JP2023515692A - 代謝性肝障害の治療のための組成物と方法 - Google Patents

代謝性肝障害の治療のための組成物と方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、代謝性肝障害の治療のための組成物及び方法に関する。前記組成物及び方法は、トランス遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃポリヌクレオチドを含むことができる。前記トランス遺伝子は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）又はメチルマロニルＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）を含むことができる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月４日に出願された米国仮出願第６２／９８５，０４７号、及び２０２０年１２月４日に出願された米国仮出願第６３／１２１，４８８号に対する優先権及び利益を主張する。前述の特許出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年３月３日に作成されたこのＡＳＣＩＩコピーは、「ＰＯＴＨ－０５８＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名前で、サイズは約３２９ＫＢである。
先天性代謝異常症としても知られている遺伝性代謝障害は、両親から最も一般的に遺伝しやすい遺伝的欠陥によって引き起こされる病状である。正常な代謝には、細胞や生物が、食物やその他の栄養素を必須化合物やエネルギーに変換するために使用する一連の複雑な化学反応が必要である。これらの化学反応はまた、有毒物質を含む不要な物質を分解して除去するためにも使用される。遺伝性代謝障害を引き起こす遺伝的欠陥は、多くの場合、１つ以上の代謝経路内の特定の酵素の活性の欠乏をもたらす。この欠乏は、潜在的に有毒な物質の蓄積をもたらすだけでなく、必須化合物を合成する被験体の能力を制限する可能性がある。主に肝臓に影響を与えるものを含め、性状解析されている何百もの遺伝性代謝障害がある。肝臓の遺伝性代謝障害には、尿素サイクル障害（ＵＣＤ）及びメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）が含まれる。
尿素サイクル障害（ＵＣＤ）は、タンパク質及び他の窒素含有分子の分解によって生成される窒素の代謝に欠陥をもたらす遺伝子変異に起因する。ＵＣＤは一般的に、尿素回路の最初の４つの酵素、すなわちカルバモイルリン酸合成酵素Ｉ（ＣＰＳＩ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳ）、及びアルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（ＡＳＬ）のいずれか、又は補因子産生物Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）の活性の深刻な欠乏又は完全な欠如によって引き起こされ、アンモニア及び他の前駆体代謝産物の蓄積を引き起こす。通常、ＵＣＤは新生児において診断されるが、遅発性ＵＣＤが報告されている。ＵＣＤは、脳の損傷、認知障害、さらには死に至る可能性がある。実際、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）症例の最大２０％が、ＵＣＤなどの遺伝性代謝障害に起因する可能性があるという仮説が立てられている。
ＵＣＤの現在の治療は、ＵＣＤの一般的な症状である高アンモニア血症の急性制御に焦点が当てられている。高アンモニア血症は神経毒性が高く、静脈－静脈血液濾過を含む集中的治療介入が必要である。現在、ＵＣＤの長期治療は、代替経路療法、厳格な食事性タンパク質制限、尿素回路中間体の補給、及び異化作用の厳密な回避に依存している。ＵＣＤの患者はしばしば肝移植を必要とする。しかし、肝移植前に高アンモニア血症の再発を予防することは困難な場合がある。従って、当技術分野では、ＵＣＤの治療のための改善された組成物及び方法が必要とされている。
肝臓に影響を及ぼす他の代謝障害には、常染色体劣性障害であるメチルマロン酸血症（ＭＭＡ）（メチルマロン酸尿症とも呼ばれる）が含まれる。ＭＭＡは正常なアミノ酸代謝を破壊する。メチルマロン酸血症の遺伝型は、酵素メチルマロニル－ＣｏＡムターゼによるメチルマロニル－補酵素Ａ（ＣｏＡ）からスクシニル－ＣｏＡへの変換を調節する代謝経路の欠陥を引き起こす。この状態の結果、特定の脂肪やタンパク質を適切に消化できなくなり、このため血液中に毒性レベルのメチルマロン酸が蓄積される。単独のメチルマロン酸血症は、ＭＭＵＴ、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＤＨＣ、又はＭＣＥＥの５つの遺伝子の１つの変化によって引き起こされる。ホモシスチン尿症を伴うメチルマロン酸血症は、ＭＭＡＤＨＣ、ＬＭＢＲＤ１、及びＡＢＣＤ４遺伝子の変異によって引き起こされる。
メチルマロン酸血症に対する特別な治療法はない。治療は現在、症状の管理に限定されており、代償不全事象の積極的な治療、特別なタンパク質管理食、ビタミンＢ１２応答性サブタイプに対するビタミンＢ１２補給、カルニチンなどの薬物治療、代償不全事象をもたらすストレス因子（絶食や病気など）の回避が含まる。肝臓又は腎臓の移植（又は両方）が、一部の患者を助けることが示されている。これらの移植は、メチルマロン酸を正常に分解するのに役立つ新しい細胞を体に提供する。
肝臓の遺伝性代謝障害を含む遺伝性代謝障害の治療のための遺伝子治療を開発するこれまでの試みは、送達されたトランス遺伝子を標的組織で長期間発現させることができないという問題を抱えていた。この問題は、若者の肝臓などの急速に分裂する組織で特に顕著である。ＡＡＶベクターなどの既存の遺伝子治療用ベクターは、宿主のゲノムへの組み込みが不可能なため、導入されたトランス遺伝子が短期間しか発現しないという問題がある。当技術分野で長年感じられてきたこの必要性に対して、本開示の組成物及び方法は、標的組織において送達されたトランス遺伝子の長期発現をもたらすトランスポゾン／トランスポサーゼベースのＡＡＶベクターを提供することによる解決策を提供する。
要約
本開示は、５'から３'方向に以下を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する：ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、ｄ）配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｉ）配列番号１２９の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及びｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
本開示は、配列番号１３８の核酸配列を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する：ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、ｄ）配列番号１３２の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｉ）配列番号１３０の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及びｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
本開示は、配列番号１３９の核酸配列を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、５'から３'方向に以下を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する：ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、ｄ）配列番号１３の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、ｉ）配列番号１３１の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及びｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
本開示は、配列番号１４０の核酸配列を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを提供する：ａ）配列番号１２７の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、ｂ）配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、ｃ）配列番号４８の核酸配列を含む少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ｄ）配列番号１３６の核酸配列を含むポリＡ配列、ｅ）配列番号１３７の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及びｆ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
本開示は、配列番号１４４の核酸配列を含む、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターはウイルスベクターであり得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターはＡＡＶウイルスベクターであり得る。いくつかの態様において、ＡＡＶウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ウイルスベクターであり得る。いくつかの態様において、ＡＡＶウイルスベクターは、ＡＡＶ－ＫＰ－１又はＡＡＶ－ＮＰ５９ウイルスベクターであり得る。いくつかの態様において、ＡＡＶウイルスベクターは、ＡＡＶ－ＫＰ－１ウイルスベクターであり得る。
本開示は、本開示の少なくとも１つのベクターを含む組成物を提供する。
本開示は、それを必要とする被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害（ＭＬＤ）を治療する方法であって、被験体に、提示された開示のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の少なくとも１つの治療有効量を投与することを含む方法を提供する。
本開示は、それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤを治療する方法であって、被験体に、ａ）本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド、又は本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むベクター若しくは組成物、及びｂ）本開示のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド、又は本開示のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むベクター若しくは組成物を、投与することを含む方法を提供する。
本開示は、それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤの治療のための、本開示のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の使用を提供し、ここで、ポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物は、被験体に、少なくとも１つの治療有効量を投与するためのものである。
本開示は、それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤの治療に使用するための、ａ）本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド、又は本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むベクター若しくは組成物と、ｂ）本開示のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド、又は本開示のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むベクター若しくは組成物との、組合わせを提供する。
いくつかの態様において、少なくとも１つのＭＬＤは、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠乏（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞タイプ１（ＰＦＩＣ３）、又はこれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、ＭＬＤはＯＴＣ欠損症である。
上記の態様のいずれも、他の態様と組み合わせることができる。
特に他に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。明細書において、単数形には、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数形も含まれる。例として用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、単数又は複数であると理解され、用語「又は」は包括的であると理解される。例として「要素」は１つ以上の要素を意味する。本明細書全体を通して、「含んでいる（comprising）」という言葉、又は「含む（comprises）」又は「含んでいる（comprising）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の要素、整数、若しくは工程、又は要素、整数、若しくは工程の群を除外しないことを意味すると理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内であると理解することができる。文脈から特に明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、用語「約」によって修飾されている。
本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及びその他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ここに引用された参考文献は、特許請求された本発明の先行技術であると認めるものではない。矛盾がある場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示のみを目的としており、限定することを意図するものではない。本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
上記の及びさらなる特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の例示的なＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの概略図である。
本開示の様々なウイルスベクターで処理されたマウスにおいて測定されたＢＬＩを示すグラフである。
様々な濃度の本開示の様々なウイルスベクターで処理されたマウスにおいて測定されたＢＬＩを示すグラフである。
本開示の様々なウイルスベクターで処理されたＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスにおいて測定されたＢＬＩを示すグラフである。
Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスに投与された本開示の様々なウイルスベクターについて、２倍体ゲノムあたりの非組み込みベクターコピー数の量を示す一連のグラフである。
Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスに投与された本開示の様々なウイルスベクターについて、二倍体ゲノムあたりの非組み込みベクターコピー数、及び二倍体ゲノムあたりの組み込みベクターコピー数の量を示す一連のグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理したＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスにおける、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡ及びＳＰＢｍＲＮＡの量を示す一連のグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスにおける、二倍体ゲノムあたりの総ベクターコピー数に対するヒトＯＴＣｍＲＮＡ又はＳＰＢｍＲＮＡの相関を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理した誘導性高アンモニア血症マウスモデルにおける生存確率を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理された誘導性高アンモニア血症マウスモデルから得られた血漿中のアンモニア濃度を示すグラフである。
本開示の様々なウイルスベクターで処理されたマウスにおいて測定された肝臓ＢＬＩを示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡの量を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するＳＢＰｍＲＮＡの量を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣタンパク質のレベルに対するヒトＯＴＣタンパク質の量を示すグラフである。
本開示の様々なウイルスベクターで処理されたマウスにおいて測定されたＢＬＩを示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡの量を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するＳＢＰｍＲＮＡの量を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスにおける、マウスＯＴＣタンパク質のレベルに対するヒトＯＴＣタンパク質の量を示すグラフである。
本開示のウイルスベクターで処理されたマウスから単離された肝細胞の免疫組織染色解析を示す。
詳細な説明
本開示は、特に限定されるものではないが、尿素サイクル障害（ＵＣＤ）を含む代謝性肝障害の治療のための組成物及び方法を提供する。この組成物及び方法は、本明細書にさらに詳細に記載される。
開示の組成物
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのインスレーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのトランス遺伝子配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのポリＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩｎｔ６Ｆ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩｎｔ６Ｐ１配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩｎｔ６Ｒ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＪｃｔＲ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＭＣＳ配列を含むことができる。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができ、ここで、第１のインスレーター配列と第２のインスレーター配列の間には、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、及び少なくとも１つのポリＡ配列の任意の組み合わせが存在する。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができ、ここで、第１のインスレーター配列と第２のインスレーター配列との間には、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、及び少なくとも１つのポリＡ配列の任意の組み合わせが存在する。．
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができ、ここで第１のインスレーター配列と第２のインスレーター配列との間には、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、及び少なくとも１つのポリＡ配列の任意の組み合わせが存在する。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランス遺伝子配列、続いてｐｏｌｙＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、少なくとも１つのトランス遺伝子配列は、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図２に示す。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、少なくとも１つのトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図３Ａに示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列と第２のＡＡＶＩＴＲ配列との間に、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び続いて少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、少なくとも１つのトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図３Ｂに示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第２のＡＡＶＩＴＲ配列の後に、少なくとも１つのＤＮＡスペーサーを含むことができる。第２のＡＡＶＩＴＲ配列の後に少なくとも１つのＤＮＡスペーサーを有するＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例を図３Ｂに示す。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、少なくとも第２のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、少なくとも第２のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて第１のトランス遺伝子配列、続いて少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、続いて少なくとも第２のトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列は、Ｔ２Ａペプチドをコードするものを含むことができ、少なくとも第２のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図５に示す。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの別の非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターを含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列はＴ２Ａペプチドをコードするものを含むことができ、少なくとも第２のトランス遺伝子配列はルシフェラーゼ配列（例えば、NanoLuc）を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図８に示す。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列は、Ｔ２Ａペプチドをコードするものを含むことができ、少なくとも第２のトランス遺伝子配列は、誘導性カスパーゼ－９（ｉＣＡＳ９）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図７に示す。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第１のプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、少なくとも第２のプロモーター配列、少なくとも第２のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、第１のプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、少なくとも第２のプロモーター配列、少なくとも第２のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて第１のプロモーター配列、続いて第１のトランス遺伝子配列、続いて少なくとも第２のプロモーター配列、続いて少なくとも第２のトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、第１のプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、少なくとも第２のプロモーター配列は、ＨＬＰを含むことができ、少なくとも第２のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図６に示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、２つ以上のトランス遺伝子配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが２つ以上のトランス遺伝子配列を含むいくつかの態様において、個々のトランス遺伝子配列は、自己切断ペプチド配列によって分離することができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが２つ以上の自己切断ペプチド配列を含むいくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、２つ以上のトランス遺伝子配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが２つ以上のトランス遺伝子配列を含むいくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、同じポリペプチドをコードする核酸配列の複数のコピーを含むことができる。非限定例において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のトランス遺伝子配列及び第２のトランス遺伝子配列を含むことができ、ここで、第１のトランス遺伝子配列及び第２のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸を含む。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、２つ以上のプロモーター配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが２つ以上のプロモーター配列を含むいくつかの態様において、プロモーター配列は同じであっても異なっていてもよい。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、第１の自己切断ペプチド配列、第２のトランス遺伝子配列、少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、少なくとも第３のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、第１の自己切断ペプチド配列、第２のトランス遺伝子配列、少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、少なくとも第３のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて第１のトランス遺伝子配列、続いて第１の自己切断ペプチド配列、続いて第２のトランス遺伝子配列、続いて少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、続いて少なくとも第３のトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、第１の自己切断ペプチド配列、第２のトランス遺伝子配列、少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、少なくとも第３のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、第１のトランス遺伝子配列、第１の自己切断ペプチド配列、第２のトランス遺伝子配列、少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、少なくとも第３のトランス遺伝子配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、続いて第１のインスレーター配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて第１のトランス遺伝子配列、続いて第１の自己切断ペプチド配列、続いて第２のトランス遺伝子配列、続いて少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、続いて少なくとも第３のトランス遺伝子配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のインスレーター配列、続いて第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、第２トランス遺伝子配列は蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ又はｅＧＦＰ）を含むことができ、少なくとも第３トランス遺伝子配列はルシフェラーゼ配列（例えばNanoLuc）を含むことができる。この非限定例では、第１の自己切断ペプチド配列及び少なくとも第２の自己切断ペプチド配列の両方が、Ｔ２Ａペプチド又はＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図１に示す。
前述のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの別の非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列はＬＰ１プロモーターを含むことができ、第１のトランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、第２トランス遺伝子配列は、蛍光タンパク質配列（例えばＧＦＰ又はｅＧＦＰ）を含むことができ、少なくとも第３トランス遺伝子配列は、ルシフェラーゼ配列（例えばNanoLuc）を含むことができる。この非限定例において、第１の自己切断ペプチド配列及び少なくとも第２の自己切断ペプチド配列の両方が、Ｔ２Ａペプチド又はＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図８に示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１０４に示される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
ＡＡＶＩＴＲ配列
いくつかの態様においてＡＡＶＩＴＲ配列は、当技術分野で知られている任意のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。いくつかの態様においてＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１～４、９３～９４、１０５～１０６、及び１２７に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号９３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号９４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１０５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１０６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号１２７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のＡＡＶＩＴＲ配列は、配列番号４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
ｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列
いくつかの態様において、ｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、当技術分野で知られている任意のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができる、いくつかの態様において、ｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号５～６、８６～９０、９５～９６、及び１２５に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号９５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号９６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号１２５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、配列番号９６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
本開示の方法のいくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン内のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、例えば第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列及び／又は第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、眠れる森の美女（Sleeping Beauty）トランスポゾンＩＴＲ、ヘルレイザー（Helraiser）トランスポゾンＩＴＲ、Ｔｏｌ２トランスポゾンＩＴＲ、TcBusterトランスポゾンＩＴＲ、又はこれらの任意の組み合わせ含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、本開示のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、以下の配列の少なくとも１つによって、いずれかの又は両方の末端に隣接することができる：５'－ＣＴＡＡ－３'、５'－ＴＴＡＧ－３'、５'－ＡＴＡＡ－３'、５'－ＴＣＡＡ－３'、５'－ＡＧＴＴ－３'、５'－ＡＴＴＡ－３'、５'－ＧＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＧＡ－３'、５'－ＴＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＡＣ－３'、５'－ＡＣＴＡ－３'、５'－ＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＴＡＧ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＧＴ－３'、５'－ＡＴＣＡ－３'、５'－ＣＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＡ－３'、５'－ＴＣＴＣ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＴ－３'、５'－ＡＡＴＣ－３'、５'－ＡＣＡＡ－３'、５'－ＡＣＡＴ－３'、５'－ＡＣＴＣ－３'、５'－ＡＧＴＧ－３'、５'－ＡＴＡＧ－３'、５'－ＣＡＡＡ－３'、５'－ＣＡＣＡ－３'、５'－ＣＡＴＡ－３'、５'－ＣＣＡＧ－３'、５'－ＣＣＣＡ－３'、５'－ＣＧＴＡ－３'、５'－ＧＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＧ－３'、５'－ＴＣＴＡ－３'、５'－ＴＧＡＧ－３'、５'－ＴＧＴＴ－３'、５'－ＴＴＣＡ－３'、５'－ＴＴＣＴ－３'、及び５'－ＴＴＴＴ－３'。いくつかの態様において、ｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列は、５'－ＴＴＡＡ－３'にフランキングされ得る。従って、本開示の任意のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド、及び／又は任意の肝臓ナノプラスミドは、以下のいずれか１つをさらに含むことができる：ｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列にフランキングする５'－ＣＴＡＡ－３'、５'－ＴＴＡＧ－３'、５'－ＡＴＡＡ－３'、５'－ＴＣＡＡ－３'、５'－ＡＧＴＴ－３'、５'－ＡＴＴＡ－３'、５'－ＧＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＧＡ－３'、５'－ＴＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＡＣ－３'、５'－ＡＣＴＡ－３'、５'－ＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＴＡＧ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＧＴ－３'、５'－ＡＴＣＡ－３'、５'－ＣＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＡ－３'、５'－ＴＣＴＣ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＴ－３'、５'－ＡＡＴＣ－３'、５'－ＡＣＡＡ－３'、５'－ＡＣＡＴ－３'、５'－ＡＣＴＣ－３'、５'－ＡＧＴＧ－３'、５'－ＡＴＡＧ－３'、５'－ＣＡＡＡ－３'、５'－ＣＡＣＡ－３'、５'－ＣＡＴＡ－３'、５'－ＣＣＡＧ－３'、５'－ＣＣＣＡ－３'、５'－ＣＧＴＡ－３'、５'－ＧＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＧ－３'、５'－ＴＣＴＡ－３'、５'－ＴＧＡＧ－３'、５'－ＴＧＴＴ－３'、５'－ＴＴＣＡ－３'、５'－ＴＴＣＴ－３'、５'－ＴＴＴＴ－３'。
インスレーター配列
いくつかの態様において、インスレーター配列は、当技術分野で知られている任意のインスレーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、インスレーター配列は、配列番号７～８、７７～８０、及び９１～９２に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のインスレーター配列は、配列番号７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のインスレーター配列は、配列番号８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のインスレーター配列は、配列番号７７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のインスレーター配列は、配列番号７８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のインスレーター配列は、配列番号７９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のインスレーター配列は、配列番号８０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、第１のインスレーター配列は、配列番号９１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができ、そして第２のインスレーター配列は、配列番号９２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
プロモーター配列
いくつかの態様において、プロモーター配列は、当技術分野で知られている任意のプロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、プロモーター配列は、当技術分野で知られている任意の肝臓特異的プロモーター配列を含むことができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、配列番号９～１６、６９、１０７、１２６、１３２、１４５、及び１４６に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができる。ＨＬＰは、配列番号９、１０７、又は１２６と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＬＰ１プロモーターを含むことができる。ＬＰ１プロモーターは、配列番号１０又は１３２と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）ロングプロモーターの白血球特異的発現を含むことができる。ＬＳＰ１ロングプロモーターは、配列番号１１と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターを含むことができる。ＴＢＧプロモーターは、配列番号１２と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ｗＴＢＧプロモーターを含むことができる。ｗＴＢＧプロモーターは、配列番号１３と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、肝臓コンビナトリアルバンドル（ＨＣＢ）プロモーターを含むことができる。ＨＣＢプロモーターは、配列番号１４と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、２ｘＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターを含むことができる。２ｘＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターは、配列番号１５と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）＋キメライントロンプロモーターの白血球特異的発現を含むことができる。ＬＳＰ１＋キメライントロンプロモーターは、配列番号１６と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含むことができる。ＣＭＶプロモーターは、配列番号６９と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＴＴＲプロモーターを含むことができる。ＴＴＲプロモーターは、配列番号１４５と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、プロモーター配列は、ＴＴＲｍプロモーターを含むことができる。ＴＴＲｍプロモーターは、配列番号１４６と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
トランス遺伝子配列
いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここでＭＵＴ１ポリペプチドは、配列番号１７、１８、１２１、又は１２２と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする酸配列は、配列番号１９、２０、又は１１１～１２０に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、ＯＴＣポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここでＯＴＣポリペプチドは、配列番号２１、８１、１２３、又は１２４と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ＯＴＣポリペプチドをコードする酸配列は、配列番号２２、２３、８２、及び８３に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、ｉＣＡＳ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、ｉＣＡＳ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここでｉＣＡＳ９ポリペプチドは、配列番号２４又は８４と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ｉＣＡＳ９ポリペプチドをコードする酸配列は、配列番号２５又は８５に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、当技術分野で知られている方法に従ってコドン最適化することができる。
いくつかの態様において、ポリペプチド（例えば、ＯＴＣ、ＭＵＴ１など）をコードする核酸配列は、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列であり得る。ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（又はその間の任意のパーセント）以下同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
配列番号１９、２０、２２、２３、８２、及び８３は、本開示のポリヌクレオチド、ベクター及び組成物に含めることができる固有のコドン最適化核酸配列である。
いくつかの態様において、配列番号１９、２０、２２、２３、８２、及び８３に示されるものなどの、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ドナースプライス部位を含まなくてもよい。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、約１、又は約２、又は約３、又は約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８、又は約９、又は約１０以下のドナースプライス部位を含むことができる。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、少なくとも１、又は少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７、又は少なくとも８、又は少なくとも９、又は少なくとも１０少ないドナースプライス部位を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、コドン最適化核酸配列におけるドナースプライス部位の除去は、隠れたスプライシングが防止されるため、インビボでのポリペプチドの発現を思いがけなく及び予想外に増加させることがある。さらに、隠れたスプライシングは、異なる被験体間で変化する可能性があり、これは、ドナースプライス部位を含むポリペプチドの発現レベルが、異なる被験体間で予測できないほど変化する可能性があることを意味する。
いくつかの態様において、配列番号１９、２０、２２、２３、８２、及び８３に示されるような、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列の配列のＧＣ含量とは異なるＧＣ含量を有し得る。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列のＧＣ含有量は、ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布する。理論に拘束されることを望むものではないが、核酸配列全体にわたってＧＣ含有量をより均一に分布させることにより、コドン最適化核酸配列は、転写物の長さにわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を示す。融解温度の均一性は、ポリメラーゼ及び／又はリボソームの失速がより少ない状態で核酸配列の転写及び／又は翻訳が起きるため、ヒト被験体におけるコドン最適化核酸の発現が予想外に増加する。
いくつかの態様において、配列番号１９、２０、２２、２３、８２、及び８３に示されるものなどの、ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ポリペプチドをコードする野生型又はコドン最適化されていない核酸配列と比較して、ヒト被験体において、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、又は少なくとも１０００％増加した発現を示す。
いくつかの態様において、少なくとも１つのトランス遺伝子配列は、同じポリヌクレオチドに存在する少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
ポリＡ配列
いくつかの態様において、ポリＡ配列は、当技術分野で知られている任意のポリＡ配列を含むことができる。ポリＡ配列の非限定例には、特に限定されるものではないが、ＳＶ４０ポリＡ配列が含まれる。いくつかの態様において、ポリＡ配列は、配列番号２６～２７、９７、１０８、１２８、及び１３６に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
自己切断ペプチド配列
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、当技術分野で知られている任意の自己切断ペプチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、当技術分野で知られている２Ａ自己切断ペプチド配列を含むことができる。自己切断ペプチドの非限定例には、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドが含まれる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＴ２Ａペプチドは、配列番号２８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドは、配列番号２９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３０～３２及び１３５と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＥ２Ａペプチドは、配列番号３３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチドは、配列番号３４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＦ２Ａペプチドは、配列番号３５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチドは、配列番号３６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＰ２Ａペプチドは、配列番号３７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、自己切断ペプチド配列は、ＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドは、配列番号３８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
ＤＮＡスペーサー配列
いくつかの態様において、ＤＮＡスペーサー配列は、配列番号１０３、１０９、１２９～１３１、及び１３７に示される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
ＤＮＡスペーサー配列は、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド又はＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼポリヌクレオチド内の任意の位置に位置し得る。
Ｉｎｔ６Ｆ配列
いくつかの態様において、Ｉｎｔ６Ｆ配列は、配列番号９８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、Ｉｎｔ６Ｆ配列は、ポリＡ配列と第２のインスレーター配列との間に位置し得る。
Ｉｎｔ６Ｐ１配列
いくつかの態様において、Ｉｎｔ６Ｐ１配列は、配列番号９９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、ＩｎｔＰ１配列は、ポリＡ配列と第２のインスレーター配列との間に位置し得る。
Ｉｎｔ６Ｒ配列
いくつかの態様において、Ｉｎｔ６Ｒ配列は、配列番号１００と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、Ｉｎｔ６Ｒ配列は、ポリＡ配列と第２のインスレーター配列との間に位置し得る。
ＪｃｔＲ配列
いくつかの態様において、ＪｃｔＲ配列は、配列番号１０１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、ＪｃｔＲ配列は、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列と第２のＡＡＶＩＴＲ配列との間に位置し得る。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１３８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１３９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１４０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１４１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１４２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドは、配列番号１４３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
ＭＣＳ配列
いくつかの態様において、ＭＣＳ配列は、配列番号１０２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。いくつかの態様において、ＭＣＳ配列は、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列と第２のＡＡＶＩＴＲ配列との間に位置し得る。
ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド
本開示は、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、少なくとも１つのプロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのポリＡ配列を含むことができる。いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポゾンポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、続いてポリＡ配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、続いてポリＡ配列、続いて少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むことができる。
前述のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列は、ＳｕｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図４Ａに示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、図４Ａの非限定例に示されるように、ポリＡ配列と第２のＡＡＶＩＴＲ配列との間に、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、続いて少なくとも１つのプロモーター配列、続いて少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、続いてポリＡ配列、続いて第２のＡＡＶＩＴＲ配列、及び続いて少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
前述のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドの非限定例において、少なくとも１つのプロモーター配列は、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含むことができ、そして少なくとも１つのトランスポサーゼ配列は、ＳｕｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドのこの非限定例を図４Ｂに示す。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、図４Ｂの非限定例に示されるように、第２のＡＡＶＩＴＲ配列の後に、少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、配列番号１１０に示される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、配列番号１４４に示される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
トランスポサーゼ配列
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、当技術分野で知られている任意のトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ｐｉｇｇｙＢａｃ様（ＰＢＬ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ＳｕｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。
ＰＢトランスポゾン並びにＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの非限定例は、米国特許第６，２１８，１８２号、米国特許第６，９６２，８１０号。米国特許第８，３９９，６４３号、及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０９９２９６号に詳細に記載されている。
ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、トランスポゾンの末端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、その内容物を染色体部位（ＴＴＡＡ標的配列）内の配列５'－ＴＴＡＡ－３'のＩＴＲ間に挿入する。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンの標的配列は、５'－ＣＴＡＡ－３'、５'－ＴＴＡＧ－３'、５'－ＡＴＡＡ－３'、５'－ＴＣＡＡ－３'、５'－ＡＧＴＴ－３'、５'－ＡＴＴＡ－３'、５'－ＧＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＧＡ－３'、５'－ＴＴＴＡ－３'、５'－ＴＴＡＣ－３'、５'－ＡＣＴＡ－３'、５'－ＡＧＧＧ－３'、５'－ＣＴＡＧ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＧＧＴ－３'、５'－ＡＴＣＡ－３'、５'－ＣＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＡ－３'、５'－ＴＣＴＣ－３'、５'－ＴＧＡＡ－３'、５'－ＡＡＡＴ－３'、５'－ＡＡＴＣ－３'、５'－ＡＣＡＡ－３'、５'－ＡＣＡＴ－３'、５'－ＡＣＴＣ－３'、５'－ＡＧＴＧ－３'、５'－ＡＴＡＧ－３'、５'－ＣＡＡＡ－３'、５'－ＣＡＣＡ－３'、５'－ＣＡＴＡ－３'、５'－ＣＣＡＧ－３'、５'－ＣＣＣＡ－３'、５'－ＣＧＴＡ－３'、５'－ＧＴＣＣ－３'、５'－ＴＡＡＧ－３'、５'－ＴＣＴＡ－３'、５'－ＴＧＡＧ－３'、５'－ＴＧＴＴ－３'、５'－ＴＴＣＡ－３'、５'－ＴＴＣＴ－３'、及び５'－ＴＴＴＴ－３'を含むか、又はからなることができる。ＰＢ又はＰＢＬトランスポゾンシステムには、ＩＴＲ間に含めることができる目的の遺伝子のペイロード制限はない。
１つ以上のＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼの例示的なアミノ酸配列は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、及び米国特許番号８，３９９，６４３号に開示されている。好ましい態様において、ＰＢトランスポサーゼは、配列番号３９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなる。
ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、配列番号３９の配列の３０、１６５、２８２、及び／又は５３８位の２つ以上、３つ以上、又はそれぞれの位置に、アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はからなることができる。トランスポサーゼは、配列番号３９の配列のアミノ酸配列を含むか又はからなるＳＰＢトランスポサーゼであってもよく、ここで、３０位の配列のアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）によるイソロイシン（Ｉ）の置換でもよく、１６５位のアミノ酸置換はセリン（Ｓ）によるグリシン（Ｇ）の置換でもよく、２８２位のアミノ酸置換はバリン（Ｖ）によるメチオニン（Ｍ）の置換でもよく、そして５３８位のアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）によるアスパラギン（Ｎ）の置換でもよい。好ましい態様において、ＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号４０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなる。
トランスポサーゼが、３０、１６５、２８２、及び／又は５３８位に上記変異を含む特定の態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号３９又は配列番号４０の配列の３、４６、８２、１０３、１１９、１２５、１７７、１８０、１８５、１８７、２００、２０７、２０９、２２６、２３５、２４０、２４１、２４３、２５８、２９６、２９８、３１１、３１５、３１９、３２７、３２８、３４０、４２１、４３６、４５６、４７０、４８６、５０３、５５２、５７０、及び５９１位の１つ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含むことができ、これらは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に詳細に記載されている。
好ましい態様において、ＰＢトランスポサーゼは、配列番号４１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなる。
ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、配列４１の配列の２９、１６４、２８１、及び／又は５３７位の２つ以上、３つ以上、又はそれぞれの位置にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか又はからなり得る。トランスポサーゼは、配列番号４１の配列のアミノ酸配列を含むか又はからなるＳＰＢトランスポサーゼでもよく、ここで、２９位のアミノ酸置換はバリン（Ｖ）によるイソロイシン（Ｉ）の置換でもよく、１６４位のアミノ酸置換はセリン（Ｓ）によるグリシン（Ｇ）の置換でもよく、２８１位のアミノ酸置換はバリン（Ｖ）によるメチオニン（Ｍ）の置換でもよく、そして５３７位のアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）によるアスパラギン（Ｎ）の置換でもよい。好ましい態様において、ＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号４２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなる。
トランスポサーゼが２９、１６４、２８１、及び／又は５３７位に上記の変異を含む特定の態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、及びＳＰＢトランスポサーゼは、配列番号４１又は配列番号４２の配列の２、４５、８１、１０２、１１８、１２４、１７６、１７９、１８４、１８６、１９９、２０６、２０８、２２５、２３４、２３９、２４０、２４２、２５７、２９５、２９７、３１０、３１４、３１８、３２６、３２７、３３９、４２０、４３５、４５５、４６９、４８５、５０２、５５１、５６９、及び５９０位の１つ以上の位置にアミノ酸置換をさらに含むことができ、これらは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６にさらに詳細に記載されている。
ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に記載されているように、昆虫、脊椎動物、甲殻類、又は尾索動物から単離又は誘導することができる。好ましい態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、昆虫イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ８７３７５）又はカイコ（Bombyx mori）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＡＤ１１１３５）から単離又は誘導される。
過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、それが由来する天然に存在する変種より高活性なトランスポサーゼである。好ましい態様において、過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼは、カイコ（Bombyx mori）又はゼノプス・トロピカリス（Xenopus tropicalis）から単離又は誘導される。過活性ＰＢ又はＰＢＬトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。過活性アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。
いくつかの態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、組み込み欠損である。組み込み欠損ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるが、切除されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポサーゼよりも低い頻度で組み込むトランスポサーゼである。組込み欠損ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼの例は、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。組込み欠損アミノ酸置換のリストは、米国特許第１０，０４１，０７７号に開示されている。
いくつかの態様において、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼは、核局在化シグナルに融合させることができる。核局在化シグナルに融合されたＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼの例は 、米国特許第６，２１８，１８５号、米国特許第６，９６２，８１０号、米国特許第８，３９９，６４３号、及びＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている。核局在化シグナルは、配列番号４３と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。核局在化シグナルは、配列番号４４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる核酸配列によってコードされることができる。
いくつかの態様において、核局在化シグナルは、ＮＬＳと、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢとの間に位置するＧ４Ｓリンカーを使用して、ＰＢ、ＰＢＬ、又はＳＰＢトランスポサーゼに融合させることができる。Ｇ４Ｓリンカーは、配列番号４５と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。Ｇ４Ｓリンカーは、配列番号４６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる核酸配列によりコードされることができる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ＮＬＳに融合したＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここで、ＮＬＳに融合したＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドは、配列番号４７と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ＮＬＳに融合したＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号４８に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ＮＬＳに融合したＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここで、ＮＬＳに融合したＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドは、配列番号４９と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ＮＬＳに融合されたＳＢＰトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号５０に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、眠れる森の美女トランスポサーゼポリペプチド（例えば、米国特許第９，２２８，１８０号に開示されている）をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、過活性眠れる森の美女（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、眠れる森の美女トランスポサーゼは、配列番号５１及び５２と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか又はからなる。好ましい態様において、過活性眠れる森の美女（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼは、配列番号５３及び５４と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、ヘリトロン（helitron）トランスポサーゼポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている）をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ヘリトロントランスポサーゼポリペプチドは、配列番号５５又は５６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、Ｔｏｌ２トランスポサーゼポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている）をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、Ｔｏｌ２トランスポサーゼポリペプチドは、配列番号５７又は５８と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。
いくつかの態様において、トランスポサーゼ配列は、TcBusterトランスポサーゼポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１９／１７３６３６に開示されている）、又は突然変異体TcBusterトランスポサーゼポリペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６により詳細に記載されている）をコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、TcBusterトランスポサーゼポリペプチドは、配列番号５９又は６０と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。TcBusterトランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸配列又は天然に存在しない核酸配列を含むか又はからなることができる。
肝臓特異的プロモーターを試験するためのナノプラスミド
本開示は、本明細書において「肝臓ナノプラスミド」と呼ばれる、肝臓特異的プロモーターを試験するためのナノプラスミドを含む組成物を提供する。
いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つのｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つのインスレーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つのプロモーター配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つの蛍光タンパク質配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つのルシフェラーゼ配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、少なくとも１つのポリＡ配列を含むことができる。
肝臓ナノプラスミドは、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、蛍光タンパク質配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、ルシフェラーゼ配列、ポリＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができる。いくつかの態様において、肝臓ナノプラスミドは、５'から３'方向に、第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、第１のインスレーター配列、少なくとも１つのプロモーター配列、蛍光タンパク質配列、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、ルシフェラーゼ配列、ｐｏｌｙＡ配列、第２のインスレーター配列、及び第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列を含むことができる。
本開示のいくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、蛍光タンパク質配列を含むことができる。
いくつかの態様において、蛍光タンパク質配列は、ｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、蛍光タンパク質配列は、ｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここでｅＧＦＰポリペプチドは、配列番号６１又は６２と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６３、６４、又は１３３に示される配列のいずれかと、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
本開示のいくつかの態様において、トランス遺伝子配列は、ルシフェラーゼ配列を含むことができる。
いくつかの態様において、ルシフェラーゼ配列は、ｆＬｕｃ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ルシフェラーゼ配列は、ｆＬｕｃ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができ、ここでｆＬｕｃ２ポリペプチドは、配列番号６５又は６６と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一であるアミノ酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなる。いくつかの態様において、ｅＧＦＰポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６７又は６８に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
いくつかの態様において、ルシフェラーゼ配列は、ナノルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことができる。いくつかの態様において、ｎＬｕｃポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号１３４に示される配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又はその間の任意のパーセント）同一である核酸配列を含むか、から本質的になるか、又はからなることができる。
本開示のベクター
本開示は、ベクターを含む組成物を提供し、ここでベクターは、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む。少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むベクターは、本明細書では「ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター」と呼ばれる。
本開示は、ベクターを含む組成物を提供し、ここでベクターは、少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む。少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むベクターは、本明細書では「ＡＡＶトランスポサーゼベクター」と呼ばれる。
本開示のベクターは、ウイルスベクター又は組換えベクターであり得る。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はこれらの任意の組み合わせから、単離又は誘導された配列を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から単離又は誘導された配列を含むことができる。ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を含むことができる。
例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、すべての血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）、並びにある血清型のゲノム及び別の血清型のキャプシドを含むＡＡＶハイブリッドが含まれる（例えば、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８）。例示的なアデノ随伴ウイルス及び組換えアデノ随伴ウイルスには、特に限定されるものではないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（ＡＡＶ－ＫＰ１とも呼ばれる；Kerun et al. JCI Insight, 2019; 4(22):e131610に詳細に記載されている）及びＡＡＶ－ＮＰ５９（Paulk et al. Molecular Therapy, 2018; 26(1): 289-303で詳細に記載されている）が含まれる。
本開示は、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子を含む組成物を提供する。本開示は、少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子を含む組成物を提供する。本開示は、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子と、少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子とを含む組成物を提供する。
本開示は、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子を含む組成物を提供する。本開示は、少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子を含む組成物を提供する。本開示は、少なくとも１つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子と、少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む複数のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子とを含む組成物を提供する。
本開示のウイルスベクター及びウイルス粒子は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して生成することができる。
いくつかの態様において、本開示のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子は、ＫＰ－１キャプシドベクターを使用して生成することができ、ここでＫＰ－１キャプシドベクターは、配列番号７０及び配列番号７１の核酸配列の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、本開示のＡＡＶ－ＫＰ－１粒子は、ＡＡＶベクターパッケージングプラスミドを使用して産生することができ、ここでＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、配列番号７５及び配列番号７６の核酸配列の少なくとも１つを含む。
いくつかの態様において、本開示のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子は、ＮＰ－５９キャプシドベクターを使用して生成することができ、ここでＮＰ－５９キャプシドベクターは、配列番号７２、配列番号７２、配列番号７３、及び配列番号７４の核酸配列の少なくとも１つを含む。いくつかの態様において、本開示のＡＡＶ－ＮＰ５９粒子は、ＡＡＶベクターパッケージングプラスミドを使用して生成することができ、ここでＡＡＶベクターパッケージングプラスミドは、配列番号７５及び配列番号７６の核酸配列の少なくとも１つを含む。
本明細書に開示される細胞送達組成物（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター）は、治療用タンパク質又は治療薬をコードする核酸を含むことができる。治療用タンパク質の例には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／１７３６３６及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９８１６に開示されているものが含まれる。治療用タンパク質にはまた、特に限定されるものではないが、トランス遺伝子配列（例えば、ＯＴＣ、ＭＵＴ１など）の一部として本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかが含まれ得る。
製剤、用量、及び投与様式
本開示は、本明細書に記載の組成物の製剤、用量、及び投与方法を提供する。
開示された組成物及び医薬組成物は、特に限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、補助剤などの任意の適切な補助物質の少なくとも１つをさらに含むことができる。医薬的に許容し得る補助剤が好ましい。そのような無菌溶液の非限定例、及びその調製方法は、例えば、特に限定されるものではないが、Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990 及び“Physician's Desk Reference”, 52nd ed., Medical Economics (Montvale, N.J.) 1998のように当技術分野でよく知られている。
当技術分野でよく知られているか、又は本明細書に記載されているような、タンパク質足場、断片、又は変種組成物の投与様式、可溶性、及び／又は安定性に適した医薬的に許容し得る担体を、日常的に選択することができる。
使用に適した医薬賦形剤及び添加剤の非限定例には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、及び炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、及びオリゴ糖を含む糖；誘導体化された糖、例えばアルジトール、アルドン酸、エステル化糖など；及び多糖類又は糖ポリマー）があり、これらは単独又は組み合わせで存在することができ、単独で、又は組み合わせで、重量又は体積で１～９９．９９％を構成する。タンパク質賦形剤の非限定例には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能力でも機能する代表的なアミノ酸／タンパク質成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。１つの好ましいアミノ酸はグリシンである。
使用に適した炭水化物賦形剤の非限定例には、単糖類、例えばフルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えばラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど；多糖類、例えばラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど；及びアルジトール、例えばマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなどが含まれる。好ましくは、炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、及び／又はラフィノースである。
組成物はまた、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含むことができ、通常、緩衝液は有機酸又は有機塩基から調製された塩である。代表的な緩衝液には、有機酸塩、例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩；トリス、トロメタミン塩酸塩、又はリン酸緩衝液が含まれる。好ましい緩衝液は、クエン酸塩などの有機酸塩である。
さらに、開示された組成物は、高分子賦形剤／添加剤、例えばポリビニルピロリドン、フィコール（高分子糖）、デキストレート（例えば２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗菌剤、甘味剤、酸化防止剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「ツイーン２０」や「ツイーン８０」などのポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）、及びキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を含むことができる。
本明細書に開示された組成物又は医薬組成物の治療有効量を投与するために、多くの既知の及び開発された方式を使用することができる。投与様式の非限定例としては、ボーラス、口腔内、注入、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、小脳内、脳室内、結腸内、頸部内、胃内、肝内、病巣内、筋肉内、心筋内、鼻腔内、眼内、骨内（intraosseous）、骨内（intraosteal）、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、子宮内、腫瘍内、静脈内、膀胱内、経口、非経口、直腸、舌下、皮下、経皮、又は膣内手段が挙げられる。
本開示の組成物は、非経口（皮下、筋肉内、又は静脈内）又は任意の他の投与のために、特に溶液又は懸濁液の形態で使用するために；特に限定されるものではないが、クリーム及び坐剤などの半固体形態で膣又は直腸投与で使用するために；特に限定されるものではないが、特に錠剤又はカプセルの形態の、口腔又は舌下投与で使用するために；又は、特に限定されるものではないが、粉末、点鼻薬、エアロゾル、又は特定の薬剤の形態で鼻腔内で使用するために；又は、経皮的に、例えば特に限定されるものではないが、ゲル、軟膏、ローション、懸濁液、又は経皮パッチシステムで使用するために調製することができ、経皮パッチシステムは、皮膚構造を改変するか又は経皮パッチ中の薬物濃度を増加させるためのジメチルスルホキシドなどの化学増強剤を伴い（Junginger, et al. In “Drug Permeation Enhancement;” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994）、又はタンパク質及びペプチドを含む製剤の皮膚への適用（ＷＯ９８／５３８４７）を可能にする酸化剤を伴い、又は一過性輸送経路を作成するためのエレクトロポレーション若しくは皮膚を通過する荷電薬物の移動性を高めるイオントフォレシスなどの電場の適用を伴い、又はソノフォレシスなどの超音波の適用を伴う（米国特許第４，３０９，９８９号及び第４，７６７，４０２号）（上記の刊行物及び特許は参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
非経口投与のために、本明細書に開示される任意の組成物は、溶液、懸濁液、乳液、粒子、粉末、又は凍結乾燥粉末として、医薬的に許容し得る非経口ビヒクルと一緒に製剤化するか、又は別々に提供することができる。非経口投与用の製剤は、一般的な賦形剤として、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性又は油性の懸濁剤は、適切な乳化剤又は加湿剤及び懸濁化剤を使用して、既知の方法に従って調製することができる。注射用の薬剤は、非毒性で非経口投与可能な希釈剤、例えば水溶液、無菌の注射溶液、又は溶媒中の懸濁液であり得る。使用可能なビヒクル又は溶媒として、水、リンゲル液、等張食塩水などが許容される。通常の溶媒又は懸濁溶媒として、無菌の不揮発性油を使用することができる。これらの目的のために、天然又は合成又は半合成脂肪油又は脂肪酸を含む、任意の種類の不揮発性油及び脂肪酸；天然又は合成又は半合成のモノグリセリド又はジグリセリド又はトリグリセリドを使用することができる。非経口投与は、当技術分野で知られており、特に限定されるものではないが、従来の注射手段、米国特許第５，８５１，１９８号に記載されているようなガス加圧無針注射装置、及び米国特許第第５，８３９，４４６号に記載されているようなレーザー穿孔装置を使用することができる。
経口投与のための製剤は、腸壁の透過性を人為的に上昇させるために、補助剤（例えば、レゾルシノール及び非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ－ヘキサデシルポリエチレンエーテル）の同時投与に依存、並びに酵素分解を阻害するために、酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＦ）、及びトラジロール）の同時投与に依存する。経口、口腔、粘膜、鼻、肺、膣経膜、又は直腸投与を目的とした、タンパク質及びタンパク質足場を含む親水性薬剤、並びに少なくとも２つの界面活性剤の組み合わせの送達のための製剤は、米国特許第６，３０９，６６３号に記載されている。経口投与のための固体剤形の活性成分化合物は、少なくとも１種の添加剤（スクロース、ラクトース、セルロース、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、マルチトール、デキストラン、デンプン、寒天、アルギン酸塩、キチン、キトサン、ペクチン、トラガカントガム、アラビアゴム、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、合成又は半合成ポリマー、グリセリドを含む）と混合することができる。これらの剤形はまた、他のタイプの添加剤、例えば、不活性希釈剤、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、パラベン、保存剤、例えばソルビン酸、アスコルビン酸、α－トコフェロール、酸化防止剤、例えばシステイン、崩壊剤、結合剤、増粘剤、緩衝剤、甘味剤、香味剤、芳香剤などを含むことができる。
錠剤及び丸剤は、さらに加工して腸溶性コーティング調製物にすることができる。経口投与のための調製物には、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、懸濁剤、及び液剤があり、医療用に使用することができる。これらの調製物は、前記分野で通常使用される不活性な希釈剤、例えば水を含むことができる。リポソームもまた、インスリン及びヘパリンの薬物送達システムとして記載されている（米国特許第４，２３９，７５４号）。最近では、混合アミノ酸の人工ポリマー（プロテイノイド）のマイクロスフェアが医薬品の送達に使用されている（米国特許第４，９２５，６７３号）。さらに、米国特許第５，８７９，６８１号及び米国特許第５，８７１，７５３号に記載されており、生物活性剤を経口送達するために使用される担体化合物も、当技術分野で知られている。
肺投与の場合、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物は、好ましくは、肺の下気道又は副鼻腔に到達するのに有効な粒子サイズで送達される。これらの組成物又は医薬組成物は、吸入による治療薬の投与について当技術分野で知られている様々な吸入又は鼻用デバイスのいずれかによって送達することができる。患者の副鼻腔又は肺胞にエアロゾル化製剤を沈着させることができるこれらのデバイスには、定量吸入器、ネブライザー（例えば、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー）、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。このようなデバイスはすべて、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物をエアロゾルで分配するための投与に適した製剤を使用することができる。そのようなエアロゾルは、溶液（水性及び非水性の両方）又は固体粒子のいずれかで構成され得る。さらに、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物を含むスプレーは、少なくとも１つのタンパク質足場の懸濁液又は溶液をノズルを通して圧力下で押し出すことによって生成することができる。定量吸入器（ＭＤＩ）では、噴射剤、本明細書に記載の組成物又は医薬組成物、及び任意の賦形剤又は他の添加剤が、液化圧縮ガスを含む混合物としてキャニスターに含まれる。計量弁の作動は混合物を、好ましくは約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ～約５μｍ、最も好ましくは約２μｍ～約３μｍのサイズ範囲の粒子を含むエアロゾルとして放出する。肺投与、製剤、及び関連デバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
粘膜表面を介する吸収のために、組成物は、複数のサブミクロン粒子、粘膜接着性高分子、生物活性ペプチド、及び乳剤粒子の粘膜接着を達成することによって粘膜表面を介する吸収を促進する水性連続相を含む乳剤を含む（米国特許米国特許第５，５１４，６７０号）。本開示の乳剤の塗布に適した粘膜表面には、角膜、結膜、口腔、舌下、鼻、膣、肺、胃、腸、及び直腸の投与経路が含まれ得る。膣又は直腸投与用の製剤、例えば座薬は、賦形剤として、例えばポリアルキレングリコール、ワセリン、カカオ脂などを含むことができる。鼻腔内投与のための製剤は固体でもよく、賦形剤として例えばラクトースを含むか、又は点鼻薬の水性又は油性溶液であり得る。口腔内投与の場合、賦形剤には、糖、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、アルファ化デンプンなどが含まれる（米国特許第５，８４９，６９５号）。粘膜投与及び製剤のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
経皮投与のために、本明細書に開示される組成物又は医薬組成物は、リポソーム又はポリマーナノ粒子、微粒子、マイクロカプセル、又はミクロスフェア（特に明記しない限り、まとめて微粒子と呼ばれる）などの送達デバイスに封入される。合成ポリマー、例えばポリヒドロキシ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びこれらのコポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、及びポリホスファゼン、及び天然ポリマー、例えばコラーゲン、ポリアミノ酸、アルブミン、及び他のタンパク質、アルギン酸塩、及び他の多糖類、並びにこれらの組み合わせでできた微粒子を含む、多くの適切なデバイスが知られている（米国特許第５，８１４，５９９号）。経皮投与、製剤、及び適切なデバイスのより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
開示された化合物を被験体に、長期間にわたって、例えば単回投与から１週間～１年間送達することが望ましい場合がある。様々な徐放、デポー、又はインプラント剤形を利用することができる。例えば、剤形は、体液への溶解度が低い化合物の医薬的に許容し得る非毒性の塩を含むことができる：例えば、（ａ）多塩基酸、例えばリン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノ又はジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの酸付加塩、（ｂ）多価金属カチオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとの、又は例えばＮ，Ｎ'－ジベンジルエチレンジアミン又はエチレンジアミンから形成される有機カチオンとの塩、又は（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ、例えば、タンニン酸亜鉛塩。さらに、開示された化合物、又は好ましくは、今述べたもののような比較的不溶性の塩は、注射に適したゲル、例えばゴマ油を含むモノステアリン酸アルミニウムゲルに配合することができる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、タンニン酸亜鉛塩、パモ酸塩などである。注射用の別のタイプの徐放性デポー製剤は、例えば米国特許米国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコール酸ポリマーなどの遅分解性、非毒性、非抗原性ポリマー中に封入するために分散された化合物又は塩を含有するであろう。化合物、又は好ましくは、上記のものなどの比較的不溶性の塩も、特に動物で使用するために、コレステロールマトリックスシラスティックペレットに配合することもできる。追加の徐放性、デポ、又はインプラント製剤、例えばガス又は液体リポソームが文献で知られている（米国特許第５，７７０，２２２号、及び“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978）。
適切な投与量は、当技術分野で周知されている。例えば、Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.を参照されたい。好ましい用量には、単回若しくは複数回投与あたり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値、若しくは一部を達成するために、任意選択的に、約０．１～９９及び／又は１００～５００ｍｇ／ｋｇ／投与、又はその任意の範囲、値、若しくは一部が含まれる。本明細書に開示される組成物又は医薬組成物の好ましい用量範囲は、被験体の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ、最大約３ｍｇ、約６、又は約１２ｍｇである。
あるいは、投与される用量は、既知の要因、例えば特定の薬剤の薬力学的特性、及びその投与様式及び経路、受容者の年齢、健康状態、及び体重。症状の性質と程度、併用療法の種類、治療の頻度、及び望ましい効果などに応じて変化し得る。通常、有効成分の投与量は、体重１キログラムあたり約０．１～１００ミリグラムであり得る。所望の結果を得るためには、１回の投与又は徐放形態で、通常０．１～５０ｍｇ、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇが有効である。
非限定例として、ヒト又は動物の治療には、本明細書に開示される組成物又は医薬組成物の単回又は定期的な投与量として、１～４０日の少なくとも１日に、又は代替的若しくは追加的に１～５２週の少なくとも１週に、又は代替的若しくは追加的に１～２０年の少なくとも１年に、又はこれらの任意の組み合わせで、単回、注入、又は反復投与を使用して、１日あたり約０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、又はその任意の範囲、値、若しくは一部が提供され得る。
内部投与に適した剤形は、一般に、単位又は容器当たり約０．００１ｍｇ～約５００ｍｇの有効成分を含有する。これらの医薬組成物において、有効成分は通常、組成物の総重量に基づいて約０．５～９９．９９９重量％の量で存在する。
有効量は、本明細書に記載されているか、又は関連分野で知られている既知の方法を使用して行われ決定される、単回若しくは複数回投与あたり約０．１～５０００μｇ／ｍｌの血清濃度、又はその任意の範囲、値、若しくは一部を達成するために、単回投与（例えばボーラス）、複数回、又は連続投与あたり約０．００１～約５００ｍｇ／ｋｇの量を含むことができる。
それを必要とする被験体に投与される組成物が、本明細書に開示される改変細胞である態様において、細胞は、約１×１０３～１×１０１５細胞、約１ｘ１０４～１ｘ１０１２細胞、約１ｘ１０５～１ｘ１０１０細胞、約１ｘ１０６～１ｘ１０９細胞、約１ｘ１０６～１ｘ１０８細胞、約１ｘ１０６～１ｘ１０７細胞、又は約１ｘ１０６～２５ｘ１０６細胞で投与することができる。１つの態様において、細胞は、約５×１０６～２５×１０６細胞で投与される。
開示された組成物及び医薬組成物の医薬的に許容し得る賦形剤、製剤、投与量、及び投与方法のより詳細な説明は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１９／０４９８１６に開示されている。
本開示の組成物の使用方法
本開示は、開示された組成物又は医薬組成物を使用して、例えば、細胞、組織、器官、動物、又は被験体に、治療有効量の組成物又は医薬組成物を投与するか又は接触させることにより、当技術分野で知られているか又は本明細書に記載のように、細胞、組織、器官、動物、又は被験体における疾患又は障害を治療するための、開示された組成物又は医薬組成物の使用を提供する。１つの態様において被験体は哺乳動物である。好ましくは被験体はヒトである。「被験体」及び「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本開示は、本開示の少なくとも１つの組成物の少なくとも１つの治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害（ＭＬＤ）を治療するための方法を提供する。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害の治療に使用するための本開示の少なくとも１つの組成物を提供し、ここで、前記少なくとも１つの組成物は、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療するための医薬を製造するための、本開示の少なくとも１つの組成物の使用を提供し、ここで前記少なくとも１つの組成物は、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
前述の方法及び使用のいくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物は、本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを含むことができる。
従って本開示は、本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの少なくとも１つの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療するための方法を提供する。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害の治療に使用するための本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害の治療用の医薬を製造するための、本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの使用を提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
前述の方法及び使用のいくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物は、本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターを含むことができる。
従って本開示は、本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターの少なくとも１つの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療するための方法を提供する。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害の治療に使用するための本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターを提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療用の医薬を製造するための、本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターの使用を提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療する方法を提供し、この方法は、被験体に、ａ）トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物の少なくとも１つの治療有効量と、ｂ）少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物の少なくとも１つの治療有効量とを、投与することを含み、ここで、前記トランスポゾンは、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
前述の方法のいくつかの態様において、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物は、本明細書に記載の任意のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターであり得る。
前述の方法のいくつかの態様において、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物は、本開示の任意のＡＡＶトランスポサーゼベクターであり得る。
従って本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害を治療する方法を提供し、この方法は、被験体に、ａ）本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの少なくとも１つの治療有効量と、ｂ）本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターの少なくとも１つの治療有効量とを、投与することを含む。
従って本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害の治療に使用するための、本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターと本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターとの組み合わせを提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものであり、及び前記少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
従って本開示は、被験体における少なくとも１つの代謝性疾患の治療のための医薬の製造における、本開示の少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターと本開示の少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターとの組み合わせの使用を提供し、ここで、前記少なくとも１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものであり、及び前記少なくとも１つのＡＡＶトランスポサーゼベクターは、少なくとも１つの治療有効量で被験体に投与するためのものである。
代謝性肝障害には、特に限定されるものではないが、尿素サイクル障害、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠損症（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ３）、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。いくつかの態様において、代謝性肝障害は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症である。
前述の方法のいくつかの態様において、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物とは、同時に投与することができ、ここで前記トランスポゾンは少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物とは、連続的に投与することができ、ここで前記トランスポゾンは少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、トランスポゾンを含む核酸分子を含む組成物と、少なくとも１つのトランスポサーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物とは、時間的に近接して投与することができ、ここで前記トランスポゾンは少なくとも１つの治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書で使用される用語「時間的近接」は、ある治療組成物（例えば、トランスポゾンを含む組成物）の投与が、別の治療組成物（例えば、トランスポサーゼを含む組成物）の投与前又は投与後の時間内に起きることを指し、従って、１つの治療薬の治療効果が他の治療薬の治療効果と重複する。いくつかの実施態様において、１つの治療薬の治療効果は他の治療薬の治療効果と完全に重複する。いくつかの実施態様において、「時間的近接」は、ある治療薬の投与が別の治療薬の投与前又は投与後の時間内に起きることを意味し、従って、ある治療薬と他の治療薬との間に相乗効果がある。「時間的近接」は、特に限定されるものではないが、治療薬が投与される被験体の年齢、性別、体重、遺伝的背景、病状、病歴、及び治療歴；治療又は改善すべき疾患又は状態；達成すべき治療結果；治療薬の投与量、投与頻度、及び投与期間；治療薬の薬物動態及び薬力学；及び治療薬が投与される経路を含む様々な要因によって異なり得る。いくつかの実施態様において、「時間的近接」とは、１５分以内、３０分以内、１時間以内、２時間以内、４時間以内、６時間以内、８時間以内、１２時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、２日以内、３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、４週間以内、６週間以内、８週間以内を意味する。いくつかの実施態様において、ある治療薬の複数回投与は、別の治療薬の単回投与に時間的に近接して行うことができる。いくつかの実施態様において、時間的近接は、治療サイクル中又は投薬計画で変化し得る。
本開示の治療方法のいくつかの態様において、被験体への本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、被験体の少なくとも１つの器官及び／又は組織における外因性タンパク質（例えば、治療タンパク質、トランスポサーゼなど）の発現をもたらし得る。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官中の細胞の、少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％において、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官中の細胞の特定の１つ又は複数のサブセットの、少なくとも約１０％、又は少なくとも約１５％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約２５％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約３５％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約４５％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約６５％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％において、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官において、少なくとも約１日間、又は少なくとも約２日間、又は少なくとも約３日間、又は少なくとも約４日間、又は少なくとも約５日間、又は少なくとも約６日間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約８日間、又は少なくとも約９日間、又は少なくとも約１０日間の、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官中の細胞の特定の１つ又は複数のサブセットにおいて、少なくとも約１日間、又は少なくとも約２日間、又は少なくとも約３日間、又は少なくとも約４日間、又は少なくとも約５日間、又は少なくとも約６日間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約８日間、又は少なくとも約９日間、又は少なくとも約１０日間の、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官内において、約１日以下、又は約２日以下、又は約３日以下、又は約４日以下、又は約５日以下、又は約６日以下、又は約７日以下、又は約８日以下、又は約９日以下、又は約１０日以下の、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本開示の少なくとも１つの組成物及び／又はベクターの投与は、組織及び／又は器官内中の細胞の特定の１つ又は複数のサブセットにおいて、約１日以下、又は約２日以下、又は約３日以下、又は約４日以下、又は約５日以下、又は約６日以下、又は約７日以下、又は約８日以下、又は約９日以下、又は約１０日以下の、外因性タンパク質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、組織及び／又は器官は肝臓であり得る。いくつかの態様において、細胞の特定１つ又は複数のサブセットは、特に限定されるものではないが、肝細胞、肝星状細胞、クッパー細胞、肝類洞内皮細胞、又はこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本開示の任意の方法は、本明細書に開示される任意の組成物又は医薬組成物の有効量を、そのような調節、処置、又は治療を必要とする細胞、組織、器官、動物、又は被験体に投与することを含むことができる。そのような方法は、任意選択的に、そのような疾患又は障害を治療するための同時投与又は併用療法をさらに含むことができ、ここで、本明細書に開示される任意の組成物又は医薬組成物の投与は、尿素サイクル障害の少なくとも１つの追加の治療を同時に及び／又は後に施すことをさらに含む。
尿素サイクル障害のさらなる治療には、特に限定されるものではないが、透析、血液濾過、カロリー補給、ホルモン抑制、グルコース点滴、インスリン点滴、過剰窒素の薬理学的除去、デキストロースの投与、液体の投与、Intralipid（登録商標）の投与、アンモニアスカベンジャーの投与、アルギニンの投与、フェニル酢酸ナトリウムの投与、安息香酸ナトリウムの投与、Ammonulの投与、フェニル酪酸の投与、シトルリン補給、アルギニン補給、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
本開示の例示的な実施態様
実施態様１。５'から３'方向に以下を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）第１のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、
ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）第１のインスレーター配列、
ｄ）少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）ポリＡ配列、
ｇ）第２のインスレーター配列、
ｈ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び
ｉ）第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様２。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施態様１のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３。第１及び／又は第２のＡＡＶＩＴＲ配列が、配列番号１～４、９３～９４、１０５～１０６、及び１２７のいずれか１つの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号３の核酸配列を含み、第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号４の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列及び／又は第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が、配列番号５～６、８６～９０、９５～９６、及び１２５のいずれか１つの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号５の核酸配列を含み、第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲが配列番号６の核酸を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７。第１のインスレーター配列及び／又は第２のインスレーター配列が、配列番号７～８、７７～８０、及び９１～９２のいずれか１つの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様８。第１のインスレーター配列が配列番号７の核酸配列を含み、第２のインスレーター配列が配列番号８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様９。少なくとも１つのプロモーター配列が肝臓特異的プロモーターである、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１０。肝臓特異的プロモーターが、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）、ＬＰ１プロモーター、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）ロングプロモーターの白血球特異的発現、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ｗＴＢＧプロモーター、肝コンビナトリアルバンドル（ＨＣＢ）プロモーター、２ｘＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、又はｐｐ５２（ＬＳＰ１）とキメライントロンプロモーターの白血球特異的発現である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１１。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９～１６、６９、１０７、１２６、及び１３２のいずれかの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１２。少なくとも１つのトランス遺伝子配列がメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１３。ＭＵＴ１ポリペプチドが配列番号１７、１８、１２１、又は１２２のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１４。ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号１９、２０、又は１１１～１２０の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１５。少なくとも１つのトランス遺伝子配列がオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１６。ＯＴＣポリペプチドが配列番号２１又は８１のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１７。ＯＴＣポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号２２、２３、８２、及び８３のいずれかの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１８。少なくとも１つのトランス遺伝子配列がｉＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１９。ｉＣａｓ９ポリペプチドが配列番号２４又は８４のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２０。ｉＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号２５又は８５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２１。少なくとも１つのトランス遺伝子配列が少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結されている、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２２。少なくとも１つのトランス遺伝子配列の発現が少なくとも１つのプロモーター配列によって制御される、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２３。ポリＡ配列が配列番号２６～２７、９７、１０８、１２８、及び１３６のいずれか１つの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２４。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが少なくとも第２のトランス遺伝子配列をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２５。少なくとも第２のトランス遺伝子配列がｉＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２６。ｉＣａｓ９ポリペプチドが配列番号２４又は８４のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２７。ｉＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号２５又は８５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２８。少なくとも第２のトランス遺伝子配列がメチルマロニル－ＣｏＡムターゼ（ＭＵＴ１）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様２９。ＭＵＴ１ポリペプチドが配列番号１７、１８、１２１、又は１２２のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３０。ＭＵＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号１９、２０、又は１１１～１２０の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３１。少なくとも第２のトランス遺伝子配列がオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３２。ＯＴＣポリペプチドが配列番号２１又は８１のアミノ酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３３。ＯＴＣポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号２２、２３、８２、及び８３のいずれかの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３４。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが少なくとも第２のプロモーター配列をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３５。少なくとも第２のプロモーター配列が少なくとも１つのトランス遺伝子配列と少なくとも第２のトランス遺伝子配列との間に位置する、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３６。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが少なくとも１つの自己切断ペプチド配列をさらに含み、少なくとも１つの自己切断ペプチド配列が、Ｔ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｅ２Ａペプチド、Ｆ２Ａペプチド、ＧＳＧ－Ｆ２Ａペプチド、Ｐ２Ａペプチド、又はＧＳＧ－Ｐ２Ａペプチドをコードする核酸配列である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３７。少なくとも１つの自己切断ペプチド配列が少なくとも１つのトランス遺伝子配列と少なくとも第２のトランス遺伝子配列との間に位置する、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３８。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが少なくとも２つのトランス遺伝子配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様３９。少なくとも２つのトランス遺伝子配列が同じ配列である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４０。少なくとも２つのトランス遺伝子配列が異なる配列である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４１。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４２。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号１０３、１０９、１２９～１３１、及び１３７のいずれか１つの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４３。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが少なくとも２つのプロモーター配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４４。少なくとも２つのプロモーター配列が同じ配列である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４５。少なくとも２つのプロモーター配列が異なる配列である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ａ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）第１のインスレーター配列、
ｄ）少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）ポリＡ配列、
ｇ）第２のインスレーター配列、
ｈ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様４６Ｂ。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号３の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｃ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｄ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｅ。第１のインスレーター配列が配列番号７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｆ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｇ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１２６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｈ。少なくとも１つのトランス遺伝子配列が配列番号２２の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｉ。ポリＡ配列が配列番号９７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｊ。第２のインスレーター配列が配列番号８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｋ。第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｌ。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号１２９の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｍ。第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号４の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４６Ｎ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号９又は配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）配列番号１２９の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様４７。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９の核酸配列を含む、実施態様４６Ａ～４６Ｎのいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４８。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１２６の核酸配列を含む、実施態様４６Ａ～４６Ｎのいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様４９。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様４６Ａ～４６Ｎのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５０。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様４６Ａ～４６Ｎのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５１。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが配列番号１３８の核酸配列を含む、実施態様４６Ａ～５０のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ａ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）第１のインスレーター配列、
ｄ）少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）ポリＡ配列、
ｇ）第２のインスレーター配列、
ｈ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様５２Ｂ。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号３の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｃ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｄ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｅ。第１のインスレーター配列が配列番号７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｆ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１０の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｇ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１３２の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｈ。少なくとも１つのトランス遺伝子配列が配列番号２２の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｉ。ポリＡ配列が配列番号９７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｊ。第２のインスレーター配列が配列番号８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｋ。第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｌ。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号１３０の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｍ。第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号４の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５２Ｎ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号１０又は配列番号１３２の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）配列番号１３０の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様５３。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１０の核酸配列を含む、実施態様５２Ａ～５２Ｎのいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５４。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１３２の核酸配列を含む、実施態様５２Ａ～５２Ｎのいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５５。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様５２Ａ～５２Ｎのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５６。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様５２Ａ～５２Ｎのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５７。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが配列番号１３９の核酸配列を含む、実施態様５２Ａ～５６のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ａ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）第１のインスレーター配列、
ｄ）少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）ポリＡ配列、
ｇ）第２のインスレーター配列、
ｈ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様５８Ｂ。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号３の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｃ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｄ。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｅ。第１のインスレーター配列が配列番号７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｆ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１３の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｇ。少なくとも１つのトランス遺伝子配列が配列番号２２の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｈ。ポリＡ配列が配列番号９７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｉ。第２のインスレーター配列が配列番号８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｊ。第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｋ。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号１３１の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｌ。第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号４の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様５８Ｍ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号１３の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｉ）配列番号１３１の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様５９。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様５８Ａ～５８Ｍのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６０。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様５８Ａ～５８Ｍのいずれか１つのＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６１。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが配列番号１４０の核酸配列を含む、実施態様５８Ａ～６０のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６２。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号９又は配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む第１のトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号３１の核酸配列を含む第１の自己切断ペプチド配列、
ｇ）配列番号１３３の核酸配列を含む第２のトランス遺伝子配列、
ｈ）配列番号３２の核酸配列を含む少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、
ｉ）配列番号１３４の核酸配列を含む少なくとも第３のトランス遺伝子配列、
ｊ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｋ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｌ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び
ｍ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様６３。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様６２のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６４。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様６２のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６５。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９の核酸配列を含む、実施態様６２のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６６。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１２６の核酸配列を含む、実施態様６２のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６７。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが配列番号１４１の核酸配列を含む、実施態様６２～６６のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様６８。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号１０又は配列番号１３２の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む第１のトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号３１の核酸配列を含む第１の自己切断ペプチド配列、
ｇ）配列番号１３３の核酸配列を含む第２のトランス遺伝子配列、
ｈ）配列番号３２の核酸配列を含む少なくとも第２の自己切断ペプチド配列、
ｉ）配列番号１３４の核酸配列を含む少なくとも第３のトランス遺伝子配列、
ｊ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｋ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｌ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び
ｍ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様６９。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様６８のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７０。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様６８のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７１。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１０の核酸配列を含む、実施態様６８のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７２。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１３２の核酸配列を含む、実施態様６８のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７３。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが、配列番号１４２の核酸配列を含む、実施態様６８～７２のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７４。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９５又は配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
ｄ）配列番号１３の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む第１のトランス遺伝子配列、
ｆ）配列番号１３５の核酸配列を含む少なくとも１つの自己切断ペプチド配列、
ｇ）配列番号１３４の核酸配列を含む少なくとも第２のトランス遺伝子配列、
ｈ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｉ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
ｊ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、及び
ｋ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様７５。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号９５の核酸配列を含む、実施態様７４のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７６。第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列が配列番号１２５の核酸配列を含む、実施態様７４のＡＡＧｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７７。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが、配列番号１４３の核酸配列を含む、実施態様７４～７６のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様７８。前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むベクター。
実施態様７９。ベクターがウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様８０。ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様８１。ＡＡＶウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様８２。ＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１又はＡＡＶ－ＮＰ５９ウイルスベクターであり、好ましくはＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様８３。実施態様７８～８２のいずれかのベクターを含む組成物。
実施態様８４。５'から３'方向に、第１のＡＡＶＩＴＲ配列、少なくとも１つのプロモーター配列、少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、ポリＡ配列、及び第２のＡＡＶＩＴＲ配列を含むＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様８５。ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施態様８４のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様８６。第１及び／又は第２のＡＡＶＩＴＲ配列が、配列番号１～４、９３～９４、１０５～１０６、及び１２７のいずれかの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様８７。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号１の核酸配列を含み、第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号２の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様８８。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号１０５の核酸配列を含み、第２のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号１０６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様８９。少なくとも１つのプロモーター配列が肝臓特異的プロモーターである、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９０。肝臓特異的プロモーターが、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）、ＬＰ１プロモーター、ｐｐ５２（ＬＳＰ１）ロングプロモーターの白血球特異的発現、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ｗＴＢＧプロモーター、肝コンビナトリアルバンドル（ＨＣＢ）プロモーター、２ｘＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、又はｐｐ５２（ＬＳＰ１）とキメライントロンプロモーターの白血球特異的発現である、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９１。少なくとも１つのプロモーター配列が、配列番号９～１６、６９、１０７、１２６、及び１３２のいずれかの核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９２。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポサーゼポリペプチド、ｐｉｇｇｙＢａｃ様（ＰＢＬ）トランスポサーゼポリペプチド、又はＳｕｐｅｒｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９３。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が、配列番号３９～４２、４７、及び４９のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９４。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が、配列番号４８又は５０の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９５。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が、眠れる森の美女トランスポサーゼポリペプチド、過活性眠れる森の美女（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼポリペプチド、ヘリトロントランスポサーゼポリペプチド、Ｔｏｌ２トランスポサーゼポリペプチド、TcBusterトランスポサーゼポリペプチド、又は変異TcBusterトランスポサーゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９６。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が、配列番号５１～６０のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９７。ポリＡ配列が配列番号２６～２７、９７、又は１０８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様９８。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が少なくとも１つのプロモーター配列に作動可能に連結されている、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様９９。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列の発現が、少なくとも１つのプロモーター配列によって制御される、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
実施態様１００。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドが少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列をさらに含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０１。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が、配列番号１０３又は１０９の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ａ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド：
ａ）第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）少なくとも１つのプロモーター配列少なくとも１つのプロモーター配列、
ｃ）少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、
ｄ）ポリＡ配列、
ｅ）少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｆ）第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様１０２Ｂ。第１のＡＡＶＩＴＲ配列が配列番号１２７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｃ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｄ。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１２６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｅ。少なくとも１つのトランスポサーゼ配列が配列番号４８の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｆ。ポリＡ配列が配列番号１３６の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｇ。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号１３７の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｈ。少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列が配列番号４の核酸配列を含む、前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０２Ｉ。５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド：
ａ）配列番号１２７の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
ｂ）配列番号９又は配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
ｃ）配列番号４８の核酸配列を含む少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、
ｄ）配列番号１３６の核酸配列を含むポリＡ配列、
ｅ）配列番号１３７の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
ｆ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
実施態様１０３。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号９の核酸配列を含む、実施態様１０２Ａ～１０２Ｉのいずれか１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０４。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１２６の核酸配列を含む、実施態様１０２Ａ～１０２Ｉのいずれか１つのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０５。少なくとも１つのプロモーター配列が配列番号１４４の核酸配列を含む、実施態様１０２Ａ～１０４のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼポリヌクレオチド。
実施態様１０６。前述の実施態様のいずれかのＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むベクター。
実施態様１０７。ベクターがウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様１０８。ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様１０９。ＡＡＶウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様１１０。ＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１又はＡＡＶ－ＮＰ５９ＡＡＶウイルスベクターであり、好ましくはＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１ウイルスベクターである、前述の実施態様のいずれかのベクター。
実施態様１１１。実施態様１０２～１１０のいずれかのベクターを含む組成物。
実施態様１１２。実施態様７８～８２のいずれかのベクターと実施態様１０２～１１０のいずれかのベクターとを含む組成物。
実施態様１１３。それを必要とする被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害（ＭＬＤ）を治療する方法であって、前述の実施態様のいずれかの少なくとも１つのポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の少なくとも１つの治療有効量を被験体に投与することを含む方法。
実施態様１１４。それを必要とする被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害（ＭＬＤ）を治療する方法であって、被験体に以下を投与することを含む方法：
ａ）前述の実施態様のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドの、又はＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む前述の実施態様のベクター及び／又は組成物の任意の１つの、少なくとも１つの治療有効量、及び
ｂ）前述の実施態様のいずれか１つのＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼポリヌクレオチドの、又はＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼポリヌクレオチドを含む前述の実施態様のベクター及び／又は組成物の任意の１つの、少なくとも１つの治療有効量。
実施態様１１５。少なくとも１つのＭＬＤが、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠乏（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞タイプ１（ＰＦＩＣ３）、又はこれらの任意の組み合わせである、実施態様１１４の方法。
実施態様１１６。ＭＬＤがオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症である、実施態様１１５の方法。
定義
核酸及びポリヌクレオチド分子
本開示の核酸分子及びポリヌクレオチド分子は、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又は任意の他の形態などのＲＮＡの形態、又は特に限定されるものではないが、クローニングにより又は合成的に又はこれらの組合わせにより得られるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖、若しくは一本鎖、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも一本鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られているコード鎖でもよく、又はアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
核酸及びポリヌクレオチド分子の構築
本開示の核酸及びポリヌクレオチド分子は、当該分野で公知の、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、及び／又は（ｄ）これらの組み合わせを使用して作製することができる。
核酸及びポリヌクレオチド分子は、本開示のポリヌクレオチドに加えて、ヌクレオチド配列を好都合に含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離を助けることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離を助けることができる。例えばヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製する便利な手段を提供する。コード配列を除く本開示の核酸は、任意選択的に、本開示のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現のためのベクター、アダプター、又はリンカーである。
このようなクローニング及び／又は発現配列にさらなる配列を付加して、クローニング及び／又は発現におけるそれらの機能を最適化するか、ポリヌクレオチドの単離を助けるか、又は細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は、当技術分野で周知されている。
核酸及びポリヌクレオチド分子を構築するための組換え法
本開示の核酸及びポリヌクレオチド分子、例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はこれらの任意の組み合わせは、生物学的供給源から、当業者に知られている任意の数のクローニング方法を使用して得ることができる。いくつかの態様において、厳密性条件下で本開示のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列が同定される。ＲＮＡの単離、及びｃＤＮＡやゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知されている。
核酸スクリーニング及び単離方法
ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを使用してスクリーニングすることができる。プローブを使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列とハイブリダイズし、同じ生物又は異なる生物の相同遺伝子を単離することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションの様々な程度の厳密性をアッセイで使用できること、及びハイブリダイゼーション又は洗浄媒体のいずれかが厳密性であり得ることを理解するであろう。ハイブリダイゼーションの条件がより厳密になるにつれて、二重鎖形成が起きるためには、プローブと標的の間の相補性の程度が大きくなる必要がある。厳密性の程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、及びホルムアミドなどの部分変性溶媒の存在の１つ以上によって制御できる。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密性は、反応物溶液の極性を変化させることによって、例えば０％～５０％の範囲内でホルムアミドの濃度を操作することによって好都合に変更される。検出可能な結合に必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体の厳密性に従って変化する。相補性の程度は、最適には１００％、又は７０～１００％、又はその間の任意の範囲若しくは値である。しかしながら、プローブ及びプライマーにおけるわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーション媒体及び／又は洗浄媒体の厳密性を低下させることによって、補償され得ることを理解すべきである。
ＲＮＡ又はＤＮＡの増幅方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、過度の実験を行うことなく本開示に従って使用することができる。
ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の既知の方法には、特に限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセス（例えば、Mullis, et al.の米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第４，９６５，１８８号；Tabor et al.の第４，７９５，６９９号及び第４，９２１，７９４号；Innisの第５，１４２，０３３号；Wilson, et al.の第５，１２２，４６４号；Innisの第５，０９１，３１０号；Gyllensten, et al.の第５，０６６，５８４号；Gelfand, et al.の第４，８８９，８１８号；Silver, et al.の第４，９９４，３７０号；Biswasの第４，７６６，０６７号；Ringoldの第４，６５６，１３４号）、及び二本鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを使用するＲＮＡ媒介増幅（Malek, et al.の米国特許第５，１３０，２３８号、商品名ＮＡＳＢＡ）が含まれ、これらの参考文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから直接、本開示のポリヌクレオチドの配列、及び関連遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅法も、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、試料中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するための、核酸配列決定のための、又は他の目的のための、プローブとして使用する核酸を作成するために、有用であり得る。当業者にインビトロ増幅方法を指示するのに十分な技術の例は、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７年）；及びInnis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)に見いだされる。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは、当技術分野で知られている。例えば、Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech)を参照されたい。さらに、例えばＴ４遺伝子３２タンパク質（Boehringer Mannheim）を使用して、長いＰＣＲ産物の収量を改善することができる。
核酸を構築するための合成方法
本開示の核酸及びポリヌクレオチド分子は、既知の方法による直接化学合成によって調製することもできる。化学合成では、通常一本鎖オリゴヌクレオチドが生成され、このオリゴヌクレオチドが、相補配列とのハイブリダイゼーションによって又は一本鎖をテンプレートとして使用してＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換できる。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００塩基以上の配列に限定され得る一方で、より長い配列はより短い配列の連結によって得られ得ることを認識するであろう。
組換え発現カセット
本開示はさらに、本開示の核酸又はポリヌクレオチド分子を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸又はポリヌクレオチドを使用して組換え発現カセットを構築して、これを少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図された宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始調節配列に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を使用して、本開示の核酸の発現を指示することができる。
いくつかの態様において、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸を、本開示のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入して、本開示のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートすることができる。例えば、内因性プロモーターは、変異、欠失、及び／又は置換によって、インビボ又はインビトロで改変することができる。
発現ベクター及び宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離された核酸及びポリヌクレオチド分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び当技術分野で周知の組換え技術による少なくともポリヌクレオチドの産生に関する。
ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合させることができる。一般にプラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、又は荷電脂質との複合体に導入される。これは、ベクターがウイルスの場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし、宿主細胞に形質導入することができる。
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。発現構築物は、転写開始、転写停止のための部位をさらに含み、転写領域には翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの、先頭の翻訳開始コドン及び末端に適切に位置する停止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）を含み、哺乳類又は真核細胞での発現にはＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。
発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、少なくとも１つの選択マーカーを含む。そのようなマーカーには、例えば、真核細胞培養のための、特に限定されるものではないが、アンピシリン、ゼオシン（Ｓｈｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ヒグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素をコードし、メトトレキセートに対する耐性を付与する）、ミコフェノール酸、又はグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号；５，７７０，３５９号；５，８２７，７３９号）、ブラストサイジン（ｂｓｄ遺伝子）、耐性遺伝子、並びに大腸菌及び他の細菌又は原核生物を培養するためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ヒグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、又はテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれる（上記の特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。上述の宿主細胞のための適切な培地及び条件は、当技術分野で知られている。適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の既知の方法によって行うことができる。
発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞を単離するための、少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含む。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞又は細胞のサブセットを細胞の別の定義されたサブセットから区別する表面タンパク質、糖タンパク質、又はタンパク質群を含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物又は方法によって改変された細胞を、本開示の組成物又は方法によって改変されていない細胞から区別する。このような細胞表面マーカーには、例えば、特に限定されるものではないが、「指定のクラスター」又は「分類決定基」タンパク質（しばしば「ＣＤ」と省略される）、例えば末端切断型又は完全長型のＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。細胞表面マーカーには、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８がさらに含まれる（Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87）。
発現ベクターは、好ましくはしかし任意選択的に、本開示の組成物及び方法によって改変された細胞を単離するための、少なくとも１つの選択可能な薬剤耐性マーカーを含む。本開示の選択可能な薬剤耐性マーカーは、野生型又は変異型のＮｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。
当業者は、核酸又はポリヌクレオチド分子の発現に利用可能な多数の発現系に精通している。あるいは、本開示の核酸は、本開示の核酸又はポリヌクレオチドをコードする内因性ＤＮＡを含む宿主細胞において（操作によって）オンにすることによって、宿主細胞において発現され得る。そのような方法は当技術分野でよく知られており、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、第５，６４１，６７０号、第５，７３３，７４６号、及び第５，７３３，７６１号に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の核酸及びポリヌクレオチド分子、これらの特定の部分又は変種の産生に有用な細胞培養物の例は、当技術分野で知られている細菌、酵母、及び哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は細胞の単層の形態であることが多いが、哺乳動物細胞懸濁液又はバイオリアクターも使用することができる。多数の適切な宿主細胞株が当技術分野で開発されており、ＣＯＳ－１（例えばＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－１０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣＣＲＬ１６１０）、及びＢＳＣ－１（例えばＡＴＣＣＣＲＬ－２６）細胞株、Ｃｏｓ－７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、２９３細胞、ヒーラ細胞などが含まれ、これらは、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Manassas, Va.） (www.atcc.org)から容易に入手できる。好ましい宿主細胞には、骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ－１５８０）及びＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ－１８５１）である。好ましい態様において、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３又はＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞である。
これらの細胞のための発現ベクターは、特に限定されるものではないが、以下の発現制御配列の１つ以上を含むことができる：プロモーター、例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター；エンハンサー、及び／又はプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴＡｇポリＡ付加部位）、及び転写停止配列。例えば、Ausubel et al., supra; Sambrook, et al.（前述）を参照されたい。本開示の核酸又はタンパク質の産生に有用な他の細胞は既知であり、及び／又は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションの細胞株とハイブリドーマのカタログ（www.atcc.org）又はその他の既知又は市販の情報源から入手可能である。
真核宿主細胞が使用される場合、典型的には、ポリアデニル化又は転写ターミネーター配列がベクターに組み込まれる。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)）。さらに、当技術分野で知られているように、宿主細胞における複製を制御する遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。
本開示は、単離又は実質的に精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質組成物を提供する。「単離された」又は「精製された」ポリヌクレオチド若しくはタンパク質、又はその生物学的に活性な部分は、その自然環境で見られるポリヌクレオチド又はタンパク質に通常付随するか、又はこれらと相互作用する成分を、実質的又は本質的に含まない。従って、単離又は精製されたポリヌクレオチド又はタンパク質は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞材料又は培養培地を実質的に含まず、化学的に合成された場合、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。最適には「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、ポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドの５'末端及び３'末端に位置する配列）に自然に隣接する配列（最適には、タンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な態様において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ポリヌクレオチドに自然にフランキングする約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量で）未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本開示のタンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換えにより産生される場合、最適には、培養培地は、化学前駆体又は目的のタンパク質ではない化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％、又は１％（乾燥重量で）未満である。
本開示は、開示されたＤＮＡ配列及びこれらのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の、断片及び変種を提供する。本開示を通して使用される用語「断片」は、ＤＮＡ配列の一部又はアミノ酸配列の一部、従ってそれによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードすることができ、従って本明細書に記載の標的ＤＮＡ配列に対するＤＮＡ認識又は結合活性をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持しているか又はプロモーター活性を保持していないタンパク質をコードしていない。従ってＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、最大、本開示の全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
本開示の核酸又はタンパク質は、標的ベクター中のモノマー単位及び／又は反復単位を事前に組み立てることを含むモジュラーアプローチによって構築することができ、これは次に最終の目的ベクターに組み立てることができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復モノマーを含むことができ、標的ベクター中の反復単位を事前に組み立てることを含むモジュラーアプローチによって構築することができ、これは次に最終の目的ベクターに組み立てることができる。本開示は、この方法によって産生されたポリペプチド、並びにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって生成されたポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物及び細胞を提供する。
「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙された要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することを意図している。組成物及び方法を定義するために使用される「から本質的になる」は、意図された目的のために使用される場合、組み合わせに対して本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。従って、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、微量汚染物質又は不活性担体を除外しないであろう。「からなる」とは、微量以上の他の成分及び実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。
本明細書で使用される「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、又は任意の他のタイプのＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、及びメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、グリコシル化などによって修飾されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「調節（modulation）」又は「調節（regulation）」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節には、特に限定されるものではないが、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が含まれる。
「作動可能に連結された（operatively linked）」という用語又はその等価物（例えば、「作動可能に連結された（linked operatively）」）は、２つ以上の分子が、相互作用して１つ又は両方の分子又はこれらの組合わせに起因する機能に影響を与えることができるように、互いに対して配置されていることを意味する。いくつかの態様において、トランス遺伝子配列又は任意の他の配列は、プロモーター配列がトランス遺伝子配列又は任意の他の配列の発現を制御する場合、プロモーター配列に作動可能に連結されていると言われる。いくつかの態様において、プロモーター配列がトランスポサーゼ配列の発現を制御する場合、トランスポサーゼ配列はプロモーター配列に作動可能に連結されていると言われる。
非共有的連結成分、並びに非共有的連結成分を作製及び使用する方法が開示される。様々な構成要素は、本明細書に記載されるように、様々な異なる形態をとることができる。例えば、非共有的に連結（すなわち、作動可能に連結）されたタンパク質を使用して、当技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にすることができる。タンパク質などの非共有的に連結された成分が会合及び解離する能力は、所望の活性のためにそのような会合が必要とされる状況下でのみ又は主に、機能的会合を可能にする。結合は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間であり得る。
「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに共有的に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の描写は、相補鎖の配列も定義する。従って核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖を包含し得る。本開示の核酸はまた、同じ構造を保持するか又は同じタンパク質をコードする、実質的に同一の核酸及びその相補体を包含する。
本開示の核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であっても、二本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であっても、一本鎖配列を含むことができる。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらのハイブリッドを含むことができる。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組み合わせを含むことができる。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。本開示の核酸は、非天然アミノ酸修飾を含むように合成することができる。本開示の核酸は、化学合成法又は組換え法によって得ることができる。
本開示の核酸は、これらの全配列又はその任意の部分のいずれかが、天然に存在しなくてもよい。本開示の核酸は、天然に存在しない１つ以上の変異、置換、欠失、又は挿入を含むことができ、核酸配列全体を天然に存在しないものにすることができる。本開示の核酸は、１つ以上の重複配列、反転配列、又は反復配列を含むことができ、その結果として生じる配列は天然に存在せず、核酸配列全体を天然に存在しないものにすることができる。本開示の核酸は、天然に存在しない修飾ヌクレオチド、人工ヌクレオチド、又は合成ヌクレオチドを含むことができ、核酸配列全体を天然に存在しないものにすることができる。
遺伝暗号の冗長性を考えると、複数のヌクレオチド配列がある特定のタンパク質をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列はすべて、本明細書において企図される。
本開示を通して使用される用語「作動可能に連結された」は、空間的に連結されたプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５'（上流）又は３'（下流）に配置できる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてそのプロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。プロモーターと遺伝子の間の距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく対応できる。
本開示を通して使用される「プロモーター」という用語は、細胞中の核酸の発現を付与、活性化、又は増強することができる合成又は天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに増強するため、及び／又はその空間的発現及び／又は時間的発現を変更するために、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位エンハンサー又はリプレッサー要素を含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起きる細胞、組織、又は器官に応じて、又は発現が起きる成長段階に応じて、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、又は誘導剤などの外部刺激に応じて、遺伝子成分の発現を構成的又は差別的に調節することができる。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、又はＳＶ４０後期プロモーター及びＣＭＶＩＥプロモーターが含まれる。
本開示を通して使用される用語「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であること、又は２つの配列が厳密性ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
本開示を通して使用される用語「実質的に同一」は、第１の配列と第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、又は第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合、核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを指す。
本開示を通して使用される用語「変種」は、核酸を説明するために使用される場合、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の部分又は断片；（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列の相補体又はその一部；（ｉｉｉ）参照された核酸又はその相補体と実質的に同一である核酸；又は（ｉｖ）参照された核酸、その相補体、又はこれらと実質的に同一の配列に、厳密性条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
本開示を通して使用される「ベクター」という用語は、複製開始点を含む核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクター又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターでもよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、アミノ酸と、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はＤＮＡ及びＲＮＡ配列の両方との組み合わせを含むことができる。
本開示を通して使用される場合、用語「変種」は、ペプチド又はポリペプチドを説明するために使用される場合、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持しているペプチド又はポリペプチドを指す。変種はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。
アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸で置換することは、典型的には軽微な変化を伴うものとして当技術分野で認識されている。これらの小さな変化は、一部は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することによって同定することができる。Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性と電荷の考慮に基づいている。同様のハイドロパシー指数のアミノ酸は、置換してもタンパク質機能を保持することができる。１つの態様において、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能になり、これは、抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号を参照されたい。これは参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数と親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的な類似性に依存すると理解されている。
本明細書で使用される「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、又はＣに示されるように定義され得る。いくつかの態様において、融合ポリペプチド及び／又はそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性と、タンパク質の二次構造及び三次構造への寄与によって分類できる。保存的置換は、あるアミノ酸を類似の特性を持つ別のアミノ酸に置換することである。保存的置換の例を表Ａに示す。
Figure 2023515692000002
あるいは、保存的アミノ酸は、Lehninger, (Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77)に記載されているように、表Ｂに示されるようにグループ化することができる。
Figure 2023515692000003
あるいは、例示的な保存的置換を表Ｃに示す。
Figure 2023515692000004
本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、又は置換、又はこれらの任意の組み合わせ、並びにアミノ酸残基の挿入、欠失、又は置換以外の修飾を有するポリペプチドを含むことを意図していることを理解されたい。本開示のポリペプチド又は核酸は、１つ以上の保存的置換を含むことができる。
本開示を通して使用される場合、前述のアミノ酸置換の「２つ以上」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０以上の列挙されたアミノ酸置換を指す。「２つ以上」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２、３、４、又は５を指し得る。
本開示のポリペプチド及びタンパク質は、それらの全配列又はその任意の部分のいずれかが、天然に存在しない可能性がある。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない１つ以上の変異、置換、欠失、又は挿入を含み、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにすることができる。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、１つ以上の複製、反転、又は反復配列を含むことができ、その結果として生じる配列は天然に存在せず、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする。本開示のポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在しない修飾、人工、又は合成アミノ酸を含むことができ、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにすることができる。
本開示を通して使用されるように、「配列同一性」は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ：National Center for Biotechnology Information）のｆｔｐサイトから検索することができる、２つの配列をブラストするためのスタンドアロンの実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用して、デフォルトパラメータを使用して決定することができる（Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈で使用される「同一の」又は「同一性」という用語は、各配列の特定の領域にわたって同じである残基の特定のパーセントを指す。パーセントは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域で２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を指定された領域内の位置の総数で割って、及びその結果に１００を掛けて配列同一性のパーセントを得ることができる。２つの配列の長さが異なる場合、又は整列によって１つ以上の互い違いの末端が生成され、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一配列の残基は分母には含まれるが、計算の分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等と見なすことができる。同一性は、手動で、又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用して決定することができる。
本開示を通して使用される用語「内因性」は、標的遺伝子又はそれが導入される宿主細胞に天然に関連する核酸又はタンパク質配列を指す。
本開示を通して使用される用語「外因性」は、標的遺伝子又はそれが導入される宿主細胞に天然には関連しない核酸又はタンパク質配列を指し、天然に存在する核酸、例えばＤＮＡ配列の天然に存在しない複数のコピー、又は天然に存在しないゲノム位置に位置する天然に存在する核酸配列を含む。
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入する」とは、ポリヌクレオチド構築物が宿主細胞の内部にアクセスできるように、ポリヌクレオチド構築物を細胞に提示することを意味する。本開示の方法は、宿主細胞にポリヌクレオチド構築物を導入するための具体的な方法に依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部に到達することのみに依存する。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、及び動物に導入する方法は当技術分野で知られており、特に限定されるものではないが、安定な形質転換法、一過性形質転換法、及びウイルス媒介法を含む。
本明細書で使用される「被験体」という用語は、「それを必要とする被験体」という用語と交換可能であり、どちらも疾患を有するか又は疾患を発症するリスクが高い被験体を指す。「被験体」には哺乳動物が含まれる。哺乳動物は、例えばヒト又は適切な非ヒト哺乳動物、例えば霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、又はブタであり得る。被写体は鳥や家禽でもよい。１つの実施態様において、哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「治療している」又は「治療する」という用語は、疾患、状態、又は障害と闘うことを目的とする患者の管理及びケアを記述し、疾患、状態、又は障害の症状又は合併症を軽減するための、又は疾患、状態、又は障害を排除するための、本開示の化合物の投与、又はその医薬的に許容し得る塩、多形体、若しくは溶媒和物の投与を含む。「治療する」という用語はまた、インビトロの細胞又は動物モデルの治療を含むことができる。
実施例１－本開示のウイルスベクターによって媒介されるトランス遺伝子のインビボ発現
以下の非限定的実施例では、マウスを本開示のウイルスベクターで処理し、ウイルスベクターに含まれるトランス遺伝子の発現を追跡した。
新生児マウスを４つの異なる処理群に分けた。
処理群＃１のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃２のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃３のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
処理群＃４のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた
次に、ウイルスベクター投与後３５日間、マウスにおいて生物発光（ＢＬＩ）シグナルを測定して、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドにおいてコードされるトランス遺伝子の発現を測定した。この分析の結果は図１０に示される。図１０において、処理群＃１はＨＬＰ－ＯＴＣと呼び、処理群＃２はＴＢＧ－ＯＴＣと呼び、処理群＃３はＨＬＰ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃４はＴＢＧ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼ぶ。
図１０に示されるように、処理群＃３及び＃４のマウスは、３５日間にわたってＢＬＩレベルの増加を示している。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの同時投与により、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのトランス遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれ、トランス遺伝子の発現の増加と持続がもたらされることを示している。さらに、ＴＢＧプロモーターを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを投与された処理群＃４において、トランス遺伝子の発現増加が観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＴＢＧプロモーターの使用が、投与後まもなく生じるトランス遺伝子発現の増加を提供できることを示している。このような活性は、早期発症患者が治療されている臨床の場で特に有利である。
実施例２－異なる濃度の本開示のウイルスベクターによって媒介されるトランス遺伝子のインビボ発現
以下の非限定的実施例では、マウスを様々な濃度の本開示のウイルスベクターで処理し、ウイルスベクターに含まれるトランス遺伝子の発現を追跡した。
本試験においてマウスは以下のいずれかを投与された：
ａ）図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む増加する濃度のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのみ、又は
ｂ）ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターと共に、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含む増加する濃度のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクター、ここで、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
ウイルスベクターの投与後２１日目に、マウスにおいてＢＬＩを測定して、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドにおいてコードされるトランス遺伝子の発現を測定した。この分析の結果は図１１に示される。図１１に示されるように、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの両方を同時投与した場合、より低い用量でより高いレベルのトランス遺伝子発現が達成された。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの同時投与により、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのトランス遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれ、トランス遺伝子の発現の増加と持続がもたらされることを示している。これは、被験体に投与する必要があるＡＡＶの総用量を減らすことができ、ＡＡＶベクターの投与に通常伴う負の副作用を回避するのに役立つため、臨床の場で特に有利である。
実施例３－本開示のウイルスベクターによるＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスの処理
以下の非限定的実施例では、Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスを本開示のウイルスベクターで処理した。
当業者に理解されるように、Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスは、ＯＴＣ欠乏及び慢性高アンモニア血症を含む尿素サイクル障害の広く使用されているモデルである。マウスは、Ｏｔｃ遺伝子のエクソン４の最後のヌクレオチドに突然変異（ｃ．３８６Ｇ＞Ａ；ｐ．Ｒ１２９Ｈ）を含み、５'スプライス部位に影響を与えて、隣接するイントロンへの４８ｂｐの隠れたスプライス部位の部分的使用をもたらす。
新生児Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスを２つの異なる処理群に分けた。
処理群＃１のマウスに、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与し、及び図４に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。従って、処理群＃１のマウスは、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターを１：１の用量比で、総ＡＡＶ用量６．６×１０１３ｖｇ／ｋｇで処理した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ヒトＯＴＣをコードするトランス遺伝子配列を含み、内因性のマウスＯＴＣから区別することを可能にした。
処理群＃２のマウスに、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与し、及び図４に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。従って、処理群＃２のマウスは、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターを１：１の用量比で、総ＡＡＶ用量５×１０１３ｖｇ／ｋｇで処理した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ヒトＯＴＣをコードするトランス遺伝子配列を含み、内因性のマウスＯＴＣから区別することを可能にした。
ウイルスベクターの投与後、マウスにおいてＢＬＩを測定して、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドにおいてコードされるトランス遺伝子の発現を測定した。この分析の結果は図１２に示される。図１２に示されるように。両方の処理群で高レベルのトランス遺伝子発現が測定された。
ウイルスベクターの投与後、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの両方について、二倍体ゲノム当たりの非組み込みベクターのコピー数の量を測定した。この分析の結果は図１３に示される。図１３に示されるように、非組み込みＡＡＶトランスポサーゼベクターの量は、マウスの加齢と共に減少した。さらに、非組み込みＡＡＶトランスポサーゼベクターの量は、７日目でも、非組み込みＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターの量と比較して低かった。
ウイルスベクターの投与後、二倍体ゲノムあたりの非組み込みＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのコピー数の量、及び組み込みＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのコピー数の量を測定した。この分析の結果は図１４に示される。図１４に示されるように、処理後２１日目に、組み込まれたＡＡＶｐｉｇｇｂｙＢａｃトランスポゾンベクターが検出された。さらに、組み込みは、処理群＃１（２：１ ＯＴＣ：ＳＰＢ）では処理群＃２（２：２ ＯＴＣ：ＳＰＢ）と比較して、より一貫していた。理論に拘束されることを望むものではないが、図１４の結果、特にトランスポゾンベクターの組み込みは、インビボでのトランスポゾンの転位の成功を示している。
組み込まれた部位の数も、２１日目と４３日目にＬＭ－ＰＣＲによってアッセイした。簡単に説明すると、２μｇのゲノムＤＮＡをマウス肝臓組織から単離し、超音波処理によってランダムに剪断した。得られた末端に、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を連結させた。２回のＰＣＲ増幅を行った。最終的なＰＣＲ産物は、Illuminaペアエンド配列決定を行った。組み込まれた部位は、２カ所のブレークポイントの確認によって決定された。このＰＣＲ分析の結果は表１及び２に示される。理論に拘束されることを望むものではないが、表１及び表２に示される結果は、インビボでのトランスポゾンの転位及び組込みが成功したことを示している。
Figure 2023515692000005
Figure 2023515692000006
ウイルスベクターの投与後、マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡ及びＳＰＢｍＲＮＡの量をマウスで測定した。この分析の結果は図１５に示される。図１５に示されるように、ウイルスベクターで処理されたマウスは多量のヒトＯＴＣｍＲＮＡを発現する。さらに、ＳＰＢｍＲＮＡのレベルは年齢とともに減少する。理論に拘束されることを望むものではないが、ＳＰＢｍＲＮＡのこの減少は、初期治療後のオフターゲット転位作用を回避するために、臨床の場において有利であり得る。ヒトＯＴＣｍＲＮＡ及びＳＰＢｍＲＮＡと、二倍体ゲノムあたりの総ベクターコピー数との相関分析も実施された。この分析の結果は図１６に示される。図１６に示されるように、ヒトＯＴＣ及びＳＰＢのｍＲＮＡレベルは、対応するベクターコピー数と相関した。
処理後２１日目に、マウスから肝臓試料を採取し、ＧＦＰ発現を分析した。処理群＃１と処理群＃２の両方から採取された試料中の肝細胞は、強力なＧＦＰ発現を示した。
実施例４－本開示のウイルスベクターによる誘導性高アンモニア血症マウスモデルの処理
以下の非限定的実施例では、Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスを本開示のウイルスベクターで処理し、ｓｈＲＮＡを使用して誘発高アンモニア血症罹患モデルを作成した。
新生児Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスを２つの異なる処理群に分けた。
処理群＃１のマウスに、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で、及び図４に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。従って、処理群＃１のマウスは、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターを１：１の用量比で、総ＡＡＶ用量６．６×１０１３ｖｇ／ｋｇで処理した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ヒトＯＴＣをコードするトランス遺伝子配列を含み、内因性のマウスＯＴＣから区別することを可能にした。
処理群＃２のマウスに、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの用量で投与し、及び図４に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。従って、処理群＃２のマウスは、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターを２：１の用量比で、総ＡＡＶ用量５×１０１３ｖｇ／ｋｇで処理した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ヒトＯＴＣをコードするトランス遺伝子配列を含み、内因性のマウスＯＴＣから区別することを可能にした。
処理後３８日目に、各処理群のサブセットは以下のいずれかであった：
ａ）さらに放置
ｂ）マウスＯＴＣを標的とするｓｈＲＮＡの用量を投与。
対照として及び比較のために、ウイルスベクターで処理しなかった同様の年齢のＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスにも、マウスＯＴＣを標的とするｓｈＲＮＡの用量を投与した。
図１７は、さらに未処理のままに放置したか（２：２ ＯＴＣ：ＳＰＢ）、又はマウスＯＴＣを標的とする用量のｓｈＲＮＡをさらに投与した（２：２ ＯＴＣ：ＳＰＢ＋ｓｈＲＮＡ）処理群＃１のマウスの生存確率を示す。図１７はまた、ウイルスベクターで処理されず、マウスＯＴＣを標的とするｓｈＲＮＡの用量を投与された同様の年齢のＯｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスの生存確率を示す。図１８は、前述のマウス群の血漿中のアンモニア濃度を示す。図１７及び図１８に示されるように、ｓｈＲＮＡ投与の有害な作用は、ウイルスベクターで処理されたマウスでは遅延している。
実施例５－本開示のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターにおいて異なるプロモーター配列に作動可能に連結されたトランス遺伝子のインビボ発現
以下の非限定例において、マウスは、ＨＬＰプロモーター、ＬＰ１プロモーター、又はＴＢＧプロモーター配列のいずれかに作動可能に連結されたトランス遺伝子を含む本開示のウイルスベクターで処理された。ウイルスベクターに含まれるトランス遺伝子の発現を追跡して、各プロモーターがインビボで、特に肝臓内でトランス遺伝子の発現を駆動できる効率を決定した。
新生児野生型マウス及び成体野生型マウス及び新生児Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈマウスを、１２の異なる処理群に分けた。
処理群＃１～＃６は、新生児野生型マウスを含んでいた。
処理群＃１のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃２のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
処理群＃３のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃４のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
処理群＃５のマウスには、図９に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを９５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃６のマウスには、図９に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを３．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを１．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
次に、ウイルスベクター投与後４２日間、処理群＃１～＃６のマウスにおいて肝臓の生物発光（ＢＬＩ）シグナルを測定して、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドにおいてコードされるトランス遺伝子の発現を測定した。この分析の結果は図１９に示される。図１９において、処理群＃１はＨＬＰ－ＯＴＣと呼び、処理群＃２はＨＬＰ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃３はＴＢＧ－ＯＴＣと呼び、処理群＃４はＴＢＧ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃５はＬＰ１－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃６はＬＰ１－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼ぶ。図１９に示されるように、ＴＢＧプロモーターがトランス遺伝子発現を最も効率的に駆動し、次にＬＰ１プロモーター、そして次にＨＬＰプロモーターが続いた。処理群＃２、＃４、及び＃６において発現の増加及び持続が観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの同時投与により、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのトランス遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれ、トランス遺伝子の発現の増加と持続がもたらされることを示している。図１９で観察されたトランスポゾンベクターの組み込みは、インビボでのトランスポゾンの転位の成功を示す。
マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡ及びＳＰＢｍＲＮＡの量も、処理群＃１～＃６のマウスで測定した。この分析の結果は図２０（ヒトＯＴＣｍＲＮＡ）及び図２１（ＳＰＢｍＲＮＡ）に示される。図１９に示された結果と同様に、図２０及び図２１の結果は、ＴＢＧプロモーターが最高レベルのトランス遺伝子ｍＲＮＡをもたらし、次にＬＰ１プロモーター、及び次にＨＬＰプロモーターが続くことを示している。
ウイルスベクター投与後２１日目に、マウスＯＴＣタンパク質の量に対するヒトＯＴＣタンパク質の量も測定した。この分析の結果は図２２に示される。図１９～２１に示した結果と同様に、図２２に示される結果は、ＴＢＧプロモーターが最高レベルのヒトＯＴＣタンパク質をもたらし、次にＬＰ１プロモーター、そして次にＨＬＰプロモーターが続くことを示している。
さらに、処理群＃１及び処理＃２のマウス由来の肝細胞も、免疫組織化学によって分析し、ＧＦＰについて染色した。簡単に説明すると、肝臓組織を２１日目に採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した後、染色した。免疫組織化学の結果は図２７に示され、これは、より高いレベルのＧＦＰが処理群＃２で観察されたことを示している。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターとＡＡＶトランスポサーゼベクターの同時投与により、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターのトランス遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれ、トランス遺伝子の発現の増加と持続がもたらされることを示している。
さらに、処理したマウスのゲノム中の組み込まれた部位の数を、ＬＭ－ＰＣＲによってアッセイした。簡単に説明すると、２μｇのゲノムＤＮＡをマウスの肝臓組織から単離し、超音波処理によってランダムに剪断した。得られた末端に固有の分子識別子（ＵＭＩ）を連結した。２回のＰＣＲ増幅を行った。最終的なＰＣＲ産物は、Illuminaペアエンド配列決定を行った。固有の組み込み部位の合計は、２つ以上のＵＭＩを持つ片側ブレークポイントによって決定された。この分析の結果を表３に示す。
Figure 2023515692000007
処理群＃７～＃１２は成体の野生型マウスを含んでいた。
処理群＃７のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃８のマウスには、図１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを１．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを０．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
処理群＃９のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃１０のマウスには、図８に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを１．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを０．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
処理群＃１１のマウスには、図９に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを２×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。
処理群＃１２のマウスには、図９に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンベクターを１．３×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で、及びＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むＡＡＶトランスポサーゼベクターを０．７×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドは、ＨＬＰプロモーターに作動可能に連結されたＳＰＢトランスポサーゼをコードするトランスポサーゼ配列を含んでいた。
次に、ウイルスベクター投与後７日目及び１４日目に、処理群＃７～＃１２のマウスにおいて肝臓の生物発光（ＢＬＩ）シグナルを測定して、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドにおいてコードされるトランス遺伝子の発現を測定した。この分析の結果は図２３に示される。図２３において、処理群＃７はＨＬＰ－ＯＴＣと呼び、処理群＃８はＨＬＰ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃９はＴＢＧ－ＯＴＣと呼び、処理群＃１０はＴＢＧ－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃１１はＬＰ１－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼び、処理群＃１２はＬＰ１－ＯＴＣ＋ＳＰＢと呼ぶ。図２３に示されるように、プロモーターのそれぞれについて同様の強さのトランス遺伝子発現が観察された。
マウスＯＴＣｍＲＮＡのレベルに対するヒトＯＴＣｍＲＮＡ及びＳＰＢｍＲＮＡの量も、処理群＃７～＃１２のマウスにおいてウイルスベクター投与後１４日目に測定した。この分析の結果は図２４（ヒトＯＴＣｍＲＮＡ）及び図２５（ＳＰＢｍＲＮＡ）に示される。図２４及び図２５に示されるように、ＨＬＰ及びＬＰ１プロモーターについて同様のレベルのヒトＯＴＣが観察され、Ｔ最も強い発現がＢＧプロモーターで観察された。
ウイルスベクター投与後１４日目に、マウスＯＴＣタンパク質の量に対するヒトＯＴＣタンパク質の量も測定した。この分析の結果は２６に示される。図１９～２１に示した結果と同様に、図２２に示される結果は、ＴＢＧプロモーターが最高レベルのヒトＯＴＣタンパク質をもたらし、次にＬＰ１プロモーター、そして次にＨＬＰプロモーターが続くことを示している。
同等物
前述の説明は、例示のみを目的として提示されたものであり、本開示を開示された正確な形態に限定することを意図するものではない。本開示の１つ以上の実施態様の詳細は、上記の添付の説明に記載されている。本明細書に記載のものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載されている。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、本説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、単数形は、文脈が明確に指示しない限り、複数形を含む。特に他に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用されたすべての特許及び刊行物は、参照により組み込まれる。

Claims (24)

  1. ５'から３'方向に以下を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
    ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
    ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
    ｄ）配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
    ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
    ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
    ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
    ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｉ）配列番号１２９の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
    ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
  2. 配列番号１３８の核酸配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
  3. ５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
    ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
    ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
    ｄ）配列番号１３２の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
    ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
    ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
    ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
    ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｉ）配列番号１３０の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
    ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
  4. 配列番号１３９の核酸配列を含む、請求項３に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
  5. ５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド：
    ａ）配列番号３の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
    ｂ）配列番号１２５の核酸配列を含む第１のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｃ）配列番号７の核酸配列を含む第１のインスレーター配列、
    ｄ）配列番号１３の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
    ｅ）配列番号２２の核酸配列を含む少なくとも１つのトランス遺伝子配列、
    ｆ）配列番号９７の核酸配列を含むポリＡ配列、
    ｇ）配列番号８の核酸配列を含む第２のインスレーター配列、
    ｈ）配列番号９６の核酸配列を含む第２のｐｉｇｇｙＢａｃＩＴＲ配列、
    ｉ）配列番号１３１の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
    ｊ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
  6. 配列番号１４０の核酸配列を含む、請求項５に記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチド。
  7. 前記請求項のいずれかに記載のＡＡＶｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンポリヌクレオチドを含むベクター。
  8. 前記ベクターがウイルスベクターであり、好ましくは前記ウイルスベクターがＡＡＶウイルスベクターである、請求項７に記載のベクター。
  9. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
  10. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＡＡＶ－ＫＰ－１又はＡＡＶ－ＮＰ５９ウイルスベクターであり、好ましくは前記ＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１ウイルスベクターである、請求項８に記載のベクター。
  11. 請求項７～１０のいずれかに記載のベクターを含む組成物。
  12. ５'から３'方向に以下を含む、ＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド：
    ａ）配列番号１２７の核酸配列を含む第１のＡＡＶＩＴＲ配列、
    ｂ）配列番号１２６の核酸配列を含む少なくとも１つのプロモーター配列、
    ｃ）配列番号４８の核酸配列を含む少なくとも１つのトランスポサーゼ配列、
    ｄ）配列番号１３６の核酸配列を含むポリＡ配列、
    ｅ）配列番号１３７の核酸配列を含む少なくとも１つのＤＮＡスペーサー配列、及び
    ｆ）配列番号４の核酸配列を含む第２のＡＡＶＩＴＲ配列。
  13. 配列番号１４４の核酸配列を含む、請求項１２に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチド。
  14. 請求項１２又は請求項１３に記載のＡＡＶトランスポサーゼポリヌクレオチドを含むベクター。
  15. 前記ベクターがウイルスベクターであり、好ましくは前記ウイルスベクターがＡＡＶウイルスベクターである、請求項１４に記載のベクター。
  16. 前記ＡＡＶウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１ウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
  17. 前記ＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１又はＡＡＶ－ＮＰ５９ウイルスベクターであり、好ましくは前記ＡＡＶウイルスベクターがＡＡＶ－ＫＰ－１ウイルスベクターである、請求項１５に記載のベクター。
  18. 請求項１４～１７のいずれかに記載のベクターを含む組成物。
  19. 前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の少なくとも１つの治療有効量をそれを必要とする被験体に投与することを含む、前記被験体における少なくとも１つの代謝性肝障害（ＭＬＤ）を治療する方法。
  20. それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤを治療する方法であって、被験体に以下を投与することを含む方法：
    ａ）請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７～１０のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１１に記載の組成物、及び
    ｂ）請求項１２～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８に記載の組成物。
  21. それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤの治療のための、前記請求項のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物の使用であって、前記ポリヌクレオチド、ベクター、又は組成物が、その少なくとも１つの治療有効量を被験体に投与するためのものである使用。
  22. それを必要とする被験体における少なくとも１つのＭＬＤの治療に使用するための、
    ａ）請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項７～１０のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１１に記載の組成物と、
    ｂ）請求項１２～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のベクター、又は請求項１８に記載の組成物との、組み合わせ。
  23. 少なくとも１つのＭＬＤが、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素（ＮＡＧＳ）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症（ＣＰＳＩ欠損症）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギニノコハク酸合成酵素欠損症（ＡＳＳＤ）（シトルリン血症Ｉ）、シトリン欠損症（シトルリン血症ＩＩ）、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症（アルギニノコハク酸尿症）、アルギナーゼ欠損症（高アルギニン血症）、オルニチントランスロカーゼ欠損症（ＨＨＨ症候群）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ１）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ２）、進行性家族性肝内胆汁うっ滞１型（ＰＦＩＣ３）、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  24. 前記ＭＬＤがＯＴＣ欠損症である、請求項２３に記載の方法又は使用。
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