CN114829390A - Apoe基因疗法 - Google Patents

Apoe基因疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN114829390A
CN114829390A CN202080081724.7A CN202080081724A CN114829390A CN 114829390 A CN114829390 A CN 114829390A CN 202080081724 A CN202080081724 A CN 202080081724A CN 114829390 A CN114829390 A CN 114829390A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vector
gene therapy
composition
apoe4
therapy vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080081724.7A
Other languages
English (en)
Inventor
R·G·克雷斯托
S·M·凯明斯基
K·斯泰尔斯
D·松地
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cornell University
Original Assignee
Cornell University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cornell University filed Critical Cornell University
Publication of CN114829390A publication Critical patent/CN114829390A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

提供了一种包括表达盒的基因疗法载体，所述表达盒编码在第112位、第136位或第158位中的至少一个处具有除精氨酸以外的残基的哺乳动物载脂蛋白E，而不是具有R112、R136和R158的哺乳动物载脂蛋白E或具有C112、R136和C158的哺乳动物载脂蛋白E，或编码与APOE4结合或破坏APOE与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的抗体，以及使用该载体的方法。

Description

APOE基因疗法
技术领域
本申请要求于2019年11月25日提交的美国申请第62/939999号申请日的权益，所述美国申请的公开内容通过引用并入本文。
背景技术
阿尔茨海默氏病(AD)直接影响500万美国人，并且其患病率和经济影响正在迅速增加。现有药物对潜在疾病过程几乎没有影响，并且目前没有可用的预防疗法。变体APOE4的遗传传递了患上AD的高风险，而APOE2基因的遗传具有保护性，从而将患上AD的风险降低约50％并延缓发病年龄。APOE4与AD中增加的脑淀粉样蛋白负载和更大的记忆障碍相关。相反，APOE2会减弱这些效应。先前的研究表明，将人类APOE2编码序列的腺相关病毒(AAV)基因递送到表达人类APOE4的鼠模型的CNS减少了淀粉样蛋白-β肽的数量和淀粉样蛋白负荷(Zhao等人，2016)。在人类中，在E4/E4纯合基因型的情况下，患上AD的优势比为14.9，而在E2/E4杂合子中，优势比降至2.6。最近的报道表明，除了其促进淀粉样蛋白产生的作用外，APOE4与异常的脑功能相关。
发明内容
本公开提供了一种基因疗法载体，其包括编码哺乳动物载脂蛋白E(APOE)的表达盒，该APOE在结合脂蛋白受体如LDLR或结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的区域中具有保护性或包含例如相对于APOE4的取代，该区域例如诸如从第135位到第151位结合的区域。在一个实施例中，所述基因疗法载体中的哺乳动物APOE在第112位、第136位或第158位中的至少一个处具有除精氨酸、组氨酸或赖氨酸以外的残基。在一个实施例中，所述基因疗法载体中的所述哺乳动物APOE在第112位和第136位处具有除精氨酸以外的残基。在一个实施例中，所述基因治疗载体中的所述哺乳动物APOE在第136位和第158位处具有除精氨酸以外的残基。在一个实施例中，所述基因疗法载体中的所述哺乳动物APOE在第112位、第136位和第158位处具有除精氨酸以外的残基。在一个实施例中，所述载脂蛋白E是人载脂蛋白E。在一个实施例中，除精氨酸以外的残基是丝氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸或甲硫氨酸。在一个实施例中，除精氨酸以外的残基是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸或谷氨酰胺。在一个实施例中，第112位具有半胱氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。在一个实施例中，第112位具有半胱氨酸。在一个实施例中，第136位具有苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸或丝氨酸。在一个实施例中，第136位具有丝氨酸。在一个实施例中，第158位具有半胱氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、精氨酸、甘氨酸或异亮氨酸。在一个实施例中，第158位具有精氨酸或半胱氨酸。在一个实施例中，第112位、第136位或第158位中的两个具有精氨酸。在一个实施例中，第112位不具有精氨酸。在一个实施例中，第136位不具有精氨酸。在一个实施例中，第158位不具有精氨酸。在一个实施例中，所述基因疗法载体中的所述哺乳动物APOE在第112位具有Cys，在第136位具有Ser，并且在第158位具有Cys。在一个实施例中，所述基因疗法载体中的哺乳动物APOE在第112位具有Cys，在第136位具有Ser，并且在第158位具有Arg。在一个实施例中，所述基因疗法载体是病毒基因疗法载体。在一个实施例中，所述基因疗法载体是腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。在一个实施例中，所述病毒基因疗法载体是rAAV载体。在一个实施例中，所述AAV载体用例如AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳假型化。在一个实施例中，所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8或AAV5假型化。在一个实施例中，所述AAV载体是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。在一个实施例中，所述基因疗法载体进一步包括具有对应于APOE4的RNAi序列的核苷酸序列，用于抑制APOE4 mRNA。在一个实施例中，所述第二基因疗法载体包括具有对应于APOE4的RNAi序列的核苷酸序列，用于抑制APOE4 mRNA。在一个实施例中，所述核苷酸序列连接到第二启动子。在一个实施例中，所述第二启动子是PolIII启动子。在一个实施例中，所述RNAi包括包含多个miRNA序列的miRNA。在一个实施例中，所述RNAi包括包含多个siRNA序列的siRNA。在一个实施例中，所述载体是质粒。在一个实施例中，所述载体中的哺乳动物载脂蛋白基因具有C112、S136和R158或C112、S136和C158。在一个实施例中，第二基因疗法载体包括具有编码抗APOE4或抗肝素抗体的核酸序列的核苷酸序列。
还提供了一种包括所述基因疗法载体的药物组合物。在一个实施例中，所述载体是病毒载体。在一个实施例中，所述载体是rAAV载体。在一个实施例中，所述组合物中载体的量为约1×1011至约1×1016个基因组拷贝。在一个实施例中，所述组合物中载体的量为约1×1012至约1×1015个基因组拷贝。在一个实施例中，所述组合物中载体的量为约1×1011至约1×1013个基因组拷贝。在一个实施例中，所述组合物中载体的量为约1×1013至约1×1015个基因组拷贝。在一个实施例中，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载剂。
进一步提供了一种预防、抑制或治疗阿尔茨海默病的方法，包含预防或治疗其一种或多种症状，例如哺乳动物的痴呆或其他tau蛋白病或认知障碍。在一个实施例中，在施用之前，哺乳动物具有脑中淀粉样蛋白斑增加和/或tau增加或处于脑中淀粉样蛋白斑增加和/或tau增加的风险中，例如，相对于年龄匹配的哺乳动物或具有降低的阿尔茨海默病或其他tau蛋白病或认知障碍风险的哺乳动物。在一个实施例中，所述哺乳动物患有认知障碍。所述方法包含向所述哺乳动物施用有效量的包括所述基因疗法载体的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括脂质体，所述脂质体包括所述载体。在一个实施例中，所述组合物包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括所述载体。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E3杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。在一个实施例中，所述人是成年人，例如，超过20岁，例如至少40、50或60岁。在一个实施例中，所述人是少年，例如，10至20岁。在一个实施例中，所述人是儿童，例如，即低于10岁。在一个实施例中，所述组合物在人出生时或在出生后1、2、3、4或5年内施用。在一个实施例中，所述组合物是全身性施用的。在一个实施例中，所述组合物是口服施用的。在一个实施例中，所述组合物是静脉内施用的。在一个实施例中，所述组合物是局部施用的。在一个实施例中，所述组合物是注射的。在一个实施例中，所述组合物施用于中枢神经系统。在一个实施例中，所述组合物施用于脑。在一个实施例中，所述组合物是缓释组合物。在一个实施例中，所述基因疗法载体的施用有效预防或抑制淀粉样蛋白斑的积累。在一个实施例中，所述基因疗法载体的施用有效预防或抑制tau病理学。在一个实施例中，所述基因疗法载体的施用有效预防或抑制淀粉样蛋白斑的积累以及预防或抑制tau病理学。
此外，提供了一种用于预防、抑制或治疗哺乳动物的与APOE4表达相关的疾病的方法。所述方法包含向所述哺乳动物施用有效量的包括所述基因疗法载体的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括脂质体，所述脂质体包括所述载体。在一个实施例中，所述组合物包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括所述载体。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。在一个实施例中，所述组合物是全身性施用的。在一个实施例中，所述组合物是口服施用的。在一个实施例中，所述组合物是静脉内施用的。在一个实施例中，所述组合物是局部施用的。在一个实施例中，所述组合物是注射的。在一个实施例中，所述组合物施用于中枢神经系统。在一个实施例中，所述组合物施用于脑。在一个实施例中，所述组合物是缓释组合物。
提供了一种减少哺乳动物中与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用有效量的包括所述基因疗法载体的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括脂质体，所述脂质体包括所述载体。在一个实施例中，所述组合物包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括所述载体。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。在一个实施例中，所述组合物是全身性施用的。在一个实施例中，所述组合物是口服施用的。在一个实施例中，所述组合物是静脉内施用的。在一个实施例中，所述组合物是局部施用的。在一个实施例中，所述组合物是注射的。在一个实施例中，所述组合物施用于中枢神经系统。在一个实施例中，所述组合物施用于脑。在一个实施例中，所述组合物是缓释组合物。
在一个实施例中，所述组合物经由导管施用在一个实施例中，所述组合物心室内施用。在一个实施例中，所述组合物颅内施用。在一个实施例中，所述组合物施用于腰部。在一个实施例中，所述组合物施用于小脑延髓池。在一个实施例中，所述组合物经由钻孔施用于脑。在一个实施例中，所述组合物在C1-C2以下施用。
在一个实施例中，施用组合物使得编码的基因产物如修饰的APOE或结合乙酰肝素的抗体的表达与哺乳动物中APOE4的表达水平相似。在一个实施例中，哺乳动物中分泌的载体编码基因产物与分泌的APOE4之比为1:1。在一个实施例中，哺乳动物中分泌的载体编码基因产物与分泌的APOE4之比为2:1。在一个实施例中，哺乳动物中分泌的载体编码基因产物与分泌的APOE4之比为0.5:1。在一个实施例中，哺乳动物中分泌的载体编码基因产物与分泌的APOE4之比为0.1:1。在一个实施例中，哺乳动物中分泌的载体编码基因产物与分泌的APOE4之比为3:1。在一个实施例中，哺乳动物中编码基因产物的表达水平预防或抑制认知衰退(恶化)。在一个实施例中，哺乳动物中编码基因产物的表达水平降低了tau缠结和淀粉样蛋白积累。
提供了一种预防、抑制或治疗哺乳动物脂质病症的方法，所述方法包含向所述哺乳动物施用有效量的包括基因疗法载体的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括脂质体，所述脂质体包括所述载体。在一个实施例中，所述组合物包括纳米颗粒，所述纳米颗粒包括所述载体。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。在一个实施例中，所述组合物是全身性施用的。在一个实施例中，所述组合物是口服施用的。在一个实施例中，所述组合物是静脉内施用的。在一个实施例中，所述组合物是局部施用的。在一个实施例中，所述组合物是注射的。在一个实施例中，所述组合物施用于中枢神经系统。在一个实施例中，所述组合物施用于脑。在一个实施例中，所述组合物是缓释组合物。
在一个实施例中，基因疗法载体包括编码如本文所述修饰的人APOE基因和靶向内源性APOE4的顺式或反式人工miRNA的AAV表达载体。此载体系统与来自基因疗法载体(例如，AAV载体)的有益APOE基因的补充组合使有害内源性APOE4的表达沉默。示例性微小RNA序列被并入到编码人APOE编码序列的载体转基因质粒的CAG启动子内含子或polyA尾中。可替代地，可以将微小RNA插入在PolIII启动子(例如，U6启动子)与APOE表达盒的polyA位点之后的终止子之间。载体衍生的人APOE DNA序列可以包含沉默的核苷酸变化以确保其不受微小RNA的抑制，并且可以包含用于检测的标签，例如HA标签，以例如用于临床前检测研究。在一个实施例中，将所述表达构建体包装到血清型的AAV衣壳中，所述血清型靶向星形胶质细胞和胶质细胞(例如，AAV9，但是可以为其他载体)，即CNS中内源性APOE表达的突出位点。
本文所述的载体可用于预防、抑制或治疗认知障碍、痴呆、阿尔茨海默病，例如常染色体显性、迟发性或早发性。在一个实施例中，哺乳动物在施用载体后具有减少的纤维状淀粉样蛋白β斑负荷、减少的成对螺旋丝tau水平或减少的神经变性。在一个实施例中，本文所述的载体可用于预防、抑制或治疗例如与外伤性脑损伤、中风、短暂性脑缺血发作、痴呆、克雅氏病、多发性硬化、朊病毒病、皮克氏病、皮质基底节变性、帕金森病、路易体痴呆、进行性核上性麻痹相关的认知障碍；拳击员痴呆(慢性创伤性脑病)；17号染色体连锁额颞叶痴呆合并帕金森症；Lytico-Bodig病；缠结优势型痴呆；神经节胶质瘤和神经节细胞瘤；脑膜血管瘤病；亚急性硬化性全脑炎；铅中毒脑病、结节性硬化症、哈勒沃登-施帕茨(Hallervorden-Spatz)病和脂褐质沉着症；嗜银颗粒病；或额颞叶变性。
本文所述的载体还可用于预防、抑制或治疗与高脂蛋白血症如I型、2型、3型、4型或5型相关的一种或多种症状。在一个实施例中，载体的施用量降低循环胆固醇，例如降低VLDL和/或LDL，降低中密度脂蛋白，降低胆固醇和/或甘油三酯的血浆水平，降低含有VLDL的甘油三酯，降低小球毛细血管中的脂质积累，降低球内脂蛋白或降低血栓。
附图说明
图1.APOE等位基因、患病率和患上阿尔茨海默病的相关风险。
图2.示例性病毒基因疗法。
图3.基因疗法的示例性施用途径。
图4.不同APOE等位基因的选定氨基酸残基、患病率和患上阿尔茨海默病的相关风险。
图5.不同APOE等位基因中两个位置的核苷酸残基。
图6.APOE3ch突变。
图7.APOE3ch突变的影响。
图8.APOE3ch对肝素的亲和力。
图9.APOE或tau与HSPG结合的可能机制。
图10.用于预防、抑制或治疗与某些APOE等位基因表达相关的疾病的示例性基因疗法方法。
图11.APOE等位基因与显性III型高脂蛋白血症和脂蛋白肾小球病的关联。
图12.使用AAV介导的APOE AD降低风险变体递送的基因疗法。基于APOE4纯合子AD风险增加15-20倍的知识(Reiman等人，2020；Corder等人，1993；Hefferman等人，2016)，采用了使用AA V载体递送APOE2和APOE3变体与克赖斯特彻奇(Christchurch)变体的编码序列以降低AD风险的治疗策略。
图13.APOE变体、AD风险，以及建议的基因疗法以防止APOE4。APOE2、3和4是常见的变体(Hefferman等人，2016；ALXFORUM，2010)。在于APOE3背景上的克赖斯特彻奇突变保护免受导致早发性AD19的PSEN 1-E290A显性变体的病例报告中，APOE3ChC是叠加在PSEN1-E290A上的变体。APOE3ChC和APOE2ChC变体可能是减轻APOE4纯合子中AD高风险的疗法。自然界中尚未观察到APOE2ChC变体，但它可能比APOE3ChC更有效。*在PSEN 1-E290A的情况下低。
图14.支持APOE3ChC在具有PSEN1-E280突变的女性中的相对作用的研究。显示了平均皮质淀粉样蛋白斑负荷(匹兹堡(Pittsburgh)化合物8，PET)、颞下皮层PHF tau负荷(Florataucipir PET)、海马体积(MRI)和楔前叶葡萄糖代谢(氟脱氧葡萄糖PET)的量化数据。黑点——典型年轻时出现MCI的PSEN1携带者；灰点——尚未发展MCI的PSEN1携带者；具有PSEN1携带者+APOE3ChC变体的受试者(带箭头的红点)。由Arboleda-Velasquez等人(2019)修改的图。
图15.克赖斯特彻奇突变削弱了APOE的肝素结合。ELISA用于量化来自肝素柱的不同APOE异构体的NaCl洗脱模式的差异。取自Arboleda-Velasquez等人(2019)的图。箭头表示具有APOEChC变体的受试者。
图16.AAVrh.10hAPOE2载体。AAVrh.10hAPOE2载体表达组成型CAG启动子后面的人APOE2转基因，该组成型CAG启动子由巨细胞病毒(CMV)增强子、鸡β肌动蛋白启动子、剪接供体和内含子，和兔β-珠蛋白剪接受体组成，然后是兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(An)。hAPOE2表达盒两侧是AAV2反向末端重复序列(ITR)，并包装到恒河猴腺相关病毒载体血清型10(AAVrh.10)衣壳中。除了APOE编码序列外，本提案中使用的所有APOE载体都是相同的。AAVrh.10Null载体是相同的，但表达盒AAVrh.10hAPOE2被不可翻译的序列替换。
图17.以AAVrh.10hAPOE2为例，显示了SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，其显示了与预期分子量对齐的3个AAV载体衣壳蛋白相关的3个条带。
图18.在脑池内施用AAVrh.10APOE2后评估APOE2蛋白在非人灵长类动物脑中的分布。在疗法后8周评估NHP施用的AAVrh.10hAPOE2(5×1013gc，APOE2转基因)。将右半球细分为1cm3的立方体，并通过ELISA分析蛋白质APOE2水平。A：脑切片中的人APOE2蛋白。B：在3个时间点[施用前(第0天)，和施用后第28天和第56天]从3个NHP中取样CSF(10μl/时间点)，并通过SOS-PAGE分析，然后由蛋白质印迹(Western)进行APOE2抗体检测。参见Rosenberg等人(2018)。
图19A至19B.PDAPP小鼠模型中淀粉样蛋白病理学的分解。将AAVrh.10hAPOE2或对照AAVrh.10mCherry(1010gc)双侧施用到9月龄的PDAPP小鼠的海马中。施用后八周，处死小鼠，并解剖左半球海马，均质化，并依次用RIPA(代表可溶性Aβ)和5.5M胍(代表不溶性Aβ)提取。Aβ1-42和Aβ1-40水平通过ELISA测定。A)Aβ1-42的组织水平；和B)注射AAVrh.10hAPOE2或AAVrh.10mCherry的PDAPP小鼠海马中Aβ1-40的组织水平。每组n＝10-12只动物。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，***p<0.001。参见Zhao等人(2016)。
图20A至20B.海马内递送APOE2对2.5个月龄APP.PS1/TRE4小鼠海马AP水平的剂量依赖性影响。将AAVrh.10hAPOE2(0.25×1010，0.5×1010或1×1010gc)或AAVrh.10mCherry(1×1010gc)双侧注射到2.5个月龄的雄性APP.PS1/TRE4小鼠的海马中。施用后八周，处死小鼠。解剖左半球的海马，均质化，并依次用RIPA(代表可溶性Aβ)和5.5M胍(代表不溶性Aβ)提取。通过ELISA测定每种提取物中的Aβ1-42水平。A)海马中的不溶性Aβ1-42水平(可提取胍)。B)海马中的可溶性Aβ1-42水平(可提取RIPA)。每组n＝3-5只动物。数据表示为平均值±标准差；*p<0.05，***p<0.001。Zhao等人(2016)。
图21A至21B.AAV9-hAPOE2的丘脑内递送对APP.PS1/TRE4小鼠脑中APOE和Aβ水平的影响。通过双侧丘脑内注射(1010gc)向十周龄小鼠施用AAV9-hAPOE2或AAV9-GFP，并在8周后处死。将左半球的丘脑、海马和大脑皮层解剖和均质化。A)APOE和B)Aβ1-42水平通过ELISA进行量化。改编自Zhao等人。
图22.体外敲低APOE。用靶向APOE的siRNA或非靶向(NT)对照(5pmol)转染U87人星形胶质瘤细胞。72小时后收集细胞，并通过RT-qPCR量化内源性APOE mRNA水平。基于多种siRNA设计算法的比较，产生了四种不同的靶向APOE的编码序列的siRNA。鉴定的序列如下：GGUGGAGCAAGCGGUGGAGuu(SEQ ID NO:20)；GGAGUUGAAGGCCUACAAAuu(SEQ ID NO:21)；GGAAGACAUGCAGCGCCAGuu(SEQ ID NO:22)；和GCGCGCGGAUGGAGGAGAUuu(SEQ ID NO:23)。
图23A至23B.hAPOE2-mirAPOE4表达盒。A)mirAPOE4示意图。siRNA靶向序列(引导链)和具有选定错配以方便加工的反义序列(过客链)被并入增强的mir155主链中。B)AAV9-hAPOE2-mirAPOE4表达构建体示意图。该构建体含有与组成型CAG启动子[巨细胞病毒(CMV)增强子、鸡β肌动蛋白启动子、剪接供体和内含子和兔β-珠蛋白剪接受体]后面的血凝素标签(HA)融合的人APOE2编码序列，然后是兔β-珠蛋白聚腺苷酸(polyA)信号。mirAPOE4串联重复序列插入CAG内含子和/或转基因终止密码子和polyA序列之间。hAPOE2表达盒的两侧是AAV2反向末端重复序列(ITR)，并被包装到AAV9衣壳中。可以采用来自siRNA#2的miR，例如CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGATTTGTAGGCCTTCAACTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGTGAGGCCTACAAATCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC(SEQ ID NO:24)；CTGGAGGCTTGCTTTGGGCTGTATGCTGATTTGTAGGCCTTCAACTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGTTGAAGTCACAAATCAGGACACAAGGCCCTTTATCAGCACTCACATGGAACAAATGGCCACCGTGGGAGGATGACAA(SEQID NO:25)；或CTGGAGGCTTGCTTTGGGCTGTATGCTGTTCCGATTTGTAGGCCTTCAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGAAGTCACAAATCGGAACAGGACACAAGGCCCTTTATCAGCACTCACATGGAACAAATGGCCACCGTGGGAGGATGACAA(SEQ ID NO:26)。
图24.测试位于内含子和polyA中的miR的敲低效率。
图25.敲低效率的荧光素酶结果。
图26.测试仅含APOE靶位点的对照
图27.用沉默的核苷酸变化识别载体衍生的APOE2中的miRNA靶位点。
图28.产生pAAV-miRNA-APOE-HA。
图29.体内研究。
图30.对照中的荧光素酶表达。
具体实施方式
在以下描述中，参考了形成其一部分的附图，并且其中通过可以实践的说明性具体实施例的方式示出。详细描述这些实施例以使本领域技术人员能够实践本发明，并且应当理解，可以利用其他实施例并且可以进行逻辑改变而不脱离本发明的范围。因此，示例性实施例的以下描述不应以限制性意义采用，并且本发明的范围由所附权利要求限定。
详细描述
定义
“载体”是指包括多核苷酸或与多核苷酸缔合并且可以用于在体外或体内介导多核苷酸到细胞的递送的大分子或大分子的缔合物。说明性载体包含例如质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送媒剂。待递送的多核苷酸，有时称为“靶多核苷酸”或“转基因”，可以包括基因疗法中所关注的编码序列(如编码治疗上所关注的蛋白质的基因)、疫苗开发中所关注的编码序列(如表达适合在哺乳动物中引发免疫反应的蛋白质、多肽或肽的多核苷酸)和/或可选择或可检测标志物。
如本文所使用的，“转导(transduction)”、“转染”、“转化”或“转导(transducing)”是指用于将外源性多核苷酸引入到宿主细胞中导致多核苷酸(例如，细胞中的转基因)表达的过程的术语，并且包含使用重组病毒将外源性多核苷酸引入到宿主细胞。细胞中多核苷酸的转导、转染或转化可以通过本领域熟知的方法确定，包含但不限于蛋白质表达(包含稳态水平)，例如通过ELISA、流式细胞术和蛋白质印迹(Western blot)，通过杂交测定(例如，RNA印迹(Northern blot)、DNA印迹(Southern blot)和凝胶迁移率测定)测量DNA和RNA。用于引入外源性多核苷酸的方法包含众所周知的技术，如病毒感染或转染、脂质转染、转化和电穿孔，以及其他非病毒基因递送技术。所引入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。
“基因递送”是指将外源性多核苷酸引入到细胞中以进行基因转移，并且可以涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。
“基因转移”是指将外源性多核苷酸引入到细胞中，所述引入可以涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位和复制子整合，但不同于且不暗示随后的基因表达。
“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。
“感染性”病毒或病毒颗粒是包括多核苷酸组分的病毒或病毒颗粒，所述多核苷酸组分能够将其递送到病毒物种具有营养性的细胞中。所述术语不一定暗示病毒有任何复制能力。
术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式或其类似物，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化或封端的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。如本文所使用的，术语多核苷酸可互换地指双链分子和单链分子。除非另外指定或需要，否则是多核苷酸的本文所描述的任何实施例既涵盖双链形式，也涵盖已知或预测构成双链形式的两种互补的单链形式中的每种单链形式。
“分离的”多核苷酸，例如质粒、病毒、多肽或其他物质是指缺乏至少一些其他组分的物质的制剂，所述其他组分还可以存在于天然存在或最初由其制备的物质或类似物质中。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集分离的物质来制备所述分离的物质。分离的核酸、肽或多肽以不同于其在自然界中发现的形式或环境存在。例如，给定的DNA序列(例如基因)存在于宿主细胞染色体上邻近基因附近；RNA序列如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与编码多种蛋白质的许多其他mRNA的混合物存在。分离的核酸分子可以以单链或双链形式存在。当使用分离的核酸分子来表达蛋白质时，所述分子将至少含有有义链或编码链(即，所述分子可以是单链的)，但可以含有有义链和反义链两者(即，所述分子可以是双链的)。富集可以在绝对基础上测量，如每体积溶液的重量，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。设想到本发明的实施例的增加的富集。因此，例如，2倍富集、10倍富集、100倍富集或1000倍富集。
“转录调节序列”是指控制与其能够操作连接的基因或编码序列的转录的基因组区。在本发明中使用的转录调节序列通常包含至少一个转录启动子，并且还可以包含一个或多个转录增强子和/或终止子。
“能够操作地连接”是指两个或更多个组件的布置，其中如此描述的组件处于允许其以协调的方式起作用的关系。通过说明的方式，如果TRS或启动子促进编码序列的转录，则转录调节序列或启动子能够操作地连接到编码序列。能够操作地连接的TRS通常与编码序列顺式连接，但不一定直接与其相邻。
“异源”意指源自与其比较的实体在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(并且在表达时可以编码异源多肽)。类似地，转录调节元件，如从其天然编码序列中去除并且能够操作地连接到不同编码序列的启动子是异源转录调节元件。
“终止子”是指倾向于减少或防止通读转录的多核苷酸序列(即，其减少或防止源自终止子一侧的转录持续到终止子的另一侧)。转录被破坏的程度通常是碱基序列和/或终止子序列长度的函数。具体地，正如在许多分子生物学系统中众所周知的，特定的DNA序列(通常称为“转录终止序列”)是倾向于通过RNA聚合酶(可能是通过使RNA聚合酶分子停止和/或脱离被转录的DNA)破坏通读转录的特定序列。此类序列特异性终止子的典型实例包含聚腺苷酸化(“polyA”)序列，例如，SV40polyA。除了或代替此类序列特异性终止子，在启动子与编码区之间插入相对长的DNA序列也倾向于破坏编码区的转录，所述转录通常与插入序列的长度成比例。这种效应可能出现，因为RNA聚合酶分子总是有某种倾向与被转录的DNA脱离，并且增加在到达编码区之前横穿的序列的长度通常将增加脱离在编码区转录完成之前或可能甚至在开始之前发生的可能性。因此，终止子可以防止仅从一个方向(“单向”终止子)或从两个方向(“双向”终止子)转录，并且可以包括序列特异性终止序列或序列非特异性终止子或两者。多种此类终止子序列是本领域已知的；并且下文提供了在本发明范围内的此类序列的说明性用途。
“宿主细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”、“包装细胞系”和其他此类术语表示可用于本发明以例如产生重组病毒或重组融合多肽的高等真核细胞，如哺乳动物细胞，包含人类细胞。这些细胞包含被转导的原始细胞的子代。应当理解，单个细胞的子代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组补体方面)。
如应用于多核苷酸的“重组”意味着多核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤与产生不同于在自然界中发现的多核苷酸的构建体的其他程序的各种组合的产物。重组病毒是包括重组多核苷酸的病毒颗粒。所述术语分别包含原始多核苷酸构建体的复制物和原始病毒构建体的子代。
“控制元件”或“控制序列”是参与分子的相互作用的核苷酸序列，所述相互作用有助于对多核苷酸进行功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节可能影响过程的频率、速度或特异性并且在本质上会具有增强或抑制性。本领域中已知的控制元件包含例如转录调节序列，如启动子和增强子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并且启动对通常位于启动子下游(沿3'方向)的编码区进行转录的DNA区。启动子包含AAV启动子(例如，P5、P19、P40和AAV ITR启动子)以及异源启动子。
“表达载体”是包括编码所关注的基因产物的区的载体并且用于在预期靶细胞中实现基因产物的表达。表达载体还包括能够操作地连接到编码区以促进蛋白质在靶标中表达的控制元件。控制元件和与其能够操作地连接以供表达的一个或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，许多表达盒在本领域中是已知且可获得的或者可以由本领域中可获得的组分容易地构建。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代任何长度的氨基酸聚合物。该术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、乙酰化、膦酰化、脂化或与标记组分的结合。
术语“外源性”当关于细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸使用时是指已经通过人工或自然手段引入到细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸。外源性核酸可以来自不同的生物体或细胞，或者其可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个另外的拷贝。作为非限制性实例，外源性核酸位于与天然细胞不同的染色体位置，或者以其他方式侧接有与在自然界中发现的核酸序列不同的核酸序列，例如将启动子从一个基因连接到来自不同基因的基因产物的开放阅读框的表达盒。
本文所使用的“经转化的”或“转基因”包含任何宿主细胞或细胞系，所述宿主细胞或细胞系已因至少一个重组DNA序列的存在而改变或增加。本发明的宿主细胞通常通过用质粒表达载体中的DNA序列作为分离的线性DNA序列转染或用重组病毒载体感染来产生。
术语“序列同源性”意指两个核酸序列之间碱基匹配的比例或两个氨基酸序列之间氨基酸匹配的比例。当序列同源性表示为百分比时，例如50％，所述百分比表示与某个其他序列比较的所选序列长度上的匹配比例。允许空位(在两个序列中的任何一个中)以最大化匹配；通常使用15个碱基或更短，6个碱基或更短，例如，2个碱基或更短的空位长度。当使用寡核苷酸作为探针或处理时，靶核酸与寡核苷酸序列之间的序列同源性一般不少于在20个可能的寡核苷酸碱基对匹配中的17个靶碱基匹配(85％)；不少于在10个可能的碱基对匹配中的9个匹配(90％)，或不少于在20个可能的碱基对匹配中的19个匹配(95％)。
如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则这两个氨基酸序列是同源的。例如，85％同源性意指当两个序列被比对以获得最大匹配时，85％的氨基酸是相同的。在最大化匹配中允许空位(在被匹配的两个序列中的任何一个中)；5个或更少或2个或更少的空位长度。可替代地，如果使用具有突变数据矩阵和6或更大的空位罚分的程序ALIGN，两个蛋白质序列(或源自其长度为至少30个氨基酸的多肽序列)的比对得分大于5(以标准偏差单位计)，则这两个蛋白质序列是同源的，如本文所使用的此术语一样。如果两个序列或其部分的氨基酸在使用ALIGN程序进行最佳比对时大于或等于50％，则这两个序列或其部分的同源性更高。
术语“对应于”在本文中用于意指多核苷酸序列在结构上与参考多核苷酸序列的全部或部分相关，或者多肽序列在结构上与参考多肽序列的全部或部分相关，例如，其具有至少80％、85％、90％、95％或更多(例如，99％或100％)的序列同一性。相比之下，术语“与……互补”在本文中用于意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或一部分同源。为了说明，核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC”相对应，并且与参考序列“GTATA”互补。
术语“序列同一性”意指两个多核苷酸序列在比较窗口内是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”意指两个多核苷酸序列在比较窗口内是相同的(即，在逐个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过以下来计算：在比较窗口内比较两个经最佳比对的序列；确定相同核酸碱基出现在这两个序列中(例如，A、T、C、G、U或I)的位置的数量以产生匹配位置的数量；用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)；以及将结果乘以100以产生序列同一性百分比。如本文所使用的，术语“基本上同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸包括在至少20个核苷酸位置的比较窗口上(通常在至少20-50个核苷酸的窗口上)与参考序列相比具有至少85％序列同一性(例如，至少90％到95％序列同一性)或至少99％序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过将参考序列与多核苷酸序列进行比较来计算，所述多核苷酸序列可以包含在比较窗口上总共占参考序列的20％或更少的缺失或添加。
“保守”氨基酸取代是例如作为极性酸性氨基酸的天冬氨酸-谷氨酸；作为极性碱性氨基酸的赖氨酸/精氨酸/组氨酸；作为非极性或疏水性氨基酸的亮氨酸/异亮氨酸/甲硫氨酸/缬氨酸/丙氨酸/甘氨酸/脯氨酸；作为极性或不带电荷的亲水性氨基酸的丝氨酸/苏氨酸。保守氨基酸取代还包含基于侧链的分组。例如，具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，能够合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、用谷氨酸替代天冬氨酸、用丝氨酸替代苏氨酸或用结构上相关的氨基酸类似地替代氨基酸将不会对所得多肽的性质产生主要影响。氨基酸改变是否产生功能性多肽可以通过测定所述多肽的比活性来容易地确定。基于共同的侧链性质将天然存在的残基分为几类：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族；trp、tyr、phe。
本公开还设想了具有非保守取代的多肽。非保守取代需要将上述类别中的一个成员交换为另一个。
基本原理
现有药物对潜在AD疾病过程几乎没有影响，并且目前没有可用的预防疗法。由于没有针对AD的有效疗法，所以针对AD的有效疗法将是一项重大进步(Conrado等人，2020)。在全球范围内，约有3500万例AD病例，影响6％的>65岁个体(Fann等人，2018)，并且每年造成190万例死亡(Collaborators GBDD，2019；Hebert等人，2013)。在美国，每年有超过122,000例死亡。在美国照顾AD患者的估计经济负担为3050亿美元/年。APOE4等位基因占全球群体的13.7％，并且在AD患者中的频率要高得多(Safieh等人，2019)。APOE4的遗传与早期认知衰退、早发性AD和更严重的疾病伴较早死亡有关(Safieh等人，2019；Williams 2020；Raber等人，2004)。对于针对淀粉样蛋白、tau和其他病理学的AD疗法已经进行了许多尝试。虽然APOE4等位基因的遗传代表了迟发性AD发展的最强遗传风险因素，但APOE2等位基因具有保护性。在降低内源性APOE4表达的同时永久递送APOE2的基因疗法可以有效地将APOE4纯合个体转化为APOE4表达降低的APOE2/4杂合子，从而显著降低AD发展的风险。进一步的APOE4纯合个体可以在症状出现前几年根据他们的基因型接受AAV基因疗法。本策略代表了一种策略的发展，其利用了以下观察结果：APOE3ChC变体保护发展早发性AD的PSEN1-E290A家族中的个体(Arboleda-Velasquez等人，2019)。AAV介导的APOE3ChC和APOE2ChC基因转移可能在淀粉样蛋白和/或tau病理学中有效，并且比AAV单独递送APOE2更有效。
基于APOE4会增加淀粉样蛋白和基于tau的AD病理学的风险的知识，已经证明(Zhao等人，2016；Shi等人，2017；Dodart等人，2005；Hudry等人，2013)利用APOE2的CNS基因疗法可以预防小鼠模型中基于APOE4的AD病理学。该提案的主要创新是将独特的临床观察(Arboleda-Velasquez等人，2019)转化为更有效的第2代基因疗法。大量流行病学数据表明APOE基因型在AD的发病机制中起重要作用，其中APOE2保护了和APOE4增加了AD相关病理学发展的风险(Corder等人，1994；Raber 2004；Genin等人，2011；Sando等人，2008)。观察到哥伦比亚PSEN1-E290A家族中的个体通过纯合APOE3ChC的纯合共同遗传被阻止发展早发性AD，导致基于APOE3ChC基因疗法的APOE4纯合子的CNS基因修饰以预防APOE4-驱动的AD相关病理学的高风险。此外，基于先前表明利用APOE2的基因疗法抑制E4驱动的淀粉样蛋白相关病理学的研究，APOE2ChC基因疗法可以预防APOE4驱动的淀粉样蛋白和tau病理学，并且比APOE2或APOE3ChC更有效。
示例性APOE核酸和氨基酸序列
载脂蛋白E(APOE)是一种299个氨基酸的蛋白质，其参与体内脂肪的代谢。它是与脂肪结合并与低密度脂蛋白受体(LDLR)相互作用的蛋白质家族，这对于富含甘油三酯的脂蛋白的正常加工是重要的。在外周组织中，APOE由肝脏和巨噬细胞产生，并介导胆固醇代谢。在中枢神经系统中，APOE由星形胶质细胞产生，并经由作为LDLR家族成员的APO受体将胆固醇转运至神经元。存在三个主要的APOE等位基因，APOE2(Cys 112、Cys 158)、APOE3(Cys112、Arg158)和APOE4(Arg112、Arg158)。
示例性人APOE序列包含但不限于：
mkvlwaallv tflagcqakv eqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqt
lseqvqeell ssqvtqelra lmdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar lskelqaaqa
rlgadmedvc grlvqyrgev qamlgqstee lrvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy
qagaregaer glsairerlg plveqgrvra atvgslagqp lqeraqawge rlrarmeemg
srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirl qaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek
vqaavgtsaa pvpsdnh(SEQ ID NO:1)以及与其具有至少80％、85％、90％、95％或更多(例如，99％或100％)序列同一性的序列，
其中在一个实施例中，APOE4可以具有31K、46P、79T、130R、163C、292H和/或314R，并且APOE2可以具有43C、152Q、154C/S、163C/P、164Q、172A、176C、242Q、246C、254E。
示例性人APOE序列(例如，如果所述序列编码APOE2，则其用于沉默核苷酸取代)包含但不限于：
ggaacttgat gctcagagag gacaagtcat ttgcccaagg tcacacagct ggcaactggcagagccagga ttcacgccct ggcaatttga ctccagaatc ctaaccttaa cccagaagca cggcttcaagcccctggaaa ccacaatacc tgtggcagcc agggggaggt gctggaatct catttcacat gtggggagggggctcccctg tgctcaaggt cacaaccaaa gaggaagctg tgattaaaac ccaggtccca tttgcaaagcctcgactttt agcaggtgca tcatactgtt cccacccctc ccatcccact tctgtccagc cgcctagccccactttcttt tttttctttt tttgagacag tctccctctt gctgaggctg gagtgcagtg gcgagatctcggctcactgt aacctccgcc tcccgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccaagt agctaggattacaggcgccc gccaccacgc ctggctaact tttgtatttt tagtagagat ggggtttcac catgttggccaggctggtct caaactcctg accttaagtg attcgcccac tgtggcctcc caaagtgctg ggattacaggcgtgagctac cgcccccagc ccctcccatc ccacttctgt ccagccccct agccctactt tctttctgggatccaggagt ccagatcccc agccccctct ccagattaca ttcatccagg cacaggaaag gacagggtcaggaaaggagg actctgggcg gcagcctcca cattcccctt ccacgcttgg cccccagaat ggaggagggtgtctggatta ctgggcgagg tgtcctccct tcctggggac tgtggggggt ggtcaaaaga cctctatgccccacctcctt cctccctctg ccctgctgtg cctggggcag ggggagaaca gcccacctcg tgactgggggctggcccagc ccgccctatc cctgggggag ggggcgggac agggggagcc ctataattgg acaagtctgggatccttgag tcctactcag ccccagcgga ggtgaaggac gtccttcccc aggagccg(SEQ ID NO:2)
或者
ccccagcgga ggtgaaggac gtccttcccc aggagccgac tggccaatca caggcaggaagatgaaggtt ctgtgggctg cgttgctggt cacattcctg gcaggatgcc aggccaaggt ggagcaagcggtggagacag agccggagcc cgagctgcgc cagcagaccg agtggcagag cggccagcgc tgggaactggcactgggtcg cttttgggat tacctgcgct gggtgcagac actgtctgag caggtgcagg aggagctgctcagctcccaa gtcacccaag aactgagggc gctgatggac gagaccatga aggagttgaa ggcctacaaatcggaactgg aggaacaact gaccccggta gcggaggaga cgcgggcacg gctgtccaag gagctgcagacggcgcaggc ccggctgggc gcggacatgg aggacgtgtg cggccgcctg gtgcagtacc gcggcgaggtgcaggccatg ctcggccaga gcaccgagga gctgcgggtg cgcctcgcct cccacctgcg caagctgcgtaagcggctcc tccgcgatcc cgatgacctg cagaagcgcc tggcagtgta ccaggccggg gcccgcgagggcgccgagcg cggcctcagc gccatccgcg agcgcctggg gcccctggtg gaacagggcc gcgtgcgggccgccactgtg ggctccctgg ccggccagcc gctacaggag cgggcccagg cctggggcga gcggctgcgcgcgcggatgg aggagatggg cagtcggacc cgcgaccgcc tggacgaggt gaaggagcag gtggcggaggtgcgcgccaa gctggaggag caggcccagc agatacgcct gcaggccgag gccttccagg cccgcctcaagagctggttc gagcccctgg tggaagacat gcagcgccag tgggccgggc tggtggagaa ggtgcaggctgccgtgggca ccagcgccgc ccctgtgccc agcgacaatc actgaacgcc gaagcctgca gccatgcgaccccacgccac cccgtgcctc ctgcctccgc gcagcctgca gcgggagacc ctgtccccgc cccagccgtcctcctggggt ggaccctagt ttaataaaga ttcaccaagt ttcacgc(SEQ ID NO:3)
或者具有MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQTAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLASHLRKLRKRLLRDPDDLQKRLAVYQAGAREGAERGLSAIRERLGPLVEQGRVRAATVGSLAGQPLQERAQAWGERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAEVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH(SEQ ID NO:4)
以及与编码APOE的序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多(例如，99％或100％)序列同一性的序列。
其他示例性APOE序列包含
mkvlwaallv tflagcqakv eqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqtlseqvqeell ssqvtqelra lmdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar lskelqaaqa rlgadmedvcgrlvqyrgev qamlgqstee lrvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlgplveqgrvra atvgslagqp lqeraqawge rlrarmeemg srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirlqaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek vqaavgtsaa pvpsdnh(SEQ ID NO:5)；
mkvlwaallv tflagcqakv eqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqtlseqvqeell ssqvtqelra lmdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar lskelqaaqa rlgadmedvcgrlvqyrgev qamlgqstee lrvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlgplveqgrvra atvgslagqp lqeraqawge rlrarmeemg srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirlqaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek vqaavgtsaa pvpsdnh(SEQ ID NO:6)；
mkvlwaallv tflagcqakv eqavetepep elrqqtewqs gqrwelalgr fwdylrwvqtlseqvqeell ssqvtqelra lmdetmkelk aykseleeql tpvaeetrar lskelqaaqa rlgadmedvcgrlvqyrgev qamlgqstee lrvrlashlr klrkrllrda ddlqkrlavy qagaregaer glsairerlgplveqgrvra atvgslagqp lqeraqawge rlrarmeemg srtrdrldev keqvaevrak leeqaqqirlqaeafqarlk swfeplvedm qrqwaglvek vqaavgtsaa pvpsdnh(SEQ ID NO:7)。
对于第112位和第158位，E2含有两个半胱氨酸残基，E3含有半胱氨酸和精氨酸，并且E4在两个位点都含有精氨酸残基。在一个实施例中，制备AAV载体以在ApoE2或ApoE3背景中表达克赖斯特彻奇突变体。可以将载体引入野生型和疾病模型小鼠，并确定功效的表达和生物学测量。
基因递送载体
本发明范围内的基因递送载体包含但不限于分离的核酸(例如，可以在染色体外维持的基于质粒的载体)以及病毒载体，例如重组腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳头瘤病毒或腺相关病毒，包含存在于脂质体中的病毒和非病毒载体，例如中性或阳离子脂质体，如DOSPA/DOPE、DOGS/DOPE或DMRIE/DOPE脂质体，和/或与其他分子相关的病毒和非病毒载体，如DNA抗DNA抗体阳离子脂质(DOTMA/DOPE)复合物。如本文所公开的，基因疗法载体可以编码APOE、RNAi和/或其抗体或片段。下文描述了示例性病毒基因递送载体。基因递送载体可以经由任何途径施用，包含但不限于颅内、鞘内、肌肉内、口腔内、直肠、静脉内或冠状动脉内施用，并且可以使用电穿孔和/或离子电渗法和/或支架(如胞外基质或水凝胶，例如水凝胶贴片)增强向细胞的转移。在一个实施例中，不使用渗透增强剂来增强对CNS的间接递送。
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体表现出若干个独特的特征，包含其能够稳定和精确地整合到宿主基因组中，从而提供长期的转基因表达。这些载体可以离体进行操纵，以消除感染性基因颗粒，从而最小化全身感染和患者间传播的风险。假型逆转录病毒载体可以改变宿主细胞向性。
慢病毒
慢病毒来源于包含人类免疫缺陷病毒和猫免疫缺陷病毒在内的逆转录病毒家族。然而，与只感染分裂细胞的逆转录病毒不同，慢病毒可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者。例如，基于人类免疫缺陷病毒基因组的慢病毒载体能够在体内有效地转导心肌细胞。尽管慢病毒具有特定向性，但用疱疹性口炎病毒对病毒包膜进行假型化会产生范围更广的病毒(Schnepp等人，《分子医学方法(Meth.Mol.Med.)》,69:427(2002))。
腺病毒载体
可以通过从基因组中缺失负责病毒基因表达的早期(E1A和E1B)基因来使腺病毒载体无法复制，并且以染色体外形式将所述腺病毒载体稳定地维持到宿主细胞中。这些载体具有转染复制和非复制细胞的能力，并且特别地，这些载体已被证明在体内有效感染心肌细胞，例如，在定向注射或灌注后。已示出，腺病毒载体导致体内瞬时表达治疗基因，在7天达到峰值并持续大约4周。在使用神经特异性启动子的系统中，转基因表达的持续时间可以得到改善。另外，可以以非常高的滴度产生腺病毒载体，从而允许使用少量病毒进行有效的基因转移。
腺相关病毒载体
重组腺相关病毒(rAAV)来源于非致病性细小病毒，基本上不诱发细胞免疫反应，并且在大多数系统中产生持续数月的转基因表达。此外，与腺病毒一样，腺相关病毒载体也具有感染复制细胞和非复制细胞的能力并且被认为对人类无致病性。此外，它们似乎有望用于持续的心脏基因转移(Hoshijima等人，《自然医学(Nat.Med.)》,8:864(2002)；Lynch等人，《循环研究(Circ.Res.)》,80:197(1997))。
AAV载体包含但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10，包含其中AAV基因组来自与衣壳不同的来源的嵌合病毒。
质粒DNA载体
质粒DNA通常被称为“裸DNA”，以表明缺乏更精细的包装系统。将质粒DNA直接注射到体内心肌细胞已经实现。基于质粒的载体是相对非免疫原性和非致病性的，具有稳定整合到细胞基因组中的潜力，导致在体内有丝分裂后细胞中的长期基因表达。例如，尽管局部转基因表达水平相对低，但肌肉注射质粒DNA后分泌的血管生成因子的表达已在动物模型中显示出显著的生物学效应，并且在临床上看起来有希望(Isner,《自然(Nature)》,415:234(2002))。此外，质粒DNA在血流中迅速降解；因此，在远处器官系统中转基因表达的机会可以忽略不计。质粒DNA可以作为大分子复合物(例如，脂质体或DNA-蛋白质复合物，例如，参见下文)的一部分递送到细胞，并且可以使用包含电穿孔的技术来增强递送。
示例性非病毒调配物
可生物降解的颗粒(例如，用于保护性APOE表达的分离核酸、用于抗体表达的载体或用于RNAi表达的载体)可以包含可生物降解的聚合物分子或可以由其形成，所述可生物降解的聚合物分子可以包含但不限于聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、PLA和PGA的共聚物(即，聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA))、聚-ε-己内酯(PCL)、聚乙二醇(PEG)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(对二噁烷酮)、聚丙二醇富马酸酯、聚(原酸酯)、多元醇/双烯酮缩醛加成聚合物、聚烷基-氰基丙烯酸酯(PAC)、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己酮)(PCPP)、聚[双(对羧基苯氧基)甲烷](PCPM)、PSA、PCPP和PCPM的共聚物、聚(氨基酸)、聚(伪氨基酸)、聚磷腈、聚[(二氯)磷腈]和聚[(有机)磷腈]的衍生物、聚-羟基丁酸或S-己酸、弹性蛋白或明胶。(参见例如Kumari等人,《胶体和表面B：生物界面(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces)》75(2010)1-18和美国专利第6,913,767号；第6,884,435号；第6,565,777号；第6,534,092号；第6,528,087号；第6,379,704号；第6,309,569号；第6,264,987号；第6,210,707号；第6,090,925号；第6,022,564号；第5,981,719号；第5,871,747号；第5,723,269号；第5,603,960号；和第5,578,709号；和美国公开申请第2007/0081972号；和国际申请公开第WO 2012/115806号；和第WO 2012/054425号；其内容通过引用整体并入本文)。
可生物降解的纳米颗粒可以通过本领域已知的方法来制备。(参见例如，Nagavarma等人，《药理学和临床研究的亚洲杂志(Asian J.of Pharma.And Clin.Res.,)》Vol 5,Suppl3,2012,第16-23页；Cismaru等人，《罗马尼亚化学杂志(Rev.Roum.Chim.)》,2010,55(8),433-442；和国际申请公开号WO 2012/115806；和WO 2012/054425；其内容通过引用整体并入本文)。用于制备纳米颗粒的合适方法可以包含利用预形成聚合物分散体的方法，所述方法可以包含但不限于溶剂蒸发、纳米沉淀、乳化/溶剂扩散、盐析、透析和超临界流体技术。在一些实施例中，纳米颗粒可以通过形成双乳液(例如，油包水-水包油)并随后进行溶剂蒸发来制备。通过所公开的方法获得的纳米颗粒可以根据需要经受进一步处理步骤，如洗涤和冻干。任选地，纳米颗粒可以与防腐剂(例如，海藻糖)组合。
通常，纳米颗粒的平均有效直径小于1微米，例如，纳米颗粒的平均有效直径介于约25nm与约500nm之间，例如介于约50nm与约250nm之间、约100nm至约150nm或约450nm到650nm。可以通过本领域已知的方法评估颗粒的大小(例如，平均有效直径)，所述方法可以包含但不限于透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、光子相关光谱(PCS)、纳米颗粒表面积监测器(NSAM)、凝聚粒子计数器(CPC)、差分迁移率分析仪(DMA)、扫描迁移率粒度仪(SMPS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、X射线衍射(XRD)、气溶胶飞行时间质谱(ATFMS)和气溶胶颗粒质量分析仪(APM)。
可生物降解的纳米颗粒可以具有促进靶细胞摄取的ζ电位。通常，纳米颗粒的ζ电位大于0。在一些实施例中，纳米颗粒的ζ电位介于约5mV至约45mV之间、介于约15mV至约35mV之间或介于约20mV与约40mV之间。ζ电位可以经由包含电泳迁移率或动态电泳迁移率的特性来确定。动电现象和电声现象可以用于计算ζ电位。
在一个实施例中，非病毒递送媒剂包括聚合物，其包含但不限于聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、具有不同分子量(例如，2、22和25kDa)的直链和/或支链PEI、树枝状大分子，例如聚酰胺基胺(PAMAM)和聚甲基丙烯酸酯；脂质，包含但不限于阳离子脂质体、阳离子乳液、DOTAP、DOTMA、DMRIE、DOSPA、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、DOPE或DC-胆固醇；基于肽的载体，包含但不限于聚-L-赖氨酸或鱼精蛋白；或聚(β-氨基酯)、壳聚糖、PEI-聚乙二醇、PEI-甘露糖-葡萄糖、DOTAP-胆固醇或RNAiMAX。
在一个实施例中，所述递送媒剂是基于含糖聚合物的递送媒剂，即聚(含糖酰胺基胺)(PGAA)，所述基于含糖聚合物的递送媒剂具有与各种多核苷酸类型复合并形成纳米颗粒的能力。这些材料是通过使各种碳水化合物的甲酯或内酯衍生物(D-葡萄糖酸(D)、内消旋-半乳糖二酸酯(G)、D-甘露酸酯(M)和L-酒石酸酯(T))与一系列低聚乙烯胺单体(含有1-4种乙烯胺聚合而成(Liu和Reineke,2006)。由聚合物重复单元中的这些碳水化合物和四种亚乙基胺构成的子集产生了出色的递送效率。
在一个实施例中，所述递送媒剂包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺基胺(PAMAM)、PEI-PEG、PEI-PEG-甘露糖、葡聚糖-PEI、OVA缀合物、PLGA微粒或涂覆有PAMAM的PLGA微粒或其任何组合。所公开的阳离子聚合物可以包含但不限于聚酰胺基胺(PAMAM)树枝状聚合物。适用于制备当前公开的纳米颗粒的聚酰胺基胺树枝状聚合物可以包含第3代、第4代、第5代或至少第6代树枝状聚合物。
在一个实施例中，递送媒剂包括脂质，例如N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵鎓(DOTMA)、2,3-二油酰氧基-N-[2-精胺甲酰胺]乙基-N,N-二甲基-1-丙铵鎓三氟乙酸盐(DOSPA，Lipofectamine)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵鎓-丙烷(DOTAP)；N-[1-(2,3-二肉豆蔻氧基)丙基]；N,N-二甲基-N-(2-羟乙基)溴化铵(DMRIE)、3-β-[N-(N,N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；双十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS，Transfectam)；或二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)。阳离子脂质的带正电荷的亲水性头基通常由单胺(如叔胺和季胺)、聚胺、脒或胍基组成。已经开发了一系列吡啶鎓脂质(Zhu等人，2008；van der Woude等人，1997；Ilies等人，2004)。除吡啶鎓阳离子脂质外，其他类型的杂环头基包含咪唑、哌嗪和氨基酸。阳离子头基的主要功能是通过静电相互作用将带负电荷的核酸凝聚成轻微带正电荷的纳米颗粒，从而增强细胞摄取和内体逃逸。
具有两条直链脂肪酸链的脂质(如DOTMA、DOTAP和SAINT-2或DODAC)以及四烷基脂质链表面活性剂，即N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)的二聚体可以用作递送媒剂。不管其疏水链长(C16:1、C18:1和C20:1)，所有的反式取向脂质似乎都比其顺式取向的脂质提高了转染效率。
可用作递送媒剂的阳离子聚合物的结构包含但不限于线性聚合物(如壳聚糖和线性聚(乙烯亚胺))、支化聚合物(如支化聚(乙烯亚胺)(PEI))、环状聚合物(如环糊精)、网络(交联)型聚合物(如交联聚(氨基酸)(PAA))和树枝状聚合物。树枝状聚合物由中心核分子组成，若干个高度支化的臂从其“生长”以形成具有对称或不对称方式的树状结构。树枝状聚合物的实例包含聚酰胺基胺(PAMAM)和聚丙烯亚胺(PPI)树枝状聚合物。
DOPE和胆固醇是制备阳离子脂质体常用的中性辅助脂质。支化PEI-胆固醇水溶性脂聚合物缀合物自组装成阳离子胶束。也可以使用非离子聚合物Pluronic(泊洛沙姆)和SP1017，其是Pluronics L61和F127的组合。
在一个实施例中，使用PLGA颗粒来增加包封频率，尽管使用PLL形成复合物也可以增加包封效率。其他阳离子材料，例如PEI、DOTMA、DC-Chol或CTAB可以用于制造纳米球。
在一个实施例中，复合物嵌入或应用于材料，所述材料包含但不限于泊洛沙姆、聚丙烯酰胺、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)、羧基乙烯基聚合物(例如，Carbopol934，古德里奇化学公司(Goodrich Chemical Co.))、纤维素衍生物(例如，甲基纤维素、乙酸纤维素和羟丙基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙烯醇或其组合的水凝胶。
在一些实施例中，生物相容性聚合物材料源自可生物降解的聚合物，如胶原蛋白，例如羟基化胶原蛋白、纤维蛋白、聚乳酸-聚乙醇酸或聚酸酐。其他实例包含但不限于任何生物相容性聚合物，无论是亲水性、疏水性还是两亲性，如乙烯乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚四氟乙烯、N-异丙基丙烯酰胺共聚物、聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)嵌段共聚物、聚(乙二醇)/聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)嵌段共聚物、聚乙交酯、聚丙交酯(PLLA或PDLA)、聚(己内酯)(PCL)或聚(二噁烷酮)(PPS)。
在另一个实施例中，所述生物相容性材料包含聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚四氟乙烯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物、聚乙醇酸和聚羟基链烷酸酯的组合、明胶、藻酸盐、聚-3-羟基丁酸酯、聚-4-羟基丁酸酯和聚羟基辛酸酯以及聚丙烯腈聚氯乙烯。
在一个实施例中，可以采用以下聚合物，例如天然聚合物，如淀粉、甲壳素、糖胺聚糖，例如透明质酸、硫酸皮肤素和硫酸软骨素，以及微生物聚酯，例如羟基链烷酸酯，如羟基戊酸酯和羟基丁酸酯共聚物，以及合成聚合物，例如聚(原酸酯)和聚酸酐，并且包含乙交酯和丙交酯的均聚物和共聚物(例如，聚(L-丙交酯)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)、聚乙交酯和聚(D,L-丙交酯)、聚(D,L-丙交酯-共乙交酯)、聚(乳酸共赖氨酸)和聚己内酯。
在一个实施例中，所述生物相容性材料来源于分离的细胞外基质(ECM)。ECM可以从各种细胞群、组织和/或器官的内皮层分离，例如任何器官或组织来源，包含温血脊椎动物的皮肤、肝脏、消化道、呼吸道、肠道、泌尿道或生殖道的真皮。本发明中采用的ECM可以来自来源的组合。分离的ECM可以制备成薄片、微粒形式、凝胶形式等。
生物相容性支架聚合物可以包括丝、弹性蛋白、甲壳素、壳聚糖、聚(d-羟基酸)、聚(酸酐)或聚(原酸酯)。更具体地，生物相容性聚合物可以由以下形成：聚乙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物、乳酸和乙醇酸与聚乙二醇的共聚物、聚(E-己内酯)、聚(3-羟基丁酸酯)、聚(对二噁烷酮)、富马酸聚丙烯、聚(原酸酯)、多元醇/双烯酮缩醛加成聚物、聚(癸二酸酐)(PSA)、聚(羧基双羧基苯氧基苯氧基己酮)(PCPP)、聚[双(对羧基苯氧基)甲烷](PCPM)、SA、CPP和CPM的共聚物、聚(氨基酸)、聚(伪氨基酸)、聚磷腈、聚[(二氯)磷腈]或聚[(有机)磷腈]的衍生物、聚-羟基丁酸或S-己酸、聚丙交酯-共-乙交酯、聚乳酸、聚乙二醇、纤维素、氧化纤维素、藻酸盐、明胶或其衍生物。
因此，聚合物可以由多种材料中的任何一种形成，包含聚合物，包含天然存在的聚合物、合成聚合物或其组合。在一个实施例中，支架包括可生物降解的聚合物。在一个实施例中，可以对天然存在的可生物降解的聚合物进行修饰以提供衍生自天然存在的聚合物的合成可生物降解的聚合物。在一个实施例中，聚合物是聚(乳酸)(“PLA”)或聚(乳酸-共-乙醇酸)(“PLGA”)。在一个实施例中，支架聚合物包含但不限于藻酸盐、壳聚糖、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、木葡聚糖、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的共聚物、聚(乙烯醇)、硅酮、疏水性聚酯和亲水性聚酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、N-异丙基丙烯酰胺共聚物、聚(环氧乙烷)/聚(环氧丙烷)、聚乳酸、聚(原酸酯)、聚酸酐、聚氨酯、2-甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸钠的共聚物、磷酰胆碱、环糊精、聚砜和聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、聚-D,L-乳酸-对-二噁烷酮-聚乙二醇嵌段共聚物、聚丙烯、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(四氟乙烯)、聚-ε-己内酯或交联壳聚糖水凝胶。
可替代地，核酸或载体可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg、至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg、至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用，尽管其他剂量可以提供有益结果。
可替代地，核酸或载体可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg、至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg、至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用，尽管其他剂量可以提供有益结果。
药物组合物
本发明提供了一种组合物，所述组合物包括上述基因转移载体以及药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)载剂、基本上由其组成或由其组成。当组合物基本上由基因转移载体和药学上可接受的载剂组成时，可以包含对组合物没有实质影响的另外的组分(例如，佐剂、缓冲剂、稳定剂、抗炎剂、增溶剂、防腐剂等)。当组合物由本发明的基因转移载体和药学上可接受的载剂组成时，所述组合物不包括任何另外的组分。可以在本发明的上下文内使用任何合适的载剂，并且此类载剂是本领域众所周知的。载剂的选择将部分地通过可以施用组合物的特定位点和用于施用组合物的特定方法来确定。除了本文所描述的基因转移载体之外，组合物任选地可以是无菌的。组合物可以冷冻或冻干以供储存，并且在使用前在合适的无菌载剂中重构。组合物可以根据例如《雷明顿：药学技术与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA(2001)中描述的常规技术产生：
组合物的合适调配物包含水性和非水性溶液、可以含有抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂的等渗无菌溶液以及可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。调配物可以存在于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶，并且可以在立即使用之前仅需要添加无菌液体载剂(例如，水)的冷冻干燥(冻干)条件下储存。可以由前述种类的无菌粉末、颗粒体和片剂制备临时溶液和悬浮液。在一个实施例中，所述载剂是缓冲盐水溶液。在一个实施例中，本发明的基因转移载体以组合物的形式施用，所述组合物被调配成在施用前保护所述基因转移载体免受损害。例如，所述组合物可以被调配成减少基因转移载体在用于制备、储存或施用基因转移载体的装置(如玻璃器皿、注射器或针头)上的损耗。所述组合物可以被调配成降低基因转移载体的光敏感性和/或温度敏感性。为此，组合物可以包括药学上可接受的液体载剂，如上述那些液体载剂以及选自由以下组成的组的稳定剂：聚山梨醇酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖以及其组合。使用此类组合物将延长基因转移载体的保质期，促进施用并提高本发明方法的效率。含有基因转移载体的组合物的调配物进一步描述于例如Wright等人，《药物发现和开发的当前观点(Curr.Opin.Drug Discov.Devel.)》,6(2):174-178(2003)和Wright等人，《分子疗法(Molecular Therapy)》,12:171-178(2005))
所述组合物还可以被调配成增强转导效率。另外，本领域普通技术人员将理解，本发明的基因转移载体可以与其他治疗剂或生物活性剂存在于组合物中。例如，控制炎症的因子(如布洛芬或类固醇)可以是组合物的一部分，以减少与体内施用基因转移载体相关的肿胀和炎症。免疫系统刺激剂或佐剂，例如白细胞介素、脂多糖和双链RNA。可能存在抗生素，即杀微生物剂和杀真菌剂，以治疗现有感染和/或降低未来感染的风险，如与基因转移程序相关的感染。
通过在可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微囊基质来制备可注射储库型(depot)形式。根据药物与聚合物的比率以及所采用的特定聚合物的性质，可以对药物释放速率进行控制。其他可生物降解的聚合物的实例包含聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储库型可注射调配物还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。
在某些实施例中，调配物包括选自由以下组成的组的生物相容性聚合物：聚酰胺、聚碳酸酯、聚烯烃、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物、聚乙烯聚合物、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物、纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)、多糖、蛋白质、聚透明质酸、聚氰基丙烯酸酯以及其共混物、混合物或共聚物。
组合物可以在允许控释或缓释的装置中或装置上施用，如海绵、生物相容性网状物、机械储存器或机械植入物。植入物(参见例如美国专利第5,443,505号)、装置(参见例如美国专利第4,863,457号)，如可植入装置(例如，包括聚合物组合物的机械储存器、或植入物或装置)对于本发明的基因转移载体的施用特别有用。组合物还可以以缓释调配物的形式施用(参见例如美国专利第5,378,475号)，所述缓释调配物包括例如凝胶泡沫、透明质酸、明胶、硫酸软骨素、聚磷酸酯，如双-2-羟乙基-对苯二甲酸酯(BHET)和/或聚乳酸-乙醇酸。
施用于哺乳动物的组合物中的基因转移载体的剂量将取决于许多因素，包含哺乳动物的大小(质量)、任何副作用的程度、特定的施用途径等。在一个实施例中，本发明的方法包括施用“治疗有效量”的包括本文所描述的本发明的基因转移载体的组合物。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现期望的治疗结果的有效量。治疗有效量可以根据如个体的疾病或病症程度、年龄、性别和体重等因素以及基因转移载体在个体中引发期望的应答的能力而变化。实现特定治疗效果所需的组合物中的基因转移载体的剂量通常以每个细胞的载体基因组拷贝数(gc/细胞)或载体基因组拷贝数/每千克体重(gc/kg)为单位施用。基于这些以及本领域众所周知的其他因素，本领域普通技术人员可以容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的合适的基因转移载体剂量范围。治疗有效量可以在1×1010个基因组拷贝到1×1013个基因组拷贝之间。治疗有效量可以在1×1011个基因组拷贝到1×1014个基因组拷贝之间。治疗有效量可以在1×107个基因组拷贝到1×1010个基因组拷贝之间。治疗有效量可以在1×1014个基因组拷贝到1×1017个基因组拷贝之间。假设70kg的人，剂量范围可以为1.4×108gc/kg至1.4×1011gc/kg、1.4×109gc/kg至1.4×1012gc/kg、1.4×1010gc/kg至1.4×1013gc/kg或1.4×1011gc/kg至1.4×1014gc/kg。
在一个实施例中，将组合物施用于哺乳动物一次。据信，组合物的单次施用可导致哺乳动物中的持续表达，而副作用最小。然而，在某些情况下，在治疗时间段期间多次施用组合物以确保细胞充分暴露于组合物可能是合适的。例如，可以在治疗时间段期间将组合物施用于哺乳动物两次或更多次(例如，2次、3次、4次、5次、6次、6次、8次、9次、或10次或更多次)。
本公开提供了药学上可接受的组合物，其包括治疗有效量的基因转移载体，所述基因转移载体包括如上所述的核酸序列。
施用途径、剂量和剂型
例如，根据本发明的基因递送载体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况以及技术人员已知的其他因素。基因递送载体的施用可以在预先选择的时间段内基本上是连续的，或者可以呈一系列间隔剂量的形式。考虑了局部施用，例如颅内、鼻内或鞘内，以及全身施用，例如使用穿过血脑屏障的病毒。可以采用任何施用途径，例如静脉内、鼻内或支气管内、直接向肺和胸膜内施用。在一个实施例中，可以将组合物递送至胸膜。
包括基因递送载体的一种或多种合适的单位剂型(可以任选地调配用于持续释放)可以通过多种途径施用，包含颅内、鞘内或鼻内，或递送至CNS的其他方式，或口服，或肠胃外，包含通过直肠、口腔、阴道和舌下、经皮、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、胸内或肺内途径。在适当的情况下，调配物可以方便地以离散的单位剂型呈现，并且可以通过药学熟知的任何方法制备。此类方法可以包含使载体与液体载剂、固体基质、半固体载剂、细碎固体载剂或其组合结合的步骤，然后，如果需要，将产品引入或成型到所需的递送系统中。
为实现特定结果而施用的基因递送载体的量将根据各种因素变化，所述因素包含但不限于所选的基因和启动子、病况、患者特定参数，例如身高、体重和年龄，并且待实现的是预防还是治疗。
本发明的载体可以方便地以适合施用的调配物形式提供例如进入脑。合适的施用形式最好由医生根据标准程序为每位患者单独确定。合适的药学上可接受的载剂和它们的调配物描述在标准调配物论文中，例如，《雷明顿制药科学(Remington's PharmaceuticalsSciences)》。“药学上可接受的”意指载剂、稀释剂或赋形剂和/或盐必须与调配物的其他成分相容并且对其接受者无害。
本发明的载剂可以在中性pH的溶液中配制，例如约pH 6.5至约pH 8.5，或约pH 7至8，其中用赋形剂使溶液达到约等张性，例如4.5％甘露醇或0.9％氯化钠，用通常被认为是安全的本领域已知的缓冲溶液(例如磷酸钠)缓冲pH，以及利用可接受的防腐剂(例如0.1％至0.75％的间甲酚或0.15％至0.4％的间甲酚)。可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、多元醇(例如甘露糖醇和山梨糖醇)或其他无机或有机溶质来获得所需的等张性。氯化钠可用于含有钠离子的缓冲液。如果需要，还可以制备上述组合物的溶液以提高保质期和稳定性。本发明的治疗上有用的组合物可以通过按照普遍接受的程序混合成分来制备。例如，可以混合选定的组分以产生浓缩混合物，然后可以通过添加水和/或缓冲液以控制pH或添加额外的溶质以控制张力，将其调节至最终浓度和粘度。
载体可以以含有在一个或多个剂量中有效量的载体的剂型提供。对于病毒载体，有效剂量可以在至少约107个病毒颗粒，例如约109个病毒颗粒，或约1011个病毒颗粒的范围内。添加的病毒颗粒数量可能为最多1014个。例如，当采用病毒表达载体时，约108至约1060gc的病毒载体可以作为核酸或作为包装的病毒体施用。在一些实施例中，约109至约1015个拷贝的病毒载体，例如每0.5至10mL，可以作为核酸或作为包装的病毒体施用。可替代地，核酸或载体可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg、至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg、至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用，尽管其他剂量可以提供有益结果。施用的量将根据多种因素变化，包含但不限于选择用于施用的核酸或载体、哺乳动物的疾病、体重、身体状况、健康和/或年龄。此类因素可以由临床医生采用动物模型或本领域可用的其他测试系统容易地确定。如所指出，待施用的确切剂量由主治临床医生确定，但可能在1mL磷酸盐缓冲盐水中。对于单独的质粒DNA或与其他大分子复合的质粒DNA的递送，待施用的DNA量将是对接受者产生有益影响的量。例如，可以施用单剂量或分剂量的0.0001至1mg或更多，例如，最多1g，例如，0.001至0.5mg，或0.01至0.1mg的DNA。
例如，当采用病毒表达载体时，约108至约1060gc的病毒载体可以作为核酸或作为包装的病毒体施用。在一些实施例中，约109至约1015个拷贝的病毒载体，例如每0.5至10mL，可以作为核酸或作为包装的病毒体施用。可替代地，核酸或载体可以以至少约0.0001mg/kg至约1mg/kg、至少约0.001mg/kg至约0.5mg/kg、至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg或至少约0.01mg/kg至约0.25mg/kg体重的剂量施用，尽管其他剂量可以提供有益结果。
在一个实施例中，可以使用合适的导管或针头通过颅内、心室内、脑池内、腰椎、肝内、气管内或支气管内注射或输注进行施用。如本领域已知的，可以使用多种导管来实现递送。例如，适用于本发明的各种通用导管以及改进的导管可从商业供应商处获得。此外，在通过直接注射到脑或肺的特定区域实现递送的情况下，可以使用多种方法将导管引入该区域，如本领域已知的。
举例来说，脂质体和其他含脂质的基因递送复合物可用于递送一种或多种转基因。本领域已经描述了制备和使用此类复合物用于基因递送的原理(参见例如，Ledley，(1995)；Miller等人，(1995)；Chonn等人，(1995)；Schofield等人，(1995)；Brigham等人，(1993))。
含有基因递送载体的药物调配物可以通过本领域已知的程序使用众所周知且容易获得的成分来制备。例如，该药剂可以与常见的赋形剂、稀释剂或载剂一起调配，并制成片剂、胶囊、悬浮液、散剂等。本发明的载体也可以调配为适合肠胃外施用(例如通过肌肉内、皮下或静脉内途径)的酏剂或溶液。
载体的药物调配物还可以采用水溶液或无水溶液的形式，例如冻干调配物或分散体，或者可替代地采用乳液或悬浮液的形式。
在一个实施例中，载体可以调配用于施用，例如通过注射，例如推注或经由导管连续输注，并且可以以单位剂量形式存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或添加防腐剂的多剂量容器中。活性成分可以采取诸如在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的调配剂。可替代地，活性成分可以是粉末形式，通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液中冻干获得，用于在使用前用合适的媒剂例如无菌、无热原水配制。
这些调配物可以含有现有技术中众所周知的药学上可接受的媒剂和佐剂。例如，可以使用一种或多种从生理学角度可接受的有机溶剂来制备溶液。
对于通过吸入施用到上(鼻)或下呼吸道，载体可以方便地从吹入器、喷雾器或加压包或其他方便的递送气溶胶喷雾的方式递送。加压包可包括合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。
可替代地，对于通过吸入或吹入施用，组合物可以采用干粉形式，例如，治疗剂和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型存在于例如胶囊或筒中，或例如明胶或泡罩包装中，粉末可以借助吸入器、吹入器或计量剂量吸入器从其中施用。
对于鼻内施用，载体可以经由滴鼻剂、液体喷雾剂施用，例如经由塑料瓶雾化器或计量剂量吸入器。典型的雾化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。
载体的局部递送也可以通过在疾病位点或疾病位点附近施用载体的多种技术，例如使用导管或针头进行。位点特异性或靶向局部递送技术的实例并非旨在限制，而是说明可用的技术。实例包含局部递送导管，例如输注或留置导管，例如针头输注导管、分流器和支架或其他可植入装置、位点特异性载体、直接注射或直接应用。
本文所述的调配物和组合物还可以含有其他成分，例如抗微生物剂或防腐剂。
受试者
受试者可以是任何动物，包含人。人和非人动物。非人动物包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、奶牛、马、鸡、两栖动物以及爬行动物，但是如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、奶牛和马等哺乳动物可为受试者。受试者也可以是家畜，如牛、猪、羊、家禽和马，或宠物，如狗和猫。
在一个实施例中，受试者包含人类受试者。受试者通常由熟练的技术人员(如执业医师)诊断出患有病况。
本文所描述的本发明的方法可用于任何物种、性别、年龄、种族群体或基因型的受试者。因此，术语受试者包含男性和女性，并且其包含老年人、老年人到成人过渡年龄受试者成人、成人到成人前过渡年龄受试者和成人前，包含青少年、儿童和婴儿。
人类种族群体的实例包含白种人、亚洲人、西班牙裔、非洲人、非裔美国人、美洲原住民、闪米特人和太平洋岛民。本发明的方法可能更适合某些种族群体，如白人，尤其是北欧人群以及亚洲人群。
如上文所描述的，术语受试者还包含任何基因型或表型的受试者，只要他们需要本发明。另外，受试者可以具有任何头发颜色、眼睛颜色、肤色或其任何组合的基因型或表型。
术语受试者包含具有任何身高、体重或任何器官或身体部位大小或形状的受试者。
示例性实施例
在一个实施例中，提供了一种包括表达盒的基因疗法载体，所述表达盒编码哺乳动物载脂蛋白E，所述载脂蛋白E在第112位、第136位或第158位中的至少一个处具有除精氨酸以外的残基，或编码特异性结合APOE4的抗体或其抗原结合片段，例如具有结合特异性或源自9D11、4E4(结合100和150之间的残基)、5B5、E29、1343A(Arboleda-Velasquez等人，2019)的抗体，或美国专利第8,741,298号中公开的抗体，该专利的公开内容通过引用并入本文，或结合硫酸乙酰肝素的抗体，例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HPSG)。在一个实施例中，所述哺乳动物载脂蛋白E不是APOE2、APOE3或APOE4，而是修饰的APOE，其当在哺乳动物中外源表达时具有保护性，例如减少或延迟认知障碍或恶化，或可能减少与HSPG的结合。在一个实施例中，所述载体中的载脂蛋白E是人载脂蛋白E，例如，如本文所述进行修饰。在一个实施例中，所述载体中APOE中除精氨酸外的残基是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸或谷氨酰胺。在一个实施例中，所述载体中APOE中的第112位是半胱氨酸。在一个实施例中，所述载体中APOE中的第136位是丝氨酸。在一个实施例中，所述载体中APOE中的第158位是精氨酸或半胱氨酸。在一个实施例中，所述载体中APOE的第112位、第136位或第158位中的两个具有精氨酸。在一个实施例中，所述载体中APOE中的第112位不具有精氨酸。在一个实施例中，所述载体中APOE中的第158位不具有精氨酸。在一个实施例中，所述基因疗法是病毒基因疗法载体，例如腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。在一个实施例中，所述病毒基因疗法载体是rAAV载体。在一个实施例中，所述AAV载体具有AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳。在一个实施例中，所述AAV载体是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。载体可以存在于药物组合物中。在一个实施例中，所述组合物中病毒载体的量为约1×1011至约1×1016个基因组拷贝。
所述载体可在体外或体内引入细胞。在一个实施例中，一种预防、抑制或治疗哺乳动物阿尔茨海默病的方法包含向哺乳动物施用有效量的基因疗法载体。在一个实施例中，一种预防、抑制或治疗哺乳动物中与APOE4表达相关的疾病的方法包含向哺乳动物施用有效量的基因疗法载体。在一个实施例中，一种预防、抑制或治疗哺乳动物脂质病症的方法包含向哺乳动物施用有效量的基因疗法载体。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E4/E4纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E2纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E3纯合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E3/E4杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是E2/E3杂合子。在一个实施例中，所述哺乳动物是人。在一个实施例中，所述载体是全身性施用的。在一个实施例中，所述载体是注射的。在一个实施例中，所述载体施用于中枢神经系统。在一个实施例中，所述载体施用于脑。在一个实施例中，载体编码具有C112、S136和R158或具有C112、S136和C158的载脂蛋白E。
在一个实施例中，提供了一种基因疗法载体，所述基因疗法载体包括：可操作地连接到核酸序列的启动子，所述核酸序列包括编码不是APOE2、APOE3或APOE4但经过修饰并具有保护性的APOE和3'非翻译区(3'UTR)的开放阅读框；以及具有对应于APOE4的用于抑制APOE4 mRNA的RNAi序列的核苷酸序列。在一个实施例中，所述载体包括所述核苷酸序列。在一个实施例中，所述核苷酸序列是所述开放阅读框的5'或3'。在一个实施例中，所述核苷酸序列是所述开放阅读框的5'和3'。在一个实施例中，所述核苷酸序列位于不同的载体上。在一个实施例中，所述载体是病毒载体。在一个实施例中，所述病毒载体是AAV、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒或逆转录病毒载体。在一个实施例中，所述AAV是AAV5、AAV9或AAVrh10。在一个实施例中，所述核苷酸序列连接到第二启动子。在一个实施例中，所述第二启动子是PolIII启动子。在一个实施例中，所述RNAi包括包含多个miRNA序列的miRNA。在一个实施例中，所述RNAi包括包含多个siRNA序列的siRNA。在一个实施例中，所述开放阅读框包括多个沉默核苷酸取代。在一个实施例中，所述载体具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的具有沉默核苷酸取代的所述密码子。在一个实施例中，所述开放阅读框进一步包括肽标签，例如HA、组氨酸标签、Avi标签、麦芽糖结合标签、Strep-标签、FLAG-标签、V5-标签、Myc-标签、Spot-标签、T7标签或NE-标签。在一个实施例中，所述载体在宿主细胞中，例如在宿主生物体中，例如哺乳动物、或非人灵长类动物或人中。可以向宿主哺乳动物施用一定量的载体，该量例如有效预防、抑制或治疗哺乳动物的阿尔茨海默病，或有效预防、抑制或治疗哺乳动物中与APOE4表达相关的疾病。在一个实施例中，所述载体和/或核苷酸序列是全身施用的。在一个实施例中，所述载体和/或核苷酸序列是口服给药的。在一个实施例中，所述载体和/或核苷酸序列是静脉内施用的。
将通过以下非限制性实例进一步描述本发明。
实例1
概述
阿尔茨海默病(AD)的发病机制复杂，其特征在于淀粉样蛋白-β(Aβ)和淀粉样蛋白斑的中枢神经系统(CNS)积累、tau异常磷酸化、tau缠结、炎症和神经元进行性丢失，导致进行性认知衰退1。遗传学在这些致病过程的风险中起主要作用(DeTure&Dickson,2019；Holtzman等人，2012；Safieh等人，2019；Fernandez等人，2019)。早发性常染色体显性AD由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和早老素(PSEN)1和2的突变引起(Campion等人，1999；Carmona等人，2018)，所述APP和所述PSEN 1和2是影响APP加工的基因，改变Aβ肽产生，导致聚集和斑形成(Carmona等人，2018；Dai等人，2018)。散发性迟发性AD的主要遗传因素是载脂蛋白E(APOE)的变体，所述APOE是一种脂质转运蛋白(Tzioras等人，2019；Wolters等人，2019)。APOE有3种常见的亚型，常见的ε3亚型与AD的平均风险相关，ε4将风险增加15-20倍，而ε2将风险分别降低66％至99％，与ε3和ε4相比(Wolters等人，2019；Corder等人，1994；Naj等人，2011；Reiman等人，2020)。在生物学水平上，APOE基因型(ε4>ε3>ε2)预测人类和AD小鼠模型中脑淀粉样蛋白、p-tau和tau缠结的时机和数量(Tzioras等人，2019；Shi等人，2017；Abner等人，2018)。E2和E4的差异由氨基酸112和158决定；APOE2(C112 C158)传达低风险，并且APOE4(R112 R158)传达高风险(Corder等人，1994；Reiman等人，2020；Corder等人，1993)。在此112-158“阿尔茨海默病风险区”内，编码LDL受体并与乙酰肝素蛋白聚糖结合(Mahley等人，1999)。
由于APOE4传达高风险并且APOE2传达低风险，为了开发用AAVrh.10hAPOE2预防/治疗APOE4纯合子中AD相关病理学的发展的基因疗法，制备了编码人APOE2的血清型rh.10腺相关病毒(AAV)基因转移载体。CNS施用AAVrh.10hAPOE2预防小鼠模型中APOE4相关的Aβ和淀粉样蛋白负荷(Zhao等人，2016)，支持了以下概念：使用APOE2基因疗法将APOE4纯合子脑转变为APOE2-APOE4杂合子状态可能会减轻APOE4相关的AD风险(Zhao等人，2016)。
APOE 112-158区域在介导AD风险中的重要性在PSEN1 E280突变的女性携带者的报告中得到了强调，该女性也是APOE3ChC的纯合子，即克赖斯特彻奇R136S APOE3变体(Arboleda-Velasquez等人，2019)。显性PSEN1-E290A基因定义了一个>1,200个个体的哥伦比亚家族，所有个体都具有早发性CNS Aβ和淀粉样蛋白积累；杂合子在他们四十五岁左右时会患上痴呆(Lopera等人，1997)。引人注目的是，共同遗传APOE3ChC和PSEN1-E290A的女性在70岁时认知状况良好，远远超过了家族通常会出现认知衰退的年龄(Arboleda-Velasquez等人，2019年)。临床评估揭示淀粉样蛋白斑的积累，但tau病理学水平低，导致APOE3ChC变体阻止tau病理学发展的概念。体外实验证实了这一点，证明APOE3ChC的行为类似于APOE2等位基因；与紧密结合的APOE4相比，两者与肝素的结合较差(APOE3ChC>APOE2)(Mahley等人，1999；Zhao等人，2016；Rosenberg等人，2018；Arboleda-Velasquez等人，2019)。观察到APOE3ChC的遗传阻止了PSEN1-E280A驱动的tau病理学发展，但不阻止淀粉样蛋白病理学的发展(Arboleda-Velasquez等人，2019)，以及基因疗法研究表明AAV-介导的APOE2向CNS的递送可以抑制APOE4驱动的淀粉样蛋白病理学，导致在AD淀粉样蛋白和tau病理学的小鼠模型中测试，AAVrh.10介导的APOE3ChC(带有克赖斯特彻奇变体的APOE3)递送至CNS是否抑制tau相关的病理学以及APOE2ChC(带有克赖斯特彻奇变体的APOE2)的递送是否抑制淀粉样蛋白和tau病理学。使用了2种基于小鼠、人E4的模型：APP.PS1/TRE4表现出APP和APOE4相关的淀粉样蛋白病理学(Zhao等人，2016；Rosenberg等人，2018；Arboleda-Velasquez等人，2019；Lopera等人，1997；Kim等人，2011)和P301S/E4表现出tau和APOE4相关的tau病理学(Liu等人，2016；Allen等人，2002)。
策略
遗传在阿尔茨海默病的风险中起着重要作用(DeTure&Dickson，2019；Holtzman等人，2012；Safieh等人，2019；Fernandez等人，2019)。早发性常染色体显性AD由淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和早老素(PSEN)1和2的突变引起(Campion等人，1999；Carmona等人，2018)，所述APP和所述PSEN 1和2是影响APP加工的基因，改变Aβ肽产生，导致聚集和斑形成增加(Carmona等人，2018；Dai等人，2018)。散发性迟发性AD的主要遗传因素是载脂蛋白E(APOE)的变体，所述APOE是一种脂质转运蛋白(Tzioras等人，2019；Wolters等人，2019)。APOE有三种常见的亚型，ε2、ε3、ε4；常见的ε3亚型与AD的平均风险相关，ε4增加风险并且降低AD发作年龄，而ε2降低风险并延迟发作年龄(Wolters等人，2019；Corder等人，1994；Naj等人，2011)。在生物学水平上，APOE基因型(ε4>ε3>ε2)预测AD的人类和小鼠模型中脑淀粉样蛋白、p-tau和tau缠结的时机和数量(Tzioras等人，2019；Shi等人，2017；Abner等人，2018)。基于APOE基因不同变体的遗传可以决定AD风险、发作年龄和严重程度的知识(DeTure&Dickson，2019；Shinohara等人，2016)，设想一种减少APOE4纯合子中CNS相关的阿尔茨海默病病理学的疗法可以通过向CNS递送“APOE AD降低风险”变体来完成。先前的研究表明，由AAV血清型rh.10(AAVrh.10)介导的APOE2递送至CNS减少了AD小鼠模型中的Aβ和淀粉样蛋白负荷(Zhao等人，2016)。在这些小鼠模型中，APOE2减少脑Aβ负荷的能力取决于基因剂量和预先存在的Aβ1-42沉积量，这表明如果可以在疾病过程早期达到足够的脑APOE2水平，则使用AAV载体的APOE2基因递送是治疗或预防AD的可行治疗方法(Zhao等人，2016)。这数据，以及证明使用脑池内途径在非人灵长类动物的CNS中递送和安全实现高水平APOE2表达的能力的研究(Rosenberg等人，2018)，导致了一项首次在人类中进行的用AAVrh.10hAPOE2脑池内施用治疗APOE4纯合子的临床研究。
设想了一种“APOE AD降低风险”基因疗法策略，该策略在减轻APOE4驱动的AD相关病理学发展方面比使用APOE2的基因疗法更有效。该方法基于最近一份关于APOE3-克赖斯特彻奇(APOE3ChC)突变叠加在哥伦比亚PSEN1-E290A突变上的后果的报告，该哥伦比亚PSEN1-E290A突变是影响超过1,200个个体的家族中的PSEN1变体(Lopera等人，1997；Acosta-Baena等人，2011)。PSEN1-E280A突变与Aβ生产增加有关，导致淀粉样蛋白积累；杂合子在他们四十五岁左右时会患上痴呆(Lopera等人，1997)。一名来自该具有常染色体显性PSEN1 E280A突变的家族但也是APOE3ChC变体纯合子的女性在70岁时处于良好的认知状态，并且仍然保持独立，远远超过40岁的年龄，具有相同PSEN1突变的他人在该年龄就通常表现出认知衰退(Arboleda-Velsquez等人，2019)。临床评估显示淀粉样蛋白斑的显著积累，但低tau/p-tau病理学表明APOE3ChC突变可能阻碍了tau病理学的发展(Arboleda-Velsquez等人，2019)。有趣的是，APOE3ChC变体(R136S)与常见的ε2、3和4等位基因(112-158)位于APOE蛋白的同一区域，这与APOE的该区域与AD风险相关的概念一致(Mahley等人，1999)。
APOE3ChC变体抑制tau病理学的能力得到了体外实验的证实，证明APOE3ChC的行为类似于APOE2等位基因；两者都与肝素结合不佳(APOE3ChC<APOE2)(Mahley等人，1999；Arboleda-Velsquez等人，2019)。这些发现表明，AD相关的致病事件链可能在淀粉样蛋白形成后被APOE3ChC打破，并且独立于机制，克赖斯特彻奇突变具有保护性，可用于治疗APOE4纯合子，并且可能比使用APOE2等位基因的基因疗法更有效(图12至13)。在相关AD小鼠模型中使用AAVrh.10衣壳作为递送系统，评估了AAVrh.10介导的各自携带克赖斯特彻奇突变的APOE3或APOE2递送至CNS优于AA Vrh.10hAPOE2作为APOE4纯合子中的阿尔茨海默病的治疗。基于AAVrh.10hAPOE2抑制鼠模型中淀粉样蛋白积累的先前证明(Zhao等人，2016)以及克赖斯特彻奇变体的临床病例报告，AAVrh.10hAPOE3ChC可能抑制tau，但不抑制淀粉样蛋白，病理学，并且AAVrh.10hAPOE2ChC可能在抑制淀粉样蛋白和tau病理学两者方面更有效。
PSEN1-APOE3ChC。虽然遗传了APOE3ChC变体和哥伦比亚PSEN1-E280突变的个体的报告仅代表一个案例，但该报告包含支持APOE3ChC是“APOE AD降低风险”变体这一结论的其他研究。尽管淀粉样蛋白PET扫描显示CNS淀粉样蛋白斑的显著积累，但很少观察到tau病理学，并且主要局限于内侧颞叶。此外，脑葡萄糖代谢几乎正常(图14)。APOE3ChC突变阻断tau病理学发展的概念与Reiman等人(2020)的研究中的概念相似，即在来自APOE2纯合子的24个尸检样本中观察到APOE2与tau病理学减少有关。APOE3ChC变体抑制tau病理学的能力得到了体外实验的支持，证明APOE3ChC的行为类似于APOE2等位基因；并且与E4相比，E2和E3ChC两者与肝素的结合均差(结合：E4>E3>E2>>E3ChC，图15)。HSPG与淀粉样蛋白斑的形成以及促进小胶质细胞对淀粉样蛋白的反应有关(Hefferman等人，2016；ALXFORUM，2010；Snow等人，1988；Liu等人，2016；O'Callaghan等人，2018)。HSPG也与tau病理学有关；已表明HSPG允许tau原纤维附着在神经元上，促进有毒形式的tau的摄取和传播(Rauch等人，2018；Zhao等人，2019)。体外研究还表明，如通过肝素结合测量，APOE3与残基130-143(包含克赖斯特彻奇突变区域)的抗体结合在功能上将APOE3转化为APOE3ChC。总之，这些发现表明阿尔茨海默病相关的致病事件链可能在淀粉样蛋白形成后被APOE3ChC破坏，并且独立于机制，因为克赖斯特彻奇突变具有保护性，因此可用于治疗APOE4纯合子。
AD的APOE4相关风险。APOE是一种脂质结合蛋白，它是CNS中胆固醇的主要载剂(Puglielli等人，2003；Williams等人，2020)。在大脑中，它主要由星形胶质细胞和小胶质细胞产生(Flowers&Rebeck，2020；Pitas等人，1987；Holtzman等人，2012)。APOE颗粒在细胞外环境中形成(Mahley等人，1999；Flowers&Rebeck，2020)；APOE颗粒经由APOE受体(低密度脂蛋白受体基因家族的成员)将胆固醇转运至神经元(Liu等人，2013；Mondadoori等人，2007；Zhang等人，2013)。APOE蛋白(299个氨基酸)具有通过铰链区连接的N末端(1-167)和C末端(206-299)结构域(Safieh等人，2019；Flowers&Rebeck，2020)。C末端区域含有低密度脂蛋白受体结合位点41(图2)。除了其在CNS中转运胆固醇的这个作用外，APOE还有许多其他功能(Holtzman等人，2012；Castellano等人，2011；Deane等人，2008；Hashimoto等人，2012；Hatters等人，2006a；Hatters等人，2006b；Li等人，2012；Manelli等人，2005；Walker等人，2000；Yu等人，2014；Zhao等人，2009)。人类APOE通常以3种亚型(APOE2、3和4)表达，它们仅相差两个残基(Mahley等人，1996；Zannis等人，1981)(图13)。APOE4的遗传是AD最重要的遗传风险因素。APOE3是中性的，E4等位基因增加风险并降低发作年龄，并且E2降低风险并延迟发作年龄(Reiman等人，2020；Mahley，2016；Conejero-Goldberg等人，2014；Nagy等人，1995；Raber等人，2004)。流行病学数据表明APOE4和APOE2是共显性的，即E2/E4杂合子的AD风险不是E3/E4杂合子的4倍，而是接近E3/E3纯合子的正常风险(Corder等人，1994；Liu等人，2013；Genin等人，2011)，即大致等价的E2表达抵消了E4等位基因的有害影响(Corder等人，1994；Farrer等人，1997；Coon等人，2007)。流行病学研究对E2研究的保护作用的主要结论包含：E2基因型在AD中的代表性明显不足(Corder等人，1994；Reiman等人，2020)；E2等位基因与延迟的AD发作年龄相关(Reiman等人，2020；Benjamin等人，1994)；E2携带者减少了与AD相关的病理学(Reiman等人，2020；Nagy等人，1995)；E2与较慢的认知衰退有关(Small等人，2004)；E2携带者拥有更强大的白质完整性，这可能与发展AD的脆弱性降低有关(Chiang等人，2012)；并且在正常老年人中，E2携带者的脑脊髓液p-Tau水平较低且tau略低(Chiang等人，2010)。实验研究表明，E2促进Aβ的代谢；神经元修复和神经突增生；并充当抗氧化剂和抗炎剂(Rebeck等人，2002)。此外，动物和临床研究表明，APOE基因型还预测脑淀粉样蛋白β(Aβ)肽沉积以及淀粉样蛋白负荷的时机和数量(E4>E3>E2)(Castellano等人，2011；Raber等人，2004；Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Reiman等人，2009；Schmechel等人，1993)，即APOE4会损害淀粉样蛋白β的清除并增加淀粉样蛋白的形成70,71。(Liao等人，2017；Hu等人，2015)。小鼠的鼠研究表明，靶向缺失内源性ApoE基因导致AD的PDAPP小鼠模型中的纤维淀粉样蛋白和总脑Aβ沉积急剧减少(这些小鼠表达突变的APP转基因，导致人类Aβ脑水平升高)(Bales等人，1997)。通过将PDAPP小鼠与人类APOE靶向替换(TRE)小鼠杂交，在脑Aβ沉积和淀粉样蛋白负荷中观察到APOE亚型依赖性效应(E4>>E3>E2)，其方式概括了在AD患者中观察到的情况(Castellano等人，2011；Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Fagan等人，2002)，表明APOE亚型在确定脑淀粉样蛋白负荷中起重要作用。此外，对tau病理学相关的P301S/E3、E2和E4小鼠的研究表明，ApoE在tau病理学背景下独立于淀粉样蛋白-β影响神经变性。ApoE4导致神经变性加重，而ApoE的缺失具有神经保护作用(Shi等人，2017)。
APOE4相关CNS病理学的APOE2基因疗法。基于APOE2具有保护作用的流行病学数据，开发了基因疗法计划来评估将APOE2转移到APOE4纯合子的CNS会减轻E4风险的假设(Zhao等人，2016；Rosenberg等人，2018)。这种方法可行性的文献证据来自Dodart等人(2005)的研究，其证明使用慢病毒载体将APOE4和APOE2施用于鼠AD模型的CNS分别增加和减少了脑Aβ/淀粉样蛋白负荷。Hudry及同事(2013)使用AAV4载体将APOE2递送到突变APP小鼠的侧脑室中复制了APOE2降低脑Al3/淀粉样蛋白负荷的发现。使用施用至CSF的AAV8载体，Hu等人(2015)发现在TRE4小鼠模型中增加APOE2是治疗AD的有效策略；而在TRE4小鼠中增加APOE4是有害的。如下文详细描述，编码人类APOE2的AAVrh.10血清型载体降低2个鼠模型中的淀粉样蛋白负荷(Zhao等人，2016)。无论这些APOE等位基因决定AD风险的分子机制如何，鉴于APOE2具有强保护作用，并且当经由任一基因疗法载体递送到小鼠大脑时显著降低Aβ/淀粉样蛋白负荷的事实，经由病毒载体进行的APOE2的CNS基因递送代表了APOE4纯合AD的治疗策略。
AAVrh.10.AAVrh.10血清型源自恒河猴。该血清型已与各种表达盒一起施用于实验i1]动物(小鼠、非人灵长类动物)的CNS、患有CLN2病的儿童和患有阿尔茨海默病的成人(clinicaltrials.gov；NCT01414985、NCT01161576、NCT03634007)。AAVrh.10载体设计有高活性的组成型启动子、内含子编码序列和兔β-珠蛋白polyA，其两侧是AAV2反向末端重复序列(例如，AAVrh.10hAPOE2载体的详细信息，参见图16)。AAVrh.10衣壳在介导CNS中的基因表达方面非常有效，与AAV9相当，但潜在毒性较小(Rosenberg等人，2018；Rosenberg等人，2014；Sondhi等人，2012；Tardieu等人，2014；Zerah等人，20150。所有载体的特征在于身份、效力和纯度的众多量度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的纯度确定了用于载体生产的细胞中不存在污染蛋白质(图17)。作为向非人灵长类动物(NHP)脑池内施用编码人类APOE2的载体的有效性的证明，提供了载体衍生蛋白在包含脑脊髓液在内的CNS中的广泛分布(图18)。这些观察结果支持CNS施用编码人类APOE亚型的AAVrh.10载体可以有效地将编码APOE亚型分布在整个CNS中。
AA Vrh.10hAPOE2改善AD动物模型的病理学。PDAPP小鼠是一种经过充分表征的脑淀粉样变性小鼠模型，它过度表达人类APP突变并在海马和大脑皮层中产生年龄依赖性Aβ和淀粉样蛋白沉积(Games等人，1995；Schenk等人，1999)。在9个月龄时，海马中有丰富的Aβ和淀粉样蛋白斑80。AAVrh.10hAPOE2载体的表达证明了在用表达无关基因的类似病毒载体处理的对照动物中观察到的淀粉样蛋白病理学显著消退(图19)(Zhao等人，2016)。使用AAVrh.10hAPOE2载体表达APOE2导致PDAPP小鼠海马中的不溶性Aβ1-42(减少70.4％。p<0.001，与mCherry对照相比)和可溶性Aβ1-42(减少27.2％，p<0.05，与mCherry对照相比)水平显著降低。不溶性Aβ1-40也急剧降低(减少61.2％。p<0.001，与对照相比)，尽管相对已经低水平的可溶性Aβ1-40没有改变。
为了进一步评估APOE2表达对脑Aβ负荷的作用，还评价了AAVrh.10hAPOE2剂量对APP.PS1/TRE4三重转基因小鼠Aβ/淀粉样蛋白病理学的影响。APP.PS1/TRE4小鼠携带APP瑞典(Swedish)(APPswe)和PS1突变以及人类APOE4基因(Kim等人，2011；Jankowsky等人，2018)。APP.PS1/TRE4小鼠在包含大脑皮层、海马和丘脑在内的多个大脑区域发展出强大的年龄依赖性Aβ和淀粉样蛋白病理学。早在2个月龄时，在这些小鼠的皮层中就观察到淀粉样蛋白斑，并且发展的大脑AJ3/淀粉样蛋白负荷取决于APOE4表达(Kim等人，2011)。与在PDAPP小鼠中观察到的相似，在用海马内递送AAVrh.10hAPOE2处理的APP.PS1/TRE4小鼠的海马中观察到淀粉样蛋白-β水平的剂量依赖性抑制(图20)。
APOE4相关AD病理学的小鼠模型。临床目标是抑制APOE4纯合子的CNS中的淀粉样蛋白和tau病理学两者，并且因此利用鼠ApoE敲除和人类APOE4敲入选择鼠模型。一种用于APOE4相关淀粉样蛋白病理学的鼠模型，并且另一种鼠模型用于APOE4相关tau病理学。APP.PS1/TRE4小鼠表达人类β-淀粉样蛋白(Aβ)前体蛋白(APP)，其具有瑞典突变(APPswe)、突变(L 166P)人类早老素1和取代内源性的小鼠ApoE基因的人类APOE4基因。这些小鼠表达高水平的人类Aβ蛋白和人类AD样淀粉样蛋白病理学(Kim等人，2011)，并在我们之前的研究中用于证明AAVrh.10hAPOE2将抑制AD淀粉样蛋白相关病理学(Zhao等人，2016)(图20)。P301S/E4小鼠含有人P301S 1N4R tau，缺失鼠ApoE基因并添加人APOE4基因(Shi等人，2017；Allen等人，2002)。这些小鼠具有APOE4相关的tau病理学，并将用于评价基因疗法载体抑制tau病理学的能力。这些小鼠还具有小胶质细胞和星形胶质细胞激活，代表与AD相关的炎症(Shi等人，2017)。
方法。克赖斯特彻奇变体(APOE3-R 136S)位于APOE 112-158“阿尔茨海默病风险区”，其包含定义APOE2、3和4的残基112和118、LDL结合区(136-150)和蛋白聚糖硫酸乙酰肝素结合区(图13)。证明AAVrh.10APOE2的CNS施用可以预防APOE4相关小鼠模型中APOE4相关的Aβ和淀粉样蛋白负荷支持了以下概念：通过使用递送APOE2编码序列以将APOE4纯合子脑转化为APOE2-APOE4杂合子状态的基因疗法可以减轻APOE4相关的AD风险(Zhao等人，2016)。伴有APOE3ChC的纯合子遗传的PSEN1-E290A家族中的否定PSEN1-E290A驱动的AD相关tau病理学的女性报告导致了该提案的重点：使用AAVrh.10载体开发用于APOE4纯合子的第2代基因疗法在APOE3或APOE2背景上递送克赖斯特彻奇突变。我们将在2个人类APOE4相关小鼠模型中对此进行测试：APP.PS1ffRE4主要表现出与淀粉样蛋白相关的病理学，并且P301S/E4主要表现出与tau相关的病理学(Shi等人，2017；Kim等人，2011)。如果APOE3背景上的克赖斯特彻奇变体在小鼠模型中有效，相当于PSEN1-E290A和APOE3ChC双遗传的病例报告，则AAVrh.10APOE3ChC基因疗法应该抑制P301S/E4小鼠中的tau病理学，而不是APP.PS1ffRE4小鼠的淀粉样蛋白病理学。然而，基于AAVrh.10hAPOE2在抑制APP.PS1ffRE4小鼠中淀粉样蛋白病理学的有效性(Zhao等人，2016)，我们假设AAVrh.10hAPOE2ChC将抑制APP.PS1ffRE4小鼠中的淀粉样蛋白病理学以及PSEN1-E290A小鼠中的tau病理学。如果假设是正确的，则AAVrh.10hAPOEChC将是进入临床治疗APOE4纯合子的理想第2代候选者。除了不同的载体(AAVrh.10hAPOE3ChC和AAVrh.10hAPOE3，或AAVrh.10hAPOE2ChC和AAVrh.10hAPOE2)之外，一切都是相同的。统计分析包含各实验内参数的比较，并分别比较AAVrh.10hAPOE3ChC和AAVrh.10hAPOE2ChC的差异。
对于每个小鼠模型(APP.PS1ffRE4、P301S/E4)，载体AAVrh.10hAPOE3ChC、AAVrh.10hAPOE3；AAVrh.10hAPOE2ChC、AAVrh.10hAPOE2；两者的对照，AAVrh.10Null(无可翻译转基因)或PBS]在2个月龄时以2μl双侧施用于海马。载体用2剂0.4×1010个基因组拷贝(gc)或1.0×1010gc施用。评估将在5个月和9个月进行。10只雄性和10只雌性将用于所有数据点(小鼠品系、载体或PBS、评估时间点；表I)。与载体、一般病理学、淀粉样蛋白、tau和炎症相关的待进行评估列于表II。基于AAVrh.10hAPOE2有效抑制APP.PS1ffRE4小鼠的淀粉样蛋白相关病理学(Zhao等人，2016)，以及APOE3ChC纯合遗传允许淀粉样蛋白病理学但阻止PSEN1-E280A家族的女性携带者中的tau病理学的病例报告(Arboleda-Velasquez等人，2019)，我们两个在预防淀粉样蛋白和tau病理学两者方面，hAPOE3ChC和hAPOE2ChC载体可能比没有ChC变体的hAPOE3和hAPOE2载体更有效，并且hAPOE2ChC构建体可能比hAPOE3ChC构建体更有效。还测试了：(1)hAPOE3ChC和hAPOE2载体对更一般病理学的有效性(AD相关CNS结构的定量体积，一般细胞功能的转录组分析)；(2)AD相关炎症(小胶质细胞和星形胶质细胞激活，促炎基因的转录组分析)，因为与E2和E3变体相比，E4变体与更大的先天免疫相关炎症相关(Vitek等人，2009；Gale等人，2014)。
表I.利用人类APOE4相关AD病理学的APP.PS1/TRE4和P301S/E4小鼠模型的APOE变体的AAVrh.10介导疗法
参数 变量
小鼠模型 APP.PS1/TRE4,P301S/E4
转基因(AAVrh.10载体) APOE3ChC,APOE3；APOE2ChC,APOE2；-无,PBS<sup>1</sup>
途径，剂量 双侧海马，0.4×10<sup>10</sup>gc，1×10<sup>10</sup>gc2
载体施用年龄 2个月<sup>2</sup>
评估年龄 5个月、9个月<sup>3</sup>
小鼠数量/时间点，剂量 10M，10F
小鼠总数量 880
每个小鼠模型都用PBS或编码所列转基因的AAVrh.10载体进行处理；所有施用均在2个月时，以所列剂量双侧施用于海马，每次2μl；CNS评估是在5个月和9个月时进行，待评估的参数列表参见表II
表II.APOE变体在人类APOE4相关AD病理学的APP.PS1/TRE4和P301S/E4小鼠模型中的功效评估
参数 评估
载体相关的 转基因DNA、mRNA、蛋白质(Western、免疫组织化学)
一般病理学 定量体积，一般细胞功能的转录组(RNAseq)
淀粉样蛋白的 可溶性、不溶性Aβ-1-42、Aβ-1-40(ELISA、免疫组织化学)
Tau-相关的 总tau、p-tau(ELISA、免疫组织化学)
炎症相关的 小胶质细胞、星形胶质细胞激活(CD68免疫组织化学、RNAseq促炎基因)
每个小鼠模型在2个月龄时施用AAVrh.10hAPOE3ChC、hAPOE3、hAPOE2ChC、hAPOE2、无(0.4×1010gc或1×1010gc；双侧，海马)或PBS，并在5个月和9个月龄时进行评价。每个载体、每个剂量、每个时间点10只雄性、10只雌性；PBS 10M，10F每个时间点；DNA、qPCR的mRNA，APOE蛋白通过定量蛋白质印迹、定量免疫组织化学评估；评估梨状/内嗅皮质、海马、后侧脑室的定量体积和齿状回厚度；评估一般细胞功能相关的定量转录组的RNAseq；可溶性(RIPA)和不溶性Aβ-1-42和Aβ-1-40通过ELISA和Aβ的免疫组织化学评估(海马阳性面积％，Aβ斑负荷)；tau和p-tau的ELISA和免疫组织化学(评估海马的阳性面积％，tau缠结量化)；小胶质细胞(CD68，lba1)和星形胶质细胞(GFAP)的量化通过细胞计数和海马面积％、促炎基因的RNAseq定量转录组评估。
方法。
载体相关的。如前所述((Sondhi等人，2012；Sondhi等人，2007)生产和纯化MVrh.10载体。简而言之，载体是通过将HEK293T细胞与表达盒质粒和腺病毒辅助质粒共转染产生的。将包装细胞系HEK293T维持在补充有5％胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基中并维持在37℃和5％CO2下。使细胞在CellSTACKS(康宁(Corning))中生长24小时，然后使用PElpro程序用质粒转染。细胞在收获前孵育3天，并通过5次冻/融循环进行裂解。在37℃下用50U/mL的核酸酶(Benzonase)处理所得细胞裂解物持续30分钟。通过碘克沙醇密度梯度，随后是Q-HP离子交换色谱法来纯化细胞裂解物。纯化的AAVrh.10载体浓缩在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。通过Taq-Man定量聚合酶链式反应确定载体基因组滴度。纯化的载体经无菌过滤；在支持需氧细菌、厌氧细菌或真菌生长的培养基上测试14天的生长；测试内毒素；并证明不含支原体。
小鼠模型。建立了源自APP.PS1-21小鼠与人类APOE4敲入小鼠的杂交的APP.PS1/TRE4小鼠群体(Zhao等人，2016)。P301S/E4小鼠通过将人类tau突变P301S小鼠与人类APOE4敲入小鼠杂交产生。通过相关敲入基因的PCR验证小鼠的基因组。AAV载体的脑内注射通过立体定向手术进行(Dodart等人，2005)。简而言之，在无菌条件下，小鼠用异氟醚麻醉并固定在立体定位架(David Kopf Instruments)上。在颅骨制造切口，并用高速钻头制造注射针头大小的钻孔。使用33号针头(Hamilton)和注射泵(KD Scientific)以0.2μL/min的速率将AAV制剂(2μL，指定剂量的gc)双侧注射到目标脑区。用于注射的立体定向坐标如下：距前囟前后±1.7mm；距前囟中外侧±1.2mm，和硬脑膜下背腹侧±1.7mm。这是基于小鼠大脑的图谱95。每次注射后，将针头留在原位5分钟以最小化回流，然后缓慢拔出。动物被单独饲养和监测，直到它们恢复完全意识。在5个月和9个月龄时，用氯胺酮/甲苯噻嗪深度麻醉小鼠，并用0.3％肝素盐水(2500IU/L)经心灌注。大脑被快速收集，并且每个大脑将沿矢状平面分割，其中1个半脑被处理以用于组织学和免疫组织化学(IHC)分析，并且另一个半脑被显微解剖成海马、丘脑和内嗅皮层，然后在干冰上快速冷冻并储存在-80℃以进行生化分析。
大脑在4％多聚甲醛中后固定≥48小时，在冷冻前≥48小时转移到30％蔗糖中，并使用CM3050-S低温恒温器(Leica)切片。以50μm的间隔制备连续冠状切片。IHC分析将使用标准方法进行(Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Bales等人，1997)。洗涤自由浮动切片并在4℃下与一抗一起孵育过夜。免疫反应性(IR)使用Alexa Fluor 488或594偶联二抗(1:200；英杰公司(Invitrogen))或Vectastain ABC Elite试剂盒(Vector)和3,3-二氨基联苯胺溶液进行可视化。当一抗被省略时，一抗染色的特异性通过缺乏IR信号来验证。进行硫黄素-S染色以检测淀粉样蛋白斑(Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Bales等人，1997)。将固定的脑切片与0.1％新鲜制备的硫磺素-S溶液(在50％乙醇中)短暂孵育8分钟，然后用80％乙醇澄清1分钟，然后用H2O洗涤3次，每次1分钟，然后用封片剂盖上盖玻片。使用落射荧光显微镜(Nikon H550L)拍摄图像。
载体衍生的APOE。对于经处理用于载体DNA的组织匀浆，DNeasy血液和组织试剂盒(cat#69506；Qiagen)将与约50mg的匀浆组织样品一起使用。对于经处理用于载体转基因mRNA的组织匀浆，RNeasy脂质组织迷你试剂盒(Qiagen)将与约50mg的匀浆组织样品一起使用。将通过PCR使用基于TaqMan的分析(Applied Biosystems“Universal Master预混液II，无UNG”试剂)和人类特异性引物/探针组(Applied Biosystems)以在鼠基因组DNA(正向引物：5'GTGGAGAAGGTGCAGGCT-3'(SEQ ID NO:10)；反向引物：5'-AAGCGTAATCTGGAACATCGT-3'(SEQ ID NO:11)；探针，5'CCCTGTGCCCAGCGACAATC-3'(SEQ ID NO:12))的背景下检测来自病毒基因组的人APOE2或E3或E4 cDNA的3'末端来进行脑切片中载体DNA和转基因mRNA拷贝的定量分析。PCR使用QuantStudio6 Flex系统(Applied Biosystems)进行(Rosenberg等人，2018)。使用夹心ELISA测量大脑中的APOE水平(Bales等人，2009)。组织匀浆在样品稀释缓冲液(含有0.4％甘氨酸的PBST)中稀释。将样品装入涂有抗APOE抗体(1:2000；密理博(Millipore))的96孔板中。在4℃孵育过夜后，使用生物素化的抗APOE抗体(1:10,000；Meridian Life Science)进行检测。与HRP缀合的链霉亲和素(Research Diagnostics)孵育后的IR信号用TMB底物(赛默科技(Thermo Scientific))显色，并在Synergy H1 Hybrid读板器(BioTek)上读取。使用重组人APOE(Meridian Life Science)生成的标准曲线计算APOE水平。一式三份确定脑匀浆中的APOE水平，标准化为蛋白质含量，并表示为APOE/mg蛋白质的量。还通过蛋白质印迹分析对小鼠脑组织匀浆中的APOE和其他蛋白质水平进行了检查(Zhao等人，2016；Sacramento等人，2020)。使用BCA蛋白质测定试剂盒(赛默科技)确定组织匀浆中的总蛋白质浓度。对于十二烷基硫酸钠(SOS)聚丙烯酰胺凝胶电泳，将等量的蛋白质(25mg)样品与含有2％SDS和1％β-巯基乙醇的上样染料混合，在90℃下孵育10分钟，并在10％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上分解。对于非变性PAGE，将等量的蛋白质(25μg)样品与非变性上样染料混合至终浓度为0.04％溴酚蓝、4.0％甘油和100mM Tris(pH 6.8)，并在4-12％非变性Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(英杰公司)上分解。在100V下将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(密理博)膜上。在23℃下用Superblock(赛默科技)封闭1小时后，在4℃下用一抗探测膜过夜，然后在23℃用物种特异性HRP偶联的二抗(1:8000；英杰公司)探测膜1小时。增强化学发光(GE Healthcare Biosciences)用于识别条带。变性凝胶上的蛋白质分子量通过与千变万化的分子量标记物标准(Bio-Rad)进行比较来确定。天然凝胶上的粒径通过与天然高分子量标记物标准(GE Healthcare Biosciences)比较来确定。通过使用ImageLab软件(Bio-Rad)对扫描的放射自显影图进行光密度分析完成信号量化。通过剥离印迹和用β-肌动蛋白抗体(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))重新探测来标准化加载。
一般病理学。
体积分析。对每只小鼠的每第6个冠状脑切片(切片之间300μm)从前囟+2.1mm处喙侧开始到海马背侧的前囟-3.9mm处进行冷冻切片。固定切片在室温下用70％乙醇中的0.1％苏丹黑染色20分钟，然后在70％乙醇中洗涤1分钟，共3次。切片在Milli-Q水中洗涤3次，并用Fluoromount盖上盖玻片。使用NanoZoomer对染色切片进行成像，并使用NOP查看器在每个切片中跟踪和测量感兴趣的区域。使用以下公式计算体积：体积＝(面积总和)x0.3mm。对于海马和后侧脑室，量化从前囟-1.1开始并在前囟-3.9结束。对于梨状/内嗅皮质，量化从前囟-2.3开始并在前囟-3.9结束。
神经元层厚度测量。将来自每只小鼠的三个切片(前囟-1.4、-1.7和-2.0mm)安装并在室温下在甲酚紫中染色5分钟。然后将切片依次在50％、70％、95％(3次)和100％乙醇(两次)中脱水1分钟，然后在二甲苯中澄清4分钟(两次)，并用cytoseal盖上盖玻片(Coon等人，2007)(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，8310-16)。CA1锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层的厚度通过在所有3个切片中的两个点处绘制垂直于细胞层的刻度并取每只小鼠的平均值来测量。
RNASeq转录组分析。使用TRIzol方法提取总RNA，随后在RNeasy柱(Qiagen)上进行净化。通过Nanodrop ND-1000(赛默科技)评估RNA量，并通过生物分析仪(安捷伦科技(Agilent Technologies))评估RNA质量(Raman等人，2009；《肿瘤分析(Tumor Analysis)》，2004)。使用Illumina HiSeq 2500(Illumina)(Ryan等人，2014)对总RNA进行纯化、扩增并加载到Illumina流通池中以进行双末端测序反应。该文库使用(0.5μg总RNA)TruSeq RNA文库制备试剂盒v2制备。使用STAR(2.3.1z13_r470)将Illumina HiSeq双末端读数与GRCh37/hg19人类参考基因组和RefSeq基因定义(2014-06-02)进行比对。Cufflinks(2.2)用于使用RefSeq基因定义将对齐的读数转换为每千碱基外显子每百万测序片段(FPKM)的片段。FPKM>0.125的基因包含在分析中。使用Gene Ontology(GO)和人类蛋白质参考数据库(www.hprd.org)对失调的基因进行功能注释。双尾学生t检验用于比较数值数据，并且卡方检验与Yates校正一起用于比较分类数据。这些文件在Partek Genomics Suite软件版本6.6,2012(Partek)中进行处理。单因素ANOVA用于比较匹配的组，双或三因素ANOVA用于比较具有被识别为变异源的参数的组。p值<0.05被认为是显著的(使用Benjamini-Hochberg校正对p值进行了多次测试校正)。与“一般病理学”相关的正常细胞功能基因和自噬相关基因的评估详见Shi等人，(2017)的研究。
淀粉样蛋白相关的。使用标准方法对淀粉样蛋白/Al3负荷进行量化(Zhao等人，2016；Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Bales等人，1997)。简而言之，每只小鼠选择4个脑切片，每个切片相隔300μm，以用于量化。这些切片大致对应于小鼠脑图谱中前囟-1.4、-1.7、-2.0和-2.3mm的切片(Franklin等人，2019)。用生物素化3D6抗体进行免疫染色后，完成脑Aβ负荷的量化(Zhao等人，2016)。图像被阈值化以突出斑，然后通过ImageJ软件(美国国立卫生研究院)的“分析颗粒”功能进行分析。阈值化后，对识别的对象进行单独检查，以确认量化的每个对象都是斑。AβIR(Aβ负荷)或硫磺素-S(淀粉样蛋白负荷)覆盖的表面积百分比是针对海马形成的特定区域确定的，包括起层、锥体层、辐射层和齿状回。然后将Aβ或硫磺素-S负荷表示为量化的总面积的％。4个组织切片的平均值用于量化每只小鼠的斑负荷。所有分析均以盲法进行，检查者不知道任何动物的治疗状况。
使用标准方法(Bales等人，2009；Holtzman等人，2000；Bales等人，1997)，使用夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)测定小鼠脑匀浆中的Aβ水平。简而言之，用RIPA和含有蛋白酶抑制剂混合物(1:1000；罗氏公司(Roche))的5.5-M胍缓冲液连续匀浆脑组织。RIPA提取后测得的Aβ代表Aβ的可溶性池，而胍提取后测得的Aβ代表不溶性池。在测量Aβ1-40或Aβ1-42之前，用冷样品稀释缓冲液(1％牛血清白蛋白/磷酸盐缓冲盐水-0.05％吐温20[PBST])稀释匀浆。将样品加载到涂有作为捕获抗体的特异性识别Aβ1-42(21F12)或Aβ1-40(2G3)的C末端结构域的抗体的板上，并使用生物素化3D6用于检测。与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素(Research Diagnostics)孵育后的IR信号用TMB底物(赛默科技)显色，并在Synergy H1 Hybrid读板器(BioTek)上读取。使用重组人Aβ(American Peptide Company)生成的标准曲线计算Aβ的水平。一式三份确定脑匀浆中的Aβ水平，标准化为蛋白质含量，并表示为Aβ/mg蛋白质的量。Aβ寡聚体使用3D6/生物素-3D6夹心ELISA(lmmuno-BiologicalLaboratories)进行量化，其中相同的N末端(残基1-16)抗体用于捕获和检测二者。
Tau-相关的。ELISA。人总tau和p-tau通过pS202/T205-tau(ATS)和pT212/pS214-tau(AT100)抗体以夹心ELISA形式进行量化，如Chai等人(2011)所述。简而言之，96孔板用5μg/ml ATS或2μg/ml AT100(赛默飞世尔科技)在4℃下预涂过夜，然后用Starting Block封闭缓冲液(赛默飞世尔科技)封闭。样品(S1或P1)在Superblock缓冲液(赛默飞世尔科技)中稀释，并与生物素化HT7抗体(1:300；赛默飞世尔科技)一起加载到板上。在23℃孵育1小时后，用TBS/0.5％Tween 20洗涤缓冲液洗涤样品9次，然后与链霉亲和素-HRP(JacksonImmunoresearch)一起孵育30分钟。然后通过与一步式3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)底物(赛默飞世尔科技)一起孵育30分钟将板显色，并用2N H2SO4停止，然后使用BioTek SynergyH1 Hybrid读数器在450nm处读取。使用源自人类AD脑匀浆的标准曲线确定ATS或AT100免疫反应性tau的量。
炎症相关的。评估基因疗法对与2种鼠模型相关的炎症的程度和特征，如Shi等人(2017)所述。通过CD68阳性和Iba-1小胶质细胞过滤和星形胶质细胞过滤(GFAP)评估免疫组织化学。此外，使用Shi等人，(2017)使用的相同促炎基因评估RNAseq数据，特别关注促炎基因簇1和星形胶质细胞A1特异性(仅炎症)基因(Shi等人，2017)。
统计注意事项。对于载体衍生的APOE、一般病理学、淀粉样蛋白相关的、Tau相关的、炎症相关的(表II)类别中的每个测量结果，应用多因素ANOVA模型。主要的ANOVA模型包含五个因子：小鼠模型(APP.PS1/TRE4、P301S/E4)、载体(AAVrh.10-APOE3ChC、-APOE3、AAVrh.10APOE2ChC、-APOE2、AAVrh.10Null)、剂量(0.5×1010和1×1010gc)、时间(5个月和9个月)和性别(M/F)，其中使用额外的单独的ANOVA，一次将一个载体与无治疗-PBS(但其他因素相同)进行比较，以探索与PBS对照相比的影响。中心假设使用主要的ANOVA模型进行评估，其中淀粉样蛋白相关的和Tau相关的测量结果具有以下事先对比：AA Vrh.10-APOE3ChC与AA Vrh.10Null(目标1)和AAVrh.10APOE2ChC与AAVrh.10Null以及AAVrh.10-APOE3ChC与AAVrh.10APOE2ChC，其中这些中的每一种都应用于小鼠品系之间，每种小鼠品系内的剂量之间，以及每种小鼠品系内的时间点之间。这包括45(＝载体比较x因子比较x测量结果)个计划测试，并且Bonferroni校正用于评估控制总体0.05I类错误的显著性。作为逼近该设计功效下限的经验基准，在PDAPP小鼠大脑淀粉样变性实验(图8)中比较AAVrh.10hAPOE2与对照时，可溶性Aβ1-42的差异为27.2％和观察到的每组标准偏差产生的功效>0.85，其中考虑到不溶性Aβ1-42的经验差异和标准偏差，功效会更大，表明整体设计具有良好的功效来评估中心假设。和这些事先比较一样，还应用了探索性事后测试方法(带有适当的校正)来评估不同小鼠模型、剂量和测量时间的脑载体衍生APOE的数量，以及探索更广泛的载体(例如，AAVrh.10-APOE3ChC和AAVrh.10APOE2ChC相互比较以及与AAVrh.10-APOE3和AAVrh.10-APOE2相比)如何影响一般病理学和炎症相关测量结果(体积和RNA-Seq)，并估计小鼠模型、载体、剂量、测量时间和性别对这些影响的贡献。
实例2
概述
阿尔茨海默病(AD)是一种退行性脑病，并且是痴呆的最常见原因，目前影响着580万美国人和全球5000万人。AD症状包含认知和功能能力的进行性下降以及脑部病理学，包含细胞外β-淀粉样蛋白斑、细胞内tau缠结、慢性炎症和脑萎缩。对迟发性AD易感性的最强遗传风险因素涉及载脂蛋白E(APOE)等位基因的多态性。在AD患者中发现高频率的APOE4，并且纯合子遗传与患AD的风险增加14.5倍有关。相反，APOE2降低了AD发展的风险并延迟了疾病的发作，例如，将患上AD的风险降低了≥50％并延缓了发作年龄。基于流行病学数据，APOE4与AD中增加的脑淀粉样蛋白负载和更大的记忆障碍相关，而APOE2则减弱了这些影响。在人类中，在APOE4/4纯合基因型的情况下，患上AD的优势比为14.5，并且在APOE2/4杂合子中，优势比降至2.6。因此，即使由保护性APOE2补充，APOE4的存在仍然构成风险。此外，APOE4与先天免疫激活增加、神经元中的差异信号传导、tau病理恶化和脑功能异常有关，除了它在促进β-淀粉样蛋白产生方面的作用之外。
使用腺相关病毒(AAV)载体将APOE2直接递送至AD鼠模型的CNS可以提供显著的APOE2表达并降低可溶性和不溶性淀粉样蛋白-β肽和淀粉样蛋白负荷的水平。然而，即使补充了APOE2，APOE4的存在仍然构成增加的风险，因为APOE2/4杂合子患上AD的风险增加了2.6倍。在一个实施例中，提供了一种基于AAV的基因疗法，以引入保护性APOE2、修饰的APOE2或APOE3的表达，而同时降低APOE4纯合子中有害的内源性APOE4的水平。在一个实施例中，将靶向内源性APOE4的人工微小RNA(miRNA)与人APOE2基因(hAPOE2-mirAPOE4)的cDNA一起引入AAV表达盒中。在一个实施例中，AAV9血清型衣壳用于包装表达盒，因为它介导星形胶质细胞(APOE的主要生产者)以及小胶质细胞和神经元的有效转导。建立的表达突变的人类tau和人类APOE4，并且具有高磷酸化tau负荷、慢性炎症和广泛神经变性的P301S/E4 AD小鼠模型用于评估治疗效果。为了评价利用AAV9-hAPOE2-mirAPOE4的策略，在体外测试了AAV构建体的内源性APOE4表达沉默和APOE2编码序列的递送。此外，确定了APOE2的增加和内源性APOE4的减少是否防止体内tau病理学、神经变性和神经炎症。
通过海马内或丘脑内途径进行的人类APOE2编码序列的腺相关病毒(AAV)血清型rh.10和血清型9至两种AD鼠模型的中枢神经系统(CNS)的递送在整个大脑中产生了显著水平的人类APOE2表达。此外，脑部分的可溶性和不溶性淀粉样蛋白-β肽和淀粉样蛋白负荷的量减少。然而，仅通过提供APOE2将大脑从APOE4/4基因修饰为APOE2/4并不能完全减轻APOE4存在的风险。与单独使用APOE2的基因疗法相比，使用AAV基因疗法降低内源性APOE4的表达以及递送保护性APOE2可以降低APOE4纯合子的风险。
人类APOE2和APOE4的编码序列相差两个核苷酸。设计了靶向内源性APOE4mRNA以进行抑制的人工微小RNA(miRNA)序列。在体外筛选了人工miRNA在人类星形胶质瘤细胞系中沉默APOE表达的能力。选定的miRNA与不能被miRNA沉默的修饰的人类APOE2 cDNA一起并入AAV表达盒。选定的含有APOE2的AAV表达盒和靶向APOE4的人工miRNA被包装到AAV9衣壳中，以靶向表达至星形胶质细胞，所述星形胶质细胞是CNS中APOE的主要生产者。
P301S/E4 AD鼠模型小鼠表达人类突变tau和人类APOE4两者，并由小胶质细胞激活而产生高水平的磷酸化tau、脑萎缩和神经炎症。由于CNS中的APOE主要由星形胶质细胞表达，因此在本研究中使用AAV9载体，其有效地转导星形胶质细胞以及小胶质细胞和神经元。AAV9-hAPOE2-mirAPOE4和AAV9-hAPOE2载体通过脑池内途径直接施用于P301S/E4小鼠的CNS。评价小鼠的行为和认知功能随时间的变化。处死后，将评估小鼠脑中载体衍生的hAPOE2和内源性hAPOE4的表达以及β-淀粉样蛋白、总和磷酸化tau水平和病理学、小胶质细胞激活和脑萎缩。
策略。阿尔茨海默病的症状包含认知和功能能力的进行性下降，包含失忆、混淆、性格和情绪变化，以及丧失执行基本活动的能力1。与AD相关的脑病理学包含细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)斑和细胞内神经元纤维tau缠结的积累。晚期AD大脑中存在来自神经胶质激活的慢性神经炎症和导致脑萎缩的细胞丢失(阿尔茨海默病协会(Association As.)，2019)。
对迟发性AD易感性的最强遗传风险因素涉及载脂蛋白E(APOE)等位基因的多态性。APOE具有三种亚型：APOE2、APOE3和APOE4。APOE3是最常见的等位基因，而APOE4的等位基因频率为约15％，并且APOE2的等位基因频率为8％(Farrer等人，1997)。然而，具有APOE4的AD患者的频率为40-65％(Farrer等人，1997；Corder等人，1993；Ward等人，2012)。APOE4与认知衰退的速度和严重程度加快以及AD发作年龄较早有关。相比之下，APOE2将AD发展的风险降低50％，并将发作延迟长达10年(Corder等人，1993；Corder等人，1997；Sando等人，2008；Shinohara等人，2016)。
APOE是一种分泌蛋白，在外周和中枢神经系统(CNS)二者的脂质转运中起主要作用。APOE亚型仅在第112位和第158位两个氨基酸位置有所不同(APOE2：Cys/Cys，APOE3：Cys/Arg，APOE4：Arg/Arg)。然而，这些差异深刻地影响了APOE的结构和功能(Hatters&Peters-Libeu，2006)。APOE的血清和脑浓度因亚型而异(APOE2>APOE3>APOE4)。APOE2和APOE3(通常与高密度脂蛋白(HDL)相关)以及APOE4(与低密度和极低密度脂蛋白(LDL，VLDL)相关)的脂化状态存在差异(Hatters&Peters-Libeu，2006；Dong等人，1994)。此外，APOE亚型与受体的结合不同，所述受体包含低密度脂蛋白受体相关1(LRP1)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和LDL受体(LDLR)，其中APOE2的亲和力低于APOE3或APOE4(Bu，2009，Arboleda-Velasquez等人，2019)。
APOE在AD中发现的病理学和神经变性中发挥着许多作用。细胞外Aβ斑是AD病理学的标志。Aβ沉积在APOE4携带者中更为丰富(Dorey等人，2014)。APOE4增强Aβ的产生，通过削弱溶酶体降解和跨血脑屏障的转运来降低Aβ清除率，并促进Aβ积累和寡聚体稳定，代表毒性功能获得(Jiang等人，2008；Du等人，2009年；Nielsen等人，2010；Rodriguez等人，2014；Zekonyte等人，2016；Lin等人，2018；Wang等人，2018)。过度磷酸化的tau是在AD疾病后期发现的神经元纤维缠结的主要成分(Hampel等人，2010)。APOE4表达加剧了tau病理学(Shi等人，2017)。与其他亚型相比，APOE4与tau的结合较弱(Strittmatter等人，1994；Fleming等人，1996)，并且APOE4在神经元中的表达可增加tau磷酸化(Wang等人，2018；Brecht等人，2004；Harris等人，2004)。APOE还具有免疫调节功能，并且更大的免疫反应与APOE4等位基因相关(Shi&Holtzman，2018)。最近的研究表明，CNS中的先天免疫激活在AD的神经炎症和随后的神经元丢失和脑萎缩中起关键作用，并且APOE4的存在促进了小胶质细胞的激活(Rodriguez等人，2014；Shi等人，2017；Shi等人，2019)。APOE4与神经元受体的结合亲和力高于APOE2，并刺激多种信号传导通路的激活增强，包含突触形成和淀粉样蛋白前体蛋白(APP)转录增加(Ohkubo等人，2001；Huang等人，2017；Huang等人，2019)。APOE4与受损神经元上的这些受体的结合也可以充当调理素，经由与小胶质细胞表达的APOE结合伴侣“髓系细胞表达触发受体-2”(TREM2)的相互作用来促进小胶质细胞对神经元的吞噬作用，从而导致增强神经元损失和脑萎缩(Atagi等人，2015；Bailey等人，2015；Yeh等人，2016；Jendresen等人，2017)。此外，APOE4会破坏正常的星形胶质细胞和小胶质细胞的稳态功能(Fernandez等人，2019)。在临床上，APOE4与加速认知衰退有关，而APOE2具有保护作用(Shinohara等人，2016；Helkala等人，1996；Staehelin等人，1999；Wilson等人，2002)。因此，APOE4在与AD发展相关的多个过程中发挥着核心作用，并且是干预的主要目标。
人类遗传数据表明APOE4和APOE2等位基因具有半显性遗传(Corder等人，1994；Genin等人，2011)。虽然APOE4纯合个体患AD的风险增加14.5倍，但APOE2/4个体患AD的风险仅增加2.6倍，这表明保护性APOE2等位基因的存在可以部分减轻APOE4等位基因的有害影响。尽管APOE2/4杂合子AD发展的风险显著降低，但仍显著高于具有APOE2/3或APOE2/2基因型的个体(AD发展风险分别降低1.8倍和7.7倍)(Genin等人，2011)。该遗传数据表明，CNS中APOE4水平的降低以及APOE2水平的增加将有利于治疗AD发展风险高的APOE4携带者。
表达APOE4的人类诱导多能干细胞衍生的神经元具有增加的Aβ产生、更高水平的tau磷酸化和更多的变性，这通过基因编辑将APOE4转化为APOE3得以纠正(Lin等人，2018；Wang等人，2018)。我们组和其他组先前的研究表明，在AD41-43的小鼠模型中，通过病毒载体将APOE2递送到CNS既增加了APOE2的表达，又降低了脑Aβ和淀粉样蛋白负荷。递送的APOE2剂量和预先存在的Aβ1-42沉积量是决定治疗效果的重要因素(Zhao等人，2016)。然而，在这些先前的研究中，内源性APOE4仍然存在。
所公开的疗法可以在症状出现之前很久就被递送至APOE4纯合子，以在它们导致AD之前预防或停止疾病过程。
研究先前的研究测试了AAV血清型rh.10和血清型9通过海马内或丘脑内途径将人类APOE2编码序列递送到两个AD鼠模型的CNS。在表达人淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和早老素1(PS1)突变和人APOE4而非鼠APOE43的Aβ淀粉样变性的APP.PS1/TRE4AD鼠模型中，使用AAV9-APOE2载体的丘脑内递送，使人类APOE2在整个大脑中表达到高水平(图21A)。此外，APOE2增强减少了这种AD小鼠中的Aβ和淀粉样蛋白负载(Zhao等人，2016)(图21B)。一种策略是将靶向内源性APOE4的人工微小RNA(miRNA)与人类APOE2基因的cDNA一起编码到AAV表达盒中。
靶序列选择使用多种算法评价APOE4序列的用于小干扰RNA(siRNA)的最佳靶向序列，并进行筛选以最小化脱靶相互作用的可能性。针对U87人星形胶质瘤细胞系中的内源性APOE，在体外测试了所选siRNA的敲低能力(图22)。siRNA序列对APOE4没有特异性，并且会抑制所有APOE亚型的表达。选择最好的siRNA序列以并入人工miRNA盒中以在AAV载体中表达。
基因疗法的效果集中在tau病理学、神经炎症和神经变性。AAV载体递送人类APOE2的持续表达以及靶向内源性APOE4 mRNA的人工miRNA以下调表达(hAPOE2-mirAPOE4)。AAV9有效地转导星形胶质细胞(星形胶质细胞是大脑中APOE的主要生产者)，以及小胶质细胞和神经元，并将用于本研究(Xu等人，2006；Foust等人，2009；Gray等人，2011；Gong等人，2015；Vagner等人，2016；Zhang等人，2014；Zhang等人，2-2014)。这种AAV基因疗法在APOE4纯合子中相对于APOE4提供增强的APOE2表达，减少神经元纤维tau缠结，减少小胶质细胞激活，减少海马和皮质病理学，并改善行为。
AAV构建体沉默内源性APOE4表达并在体外递送APOE2编码序列。已鉴定出有效敲低U87人星形胶质瘤细胞中APOE表达的siRNA序列。这些序列靶向所有等位基因序列共有的APOE片段。选择最有效的siRNA序列并将其并入增强的mir155人工miRNA骨架中以产生mirAPOE4(Fowler等人，2016)(图23A)。由于错配在发夹茎和GC含量中的位置会影响细胞中miRNA的加工(Fowler等人，2016；Fang&Bartel，2015)，因此测试了mirAPOE4的多次重复在体外敲低APOE的能力以确保最有效的设计。将优化的mirAPOE4的两到四个串联拷贝克隆到AAV表达盒启动子中存在的内含子(杂交CMV/鸡β-肌动蛋白；CAG)或转基因(mCherry或hAPOE2-HA)终止密码子和聚腺苷酸化信号之间的插入序列中以确定mirAPOE4在表达盒中的最佳数量和位置(Mueller等人，2012)(图23B)。通过在收获培养基和细胞之前转染U87细胞72小时，在体外测试AAV mirAPOE4表达盒质粒降低APOE表达的能力。通过RT-qPCR评价APOE mRNA的表达，并通过蛋白质印迹和ELISA评价分泌的APOE蛋白。
同时，在人类APOE2 cDNA的编码序列中，在所选mirAPOE4的识别位点进行沉默突变，以确保载体衍生的APOE2表达不会被沉默。载体衍生的人类APOE2具有C末端血凝素(HA)标签以促进检测。在mirAPOE4存在下，载体衍生的hAPOE2-HA的表达通过共转染和分析hAPOE2-HA表达(用抗HA抗体进行蛋白质印迹)来证实。优化的hAPOE2-mirAPOE4盒被包装到AAV9血清型衣壳中。AAV9有效地转导星形胶质细胞(其是大脑中APOE的主要生产者)，以及小胶质细胞和神经元。在进行体内实验之前，在体外证实了AAV9载体表达hAPOE2-HA和mirAPOE4的功能。
APOE2的增强可能与内源性APOE4的减少相关，从而在体内防止tau病理学、神经变 性和神经炎症。在人类APOE4的背景下，AAV9-hAPOE2对CNS的施用增加了整个大脑的APOE水平并降低了Aβ淀粉样变性的APP.PS1/TRE4 AD小鼠模型中的Aβ1-42水平(Zhao等人，2016；Kim等人，2011)(图21)。由于神经元纤维tau缠结和先天免疫反应在AD脑萎缩和认知功能障碍中的重要性，与Aβ负载无关(Arboleda-Velasquez等人，2019；Shi等人，2017；Shi等人，2019；Josephs等人，2008；Mattsson等人，2018)，确定了tau病理学、小胶质细胞激活和神经变性。P301S/E4小鼠过表达含有P301S突变的1N4R人类tau，这与额颞叶痴呆有关，并且人类APOE4取代了小鼠APOE(Shi等人，2017；Yoshiyama等人，2007)。与表达人类APOE3或APOE2的小鼠相比，P301S/E4小鼠具有更高的脑磷酸化tau负荷以及更广泛的神经变性和神经炎症(Shi等人，2017；Shi等人，2019)，但没有显示出淀粉样蛋白斑形成(Shi等人，2017；Yoshiyama等人，2007；Haurigot等人，2013)。P301S 1N4R tau B6/C3小鼠(JacksonLaboratories 008169)和人类APOE4敲入小鼠(TRE4-Taconic 1549:B6.129P2-Apoetm3(APOE*4)Mae N8)可以通过将P301S和TRE4小鼠杂交来重建已发布的模型。C57B1/6小鼠用作野生型对照。
在P301S/E4小鼠中通过脑池内(IC)途径施用后，评估载体介导的表达人类APOE2加miRNA的AAV9-hAPOE2-mirAPOE4的递送对内源性APOE4的影响。IC途径以最小的侵入性施用在整个大脑中提供广泛的载体分布(Haurigot等人，2013；Hinderer等人，2018；Rosenberg等人，2018；Markmann等人，2018)。AAV9-hAPOE2、AAV9-mCherry-mirAPOE4、AAV9-无和无治疗(PBS)用作对照。每月评价小鼠的行为和进行神经系统评估。处死后，在施用后1个月和7个月评价小鼠的载体衍生hAPOE2和内源性APOE4表达、Aβ肽负荷、总可溶性和不溶性tau负荷、过度磷酸化的tau缠结、小胶质细胞激活和脑神经变性(总年龄：分别为3个月和9个月)(表3)
表3.小鼠研究
Figure BDA0003659960450000501
八周老年小鼠，每个治疗队列n＝16只雄性和n＝16只雌性(总共n＝192)。所有小鼠被随机分配到队列组，以避免潜在的研究偏差，所有组的动物都交错给药。笼子在没有治疗限定符的情况下进行编号，以使研究人员对治疗状态不知情。
治疗队列涉及具有人类tau和APOE4基因替换的双突变小鼠系(P301S/E4)。具有相同遗传背景的野生型对照C57B1/6品系用于“无治疗”对照。
测试载体包含：AAV9-hAPOE2、AAV9-hAPOE2-mirAPOE4\AAV9-mCherry-mirAPOE4、AAV9-无或无治疗(PBS)。
经由IC途径将所有载体以1011个基因组拷贝(gc)或PBS(10μl)施用到CSF中。该剂量可扩展至安全递送至人体的剂量(1014gc)(Sharma&McNeill，2009)。
前两周每周进行3次健康检查，然后每周对所有存活的小鼠进行一次健康检查，观察任何异常或改变的行为。作为每周健康检查的一部分，对小鼠进行称重并由对治疗队列不知情的人员进行记录。
在2个时间点(3个月龄和9个月龄，载体施用后1个月和7个月)处死小鼠，处死每个队列的一半(n＝8M/8F)。在尸检期间，首先从小脑延髓池中采集小鼠CSF，然后用冷PBS灌注小鼠，并收集大脑并在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。大脑的一半用于载体DNA、mRNA和蛋白质测定。将剩余的半球固定并以50μM切片进行冠状切片，以用于免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)或病理学。
以每月一次的间隔时间，对小鼠进行行为和神经系统评估。在配备红外光束阵列的开放场室中评价小鼠的自发活动和站立/用后腿直立的能力，以监测和记录小鼠的运动64。其次，在引入新物体后24小时，通过使用新物体识别测试小鼠的认知能力。测试在开放场室内进行，并记录探索新物体的时间量(Webster等人，2013)。AD小鼠在该测试中表现出随着年龄的增长而降低的表现。所有测试都被录像，以检查不知情人员导致的行为改变。
使用对hAPOE4和hAPOE2 HA标签特异的抗体，通过蛋白质印迹/ELISA在来自多个区域的脑组织样品中检测到hAPOE2-HA和hAPOE4蛋白；使用等位基因特异性探针通过RTqPCR检测mRNA(Zhong等人，2016)。
将海马、丘脑和大脑皮层的显微解剖切片均质化，并用RIPA(可溶性Aβ)和5.5M胍(不溶性Aβ)依次提取。Aβ1-42/1-40水平通过ELISA进行量化(Zhao等人，2016)。
通过蛋白质印迹用针对总tau(BT2)和磷酸化tau(CP13)的抗体探测脑裂解物(Sacramento等人，2020)。
脑切片被用于IHC/IF的抗磷酸化tau抗体AT8染色(Shi等人，2017；Sacramento等人，2020)。
通过由IHC对CD68阳性细胞染色来评估脑切片中的小胶质细胞激活(Shi等人，2017)。
多个脑切片(相隔300μM)用0.1％苏丹黑染色以用于脑容量分析。在成像软件中跟踪和测量感兴趣的区域，包含海马、后侧脑室和梨状/内嗅皮质。三个切片用甲酚紫染色以用于CA1锥体细胞层和齿状回颗粒细胞层的神经元层厚度测量，从而观察海马区的变化。使用ImageJ软件在所有位点记录测量结果并取平均值(Shi等人，2017)。
通过评估三个切片中每个切片的阳性染色细胞的百分比，在甲酚紫染色的脑切片中评价AAV9载体本身的神经元毒性。
统计。三个独立实验一式三份进行研究，并且除非另有说明，否则数据将表示为平均值±标准偏差(SD)。使用单因素方差分析(ANOVA)分析组之间的差异以进行多重比较。目标2研究将以每个队列n＝8只小鼠(8M/8F)进行。如果两组的变异系数均为35％，则使用每组n＝8允许组间差异为2.8倍(p<0.05，功效＝0.95)。通过ANOVA分析组之间生化测量结果的差异以进行多重比较。通过双因素重复测量ANOVA和多重比较来分析行为评估。
示例性修饰的APOE2序列：
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTCAAAGCTTATAAGAGCGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:26)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTTAAAGCATATAAGAGTGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:27)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTCAAAGCATATAAGAGTGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:28)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTTAAAGCTTATAAGAGTGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:29)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTTAAAGCATATAAGAGCGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:30)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTCAAAGCTTATAAGAGTGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:31)；
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTCAAAGCATATAAGAGCGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:32)；或
ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAAGAACTTAAAGCTTATAAGAGCGAGCTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCATGCTCGGCCAGAGCACCGAGGAGCTGCGGGTGCGCCTCGCCTCCCACCTGCGCAAGCTGCGTAAGCGGCTCCTCCGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGTGCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGGGCCCGCGAGGGCGCCGAGCGCGGCCTCAGCGCCATCCGCGAGCGCCTGGGGCCCCTGGTGGAACAGGGCCGCGTGCGGGCCGCCACTGTGGGCTCCCTGGCCGGCCAGCCGCTACAGGAGCGGGCCCAGGCCTGGGGCGAGCGGCTGCGCGCGCGGATGGAGGAGATGGGCAGCCGGACCCGCGACCGCCTGGACGAGGTGAAGGAGCAGGTGGCGGAGGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC(SEQ ID NO:33)。
参考文献
2020阿尔茨海默病的事实和数据。《阿尔兹海默病和痴呆(Alzheimers Dement.)》2020。
Abner等人,《阿尔兹海默病杂志(J.Alzheimers Dis.)》,64:1307(2018)。
Acosta-Baena等人,《柳叶刀(Lancet.)》《神经学(Neural.)》,10:213(2011)。
Allen等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,22:9340(2002)。
Arboleda-Velasquez等人,《自然医学(Nat.Med.)》,25:1680(2019)。
阿尔茨海默病协会2019阿尔茨海默病的事实和数据。《阿尔兹海默病和痴呆(Alzheimer's&Dementia.)》2019；15:321-387。
Atagi等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,290:26043(2015)。
Bailey等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,290:26033(2015)。
Bales等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,29:6771(2009)。
Bales等人,《自然遗传学(Nat.Genet.)》,17:263(1997)。
Benjamin等人,《衰老心理性(Psychol.Aging)》,19:592(2004)。
Brecht等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,24:2527(2004)。
Bu,《自然神经科学评论(Nat.Rev.Neurosci.)》,10:333(2009)。
Campion等人,《美国人类遗传学杂志(Am.J.Hum.Genet.)》,65:664(1999)。
Carmona等人,《临床神经病学手册(Handb.Clin.Neural.)》,148:395(2018)。
Castellano等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》,3:89ra57(2011)。
Chai等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,286:34457(2011)。
Chiang等人,《美国神经放射学会杂志(AJNR Am.J.Neuroradiol.)》,33:1392(2012)。
Chiang等人,《神经学(Neurology)》,75:1976(2010)。
Collaborators GBDD,《柳叶刀神经学(Lancet Neural.)》,18:88(2019)。
Conejero-Goldberg等人,《分子精神病学(Mol.Psychiatry.)》,19:1243(2014)。
Conrado等人,《临床药理学疗法(Clin.Pharmacol.Ther.)》,107:796(2020)。
Coon等人,《临床精神病学杂志(J.Clin.Psychiatry)》,68:613(2007)。
Corder等人,《自然遗传学(Nat.Genet.)》,7:180(1994)。
Corder等人,《科学(Science)》,261:921(1993)。
Dai等人,《肿瘤靶标(Oncotarget.)》,9:15132(2018)。
Deane等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,118:4002(2008)。
DeTure&Dickson,《分子神经变性(Mol.Neurodegener.)》,14:32(2019)。
Dodart等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,102:1211(2005)。
Dong等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,269:22358(1994)。
Dorey等人,《神经科学通报(Neurosci.Bull.)》,30:317(2014)。
Du等人,《神经科学通讯(Neurosci.Lett.)》,464:140(2009)。
APOE2纯合子中阿尔茨海默病痴呆的可能性极低[网络]。2019。
Fagan等人,《神经生物学疾病(Neurobiol.Dis.)》,9:305(2002)。
Fang和Bartel,《分子细胞(Mol.Cell.)》,60:131(2015)。
Fann等人,《柳叶刀精神病学(Lancet.Psychiatry.)》,5:424(2018)。
Farrer等人,《美国医学会杂志(JAMA)》,278:1349(1997)。
Fernandez等人,《衰老神经科学前沿(Front Aging Neurosci.)》,11:14(2019)。
Fernandez等人,《神经科学(Neurosci.)》,11:14(2019)。
Fleming等人,《神经学实验(Exp.Neurol.)》,138:252(1996)。
Flowers&Rebeck,《神经生物学疾病(Neurobiol.Dis.)》,136:104724(2020)。
Foust等人,《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》,27:59(2009)。
Fowler等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,44:e48(2016)。
Franklin K,Paxinos G.Paxinos和Franklin，《立体坐标中的小鼠大脑(MouseBrain in Stereotaxic Coordinates)》,Compact Academic Press；2019。
Gale等人,《过敏与临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)》,134:127(2014)。
Games等人,《自然(Nature)》,373:523(1995)。
Gatz等人,《自然神经科学评论(Nat.Rev.Neurosci.)》,19:583(2018)。
Genin等人,《分子精神病学(Mol.Psychiatry.)》,16:903(2011)。
Gong等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》,23:824(2015)。
Gray等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》,19:1058(2011)。
Hampel等人,《老年学实验(Exp.Gerontol.)》,45:30(2010)。
Harris等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,279:44795(2004)。
Hashimoto等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,32:15181(2012)。
Hatters等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,361:932(2006b)。
Hatters等人,《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》,31:445(2006a)。
Haurigot等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,123:3254(2013)。
Hebert等人,《神经学(Neurology)》,80:1778(2013)。
Heffernan等人,《分子神经科学杂志(J.Mol.Neurosci.)》,60:316(2016)。
Helkala等人,《神经科学通讯(Neurosci.Lett.)》,204:177(1996)。
Hinderer等人,《人类基因疗法(Hum.Gene.Ther.)》,29:15(2018)。
Holtzman等人,《冷泉港医学观点(Cold Spring Harb.Perspect Med.)》,2:a006312(2012)。
Holtzman等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,97:2892(2000)。
Hu等人,《分子神经变性(Mol.Neurodegener.)》,10:6(2015)。
Huang等人,《细胞(Cell.)》,168:427(2017)。
Huang等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,39:7408(2019)。
Hudry等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》,5:212ra161(2013)。
Jankowsky等人,《英国生物分子(Biomol.Eng.)》,17:157(2001)。
Jendresen等人,《神经炎症杂志(J.Neuroinflammation.)》,14:59(2017)。
Jiang等人,《神经学(Neuron.)》,58:681(2008)。
Josephs等人,《神经病学年鉴(Ann.Neurol.)》,63:204(2008)。
Kim等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,31:18007(2011)。
Li等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,287:44593(2012)。
Liao等人,《脂质学的当前观点(Curr.Opin.Lipidol.)》,28:60(2017)。
Lin等人,《神经学(Neuron.)》,98:1141(2018)。
Liu等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,36:12425(2016)。
Liu等人,《自然神经学评论(Nat.Rev.Neural.)》,9:106(2013)。
Liu等人,《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》,8:332ra344(2016)。
Lopera等人,《美国医学会杂志(JAMA)》,277:793(1997)。
Mahley等人,《纽约科学院年报(Ann.NY Acad.Sci.)》,777:139(1996)。
Mahley等人,《脂质研究杂志(J.Lipid.Res.)》,40:1933(1999)。
Mahley,《动脉硬化、血栓与血管生物(Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.)》,36:1305(2016)。
Manelli等人,《分子神经科学杂志(J.Mol.Neurosci.)》,23:235(2004)。
Markmann等人,《神经学实验(Exp.Neurol.)》,306:22(2018)。
Mattsson等人,《阿尔兹海默病研究和治疗(Alzheimers Res.Ther.)》,10:77(2018)。
Mondadori等人,《大脑皮层(Cereb.Cortex.)》,17:1934(2007)。
Mueller等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》,20:590(2012)。
Nagy等人,《神经科学(Neuroscience)》,69:757(1995)。
Naj等人,《自然遗传学(Nat.Genet.)》,43:436(2011)。
Nielsen等人,《神经胶质(Glia.)》,58:1235(2010)。
O'Callaghan等人,《组织化学与细胞化学杂志(J.Histochem.Cytochem.)》,66:305(2018)。
Ohkubo等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,276:3046(2001)。
Phillips,《(国际生物化学与分子生物学联合会IUBMB Life)》,66:616(2014)。
Pitas等人,《生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta.)》,917:148(1987)。
Prince等人,《阿尔兹海默病和痴呆(Alzheimers Dement.)》,9:63(2013)。
Puglielli等人,《自然神经科学(Nat.Neurosci.)》,6:345(2003)。
Raber等人,《衰老神经生物学(Neurobiol.Aging)》,25:641(2004)。
Raman等人,《BMC基因组学(BMC Genomics)》,10:493(2009)。
Rauch等人,《科学报告(Sci.Rep.)》,8:6382(2018)。
Rebeck等人,《阿尔兹海默病杂志(J.Alzheimers Dis.)》,4:145(2002)。
Reiman等人,《自然通讯(Nat.Commun.)》,11:667(2020)。
Reiman等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,106:6820(2009)。
Rodriguez等人,《神经炎症杂志(J.Neuroinflammation.)》,11:111(2014)。
Rosenberg等人,《人类基因疗法临床开发(Hum.Gene Ther.Clin.Dev.)》,25:164(2014)。
Rosenberg等人,《人类基因疗法临床开发(Hum.Gene.Ther.Clin.Dev.)》,29:24(2018)。
Ryan等人,《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》,9:e88051(2014)。
Sacramento等人,《人类基因疗法(Hum.Gene.Ther.)》,31:57(2020)。
Safieh等人,《BMC医学(BMC Med.)》,17:64(2019)。
Sando等人,《BMC神经学(BMC Neurol.)》,8:9(2008)。
Schenk等人,《自然(Nature)》,400:173(1999)。
Schmechel等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,90:9649(1993)。
Sharma&McNeill,《英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)》,157:907(2009)。
Shi&Holtzman,《自然免疫学评论(Nat.Rev.Immunol.)》,18:759(2018)。
Shi等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,216:2546(2019)。
Shi等人,《自然(Nature.)》,549:523(2017)。
Shinohara等人,《神经病学年鉴(Ann.Neurol.)》,79:758(2016)。
Snow等人,《美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)》,133:456(1988)。
Sondhi等人,《人类基因治疗方法(Hum.Gene Ther.Methods)》,23:324(2012)。
Sondhi等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》,15:481(2007)。
Staehelin等人,《斯堪的纳维亚神经学学报(Acta.Neurol.Scand.)》,100:53(1999)。
Strittmatter等人,《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,91:11183(1994)。
Sullivan等人,《中风和脑血管疾病杂志(J.Stroke Cerebrovasc.Dis.)》,17:303(2008)。
Tardieu等人,《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》,25:506(2014)。
Tatem等人,《可视化实验杂志(J.Visualized Exp.)》,JoVE.___:51785(2014)。
肿瘤分析最佳实践工作组，表达概况——临床试验中数据生成和解释的最佳实践,《自然遗传学评论(Nat.Rev.Genet.)》,5:229(2004)。
Tzioras等人,《神经病理学和应用神经生物学(Neuropathol.Appl.Neurobiol.)》,45:327(2019)。
Vagner等人,《分子细胞神经科学(Mol.Cell.Neurosci.)》,77:76(2016)。
Vitek等人,《衰老神经生物学(Neurobiol.Aging)》,30:1350(2009)。
Walker等人,《神经病理学学报(Acta.Neuropathol.)》,100:36(2000)。
Wang等人,《自然医学(Nat.Med.)》,24:647(2018)。
Ward等人,《神经流行病学(Neuroepidemiology)》,38:1(2012)。
Webster等人,《阿尔茨海默病研究与治疗(Alzheimer's research&therapy)》,5:28(2013)。
Wildsmith等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》,395:116(2009)。
Williams等人,《分子神经变性(Mol.Neurodegener.)》,15:8(2020)。
Wilson等人,《神经病、神经外科和精神病学杂志(J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry.)》,73:672(2002)。
Wolters等人,《公共科学图书馆期刊(PLoS One.)》,14:e0219668(2019)。
世界卫生组织。痴呆现状的流行病学和影响以及未来趋势。2015https://www.who.int/mental_health/neurology/dementia/dementia_thematicbrief_epidemiology.pdf[最后于6/3/20访问]
Xu等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,26:4985(2006)。
Yeh等人,《神经学(Neuron.)》,91:328(2016)。
Yoshiyama等人,《神经学(Neuron.)》,53:337(2007)。
Yu等人,《神经科学年评(Annu.Rev.Neurosci.)》,37:79(2014)。
Zannis&Breslow,《生物化学(Biochemistry)》,20:1033(1981)。
Zekonyte等人,《生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta.)》,1862:1047(2016)。
Zerah等人,《人类基因疗法临床开发(Hum.Gene Ther.Clin.Dev.)》,26:113(2015)。
Zhang等人,《基因检测和分子生物标志物(Genet.Test Mol.Biomarkers.)》,17:47(2013)。
Zhang等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,34:11929(2014)。
Zhang等人,《神经学(Neuron.)》,89:37(2016)。
Zhao等人,《英文应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.)》,(2019)。
Zhao等人,《神经科学杂志(J.Neurosci.)》,29:3603(2009)。
Zhao等人,《衰老神经生物学(Neurobiol.Aging)》,44:159(2016)。
Zhong等人,《分子神经退化(Mol.Neurodegener.)》,11:2(2016)。
所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。尽管在前述说明书中已经结合其某些优选实施例描述了本发明，并且出于说明的目的已经阐述了许多细节，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明容易受到另外的实施例的影响，并且本文描述的某些细节可以在不偏离本发明的基本原理的情况下发生显著变化。

Claims (48)

1.一种包括表达盒的基因疗法载体，所述表达盒编码在第112位、第136位或第158位中的至少一个处具有除精氨酸以外的残基的哺乳动物载脂蛋白E，而不是具有R112、R136和R158的哺乳动物载脂蛋白E或具有C112、R136和C158的哺乳动物载脂蛋白E，或编码与APOE4结合或破坏APOE与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的抗体。
2.根据权利要求1所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E是人载脂蛋白E。
3.根据权利要求1或2所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中除精氨酸以外的残基是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸或谷氨酰胺。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第112位具有半胱氨酸。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第136位具有精氨酸或丝氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第158位具有精氨酸或半胱氨酸。
7.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第112位、第136位或第158位中的两个具有精氨酸。
8.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第112位不具有精氨酸。
9.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第136位不具有精氨酸。
10.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述载脂蛋白E中的第158位不具有精氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的基因疗法载体，其是病毒基因疗法载体，
12.根据权利要求11所述的基因疗法载体，其是腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒载体。
13.根据权利要求12所述的基因疗法载体，其中所述病毒基因疗法载体是rAAV载体。
14.根据权利要求13所述的基因疗法载体，其中AAV载体是假型化的。
15.根据权利要求14所述的基因疗法载体，其中所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8、AAV9、AAV5、AAVhu.37、AAVhu.20、AAVhu.43、AAVhu.8、AAVhu.2或AAV7衣壳假型化。
16.根据权利要求15所述的基因疗法载体，其中所述AAV载体用AAVrh.10、AAV8或AAV5假型化。
17.根据权利要求13至16中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述AAV载体是AAV2、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh.10。
18.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的基因疗法载体，其进一步包括具有对应于APOE4的RNAi序列的核苷酸序列以用于抑制APOE4 mRNA。
19.根据权利要求18所述的基因疗法载体，其中所述核苷酸序列与第二启动子连接。
20.根据权利要求19所述的基因疗法载体，其中所述第二启动子是PolIII启动子。
21.根据权利要求18至20中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述RNAi包括miRNA，所述miRNA包含多个miRNA序列。
22.根据权利要求18至21中任一权利要求所述的基因疗法载体，其中所述RNAi包括siRNA，所述siRNA包含多个siRNA序列。
23.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到22中任一权利要求所述的基因疗法载体。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述载体是病毒载体。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述载体是rAAV载体。
26.根据权利要求24或25所述的药物组合物，其中所述载体的量为约1×1011至约1×1016个基因组拷贝。
27.一种预防、抑制或治疗哺乳动物阿尔茨海默病的方法，其包括：向所述哺乳动物施用有效量的包括根据权利要求1至22中任一权利要求所述的基因治疗载体的组合物。
28.一种预防或抑制哺乳动物认知衰退的方法，其包括：向所述哺乳动物施用有效量的包括根据权利要求1至22中任一权利要求所述的基因治疗载体的组合物。
29.一种预防、抑制或治疗哺乳动物的与APOE4表达相关的疾病的方法，其包括：向所述哺乳动物施用有效量的包括根据权利要求1至22中任一权利要求所述的基因治疗载体的组合物。
30.一种预防、抑制或治疗哺乳动物脂质病症的方法，其包括：向所述哺乳动物施用有效量的包括根据权利要求1至22中任一权利要求所述的基因治疗载体的组合物。
31.根据权利要求27、28、29或30所述的方法，其中所述哺乳动物是E2/E4杂合子、E4/E4纯合子或E3/E4杂合子。
32.根据权利要求27至31中任一权利要求所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
33.根据权利要求27至31中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物是全身施用的。
34.根据权利要求27至32中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物是注射的。
35.根据权利要求27至32或34中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物施用于中枢神经系统。
36.根据权利要求27至32或34中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物施用于脑。
37.根据权利要求27至36中任一权利要求所述的方法，其中采用导管来施用所述组合物。
38.根据权利要求27至37中任一权利要求所述的方法，其中所述组合物是持续释放组合物。
39.根据权利要求27至38中任一权利要求所述的方法，其中所述载体编码具有C112、S136和R158或具有C112、S136和C158的载脂蛋白E。
40.根据权利要求27至38中任一权利要求所述的方法，其中所述载体包括具有对应于APOE4的RNAi序列的核苷酸序列，以用于抑制APOE4 mRNA。
41.根据权利要求27至38中任一权利要求所述的方法，其中进一步向所述哺乳动物施用第二组合物，所述第二组合物包括具有对应于APOE4的RNAi序列的核苷酸序列，以用于抑制APOE4 mRNA。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第二组合物包括脂质体。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述第二组合物包括纳米颗粒。
44.根据权利要求27至38中任一权利要求所述的方法，其中进一步向所述哺乳动物施用第二组合物，所述第二组合物包括抗乙酰肝素抗体或结合APOE4或破坏APOE与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合的抗体，或编码所述抗体的核苷酸序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中病毒载体包括编码所述抗体的所述核苷酸序列。
46.根据权利要求41至45中任一权利要求所述的方法，其中所述第二组合物是全身施用的。
47.根据权利要求41至45中任一权利要求所述的方法，其中所述第二组合物是局部施用的。
48.根据权利要求27至47中任一权利要求所述的方法，其中载体是AAV载体。
CN202080081724.7A 2019-11-25 2020-11-25 Apoe基因疗法 Pending CN114829390A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962939999P 2019-11-25 2019-11-25
US62/939,999 2019-11-25
PCT/US2020/070822 WO2021108809A1 (en) 2019-11-25 2020-11-25 Apoe gene therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114829390A true CN114829390A (zh) 2022-07-29

Family

ID=73857283

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080081724.7A Pending CN114829390A (zh) 2019-11-25 2020-11-25 Apoe基因疗法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230044351A1 (zh)
EP (1) EP4065600A1 (zh)
JP (1) JP2023502515A (zh)
KR (1) KR20220107243A (zh)
CN (1) CN114829390A (zh)
AU (1) AU2020391518A1 (zh)
BR (1) BR112022010065A2 (zh)
CA (1) CA3162761A1 (zh)
IL (1) IL293116A (zh)
MX (1) MX2022006364A (zh)
WO (1) WO2021108809A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023198702A1 (en) * 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of c9orf72
WO2023198745A1 (en) * 2022-04-12 2023-10-19 Uniqure Biopharma B.V. Nucleic acid regulation of apoe
WO2024011237A1 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Cornell University Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and the prevention of alzheimers disease

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4863457A (en) 1986-11-24 1989-09-05 Lee David A Drug delivery device
US5378475A (en) 1991-02-21 1995-01-03 University Of Kentucky Research Foundation Sustained release drug delivery devices
AU4198793A (en) 1992-07-24 1994-01-27 Takeda Chemical Industries Ltd. Microparticle preparation and production thereof
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
EP0688429B1 (en) 1993-03-09 1998-02-11 Epic Therapeutics, Inc.. Macromolecular microparticles and methods of production
US5603960A (en) 1993-05-25 1997-02-18 O'hagan; Derek T. Preparation of microparticles and method of immunization
US6913767B1 (en) 1993-10-25 2005-07-05 Genentech, Inc. Compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines
US5443505A (en) 1993-11-15 1995-08-22 Oculex Pharmaceuticals, Inc. Biocompatible ocular implants
EP0930874A2 (en) 1996-10-09 1999-07-28 Takeda Chemical Industries, Ltd. A method for producing a microparticle
US6210707B1 (en) 1996-11-12 2001-04-03 The Regents Of The University Of California Methods of forming protein-linked lipidic microparticles, and compositions thereof
US6884435B1 (en) 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
GB9810236D0 (en) 1998-05-13 1998-07-08 Microbiological Res Authority Improvements relating to encapsulation of bioactive agents
US6406719B1 (en) 1998-05-13 2002-06-18 Microbiological Research Authority Encapsulation of bioactive agents
US6264987B1 (en) 2000-05-19 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Method for preparing microparticles having a selected polymer molecular weight
US20070081972A1 (en) 2005-09-30 2007-04-12 The University Of Iowa Research Foundation Polymer-based delivery system for immunotherapy of cancer
WO2012054425A2 (en) 2010-10-18 2012-04-26 University Of Iowa Research Foundation Biodegradable particulate formulations
CA2825791A1 (en) 2011-02-07 2012-08-16 Neotope Biosciences Limited Apoe immunotherapy
US9345776B2 (en) 2011-02-24 2016-05-24 The University Of Iowa Research Foundation Biodegradable polymers with sulfenamide bonds for drug delivery applications
KR20200044793A (ko) * 2017-08-03 2020-04-29 보이저 테라퓨틱스, 인크. Aav의 전달을 위한 조성물 및 방법
CA3141988A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 The General Hospital Corporation Apoe antibodies, fusion proteins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220107243A (ko) 2022-08-02
WO2021108809A1 (en) 2021-06-03
AU2020391518A1 (en) 2022-07-14
US20230044351A1 (en) 2023-02-09
CA3162761A1 (en) 2021-06-03
JP2023502515A (ja) 2023-01-24
BR112022010065A2 (pt) 2022-09-06
MX2022006364A (es) 2022-06-22
EP4065600A1 (en) 2022-10-05
IL293116A (en) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7221275B2 (ja) Ａａｖを送達するための組成物および方法
US11752181B2 (en) Compositions and methods of treating Huntington&#39;s disease
US11819478B2 (en) Selective gene therapy expression system
JP6453307B2 (ja) デュアルａａｖベクターによる大型遺伝子の効果的送達
US11903985B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US20230044351A1 (en) Apoe gene therapy
JP2021502058A (ja) Ｒｎａを編集するための組成物および方法
US20200332265A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
CN114761569A (zh) 阿尔茨海默氏病的基因疗法
US20100266551A1 (en) Adeno-associated viral vectors for the expression of dysferlin
US20230227802A1 (en) Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency
US20230310654A1 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
WO2024050560A1 (en) Compositions and methods for treating neurodegeneration
US20230414787A1 (en) Gene knock-out for treatment of glaucoma
US20240131093A1 (en) Compositions and methods of treating huntington&#39;s disease
JP2022531177A (ja) 神経変性障害を治療するための方法
Bosch Merino Intrathecal administration of AAVrh10 coding for β‐glucuronidase corrects biochemical and histological hallmarks of mucopolysaccharidosis type VII mice and improves behavior and survival

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40073495

Country of ref document: HK