JP2023502515A

JP2023502515A - Ａｐｏｅ遺伝子療法

Info

Publication number: JP2023502515A
Application number: JP2022530164A
Authority: JP
Inventors: ロナルドジー．クリスタル; スティーブンエム．カミンスキー; ケイティスタイルズ; ドランソンディ
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2023-01-24
Also published as: EP4065600A1; AU2020391518A1; WO2021108809A1; CN114829390A; MX2022006364A; US20230044351A1; CA3162761A1; KR20220107243A; BR112022010065A2; IL293116A

Abstract

１１２位、１３６位、もしくは１５８位のうちの少なくとも１つにアルギニン以外の残基を有するが、Ｒ１１２、Ｒ１３６、およびＲ１５８を有する哺乳動物アポリポタンパク質Ｅでも、Ｃ１１２、Ｒ１３６、およびＣ１５８を有する哺乳動物アポリポタンパク質Ｅでもない、哺乳動物アポリポタンパク質Ｅをコードするか、またはＡＰＯＥ４に結合するもしくはＡＰＯＥのへパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を分断させる抗体をコードする、発現カセットを含む、遺伝子治療ベクターと、本ベクターを使用する方法とが提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２５日に出願された米国特許出願第６２／９３９９９９号の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、５００万人の米国人を直接侵しており、罹患率および経済的影響を急速に増加させている。既存の薬物は、基礎疾患経過にほとんど影響せず、現在利用可能な予防療法はない。バリアントＡＰＯＥ４の遺伝により、ＡＤの発症の高いリスクがもたらされる一方、ＡＰＯＥ２遺伝子の遺伝は、保護的であり、ＡＤを発症するリスクを約５０％低減し、発症年齢を遅延させる。ＡＰＯＥ４は、ＡＤにおける脳アミロイド負荷の増加およびより大きな記憶障害と関連付けられる。逆に、ＡＰＯＥ２は、これらの効果を弱める。以前の研究は、ヒトＡＰＯＥ４を発現するマウスモデルのＣＮＳへのヒトＡＰＯＥ２コード配列のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子送達により、アミロイド－βペプチドおよびアミロイド荷重の量が低減されることを示している（Ｚｈａｏｅｔａｌ．２０１６）。ヒトにおいて、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合型遺伝子型のＡＤを発症するオッズ比は１４．９であり、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体においては２．６に低減される。最近の報告により、ＡＰＯＥ４は、アミロイド産生を促進するその役割の他に、異常な脳機能と関連付けられることが示唆されている。

概要
本開示は、リポタンパク質受容体、例えば、ＬＤＬＲに結合するか、またはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合する領域、例えば、１３５位～１５１位の領域などにおいて、保護的であるか、または、例えばＡＰＯＥ４に対する置換を含む、哺乳動物アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）をコードする発現カセットを含む遺伝子治療ベクターを提供する。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１１２位、１３６位、または１５８位のうちの少なくとも１つに、アルギニン、ヒスチジン、またはリジン以外の残基を有する。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１１２位および１３６位にアルギニン以外の残基を有する。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１３６位および１５８位にアルギニン以外の残基を有する。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１１２位、１３６位、および１５８位にアルギニン以外の残基を有する。一実施形態では、アポリポタンパク質Ｅは、ヒトアポリポタンパク質Ｅである。一実施形態では、アルギニン以外の残基は、セリン、ロイシン、バリン、グリシン、イソロイシン、アラニン、トレオニン、アスパラギン、システイン、またはメチオニンである。一実施形態では、アルギニン以外の残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、システイン、またはグルタミンである。一実施形態では、１１２位は、システイン、メチオニン、バリン、トレオニン、アラニン、セリン、アルギニン、グリシン、またはイソロイシンを有する。一実施形態では、１１２位は、システインを有する。一実施形態では、１３６位は、トレオニン、システイン、メチオニン、アルギニン、またはセリンを有する。一実施形態では、１３６位は、セリンを有する。一実施形態では、１５８位は、システイン、メチオニン、バリン、トレオニン、アラニン、セリン、アルギニン、グリシン、またはイソロイシンを有する。一実施形態では、１５８位は、アルギニンまたはシステインを有する。一実施形態では、１１２位、１３６位、または１５８位のうちの２つは、アルギニンを有する。一実施形態では、１１２位は、アルギニンを有しない。一実施形態では、１３６位は、アルギニンを有しない。一実施形態では、１５８位は、アルギニンを有しない。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１１２位にＣｙｓ、１３６位にＳｅｒ、および１５８位にＣｙｓを有する。一実施形態では、遺伝子治療ベクター中の哺乳動物ＡＰＯＥは、１１２位にＣｙｓ、１３６位にＳｅｒ、および１５８位にＡｒｇを有する。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルス遺伝子治療ベクターである。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．２、またはＡＡＶ７キャプシドでシュードタイプ化される。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ５でシュードタイプ化される。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ．１０である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のための、ＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態では、第２の遺伝子治療ベクターは、ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のための、ＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、第２のプロモーターに連結する。一実施形態では、第２のプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｍｉＲＮＡ配列を含むｍｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ベクターは、プラスミドである。一実施形態では、ベクター中の哺乳動物アポリポタンパク質遺伝子は、Ｃ１１２、Ｓ１３６、およびＲ１５８、またはＣ１１２、Ｓ１３６、およびＣ１５８を有する。一実施形態では、第２の遺伝子治療ベクターは、抗ＡＰＯＥ４または抗ヘパラン抗体をコードする核酸配列を有するヌクレオチド配列を含む。

遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物も提供される。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。一実施形態では、組成物中のベクターの量は、約１×１０^１１～約１×１０^１６ゲノムコピーである。一実施形態では、組成物中のベクターの量は、約１×１０^１２～約１×１０^１５ゲノムコピーである。一実施形態では、組成物中のベクターの量は、約１×１０^１１～約１×１０^１３ゲノムコピーである。一実施形態では、組成物中のベクターの量は、約１×１０^１３～約１×１０^１５ゲノムコピーである。一実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。

アルツハイマー病を防止、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物において、１つ以上のその症状、例えば認知症、または他のタウオパチーもしくは認知障害を防止または治療することを含む、方法がさらに提供される。一実施形態では、投与前に、哺乳動物は、例えば、年齢を適合させた哺乳動物、あるいはアルツハイマー病または他のタウオパチーもしくは認知障害のリスクが低い哺乳動物と比較して、脳内のアミロイド斑の増加および／またはタウの増加を有するか、あるいはそのリスクがある。一実施形態では、哺乳動物は、認知障害を有する。本方法には、哺乳動物に、遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することが含まれる。一実施形態では、組成物は、ベクターを含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、核酸を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ３ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、ヒトは、成人、例えば、２０歳以上、例えば、少なくとも４０歳、５０歳、または６０歳である。一実施形態では、ヒトは、若年者、例えば、１０～２０歳である。一実施形態では、ヒトは、小児、例えば、１０歳未満である。一実施形態では、組成物は、出生時または出生後１、２、３、４、もしくは５年以内に、ヒトに投与される。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターの投与は、アミロイド斑の蓄積を防止または阻害するのに有効である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターの投与は、タウ病変を予防または阻害するのに有効である。一実施形態では、遺伝子治療ベクターの投与は、アミロイド斑の蓄積を予防または阻害し、タウ病変を予防または阻害するのに有効である。

加えて、哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現と関連付けられる疾患を、防止、阻害、または治療するための方法が提供される。本方法には、哺乳動物に、遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することが含まれる。一実施形態では、組成物は、ベクターを含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、核酸を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。

遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物においてヘパリン硫酸プロテオグリカンへの結合を低下させる方法が提供される。一実施形態では、組成物は、ベクターを含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、核酸を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。

一実施形態では、組成物は、カテーテルを介して投与される。一実施形態では、組成物は、脳室内投与される。一実施形態では、組成物は、頭蓋内投与される。一実施形態では、組成物は、腰部に投与される。一実施形態では、組成物は、大槽に投与される。一実施形態では、組成物は、穿頭孔を介して脳に投与される。一実施形態では、組成物は、Ｃ１－Ｃ２の下で投与される。

一実施形態では、組成物は、コードされる遺伝子産物、例えば、修飾ＡＰＯＥ、またはヘパランに結合する抗体の発現が、哺乳動物におけるＡＰＯＥ４の発現レベルに類似するように、投与される。一実施形態では、哺乳動物における分泌されたベクターでコードされた遺伝子産物と分泌されたＡＰＯＥ４との比は、１：１である。一実施形態では、哺乳動物における分泌されたベクターでコードされた遺伝子産物と分泌されたＡＰＯＥ４との比は、２：１である。一実施形態では、哺乳動物における分泌されたベクターでコードされた遺伝子産物と分泌されたＡＰＯＥ４との比は、０．５：１である。一実施形態では、哺乳動物における分泌されたベクターでコードされた遺伝子産物と分泌されたＡＰＯＥ４との比は、０．１：１である。一実施形態では、哺乳動物における分泌されたベクターでコードされた遺伝子産物と分泌されたＡＰＯＥ４との比は、３：１である。一実施形態では、哺乳動物におけるコードされた遺伝子産物の発現のレベルは、認知低下（悪化）を防止または阻害するものである。一実施形態では、哺乳動物におけるコードされた遺伝子産物の発現のレベルは、タウのもつれおよびアミロイド蓄積を低減させるものである。

哺乳動物における脂質障害を予防、阻害、または治療するための方法であって、哺乳動物に、遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、組成物は、ベクターを含むリポソームを含む。一実施形態では、組成物は、核酸を含むナノ粒子を含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、組成物は、全身投与される。一実施形態では、組成物は、経口投与される。一実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一実施形態では、組成物は、局所投与される。一実施形態では、組成物は、注射される。一実施形態では、組成物は、中枢神経系に投与される。一実施形態では、組成物は、脳に投与される。一実施形態では、組成物は、徐放性組成物である。

一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、本明細書に記載のように修飾されたヒトＡＰＯＥ遺伝子をコードするＡＡＶ発現ベクターと、シスまたはトランスのいずれかで、内因性ＡＰＯＥ４を標的とする人工ｍｉＲＮＡと、を含む。このベクターシステムは、遺伝子治療ベクター、例えば、ＡＡＶベクターからの有益なＡＰＯＥ遺伝子の補充と組み合わせて、有害な内因性ＡＰＯＥ４の発現をサイレンシングする。例示的なマイクロＲＮＡ配列を、ヒトＡＰＯＥコード配列をコードするベクター導入遺伝子プラスミドのＣＡＧプロモーターイントロンまたはポリＡテールに組み込んだ。あるいは、マイクロＲＮＡを、ＰｏｌＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターと、ＡＰＯＥ発現カセットのポリＡ部位に続くターミネーターとの間に挿入してもよい。ベクター由来のヒトＡＰＯＥＤＮＡ配列は、マイクロＲＮＡによって抑制されないことを確実にするためにサイレントヌクレオチド変化を含み、検出のための、例えば、臨床前検出研究のための、ＨＡタグなどのタグを含み得る。一実施形態では、発現構築物は、ＣＮＳにおける内因性ＡＰＯＥ発現の顕著な部位であるアストロサイトおよび膠細胞を標的とする血清型のＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ９であるが、他のベクターであってもよい）中にパッケージングされる。

本明細書に記載されるベクターは、認知障害、認知症、アルツハイマー病（例えば、常染色体顕性、遅発性、または早発性のもの）を防止、阻害、または治療するために用いられてもよい。一実施形態では、哺乳動物は、ベクターの投与後、線維性アミロイドベータ斑負荷の低下、ペアードヘリカルフィラメントタウのレベルの低下、または神経変性の減少を有する。一実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、例えば、外傷性脳損傷、脳卒中、一過性虚血発作、認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、プリオン病、ピック病、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺と関連付けられる認知障害；ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）；前頭側頭型認知症、および１７番染色体に関連するパーキンソニズム；リティコ－ボディグ病；神経原線維変化優位型認知症；神経節膠腫および神経節細胞腫；髄膜血管腫症；亜急性硬化性全脳炎；鉛脳症、結核性硬化症、ハレルフォルデン－スパッツ症候群、およびリポフスチン症；嗜銀顆粒性疾患；または前頭側頭葉変性症を防止、阻害、または治療するために用いられてもよい。

本明細書に記載されるベクターはまた、高リポタンパク血症、例えば、Ｉ型、２型、３型、４型、または５型と関連付けられる１つ以上の症状を防止、阻害、または治療するために用いられてもよい。一実施形態では、投与された量のベクターにより、循環コレステロールが減少し、例えば、ＶＬＤＬおよび／もしくはＬＤＬが減少し、中間密度リポタンパク質が減少し、コレステロールおよび／もしくはトリグリセリドの血漿レベルが減少し、ＶＬＤＬを含有するトリグリセリドが減少し、糸球体毛細血管における脂質蓄積が減少し、糸球体内リポタンパク質が減少し、または血栓が減少する。

ＡＰＯＥ対立遺伝子、罹患率、およびアルツハイマー病の発症の関連リスクである。例示的なウイルス遺伝子治療である。遺伝子治療の例示的な投与経路である。異なるＡＰＯＥ対立遺伝子に対した選択されたアミノ酸残基、罹患率、およびアルツハイマー病の発症の関連リスクである。異なるＡＰＯＥ対立遺伝子内の２つの位置でのヌクレオチド残基である。ＡＰＯＥ３ｃｈ変異である。ＡＰＯＥ３ｃｈ変異の影響である。ヘパリンに対するＡＰＯＥ３ｃｈの親和性である。ＨＳＰＧへのＡＰＯＥまたはタウの結合についての可能性のある機序である。ある特定のＡＰＯＥ対立遺伝子の発現と関連付けられる疾患を防止、阻害、または治療するための例示的な遺伝子治療アプローチである。ＡＰＯＥ対立遺伝子の、顕性ＩＩＩ型高リポタンパク血症およびリポタンパク質糸球体症との関連性である。ＡＰＯＥＡＤのＡＡＶ媒介性送達による遺伝子治療により、リスクバリアントが減少した。ＡＰＯＥ４ホモ接合体はＡＤに対するリスクが１５～２０倍増加するという知見（Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９３、Ｈｅｆｆｅｒｍａｎｅｔａｌ．，２０１６）に基づいて、ＡＡＶベクターを使用して、ＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３バリアントのコード配列をＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアントとともに送達して、ＡＤに対するリスクを低減させる治療戦略を用いる。ＡＰＯＥバリアント、ＡＤに対するリスク、およびＡＰＯＥ４から保護するために提案された遺伝子治療である。ＡＰＯＥ２、３、および４は、一般的なバリアントである（Ｈｅｆｆｅｒｍａｎｅｔａｌ．，２０１６、ＡＬＸＦＯＲＵＭ，２０１０）。ＡＰＯＥ３ＣｈＣは、早期発症ＡＤ１９を引き起こすＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ顕性バリアントから保護するＡＰＯＥ３バックグラウンド上のＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異の症例報告における、ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａに重ね合わせたバリアントである。ＡＰＯＥ３ＣｈＣおよびＡＰＯＥ２ＣｈＣバリアントは、ＡＰＯＥ４ホモ接合体におけるＡＤの高いリスクを軽減するための治療であり得る。ＡＰＯＥ２ＣｈＣバリアントは、天然では観察されていないが、ＡＰＯＥ３ＣｈＣよりも効果的であり得る。＊ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａの背景では低い。ＰＳＥＮ１－Ｅ２８０変異を有する雌のＡＰＯＥ３ＣｈＣの相対的効果を裏付ける研究である。平均皮質アミロイド斑負荷（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ化合物８、ＰＥＴ）、下側頭皮質ＰＨＦタウ負荷（ＦｌｏｒａｔａｕｃｉｐｉｒＰＥＴ）、海馬体積（ＭＲＩ）、および楔前部グルコース代謝（ＦｌｕｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅＰＥＴ）に関する定量データを示す。黒色の点は、典型的な若年時にＭＣＩが発症したＰＳＥＮ１保因者であり、灰色の点は、ＭＣＩをまだ発症していないＰＳＥＮ１保因者であり、ＰＳＥＮ１保因者＋ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントを有する対象（矢印付きの赤色の点）である。図は、Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．（２０１９）からのものを修正した。Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異は、ＡＰＯＥのヘパリン結合を損なう。ＥＬＩＳＡを使用して、ヘパリンカラムからの異なるＡＰＯＥアイソフォームのＮａＣｌ溶出パターンにおける差異を定量した。図は、Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔ．ａｌ．（２０１９）から抜粋した。矢印は、ＡＰＯＥＣｈＣバリアントを有する対象を示す。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ベクターである。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、スプライスドナーおよびイントロン、ならびにウサギβ－グロビンスプライスアクセプターからなる構成的ＣＡＧプロモーターの後ろにヒトＡＰＯＥ２導入遺伝子を発現し、後にウサギβ－グロビンポリアデニル化シグナル（Ａ_ｎ）が続く。ｈＡＰＯＥ２発現カセットは、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接し、アカゲザルアデノ随伴ウイルスベクター血清型１０（ＡＡＶｒｈ．１０）キャプシドにパッケージ化される。この提案で使用するすべてのＡＰＯＥベクターは、ＡＰＯＥコード配列を除いて同一である。ＡＡＶｒｈ．１０Ｎｕｌｌベクターは同一であるが、発現カセットＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２は、翻訳不可能な配列によって代置される。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２を例として使用して、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示し、これは、予期される分子量と合致する３つのＡＡＶベクターキャプシドタンパク質と関連付けられる３つのバンドを示す。ＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２の嚢内投与後の非ヒト霊長類の脳におけるＡＰＯＥ２タンパク質の分布の評価である。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２（５×１０^１３ｇｃ、ＡＰＯＥ２導入遺伝子）を投与したＮＨＰを、治療の８週間後に評価した。右半球を１ｃｍ^３の立方体に細分化し、タンパク質ＡＰＯＥ２レベルについてＥＬＩＳＡで分析した。Ａ．脳切片におけるヒトＡＰＯＥ２タンパク質。Ｂ．ＣＳＦ（１０μｌ／時点）を３つの時点（投与前（０日目）、投与後２８日目および５６日目）で３つのＮＨＰからサンプリングし、ＳＯＳ－ＰＡＧＥにより分析した後、ウエスタンによるＡＰＯＥ２の抗体検出を行った。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．（２０１８）を参照されたい。図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＰＤＡＰＰマウスモデルにおけるアミロイド病変の分解能である。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２または対照ＡＡＶｒｈ．１０ｍＣｈｅｒｒｙ（１０^１０ｇｃ）を、９か月齢のＰＤＡＰＰマウスの海馬の両側に投与した。投与の８週間後、マウスを屠殺し、左半球の海馬を切除し、均質化し、ＲＩＰＡ（可溶性Ａβを表す）および５．５Ｍのグアニジン（不溶性Ａβを表す）で順次抽出した。Ａβ１～４２およびＡβ１～４０レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。ｎ＝群当たり１０～１２動物で、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２またはＡＡＶｒｈ．１０ｍＣｈｅｒｒｙを注射したＰＤＡＰＰマウスの海馬における、（Ａ）Ａβ１～４２の組織レベル、および（Ｂ）Ａβ１～４０の組織レベル。データは、平均±ＳＤとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｚｈａｏｅｔａｌ．（２０１６）を参照されたい。図２０Ａおよび図２０Ｂは、２．５か月齢のＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスの海馬におけるＡＰレベルに対するＡＰＯＥ２の海馬内送達の用量依存的効果である。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２（０．２５×１０^１０、０．５×１０^１０、または１×１０^１０ｇｃ）またはＡＡＶｒｈ．１０ｍＣｈｅｒｒｙ（１×１０^１０ｇｃ）を、２．５か月齢の雄ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスの海馬の両側に注射した。投与の８週間後、マウスを屠殺した。左半球の海馬を切除し、均質化し、ＲＩＰＡ（可溶性Ａβを表す）および５．５Ｍのグアニジン（不溶性Ａβ）で順次抽出した。各抽出物中のＡβ１～４２レベルを、ＥＬＩＳＡにより決定した。（Ａ）海馬中の不溶性Ａβ１～４２レベル（グアニジン抽出可能）。（Ｂ）海馬中の可溶性Ａβ１～４２レベル（ＲＩＰＡ抽出可能）。ｎ＝群当たり３～５動物。データは、平均±ＳＤとして提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｚｈａｏｅｔａｌ．（２０１６）。図２１Ａおよび図２１Ｂは、ＡＰＯＥ上のＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２の視床内送達、およびＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスの脳中のＡβレベルである。１０週齢のマウスに、ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２またはＡＡＶ９－ＧＦＰを、両側視床内注射（１０^１０ｇｃ）によって投与し、８週間後に屠殺した。左半球の視床、海馬、および大脳皮質を解剖し、均質化した。（Ａ）ＡＰＯＥおよび（Ｂ）Ａβ１～４２のレベルを、ＥＬＩＳＡにより定量した。Ｚｈａｏｅｔａｌ．から借用。インビトロでのＡＰＯＥのノックダウンである。Ｕ８７ヒト星細胞腫細胞を、ＡＰＯＥ標的化ｓｉＲＮＡまたは非標的化（ＮＴ）対照（５ｐｍｏｌ）でトランスフェクトした。細胞を７２時間後に収集し、内因性ＡＰＯＥｍＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲにより定量化した。複数のｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムの比較に基づいて、ＡＰＯＥのコード配列を標的とする４つの異なるｓｉＲＮＡを生成した。特定した配列は、以下のとおりであった：ＧＧＵＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＧＵＧＧＡＧｕｕ（配列番号２０）、ＧＧＡＧＵＵＧＡＡＧＧＣＣＵＡＣＡＡＡｕｕ（配列番号２１）、ＧＧＡＡＧＡＣＡＵＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧｕｕ（配列番号２２）、およびＧＣＧＣＧＣＧＧＡＵＧＧＡＧＧＡＧＡＵｕｕ（配列番号２３）。図２３Ａおよび図２３Ｂは、ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４発現カセットである。（Ａ）ｍｉｒＡＰＯＥ４の概略図である。ｓｉＲＮＡ標的化配列（ガイド鎖）と、プロセシングを促進するために選択されたミスマッチを有するアンチセンス配列（パッセンジャー鎖）とを、増強されたｍｉｒ１５５骨格に組み込む。（Ｂ）ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４発現構築物の概略図である。構築物は、構成的ＣＡＧプロモーター［サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、スプライスドナーおよびイントロン、ならびにウサギβ－グロビンスプライスアクセプター］の後ろに、ヘマグルチニンタグ（ＨＡ）に融合したヒトＡＰＯＥ２コード配列を含有し、後にウサギβ－グロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナルが続く。ｍｉｒＡＰＯＥ４縦列反復が、ＣＡＧイントロン、および／または導入遺伝子停止コドンとポリＡ配列との間のいずれかに挿入される。ｈＡＰＯＥ２発現カセットは、ＡＡＶ２逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接し、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージ化される。ｓｉＲＮＡ＃２からのｍｉＲ、例えば、ＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＴＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣ（配列番号２４）、ＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡ（配列番号２５）、またはＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＣＴＴＴＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＴＴＣＣＧＡＴＴＴＧＴＡＧＧＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＴＧＡＡＧＴＣＡＣＡＡＡＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡ（配列番号２６）を用いてもよい。イントロンおよびポリＡに位置するｍｉＲのノックダウン効率を試験する。ルシフェラーゼにより、ノックダウン効率がもたらされる。ＡＰＯＥ標的部位のみの対照を試験する。サイレントヌクレオチド変化を有するベクター由来ＡＰＯＥ２におけるｍｉＲＮＡ標的部位を特定する。ｐＡＡＶ－ｍｉＲＮＡ－ＡＰＯＥ－ＨＡを生成する。インビボ試験である。対照におけるルシフェラーゼ発現である。

詳細な説明
以下の説明では、その一部を形成する添付の図面が参照され、これらの図面は、実施され得る特定の実施形態を例解する目的で示される。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするために詳細に記載されており、他の実施形態が利用されてもよいこと、および本発明の範囲から逸脱することなく論理的な変更が行われてもよいことを理解されたい。したがって、例示的な実施形態の以下の説明は、限定的な意味で理解されるべきものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。

詳細な説明
定義
「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含むか、またはそれと会合し、インビトロまたはインビボのいずれかで、ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するために使用され得る巨大分子または巨大分子の会合を指す。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソーム、および他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。時には「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と称される、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコード配列（治療目的のタンパク質をコードする遺伝子など）、ワクチン開発における目的のコード配列（哺乳動物における免疫応答の誘発に好適なタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを発現するポリヌクレオチドなど）、および／または選択可能もしくは検出可能なマーカーを含み得る。

本明細書で使用される「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入する」は、細胞におけるポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入のためのプロセスを指す用語であり、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための組換えウイルスの使用を含む。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクション、または形質転換は、例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、およびウエスタンブロットによるタンパク質発現（定常状態レベルを含む）、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ノーザンブロット、サザンブロット、およびゲルシフト移動度アッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡの測定を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の方法によって決定され得る。外因性ポリヌクレオチドの導入のために使用される方法には、ウイルス感染またはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換、およびエレクトロポレーションなどの周知の技術、ならびに他の非ウイルス遺伝子送達技術が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にまたは一過性に維持され得る。

「遺伝子送達」は、遺伝子移入のための細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組み込み、および発現を包含し得る。

「遺伝子移入」は、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、およびレプリコン組み込みを包含し得るが、その後の遺伝子の発現とは異なり、それを意味しない、外因性ポリヌクレオチドの細胞中への導入を指す。

「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子の転写、翻訳、および翻訳後修飾のプロセスを指す。

「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、それに対してウイルス種が栄養性である細胞中に、それが送達することができるポリヌクレオチド構成要素を含むものである。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味しない。

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化またはキャッピングされたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る本明細書で使用されるポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換的に指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記載される任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作り上げることが知られているかまたは予想される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

「単離された」ポリヌクレオチド、例えば、プラスミド、ウイルス、ポリペプチド、または他の物質は、物質または類似の物質が、天然に存在するかまたは最初に調製される所に同様に存在し得る他の構成要素の少なくともいくらかを欠いている物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、供給源混合物からそれを濃縮することによって調製され得る。単離された核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、それが天然に見出される形態または状況とは異なる形態または状況で存在する。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）は、隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見出され、ＲＮＡ配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のｍＲＮＡとの混合物として細胞において見出される。単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸分子がタンパク質を発現させるために利用される場合、分子は、最低でもセンス鎖またはコード鎖を含有する（すなわち、分子は、一本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含有し得る（すなわち、分子は、二本鎖であり得る）。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定され得るか、または供給源混合物中に存在する第２の潜在的妨害物質との関連で測定され得る。本発明の実施形態の漸増的濃縮が想定される。したがって、例えば、２倍の濃縮、１０倍の濃縮、１００倍の濃縮、または１０００倍の濃縮。

「転写調節配列」は、それが作動可能に連結している遺伝子またはコード配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明における使用の転写調節配列は、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターを含み、１つ以上の転写のエンハンサーおよび／またはターミネーターもまた含み得る。

「作動可能に連結された」は、そのように記載された構成要素が、それらが協調的に機能することを可能にする関係にある、２つ以上の構成要素の配置を指す。例示として、転写調節配列またはプロモーターは、ＴＲＳまたはプロモーターが、コード配列の転写を促進する場合、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたＴＲＳは、一般に、コード配列とシスで連結されるが、必ずしもそれに直接的に隣接しない。

「異種」は、それが比較される実体とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型中に導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、そのネイティブなコード配列から取り出され、異なるコード配列に作動可能に連結されたプロモーターなどの転写調節エレメントは、異種転写調節エレメントである。

「ターミネーター」は、リードスルー転写を減弱させるまたは防止する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す（すなわち、ターミネーターの一方の側を起源とする転写が、ターミネーターの他方の側まで継続することを減弱させるまたは防止する）。転写が中断される程度は、典型的には、塩基配列および／またはターミネーター配列の長さに応ずる。特に、多数の分子生物学的システムにおいて周知であるように、一般に「転写終結配列」と称される特定のＤＮＡ配列は、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させること、および／または転写されているＤＮＡから離脱させることによって、中断する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例としては、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えば、ＳＶ４０ポリＡが挙げられる。そのような配列特異的ターミネーターに加えて、またはその代わりに、プロモーターとコード領域との間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に、介在配列の長さに比例して、コード領域の転写を中断する傾向がある。この効果は、おそらく、転写されているＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼ分子が離脱するようになるいくらかの傾向が常に存在し、コード領域に到達する前に横切られる配列の長さを増加させることが、一般に、コード領域の転写が完了する前、またはことによると開始される前にさえ離脱が生じる可能性を増加させることから生じる。したがって、ターミネーターは、一方向のみから（「一方向」ターミネーター）または両方向から（「二方向」ターミネーター）の転写を防止し得、配列特異的終結配列もしくは配列非特異的ターミネーター、またはその両方で構成され得る。様々なそのようなターミネーター配列が当該技術分野で既知であり、本発明の文脈内でのそのような配列の例示的な使用が以下に提供される。

「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」、および他のそのような用語は、本発明において、例えば、組換えウイルスまたは組換え融合ポリペプチドを産生するために有用な、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの高等真核細胞を示す。これらの細胞は、形質導入された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、必ずしも元の親細胞と完全に同一ではない（形態またはゲノム補完が）場合があることが理解される。

ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、および／またはライゲーションステップ、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の種々の組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元のポリヌクレオチド構築物の複製物、および元のウイルス構築物の子孫をそれぞれ含む。

「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を与え得、本来、増強的または阻害的であり得る。当該技術分野で既知の制御エレメントには、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３’方向）に位置するコード領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０、およびＡＡＶＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターが含まれる。

「発現ベクター」は、目的の遺伝子産物をコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞における遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するようにコード領域に作動可能に連結された制御エレメントを含む。制御エレメントと、発現のためにそれが作動可能に連結された１つまたは複数の遺伝子との組み合わせは、時には「発現カセット」と称され、その多数が、当該技術分野で既知であり、利用可能であるか、または当該技術分野で利用可能である構成要素から容易に構築され得る。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この用語はまた、修飾された（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質付加、または標識構成要素との抱合）アミノ酸ポリマーを包含する。

「外因性」という用語は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合、人工的なまたは天然の手段によって細胞または生物中に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は、異なる生物もしくは細胞からのものであり得、または生物もしくは細胞内で天然に存在する核酸の１つ以上の追加のコピーであり得る。非限定的な例として、外因性核酸は、天然細胞のものとは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ、天然に見出されるものとは異なる核酸配列に隣接している（例えば、１つの遺伝子からのプロモーターを、異なる遺伝子からの遺伝子産物のオープンリーディングフレームに連結する発現カセット）。

「形質転換された」または「トランスジェニック」は、少なくとも１つの組換えＤＮＡ配列の存在によって変化または増大させられた任意の宿主細胞または細胞株を含むように本明細書で使用される。本発明の宿主細胞は、典型的には、単離された直鎖ＤＮＡ配列としての、プラスミド発現ベクター中のＤＮＡ配列を用いるトランスフェクション、または組換えウイルスベクターでの感染によって産生される。

「配列相同性」という用語は、２つの核酸配列の間の塩基マッチの割合、または２つのアミノ酸配列の間のアミノ酸マッチの割合を意味する。配列相同性がパーセンテージとして表される場合（例えば、５０％）、パーセンテージは、何らかの他の配列と比較される、選択された配列の長さにわたるマッチの割合を示す。ギャップ（２つの配列のいずれかにおける）はマッチングを最大化するために許容され、１５塩基以下のギャップ長が通常使用される（６塩基以下、例えば、２塩基以下）。オリゴヌクレオチドをプローブまたは治療として使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、一般に、２０個の可能なオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうち１７個以上の標的塩基対マッチ（８５％）、１０個の可能な塩基対マッチのうち９個以上のマッチ（９０％）、または２０個の可能な塩基対マッチのうち１９個以上のマッチ（９５％）である。

２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的なまたは完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列が最大のマッチングのために整列させられたときに、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（マッチングされる２つの配列のいずれかにおける）は、マッチングの最大化において許容される（５以下または２以下のギャップ長）。あるいは、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸長のそれらに由来するポリペプチド配列）は、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティでプログラムＡＬＩＧＮを使用して５超（標準偏差単位）のアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書で使用されるように相同である。２つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸が、ＡＬＩＧＮプログラムを使用して最適に整列させられたときに５０％以上同一である場合、より相同である。

「対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に構造的に関連すること、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列の全部または一部に構造的に関連することを意味するために本明細書で使用され、例えば、それらは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば、９９％または１００％の配列同一性を有する。これと対比して、「相補的」という用語は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に相同であることを意味するために本明細書で使用される。例示のために、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。

「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに）ことを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチドごとに）ことを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、２つの最適に整列させられた配列を比較のウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両方の配列において生じる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書で使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも２０～５０個のヌクレオチドのウィンドウにわたって、参照配列と比較して少なくとも８５パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９０～９５パーセントの配列同一性、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を、比較のウィンドウにわたって、参照配列の合計２０パーセント以下になる欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することによって計算される。

「保存的」アミノ酸置換は、例えば、極性酸性アミノ酸としてのアスパラギン酸－グルタミン酸、極性塩基性アミノ酸としてのリジン／アルギニン／ヒスチジン、非極性または疎水性アミノ酸としてのロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン、極性または非荷電親水性アミノ酸としてのセリン／スレオニンである。保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づく群化を含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での同様な置換が、得られるポリペプチドの特性に対する大きな効果を有しないと予想することは合理的である。アミノ酸変化が機能性ポリペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチドの比活性をアッセイすることによって容易に決定され得る。天然に存在する残基は、一般的な側鎖特性に基づいて群に分けられる。（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および（６）芳香族；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

本開示はまた、非保存的置換を有するポリペプチドを想定する。非保存的置換は、上記のクラスのうちの１つのメンバーを別のものと交換することを必然的に伴う。

論拠
既存の薬物は、ＡＤの基礎疾患プロセスに対してほとんど効果がなく、現在利用可能な予防療法はない。ＡＤに対する有効な療法はないので、ＡＤに対する有効な療法は、大きな進歩となるであろう（Ｃｏｎｒａｄｏｅｔａｌ．，２０２０）。世界では、ＡＤは約３５００万例あり、６５歳超の個人の６％に影響を及ぼしており（Ｆａｎｎｅｔａｌ．，２０１８）、年間１９０万人の死因となっている（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｓＧＢＤＤ，２０１９、Ｈｅｂｅｒｔｅｔａｌ．，２０１３）。米国では、年間１２２，０００人超が死亡している。米国におけるＡＤ患者のケアの推定経済的負担は、年間３０５０億ドルである。ＡＰＯＥ４対立遺伝子は、世界人口の１３．７％を占め、ＡＤを有する患者においては、頻度がはるかに高い（Ｓａｆｉｅｈｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥ４の遺伝は、早期認知低下、早発性ＡＤ、および早期死亡を伴うより重篤な疾患と関連付けられる（Ｓａｆｉｅｈｅｔａｌ．，２０１９、Ｗｉｌｌｉａｍｓ２０２０、Ｒａｂｅｒｅｔａｌ．，２００４）。アミロイド、タウ、および他の病態を対象としたＡＤのための療法への試みは多くある。ＡＰＯＥ４対立遺伝子の遺伝は遅発性ＡＤの発症の最も強力な遺伝的リスク因子であるが、ＡＰＯＥ２対立遺伝子は保護的なものである。内因性ＡＰＯＥ４発現を減少させながらＡＰＯＥ２を永続的に送達するための遺伝子治療は、ＡＰＯＥ４ホモ接合性個体をＡＰＯＥ４発現が低下したＡＰＯＥ２／４ヘテロ接合体に効果的に変換し、ＡＤ発症のリスクを大幅に低減させ得る。さらに、ＡＰＯＥ４ホモ接合性個体は、症状の発症の何年も前に、自身の遺伝子型に従ってＡＡＶ遺伝子治療を受け得る。本戦略は、ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントが、早発性ＡＤを発症するＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ家系の個体を保護したという所見を生かして、戦略の発展を示す（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥ３ＣｈＣおよびＡＰＯＥ２ＣｈＣのＡＡＶ媒介性遺伝子移入は、アミロイドおよび／またはタウ病変において効果的であり得、ＡＰＯＥ２単独のＡＡＶ送達よりも効果的であり得る。

ＡＰＯＥ４がアミロイドおよびタウベースのＡＤ病変のリスクを増強するという知見に基づいて、ＡＰＯＥ２を用いたＣＮＳ遺伝子治療により、マウスモデルにおけるＡＰＯＥ４ベースのＡＤ病変が防止され得ることが実証された（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｄｏｄａｒｔｅｔａｌ．，２００５、Ｈｕｄｒｙｅｔａｌ．，２０１３）。この提案の主な革新は、固有の臨床観察（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）を、第２世代のより有効な遺伝子治療に変換することである。ＡＰＯＥ遺伝子型がＡＤの病因に重要な役割を果たし、ＡＤ関連病変の発症をＡＰＯＥ２が保護し、ＡＰＯＥ４がそのリスクを増加させることを示す広範な疫学的データがある（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｒａｂｅｒ２００４、Ｇｅｎｉｎｅｔａｌ．，２０１１、Ｓａｎｄｏｅｔａｌ．，２００８）。ホモ接合性ＡＰＯＥ３ＣｈＣのホモ接合性共遺伝の結果、ＡＰＯＥ４ホモ接合体のＣＮＳのＡＰＯＥ３ＣｈＣ遺伝子治療ベースの遺伝子修飾がＡＰＯＥ４駆動型ＡＤ関連病変の高いリスクを防止するようになることにより、コロンビア系ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ家系の個体の早発性ＡＤの発症が防止されたことが観察された。さらに、ＡＰＯＥ２を用いた遺伝子治療により、Ｅ４駆動型アミロイド関連病変が抑制されることを実証した以前の研究に基づき、ＡＰＯＥ２ＣｈＣ遺伝子治療は、ＡＰＯＥ４駆動型のアミロイド病変およびタウ病変の両方を防止し、ＡＰＯＥ２またはＡＰＯＥ３ＣｈＣよりも効果的にそれを行い得る。

例示的なＡＰＯＥ核酸およびアミノ酸配列
アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）は、体内の脂肪の代謝に関与する２９９アミノ酸タンパク質である。これは、脂肪に結合し、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）と相互作用するタンパク質のファミリーであり、これは、トリグリセリドが豊富なリポタンパク質の正常な処理に重要である。末梢組織では、ＡＰＯＥは、肝臓およびマクロファージによって産生され、コレステロール代謝を媒介する。中枢神経系では、ＡＰＯＥは、アストロサイトによって産生され、ＬＤＬＲファミリーのメンバーであるＡＰＯ受容体を介してコレステロールをニューロンに輸送する。主要なＡＰＯＥ対立遺伝子は、ＡＰＯＥ２（Ｃｙｓ１１２、Ｃｙｓ１５８）、ＡＰＯＥ３（Ｃｙｓ１１２、Ａｒｇ１５８）、およびＡＰＯＥ４（Ａｒｇ１１２、Ａｒｇ１５８）の３つである。

例示的なヒトＡＰＯＥ配列には、

、およびそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば、９９％または１００％の配列同一性を有する配列が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、一実施形態では、ＡＰＯＥ４は、３１Ｋ、４６Ｐ、７９Ｔ、１３０Ｒ、１６３Ｃ、２９２Ｈ、および／または３１４Ｒを有してもよく、ＡＰＯＥ２は、４３Ｃ、１５２Ｑ、１５４Ｃ／Ｓ、１６３Ｃ／Ｐ、１６４Ｑ、１７２Ａ、１７６Ｃ、２４２Ｑ、２４６Ｃ、２５４Ｅを有してもよい。

例示的なヒトＡＰＯＥ配列、例えば、ＡＰＯＥ２をコードする場合のサイレントヌクレオチド置換のための配列には、

または

または

、およびＡＰＯＥをコードする、それらと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上、例えば９９％または１００％の配列同一性を有する配列が含まれるが、これらに限定されない。

他の例示的なＡＰＯＥ配列には、

が含まれる。

１１２位および１５８位について、Ｅ２は２つのシステイン残基を含み、Ｅ３はシステインおよびアルギニンを含み、Ｅ４は両方の部位にアルギニン残基を含む。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡｐｏＥ２またはＡｐｏＥ３の背景でＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異体を発現するように調製される。ベクターは、野生型および疾患モデルマウスに導入され、発現および有効性の生物学的尺度が決定されてもよい。

遺伝子送達ベクター
本発明の範囲内の遺伝子送達ベクターには、単離された核酸、例えば、染色体外で維持され得るプラスミドベースのベクター、およびウイルスベクター、例えば、組換えアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス、またはアデノ随伴ウイルスが含まれるが、これらに限定されず、リポソーム、例えば、ＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ、ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ、またはＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥリポソームなどの中性またはカチオン性リポソーム中に存在する、および／あるいはＤＮＡ－抗ＤＮＡ抗体－カチオン性脂質（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）複合体または天然もしくは合成ポリマーなどの他の分子と会合したウイルスおよび非ウイルスベクターが含まれる。遺伝子治療ベクターは、本明細書に開示されるＡＰＯＥ、ＲＮＡｉ、および／または抗体もしくはその断片をコードしてもよい。例示的なウイルス遺伝子送達ベクターを以下に記載する。遺伝子送達ベクターは、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、頬側、直腸、静脈内、または冠状動脈内投与を含むが、これらに限定されない、任意の経路を介して投与され得、細胞への移入は、エレクトロポレーションおよび／またはイオントフォレシス、および／または細胞外マトリックスもしくはヒドロゲル、例えば、ヒドロゲルパッチなどの足場を使用して増強され得る。一実施形態では、ＣＮＳへの間接送達を促進するために、浸透促進剤は用いられない。

レトロウイルスベクター
レトロウイルスベクターは、宿主ゲノム中に安定かつ正確に組み込んで、長期導入遺伝子発現を提供するその能力を含むいくつかの特有の特徴を示す。これらのベクターは、全身感染および患者間伝播のリスクを最小化するために、感染性遺伝子粒子を除去するようにエクスビボで操作され得る。シュードタイプ化レトロウイルスベクターは、宿主細胞の向性を変化させ得る。

レンチウイルス
レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスを含むレトロウイルス科に由来する。しかしながら、分裂細胞のみに感染するレトロウイルスとは異なり、レンチウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染し得る。例えば、ヒト免疫不全ウイルスゲノムに基づくレンチウイルスベクターは、インビボでの心筋細胞の効率的な形質導入が可能である。レンチウイルスは特定の向性を有するが、水泡性口内炎ウイルスでのウイルスエンベロープのシュードタイプ化は、範囲がより広いウイルスをもたらす（Ｓｃｈｎｅｐｐｅｔａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６９：４２７（２００２））。

アデノウイルスベクター
アデノウイルスベクターは、ゲノムからのウイルス遺伝子発現を担う初期（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）遺伝子を欠失させることによって複製不全にされ得、染色体外形態で宿主細胞中に安定に維持される。これらのベクターは、複製細胞および非複製細胞の両方をトランスフェクトする能力を有し、特に、これらのベクターは、インビボで、例えば、方向注射または灌流の後に、心筋細胞を効率的に感染させることが示されている。アデノウイルスベクターは、インビボで治療遺伝子の一過性発現をもたらすことが示されており、７日でピークに達し、約４週間持続する。導入遺伝子発現の持続時間は、神経特異的プロモーターを利用するシステムにおいて改善され得る。加えて、アデノウイルスベクターは、非常に高い力価で産生させることができ、これにより、少量のウイルスで効率的な遺伝子移入が可能となる。

アデノ随伴ウイルスベクター
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、非病原性パルボウイルスに由来し、細胞免疫応答を本質的に誘起せず、大部分のシステムにおいて数か月持続する導入遺伝子発現をもたらす。さらに、アデノウイルスと同様に、アデノ随伴ウイルスベクターも、複製細胞および非複製細胞に感染する能力を有し、ヒトに対しては非病原性であると考えられる。さらに、それらは、持続的な心臓遺伝子移入のために有望であるように見受けられる（Ｈｏｓｈｉｊｉｍａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８：８６４（２００２）、Ｌｙｎｃｈｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８０：１９７（１９９７））。

ＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０（ＡＡＶゲノムが、キャプシドとは異なる供給源からのものであるキメラウイルスを含む）が含まれるが、これらに限定されない。

プラスミドＤＮＡベクター
プラスミドＤＮＡは、より入念なパッケージングシステムの不在を示すために、しばしば「裸のＤＮＡ」と称される。インビボでの心筋細胞へのプラスミドＤＮＡの直接注射が達成されている。プラスミドベースのベクターは、相対的に非免疫原性であり、非病原性であり、細胞ゲノム中に安定的に組み込まれる潜在力を有し、インビボでの有糸分裂後細胞における長期遺伝子発現をもたらす。例えば、プラスミドＤＮＡの筋肉注射後の分泌された血管新生因子の発現は、局限性導入遺伝子発現のレベルが比較的低いにもかかわらず、動物モデルにおいて有意な生物学的効果を示し、臨床的に有望であるように見受けられる（Ｉｓｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，４１５：２３４（２００２））。さらに、プラスミドＤＮＡは、血流中で迅速に分解され、したがって、遠位の器官系において導入遺伝子が発現する可能性は無視できるものである。プラスミドＤＮＡは、巨大分子複合体、例えば、リポソームまたはＤＮＡ－タンパク質複合体（例えば、以下参照）の一部として細胞に送達されてもよく、送達は、エレクトロポレーションを含む技法を使用して増強することができる。

例示的な非ウイルス製剤
例えば、保護的なＡＰＯＥ発現のための単離された核酸、抗体発現のためのベクター、またはＲＮＡｉ発現のためのベクターを含む生分解性粒子は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ＰＬＡおよびＰＧＡのコポリマー（すなわち、ポリ乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ））、ポリ－ε－カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ－アルキル－シアノ－アクリレート（ＰＡＣ）、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン）（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン（ＰＣＰＭ）、ＰＳＡ、ＰＣＰＰ、およびＰＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（シュードアミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］およびポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリヒドロキシ酪酸、もしくはＳ－カプロン酸、エラスチン、またはゼラチンを含み得るがこれらに限定されない生分解性ポリマー分子を含んでもよく、またはそれから形成されてもよい。（例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｍａｒｉｅｔａｌ．，ＣｏｌｌｏｉｄｓａｎｄＳｕｒｆａｃｅｓＢ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ７５（２０１０）１－１８、ならびに米国特許第６，９１３，７６７号、第６，８８４，４３５号、第６，５６５，７７７号、第６，５３４，０９２号、第６，５２８，０８７号、第６，３７９，７０４号、第６，３０９，５６９号、第６，２６４，９８７号、第６，２１０，７０７号、第６，０９０，９２５号、第６，０２２，５６４号、第５，９８１，７１９号、第５，８７１，７４７号、第５，７２３，２６９号、第５，６０３，９６０号、および第５，５７８，７０９、ならびに米国出願公開第２００７／００８１９７２号、ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１２／１１５８０６および第ＷＯ２０１２／０５４４２５号を参照されたい）。

生分解性ナノ粒子は、当該技術分野で既知の方法によって調製され得る。（例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｇａｖａｒｍａｅｔａｌ．，ＡｓｉａｎＪ．ｏｆＰｈａｒｍａ．ＡｎｄＣｌｉｎ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ５，Ｓｕｐｐｌ３，２０１２，１６～２３頁、Ｃｉｓｍａｒｕｅｔａｌ．，Ｒｅｖ．Ｒｏｕｍ．Ｃｈｉｍ．，２０１０，５５（８），４３３－４４２、ならびに国際出願公開第ＷＯ２０１２／１１５８０６号および第ＷＯ２０１２／０５４４２５を参照されたい）。ナノ粒子を調製するための好適な方法には、溶媒蒸発、ナノ沈殿、乳化／溶媒拡散、塩析、透析、および超臨界流体技術を含み得るが、これらに限定されない、予め形成されたポリマーの分散液を利用する方法が含まれ得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、ダブルエマルジョン（例えば、水中油中水）を形成し、その後溶媒蒸発を行うことによって調製され得る。開示される方法によって得られたナノ粒子は、所望により、洗浄および凍結乾燥などのさらなる処理ステップに供され得る。任意選択で、ナノ粒子は、保存剤（例えば、トレハロース）と合わされ得る。

典型的には、ナノ粒子は、１ミクロン未満の平均有効径を有し、例えば、ナノ粒子は、約２５ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、または約４５０ｎｍ～６５０ｎｍの平均有効径を有する。粒子のサイズ（例えば、平均有効径）は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）、ナノ粒子表面積モニター（ＮＳＡＭ）、凝縮式粒子計数器（ＣＰＣ）、微分型電気移動度分析器（ＤＭＡ）、走査型電気移動度粒径測定器（ＳＭＰＳ）、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）、Ｘ線回折（ＸＲＤ）、エアロゾル飛行時間型質量分析法（ＡＴＦＭＳ）、およびエアロゾル粒子質量分析器（ＡＰＭ）を含み得るが、これらに限定されない当該技術分野で既知の方法によって評価され得る。

生分解性ナノ粒子は、標的細胞による取り込みを容易にするゼータ電位を有し得る。典型的には、ナノ粒子は、０超のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約５ｍＶ～約４５ｍＶ、約１５ｍＶ～約３５ｍＶ、または約２０ｍＶ～約４０ｍＶのゼータ電位を有する。ゼータ電位は、電気泳動移動度または動的電気泳動移動度を含む特徴によって決定され得る。電気運動現象および電気音響現象を利用して、ゼータ電位を計算し得る。

一実施形態では、非ウイルス送達ビヒクルは、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、異なる分子量（例えば、２、２２、および２５ｋＤａ）を有する直鎖および／もしくは分岐ＰＥＩ、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）およびポリメトアクリレートなどのデンドリマー、カチオン性リポソーム、カチオン性エマルション、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＯＰＥ、もしくはＤＣコレステロールを含むが、これらに限定されない脂質、ポリ－Ｌ－リジンもしくはプロタミンを含むが、これらに限定されないペプチドベースのベクター、またはポリ（β－アミノエステル）、キトサン、ＰＥＩ－ポリエチレングリコール、ＰＥＩ－マンノース－デキストロース、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、もしくはＲＮＡｉＭＡＸを含むがこれらに限定されないポリマーを含む。

一実施形態では、送達ビヒクルは、種々のポリヌクレオチド型と複合体形成し、ナノ粒子を形成する能力を有する、グリコポリマーベースの送達ビヒクルであるポリ（グリコアミドアミン）（ＰＧＡＡ）である。これらの材料は、種々の炭水化物（Ｄ－グルカレート（Ｄ）、メソ－ガラクタレート（Ｇ）、Ｄ－マンナレート（Ｍ）、およびＬ－タータレート（Ｔ））のメチルエステルまたはラクトン誘導体を、一連のオリゴエチレンアミンモノマー（１～４個のエチレンアミンを含有する）と重合することによって作製される（ＬｉｕａｎｄＲｅｉｎｅｋｅ，２００６）。ポリマー反復単位中のこれらの炭水化物および４つのエチレンアミンから構成されるサブセットは、卓越した送達効率をもたらした。

一実施形態では、送達ビヒクルは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ＰＥＩ－ＰＥＧ、ＰＥＩ－ＰＥＧ－マンノース、デキストラン－ＰＥＩ、ＯＶＡ抱合体、ＰＬＧＡ微粒子、もしくはＰＡＭＡＭでコーティングされたＰＬＧＡ微粒子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。開示されるカチオン性ポリマーには、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが含まれ得るが、これに限定されない。本開示のナノ粒子を調製するために好適なポリアミドアミンデンドリマーには、第３、第４、第５、または少なくとも第６世代のデンドリマーが含まれ得る。

一実施形態では、送達ビヒクルは、脂質、例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロペル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－スペルミンカルボキサミド］エチル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアンモニウムトリフルオルアセテート（ＤＯＳＰＡ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジミリストルオキシ）プロピル］、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３－β－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリセリルスペルミン（ＤＯＧＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）、またはイメチルジオクタデクリアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）を含む。カチオン性脂質の正に荷電した親水性頭部基は、通常、第三級および第四級アミン、ポリアミン、アミジニウム、またはグアニジニウム基などのモノアミンからなる。一連のピリジニウム脂質が開発されている（Ｚｈｕｅｔａｌ．，２００８、ｖａｎｄｅｒＷｏｕｄｅｅｔａｌ．，１９９７、Ｉｌｉｅｓｅｔａｌ．，２００４）。ピリジニウムカチオン性脂質に加えて、他の型の複素環式頭部基には、イミダゾール、ピペリジン、およびアミノ酸が含まれる。カチオン性頭部基の主な機能は、負に荷電した核酸を、わずかに正に荷電したナノ粒子に静電相互作用によって縮合し、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出の増強をもたらすことである。

ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、およびＳＡＩＮＴ－２、またはＤＯＤＡＣなどの２つの直鎖脂肪酸鎖を有する脂質は、テトラアルキル脂質鎖界面活性剤であるＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）の二量体と同様に、送達ビヒクルとして用いられ得る。その疎水性鎖長にかかわらず（Ｃ_１６：１、Ｃ_１８：１、およびＣ_２０：１）、すべてのトランス配向脂質は、それらのシス配向対応物と比較してトランスフェクション効率を増強させるようである。

送達ビヒクルとして有用なカチオン性ポリマーの構造には、キトサンおよび直鎖ポリ（エチレンイミン）などの直鎖ポリマー、分岐ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）などの分岐ポリマー、シクロデキストリンなどの環様ポリマー、架橋ポリ（アミノ酸）（ＰＡＡ）などのネットワーク（架橋）型ポリマー、ならびにデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。デンドリマーは、そこからいくつかの高度に分岐したアームが「成長」して、対称または非対称の様式で樹様構造を形成する、中心コア分子からなる。デンドリマーの例としては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）およびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドリマーが挙げられる。

ＤＯＰＥおよびコレステロールは、カチオン性リポソームを調製するために一般的に使用される中性共脂質である。分岐ＰＥＩ－コレステロール水溶性リポポリマー抱合体は、カチオン性ミセルに自己組織化する。非イオン性ポリマーであるＰｌｕｒｏｎｉｃ（ポロキサマー）、ならびにＰｌｕｒｏｎｉｃＬ６１およびＦ１２７の組み合わせであるＳＰ１０１７もまた使用され得る。

一実施形態では、ＰＬＧＡ粒子は、カプセル化頻度を増加させるために用いられるが、ＰＬＬとの複合体形成もまた、カプセル化効率を増加させ得る。他のカチオン性材料、例えば、ＰＥＩ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣ－Ｃｈｏｌ、またはＣＴＡＢは、ナノスフェアを作製するために使用され得る。

一実施形態では、複合体は、ポロキサマー、ポリアクリルアミド、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、カルボキシビニルポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４、ＧｏｏｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）、セルロース誘導体、例えば、メチルセルロース、酢酸セルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンもしくはポリビニルアルコール、またはそれらの組み合わせのヒドロゲルを含むが、これらに限定されない材料中に包埋されるか、またはそれにアプライされる。

いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマー材料は、コラーゲン、例えば、ヒドロキシル化コラーゲン、フィブリン、ポリ乳酸－ポリグリコール酸、またはポリ無水物などの生分解性ポリマーに由来する。他の例には、任意の生体適合性ポリマー（親水性、疎水性、または両親媒性のいずれでも）、例えば、エチレン酢酸ビニルコポリマー（ＥＶＡ）、ポリメチルメタクリレート、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー、ポリ（エチレングリコール）／ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）ブロックコポリマー、ポリグリコリド、ポリラクチド（ＰＬＬＡまたはＰＤＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、またはポリ（ジオキサノン）（ＰＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。

別の実施形態では、生体適合性材料には、ポリエチレンテレフアレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのコポリマー、ポリグリコール酸およびポリヒドロキシアルカノエートの組み合わせ、ゼラチン、アルギネート、ポリ－３－ヒドロキシブチレート、ポリ－４－ヒドロキシブチレート、ならびにポリヒドロキシオクタノエート、ならびにポリアクリロニトリルポリビニルクロリドが含まれる。

一実施形態では、以下のポリマー、例えば、デンプン、キチン、グリコサミノグリカン、例えば、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、およびクロンドロチン硫酸などの天然ポリマー、ならびに微生物ポリエステル、例えば、ヒドロキシバレレートおよびヒドロキシブチレートコポリマーなどのヒドロキシアルカノエート、ならびに合成ポリマー、例えば、ポリ（オルトエステル）およびポリ無水物、ならびにグリコリドおよびラクチドのホモおよびコポリマーを含む（例えば、ポリ（Ｌ－ラクチド、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド、ポリグリコリドおよびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポル（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コグリコリド）、ポリ（乳酸コリジン）、およびポリカプロラクトンが用いられ得る。

一実施形態では、生体適合性材料は、単離された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する。ＥＣＭは、種々の細胞集団、組織、および／または器官の内皮層、例えば、温血脊椎動物の皮膚、肝臓、消化管、気道、腸管、尿路、または生殖器の真皮を含む任意の器官または組織供給源から単離され得る。本発明において用いられるＥＣＭは、供給源の組み合わせからものであり得る。単離されたＥＣＭは、シートとして、粒子形態、ゲル形態などで調製され得る。

生体適合性足場ポリマーは、シルク、エラスチン、キチン、キトサン、ポリ（ｄ－ヒドロキシ酸）、ポリ（無水物）、またはポリ（オルトエステル）を含み得る。より具体的には、生体適合性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、乳酸およびグリコール酸のポリエチレングリコールとのコポリマー、ポリ（Ｅ－カプロラクトン）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）、ポリ（ｐ－ジオキサノン）、ポリプロピレンフマレート、ポリ（オルトエステル）、ポリオール／ジケテンアセタール付加ポリマー、ポリ（セバシン酸無水物）（ＰＳＡ）、ポリ（カルボキシビスカルボキシフェノキシフェノキシヘキソン（ＰＣＰＰ）ポリ［ビス（ｐ－カルボキシフェノキシ）メタン］（ＰＣＰＭ）、ＳＡ、ＣＰＰ、およびＣＰＭのコポリマー、ポリ（アミノ酸）、ポリ（シュードアミノ酸）、ポリホスファゼン、ポリ［（ジクロロ）ホスファゼン］またはポリ［（オルガノ）ホスファゼン］の誘導体、ポリ－ヒドロキシ酪酸、またはＳ－カプロン酸、ポリラクチド－コ－グリコリド、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、セルロース、酸化セルロース、アルギネート、ゼラチン、またはそれらの誘導体で形成され得る。

したがって、ポリマーは、天然に存在するポリマー、合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを含むポリマーを含む広範囲の材料のいずれかで形成され得る。一実施形態では、足場は、生分解性ポリマーを含む。一実施形態では、天然に存在する生分解性ポリマーは、天然に存在するポリマーに由来する合成生分解性ポリマーを提供するために修飾され得る。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（乳酸）（「ＰＬＡ」）またはポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）である。一実施形態では、足場ポリマーには、アルギネート、キトサン、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、キシログルカン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、シリコーン、疎水性ポリエステルおよび親水性ポリエステル、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）、Ｎ－イソプロイルアクリルアミドコポリマー、ポリ（エチレンオキシド）／ポリ（プロピレンオキシド）、ポリ乳酸、ポリ（オルトエステル）、ポリ無水物、ポリウレタン、２－ヒドロキシエチルメタクリレートおよびメタクリル酸ナトリウムのコポリマー、ホスホリルコリン、シクロデキストリン、ポリスルホンおよびポリビニルピロリジン、デンプン、ポリ－Ｄ，Ｌ－乳酸－パラ－ジオキサノン－ポリエチレングリコールブロックコポリマー、ポリプロピレン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ－イプシロン－カプロラクトン、または架橋キトサンヒドロゲルが含まれるが、これらに限定されない。

あるいは、核酸またはベクターは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され得るが、他の投薬量は有益な結果を与え得る。

医薬組成物
本発明は、上記の遺伝子移入ベクターと、薬学的に許容される（例えば、生理学的に許容される）担体とを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる組成物を提供する。組成物が、遺伝子移入ベクターと、薬学的に許容される担体とから本質的になる場合、組成物に実質的に影響を与えない追加の構成要素（例えば、アジュバント、緩衝剤、安定化剤、抗炎症剤、可溶化剤、保存剤など）が含まれ得る。組成物が、本発明の遺伝子移入ベクターと、薬学的に許容される担体とからなる場合、組成物は、いかなる追加の構成要素も含まない。いずれの好適な担体も本発明の文脈内で使用することができ、そのような担体は、当該技術分野で周知である。担体の選択は、部分的に、組成物が投与され得る特定の部位、および組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。組成物は、任意選択で、本明細書に記載される遺伝子移入ベクターを例外として、無菌であり得る。組成物は、貯蔵のために凍結または凍結乾燥され、使用前に好適な無菌担体中で再構成され得る。組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ，ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２００１）に記載される従来の技術に従って生成され得る。

組成物に好適な製剤には、水性および非水性溶液、等張無菌溶液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有し得る）、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアル中で提示され得、使用直前に無菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とする、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得る。即時性溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。一実施形態では、担体は、緩衝食塩水溶液である。一実施形態では、本発明の遺伝子移入ベクターは、投与前に遺伝子移入ベクターを損傷から保護するように製剤化された組成物中で投与される。例えば、組成物は、ガラス器具、シリンジ、または針などの遺伝子移入ベクターを調製、貯蔵、または投与するために使用されるデバイス上での遺伝子移入ベクターの損失を低減するように製剤化され得る。組成物は、遺伝子移入ベクターの光感受性および／または温度感受性を減少させるように製剤化され得る。この目的のために、組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体、およびポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を含み得る。そのような組成物の使用は、遺伝子移入ベクターの保存期間を延長し、投与を容易にし、本発明の方法の効率を増加させる。遺伝子移入ベクター含有組成物のための製剤は、例えば、Ｗｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．，６（２）：１７４－１７８（２００３）、およびＷｒｉｇｈｔｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，１２：１７１－１７８（２００５））にさらに記載されている。

組成物はまた、形質導入効率を高めるように製剤化され得る。加えて、当業者は、本発明の遺伝子移入ベクターが、他の治療剤または生物活性剤とともに組成物中に存在し得ることを理解するであろう。例えば、イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、遺伝子移入ベクターのインビボ投与と関連付けられる腫脹および炎症を低減するために組成物の一部となり得る。免疫系刺激剤またはアジュバント、例えば、インターロイキン、リポ多糖、および二本鎖ＲＮＡ。抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺真菌剤は、既存の感染症を治療するため、および／または遺伝子移入処置と関連付けられる感染症などの将来の感染症のリスクを低減するために存在し得る。

注射用デポー形態は、ポリラクチド－ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で、対象化合物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度は制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤はまた、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによって調製される。

特定の実施形態では、製剤は、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそのコポリマー、セルロース、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、多糖、タンパク質、ポリヒアルロン酸、ポリシアノアクリレート、ならびにそれらのブレンド、混合物、またはコポリマーからなる群から選択される生体適合性ポリマーを含む。

組成物は、スポンジ、生体適合性メッシュワーク、機械的リザーバー、または機械的インプラントなどの、制御放出または徐放を可能にするデバイスの中または上で投与され得る。インプラント（例えば、米国特許第５，４４３，５０５号を参照されたい）、デバイス（例えば、米国特許第４，８６３，４５７号を参照されたい）、例えば、植え込み型デバイス、例えば、機械的リザーバー、またはポリマー組成物で構成されたインプラントもしくはデバイスは、遺伝子移入ベクターの投与に特に有用である。組成物はまた、例えば、ゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ポリホスホエステル、例えば、ビス－２－ヒドロキシエチル－テレフタレート（ＢＨＥＴ）、および／またはポリ乳酸－グリコール酸を含む徐放性製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号を参照されたい）の形態で投与され得る。

哺乳動物に投与される組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は、哺乳動物のサイズ（質量）、あらゆる副作用の程度、特定の投与経路などを含むいくつかの要因に依存する。一実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される遺伝子移入ベクターを含む「治療有効量」の組成物を投与することを含む。「治療有効量」は、所望される治療結果を達成するための必要に応じた期間および投薬量で、有効な量を指す。治療有効量は、疾患または障害の程度、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望される応答を誘発する遺伝子移入ベクターの能力などの要因に応じて変動し得る。特定の治療効果を達成するための組成物中の遺伝子移入ベクターの用量は、典型的には、細胞当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／細胞）または体重キログラム当たりのベクターゲノムコピー（ｇｃ／ｋｇ）の単位で投与される。当業者であれば、これらおよび当該技術分野で周知である他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するための適切な遺伝子移入ベクター用量範囲を容易に決定することができる。治療有効量は、１×１０^１０ゲノムコピー～１×１０^１３ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１×１０^１１ゲノムコピー～１×１０^１４ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１×１０^７ゲノムコピー～１×１０^１０ゲノムコピーであり得る。治療有効量は、１×１０^１４ゲノムコピー～１×１０^１７ゲノムコピーであり得る。７０ｋｇのヒトを想定すると、用量範囲は、１．４×１０^８ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１１ｇｃ／ｋｇ、１．４×１０^９ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１２ｇｃ／ｋｇ、１．４×１０^１０ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１３ｇｃ／ｋｇ、または１．４×１０^１１ｇｃ／ｋｇ～１．４×１０^１４ｇｃ／ｋｇであり得る。

一実施形態では、組成物は、哺乳動物に１回投与される。組成物の単回投与は、最小の副作用で哺乳動物において持続的な発現をもたらし得ると考えられる。しかしながら、特定の場合では、組成物への細胞の十分な曝露を確実にするために、治療期間の間に組成物を複数回投与することが適切であり得る。例えば、組成物は、治療期間の間に、哺乳動物に２回以上（例えば、２、３、４、５、６、６、８、９、または１０回、またはそれ以上）投与され得る。

本開示は、上記の核酸配列を含む治療有効量の遺伝子移入ベクターを含む、薬学的に許容される組成物を提供する。

投与経路、投薬量、および投薬形態
例えば、本発明に従う遺伝子送達ベクターの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、および熟練施術者に既知の他の要因に応じて、連続的であっても断続的であってもよい。遺伝子送達ベクターの投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であってもよく、一連の間隔を空けた用量で行われてもよい。局所投与、例えば、頭蓋内、鼻腔内、または髄腔内と、例えば血液脳関門を通過するウイルスを使用する全身投与との両方が企図される。任意の投与経路、例えば、静脈内、鼻腔内、または気管支内、肺への直接投与、および胸膜内が用いられ得る。一実施形態では、組成物は、胸膜に送達されてもよい。

任意選択で徐放用に製剤化されてもよい、遺伝子送達ベクターを含む１つ以上の好適な単位剤形は、頭蓋内、髄腔内、もしくは鼻腔内を含む様々な経路、または直腸、口腔、膣、および舌下、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、もしくは肺内経路を含む、ＣＮＳ、もしくは経口、もしくは非経口に送達するための他の手段によって投与され得る。製剤は、適切な場合、個別の単位剤形で簡便に提示されてもよく、薬学的に周知の方法のいずれによって調製されてもよい。そのような方法には、ベクターを、液体担体、固体マトリックス、半固体担体、細かく分割された固体担体、またはそれらの組み合わせと会合させ、次いで必要に応じて、生成物を所望の送達系に導入または成形するステップが含まれ得る。

特定の転帰を達成するために投与される遺伝子送達ベクターの量は、選択される遺伝子およびプロモーター、状態、患者固有のパラメータ、例えば、身長、体重、および年齢、ならびに予防または治療が達成されるかどうかを含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて変化することになる。

本発明のベクターは、例えば脳への投与に好適な製剤の形態で簡便に提供され得る。好適な投与形式は、医師が、標準手順に従って、各患者について個々に決定するのが最善であり得る。好適な薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準的な製剤論文、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。「薬学的に許容される」とは、製剤の他の成分と適合性であり、かつそのレシピエントに有害ではない担体、希釈剤、賦形剤、および／または塩を意味する。

本発明のベクターは、中性ｐＨ、例えば、約ｐＨ６．５～約ｐＨ８．５、または約ｐＨ７～８の溶液中で、溶液をほぼ等張性にするための賦形剤、例えば、４．５％のマンニトールまたは０．９％の塩化ナトリウムを用い、一般に安全とみなされるリン酸ナトリウムなどの当該技術分野で既知である緩衝液でｐＨを緩衝して、メタクレゾール０．１％～０．７５％、または０．１５％～０．４％のメタクレゾールなどの許容される防腐剤と一緒に、製剤化され得る。所望の等張性を得ることは、塩化ナトリウム、またはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール（マンニトールおよびソルビトールなど）、または他の無機もしくは有機溶質などの他の薬学的に許容される薬剤を使用して達成することができる。塩化ナトリウムは、ナトリウムイオンを含有する緩衝液に有用である。所望される場合、上記組成物の溶液を調製して、保存期間および安定性を向上させることもできる。本発明の治療的に有用な組成物は、概して許容されている手順に従って成分を混合することによって調製することができる。例えば、選択された構成要素を混合して、濃縮された混合物を生成することができ、その後これを、ｐＨを制御するための水および／もしくは緩衝液、または張力を制御するための追加の溶質の添加により、最終濃度および粘度に調整してもよい。

ベクターは、１つまたは複数の用量で有効な量のベクターを含有する剤形で提供することができる。ウイルスベクターについては、有効用量は、少なくとも約１０^７ウイルス粒子、例えば、約１０^９ウイルス粒子、または約１０^１１ウイルス粒子の範囲であってもよい。添加されるウイルス粒子の数は、最大１０^１４であってもよい。例えば、ウイルス発現ベクターを用いる場合、約１０^８～約１０^６０ｇｃのウイルスベクターを、核酸として、またはパッケージ化ビリオンとして、投与することができる。いくつかの実施形態では、例えば０．５～１０ｍＬ当たり、約１０^９～約１０^１５コピーのウイルスベクターを、核酸として、またはパッケージ化ビリオンとして、投与することができる。あるいは、核酸またはベクターは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され得るが、他の投薬量は有益な結果を与え得る。投与される量は、投与に選択される核酸またはベクター、疾患、哺乳動物の体重、身体状態、健康、および／または年齢を含むがこれらに限定されない、様々な要因に応じて変化することになる。そのような要因は、当該技術分野で利用可能である動物モデルまたは他の試験システムを用いて、臨床医により容易に決定され得る。上述のように、投与される正確な用量は、主治医によって決定されるが、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水中にあってもよい。プラスミドＤＮＡ単独、または他の巨大分子と複合体化させたプラスミドＤＮＡの送達には、投与されるＤＮＡの量は、レシピエントに有益な効果をもたらす量となる。例えば、個々の用量または分割用量で、０．０００１～１ｍｇ以上、例えば、最大１ｇ、例えば、０．００１～０．５ｍｇ、または０．０１～０．１ｍｇのＤＮＡを投与することができる。

例えば、ウイルス発現ベクターを用いる場合、約１０^８～約１０^６０ｇｃのウイルスベクターを、核酸として、またはパッケージ化ビリオンとして、投与することができる。いくつかの実施形態では、例えば０．５～１０ｍＬ当たり、約１０^９～約１０^１５コピーのウイルスベクターを、核酸として、またはパッケージ化ビリオンとして、投与することができる。あるいは、核酸またはベクターは、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与され得るが、他の投薬量は有益な結果を与え得る。

一実施形態では、投与は、適切なカテーテルまたは針を使用した、頭蓋内、脳室内、嚢内、腰椎、肝内、気管内、または気管支内への注射または注入によって行われてもよい。当該技術分野で既知のように、様々なカテーテルが送達を達成するために使用され得る。例えば、様々な汎用カテーテル、ならびに本発明で使用するのに好適な改造カテーテルが、商業的供給業者から入手可能である。また、送達が脳または肺の特定の領域への直接注入により達成される場合、当該技術分野で既知のように、ある数のアプローチを使用して、カテーテルをその領域に導入することができる。

例解目的で、リポソームおよび他の脂質含有遺伝子送達複合体を使用して、１つ以上の導入遺伝子を送達することができる。遺伝子送達のためのそのような複合体の調製および使用の原理は、当該技術分野で説明されている（例えば、Ｌｅｄｌｅｙ，（１９９５）、Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９９５）、Ｃｈｏｎｎｅｔａｌ．，（１９９５）、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄｅｔａｌ．，（１９９５）、Ｂｒｉｇｈａｍｅｔａｌ．，（１９９３）を参照されたい）。

遺伝子送達ベクターを含有する医薬製剤は、周知であり容易に入手可能な成分を使用して、当該技術分野で既知の手順によって調製することができる。例えば、薬剤は、一般的な賦形剤、希釈剤、または担体とともに製剤化し、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、粉末剤などに形成することができる。本発明のベクターは、例えば、筋肉内、皮下、または静脈内経路による、非経口投与に適切なエリキシル剤または溶液剤として製剤化することもできる。

ベクターの医薬製剤は、水溶液もしくは無水溶液、例えば、凍結乾燥製剤、もしくは分散液の形態、または代替的にエマルションもしくは懸濁液の形態をとることもできる。

一実施形態では、ベクターは、例えば、注射、例えば、ボーラス注射またはカテーテルを介した連続注入による投与のために製剤化されてもよく、アンプル、事前充填されたシリンジ、小容量注入容器中、または防腐剤が添加された複数回投薬容器中、単位用量形態で提示されてもよい。活性成分は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの調合剤を含有してもよい。あるいは、有効成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、滅菌された発熱物質を含まない水で構成するための、滅菌固体の無菌単離によってまたは溶液から凍結乾燥によって得られる粉末形態であってもよい。

これらの製剤には、従来技術で周知である、薬学的に許容されるビヒクルおよびアジュバントが含有され得る。例えば、生理学的観点から許容される１つ以上の有機溶媒を使用して、溶液を調製することが可能である。

吸入による上気道（鼻）または下気道への投与の場合、ベクターは、吹送器、噴霧器、加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から、簡便に送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスなどの好適な噴射剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。

あるいは、吸入または吹送による投与のため、組成物は、乾燥粉末、例えば、治療剤とラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、例えばカプセルもしくはカートリッジ、または例えばゼラチンもしくはブリスターパック中の単位剤形で提示されてもよく、それから、吸入器、吹送器、または計量用量吸入器を活用して、粉末が投与されてもよい。

鼻腔内投与のためには、ベクターは、点鼻薬、液体スプレーを介して、例えば、プラスチック製ボトル噴霧器または計量用量吸入器を介して、投与されてもよい。噴霧器の典型的なものは、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。

ベクターの局所送達は、例えば、カテーテルまたは針を使用して、ベクターを疾患の部位でまたはその付近で投与する様々な技法によって行うこともできる。部位特異的なまたは標的化した局所送達技法の例は、限定することを意図するものではなく、利用可能な技法を例解するものである。例としては、注入または留置カテーテルなどの局所送達カテーテル、例えば、針注入カテーテル、シャントおよびステント、または他の植え込み型デバイス、部位特異的担体、直接注入、または直接塗布が挙げられる。

本明細書に記載の製剤および組成物は、抗菌剤または防腐剤などの他の成分も含有し得る。

対象
対象は、ヒト、ヒトおよび非ヒト動物を含むいずれの動物であってもよい。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれるが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどの哺乳動物が対象であってもよい。対象はまた、家畜、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽、およびウマ、またはペット、例えば、イヌおよびネコであり得る。

一実施形態では、対象には、ヒト対象が含まれる。対象は、一般に、当業者、例えば、医師によって状態と診断される。

本明細書に記載される本発明の方法は、いずれの種、性別、年齢、民族集団、または遺伝子型の対象にも用いることができる。したがって、対象という用語には、男性および女性を含み、高齢者、高齢者～成人移行年齢対象、成人、成人～前成人移行年齢対象、ならびに思春期、小児、および乳幼児を含む前成人が含まれる。

ヒト民族集団の例としては、コーカサス人、アジア人、ヒスパニック、アフリカ人、アフリカ系アメリカ人、ネイティブアメリカン、セム人、およびパシフィックアイランダーズが挙げられる。本発明の方法は、コーカサス人、特に北欧人集団、ならびにアジア人集団などのいくつかの民族集団に対して、より適切であってもよい。

対象という用語はまた、上記のように、それらが治療を必要とする限り、いずれの遺伝子型または表現型の対象も含む。加えて、対象は、任意の毛髪の色、眼の色、皮膚の色、またはそれらの任意の組み合わせのための遺伝子型または表現型を有し得る。

対象という用語は、任意の身長、体重、または任意の器官もしくは身体部分のサイズもしくは形状の対象を含む。

例示的な実施形態
一実施形態では、１１２位、１３６位、または１５８位のうちの少なくとも１つにアルギニン以外の残基を有する哺乳動物アポリポタンパク質Ｅをコードするか、あるいは、ＡＰＯＥ４に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、９Ｄ１１、４Ｅ４（１００～１５０の残基に結合する）、５Ｂ５、Ｅ２９、１３４３Ａに結合特異性を有するもしくはそれらに由来する抗体（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）、または開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７４１，２９８号に開示されているもの、またはヘパラン硫酸、例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＰＳＧ）に結合するものをコードする、発現カセットを含む、遺伝子治療ベクターが提供される。一実施形態では、哺乳動物アポリポタンパク質Ｅは、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、またはＡＰＯＥ４ではなく、むしろ、哺乳動物において外因的に発現されると、保護的である、例えば、認知障害もしくは悪化を減少もしくは遅延させるか、またはＨＳＰＧへの結合が低下していてもよい、修飾されたＡＰＯＥである。一実施形態では、ベクター中のアポリポタンパク質Ｅは、ヒトアポリポタンパク質Ｅ、例えば、本明細書に記載のように修飾されたものである。一実施形態では、アルギニン以外のベクター中のＡＰＯＥにおける残基は、セリン、トレオニン、アスパラギン、システイン、またはグルタミンである。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの１１２位は、システインである。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの位置１３６位は、セリンである。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの位置１５８位は、アルギニンまたはシステインである。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの１１２位、１３６位、または１５８位のうちの２つは、アルギニンを有する。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの１１２位は、アルギニンを有しない。一実施形態では、ベクター中のＡＰＯＥの１５８位は、アルギニンを有しない。一実施形態では、遺伝子治療は、ウイルス遺伝子治療ベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ｒＡＡＶベクターである。一実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．２、またはＡＡＶ７キャプシドを有する。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ．１０である。ベクターは、医薬組成物中に存在してもよい。一実施形態では、組成物中のウイルスベクターの量は、約１×１０^１１～約１×１０^１６ゲノムコピーである。

ベクターは、インビトロまたはインビボで細胞に導入されてもよい。一実施形態では、哺乳動物におけるアルツハイマー病を防止、阻害、または治療するための方法は、哺乳動物に、有効量の遺伝子治療ベクターを投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現と関連付けられる疾患を防止、阻害、または治療するための方法は、哺乳動物に、有効量の遺伝子治療ベクターを投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物における脂質障害を防止、阻害、または治療するための方法は、哺乳動物に、有効量の遺伝子治療ベクターを投与することを含む。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ２ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ３ホモ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、Ｅ２／Ｅ３ヘテロ接合体である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、ベクターは、全身投与される。一実施形態では、ベクターは、注射される。一実施形態では、ベクターは、中枢神経系に投与される。一実施形態では、ベクターは、脳に投与される。一実施形態では、ベクターは、Ｃ１１２、Ｓ１３６、およびＲ１５８を有するか、またはＣ１１２、Ｓ１３６、およびＣ１５８を有するアポリポタンパク質Ｅをコードする。

一実施形態では、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、またはＡＰＯＥ４ではないが、修飾され、保護的であるＡＰＯＥをコードするオープンリーディングフレーム、および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む核酸配列に作動可能に連結したプロモーターと、ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のためのＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子治療ベクター。一実施形態では、ベクターは、ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’または３’である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームに対して５’および３’である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、異なるベクター上にある。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、またはレトロウイルスベクターである。一実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ１０である。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、第２のプロモーターに連結されている。一実施形態では、第２のプロモーターは、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｍｉＲＮＡ配列を含むｍｉＲＮＡを含む。一実施形態では、ＲＮＡｉは、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、オープンリーディングフレームは、複数のサイレントヌクレオチド置換を含む。一実施形態では、ベクターは、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のコドンは、サイレントヌクレオチド置換を有する。一実施形態では、オープンリーディングフレームは、ペプチドタグ、例えば、ＨＡ、ヒスチジンタグ、ＡｖｉＴａｇ、マルトース結合タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｖ５－タグ、Ｍｙｃ－タグ、Ｓｐｏｔ－タグ、Ｔ７タグ、またはＮＥ－タグをさらに含む。一実施形態では、ベクターは、宿主細胞内、例えば、哺乳動物、または非ヒト霊長類もしくはヒトなどの宿主生物内にある。宿主哺乳動物は、例えば、哺乳動物におけるアルツハイマー病を防止、阻害、もしくは治療する、または哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現と関連付けられる疾患を防止、阻害、または治療するのに有効な量のベクターを投与されてもよい。一実施形態では、ベクターおよび／またはヌクレオチド配列は、全身投与される。一実施形態では、ベクターおよび／またはヌクレオチド配列は、経口投与される。一実施形態では、ベクターおよび／またはヌクレオチド配列は、静脈内投与される。

本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。

実施例１
概要
アルツハイマー病（ＡＤ）の病因は複雑であり、中枢神経系（ＣＮＳ）のアミロイドベータ（Ａβ）の蓄積、およびアミロイド斑、タウの異常なリン酸化、タウのもつれ、ニューロンの炎症および進行性消失を特徴とし、進行性認知低下をもたらす１。遺伝学は、これらの発病過程のリスクにおいて主要な役割を果たす（ＤｅＴｕｒｅ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，２０１９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０１２、Ｓａｆｉｅｈｅｔａｌ．，２０１９、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。早発性の常染色体顕性ＡＤは、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）ならびにプレセニリン（ＰＳＥＮ）１および２の変異によって引き起こされ（Ｃａｍｐｉｏｎｅｔａｌ．，１９９９、Ｃａｒｍｏｎａｅｔａｌ．，２０１８）、これらの遺伝子は、ＡＰＰプロセシングに影響を及ぼすことで、Ａβペプチドの産生を改変し、凝集および斑形成をもたらす（Ｃａｒｍｏｎａｅｔａｌ．，２０１８、Ｄａｉｅｔａｌ．，２０１８）。散発性の遅発性ＡＤの主要な遺伝因子は、脂質輸送タンパク質であるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）のバリアントである（Ｔｚｉｏｒａｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｗｏｌｔｅｒｓｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥは、３つの一般的なアイソフォームを有し、一般的なε３アイソフォームは、ＡＤの平均リスクと関連付けられ、ε４は、リスクを１５～２０倍増加させるが、ε２は、リスクをそれぞれε３およびε４より６６～９９％減少させる（Ｗｏｌｔｅｒｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｎａｊｅｔａｌ．，．２０１１、Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０）。生物学的レベルでは、ＡＰＯＥ遺伝子型（ε４＞ε３＞ε２）により、ヒトおよびＡＤマウスモデルにおける脳アミロイド、ｐ－タウ、およびタウのもつれのタイミングおよび量が予測される（Ｔｚｉｏｒａｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ａｂｎｅｒｅｔａｌ．，２０１８）。Ｅ２とＥ４との差異は、アミノ酸１１２および１５８によって決まり、ＡＰＯＥ２（Ｃ１１２Ｃ１５８）は低リスクを表し、ＡＰＯＥ４（Ｒ１１２Ｒ１５８）は高リスクを表す（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９３）。この１１２～１５８内で、「アルツハイマーのリスク領域」は、ＬＤＬ受容体をコードし、ヘパランプロテオグリカンに結合する（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９）。

ＡＰＯＥ４は高リスクを、ＡＰＯＥ２は低リスクを表すため、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２によるＡＰＯＥ４ホモ接合体におけるＡＤ関連病変の発症を予防／治療するための遺伝子治療を開発するために、ヒトＡＰＯＥ２をコードする血清型ｒｈ．１０アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子移入ベクターを調製した。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２のＣＮＳ投与により、マウスモデルにおいてＡＰＯＥ４関連Ａβおよびアミロイド負荷が予防された（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）ことで、ＡＰＯＥ２遺伝子治療を使用してＡＰＯＥ４ホモ接合体脳をＡＰＯＥ２－ＡＰＯＥ４ヘテロ接合体状態に変換することによって、ＡＤのＡＰＯＥ４関連リスクが軽減され得るという構想が裏付けられた（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。

ＡＤリスクの媒介におけるＡＰＯＥ１１２～１５８領域の重要性は、ＰＳＥＮ１Ｅ２８０変異の女性保因者の報告によって強調されたが、ＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈＲ１３６ＳＡＰＯＥ３バリアントであるＡＰＯＥ３ＣｈＣのホモ接合体も同じであった（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。顕性ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ遺伝子は、早発性ＣＮＳＡβおよびアミロイド蓄積を有するすべての１，２００個体を超えるコロンビア系一族を定義するものであり、ヘテロ接合体は４０代半ばに認知症を発症する（Ｌｏｐｅｒａｅｔａｌ．，１９９７）。印象的なことに、ＡＰＯＥ３ＣｈＣおよびＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａの共遺伝を有する女性は、親戚が典型的に認知低下を発症する年齢をはるかに超えた７０歳で良好な認知状態にあった（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。臨床評価により、アミロイド斑の蓄積が明らかになったが、タウ病変のレベルは低く、これは、ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントがタウ病変の進行を遮断したという構想につながった。このことは、ＡＰＯＥ３ＣｈＣがＡＰＯＥ２対立遺伝子のように挙動し、両方とも、ヘパリンへの結合が、緊密に結合するＡＰＯＥ４と比較して不良であること（ＡＰＯＥ３ＣｈＣ＞ＡＰＯＥ２）を実証するインビトロの実験によって確認された（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８、Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥ３ＣｈＣの遺伝がＰＳＥＮ１－Ｅ２８０Ａ駆動型のタウ病変の進行を防止するが、アミロイド病変を防止しないという観察（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）により、ＡＰＯＥ４駆動型のアミロイド病変が、ＡＰＯＥ２のＣＮＳへのＡＡＶ媒介性送達によって抑制され得ることを示す遺伝子治療研究と併せて、ＡＰＯＥ３ＣｈＣ（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアントを有するＡＰＯＥ３）のＣＮＳへのＡＡＶｒｈ．１０媒介性送達がタウ関連病変を抑制するかどうか、およびＡＰＯＥ２ＣｈＣ（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアントを有するＡＰＯＥ２）の送達がアミロイド病変とタウ病変との両方を抑制するかどうかを、ＡＤアミロイドおよびタウ病変のマウスモデルにおいて試験することになった。２つのマウス、ヒトＥ４ベースのモデルを使用する：ＡＰＰおよびＡＰＯＥ４関連アミロイド病変を呈するＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８、Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９、Ｌｏｐｅｒａｅｔａｌ．，１９９７、Ｋｉｍｅｔａｌ，２０１１）、ならびにタウおよびＡＰＯＥ４関連タウ病変を呈するＰ３０１Ｓ／Ｅ４（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１６、Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，２００２）。

戦略
遺伝は、アルツハイマー病のリスクにおいて主要な役割を果たす（ＤｅＴｕｒｅ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，２０１９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０１２、Ｓａｆｉｅｈｅｔａｌ．，２０１９、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。早発性の常染色体顕性ＡＤは、アミロイドタンパク質前駆体（ＡＰＰ）ならびにプレセニリン１（ＰＳＥＮ１）および２（ＰＳＥＮ２）の変異によって引き起こされ（Ｃａｍｐｉｏｎｅｔａｌ．，１９９９、Ｃａｒｍｏｎａｅｔａｌ．，２０１８）、これらの遺伝子は、ＡＰＰのプロセシングに影響を及ぼすことで、Ａβペプチドの産生を改変し、凝集および斑形成の増加をもたらす（Ｃａｒｍｏｎａｅｔａｌ．，２０１８、Ｄａｉｅｔａｌ．，２０１８）。散発性の遅発性ＡＤの主要な遺伝因子は、脂質輸送タンパク質であるアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）のバリアントである（Ｔｚｉｏｒａｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｗｏｌｔｅｒｓｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥは、３つの一般的なアイソフォームである、ε２、ε３、ε４を有し、一般的なε３アイソフォームは、ＡＤの平均リスクと関連付けられ、ε４は、ＡＤの発症のリスクを増加させ、その発症年齢を低下させるが、ε２は、発症のリスクを減少させ、発症年齢を遅延させる（Ｗｏｌｔｅｒｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｎａｊｅｔａｌ．，２０１１）。生物学的レベルでは、ＡＰＯＥ遺伝子型ε４＞ε３＞ε２により、ＡＤのヒトおよびマウスモデルにおける脳アミロイド、ｐ－タウ、およびタウのもつれのタイミングおよび量が予測される（Ｔｚｉｏｒａｓｅｔａｌ．，２０１９、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ａｂｎｅｒｅｔａｌ．，２０１８）。ＡＰＯＥ遺伝子の異なるバリアントの遺伝により、ＡＤリスク、発症年齢、および重症度が決まり得るという知見（ＤｅＴｕｒｅ＆Ｄｉｃｋｓｏｎ，２０１９、Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．，２０１６）に基づき、ＡＰＯＥ４ホモ接合体におけるＣＮＳ関連アルツハイマー病変を低減する療法は、「ＡＰＯＥＡＤリスク減少」バリアントをＣＮＳに送達することによって達成され得ることが想定された。以前の研究は、ＡＡＶ血清型ｒｈ．１０（ＡＡＶｒｈ．１０）によって媒介されるＣＮＳへのＡＰＯＥ２送達により、ＡＤのマウスモデルにおいてＡβおよびアミロイド負荷が低減されたことを実証した（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。これらのマウスモデルにおける脳Ａβ負荷を低減するＡＰＯＥ２の能力は遺伝子量および既存のＡβ１～４２沈着の量に依存しており、このことにより、疾患の過程の早期に十分な脳ＡＰＯＥ２レベルが達成されれば、ＡＡＶベクターを使用したＡＰＯＥ２の遺伝子送達が、ＡＤを治療または予防するための実行可能な治療的アプローチであることが示唆された（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。このデータは、嚢内経路を使用して非ヒト霊長類のＣＮＳにおいて高いレベルのＡＰＯＥ２発現を送達し安全に達成する能力を実証する研究（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８）とともに、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２の嚢内投与によりＡＰＯＥ４ホモ接合体を治療するためのヒト初の進行中の臨床試験につながった。

ＡＰＯＥ４駆動型ＡＤ関連病態の進行を軽減することにおいてＡＰＯＥ２による遺伝子治療よりも効果的である「ＡＰＯＥＡＤリスク減少」遺伝子治療戦略が想定されている。このアプローチは、１，２００を超える個体に影響を与える家族内のＰＳＥＮ１バリアントであるコロンビア系ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ変異に重ね合わせたＡＰＯＥ３－Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ（ＡＰＯＥ３ＣｈＣ）変異の結果の最近の報告に基づいている（Ｌｏｐｅｒａｅｔａｌ．，１９９７、Ａｃｏｓｔａ－Ｂａｅｎａｅｔａｌ．，２０１１）。ＰＳＥＮ１－Ｅ２８０Ａ変異は、Ａβ産生の増加と関連付けられ、アミロイド蓄積をもたらす。ヘテロ接合体は、４０代半ばで認知症を発症する（Ｌｏｐｅｒａｅｔａｌ．，１９９７）。常染色体顕性ＰＳＥＮ１Ｅ２８０Ａ変異を有するが、ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントについてホモ接合性でもあるこの家系の女性は、同じＰＳＥＮ１変異を有する者が典型的に認知低下を示す４０歳をはるかに超えて、７０歳で良好な認知状態にあり、自立したままである（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。臨床評価により、アミロイド斑の蓄積は顕著であるが、タウ／ｐ－タウ病変は低いことが明らかとなり、これは、ＡＰＯＥ３ＣｈＣ変異がタウ病変の進行を遮断した可能性があることを示唆する（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。興味深いことに、ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアント（Ｒ１３６Ｓ）は、一般的なε２、３、および４対立遺伝子と同じＡＰＯＥタンパク質の領域（１１２～１５８）内にあり、このことは、ＡＰＯＥのこの領域がＡＤのリスクに関連するという構想と一致する（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９）。

ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントがタウ病変を抑制する能力は、ＡＰＯＥ３ＣｈＣがＡＰＯＥ２対立遺伝子のように挙動する（両方ともヘパリンへの結合が不良である（ＡＰＯＥ３ＣｈＣ＜ＡＰＯＥ２））ことを実証するインビトロ実験によって確認された（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９、Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。これらの知見は、病原事象のＡＤ関連鎖が、アミロイド形成後にＡＰＯＥ３ＣｈＣによって破壊される可能性が高く、機序とは無関係に、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異が保護的であり、ＡＰＯＥ４ホモ接合体を治療するために使用することができ、ＡＰＯＥ２対立遺伝子による遺伝子治療よりも有効である可能性が高いことを示唆する（図１２～１３）。関連するＡＤマウスモデルにおける送達系としてＡＡＶｒｈ．１０キャプシドを使用して、各々Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異を保有するＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ２のいずれかのＣＮＳへのＡＡＶｒｈ．１０媒介性送達が、ＡＰＯＥ４ホモ接合体におけるアルツハイマー病の治療としてＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２よりも優れていることを評価する。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２がマウスモデルにおいてアミロイド蓄積を抑制するという以前の実証（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）、およびＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアントに関する臨床症例報告に基づき、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣは、アミロイドではなくタウ病変を抑制する可能性が高く、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣは、アミロイド病変とタウ病変との両方を抑制するため、より有効である可能性が高い。

ＰＳＥＮ１－ＡＰＯＥ３ＣｈＣ。ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントをコロンビア系ＰＳＥＮ１－Ｅ２８０変異と併せて受け継いだ個体の報告は単一の症例を表すに過ぎないが、この報告には、ＡＰＯＥ３ＣｈＣが「ＡＰＯＥＡＤリスク減少」バリアントであるという結論を裏付ける追加の研究が含まれた。アミロイドＰＥＴスキャンにより、ＣＮＳアミロイド斑の顕著な蓄積が明らかとなったが、タウ病変はほとんど観察されず、大部分が内側側頭葉に限定された。加えて、脳のグルコース代謝はほぼ正常であった（図１４）。ＡＰＯＥ３ＣｈＣ変異がタウ病変の進行を遮断するという構想は、Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．（２０２０）による研究における構想に類似しており、この研究では、ＡＰＯＥ２ホモ接合体からの２４個の剖検試料において、ＡＰＯＥ２がタウ病変の減少と関連付けられたことが観察された。ＡＰＯＥ３ＣｈＣバリアントがタウ病変を抑制する能力は、ＡＰＯＥ３ＣｈＣがＡＰＯＥ２対立遺伝子のように挙動すること、ならびにＥ４、Ｅ２、およびＥ３ＣｈＣと比較して、両方ともヘパリンへの結合が不良であること（結合：Ｅ４＞Ｅ３＞Ｅ２＞＞Ｅ３ＣｈＣ、図１５）を実証するインビトロ実験によって裏付けられた。ＨＳＰＧは、アミロイド斑の集積、およびアミロイドに対する小膠細胞応答の促進に関与している（Ｈｅｆｆｅｒｍａｎｅｔａｌ．，２０１６、ＡＬＸＦＯＲＵＭ，２０１０、Ｓｎｏｗｅｔａｌ．，１９８８、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１６、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎｅｔａｌ．，２０１８）。ＨＳＰＧはタウ病変とも関連付けられており、ＨＳＰＧにより、タウ原線維がニューロンに付着し、毒性形態のタウの取り込みおよび伝播が促進されることが示唆されている（Ｒａｕｃｈｅｔａｌ．，２０１８、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１９）。インビトロ研究により、残基１３０～１４３（Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異の領域を含む）への抗体と結合したＡＰＯＥ３が、ヘパリン結合によって測定されるように、ＡＰＯＥ３を機能的にＡＰＯＥ３ＣｈＣに変換したことも示された。これらの知見を合わせると、病原事象のアルツハイマー関連鎖は、アミロイド形成後にＡＰＯＥ３ＣｈＣによって破壊される可能性が高く、機序とは無関係に、Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異が保護的であることを理由に、ＡＰＯＥ４ホモ接合体を治療するためにこれを使用することができることが示唆される。

ＡＤのＡＰＯＥ４関連リスク。脂質結合タンパク質であるＡＰＯＥは、ＣＮＳにおけるコレステロールの主要な担体である（Ｐｕｇｌｉｅｌｌｉｅｔａｌ．，２００３、Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔａｌ．，２０２０）。脳内では、これは星状膠細胞および小膠細胞によって主に産生される（Ｆｌｏｗｅｒｓ＆Ｒｅｂｅｃｋ，２０２０、Ｐｉｔａｓｅｔａｌ．，１９８７、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０１２）。ＡＰＯＥ粒子は、細胞外環境で形成され（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９９、Ｆｌｏｗｅｒｓ＆Ｒｅｂｅｃｋ，２０２０）、ＡＰＯＥ粒子は、低密度リポタンパク質受容体遺伝子ファミリーのメンバーであるＡＰＯＥ受容体を介してコレステロールをニューロンに輸送する（Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１３、Ｍｏｎｄａｄｏｏｒｉｅｔａｌ．，２００７、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１３）。ＡＰＯＥタンパク質（２９９アミノ酸）は、ヒンジ領域によって接続されるＮ末端（１～１６７）ドメインとＣ末端（２０６～２９９）ドメインとを有する（Ｓａｆｉｅｈｅｔａｌ，２０１９、Ｆｌｏｗｅｒｓ＆Ｒｅｂｅｃｋ，２０２０）。Ｃ末端領域には、低密度リポタンパク質受容体結合部位４１が含まれる（図２）。ＣＮＳ内でコレステロールを輸送する役割に加えて、ＡＰＯＥは、無数の他の機能を有する（Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０１２、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｅｔａｌ．，２０１１、Ｄｅａｎｅｅｔａｌ．，２００８、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏｅｔａｌ．，２０１２、Ｈａｔｔｅｒｓｅｔａｌ．，２００６ａ、Ｈａｔｔｅｒｓｅｔａｌ．，２００６ｂ、Ｌｉｅｔａｌ．，２０１２、Ｍａｎｅｌｌｉｅｔａｌ．，２００５、Ｗａｌｋｅｒｅｔａｌ．，２０００、Ｙｕｅｔａｌ．，２０１４、Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２００９）。ヒトＡＰＯＥは、一般に、２つの残基のみ異なる３つのアイソフォーム（ＡＰＯＥ２、３、および４）において発現される（Ｍａｈｌｅｙｅｔａｌ．，１９９６、Ｚａｎｎｉｓｅｔａｌ．，１９８１）（図１３）。ＡＰＯＥ４の遺伝は、ＡＤの最も重要な遺伝的リスクである。ＡＰＯＥ３は中立であり、Ｅ４対立遺伝子は、リスクを増加させ、発症年齢を低下させ、Ｅ２は、リスクを減少させ、発症年齢を遅延させる（Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０、Ｍａｈｌｅｙ，２０１６、Ｃｏｎｅｊｅｒｏ－Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１４、Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９５、Ｒａｂｅｒｅｔａｌ．，２００４）。疫学的データは、ＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２が共顕性であること、つまり、Ｅ３／Ｅ４ヘテロ接合体のＡＤのリスクが４倍である代わりに、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体は、通常のリスクであるＥ３／Ｅ３ホモ接合体に近い（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１３、Ｇｅｎｉｎｅｔａｌ．，２０１１）、すなわち、Ｅ２のほぼ等価の発現が、Ｅ４対立遺伝子の有害な効果を打ち消す（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｆａｒｒｅｒｅｔａｌ．，１９９７、Ｃｏｏｎｅｔａｌ．，２００７）ことを示唆する。Ｅ２研究の保護的効果の疫学的研究からの肝要な結論には、Ｅ２遺伝子型がＡＤにおいて際立って少ししか表されないこと（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０）、Ｅ２対立遺伝子がＡＤの発症年齢の遅延と関連付けられること（Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０、Ｂｅｎｊａｍｉｎｅｔａｌ．，１９９４）、Ｅ２保因者のＡＤ関連病変が低下していること（Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２０２０、Ｎａｇｙｅｔａｌ．，１９９５）、Ｅ２がより緩徐な認知低下と関連付けられること（Ｓｍａｌｌｅｔａｌ．，２００４）、Ｅ２保因者が、ＡＤの進行に対する脆弱性の減少と関連付けられ得るより堅牢な白質の完全性を保有すること（Ｃｈｉａｎｇｅｔａｌ．，２０１２）、および正常な高齢者において、Ｅ２保因者の脳脊髄液ｐ－タウのレベルが低く、タウがわずかに低いこと（Ｃｈｉａｎｇｅｔａｌ．，，２０１０）が含まれる。実験的研究は、Ｅ２が、Ａβの代謝、ニューロン修復および神経突起伸長を促進し、抗酸化剤および抗炎症剤として機能することを示す（Ｒｅｂｅｃｋｅｔａｌ．，２００２）。さらに、動物および臨床研究は、ＡＰＯＥ遺伝子型によっても、脳アミロイドβ（Ａβ）ペプチド沈着のタイミングおよび量ならびにアミロイド負荷（Ｅ４＞Ｅ３＞Ｅ２）が予測されること（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｅｔａｌ．，２０１１、Ｒａｂｅｒｅｔａｌ．，２００４、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｒｅｉｍａｎｅｔａｌ．，２００９、Ｓｃｈｍｅｃｈｅｌｅｔａｌ．，１９９３）、すなわち、ＡＰＯＥ４により、アミロイドβクリアランスが損なわれ、アミロイド形成が増加することが示されている７０、７１。（Ｌｉａｏｅｔｌ．，２０１７、Ｈｕｅｔａｌ．，２０１５）。マウスにおけるマウス研究は、内因性ＡｐｏＥ遺伝子の標的化した欠失により、ＡＤのＰＤＡＰＰマウスモデルにおいて線維性アミロイドおよび全脳Ａβ沈着が劇的に減少することを示している（これらのマウスは、ヒトＡβの高い脳中レベルを生じさせる変異型ＡＰＰ導入遺伝子を発現する）（Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，１９９７）。ＰＤＡＰＰマウスを、ヒトＡＰＯＥ標的代置（ＴＲＥ）マウスと交配させることにより、ＡＰＯＥアイソフォーム依存性の効果が、ＡＤ患者で観察されるものを再現する様式で、脳Ａβ沈着およびアミロイド負荷（Ｅ４＞＞Ｅ３＞Ｅ２）において観察され（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｅｔａｌ．，２０１１、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｆａｇａｎｅｔａｌ．，２００２）、ＡＰＯＥアイソフォームが、脳アミロイド負荷の決定において重要な役割を果たすことが示唆された。さらに、タウ病変関連Ｐ３０１Ｓ／Ｅ３、Ｅ２、およびＥ４マウスにおける研究により、ＡｐｏＥが、アミロイド－βとは無関係にタウ病変の背景において神経変性に影響を及ぼすことが示される。ＡｐｏＥ４により神経変性が悪化した一方、ＡｐｏＥの不在は神経保護的であった（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。

ＡＰＯＥ４関連ＣＮＳ病変のＡＰＯＥ２遺伝子治療。ＡＰＯＥ２が保護的であるという疫学的データに基づいて、ＡＰＯＥ２をＡＰＯＥ４ホモ接合体のＣＮＳに移入することでＥ４リスクが軽減され得るという仮説を評価するために、遺伝子治療プログラムが開発された（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８）。このアプローチの実現可能性の文献における証拠は、レンチウイルスベクターを使用して、ＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２をマウスＡＤモデルのＣＮＳに投与することで、脳Ａβ／アミロイド負荷がそれぞれ増加および減少したことを示した、Ｄｏｄａｒｔｅｔａｌ．（２００５）の研究から得られた。ＡＰＯＥ２が脳Ａβ／アミロイド負荷を減少させたという所見は、ＡＡＶ４ベクターを使用して、ＡＰＯＥ２を変異型ＡＰＰマウスの側脳室に送達することにより、Ｈｕｄｒｙおよび共同研究者ら（２０１３）によって再現された。ＣＳＦに投与したＡＡＶ８ベクターを使用して、Ｈｕｅｔａ１．（２０１５）は、ＴＲＥ４マウスモデルにおいてＡＰＯＥ２を増加させることは、ＡＤを治療するための有効な戦略である一方で、ＴＲＥ４マウスにおいてＡＰＯＥ４を増加させることは、有害であることを見出した。以下で詳細に説明するように、ヒトＡＰＯＥ２をコードするＡＡＶｒｈ．１０血清型ベクターにより、２匹のマウスモデルにおいてアミロイド負荷が低減した（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。これらのＡＰＯＥ対立遺伝子がＡＤリスクを決定する分子機構にかかわらず、ＡＰＯＥ２が強力に保護的であり、またいずれかの遺伝子治療ベクターを介してマウス脳に送達されると、Ａβ／アミロイド負荷を顕著に低減させるという事実を考慮すると、ウイルスベクターを介したＡＰＯＥ２のＣＮＳ遺伝子送達は、ＡＰＯＥ４ホモ接合性ＡＤの治療戦略を示す。

ＡＡＶｒｈ．１０。ＡＡＶｒｈ．１０血清型は、アカゲザルに由来する。この血清型を、実験動物（マウス、非ヒト霊長類）のＣＮＳ、ＣＬＮ２疾患を有する小児、およびアルツハイマー病を有する成人（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ；ＮＣＴ０１４１４９８５、ＮＣＴ０１１６１５７６、ＮＣＴ０３６３４００７）へと、種々の発現カセットと共に投与した。ＡＡＶｒｈ．１０ベクターを、高度に活性な構成的プロモーター、イントロンコード配列、およびＡＡＶ２逆方向末端反復に隣接するウサギβ－グロビンポリＡを用いて設計する（例として、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ベクターの詳細については、図１６を参照されたい）。ＡＡＶｒｈ．１０キャプシドは、ＡＡＶ９と等しく、ＣＮＳ内の遺伝子発現の媒介に非常に有効であるが、毒性の可能性が低い（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１４、Ｓｏｎｄｈｉｅｔａｌ．，２０１２、Ｔａｒｄｉｅｕｅｔａｌ．，２０１４、Ｚｅｒａｈｅｔａｌ．，２０１５０）。すべてのベクターを、同一性、効力、および純度の多数の尺度について特性評価する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動による純度により、ベクター産生で使用される細胞からの汚染タンパク質の不在が立証される（図１７）。ヒトＡＰＯＥ２をコードするベクターを非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に嚢内投与することの有効性の実証として、脳脊髄液を含むＣＮＳ全体にわたるベクター由来タンパク質の広範な分布を提供する（図１８）。これらの観察は、ヒトＡＰＯＥアイソフォームをコードするＡＡＶｒｈ．１０ベクターのＣＮＳ投与により、コード化ＡＰＯＥアイソフォームがＣＮＳ全体に効果的に分布できるようになることを裏付ける。

ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２は、ＡＤ動物モデルにおいて病変を改善する。ＰＤＡＰＰマウスは、ヒトＡＰＰ変異を過剰発現し、海馬および大脳皮質において年齢依存性Ａβおよびアミロイド沈着を進行させる、脳アミロイドーシスの十分に特徴付けられたマウスモデルである（Ｇａｍｅｓｅｔａｌ．，１９９５、Ｓｃｈｅｎｋｅｔａｌ．，１９９９）。９か月齢で、大量のＡβおよびアミロイド斑が海馬にあった８０。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ベクターの発現は、無関係の遺伝子を発現する類似のウイルスベクターで処置した対照動物において観察されたアミロイド病変の著しい消散を示した（図１９）（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ベクターを使用したＡＰＯＥ２の発現により、ＰＤＡＰＰマウスの海馬における不溶性Ａβ１～４２（ｍＣｈｅｒｒｙ対照に対して７０．４％の低減、ｐ＜０．００１）および可溶性Ａβ１～４２（ｍＣｈｅｒｒｙ対照に対して２７．２％の低減、ｐ＜０．０５）レベルの際立った減少が生じた。不溶性Ａβ１～４０も劇的に減少した（対照に対して６１．２％の減少、ｐ＜０．００１）が、既にレベルが比較的低かった可溶性Ａβ１～４０は変化しなかった。

脳Ａβ負荷に対するＡＰＯＥ２発現の役割をさらに評価するために、ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４トリプルトランスジェニックマウスにおけるＡβ／アミロイド病変に対するＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２用量の影響も評価した。ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスは、ＡＰＰＳｗｅｄｉｓｈ（ＡＰＰｓｗｅ）およびＰＳ１変異、ならびにヒトＡＰＯＥ４遺伝子を担持する（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１、Ｊａｎｋｏｗｓｋｙｅｔａｌ．，２０１８）。ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスは、大脳皮質、海馬、および視床を含む複数の脳領域において、堅牢な年齢依存性Ａβおよびアミロイド病変を進行させる。早くも２か月齢のマウスの皮質でアミロイド斑が観察され、進行する脳ＡＪ３／アミロイド負荷は、ＡＰＯＥ４発現に依存する（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１）。ＰＤＡＰＰマウスにおける観察に類似して、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２の海馬内送達により処置したＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスの海馬において、アミロイドベータレベルの用量依存性の抑制が観察された（図２０）。

ＡＰＯＥ４関連ＡＤ病変のマウスモデル。臨床目標は、ＡＰＯＥ４ホモ接合体のＣＮＳにおけるアミロイド病変とタウ病変との両方を抑制することであるため、マウスＡｐｏＥノックアウトおよびヒトＡＰＯＥ４ノックインを有するマウスモデルを選択した。１つのマウスモデルは、ＡＰＯＥ４関連アミロイド病変のためのものであり、もう１つのマウスモデルは、ＡＰＯＥ４関連タウ病変のためのものである。ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスは、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異を有するヒトβ－アミロイド（Ａβ）前駆タンパク質（ＡＰＰ）（ＡＰＰｓｗｅ）、変異型（Ｌ１６６Ｐ）ヒトプレセニリン１、および内因性マウスＡｐｏＥ遺伝子を代置するヒトＡＰＯＥ４遺伝子を発現する。これらのマウスは、高レベルのヒトＡβタンパク質およびヒトＡＤ様アミロイド病変を発現し（Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１）、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２がＡＤアミロイド関連病変を抑制することを実証するために、以前の研究で使用された（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）（図２０）。Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスは、ヒトＰ３０１Ｓ１Ｎ４Ｒタウ、マウスＡｐｏＥ遺伝子の欠失、およびヒトＡＰＯＥ４遺伝子の付加を保有する（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，２００２）。これらのマウスは、ＡＰＯＥ４関連タウ病態を有し、タウ病変を抑制する遺伝子治療ベクターの能力を評価するために使用されることになる。これらのマウスはまた、ＡＤ関連炎症を表す小膠細胞および星状膠細胞の活性化を有する（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。

アプローチ。Ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアント（ＡＰＯＥ３－Ｒ１３６Ｓ）は、ＡＰＯＥ２、３、および４を定義する残基１１２および１１８と、ＬＤＬ結合領域（１３６～１５０）と、ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合領域とを含む、ＡＰＯＥ１１２～１５８の「アルツハイマーリスク領域」にある（図１３）。ＡＰＯＥ４関連マウスモデルにおけるＡＰＯＥ４関連Ａベータおよびアミロイド負荷が、ＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２のＣＮＳ投与によって防止され得ることの実証は、ＡＰＯＥ４ホモ接合体脳をＡＰＯＥ２－ＡＰＯＥ４ヘテロ接合体状態に変換するためにＡＰＯＥ２コード配列を送達する遺伝子治療を使用することにより、ＡＤのＡＰＯＥ４関連リスクが軽減され得るという構想を裏付ける（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ駆動型ＡＤ関連タウ病変を無効にしたＡＰＯＥ３ＣｈＣの同時ホモ接合性遺伝を有するＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａ家系の女性の報告は、ＡＡＶｒｈ．１０ベクターを使用してＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ２のいずれかの背景にＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ変異を送達することによる、ＡＰＯＥ４ホモ接合体のための第２世代遺伝子治療を開発するという、この提案の焦点につながった。これを以下の２つのヒトＡＰＯＥ４関連マウスモデルで試験する：主にアミロイド関連の病変を示すＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４、および主にタウ関連の病変を示すＰ３０１Ｓ／Ｅ４（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１）。ＡＰＯＥ３背景のＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈバリアントが、ＰＳＥＮ１－Ｅ２９０ＡおよびＡＰＯＥ３ＣｈＣの二重遺伝の症例報告と同等に、マウスモデルにおいて有効である場合には、ＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ３ＣｈＣによる遺伝子治療は、Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスにおけるタウ病変を抑制するが、ＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４マウスにおけるアミロイド病変は抑制しないはずである。しかしながら、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２がＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４マウスにおけるアミロイド病変を抑制する有効性（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）に基づいて、発明者らは、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣが、ＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４マウスにおけるアミロイド病変とＰＳＥＮ１－Ｅ２９０Ａマウスにおけるタウ病変との両方を抑制すると仮定する。仮説が正しい場合、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥＣｈＣは、ＡＰＯＥ４ホモ接合体を治療するための、臨床に移る理想的な第２世代の候補となる。異なるベクター（ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣおよびＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３、またはＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣおよびＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２）以外は、すべてが同一である。統計分析には、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣとＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣとの差異を比較するために、各実験内でおよび別々に、パラメータの比較が含まれる。

各マウスモデル（ＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４、Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４）について、ベクターＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣ、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３；ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣ、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２；両方について対照ＡＡＶｒｈ．１０Ｎｕｌｌ（翻訳可能な導入遺伝子なし）またはＰＢＳ］を、２か月齢で、２μｌで海馬に両側投与する。ベクターを、２用量の０．４×１０^１０ゲノムコピー（ｇｃ）または１．０×１０^１０ｇｃで投与する。評価を５か月および９か月で行う。すべてのデータ点（マウス株、ベクターまたはＰＢＳ、評価時点；表Ｉ）に、１０匹の雄および１０匹の雌を使用する。ベクター、一般病変、アミロイド、タウ、および炎症に関連して実施される評価を、表ＩＩに列挙する。ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２が、ＡＰＰ．ＰＳ１ｆｆＲＥ４マウスにおいてアミロイド関連病変を効果的に抑制すること（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）、およびＡＰＯＥ３ＣｈＣのホモ接合性遺伝がＰＳＥＮ１－Ｅ２８０Ａ家系の女性保因者においてアミロイド病変を生じさせたがタウ病変を防止した症例報告（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）に基づき、発明者らは、ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣベクターおよびｈＡＰＯＥ２ＣｈＣベクターの両方が、ＣｈＣバリアントを有しないｈＡＰＯＥ３ベクターおよびｈＡＰＯＥ２ベクターよりも有効である可能性が高く、ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣ構築物が、アミロイド病変およびタウ病変の両方の防止において、ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣ構築物よりも有効である可能性が高い。また、以下も試験する：（１）より一般的な病変に対するｈＡＰＯＥ３ＣｈＣベクターおよびｈＡＰＯＥ２ベクターの有効性（ＡＤ関連ＣＮＳ構造の定量体積、一般的な細胞機能のトランスクリプトーム分析）、ならびに（２）Ｅ４バリアントが、Ｅ２およびＥ３バリアントよりも大きな先天性免疫関連炎症と関連付けられるため、ＡＤ関連炎症（小膠細胞および星状膠細胞活性化、炎症促進遺伝子のトランスクリプトーム分析）（Ｖｉｔｅｋｅｔａｌ．，２００９、Ｇａｌｅｅｔａｌ．，２０１４）。

（表Ｉ）ヒトＡＰＯＥ４関連ＡＤ病変のＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４およびＰ３０１Ｓ／Ｅ４マウスモデルのＡＰＯＥバリアントによるＡＡＶｒｈ．１０媒介治療

各マウスモデルを、ＰＢＳ、または列挙した導入遺伝子をコードするＡＡＶｒｈ１０ベクターで処理し、すべての投与は、２か月に、各々２μｌで列挙した用量で、海馬の両側に行い、ＣＮＳの評価は、５か月および９か月に行う。評価するパラメータのリストについては、表ＩＩを参照されたい。

（表ＩＩ）ヒトＡＰＯＥ４関連ＡＤ病変のＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４およびＰ３０１Ｓ／Ｅ４マウスモデルにおけるＡＰＯＥバリアントの効能の評価

各マウスモデルに、２か月齢で、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ３ＣｈＣ、ｈＡＰＯＥ３、ｈＡＰＯＥ２ＣｈＣ、ｈＡＰＯＥ２、Ｎｕｌｌ（０．４×１０^１０ｇｃまたは１×１０^１０ｇｃ；両側、海馬）、またはＰＢＳを投与し、５か月齢および９か月齢で評価する。各ベクター、各用量、各時点について、雄１０匹、雌１０匹；ＰＢＳ、各時点で雄１０匹、雌１０匹；ＤＮＡ、ｑＰＣＲによるｍＲＮＡ、ＡＰＯＥタンパク質を、定量ウエスタン、定量免疫組織化学によって評価する；梨状／内嗅皮質、海馬、後側脳室、および歯状回の厚さの定量体積を評価する；一般細胞機能関連の定量トランスクリプトームのＲＮＡｓｅｑを評価する；可溶性（ＲＩＰＡ）および不溶性Ａβ－１－４２ならびにＡβ－１－４０を、ＡβのＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学により評価する（海馬の陽性面積％、Ａβ斑負荷）；タウおよびｐ－タウのＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学（海馬の陽性面積％、タウのもつれの定量化を評価する）；小膠細胞（ＣＤ６８、ｌｂａ１）および星状膠細胞（ＧＦＡＰ）の定量化を、細胞計数および海馬の面積％、炎症促進遺伝子のＲＮＡｓｅｑ定量トランスクリプトームにより評価する。

方法。
ベクター関連。ＭＶｒｈ．１０を、以前に説明されているように産生させ精製する（（Ｓｏｎｄｈｉｅｔａｌ．，２０１２、Ｓｏｎｄｈｉｅｔａｌ．，２００７）。簡潔に述べると、ベクターを、発現カセットプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミドを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションによって産生する。パッケージング細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔを、５％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中で維持し、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。細胞をＣｅｌｌＳＴＡＣＫＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で２４時間成長させた後、ＰＥｌｐｒｏ手順を使用してプラスミドでトランスフェクトする。細胞を、３日間インキュベートした後、回収し、５回の凍結／解凍サイクルによって溶解する。得られた細胞溶解物を、３７℃で３０分間、５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼで処理する。細胞溶解物を、ヨウジキサノール密度勾配、続いてＱ－ＨＰイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。精製したＡＡＶｒｈ．１０ベクターを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で濃縮する。ベクターゲノム力価を、ＴａｑＭａｎ定量ポリメラーゼ連鎖反応によって決定する。精製したベクターを無菌濾過し、好気性細菌、嫌気性細菌、または真菌の増殖を支持する培地上での増殖について１４日間試験し、エンドトキシンについて試験し、マイコプラズマ不含であることを実証する。

マウスモデル。ＡＰＰ．ＰＳ１－２１マウスをヒトＡＰＯＥ４ノックインマウスと交配して得られたＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４マウスコロニーが確立されている（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。ヒトタウ変異型Ｐ３０１ＳマウスをヒトＡＰＯＥ４ノックインマウスと交配することによって、Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスを生成する。マウスのゲノムを、関連性のあるノックイン遺伝子のＰＣＲによって検証する。ＡＡＶベクターの脳内注射を、定位固定手術によって実行する（Ｄｏｄａｒｔｅｔａｌ．，２００５）。簡潔に述べると、無菌条件下で、マウスをイソフルランで麻酔し、定位固定フレームに固定する（ＤａｖｉｄＫｏｐｆＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。頭蓋骨の上に切開を行い、高速ドリルを使用して注射針のサイズの穿頭孔を作製する。ＡＡＶ調製物（指示用量で２μＬ、ｇｃ）を、３３ゲージ針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびシリンジポンプ（ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、０．２μＬ／分の速度で標的の脳領域に両側注射する。注射に使用する定位座標は、以下のとおりである：ブレグマから前後±１．７ｍｍ、ブレグマから中外側±１．２ｍｍ、および硬膜下背腹±１．７ｍｍ。これはマウス脳の図解に基づく９５。各注射後、針を定位置に５分間放置して逆流を最小限に抑え、その後、ゆっくりと引き戻す。動物は、完全に意識を取り戻すまで、個別に収容し、監視する。５か月および９か月齢で、マウスを、ケタミン／キシラジンで深く麻酔し、０．３％のヘパリン化食塩水（２５００ＩＵ／Ｌ）で経心臓灌流する。脳を迅速に収集し、各脳を、矢状面に沿って分割し、一方の半球を組織学および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために処理し、他方の半球を、海馬、視床、および内嗅皮質に顕微切断し、その後、ドライアイス上で急速に凍結させ、生化学分析のために－８０°で貯蔵する。

脳を、≧４８時間、４％パラホルムアルデヒドに後固定し、３０％スクロースに≧４８時間移してから、凍結させ、ＣＭ３０５０－Ｓクライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して切片化する。連続した冠状断面を５０μｍ間隔で調製する。ＩＨＣ分析を、標準的な方法を使用して行う（Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，１９９７）。浮遊性切片を洗浄し、一次抗体とともに一晩４℃でインキュベートする。免疫反応性（ＩＲ）を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８または５９４抱合二次抗体（１：２００、ｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣＥｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ）および３，３－ジアミノベンジジン溶液を使用して可視化する。一次抗体染色の特異性を、一次抗体を除いたときのＩＲシグナルの欠如によって検証する。アミロイド斑を検出するために、チオフラビン－Ｓ染色を行う（Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，１９９７）。固定した脳切片を、新たに作製した０．１％のチオフラビン－Ｓ溶液（５０％エタノール中）とともに８分間手短にインキュベートした後、８０％エタノールで１分間清澄化し、続いて、Ｈ_２Ｏで３回、各回１分間洗浄した後、封入剤でカバースリップをする。落射蛍光顕微鏡（ＮｉｋｏｎＨ５５０Ｌ）を使用して、画像を撮影する。

ベクター由来ＡＰＯＥ。ベクターＤＮＡのために処理した組織ホモジネートについては、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（カタログ番号６９５０６、Ｑｉａｇｅｎ）を、約５０ｍｇの均質化組織試料とともに使用する。ベクター導入遺伝子ｍＲＮＡのために処理した組織ホモジネートについては、ＲＮｅａｓｙＬｉｐｉｄＴｉｓｓｕｅＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を、約５０ｍｇの均質化組織試料とともに使用する。脳切片中のベクターＤＮＡおよび導入遺伝子ｍＲＮＡコピーの定量分析は、マウスゲノムＤＮＡの背景で、ウイルスゲノムからヒトＡＰＯＥ２またはＥ３またはＥ４ｃＤＮＡの３’末端を検出するために、ＴａｑＭａｎベースの分析（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ「ＵｎｉｖｅｒｓａｌＭａｓｔｅｒＭｉｘＩＩ，ｎｏＵＮＧ」試薬）およびヒト特異的プライマー／プローブセット（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＰＣＲによって行う（順方向プライマー：５’ＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴ－３’（配列番号１０）；逆方向プライマー：５’－ＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴ－３’（配列番号１１）；プローブ、５’ＣＣＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＴＣ－３’（配列番号１２）。ＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６Ｆｌｅｘシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行う（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８）。ＡＰＯＥレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、脳内で測定する（Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９）。組織ホモジネートを、試料希釈緩衝液（０．４％グリシンを含有するＰＢＳＴ）中で希釈する。試料を、抗ＡＰＯＥ抗体でコーティングした９６ウェルプレートにロードした（１：２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。４℃で一晩インキュベーションした後、ビオチン化抗ＡＰＯＥ抗体（１：１０，０００、ＭｅｒｉｄｉａｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を検出に使用する。ＨＲＰ抱合ストレプトアビジン（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とインキュベーションした後のＩＲシグナルを、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させ、ＳｙｎｅｒｇｙＨ１Ｈｙｂｒｉｄプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取る。ＡＰＯＥのレベルを、組換えヒトＡＰＯＥ（ＭｅｒｉｄｉａｎＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）で生成された標準曲線を使用して計算する。脳ホモジネート中のＡＰＯＥのレベルを三連で決定し、タンパク質含有量に正規化し、ＡＰＯＥ／タンパク質ｍｇの量として表す。マウス脳組織ホモジネート中のＡＰＯＥおよび他のタンパク質レベルの検討も、ウエスタン分析によって実施される（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏｅｔａｌ．，２０２０）。組織ホモジネート中の総タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動のために、等量のタンパク質（２５ｍｇ）試料を、２％ＳＤＳおよび１％β－メルカプトエタノールを含有するローディング色素と混合し、１０分間９０℃でインキュベートし、１０％トリス－グリシンポリアクリルアミドゲルで分離する。非変性ＰＡＧＥのために、等量のタンパク質（２５μｇ）試料を、非変性ローディング色素と混合して、０．０４％ブロモフェノールブルー、４．０％グリセロール、および１００ｍＭトリス（ｐＨ６．８）の最終濃度にし、４～１２％非変性トリス－グリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離する。タンパク質を１００Ｖでフッ化ポリビニリデン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜上に移した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１時間、２３℃でブロッキングした後、膜を一次抗体により一晩４℃でプローブし、続いて種特異的ＨＲＰ抱合二次抗体（１：８０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により１時間２３℃でプローブする。強化化学発光（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバンドを特定する。変性ゲル上のタンパク質分子量を、カレイドスコープ分子量マーカー標準（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）との比較によって決定する。天然ゲル上の粒子径を、天然高分子量マーカー標準（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と比較することによって決定する。シグナル定量化を、ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によるスキャンしたオートラジオグラムの濃度測定分析を使用して行う。ローディングを、ブロットのストリッピング、およびβ－アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）での再プローブによって正規化する。

一般病変。
体積分析。ブレグマ＋２．１ｍｍから吻側に開始して、ブレグマ－３．９ｍｍの海馬の背側端部までの６個に１個の冠状脳切片（切片間３００μｍ）を、各マウスについて凍結切除する。封入した切片を、室温で２０分間、７０％エタノール中の０．１％スダンブラックで染色した後、７０％エタノール中で１分間、３回洗浄する。切片をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で３回洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔでカバースリップをする。染色したスライスをＮａｎｏＺｏｏｍｅｒで画像化し、目的の領域を、ＮＯＰビューワを使用して各スライス中でトレースし測定する。体積＝（面積の合計）×０．３ｍｍの式を使用して、体積を計算する。海馬および後側脳室については、定量化は、ブレグマ－１．１で開始し、ブレグマ－３．９で終了する。梨状／内嗅皮質については、定量化は、ブレグマ－２．３で開始し、ブレグマ－３．９で終了する。

ニューロン層厚測定。各マウスからの３つの切片（ブレグマ－１．４、－１．７、および－２．０ｍｍ）を載せ、クレシルバイオレット中で５分間室温で染色する。次に、スライスを、５０％、７０％、９５％（３回）、および１００％エタノール（２回）中で１分間連続して脱水した後、キシレン中で４分間清澄化し（２回）、Ｃｙｔｏｓｅａｌ中でカバースリップをする（Ｃｏｏｎｅｔａｌ．，２００７）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８３１０－１６）。ＣＡ１錐体細胞層および歯状回顆粒細胞層の厚さを、３つすべてのスライス中の２つのスポットで細胞層に垂直なスケールを描出し、各マウスの平均値を取ることによって測定する。

ＲＮＡＳｅｑトランスクリプトーム分析。総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ法を使用して抽出し、その後のクリーンアップを、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で行った。ＲＮＡ量をＮａｎｏｄｒｏｐＮＤ－１０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって評価し、ＲＮＡ品質をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価した（Ｒａｍａｎｅｔａｌ．，２００９、ＴｕｍｏｒＡｎａｌｙｓｉｓ，２００４）。総ＲＮＡを精製し、増幅し、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、ペアエンド配列決定反応のためにＩｌｌｕｍｉｎａフローセルにロードする（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，２０１４）。（０．５μｇの総ＲＮＡ）ＴｒｕＳｅｑＲＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔｖ２を使用して、ライブラリーを調製する。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑペアエンドリードを、ＳＴＡＲ（２．３．１ｚ１３＿ｒ４７０）を使用して、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９ヒト参照ゲノムおよびＲｅｆＳｅｑ遺伝子定義（２０１４－０６－０２）に整列させる。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（２．２）を使用して、整列させたリードを、ＲｅｆＳｅｑ遺伝子定義を使用して配列決定した１００万個の断片当たりのエクソンのキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）に変換する。ＦＰＫＭが０．１２５超である遺伝子を分析に含める。調節不全の遺伝子は、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）およびＨｕｍａｎＰｒｏｔｅｉｎＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤａｔａＢａｓｅ（ｗｗｗ．ｈｐｒｄ．ｏｒｇ）を使用して、機能的に注釈を付ける。数値データの比較には両側スチューデントｔ検定を使用し、カテゴリーデータの比較にはイェーツ補正を使用するカイ二乗検定を使用する。ファイルを、ＰａｒｔｅｋＧｅｎｏｍｉｃｓＳｕｉｔｅソフトウェアバージョン６．６、２０１２（Ｐａｒｔｅｋ）で処理する。一元配置ＡＮＯＶＡを、マッチした群を比較するために使用し、二元配置または三元配置ＡＮＯＶＡを、変動源として特定されたパラメータを有する群を比較するために使用する。０．０５未満のｐ値を有意であるとみなす（ｐ値は、ベンジャミニ－ホッホベルク補正を使用して複数の試験について補正した）。「一般病変」に関連して、正常な細胞機能遺伝子および自食作用関連遺伝子を、Ｓｈｉｅｔａｌ．（２０１７）の研究で詳細されているとおりに評価する。

アミロイド関連。アミロイド／Ａβ負荷の定量化を、標準的な方法を使用して行う（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，１９９７）。簡潔に述べると、各々３００μｍ離れたマウス１匹あたり４つの脳切片を定量化のために選択する。これらの切片は、マウス脳図解におけるブレグマ－１．４、－１．７、－２．０、および－２．３ｍｍでの切片に概ね対応する（Ｆｒａｎｋｌｉｎｅｔａｌ．，２０１９）。脳Ａβ負荷の定量化は、ビオチン化３Ｄ６抗体で免疫染色した後に完了する（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。画像を、斑を強調するように閾値付けした後、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）の「ＡｎａｌｙｚｅＰａｒｔｉｃｌｅｓ」機能によって分析する。閾値付け後、特定された物体を個別に検査して、定量された各物体が斑であることを確認する。ＡβＩＲ（Ａβ負荷）またはチオフラビン－Ｓ（アミロイド負荷）によって覆われた表面積の割合を、上昇層、錐体細胞層、放線状層、および歯状回を含む海馬形成の特定の領域に関して決定する。その後、Ａβまたはチオフラビン－Ｓ負荷を、定量した総面積の％として表す。平均で４つの組織切片を使用して、各マウスの斑負荷を定量する。すべての分析を盲検で行い、検査者は任意の動物の治療条件を認識していない。

標準的な方法を使用するサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、マウスからの脳ホモジネート中でＡβレベルをアッセイする（Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，２００９、Ｈｏｌｔｚｍａｎｅｔａｌ．，２０００、Ｂａｌｅｓｅｔａｌ．，１９９７）。簡潔に述べると、脳組織は、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを含有するＲＩＰＡおよび５．５－Ｍグアニジン緩衝液（１：１０００、Ｒｏｃｈｅ）を用いて連続して均質化する。ＲＩＰＡ抽出後に測定したＡβはＡβの可溶性プールを表す一方、グアニジン抽出後に測定したＡβは不溶性プールを表す。ホモジネートを、Ａβ１～４０またはＡβ１～４２の測定の前に、冷たい試料希釈緩衝液（リン酸緩衝食塩水中の１％ウシ血清アルブミン－０．０５％ＴＷＥＥＮ２０［ＰＢＳＴ］）で希釈する。試料を、Ａβ１～４２（２１Ｆ１２）、またはＡβ１～４０（２Ｇ３）のＣ末端ドメインを捕捉抗体として特異的に認識する抗体でコーティングしたプレート上にロードし、ビオチン化３Ｄ６を検出に使用する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合ストレプトアビジン（ＲｅｓｅａｒｃｈＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とインキュベーションした後のＩＲシグナルを、ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発色させ、ＳｙｎｅｒｇｙＨ１Ｈｙｂｒｉｄプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で読み取る。Ａβのレベルを、組換えヒトＡβ（ＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄｅＣｏｍｐａｎｙ）で生成された標準曲線を使用して計算する。脳ホモジネート中のＡβのレベルを三連で決定し、タンパク質含有量に対して正規化し、Ａβ／タンパク質ｍｇの量として表す。Ａβオリゴマーを、同じＮ末端（残基１～１６）抗体を捕捉および検出の両方に使用する３Ｄ６／ビオチン－３Ｄ６サンドイッチＥＬＩＳＡ（ｌｍｍｕｎｏ－ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて定量する。

タウ関連。ＥＬＩＳＡ。ヒト総タウ、およびｐ－タウを、Ｃｈａｉｅｔａｌ．（２０１１）によって説明されているように、サンドイッチＥＬＩＳＡとして、ｐＳ２０２／Ｔ２０５－タウ（ＡＴＳ）およびｐＴ２１２／ｐＳ２１４－タウ（ＡＴ１００）抗体によって定量する。簡潔に述べると、９６ウェルプレートを、５μｇ／ｍＬのＡＴＳ、または２μｇ／ｍＬのＡＴ１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、一晩４℃で事前コーティングし、続いてＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングする。試料（Ｓ１またはＰ１）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で希釈し、ビオチン化ＨＴ７抗体（１：３００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にプレートにロードする。１時間２３℃でインキュベーションした後、試料を、ＴＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０洗浄緩衝液で９回洗浄し、続いて、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに３０分間インキュベートする。次に、プレートを、ワンステップ３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに３０分間インキュベートすることによって発色させ、２ＮＨ_２ＳＯ_４で停止させた後、ＢｉｏＴｅｋＳｙｎｅｒｇｙＨ１ＨｙｂｒｉｄＲｅａｄｅｒを４５０ｎｍで使用して読み取る。ＡＴＳまたはＡＴ１００免疫反応性タウの量を、ヒトＡＤ脳ホモジネートに由来する標準曲線を使用して決定する。

炎症関連。２つのマウスモデルと関連付けられる炎症に対する遺伝子治療の程度および特徴を、Ｓｈｉｅｔａｌ．（２０１７）によって説明されているように評価する。免疫組織化学は、ＣＤ６８陽性およびＩｂａ－１小膠細胞株化および星状膠細胞株化（ＧＦＡＰ）によって評価する。加えて、ＲＮＡｓｅｑデータを、Ｓｈｉｅｔａｌ．（２０１７）によって使用されるものと同じ炎症誘発遺伝子を使用して評価し、特に炎症促進遺伝子クラスター１および星状膠細胞Ａ１特異的（炎症のみ）遺伝子に焦点を当てる（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。

統計的考察。ベクター由来ＡＰＯＥ、一般病変、アミロイド関連、タウ関連、炎症関連（表ＩＩ）のカテゴリー内の各測定について、多元配置ＡＮＯＶＡモデルを適用する。主なＡＮＯＶＡモデルは、マウスモデル（ＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４、Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４）、ベクター（ＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ３ＣｈＣ、－ＡＰＯＥ３、ＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２ＣｈＣ、－ＡＰＯＥ２、ＡＡＶｒｈ．１０Ｎｕｌｌ）、用量（０．５×１０^１０および１×１０^１０ｇｃ）、時間（５か月および９か月）、および性別（雄／雌）の５つの因子を含み、ここで、一度に１つのベクターを非処置ＰＢＳと比較する（ただし、それ以外は同じ因子）追加の別個のＡＮＯＶＡを使用し、ＰＢＳ対照と比較して影響を探索する。中心仮説を、アミロイド関連およびタウ関連測定のための以下の事前コントラストを有する主要なＡＮＯＶＡモデルを用いて評価する。ＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ３ＣｈＣ対ＡＡＶｒｈ．１０Ｎｕｌｌ（目的１）、およびＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２ＣｈＣ対ＡＡＶｒｈ．１０Ｎｕｌｌ、およびＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ３ＣｈＣ対ＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２ＣｈＣであり、これらの各々は、マウス株間、各マウス株内の用量間、および各マウス株内の時点間に適用される。これには、４５（＝ベクター比較×因子比較×測定）の計画された試験が含まれ、ボンフェローニ補正を使用して、全体的な０．０５のＩ型エラーを制御する有意性を評価する。ＰＤＡＰＰマウス脳アミロイドーシス実験において、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２を対照と比較したときの、２７．２％の可溶性Ａβ１～４２における差および各群の観察された標準偏差（図８）により、０．８５超の検出力が得られ、不溶性Ａβ１～４２についての経験的差および標準偏差を考慮すると、検出力はさらに大きくなり、これにより、全体的な設計が中心仮説の評価に十分な検出力を有することが示される。これらの事前比較と同様に、探索的事後試験アプローチ（適切な補正を伴う）を追加的に適用して、異なるマウスモデル、用量、および測定時間についての脳ベクター由来ＡＰＯＥの量を評価し、一般病態および炎症関連測定（体積およびＲＮＡ－Ｓｅｑ）に対するより幅広いベクターの影響（例えば、互いに対してならびにＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ３およびＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ２に対して比較したＡＡＶｒｈ．１０－ＡＰＯＥ３ＣｈＣおよびＡＡＶｒｈ．１０ＡＰＯＥ２ＣｈＣ）を探索し、かつこれらの影響へのマウスモデル、ベクター、用量、測定時間、および性別の寄与を予測する。

実施例２
概要
変性性脳疾患であり、認知症の最も一般的な原因であるアルツハイマー病（ＡＤ）は、現在、世界中で５８０万人の米国人、全世界で５０００万人の人々を侵している。ＡＤ症状には、細胞外ベータ－アミロイド斑、細胞内タウのもつれ、慢性炎症、および脳萎縮を含む、認知能力および機能的能力の進行性の低下、ならびに脳病変が含まれる。遅発性ＡＤへの感受性に対する最も強力な遺伝的リスク因子は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）対立遺伝子の多型に関する。ＡＰＯＥ４はＡＤ患者において高頻度で見出され、ホモ接合性遺伝は、ＡＤを発症するリスクの１４．５倍の増加と関連付けられる。対照的に、ＡＰＯＥ２は、ＡＤ発症のリスクを減少させ、疾患の発症を遅延させ、例えば、ＡＤを発症するリスクを５０％以上低減し、発症年齢を遅延させる。疫学的データに基づき、ＡＰＯＥ４は、ＡＤにおける脳アミロイド負荷の増加およびより大きな記憶障害と関連付けられる一方、ＡＰＯＥ２は、これらの効果を弱める。ヒトにおいて、ＡＰＯＥ４／４ホモ接合型遺伝子型のＡＤを発症するオッズ比は１４．５であり、ＡＰＯＥ２／４ヘテロ接合体においては２．６に低減される。このため、ＡＰＯＥ４の存在は、保護的ＡＰＯＥ２によって補充されたとしても依然としてリスクを引き起こす。加えて、ＡＰＯＥ４は、β－アミロイド産生を促進するその役割の他に、先天性免疫活性の増加、ニューロンにおける差別的シグナル伝達、タウ病変の増悪、および異常な脳機能と関連付けられる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＡＰＯＥ２をＡＤマウスモデルのＣＮＳに直接送達することで、ＡＰＯＥ２の有意な発現をもたらし、可溶性及および不溶性アミロイド－βペプチドならびにアミロイド負荷のレベルを減少させ得る。しかしながら、ＡＰＯＥ２を補充したとしても、ＡＰＯＥ２／４ヘテロ接合体は、ＡＤを発症するリスクが２．６倍増加するため、ＡＰＯＥ４の存在は依然としてリスクの増加を引き起こす。一実施形態では、ＡＰＯＥ４ホモ接合体における有害な内因性ＡＰＯＥ４のレベルを減少させると同時に、保護的ＡＰＯＥ２、修飾ＡＰＯＥ２、またはＡＰＯＥ３の発現を導入するＡＡＶベースの遺伝子治療が提供される。一実施形態では、内因性ＡＰＯＥ４を標的とする人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、ヒトＡＰＯＥ２遺伝子（ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４）のｃＤＮＡとともに、ＡＡＶ発現カセットに導入する。一実施形態では、ＡＡＶ９血清型キャプシドは、ＡＰＯＥの主要産生源である星状膠細胞、ならびに小膠細胞およびニューロンの効率的な形質導入を媒介するので、発現カセットをパッケージ化するために用いられる。変異ヒトタウおよびヒトＡＰＯＥ４を発現し、高いリン酸化タウ負荷、慢性炎症、および広範な神経変性を有する確立されたＰ３０１Ｓ／Ｅ４ＡＤマウスモデルを使用して、治療有効性を評価する。ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４による戦略を評価するために、ＡＡＶ構築物を、インビトロでの内因性ＡＰＯＥ４発現のサイレンシングおよびＡＰＯＥ２コード配列の送達について試験する。加えて、内因性ＡＰＯＥ４の低減を伴うＡＰＯＥ２の増大により、インビボでのタウ病変、神経変性、および神経炎症から保護されるかどうかを決定する。

海馬内または視床内経路による２つのＡＤマウスモデルの中枢神経系（ＣＮＳ）へのヒトＡＰＯＥ２コード配列のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型ｒｈ．１０および血清型９送達により、脳全体にわたってヒトＡＰＯＥ２発現のレベルが顕著になった。さらに、脳の一部において、可溶性および不溶性アミロイド－βペプチドならびにアミロイド負荷の量が低減した。しかしながら、ＡＰＯＥ２を提供することのみによって脳をＡＰＯＥ４／４からＡＰＯＥ２／４に遺伝子修飾しても、ＡＰＯＥ４が存在するリスクを完全には軽減できない。ＡＡＶ遺伝子治療を使用して保護的ＡＰＯＥ２を送達するとともに内因性ＡＰＯＥ４の発現を減少させることで、ＡＰＯＥ２単独での遺伝子治療よりもＡＰＯＥ４ホモ接合体のリスクを減弱させ得る。

ヒトＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ４のコード配列は、２つのヌクレオチドによって異なる。抑制のために内因性ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡを標的とする人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）配列を設計した。人工ｍｉＲＮＡを、ヒト星細胞腫細胞株におけるＡＰＯＥ発現をサイレンシングする能力についてインビトロでスクリーニングする。選択したｍｉＲＮＡを、ｍｉＲＮＡによってサイレンシングすることができない修飾ヒトＡＰＯＥ２ｃＤＮＡとともに、ＡＡＶ発現カセットに組み込む。ＡＰＯＥ２を含有する選択したＡＡＶ発現カセットおよびＡＰＯＥ４を標的とする人工ｍｉＲＮＡを、ＣＮＳにおけるＡＰＯＥの主要産生源である星状膠細胞に発現を標的化するために、ＡＡＶ９キャプシドにパッケージ化する。

Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４ＡＤマウスモデルのマウスは、ヒト変異型タウおよびヒトＡＰＯＥ４の両方を発現し、小膠細胞活性化からの高レベルのリン酸化タウ、脳萎縮、および神経炎症を発症する。ＣＮＳ内のＡＰＯＥは主に星状膠細胞から発現するため、本研究では、小膠細胞およびニューロンだけでなく、星状膠細胞を効率的に形質導入するＡＡＶ９ベクターを使用する。ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４およびＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２ベクターは、嚢内経路によってＰ３０１Ｓ／Ｅ４マウスのＣＮＳに直接投与する。マウスを、経時的な行動および認知機能の変化について評価する。屠殺後、マウスを、脳中のベクター由来ｈＡＰＯＥ２および内因性ｈＡＰＯＥ４の発現、ならびにβ－アミロイド、総タウレベルおよびリン酸化タウレベルおよび病変、小膠細胞活性化、ならびに脳萎縮について評価する。

戦略。アルツハイマーの症状には、記憶喪失、混乱、性格および気分の変化、ならびに基本的な活動を行う能力の喪失を含む、認知および機能的能力の進行性の低下が含まれる１。ＡＤと関連付けられる脳病変には、細胞外ベータ－アミロイド（Ａβ）斑および細胞内神経原線維タウのもつれの蓄積が含まれる。進行したＡＤ脳には、神経膠活性化による慢性的な神経炎症および脳萎縮につながる細胞喪失が存在する（ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＡｓ．，２０１９）。

遅発性ＡＤへの感受性に対する最も強力な遺伝的リスク因子は、アポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）対立遺伝子の多型に関する。ＡＰＯＥは、３つのアイソフォーム、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３、およびＡＰＯＥ４を有する。ＡＰＯＥ３は、最も一般的な対立遺伝子であり、一方でＡＰＯＥ４の対立遺伝子頻度は約１５％、ＡＰＯＥ２は８％である（Ｆａｒｒｅｒｅｔａｌ．，１９９７）。しかしながら、ＡＰＯＥ４を有するＡＤ患者の頻度は、４０～６５％である（Ｆａｒｒｅｒｅｔａｌ．，１９９７、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９３、Ｗａｒｄｅｔａｌ．，２０１２）。ＡＰＯＥ４は、認知低下の速度および重症度が加速していること、ならびにＡＤの発症年齢がより早いことと関連付けられる。対照的に、ＡＰＯＥ２は、ＡＤ発症のリスクを５０％減少させ、発症を最大１０年遅延させる（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９３、Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７、Ｓａｎｄｏｅｔａｌ．，２００８、Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．，２０１６）。

ＡＰＯＥは、末梢神経系および中枢神経系（ＣＮＳ）の両方における脂質輸送に主要な役割を有する分泌タンパク質である。ＡＰＯＥアイソフォームは、２つのアミノ酸１１２位および１５８位の２つのアミノ酸しか異ならない（ＡＰＯＥ２：Ｃｙｓ／Ｃｙｓ、ＡＰＯＥ３：Ｃｙｓ／Ａｒｇ、ＡＰＯＥ４：Ａｒｇ／Ａｒｇ）。しかしながら、これらの違いは、ＡＰＯＥの構造および機能に深く影響する（Ｈａｔｔｅｒｓ＆Ｐｅｔｅｒｓ－Ｌｉｂｅｕ，２００６）。ＡＰＯＥの血清および脳濃度は、アイソフォーム間で異なる（ＡＰＯＥ２＞ＡＰＯＥ３＞ＡＰＯＥ４）。通常高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）と関連付けられるＡＰＯＥ２およびＡＰＯＥ３と、低密度および非常に低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ）と関連付けられるＡＰＯＥ４とには、脂質化状態に差がある（Ｈａｔｔｅｒｓ＆Ｐｅｔｅｒｓ－Ｌｉｂｅｕ，２００６、Ｄｏｎｇｅｔａｌ．，１９９４）。加えて、ＡＰＯＥアイソフォームは、低密度リポタンパク質受容体関連１（ＬＲＰ１）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、およびＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を含む受容体に差別的に結合し、ＡＰＯＥ２は、親和性がＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ４よりも低い（（Ｂｕ，２００９，Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。

ＡＰＯＥは、ＡＤに見られる病変および神経変性に多くの役割を果たす。細胞外Ａβ斑は、ＡＤ病変の特徴である。Ａβ沈着は、ＡＰＯＥ４保因者においてより多く存在する（Ｄｏｒｅｙｅｔａｌ．，２０１４）。ＡＰＯＥ４は、Ａβ産生を増強し、リソソーム分解および血液脳関門を通過する輸送を損なうことによってＡβクリアランスを低減し、Ａβ凝集およびオリゴマー安定化を促進するため、毒性の機能獲得を示す（Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．，２００８、Ｄｕｅｔａｌ．，２００９、Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，２０１０、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，２０１４、Ｚｅｋｏｎｙｔｅｅｔａｌ．，２０１６、Ｌｉｎｅｔａｌ．，２０１８、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１８）。高リン酸化タウは、ＡＤ疾患の後期に見られる神経原線維もつれの主要な構成要素である（Ｈａｍｐｅｌｅｔａｌ．，２０１０）。ＡＰＯＥ４発現は、タウ病変を悪化させる（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。ＡＰＯＥ４は、他のアイソフォームよりも弱いタウへの結合を示し（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｆｌｅｍｉｎｇｅｔａｌ．，１９９６）、ニューロン中のＡＰＯＥ４の発現は、タウリン酸化を増加させ得る（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１８、Ｂｒｅｃｈｔｅｔａｌ．，２００４、Ｈａｒｒｉｓｅｔａｌ．，２００４）。ＡＰＯＥはまた、免疫調節機能を有し、より大きな免疫応答がＡＰＯＥ４対立遺伝子と関連付けられる（Ｓｈｉ＆Ｈｏｌｔｚｍａｎ，２０１８）。最近の研究により、ＣＮＳにおける先天性免疫活性化が、ＡＤにおける神経炎症、ならびにその後のニューロン喪失および脳萎縮に重要な役割を果たし、小膠細胞活性化が、ＡＰＯＥ４の存在によって促進されることが示された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．，２０１４、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１９）。ＡＰＯＥ４は、ＡＰＯＥ２よりも高い親和性でニューロン上の受容体に結合し、シナプス形成を含む多数のシグナル伝達経路の活性化の増強およびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）転写の増加を刺激する（Ｏｈｋｕｂｏｅｔａｌ．，２００１、Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，２０１７、Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，２０１９）。損傷したニューロン上のこれらの受容体に結合するＡＰＯＥ４はまた、ニューロン喪失および脳萎縮の増強につながる、小膠細胞によって発現されるＡＰＯＥ結合パートナーである「骨髄性細胞上に発現されるトリガー受容体－２」（ＴＲＥＭ２）との相互作用を介して小膠細胞によるニューロン貧食を促進するオプソニンとして作用し得る（Ａｔａｇｉｅｔａｌ．，２０１５、Ｂａｉｌｅｙｅｔａｌ．，２０１５、Ｙｅｈｅｔａｌ．，２０１６、Ｊｅｎｄｒｅｓｅｎｅｔａｌ．，２０１７）。さらに、ＡＰＯＥ４は、正常な星状膠細胞および小膠細胞の恒常性維持機能を破壊する（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚｅｔａｌ．，２０１９）。臨床的には、ＡＰＯＥ４は、認知低下の加速と関連付けられるが、一方でＡＰＯＥ２は保護的である（Ｓｈｉｎｏｈａｒａｅｔａｌ．，２０１６、Ｈｅｌｋａｌａｅｔａｌ．，１９９６、Ｓｔａｅｈｅｌｉｎｅｔａｌ．，１９９９、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，２００２）。このため、ＡＰＯＥ４は、ＡＤ発症に関連する複数のプロセスにおいて中心的な役割を果たし、介入の主要な標的である。

ヒト遺伝子データにより、ＡＰＯＥ４およびＡＰＯＥ２対立遺伝子が半顕性遺伝を有することが示される（Ｃｏｒｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４、Ｇｅｎｉｎｅｔａｌ．，２０１１）。ＡＰＯＥ４ホモ接合性個体は、ＡＤを発症するリスクが１４．５倍高いが、ＡＰＯＥ２／４個体は、リスクが２．６倍しか増加せず、保護的ＡＰＯＥ２対立遺伝子の存在により、ＡＰＯＥ４対立遺伝子の有害作用が部分的に軽減され得ることを示す。ＡＤ発症のリスクは、ＡＰＯＥ２／４ヘテロ接合体において実質的に低下するが、ＡＰＯＥ２／３またはＡＰＯＥ２／２遺伝子型を有する個体よりも依然として有意に高い（それぞれ、ＡＤ発症リスクが１．８倍および７．７倍減少（Ｇｅｎｉｎｅｔａｌ．，２０１１）。この遺伝子データにより、ＣＮＳ中のＡＰＯＥ２の増加とともにＡＰＯＥ４のレベルを低減することは、ＡＤ発症のリスクが高いＡＰＯＥ４保因者のための治療に有益であることが示唆される。

ＡＰＯＥ４を発現するヒト誘導多能性幹細胞由来ニューロンは、Ａβ産生の増加、タウリン酸化のレベルの増加、および遺伝子編集をとおしてＡＰＯＥ４をＡＰＯＥ３に変換することによって補正されたより多くの変性を有した（Ｌｉｎｅｔａｌ．，２０１８、Ｗａｎｇｅｔａｌ．，２０１８）。発明者らのグループおよび他者からの以前の研究により、ウイルスベクターによるＡＰＯＥ２のＣＮＳへの送達が、ＡＤ４１～４３のマウスモデルにおいて、ＡＰＯＥ２の発現の増加と、脳Ａβおよびアミロイド負荷の減少との両方を行うことが実証された。送達されたＡＰＯＥ２の用量および既存のＡβ１～４２沈着の量は、処置の有効性を決定する上で重要な因子であった（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。しかしながら、これらの以前の研究では、内因性ＡＰＯＥ４は依然として存在していた。

開示の治療は、ＡＤにつながる前に疾患プロセスを防止または停止させるために、症状発症のはるか前にＡＰＯＥ４ホモ接合体に送達され得る。

試験。以前の研究では、海馬内または視床内経路による２つのＡＤマウスモデルのＣＮＳへの、ヒトＡＰＯＥ２コード配列のＡＡＶ血清型ｒｈ．１０および血清型９送達を試験した。ヒトＡＰＯＥ２を、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリン１（ＰＳ１）変異、ならびにマウスＡＰＯＥ４３の代わりにヒトＡＰＯＥ４を発現するＡβアミロイドーシスのＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４ＡＤマウスモデルにおけるＡＡＶ９－ＡＰＯＥ２ベクターの視床内送達を使用して、脳全体にわたって高レベルに発現させた（図２１Ａ）。さらに、ＡＰＯＥ２増大により、このＡＤマウスにおけるＡβおよびアミロイド負荷が低減した（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）（図２１Ｂ）。１つの戦略は、ヒトＡＰＯＥ２遺伝子のｃＤＮＡとともに、内因性ＡＰＯＥ４を標的とする人工マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をＡＡＶ発現カセットにコードすることである。

標的配列選択。ＡＰＯＥ４配列を、複数のアルゴリズムを使用して、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に対する最良の標的化配列について評価し、標的外相互作用の可能性を最小限に抑えるようにスクリーニングした。選択したｓｉＲＮＡのノックダウン能力を、Ｕ８７ヒト星細胞腫細胞株内の内因性ＡＰＯＥについてインビトロで試験した（図２２）。ｓｉＲＮＡ配列はＡＰＯＥ４に特異的ではなく、すべてのＡＰＯＥアイソフォームの発現を阻害することになる。ＡＡＶベクターにおける発現のための人工ｍｉＲＮＡカセットに組み込むのに最良のｓｉＲＮＡ配列を選択した。

遺伝子治療の効果は、タウ病変、神経炎症、および神経変性に焦点を当てる。ＡＡＶベクターは、発現を下方調節するために内因性ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡを標的とする人工ｍｉＲＮＡとともにヒトＡＰＯＥ２の持続的な発現を送達する（ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４）。ＡＡＶ９は、脳内のＡＰＯＥの主要産生源である星状膠細胞、ならびに小膠細胞およびニューロンを効率的に形質導入するものであり、本研究に使用される（Ｘｕｅｔａｌ．，２００６、Ｆｏｕｓｔｅｔａｌ．，２００９、Ｇｒａｙｅｔａｌ．，２０１１、Ｇｏｎｇｅｔａｌ．，２０１５、Ｖａｇｎｅｒｅｔａｌ．，２０１６、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１４、Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２－２０１４）。このＡＡＶ遺伝子治療は、ＡＰＯＥ４ホモ接合体におけるＡＰＯＥ４と比べて強化されたＡＰＯＥ２発現を提供し、神経原線維タウのもつれを低減し、小膠細胞活性を減少させ、海馬および皮質病変を低減し、挙動を改善する。

内因性ＡＰＯＥ４発現をサイレンシングし、インビトロでＡＰＯＥ２コード配列を送達するＡＡＶ構築物。Ｕ８７ヒト星細胞腫細胞におけるＡＰＯＥの発現を効果的にノックダウンするｓｉＲＮＡ配列を特定した。これらの配列は、すべての対立遺伝子配列に共通のＡＰＯＥのセグメントを標的とする。最も効果的なｓｉＲＮＡ配列を選択し、増強したｍｉｒ１５５人工ｍｉＲＮＡ骨格に組み込んで、ｍｉｒＡＰＯＥ４を得る（Ｆｏｗｌｅｒｅｔａｌ．，２０１６）（図２３Ａ）。ヘアピンステムおよびＧＣ含有量におけるミスマッチの配置は、細胞におけるｍｉＲＮＡのプロセシングに影響を及ぼし得るので（Ｆｏｗｌｅｒｅｔａｌ．，２０１６、Ｆａｎｇ＆Ｂａｒｔｅｌ，２０１５）、最も効果的な設計を確実にするために、ｍｉｒＡＰＯＥ４のいくつかの反復を、インビトロでＡＰＯＥをノックダウンする能力について試験する。最適化したｍｉｒＡＰＯＥ４の２～４つの縦列コピーを、ＡＡＶ発現カセットプロモーター（ハイブリッドＣＭＶ／ニワトリβ－アクチン；ＣＡＧ）に存在するイントロンか、または導入遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙまたはｈＡＰＯＥ２－ＨＡ）停止コドンとポリアデニル化シグナルとの間の介在配列かのいずれかにクローニングして、発現カセット中のｍｉｒＡＰＯＥ４の最適な数および位置を決定する（Ｍｕｅｌｌｅｒｅｔａｌ．，２０１２）（図２３Ｂ）。ＡＡＶｍｉｒＡＰＯＥ４発現カセットプラスミドを、ＡＰＯＥの発現を低減する能力について、培地および細胞を採取する前に、７２時間Ｕ８７細胞をトランスフェクトすることによって、インビトロで試験する。ＡＰＯＥｍＲＮＡの発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより、分泌されたＡＰＯＥタンパク質をウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡにより評価する。

並行して、選択したｍｉｒＡＰＯＥ４の認識部位におけるヒトＡＰＯＥ２ｃＤＮＡのコード配列において、サイレント変異を作製して、ベクター由来のＡＰＯＥ２発現のサイレンシングができないことを確実にする。ベクター由来のヒトＡＰＯＥ２は、検出を容易にするためにＣ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを有する。ｍｉｒＡＰＯＥ４の存在下でのベクター由来のｈＡＰＯＥ２－ＨＡの発現は、抗ＨＡ抗体によるウエスタンブロットによるｈＡＰＯＥ２－ＨＡ発現の同時トランスフェクションおよび分析によって確認される。最適化したｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４カセットを、ＡＡＶ９血清型キャプシドにパッケージ化する。ＡＡＶ９は、脳内のＡＰＯＥの主要な産生源である星状膠細胞、ならびに小膠細胞およびニューロンを、効率的に形質導入する。ｈＡＰＯＥ２－ＨＡおよびｍｉｒＡＰＯＥ４を発現するＡＡＶ９ベクターの機能性を、インビボ実験に進む前に、インビトロで確認する。

ＡＰＯＥ２の増大は、内因性ＡＰＯＥ４の低減と相関する可能性があり、これは、インビボでのタウ病変、神経変性、および神経炎症から保護する。ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２をＣＮＳに投与することにより、ヒトＡＰＯＥ４の背景におけるＡβアミロイドーシスのＡＰＰ．ＰＳ１／ＴＲＥ４ＡＤマウスモデルにおいて、脳全体にわたってＡＰＯＥレベルが増加し、Ａβ１～４２レベルが低下した（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６、Ｋｉｍｅｔａｌ，２０１１）（図２１）。Ａβ負荷とは無関係のＡＤ脳萎縮および認知機障害における神経原線維タウのもつれおよび先天性免疫応答の重要性を理由に（Ａｒｂｏｌｅｄａ－Ｖｅｌａｓｑｕｅｚｅｔａｌ．，２０１９、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１９、Ｊｏｓｅｐｈｓｅｔａｌ．，２００８、Ｍａｔｔｓｓｏｎｅｔａｌ，．２０１８）、タウ病変、小膠細胞活性化、および神経変性を決定する。Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスは、前頭側頭型認知症に関連するＰ３０１Ｓ変異を含有する１Ｎ４Ｒヒトタウと、マウスＡＰＯＥを代置するヒトＡＰＯＥ４とを過剰発現する（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｙｏｓｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，２００７）。Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスは、ヒトＡＰＯＥ３またはＡＰＯＥ２を発現するマウスよりも、脳リン酸化タウ負荷が高く、神経変性および神経炎症がより広範であるが（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１９）、アミロイド斑形成を示さない（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｙｏｓｈｉｙａｍａｅｔａｌ．，２００７、Ｈａｕｒｉｇｏｔｅｔａｌ．，２０１３）。Ｐ３０１Ｓ１Ｎ４ＲタウＢ６／Ｃ３マウス（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ００８１６９）およびヒトＡＰＯＥ４ノックインマウス（ＴＲＥ４－Ｔａｃｏｎｉｃ１５４９：Ｂ６．１２９Ｐ２－Ａｐｏｅｔｍ３（ＡＰＯＥ＊４）ＭａｅＮ８）は、Ｐ３０１ＳマウスとＴＲＥ４マウスとを交配することにより、公開されたモデルを再現することができる。Ｃ５７Ｂ１／６マウスを野生型対照として使用する。

ヒトＡＰＯＥ２を発現するＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４を内因性ＡＰＯＥ４に対するｍｉＲＮＡと併せてベクターを介して送達することの影響を、Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４マウスにおける嚢内（ＩＣ）経路によって投与した後に評価する。ＩＣ経路は、侵襲性の最も低い投与で脳全体に広いベクター分布を提供する（Ｈａｕｒｉｇｏｔｅｔａｌ．，２０１３、Ｈｉｎｄｅｒｅｒｅｔａｌ．，２０１８、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，２０１８、Ｍａｒｋｍａｎｎｅｔａｌ．，２０１８）。ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２、ＡＡＶ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｍｉｒＡＰＯＥ４、ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ、および治療なし（ＰＢＳ）を、対照として使用する。マウスを、行動および神経学的評価について毎月評価する。屠殺後、マウスを、ベクター由来のｈＡＰＯＥ２および内因性ＡＰＯＥ４発現、Ａβペプチド負荷、総可溶性および不溶性タウ負荷、高リン酸化タウのもつれ、小膠細胞活性化、および脳神経変性について、投与後１か月および７か月に評価する（総年齢：それぞれ３か月および９か月）（表３）。

（表３）マウス研究

処置コホート当たり８週齢の成体マウス、ｎ＝雄１６匹およびｎ＝雌１６匹（ｎ＝合計１９２匹）。すべてのマウスは、研究バイアスの可能性を回避するためにコホート群に無作為に割り当て、すべての群にわたって動物に時間をずらした投薬を行う。ケージには、研究者に対して治療状態を盲検に保つために処置説明ではなく番号を振る。
処置コホートは、ヒトタウおよびＡＰＯＥ４遺伝子代置を有する二重変異型マウス株（Ｐ３０１Ｓ／Ｅ４）を含む。遺伝的背景が同じである野生型対照Ｃ５７Ｂ１／６株を、「治療なし」対照に使用する。
試験したベクターには、以下が含まれる：ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２、ＡＡＶ９－ｈＡＰＯＥ２－ｍｉｒＡＰＯＥ４、ＡＡＶ９－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｍｉｒＡＰＯＥ４、ＡＡＶ９－ｎｕｌｌ、または治療なし（ＰＢＳ）。
すべてのベクターを、１０^１１ゲノムコピー（ｇｃ）またはＰＢＳ（１０μｌ）でＩＣ経路を介してＣＳＦに投与する。この用量を、ヒトにおいて送達することが安全である用量（１０^１４ｇｃ）にスケーリングする（Ｓｈａｒｍａ＆ＭｃＮｅｉｌｌ，２００９）。
健康診断を、最初の２週間で３回／週、次いで、生存しているすべてのマウスにその後毎週行い、異常または変化した行動を観察した。毎週の健康診断の一部として、処置コホートを知らない人員がマウスを計量し記録する。
マウスを、２つの時点（３か月齢および９か月齢、ベクター投与後１か月および７か月）で屠殺し、各コホートの半分を屠殺する（ｎ＝雄８／雌８）。剖検中、マウスＣＳＦをまず大槽からサンプリングし、次いでマウスに冷ＰＢＳを灌流し、脳を収集し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で貯蔵する。脳の半分を、ベクターＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびタンパク質アッセイに使用する。残りの半球を固定し、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）、または病理学のために、５０μＭのスライスで冠状に切片化する。
毎月の間隔で、マウスを行動および神経学的評価に供する。マウスの自発運動および立つ／体を起こす能力を、赤外線ビームアレイを搭載したオープンフィールドチャンバ内で評価して、マウスの運動をモニタリングする６４。第２に、マウスを、新しい物体を導入した２４時間後に新規物体認識を使用することによって、認知能力について試験する。試験は、オープンフィールドチャンバ内部で行い、新しい物体を探索する時間を記録する（Ｗｅｂｓｔｅｒｅｔａｌ．，２０１３）。ＡＤマウスは、年齢とともに、この試験における成績の低下を示す。すべての試験は、知らされていない人員により、変化した行動の検査のためにビデオ録画される。
ｈＡＰＯＥ２－ＨＡおよびｈＡＰＯＥ４タンパク質を、ｈＡＰＯＥ４およびｈＡＰＯＥ２ＨＡタグに特異的な抗体によるウエスタンブロット／ＥＬＩＳＡによって複数の領域からの脳組織試料中で検出し、ｍＲＮＡは、対立遺伝子特異的プローブを使用するＲＴｑＰＣＲによって検出する（Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，２０１６）。
海馬、視床、および大脳皮質の顕微解剖切片を均質化し、ＲＩＰＡ（可溶性Ａβ）および５．５Ｍグアニジン（不溶性Ａβ）で連続して抽出する。Ａβ１～４２／１～４０レベルを、ＥＬＩＳＡによって定量する（Ｚｈａｏｅｔａｌ．，２０１６）。
脳溶解物を、ウエスタンブロットによって総タウ（ＢＴ２）およびリン酸化タウ（ＣＰ１３）に対する抗体でプローブする（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏｅｔａｌ．，２０２０）。
脳スライスを、ＩＨＣ／ＩＦのために、抗ホスホ－タウ抗体ＡＴ８によって染色する（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏｅｔａｌ．，２０２０）。
小膠細胞活性化を、ＩＨＣによるＣＤ６８陽性細胞に対する染色により、脳切片中で評価する（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。
３００μＭ離れた複数の脳スライスを、脳体積分析のために０．１％のスダンブラックで染色する。海馬、後側脳室、および梨状／内嗅皮質を含む目的の領域を追跡し、画像化ソフトウェアで測定する。３つの切片を、海馬領域の観察的変化のためのＣＡ１錐体細胞層および歯状回顆粒細胞層のニューロン層厚測定に対して、クレシルバイオレットで染色する。測定値を、すべての部位でＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して記録し、平均をとる（Ｓｈｉｅｔａｌ．，２０１７）。
ＡＡＶ９ベクター自体の神経毒性を、３つの切片の各々について陽性染色された細胞の割合を評価することによって、クレシルバイオレット染色した脳切片中で評価する。

統計。試験は、３つの独立した実験に対して３回で実施し、データは、別途明記しない限り、平均±標準偏差（ＳＤ）として提示する。群間の差は、複数の比較について、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して分析する。目的２の試験は、コホートごとにｎ＝８匹のマウス（雄８匹／雌８匹）を用いて行う。両群について変動係数が３５％である場合には、群ごとにｎ＝８を使用すると、２．８倍の群間の差が認められる（ｐ＜０．０５、検出力＝０．９５）。生化学的測定のための群間の差は、多重比較のためにＡＮＯＶＡによって分析する。行動評価は、複数の比較を伴う双方向反復測定ＡＮＯＶＡによって分析する。

例示的な修飾されたＡＰＯＥ２配列：

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参考文献

すべての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。先の明細書において、本発明を、そのある特定の実施形態との関連で説明し、多くの詳細を例示の目的で示してきたが、本発明には追加の実施形態を受け入れる余地があること、および本明細書に記載される詳細のうちのある特定のものが、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変化し得ることは、当業者には明白であろう。

Claims

１１２位、１３６位、もしくは１５８位のうちの少なくとも１つにアルギニン以外の残基を有するが、Ｒ１１２、Ｒ１３６、およびＲ１５８を有する哺乳動物アポリポタンパク質Ｅでも、Ｃ１１２、Ｒ１３６、およびＣ１５８を有する哺乳動物アポリポタンパク質Ｅでもない、哺乳動物アポリポタンパク質Ｅをコードするか、またはＡＰＯＥ４に結合するもしくはＡＰＯＥのへパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を分断させる抗体をコードする、発現カセット
を含む、遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅが、ヒトアポリポタンパク質Ｅである、請求項１に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅ中の前記アルギニン以外の残基が、セリン、トレオニン、アスパラギン、システイン、またはグルタミンである、請求項１または２に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１１２位が、システインを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１３６位が、アルギニンまたはセリンを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１５８位が、アルギニンまたはシステインを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１１２位、１３６位、または１５８位のうちの２つが、アルギニンを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１１２位が、アルギニンを有しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１３６位が、アルギニンを有しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記アポリポタンパク質Ｅの１５８位が、アルギニンを有しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
ウイルス遺伝子治療ベクターである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターである、請求項１１に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ウイルス遺伝子治療ベクターが、ｒＡＡＶベクターである、請求項１２に記載の遺伝子治療ベクター。
ＡＡＶベクターが、シュードタイプ化される、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｈｕ．２、またはＡＡＶ７キャプシドでシュードタイプ化される、請求項１４に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ５でシュードタイプ化される、請求項１５に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶｒｈ．１０である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のための、ＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ヌクレオチド配列が、第２のプロモーターに連結する、請求項１８に記載の遺伝子治療ベクター。
前記第２のプロモーターが、ＰｏｌＩＩＩプロモーターである、請求項１９に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ＲＮＡｉが、複数のｍｉＲＮＡ配列を含むｍｉＲＮＡを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
前記ＲＮＡｉが、複数のｓｉＲＮＡ配列を含むｓｉＲＮＡを含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクター。
請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む、医薬組成物。
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項２３に記載の医薬組成物。
前記ベクターが、ｒＡＡＶベクターである、請求項２４に記載の医薬組成物。
前記ベクターの量が、約１×１０^１１～約１×１０^１６ゲノムコピーである、請求項２４または２５に記載の医薬組成物。
哺乳動物におけるアルツハイマー病を防止、阻害、または治療するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
哺乳動物における認知低下を防止または阻害するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
哺乳動物におけるＡＰＯＥ４発現と関連付けられる疾患を防止、阻害、または治療するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
哺乳動物における脂質障害を防止、阻害、または治療するための方法であって、前記哺乳動物に、請求項１～２２のいずれか一項に記載の遺伝子治療ベクターを含む有効量の組成物を投与することを含む、方法。
前記哺乳動物が、Ｅ２／Ｅ４ヘテロ接合体、Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体、またはＥ３／Ｅ４ヘテロ接合体である、請求項２７、２８、２９、または３０に記載の方法。
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、全身投与される、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、注射される、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、中枢神経系に投与される、請求項２７～３２または３４のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、脳に投与される、請求項２７～３２または３４のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物の投与にカテーテルが用いられる、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、徐放性組成物である、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、
Ｃ１１２、Ｓ１３６、およびＲ１５８を有するか、またはＣ１１２、Ｓ１３６、およびＣ１５８を有する、アポリポタンパク質Ｅ
をコードする、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
前記ベクターが、ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のためのＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物が、ＡＰＯＥ４ｍＲＮＡの阻害のためのＡＰＯＥ４に対応するＲＮＡｉ配列を有するヌクレオチド配列を含む第２の組成物をさらに投与される、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の組成物が、リポソームを含む、請求項４１に記載の方法。
前記第２の組成物が、ナノ粒子を含む、請求項４１に記載の方法。
前記哺乳動物が、抗ヘパラン抗体、またはＡＰＯＥ４に結合するかもしくはＡＰＯＥのヘパラン硫酸プロテオグリカンへの結合を分断させる抗体、または前記抗体をコードするヌクレオチド配列を含む第２の組成物をさらに投与される、請求項２７～３８のいずれか一項に記載の方法。
ウイルスベクターが、前記抗体をコードする前記ヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
前記第２の組成物が、全身投与される、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の組成物が、局所投与される、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
ベクターがＡＡＶベクターである、請求項２７～４７のいずれか一項に記載のベクター。