275位から281位）を有する
ことを特徴とする、ニジマスガレクチンのアミノ酸配列
に対応する塩基配列を有している。

【００２８】一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定され
ると、その後は化学合成によって、又はcDNAを鋳型とし
たPCRによって、あるいは該塩基配列を有するDNA断片を
プローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発
明の遺伝子を得ることができる。

【００２９】２．組換えベクター及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。
本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で
複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラ
スミド DNA、ファージ DNA等が挙げられる。

【００３０】プラスミド DNAとしては、大腸菌由来のプ
ラスミド（例えばpBR322, pBR325,pUC118, pUC119, pUC
18, pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB11
0,pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp2
4, YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλフ
ァージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt1
0、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウ
イルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バ
キュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いるこ
ともできる。

【００３１】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。

【００３２】本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発
揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子
等が挙げられる。

【００３３】(2) 形質転換体の作製本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
DNAを発現できるものであれば特に限定されるものでは
ない。例えば、大腸菌(Escherichia coli）等のエッシ
ェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtili
s)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomon
as putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロ
ティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細
菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharom
ycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizo
saccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、COS細胞、C
HO細胞等の動物細胞が挙げられ、あるいはS121等の昆虫
細胞が挙げられる。

【００３４】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。

【００３５】大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli) DH1などが挙げられ、枯草菌と
しては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtil
is)などが挙げられるが、これらに限定されるものでは
ない。

【００３６】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモーター、P_R
プロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロ
モーターが用いられる。tacプロモーターなどのよう
に、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよ
い。

【００３７】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen,
S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110
(1972)]、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

【００３８】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用い
られる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できる
ものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモータ
ー、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プ
ロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、P
GKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、
AOX1プロモーター等を用いることができる。

【００３９】酵母への組換えベクターの導入方法は、酵
母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例え
ばエレクトロポレーション法[Becker, D.M. et al.：Me
thods. Enzymol., 194： 182(1990)]、スフェロプラス
ト法[Hinnen, A. et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., US
A, 75： 1929(1978)]、酢酸リチウム法[Itoh, H.：J.Ba
cteriol., 153：163(1983)]等が挙げられる。

【００４０】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用い
られる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プ
ロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用
いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子
プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベ
クターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーシ
ョン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が
挙げられる。

【００４１】昆虫細胞を宿主とする場合は、S121細胞な
どが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方
法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクシ
ョン法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。

【００４２】(3) 本発明のタンパク質の生産本発明のタンパク質は、本発明のガレクチン遺伝子によ
りコードされるアミノ酸配列を有するもの、または該ア
ミノ酸配列において少なくとも1個のアミノ酸に前記変
異が導入されたアミノ酸配列を有し、かつガレクチン活
性を有するものである。なお、本発明のタンパク質をガ
レクチンタンパク質ともいう。

【００４３】本発明のガレクチンタンパク質は、前記形
質転換体を培養し、その培養物から採取することにより
得ることができる。「培養物」とは、培養上清、あるい
は培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破
砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転
換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の
方法に従って行われる。

【００４４】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資
化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転
換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、
天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源と
しては、グルコース、フラクトース、スクロース、デン
プン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エ
タノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられ
る。

【００４５】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸
アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム
塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物と
しては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リ
ン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウ
ム等が挙げられる。

【００４６】培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養
などの好気的条件下、37℃で行う。なお、培地のpHの調
整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン
等の抗生物質を培地に添加してもよい。

【００４７】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクタ
ーで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピ
ル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)等を、trpプロ
モーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を
培養するときにはインドール酢酸(IAA)等を培地に添加
してもよい。

【００４８】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地として、一般に使用されているRPMI1640
培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加
した培地等が用いられる。培養は、通常、５％CO₂存在
下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマ
イシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。

【００４９】培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は
細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕する
ことによりガレクチンタンパク質を抽出する。また、本
発明のタンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合
には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により
菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精
製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アン
モニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前
記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製すること
ができる。

【００５０】３．本発明の遺伝子を用いたニジマスガレ
クチンの検出方法及び検出用試薬 (1)本発明の遺伝子又はその断片のプローブとしての利
用本発明においては、上記のDNA又はRNAとハイブリダイズ
し、該DNA又はRNAを特異的に検出するプローブもニジマ
スガレクチンの検出用試薬として提供される。該プロー
ブは、通常使用される放射性同位元素（例えば、³²P、
³⁵S）、酵素（例えば、ディゴキシゲニン、フルオロレ
ッセイン）、などにより標識され、通常のプロッティン
グ分析、In situハイブリダイゼーションなどにより該D
NA又はRNAと特異的にハイブリダイズし、検出させる。

【００５１】本発明においてプローブとして使用するDN
A又はRNAは、配列番号１又は３に記載したDNA又はRNAの
塩基配列のうち少なくとも一部を有するものである。プ
ローブの長さは200〜300塩基であるが、配列の全部を有
するものであってもよく、特に限定されるものではな
い。本発明においては、配列番号１又は３の配列のう
ち、例えば第196〜218番目の配列、第474〜494番目の配
列を好適に用いることができる。

【００５２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。〔実施例1〕ガレクチン遺伝子の単離（a）cDNAライブラリーの構築ニジマス頭腎組織から総RNAをグアニジウムチオシアネ
ート-トリフルオロ酢酸セシウム法（Pharmacia RNA ext
raction Kit (Pharmacia)）により抽出した後、総RNAか
ら、ポリ（A）＋RNAをオリゴ（dT）−セルロースカラム
を使用して精製した。精製したポリ（A）＋RNAをテン
プレートとし、Cap Finder cDNA Synthesis Kit (Clont
ech)を用い、スピンカラムにて精製し、脱リン酸化する
ことにより両末端にEcoRIサイトを有するcDNAを構築し
た。

【００５３】このcDNAをλgt11のEcoRIサイトにT4DNAリ
ガーゼを用い連結させた。次にこのcDNAをインビトロパ
ッケージングキット（Gigapack III Gold Pakaging Ext
raction Kit (Stratagene）)を使用し、インビトロパッ
ケージングを行い、cDNAライブラリーを構築した。

【００５４】（b）cDNAライブラリーからの新規ガレク
チン遺伝子のスクリーニング（a）に記載したλgtll中に構築したニジマス頭腎cDNA
ライブラリーを宿主菌大腸菌Y1088に感染させ、プラー
クを形成させた。すなわち、Y1088株を0.2％マルトース
及び10mM MgCl₂を含むL培地で6-8時間培養後、集菌し、
10mM MgSO₄に吸光度0.5OD(600nm)となるように懸濁し
た。この細胞懸濁液とファージ液とを混合し、37℃で15
分間インキュベートすることによりファージを宿主菌に
吸着させた。これに0.7％軟寒天を加え、Lプレート上に
広げた（上記の操作を以後「プレーティング」と称
す）。単一プラークが形成されるように希釈してプレー
ティングし、単離した組換え体ファージを得た。プラー
クを少量分取し、SM溶液に分散させ、この一部をテンプ
レートに用いた。

【００５５】（c）PCRによるλgt11に組み込んだ遺伝子
の増幅と塩基配列の決定ニジマス頭腎由来のcDNAを組み込んだλgt11のcDNA領域
をλgt11用プライマー(Takara)でPCRを行い増幅させ
た。PCRは、以下の組成を有する反応液を用い、はじめ
に１回だけ94℃5分反応させた後、94℃で1分、55℃で1
分及び72℃で1分のサイクルを1サイクルとしてこれを35
サイクル行った。

【００５６】反応液の組成：PCR産物はエチジウムブロ
マイド存在下アガロースゲル電気泳動を行い、産物のサ
イズを調べた。また、PCR産物は遠心式の限外濾過器
（ウルトラフリーC3TK(Millipore)）を用いて精製後、D
NAシークエンシングキット（Applied Biosystems）を使
用し蛍光シークエンサModel310(Applied Biosystem)を
用いて塩基配列を決定した。

【００５７】（d）挿入断片の塩基配列決定前項（c）で調製したλgt11のcDNA領域のPCR産物をEcoR
IとSau3AIで分解し、この分解産物をアガロース電気泳
動により分離精製を行った。この精製物をベクターpUC1
8のマルチクローニングサイトのEcoRI-BamHIまたはBamH
Iサイトに挿入し、これらの組み換え体pUC18を大腸菌JM
109に形質転換させた。形質転換した大腸菌の各クロー
ンの挿入部分をPCR反応により増幅した。このPCR産物を
遠心式の限外濾過器（ウルトラフリーC3TK(Millipor
e)）を用いて精製後、DNAシークエンシングキット（App
lied Biosystems）を使用し、蛍光シークエンサModel31
0(Applied Biosystem)を用いて塩基配列を決定した。

【００５８】決定した塩基配列の全長は1565塩基対であ
り、その配列は配列番号１に記載した。GENBANK／EMBL
DNAData Baseを使用し、配列番号１に記載した塩基配列
を検索したが、同一の配列は存在しなかった。従って、
この塩基配列を有するDNAは全く新規なものであること
が認められた。

【００５９】配列番号１に記載した上記のクローンのcD
NAの塩基配列は、3’非翻訳配列と共に推定355アミノ酸
残基のオープンリーディングフレームを有していた。開
始コドンは塩基番号69-71に位置し、停止コドンは塩基
番号1092-1094に存在する。このオープンリーディング
フレームは、配列番号２に記載した341アミノ酸からな
る配列をコードしており、Ｎ末端領域の82番目から88番
目の領域のアミノ酸配列(WGTEERK；配列番号4)、及びＣ
末端領域の275番目から281番目の領域のアミノ酸配列(W
GKEERS：配列番号5)など、βガラクトースに結合すると
考えられる領域が存在することが認められた。

【００６０】図１に示すようにニジマスガレクチンのア
ミノ酸配列（Fish）と公知のガレクチンファミリーのア
ミノ酸配列(Rat)との相同性を調査した結果、ニジマス
ガレクチンは公知のガレクチンファミリーと高い相同性
を示した。アミノ酸レベルではマウスのガレクチン９に
最も高い相同性(46％)を示し、核酸レベルではラットの
ガレクチン9に最も高い相同性(64％)を示した。特に、
上述したように、βガラクトースに結合すると考えられ
る部位の配列が良く保存されている。なお、図1におい
て、アミノ酸配列は1文字で表記しており、また、下線
部はガラクトース結合部位を表す。

【００６１】〔実施例2〕遺伝子発現 (1) プローブの作製実施例１(c)項に記載したPCR産物をpGEM-T EASY ベクタ
ー（Promega）に組み込み、これを利用して大腸菌を形
質転換させた。菌を増殖後プラスミドを精製し、プロー
ブを作製する際のテンプレートとした。遺伝子解析ソフ
ト（GENETYXMACv9.0）を用いて以下の配列を有するプラ
イマーを設計した。 5'-TCCATGTGAA TTTGCAGTGT GGT-3'(配列番号6) 5'-CAACTCCACT TTCCCATCGG C-3'(配列番号7) 上記プライマー及びPCR DIG Probe Synthesis Kit（BOE
HRINGER MANNHEIM）を用いて、配列番号１に記載したニ
ジマスガレクチンcDNAのN末端側をコードする299bp断片
を増幅するとともにDIG（ディゴキシゲニン）標識し、
これをプローブとして用いた。

【００６２】(2) 組織での発現ニジマス各組織（頭腎、脾臓、胸腺、肝臓、心臓、脳、
眼、腸、表皮、筋肉、卵巣、血液、鰓、鰭及び浮袋）由
来のtotal RNAをプロットしてあるナイロンメンブレン
（BOEHRINGER MANNHEIM）に対し、DIG標識した、(a)項
に記載のPCR産物をプローブとして用いてハイブリダイ
ゼーションを行った。2XSSC（0.30M NaCl、0.030M tris
odiumcitrate-2H₂O、pH7.0）で洗浄したナイロンメンブ
レンフィルターをDIG Easy Hyb溶液（BOEHRINGER MANNH
EIM）中で穏やかに攪拌しながら、3時間プレハイブリダ
イズした。次に新たにDIG EasyHyb溶液に熱変性したプ
ローブを加えたハイブリダイジング溶液と交換し、37℃
で１晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイ
ゼーション完了後、0.1％SDS含有2×SSC溶液を用いて、
室温で５分間の条件で２回洗浄した。次にフィルターを
同溶液中に68℃、15分間の条件で２回洗浄した。このフ
ィルターを0.3% tween-20を含有した緩衝液（0.15M NaC
l, 0.1M マレイン酸, pH7.5）で室温、５分間洗浄後、
アルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体とCSPD (Disod
ium 3-(4-methoxyspiro (1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chlo
ro)tricyclo(3.3.1.13,7)decan)-4-yl)phenyl phosphat
e)を用いた化学発光検出キット（BOEHRINGER MANNHEI
M）により、フィルター上におけるDIG標識されたプロー
ブの検出を行った。その結果、ガレクチン遺伝子の転写
産物のサイズは、何れの組織でも約1.7kbであり、調べ
た組織中、頭腎、脾臓、胸腺で高い発現を認めた（図
２）。

【００６３】〔実施例3〕ガレクチンタンパク質の生産 (a) 発現ベクターの作製大腸菌と原核細胞発現用ベクターであるpRSET Cベクタ
ー（Invitrogen）を用いてニジマスガレクチンの発現を
試みた。先ず、ベクターへの挿入断片の作製のために、
ニジマスガレクチン遺伝子のコーディング領域を含み、
またベクターのフレームに合う増幅断片を得るために以
下のプライマーを設計した。センスプライマー: 5' CGGGATCCAAATGGCATTTTACAACCAGGAAC 3'（配列番号8） BamHI アンチセンスプライマー: 5' CCCAAGCTTCTAAACCATCACAGAGGTCAAACT 3'（配列 Hind III 番号9）

【００６４】ベクターへのライゲーションを簡便にする
ため上記センスプライマーとアンチセンスプライマーの
上流側にそれぞれBamHI及びHind IIIの制限酵素消化サ
イトを付加した（下線部）。ラムダgt11ファージから上
記一組のプライマーとExtaqポリメラーゼ(TaKaRa)を用
いてPCRを行った。PCRの条件は、プライマーを変えたこ
とを除いて実施例１、(c)に記載の条件（ラムダgt11フ
ァージからガレクチン遺伝子を増幅させたときの条件）
と同じ条件で行った。

【００６５】PCR反応終了後、PCR産物とpRSET Cベクタ
ーのBamH Iサイト及びHind IIIサイトを各制限酵素で消
化した。QIAEX IIkit (QIAGEN)を用いてそれぞれの消化
産物をゲル抽出した後、T4リガーゼによりライゲーショ
ンした。

【００６６】(b) 挿入断片（ガレクチン遺伝子）の塩基
配列の確認上記ガレクチン遺伝子を挿入したpRSET Cベクターを用
いて、サブクローニング用宿主大腸菌XL1-Blue株（STRA
TAGENE）を形質転換した。宿主大腸菌からプラスミドを
調製し、挿入断片の塩基配列解析を行った結果、正しい
ガレクチン遺伝子の塩基配列がフレームに合致して挿入
されていることを確認した。

【００６７】(c) 形質転換体の作製及びニジマスガレク
チンのタンパク質の生産上記ガレクチン遺伝子を挿入したpRSET Cベクターを用
いて、タンパク質発現用宿主大腸菌BL21(DE3)pLysS株
（Invitrogen）を形質転換した。すなわち、大腸菌コン
ピテントセルとプラスミドを混和後、氷上で30分、42℃
で1分、37℃で2分の温度処理を行い、SOC培地に浮遊し
て37℃で1時間インキュベートした。その後50μg/mlア
ンピシリンを添加したLB寒天培地上に播種し、形質転換
させた大腸菌コロニーを得た。

【００６８】50μg/mlアンピシリン、34μg/mlクロラム
フェニコールを添加したLB培地で形質転換した大腸菌を
37℃で培養し、培養液のタンパク質濃度が0.6OD（600n
m）に達した時点で最終濃度1mMのIPTGを添加した。IPTG
を添加して４時間後に3mlの培養液を5,000×g、10分
間、4℃で遠心し大腸菌を沈殿させた。ペレットを3mlの
MEPBS(58mM Na₂HPO₄, 18mM KH₂PO₄, 75mM NaCl, 2mM ED
TA, 4mM 2-βメルカプトエタノール, 1mM PMSF(phenylm
ethylsulphonyl fluoride))に再浮遊し、菌体を超音波
破砕した。菌体破砕液を20,000×g、30分間、４℃で遠
心し、上清をラクトースアガロース（SIGMA）をつめた2
mlカラムに添加し、ラクトース結合性のタンパク質を吸
着させた。カラムをMEPBSで３回洗浄後、カラム内のラ
クトースアガロースを可溶化用緩衝液(lysis buffer)
（100mM NaCl, 50mM Na₂HPO₄, 10mM Tris-HCl, 8M Ure
a, pH 8.0）に浮遊させ、続いて試料用緩衝液(2ME+)（W
AKO）を添加した。

【００６９】ラクトース結合性のタンパク質をSDS-PAGE
電気泳動に供試し、目的のタンパク質の検出を行った
（図３）。図３において、各レーンは以下の通りであ
る。レーン１：宿主大腸菌BL21株可溶化物レーン２：ガレクチン組み換え宿主大腸菌BL21株可溶化
物レーン３：ラクトースアフィニティカラムを用いて精製
されたガレクチン

【００７０】レーン２においては、レーン1に認められ
ないガレクチン分子（予想サイズ約38kDa）のバンドが
認められた。レーン３においては、ガレクチンと考えら
れるタンパク質がラクトースカラムによって精製された
こと（すなわち、本発明のタンパク質がラクトースに結
合したこと）を示している。なお、他のタンパク質の遺
伝子をpRSET Cベクターに組み込み、同様な方法により
発現させたタンパク質をラクトースアフィニティにより
精製した場合には、ラクトース結合性のタンパク質が得
られなかった。

【００７１】

【発明の効果】本発明により、ニジマスガレクチン、該
ガレクチンをコードする遺伝子が提供される。本発明の
遺伝子は、魚類免疫機構を解明するための研究用試薬又
は魚病の診断用試薬として有用である。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director General,National Research Institute of Aquaculture,Fisher ies Agency,Ministry of Agriculture,Forestory and Fisheries <120> A gene encoding Galectin <130> P98-0427 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1565 <212> DNA <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> CDS <222> (69)..(1091) <400> 1 ttctcgtact gagaagagag tgttgagcaa ctgagaagac gtttcgattt actgtgagat 60 ttggagaa atg gca ttt tac aac cag gaa cct ttt tat aat ccg agt ctc 110 Met Ala Phe Tyr Asn Gln Glu Pro Phe Tyr Asn Pro Ser Leu 1 5 10 cct ttc acc ggc tca atc caa ggt ggg ctt cag gag ggg aag acc atc 158 Pro Phe Thr Gly Ser Ile Gln Gly Gly Leu Gln Glu Gly Lys Thr Ile 15 20 25 30 act atc act ggg aga gtt cac cat ggg gca gac agg ttc cat gtg aat 206 Thr Ile Thr Gly Arg Val His His Gly Ala Asp Arg Phe His Val Asn 35 40 45 ttg cag tgt ggt tct agg gca ggg gca gac att gcc ctt cac ttc aat 254 Leu Gln Cys Gly Ser Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ala Leu His Phe Asn 50 55 60 cca cgc tat gac agt cac cct gga tat gtg gtg acc aac acc ttg cag 302 Pro Arg Tyr Asp Ser His Pro Gly Tyr Val Val Thr Asn Thr Leu Gln 65 70 75 caa tcc aaa tgg ggg aca gag gag cgg aag cag cat tcc ccc ttc caa 350 Gln Ser Lys Trp Gly Thr Glu Glu Arg Lys Gln His Ser Pro Phe Gln 80 85 90 cgt ggc tcc agc ttc agc ctc gag ata act gtc cag agg gac ttc ttc 398 Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu Glu Ile Thr Val Gln Arg Asp Phe Phe 95 100 105 110 cag ttg aaa gtg aat ggg aac cat ttc atg acc ttc aag cac cga atc 446 Gln Leu Lys Val Asn Gly Asn His Phe Met Thr Phe Lys His Arg Ile 115 120 125 ccg ttt tac tca gtg gac acc atc tca gcc gat ggg aaa gtg gag ttg 494 Pro Phe Tyr Ser Val Asp Thr Ile Ser Ala Asp Gly Lys Val Glu Leu 130 135 140 acc tcc atc gtc ttc cag aac cct gcg ccc acc att cct gca cag cca 542 Thr Ser Ile Val Phe Gln Asn Pro Ala Pro Thr Ile Pro Ala Gln Pro 145 150 155 gga ttt ccg gca caa cct gga ttc cct tct tat ccg gga ttt ccg gcc 590 Gly Phe Pro Ala Gln Pro Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala 160 165 170 caa cca gga ttc cct tct tat ccg gga ttt ccg gca caa cca gga ttc 638 Gln Pro Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala Gln Pro Gly Phe 175 180 185 190 cct tct tgt ccg gga ttt ccg gga caa cca gga ttc cct tat cca gga 686 Pro Ser Cys Pro Gly Phe Pro Gly Gln Pro Gly Phe Pro Tyr Pro Gly 195 200 205 ttt ccc gca caa cca gct gtt cca tac aag aac atg atc aat gga gga 734 Phe Pro Ala Gln Pro Ala Val Pro Tyr Lys Asn Met Ile Asn Gly Gly 210 215 220 ctc tac cct gga cgc acc atc aac atc cag gga gtg gtt aac ccc aat 782 Leu Tyr Pro Gly Arg Thr Ile Asn Ile Gln Gly Val Val Asn Pro Asn 225 230 235 gcc aat agg ttc cac att aac cta ctg ttc aac tct ggg att gcg ctg 830 Ala Asn Arg Phe His Ile Asn Leu Leu Phe Asn Ser Gly Ile Ala Leu 240 245 250 cac ttc aac ccc cga ttt gac gag acc cta gtg gta cgc aac agc aag 878 His Phe Asn Pro Arg Phe Asp Glu Thr Leu Val Val Arg Asn Ser Lys 255 260 265 270 ctg aga gac cag tgg gga aag gag gag cgc tct ggt gga atg ccc ttc 926 Leu Arg Asp Gln Trp Gly Lys Glu Glu Arg Ser Gly Gly Met Pro Phe 275 280 285 cac agg ggc cag gcc ttc acg ctg tct att acc tgt gat gcg cag tgc 974 His Arg Gly Gln Ala Phe Thr Leu Ser Ile Thr Cys Asp Ala Gln Cys 290 295 300 tac aag ata gtg gtc aac ggg aat cag acg agc acc tac aaa cac cgc 1022 Tyr Lys Ile Val Val Asn Gly Asn Gln Thr Ser Thr Tyr Lys His Arg 305 310 315 cac acc ctc ctc cag cag gtc aac atc ctg gag gtg gat gga gac ctc 1070 His Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Ile Leu Glu Val Asp Gly Asp Leu 320 325 330 agt ttg acc tct gtg atg gtt tagtgctgtg ggtcacaact gtctttggtg 1121 Ser Leu Thr Ser Val Met Val 335 340 acctagccac ttgtttcatc tgacccaaac catttgtatt ttttgatctc ttcttgctat 1181 gataaaaatg acatgaactt tgttttttta ctgctttcac tgcctgttag attatctcac 1241 ttgcaaatgt attatcagtc agtgctgtgc catcaacttc gaggatgaga aatgtattcc 1301 tgtttgttat aaatcacagt agaaagccat cagaaatcat attgattgct ttagccatca 1361 tttttgtagc gctagacata ttcttaaatc attattattt ttttgtgata taatgccaga 1421 cctgatgtta cctatcatga gaagtaccct gaggacatta attctgataa ttccatatgc 1481 ctgataattc catatgtagc cttgttcatc accagagtct ctatgctcgt ttctataaaa 1541 gtctgaagat atatacaaaa aaaa 1565 <210> 2 <211> 341 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <400> 2 Met Ala Phe Tyr Asn Gln Glu Pro Phe Tyr Asn Pro Ser Leu Pro Phe 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ile Gln Gly Gly Leu Gln Glu Gly Lys Thr Ile Thr Ile 20 25 30 Thr Gly Arg Val His His Gly Ala Asp Arg Phe His Val Asn Leu Gln 35 40 45 Cys Gly Ser Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ala Leu His Phe Asn Pro Arg 50 55 60 Tyr Asp Ser His Pro Gly Tyr Val Val Thr Asn Thr Leu Gln Gln Ser 65 70 75 80 Lys Trp Gly Thr Glu Glu Arg Lys Gln His Ser Pro Phe Gln Arg Gly 85 90 95 Ser Ser Phe Ser Leu Glu Ile Thr Val Gln Arg Asp Phe Phe Gln Leu 100 105 110 Lys Val Asn Gly Asn His Phe Met Thr Phe Lys His Arg Ile Pro Phe 115 120 125 Tyr Ser Val Asp Thr Ile Ser Ala Asp Gly Lys Val Glu Leu Thr Ser 130 135 140 Ile Val Phe Gln Asn Pro Ala Pro Thr Ile Pro Ala Gln Pro Gly Phe 145 150 155 160 Pro Ala Gln Pro Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala Gln Pro 165 170 175 Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala Gln Pro Gly Phe Pro Ser 180 185 190 Cys Pro Gly Phe Pro Gly Gln Pro Gly Phe Pro Tyr Pro Gly Phe Pro 195 200 205 Ala Gln Pro Ala Val Pro Tyr Lys Asn Met Ile Asn Gly Gly Leu Tyr 210 215 220 Pro Gly Arg Thr Ile Asn Ile Gln Gly Val Val Asn Pro Asn Ala Asn 225 230 235 240 Arg Phe His Ile Asn Leu Leu Phe Asn Ser Gly Ile Ala Leu His Phe 245 250 255 Asn Pro Arg Phe Asp Glu Thr Leu Val Val Arg Asn Ser Lys Leu Arg 260 265 270 Asp Gln Trp Gly Lys Glu Glu Arg Ser Gly Gly Met Pro Phe His Arg 275 280 285 Gly Gln Ala Phe Thr Leu Ser Ile Thr Cys Asp Ala Gln Cys Tyr Lys 290 295 300 Ile Val Val Asn Gly Asn Gln Thr Ser Thr Tyr Lys His Arg His Thr 305 310 315 320 Leu Leu Gln Gln Val Asn Ile Leu Glu Val Asp Gly Asp Leu Ser Leu 325 330 335 Thr Ser Val Met Val 340 <210> 3 <211> 1565 <212> RNA <213> Oncorhynchus mykiss <220> <221> CDS <222> (69)..(1091) <400> 3 uucucguacu gagaagagag uguugagcaa cugagaagac guuucgauuu acugugagau 60 uuggagaa aug gca uuu uac aac cag gaa ccu uuu uau aau ccg agu cuc 110 Met Ala Phe Tyr Asn Gln Glu Pro Phe Tyr Asn Pro Ser Leu 1 5 10 ccu uuc acc ggc uca auc caa ggu ggg cuu cag gag ggg aag acc auc 158 Pro Phe Thr Gly Ser Ile Gln Gly Gly Leu Gln Glu Gly Lys Thr Ile 15 20 25 30 acu auc acu ggg aga guu cac cau ggg gca gac agg uuc cau gug aau 206 Thr Ile Thr Gly Arg Val His His Gly Ala Asp Arg Phe His Val Asn 35 40 45 uug cag ugu ggu ucu agg gca ggg gca gac auu gcc cuu cac uuc aau 254 Leu Gln Cys Gly Ser Arg Ala Gly Ala Asp Ile Ala Leu His Phe Asn 50 55 60 cca cgc uau gac agu cac ccu gga uau gug gug acc aac acc uug cag 302 Pro Arg Tyr Asp Ser His Pro Gly Tyr Val Val Thr Asn Thr Leu Gln 65 70 75 caa ucc aaa ugg ggg aca gag gag cgg aag cag cau ucc ccc uuc caa 350 Gln Ser Lys Trp Gly Thr Glu Glu Arg Lys Gln His Ser Pro Phe Gln 80 85 90 cgu ggc ucc agc uuc agc cuc gag aua acu guc cag agg gac uuc uuc 398 Arg Gly Ser Ser Phe Ser Leu Glu Ile Thr Val Gln Arg Asp Phe Phe 95 100 105 110 cag uug aaa gug aau ggg aac cau uuc aug acc uuc aag cac cga auc 446 Gln Leu Lys Val Asn Gly Asn His Phe Met Thr Phe Lys His Arg Ile 115 120 125 ccg uuu uac uca gug gac acc auc uca gcc gau ggg aaa gug gag uug 494 Pro Phe Tyr Ser Val Asp Thr Ile Ser Ala Asp Gly Lys Val Glu Leu 130 135 140 acc ucc auc guc uuc cag aac ccu gcg ccc acc auu ccu gca cag cca 542 Thr Ser Ile Val Phe Gln Asn Pro Ala Pro Thr Ile Pro Ala Gln Pro 145 150 155 gga uuu ccg gca caa ccu gga uuc ccu ucu uau ccg gga uuu ccg gcc 590 Gly Phe Pro Ala Gln Pro Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala 160 165 170 caa cca gga uuc ccu ucu uau ccg gga uuu ccg gca caa cca gga uuc 638 Gln Pro Gly Phe Pro Ser Tyr Pro Gly Phe Pro Ala Gln Pro Gly Phe 175 180 185 190 ccu ucu ugu ccg gga uuu ccg gga caa cca gga uuc ccu uau cca gga 686 Pro Ser Cys Pro Gly Phe Pro Gly Gln Pro Gly Phe Pro Tyr Pro Gly 195 200 205 uuu ccc gca caa cca gcu guu cca uac aag aac aug auc aau gga gga 734 Phe Pro Ala Gln Pro Ala Val Pro Tyr Lys Asn Met Ile Asn Gly Gly 210 215 220 cuc uac ccu gga cgc acc auc aac auc cag gga gug guu aac ccc aau 782 Leu Tyr Pro Gly Arg Thr Ile Asn Ile Gln Gly Val Val Asn Pro Asn 225 230 235 gcc aau agg uuc cac auu aac cua cug uuc aac ucu ggg auu gcg cug 830 Ala Asn Arg Phe His Ile Asn Leu Leu Phe Asn Ser Gly Ile Ala Leu 240 245 250 cac uuc aac ccc cga uuu gac gag acc cua gug gua cgc aac agc aag 878 His Phe Asn Pro Arg Phe Asp Glu Thr Leu Val Val Arg Asn Ser Lys 255 260 265 270 cug aga gac cag ugg gga aag gag gag cgc ucu ggu gga aug ccc uuc 926 Leu Arg Asp Gln Trp Gly Lys Glu Glu Arg Ser Gly Gly Met Pro Phe 275 280 285 cac agg ggc cag gcc uuc acg cug ucu auu acc ugu gau gcg cag ugc 974 His Arg Gly Gln Ala Phe Thr Leu Ser Ile Thr Cys Asp Ala Gln Cys 290 295 300 uac aag aua gug guc aac ggg aau cag acg agc acc uac aaa cac cgc 1022 Tyr Lys Ile Val Val Asn Gly Asn Gln Thr Ser Thr Tyr Lys His Arg 305 310 315 cac acc cuc cuc cag cag guc aac auc cug gag gug gau gga gac cuc 1070 His Thr Leu Leu Gln Gln Val Asn Ile Leu Glu Val Asp Gly Asp Leu 320 325 330 agu uug acc ucu gug aug guu uagugcugug ggucacaacu gucuuuggug 1121 Ser Leu Thr Ser Val Met Val 335 340 accuagccac uuguuucauc ugacccaaac cauuuguauu uuuugaucuc uucuugcuau 1181 gauaaaaaug acaugaacuu uguuuuuuua cugcuuucac ugccuguuag auuaucucac 1241 uugcaaaugu auuaucaguc agugcugugc caucaacuuc gaggaugaga aauguauucc 1301 uguuuguuau aaaucacagu agaaagccau cagaaaucau auugauugcu uuagccauca 1361 uuuuuguagc gcuagacaua uucuuaaauc auuauuauuu uuuugugaua uaaugccaga 1421 ccugauguua ccuaucauga gaaguacccu gaggacauua auucugauaa uuccauaugc 1481 cugauaauuc cauauguagc cuuguucauc accagagucu cuaugcucgu uucuauaaaa 1541 gucugaagau auauacaaaa aaaa 1565 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <400> 4 Trp Gly Thr Glu Glu Arg Lys 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Oncorhynchus mykiss <400> 5 Trp Gly Lys Glu Glu Arg Ser 1 5 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of SEQ ID NO 2. <400> 6 tccatgtgaa tttgcagtgt ggt 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide designed based on the sequence of SEQ ID NO 2. <400> 7 caactccact ttcccatcgg c 21 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 cgggatccaa atggcatttt acaaccagga ac 32 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 cccaagcttc taaaccatca cagaggtcaa act 33

【００７３】

【配列表フリーテキスト】配列番号６：配列番号２の配
列に基づいて設計したオリゴヌクレオチド。配列番号７：配列番号２の配列に基づいて設計したオリ
ゴヌクレオチド。配列番号8：合成DNA。配列番号9：合成DNA。

【図面の簡単な説明】

【図１】ニジマスガレクチンのアミノ酸配列と公知のガ
レクチンファミリーのアミノ酸配列との相同性を示す図
である。

【図２】ノーザンブロット分析による各種のニジマス組
織中でのガレクチンmRNAの発現結果を示す写真である。

【図３】SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を
示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタン
パク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつガレクチン活性を有するタ
ンパク質
【請求項２】以下の(a)又は(b)のタンパク質をコード
する遺伝子。 (a) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタン
パク質 (b) 配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつガレクチン活性を有するタ
ンパク質
【請求項３】以下の(c)又は(d)のDNAからなる遺伝
子。 (c) 配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNA (d) 配列番号１で表わされる塩基配列からなるDNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつガレ
クチン活性を有するタンパク質をコードするDNA
【請求項４】以下の(e)又は(f)のRNAからなる遺伝
子。 (e) 配列番号３で表わされる塩基配列からなるRNA (f) 配列番号３で表わされる塩基配列からなるRNAとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつガレ
クチン活性を有するタンパク質をコードするRNA
【請求項５】請求項２〜４のいずれか１項に記載の遺
伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】請求項５記載の組換えベクターを含む形
質転換体。
【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培養し、得
られる培養物からガレクチンを採取することを特徴とす
るガレクチンの製造方法。
【請求項８】配列番号６及び７で表される塩基配列を
有するプライマーを用いて増幅される断片であって、配
列番号１に記載のニジマスガレクチンcDNAのうち該ニジ
マスガレクチンのN末端側をコードする299bpの断片を含
む、ニジマスガレクチンの検出用試薬。