JP2023534999A - 操作された筋肉標的化組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載するのは、筋特異的標的化部分及び該筋特異的標的化モチーフを含む組成物である。同様に本明細書に記載するのは、該筋特異的標的化モチーフ及び該筋特異的標的化部分を含む組成物の使用である。いくつかの実施形態では、該筋特異的標的化部分及び該筋特異的標的化部分を含む組成物は、筋細胞にカーゴを直接送達するために使用され得る。【選択図】図１１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月２２日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」というタイトルの米国仮特許出願第６３／０５５，２６５号、２０２０年１０月２９日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」というタイトルの米国仮特許出願第６３／１０７，３９４号、及び２０２１年５月２日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」というタイトルの米国仮特許出願第６３／１８３，０３８号の利益及び優先権を主張するものであり、これら仮出願の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２１年７月１３日に作成され、１８６，０９７バイト（ディスク上１８８ＫＢ）のサイズを有するＢＲＯＤ－５２１５ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔというタイトルのＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表を含む。該配列表の内容は、全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示する主題は一般に、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びその系を含む筋肉標的化組成物、組成物、ならびにその使用に関する。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子治療及び遺伝子編集に最も一般的に使用される送達媒体である。それにもかかわらず、天然のカプシドバリアントを含むｒＡＡＶは、細胞指向性が限られている。実際には、今日使用されているｒＡＡＶは、全身送達後に主に肝臓に感染する。さらに、天然のカプシドバリアントを含むこれらの従来のｒＡＡＶによる他の細胞型、組織、及び器官における従来のｒＡＡＶの形質導入効率は限られている。そのため、肝臓以外の細胞、組織、及び器官（例えば、神経系、骨格筋、及び心筋）に影響を及ぼす疾患のためのＡＡＶ媒介ポリヌクレオチド送達は通常、多量のウイルス（通常は約１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ）の注射を必要とし、これはしばしば肝臓毒性をもたらす。さらに、従来のｒＡＡＶを使用する場合に多量が必要であるため、成人患者に投薬するために必要とされる十分な量の治療用ｒＡＡＶを製造することは極めて困難である。また、遺伝子発現及び生理学における相違により、マウス及び霊長類モデルでは、ウイルスのカプシドに対する反応が異なる。異なるウイルス粒子の形質導入効率は、種間で異なり、結果として、マウスにおける前臨床研究はしばしば、ヒトを含めた霊長類における結果を正確に反映しない。このように、様々な遺伝子疾患の治療において使用するための改善されたｒＡＡＶに対する必要性が存在する。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載するのは、筋肉細胞を標的とするのに有効な標的化部分を含む組成物であり、該標的化部分は、１つ以上のｎ量体モチーフを含み、該１つ以上のｎ量体モチーフのうちの少なくとも１つのｎ量体モチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎを含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘｍ及びＸｎは、各々独立して、任意のアミノ酸から選択され、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり、ｍは、１～４であり、該組成物は任意にカーゴを含み、該カーゴは、該標的化部分に連結されているか、または他の方法で関連している。
ある特定の例示的な実施形態では、該少なくとも１つのｎ量体モチーフは、表２、表３、図１４のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせに示すものである。
ある特定の例示的な実施形態では、該標的化部分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはその組み合わせを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該標的化部分は、ウイルスタンパク質を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ｎ量体モチーフは、該ｎ量体モチーフが、ウイルスのカプシドの外側であるように、該ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸の間に配置される。
ある特定の例示的な実施形態では、該ｎ量体モチーフは、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４、もしくはそれらの任意の組み合わせの間の、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続したアミノ酸の間に挿入される。
ある特定の例示的な実施形態では、該ｎ量体モチーフは、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるアミノ酸５８８と５８９の間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入される。
ある特定の例示的な実施形態では、該組成物は、操作されたウイルス粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該操作されたウイルス粒子は、操作されたＡＡＶウイルス粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である
ある特定の例示的な実施形態では、該ｎ量体モチーフは、３～１５アミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該任意のカーゴは、筋肉の疾患または障害を治療または予防することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋肉の疾患または障害は、
（ａ）自己免疫疾患、
（ｂ）がん、
（ｃ）筋ジストロフィー、
（ｄ）神経筋疾患、
（ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症、
（ｆ）伸長リピート病、
（ｇ）ドミナントネガティブ疾患、
（ｈ）心筋症、
（ｉ）ウイルス性疾患、
（ｊ）早老性疾患、または
（ｋ）それらの任意の組み合わせ
である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、もしくはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を含むリボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、もしくは他の遺伝子組み換えもしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
ある特定の例示的な実施形態では、該組成物は、増加した筋細胞能力、筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
本明細書においてある特定の例示的な実施形態に記載するのは、以下を含むベクターを含むベクター系である：筋細胞を標的とするのに有効な１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ここで、各標的化部分は、１つ以上のｎ量体モチーフを含み、該１つ以上のｎ量体モチーフのうちの少なくとも１つのｎ量体モチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎを含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘｍ及びＸｎは、各々独立して、任意のアミノ酸から選択され、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり、ｍは、１～４であり、該１つ以上のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、該少なくとも１つのｎ量体モチーフを少なくともコードするもの、及び任意に、１つ以上の該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御要素。
ある特定の例示的な実施形態では、少なくとも１つのｎ量体モチーフは、表２、表３、図１４Ｆのいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせに示すものである。
ある特定の例示的な実施形態では、該ベクター系は、さらにカーゴを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、カーゴポリヌクレオチドであり、任意に、該標的化部分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの１つ以上に連結される。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、該標的化部分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターに存在する。
ある特定の例示的な実施形態では、該ベクター系は、存在する場合に該カーゴを含むウイルス粒子を産生することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ベクター系は、１つ以上の該標的化部分を含むカプシドポリペプチドを産生することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ベクター系は、ＡＡＶウイルス粒子を産生することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶウイルス粒子は、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カプシドポリペプチドは、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである。
該ベクター系のある特定の例示的な実施形態では、１つのｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、該ｎ量体モチーフ（複数可）が該ウイルスのカプシドの外側となるように該ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸に対応する２つのコドン間に挿入される。
ある特定の例示的な実施形態では、１つ以上のｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４、もしくはそれらの任意の組み合わせの間の、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続したアミノ酸に対応する２つのコドンの間に挿入される。
ある特定の例示的な実施形態では、１つ以上のｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドは、ＡＡＶ９のカプシドポリヌクレオチドにおけるアミノ酸５８８と５８９に対応するコドンの間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入される。
ある特定の例示的な実施形態では、１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターは、スプライス制御要素を含まない。
ある特定の例示的な実施形態では、該ベクター系はさらに、ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターにある。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスｒｅｐタンパク質は、制御要素に作動可能に連結される。
本明細書においてある特定の例示的な実施形態に記載するのは、先行する段落のいずれかまたは本明細書の他の箇所に記載のベクター系によってコードされる及び／または産生されるポリヌクレオチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、該ポリペプチドは、ウイルスポリペプチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルスポリペプチドは、ＡＡＶポリペプチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載するのは、先行する段落のいずれかに記載のまたは本明細書の他の箇所に記載のベクター系によって産生される及び／またはポリペプチドを含む粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該粒子は、ウイルス粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、レンチウイルス粒子、またはレトロウイルス粒子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ウイルス粒子は、筋特異的指向性を有する。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、筋肉の疾患または障害を治療または予防することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋肉の疾患または障害は、
ａ．自己免疫疾患、
ｂ．がん、
ｃ．筋ジストロフィー、
ｄ．神経筋疾患、
ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症、
ｆ．伸長リピート病、
ｇ．ドミナントネガティブ疾患、
ｈ．心筋症、
ｉ．ウイルス性疾患、
ｊ．早老性疾患、または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、もしくはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を含むリボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、もしくは他の遺伝子組み換えもしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
ある特定の例示的な実施形態では、該カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ポリペプチド、粒子、またはその両方は、増加した筋細胞能力、筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載するのは、以下を含む細胞である：
ａ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の組成物、
ｂ．先行する段落のもしくは本明細書の他の箇所に記載のベクター系、
ｃ．先行する段落のもしくは本明細書の他の箇所に記載のポリペプチド、
ｄ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の粒子、または
ｅ．それらの組み合わせ。
ある特定の例示的な実施形態では、該細胞は、原核細胞である。
ある特定の例示的な実施形態では、該細胞は、真核細胞である。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載するのは、以下を含む医薬製剤である：
ａ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の組成物、
ｂ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載のベクター系、
ｃ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載のポリペプチド、
ｄ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の粒子、
ｅ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の細胞、または
ｆ．それらの組み合わせ、及び
医薬的に許容される担体。
ある特定の例示的な実施形態では、本明細書に記載するのは、
ａ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の組成物、
ｂ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載のベクター系、
ｃ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載のポリペプチド、
ｄ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の粒子、
ｅ．先行する段落のいずれかもしくは本明細書の他の箇所に記載の細胞、
ｆ．先行する段落のもしくは本明細書の他の箇所に記載の医薬製剤、または
ｇ．それらの組み合わせ
を、それを必要とする対象に対して投与することを含む方法である。
ある特定の例示的な実施形態では、該対象は、筋肉の疾患または障害を有する。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋肉の疾患または障害は、
ａ．自己免疫疾患、
ｂ．がん、
ｃ．筋ジストロフィー、
ｄ．神経筋疾患、
ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症、
ｆ．伸長リピート病、
ｇ．ドミナントネガティブ疾患、
ｈ．心筋症、
ｉ．ウイルス性疾患、
ｊ．早老性疾患、または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
ある特定の例示的な実施形態では、該伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
ある特定の例示的な実施形態では、該筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である。
ある特定の例示的な実施形態では、該神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
ある特定の例示的な実施形態では、該組成物は、非筋細胞に対する標的化または特異性が低減または排除されている。ある特定の例示的な実施形態では、該非筋細胞は、肝臓細胞である。
該例示的な実施形態のこれら及び他の実施形態、目的、特徴、及び利点は、以下で説明される例示的な実施形態の詳細な説明の検討に基づいて、当業者には明らかになるであろう。
本発明の特徴及び利点の理解は、本発明の原理が利用され得る例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
導入遺伝子からのｍＲＮＡの生成をもたらす、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入メカニズムを示している。 ＡＡＶバリアントのｍＲＮＡベースの選択は、ＤＮＡベースの選択よりもストリンジェントであり得る。このウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 Ａ～Ｂ－肝臓におけるウイルスライブラリとベクターゲノムＤＮＡ（Ａ）及びｍＲＮＡ（Ｂ）との間の相関関係。 Ａ～Ｆ－異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアント。この実験では、このウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 細胞型特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞型特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 細胞型特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞型特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 細胞型特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞型特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 種にわたる組織特異的遺伝子送達のためのカプシドバリアントを産生及び選択する方法の実施形態を示す概略図。 ＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にランダムｎ量体（ｎ＝３～１５アミノ酸）の野生型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９への挿入を示す概略図。 ＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にバリアントＡＡＶ粒子産生を示す概略図。各カプシドバリアントは、それ自体のコーディング配列をベクターゲノムとして封入する。 ＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成するためにＡＡＶベクター系において使用され得る代表的なＡＡＶのカプシドプラスミドライブラリベクター（例えば、図８参照）の例示的なベクターマップ。 異なる構成的及び細胞型特異的哺乳類プロモーターを含む構築物によってもたらされたウイルス力価（ＡＡＶ９ベクターゲノム／１５ｃｍディッシュとして計算される）。 さらに最適化されたｍｙｏＡＡＶのカプシドバリアント（本明細書では改良されたＭｙｏＡＡＶのカプシドバリアントとも呼ばれる）の選択の概略図。 改良されたＭｙｏＡＡＶ（ｅＭｙｏＡＡＶ）のカプシドバリアントは、全身送達後、第一世代のＭｙｏＡＡＶと比較して、より効率的にマウスの筋肉に形質導入され得る。 第一及び第二世代のｍｙｏＡＡＶのカプシドバリアントは、ヒト一次筋管の形質導入に関して、ａＶｂ６インテグリンヘテロダイマーに依存する（配列番号２～１２）。 Ａ)ＤＥＬＩＶＥＲは、ＲＧＤモチーフを含む筋指向性ＡＡＶのカプシドバリアントのクラスを特定する。Ａ)ＤＥＬＩＶＥＲを使用するウイルスライブラリの産生及びカプシドバリアントの選択の概略図（配列番号１３）。 ＤＥＬＩＶＥＲは、ＲＧＤモチーフを含む筋指向性ＡＡＶのカプシドバリアントのクラスを同定する。Ｂ）ＣＭＶ、ＣＫ８、またはＭＨＣＫ７プロモーターの制御下でＡＡＶ９のカプシドのコーディング配列を発現するＩＴＲ含有構築物を使用して生じるｒＡＡＶの力価の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。Ｐ値は、テューキーの多重比較検定（ＭＣＴ）を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって計算した。Ｃ）全身注射後、マウスの骨格筋において、ＣＭＶ、ＣＫ８、またはＭＨＣＫ７プロモーターの制御下で発現したＡＡＶ９のカプシドライブラリｍＲＮＡのインビボ発現。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、テューキーのＭＣＴを用いた一元配置分散分析によって計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。Ｄ）全身注射後、マウスの心臓において、ＣＭＶ、ＣＫ８、またはＭＨＣＫ７プロモーターの制御下で発現したＡＡＶ９のカプシドライブラリｍＲＮＡのインビボ発現。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、テューキーのＭＣＴを用いた一元配置分散分析によって計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１。Ｅ）異なるマウス骨格筋におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するＭＨＣＫ７プロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。 ＤＥＬＩＶＥＲは、ＲＧＤモチーフを含む筋指向性ＡＡＶのカプシドバリアントのクラスを同定する。Ｆ）第二回の転写物ベースの選択後にマウス筋において最上位の高度に発現したカプシドバリアントにおける７量体挿入の配列。各群において同色のバリアントは、同義ＤＮＡコドン（配列番号８～１２、１４～１８）によってコードされる。図２１Ａ～２１Ｉも参照されたい。 ＭｙｏＡＡＶは、全身注射後、高効率でマウスの骨格筋を形質導入する。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の骨格筋、心臓及び肝臓の全載蛍光画像。緑：ＥＧＦＰ、赤：筋肉用ラミニン、肝臓用レクチン、青、Ｈｏｅｃｈｓｔ、断面のスケールバー：１００μｍ。 ＭｙｏＡＡＶは、全身注射後、高効率でマウスの骨格筋を形質導入する。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来の骨格筋、心臓及び肝臓の断面画像。緑：ＥＧＦＰ、赤：筋肉用ラミニン、肝臓用レクチン、青、Ｈｏｅｃｈｓｔ、断面のスケールバー：１００μｍ。 ＭｙｏＡＡＶは、全身注射後、高効率でマウスの骨格筋を形質導入する。注射したオス及びメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの様々な組織におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３～４）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、ＡＡＶ９及びＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウス間のスチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶは、全身注射後、高効率でマウスの骨格筋を形質導入する。媒体、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したマウス（左）及びヒト（右）一次筋管におけるインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。ドナー１：２９歳男性、ドナー２：１９歳女性、ドナー３：２０歳男性、ドナー４：３４歳女性。図２２Ａ～２２Ｋ及び２９Ａ～２９Ｏも参照されたい。 ＭｙｏＡＡＶの全身注射は、高速かつ持続性高レベルのレポーター導入遺伝子発現を全身の筋肉にもたらす。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを全身注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの１２０日間にわたって撮影した全身インビボ生物発光画像。 ＭｙｏＡＡＶの全身注射は、高速かつ持続性高レベルのレポーター導入遺伝子発現を全身の筋肉にもたらす。ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射した動物の前肢及び後肢からの１２０日にわたって評価した全蛍光の定量化。Ｐ値は、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ群間のテューキーのＭＣＴを用いた二元配置分散分析によって計算した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。ＭｙｏＡＡＶ １Ａ対ＡＡＶ８及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ対ＡＡＶ９の両方に関して＊＊：Ｐ＜０．０１。ＡＡＶ８群及びＡＡＶ９群間の差は、いずれの時点においても統計的に有意ではない。 ＭｙｏＡＡＶの全身注射は、高速かつ持続性高レベルのレポーター導入遺伝子発現を全身の筋肉にもたらす。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスから注射後４か月で採取したＴＡ、三頭筋、腓腹筋、大腿四頭筋、及び腹筋の全器官発光画像。カラースケール：１Ｅ＋７～１Ｅ＋８。 ＭｙｏＡＡＶの全身注射は、高速かつ持続性高レベルのレポーター導入遺伝子発現を全身の筋肉にもたらす。ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射した動物から注射後１２０日で採取した異なる筋肉からの全蛍光の定量化。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１（ＭｙｏＡＡＶ群とＡＡＶ９群間のマン・ホイットニーのＵ検定）。図２２Ａ～２２Ｋ、２３Ａ～２３Ｂ、及び２９Ａ～２９Ｏも参照されたい。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘ筋におけるジストロフィン（赤）の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー：４００μｍ。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したマウスの筋肉におけるジストロフィン及びＧＡＰＤＨを検出するウエスタンブロット。下部には、濃度測定によって特定された相対的シグナル強度を含む。Ａ．Ｕ．：任意単位、ＧＡＰＤＨに対して正規化。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射した成体ｍｄｘマウスの異なる筋肉におけるエクソン２３欠失ｍＲＮＡのＴａｑｍａｎベースの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝９～１０）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体を注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１１）、及び媒体（ｎ＝１５）、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｎ＝１５）、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｎ＝１７）を注射したｍｄｘマウスに関する前脛骨筋の比筋力。＊＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体を注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１１）、及び媒体（ｎ＝１５）、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｎ＝１５）、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ（ｎ＝１７）を注射したｍｄｘマウスに関する６回の遠心性収縮後の筋力の低下。＊＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。４週齢のＭｔｍ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに全身送達された２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ヒトＭＴＭ１（ｈＭＴＭ１）の有効性を調べるための実験の概略図。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体または２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウス及び媒体を注射した野生型同腹子対照の全体重。データは、平均±ＳＤ（ＫＯ ＡＡＶ９ではｎ＝６、ＫＯ ＭｙｏＡＡＶ １Ａではｎ＝６、野生型媒体ではｎ＝３、ＫＯ媒体ではｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（ホルム・サイダックのＭＣＴによる多重ｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１またはＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１のいずれかを注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスのウイルス注射後１６週の写真。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１、またはＭｙｏＡＡＶ－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯ動物、及び媒体を注射した野生型同腹子の生存曲線。媒体を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスのデータ点は、以前の実験に由来する。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体を注射した野生型マウス、または媒体、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１、もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１をともに２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスから、ケージ内での回し車の回転によって評価した１時間あたりの受動的な活動の平均。データは、３週間にわたって平均した毎週の測定値に関して平均±ＳＥＭ（ＫＯ ＡＡＶ９ではｎ＝６、ＫＯ ＭｙｏＡＡＶ １Ａではｎ＝６、野生型媒体ではｎ＝３、ＫＯ媒体ではｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（ホルム・サイダックのＭＣＴによる多重ｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体を注射した野生型マウス、またはＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１、もしくはＭｙｏＡＡＶ－ｈＭＴＭ１をともに２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスによる、活動観察において５分の間の立ち上がり行動の回数。データは、３週間にわたって平均した毎週の測定値に関して平均±ＳＤ（ＫＯ ＡＡＶ９ではｎ＝５、ＫＯ ＭｙｏＡＡＶではｎ＝６、野生型媒体ではｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（二段階Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯ動物、及び媒体を注射した野生型同腹子の生存曲線（ＫＯ ＡＡＶ９ではｎ＝６、ＫＯ ＭｙｏＡＡＶ １Ａではｎ＝６、野生型媒体ではｎ＝３、ＫＯ媒体ではｎ＝４）。媒体を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスのデータ点は、以前の実験に由来する。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（マンテル・コックス検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスの腓腹筋、大腿四頭筋、心臓、及び肝臓における注射の４週後に分析したｈＭＴＭ１ ｍＲＮＡ発現の倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１からの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（組織ごとに、ＡＡＶ９及びＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した群間のスチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスの様々な組織における注射の４週後に分析した２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスの筋肉におけるｈＭＴＭ１及びＧＡＰＤＨを検出するウエスタンブロット。下部には、濃度測定によって特定された相対的シグナル強度を含む。Ａ．Ｕ．：任意単位、ＧＡＰＤＨに対して正規化。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与は、それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおいて治療効果をもたらす。媒体を注射した野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝４）、及び媒体（ｎ＝２）、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１（ｎ＝４）、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１（ｎ＝４）を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスに関する長趾伸筋（ＥＤＬ）の比筋力。＊＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。図２４Ａ～２４Ｇも参照されたい。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーをコードするプラスミドまたはｐＵＣ１９でトランスフェクトし、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、ｐＵＣ１９でトランスフェクトした細胞と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（ダネットの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーをコードするプラスミドまたはｐＵＣ１９でトランスフェクトし、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３細胞における細胞表面に結合したウイルスの定量化。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、ｐＵＣ１９でトランスフェクトした細胞と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（ダネットの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７ｐａｎ－インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したマウス一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎＭの小分子条件と比較して計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（ダネットの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７ｐａｎ－インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎＭの小分子条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１（群ごとに、対照として設定した０ｎＭの組み換えタンパク質とのダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＡＡＶ９－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１（群ごとに、対照として設定した０ｎＭの組み換えタンパク質とのダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度の抗αＶｂ６抗体で処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎｇ／ｕｌの抗体条件と比較して計算した。＊＊：Ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度の抗αＶｂ６抗体で処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎｇ／ｕｌの抗体条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のアイソタイプ対照抗体で処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎｇ／ｕｌの抗体条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーをコードするプラスミドまたはｐＵＣ１９でトランスフェクトし、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１（対照として設定したｐＵＣ１９でトランスフェクトした細胞とのダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーをコードするプラスミドまたはｐＵＣ１９でトランスフェクトし、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３細胞における細胞表面に結合したウイルスの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１（対照として設定したｐＵＣ１９でトランスフェクトした細胞とのダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のＣＷＨＭ－１２ｐａｎ－インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎＭの小分子条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲの両方に依存する。異なる濃度のアイソタイプ対照抗体で処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎｇ／ｕｌの抗体条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．００１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。図２５Ａ～２５Ｋ及び２６Ａ～２６Ｏも参照されたい。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。ＡＡＶ９ ＶＲ－ＶＩＩＩ表面ループの構造及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ ＶＲ－ＶＩＩＩ表面ループのアミノ酸注釈付き予測構造。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。第二回のウイルスライブラリの２つの異なる用量での注射後のマウス筋から同定された最上位のヒットのウイルスライブラリデザイン及び配列の概略図（配列番号２～７、１９～２１）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。２Ｅ＋１１ｖｇのＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（左）またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（右）を全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの青色光で照射した異なる組織。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したマウスの腓腹筋、三頭筋、ＴＡ、及び大腿四頭筋の全載断面画像。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。２Ｅ＋１１ｖｇのＭｙｏＡＡＶ １Ａ－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの様々な組織におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の同用量のＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したマウスと比較した倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ＭｙｏＡＡＶ １Ａ及びＭｙｏＡＡＶ ２Ａではｎ＝１１、ＡＡＶ９ではｎ＝８）として表されている。Ｐ値は、ＡＡＶ９群と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。ＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、０ｎＭの小分子条件と比較して計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（ダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（群ごとに、対照として０ｎＭの組み換えタンパク質条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＡＡＶ９－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（群ごとに、対照として０ｎＭの組み換えタンパク質条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶｒｈ７４－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを全身注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの２１日間にわたって撮影した全身インビボ生物発光画像。カラースケール：６Ｅ＋６～１Ｅ＋９。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。ＡＡＶｒｈ７４－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射した動物の後肢からの２１日間にわたって評価した全蛍光の定量化。Ｐ値は、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ９、及びＭｙｏＡＡＶ ２Ａ群間のテューキーのＭＣＴを用いた二元配置分散分析によって計算した。ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ対ＡＡＶｒｈ７４及びＭｙｏＡＡＶ ２Ａ対ＡＡＶ９の両方に関して＊＊：Ｐ＜０．０１。ＡＡＶｒｈ７４群とＡＡＶ９群間の差は、いずれの時点においても統計的に有意ではない。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの様々な組織における２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの定量化。データは、平均±ＳＤ（ＭｙｏＡＡＶ １Ａ及びＭｙｏＡＡＶ ２Ａではｎ＝１１、ＡＡＶ９ではｎ＝８）として表されている。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。 ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＭｙｏＡＡＶのさらなる進化により、さらに改良された筋指向性カプシドバリアントが生成される。異なる濃度の抗αＶｂ６抗体（左）または１０ｎｇ／ｕｌのアイソタイプ対照抗体（右）で処理し、ＣＫ８プロモーターの制御下でＮｌｕｃをコードするＡＡＶ９－または第一もしくは第二世代のＲＧＤ含有カプシドバリアントで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。抗αＶｂ６抗体データのＰ値は、第一世代群と第二世代群間で計算した。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによる二元配置分散分析）。アイソタイプ対照データのＰ値は、群ごとに、アイソタイプ対照と１０ｎｇ／ｕｌの抗αＶｂ６抗体条件間で計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。図２７Ａ～２７Ｂも参照されたい。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスの筋肉におけるマイクロジストロフィン－ＦＬＡＧ（赤）の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー：４００μｍ。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを注射したマウスの筋肉におけるマイクロジストロフィン－ＦＬＡＧ及びＧＡＰＤＨを検出するウエスタンブロット。下部には、濃度測定によって特定された相対的シグナル強度を含む。Ａ．Ｕ．：任意単位、ＧＡＰＤＨに対して正規化。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを全身注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスの様々な筋肉及び肝臓におけるマイクロジストロフィンｍＲＮＡ発現の同用量のＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを注射したマウスと比較した倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィンからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝９～１０）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスの様々な筋肉及び肝臓における２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝９～１０）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。媒体を注射したＤＢＡ／２Ｊマウス（ｎ＝１０）、及び媒体（ｎ＝１０）、ＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィン（ｎ＝１０）、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィン（ｎ＝１０）を注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスに関する比筋力。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（テューキーのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィンを低用量の２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇで全身投与することにより、成体ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスにおいて、幅広いマイクロジストロフィン発現及び効果的な筋肉機能の回復につながる。媒体を注射したＤＢＡ／２Ｊマウス（ｎ＝１０）、及び媒体（ｎ＝１０）、ＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィン（ｎ＝１０）、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィン（ｎ＝１０）を注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスに関する遠心性収縮後の筋力の低下。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（テューキーのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。ＡＡＶの形質導入における異なる段階の略図。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの脳におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの腎臓におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの肺におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの骨格筋におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの心臓におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。注射したマウスの肝臓におけるＤＮＡ及びｍＲＮＡのレベルでのウイルスライブラリに対するユビキタスＣＭＶプロモーター下で発現したカプシドバリアントの濃縮を示すグラフ。ＤＥＬＩＶＥＲで使用される転写物ベースの選択により、ＤＮＡベースの選択と比較してよりストリンジェントな機能的カプシドバリアントの同定が可能になる。ウイルスライブラリに対する濃縮は、組織で同定されたバリアントごとに、１００万分のリード（ＲＰＭ）を、ウイルスライブラリの同じバリアントのＲＰＭで除することによって計算する。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。ウイルスライブラリにおける各カプシドバリアントの存在量と、ウイルスライブラリを注射したマウスの肝臓で同定されたバリアントからのベクターゲノムＤＮＡの存在量の相関関係。各バリアントからのベクターゲノムＤＮＡの相対量は、ウイルスライブラリにおけるそのバリアントの存在量と相関するが、各バリアントからのカプシドｍＲＮＡ発現のレベルと、ウイルスライブラリにおけるそのバリアントの量の間には、２つのサンプル型間の線形回帰に基づいて、相関関係はほとんどない。ＲＰＭ：１００万分のリード。 ＤＥＬＩＶＥＲは、様々な組織において機能的形質導入が可能なカプシドバリアントの選択を可能にする。ウイルスライブラリにおける各カプシドバリアントの存在量と、ウイルスライブラリを注射したマウスの肝臓で同定されたバリアントからの発現ｍＲＮＡ（ＣＭＶプロモーターの制御下）の存在量の相関関係。各バリアントからのベクターゲノムＤＮＡの相対量は、ウイルスライブラリにおけるそのバリアントの存在量と相関するが、各バリアントからのカプシドｍＲＮＡ発現のレベルと、ウイルスライブラリにおけるそのバリアントの量の間には、２つのサンプル型間の線形回帰に基づいて、相関関係はほとんどない。ＲＰＭ：１００万分のリード。 ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９と比較して同様の力価で組み換えＡＡＶを産生し、成体ｍｄｘ－Ａｉ９マウスへの全身送達後、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９よりも効果的に筋幹細胞を形質導入する。Ａ）１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの三頭筋、腓腹筋、及び腹筋の全載蛍光画像。緑：ＥＧＦＰ、赤：ラミニン、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ、断面のスケールバー：１００μｍ。Ｂ）１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射した５７ＢＬ／６Ｊマウスの三頭筋、腓腹筋、及び腹筋の断面画像。緑：ＥＧＦＰ、赤：ラミニン、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ、断面のスケールバー：１００μｍ。Ｃ）１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの肺、腎臓、脾臓、及び脳の全載蛍光画像。 ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９と比較して同様の力価で組み換えＡＡＶを産生し、成体ｍｄｘ－Ａｉ９マウスへの全身送達後、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９よりも効果的に筋幹細胞を形質導入する。Ｄ）１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの様々な組織における２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（スチューデントｔ検定）。Ｅ）最上位のＲＧＤ含有カプシドバリアントによって産生された組み換えＡＡＶの力価と野生型ＡＡＶ９の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。Ｐ値は、ダネットのＭＣＴによる対照としてのＡＡＶ９とのＡＮＯＶＡによって計算した。 ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９と比較して同様の力価で組み換えＡＡＶを産生し、成体ｍｄｘ－Ａｉ９マウスへの全身送達後、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９よりも効果的に筋幹細胞を形質導入する。Ｆ）衛星細胞の形質導入分析実験の概略図。Ａｉ９遺伝子座を含む細胞にＣｒｅリコンビナーゼを送達することにより、ゲノムからＳＴＯＰカセットが除去され、ｔｄＴｏｍａｔｏが発現する。Ｇ）６か月齢のｍｄｘ－Ａｉ９マウスから、４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｃｒｅの全身注射の２週後に単離したｔｄＴｏｍａｔｏ＋形質導入筋幹細胞のパーセント。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１（テューキーのＭＣＴによる一元配置分散分析）。Ｈ）注射したｍｄｘ－Ａｉ９マウスから単離した筋幹細胞からの代表的なＦＡＣＳプロット。 ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９と比較して同様の力価で組み換えＡＡＶを産生し、成体ｍｄｘ－Ａｉ９マウスへの全身送達後、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９よりも効果的に筋幹細胞を形質導入する。Ｉ）ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを全身注射したｍｄｘ－Ａｉ９マウスから単離したＦＡＣＳでソートした筋幹細胞から分化した筋管の代表的な免疫蛍光画像。緑、ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、赤、ｔｄＴｏｍａｔｏ、青、Ｈｏｅｃｈｓｔ。スケールバー：４００μｍ。Ｊ）媒体、または１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したマウスの筋肉におけるＥＧＦＰ及びビンキュリンを検出するウエスタンブロット。Ｋ）筋肉の単核細胞から骨格筋前駆体を単離するためのゲーティング戦略。 ＭｙｏＡＡＶの全身投与により、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの筋肉において長期的な高レベルの導入遺伝子発現がもたらされる。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したＢＡＬＢ／ｃＪマウスの１２０日間にわたる全身インビボ生物発光画像。この画像は、図１６Ａに示した同じマウスからの発光シグナルを、ＡＡＶ８－及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスの筋肉でのシグナルの検出を可能にするために異なるカラースケール（５Ｅ＋６～５Ｅ＋７）で示す。 ＭｙｏＡＡＶの全身投与により、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの筋肉において長期的な高レベルの導入遺伝子発現がもたらされる。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスから注射後４か月で採取したＴＡ、三頭筋、腓腹筋、大腿四頭筋、及び腹筋の全器官発光画像。この画像は、図１６Ｃに示した同じマウスからの発光シグナルを、ＡＡＶ８－及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスの筋肉でのシグナルの検出を可能にするために異なるカラースケール（５Ｅ＋５～５Ｅ＋７）で示す。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。ＡＡＶ９－及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲウイルスを生成するために使用したＡＡＶ構築物の概略図。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。ＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲをｍｄｘマウスに投与した後のジストロフィンの修復の概略図。マウスに、４．５Ｅ＋１２ｖｇのＳａＣａｓ９及び９Ｅ＋１２ｖｇのｇＲＮＡ ＡＡＶを注射した。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。４．５Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＳａＣａｓ９を全身注射した８週齢のｍｄｘマウスの異なる筋肉におけるＳａＣａｓ９ ｍＲＮＡ発現における倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＳａＣａｓ９からの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５～６）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（スチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。９Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｇＲＮＡを全身注射した８週齢のｍｄｘマウスの異なる筋肉におけるｇＲＮＡ発現における倍率差の定量化。赤い破線は、ＡＡＶ９－ｇＲＮＡからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５～６）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（スチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。ＡＡＶ９－及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７ヒトＭＴＭ１ウイルスを生成するために使用したＡＡＶ構築物の概略図。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。ＡＡＶ９－及びＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７ヒトＭＴＭ１ウイルスを生成するために使用したＡＡＶ構築物の概略図。 ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲの全身投与により、全身の複数の筋肉においてＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して高いレベルのＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現がもたらされる。媒体を注射した野生型マウス、または媒体、ＡＡＶ９－ｈＭＴＭ１、もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ｈＭＴＭ１をともに２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスによる、５分間の立ち上がり行動の回数。データは、３週間にわたって平均した毎週の測定値に関して平均±ＳＤ（ＫＯ ＡＡＶ９ではｎ＝６、ＫＯ ＭｙｏＡＡＶ １Ａではｎ＝６、野生型媒体ではｎ＝３、ＫＯ媒体ではｎ＝４）として表されている。媒体を注射したＭｔｍ１ ＫＯマウスのデータ点は、以前の実験に由来する。Ｐ値は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ群とＡＡＶ９群間で計算した。＊＊：Ｐ＜０．０１（ホルム・サイダックのＭＣＴによる多重ｔ検定）。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンαＶを発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンβ１を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンα５を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンβ８を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンβ５を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンβ３を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。ｐＵＣ１９またはＥＦ１αプロモーターの制御下でインテグリンβ６を発現するプラスミドでトランスフェクトし、過剰発現したタンパク質に対する抗体で染色したＨＥＫ２９３細胞のフローサイトメトリー分析からの代表的なヒストグラム。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。対応するインテグリンプラスミド（レーン１及び２）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ｐＵＣ１９（レーン３及び４）でトランスフェクトした細胞と比較したインテグリンα８の過剰発現を示すウエスタンブロット。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。対応するインテグリンプラスミド（レーン１及び２）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ｐＵＣ１９（レーン３及び４）でトランスフェクトした細胞と比較したインテグリンαＩＩｂの過剰発現を示すウエスタンブロット。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。対応するインテグリンプラスミド（レーン１及び２）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ｐＵＣ１９（レーン３及び４）でトランスフェクトした細胞と比較したインテグリンβ３の過剰発現を示すウエスタンブロット。 フローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより、ＨＥＫ２９３細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にインテグリンアルファ及びベータタンパク質の過剰発現が確認される。対応するインテグリンプラスミド（レーン１及び２）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ｐＵＣ１９（レーン３及び４）でトランスフェクトした細胞と比較したインテグリンβ８の過剰発現を示すウエスタンブロット。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＣＷＨＭ－１２インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃ（ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃ）で形質導入したマウス一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃ（ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃ）で形質導入したマウス一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＣＷＨＭ－１２インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＣＷＨＭ－１２インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＣＷＨＭ－１２インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入した３人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによるＡＮＯＶＡ）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーをコードするプラスミドまたはｐＵＣ１９でトランスフェクトし、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞、及びＡＡＶＲを過剰発現するＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞におけるインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表されている。＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した未処理のＨＥＫ２９３細胞またはＮＡで前処理した細胞のインビトロ形質導入の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した未処理のＨＥＫ２９３細胞またはＮＡで前処理した細胞の結合の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃによる、ＮＡとＥＣＬまたはＮＡ単独で前処理したＨＥＫ２９３細胞のインビトロ形質導入（Ｋ）及び結合（Ｌ）の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ４－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞とＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞間のインビトロ形質導入の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃによる、ＮＡとＥＣＬまたはＮＡ単独で前処理したＨＥＫ２９３細胞のインビトロ結合の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊：Ｐ＜０．０１、＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 インテグリンαＶアンタゴニストは、一次マウス筋管及び異なるドナー由来の一次ヒト筋管において、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を抑制するが、ＡＡＶ９を抑制しない。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ４－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞とＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞間のインビトロ形質導入の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０００１（対数変換データを用いたスチューデントｔ検定）。 第二世代のＲＧＤ含有カプシドバリアントは、第一世代のバリアントと比較して、ヒト一次筋管の形質導入についてのαＶβ６への依存が低い。２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ－、またはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの様々な組織における２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの定量化。データは、平均±ＳＥＭ（ＭｙｏＡＡＶ及びＥＭｙｏＡＡＶではｎ＝１１、ＡＡＶ９ではｎ＝８）として表されている。＊：Ｐ＜０．０５（マン・ホイットニー検定）。 第二世代のＲＧＤ含有カプシドバリアントは、第一世代のバリアントと比較して、ヒト一次筋管の形質導入についてのαＶβ６への依存が低い。異なる濃度の抗αＶβ６抗体で処理し、ＣＫ８プロモーターの制御下でＮｌｕｃをコードするＡＡＶ９－または第一もしくは第二世代のＲＧＤ含有カプシドバリアントで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＥＭ（ｎ＝５）として表されている。左側のグラフは、個々のバリアントごとに、形質導入効率を示している。右側のグラフでは、第一世代のバリアント（ＲＧＤＬＴＴＰ（配列番号１２）、ＲＧＤＬＳＴＰ（配列番号８）、ＲＧＤＬＮＱＹ（配列番号９）、ＲＧＤＡＴＥＬ（配列番号１０）、及びＲＧＤＴＭＳＫ（配列番号１１））ならびに第二世代のバリアント（ＧＰＧＲＧＤＱＴＴＬ（配列番号２）、ＡＥＧＲＧＤＱＹＴＲ（配列番号３）、ＡＴＧＲＧＤＬＧＱＡ（配列番号４）、ＡＶＡＲＧＤＱＧＬＩ（配列番号５）、ＮＩＳＲＧＤＱＧＹＱ（配列番号６）、ＡＰＡＲＧＤＱＧＳＱ（配列番号７））が２群としてプロットされている。＊：Ｐ＜０．０１（第一世代群と第二世代群間の二段階Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、Ｋｒｉｅｇｅｒ、及びＹｅｋｕｔｉｅｌｉ検定）（配列番号２～１２）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。ウイルスライブラリデザインの概略図及びランダム７量体挿入を含むカプシドバリアントからのカニクイザルにおける二回のインビボ選択後にＮＨＰ筋から同定された最上位のヒットの配列（配列番号１３、２２～２７）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。マウスにおける第一回のＲＧＤ固定選択から同定された最上位１２０，０００バリアントを使用してカニクイザルにおける１回のインビボ選択から同定された最上位のヒットの配列（配列番号１９、２８～３２）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。４人の異なるドナーに由来するヒト一次筋管において、マウスで選択した１１の筋指向性カプシドバリアント間のインビトロ形質導入の比較。データは、個々のデータ点として平均とともに表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１（対照としてＭｙｏＡＡＶ １Ａを用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。ＮＨＰにおいて最上位の筋指向性バリアント（配列番号２８、３０、３２～３３）の特性評価に使用されるバーコード化ヒトフラタキシン導入遺伝子及びカプシドバリアントのプールの概略図。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。３匹のカニクイザルの異なる骨格筋、心臓、及び肝臓におけるＡＡＶｒｈ７４に対するｍＲＮＡ発現の倍率変化。ｍＲＮＡ発現は、各カプシドバリアントに関連するバーコードのディープシーケンシングによって定量化した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照としてＡＡＶｒｈ７４を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。６つの異なる導入遺伝子によるＡＡＶｒｈ７４、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ、及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ、ならびにＡＡＶ９の力価の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝６）で表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照としてＡＡＶｒｈ７４を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。異なる濃度のＧＬＰＧ－０１８７インテグリンαＶアンタゴニストで処理し、ＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ－、またはＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。Ｐ値は、群ごとに、対照として設定した０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析で計算した。ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ、及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｅに関して：Ｐ＜０．０００１。ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｅに関して：Ｐ＜０．０００１。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＡＡＶ９－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（群ごとに、対照として０ｎＭの組み換えタンパク質条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。異なる濃度のαＶｂ１、αＶｂ３、αＶｂ６、αＶｂ８、またはＭＢＰ組み換えタンパク質とともにインキュベートした、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ－、またはＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（群ごとに、対照として０ｎＭの組み換えタンパク質条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。異なる濃度の抗αＶｂ６抗体またはマウスアイソタイプ対照で処理し、ＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ－、またはＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃで形質導入したヒト一次筋管におけるインビトロ形質導入効率。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）として表されている。ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ、及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｅに関して：Ｐ＜０．０００１。ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ、及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｅに関して：Ｐ＜０．０００１（群ごとに、対照として０ｎＭ条件を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＮＨＰにおいて進化したＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントは、カニクイザルの異なる筋肉を高効率で形質導入する。ＡＡＶ２－、ＡＡＶ４－、ＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ａ－、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｃ－、またはＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したＨＥＫ２９３ＦＴ細胞とＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞間のインビトロ形質導入の比較。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４）として表されている。：Ｐ＜０．０００１（対数変換データでのスチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（上）またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（下）を全身注射したメスのＤＢＡ／２Ｊマウスの青色光で照射した異なる組織。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（上）またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（下）を全身注射したオスのＤＢＡ／２Ｊマウスの青色光で照射した異なる組織。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（上）またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（下）を全身注射したメスのＢＡＬＢ／ｃＪマウスの青色光で照射した異なる組織。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（上）またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ（下）を全身注射したオスのＢＡＬＢ／ｃＪマウスの青色光で照射した異なる組織。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを全身注射したオス及びメスのＤＢＡ／２ＪならびにＢＡＬＢ／ｃＪマウスの三頭筋、腓腹筋、心臓、及び肝臓におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の倍率差の定量化。灰色の破線は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝４～５）で表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（群ごとに、ＡＡＶ９とＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウス間のスチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴＡにおけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の倍率差の定量化。灰色の破線は、ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰからの相対的発現を示す。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（スチューデントｔ検定）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。媒体、または２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴＡ筋におけるＥＧＦＰ及びチューブリンを検出するウエスタンブロット。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。媒体、または２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴＡの免疫蛍光画像。グレースケール：ＥＧＦＰ、赤：ラミニン、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ。断面のスケールバー：４００μｍ。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。媒体、または１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの注射前、ならびにその全身注射の１４日及び２８日後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清中のＡＬＴ酵素レベルの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。Ｐ値は、テューキーのＭＣＴを用いた二元配置分散分析によって計算した。有意性閾値：Ｐ＜０．０５。各時点で任意の２群間の差は有意ではない。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。媒体、または１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰの注射前、ならびにその全身注射の１４日及び２８日後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清中のＡＳＴ酵素レベルの定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。Ｐ値は、テューキーのＭＣＴを用いた二元配置分散分析によって計算した。有意性閾値：Ｐ＜０．０５。各時点で任意の２群間の差は有意ではない。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。ＡＡＶ９－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したマウスの血清によるＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃ形質導入の阻害。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（サイダックのＭＣＴによる二元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したマウスの血清によるＨＥＫ２９３細胞におけるＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃ形質導入の阻害。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（サイダックのＭＣＴによる二元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスから注射後４か月で採取したＴＡ、三頭筋、腓腹筋、大腿四頭筋、及び腹筋の全器官発光画像。グレースケール：１Ｅ＋７～１Ｅ＋８。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射した動物の異なる筋肉から注射後１２０日で採取した全発光の定量化。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１（テューキーのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪバックグラウンドからのマウスにおいて全身投与後に異なる骨格筋を効果的に形質導入し、筋内送達後の筋肉形質導入において極めて強力である。４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスから注射後４か月で採取したＴＡ、三頭筋、腓腹筋、大腿四頭筋、及び腹筋の全器官発光画像。この画像は、図１７Ｃに示した同じマウスからの発光シグナルを、ＡＡＶ８－及びＡＡＶ９－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを注射したマウスの筋肉でのシグナルの検出を可能にするためにグレースケール（５Ｅ＋５～５Ｅ＋７）で示す。 カニクイザルにおいて進化した筋指向性カプシドバリアントの特性評価。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの異なる組織におけるＡＡＶｒｈ７４に対するｍＲＮＡ発現の倍率変化。ｍＲＮＡ発現は、各カプシドバリアントに関連するバーコードのディープシーケンシングによって定量化した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝５）で表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照としてＡＡＶｒｈ７４を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 カニクイザルにおいて進化した筋指向性カプシドバリアントの特性評価。カニクイザルの異なる組織におけるＡＡＶｒｈ７４に対するｍＲＮＡ発現の倍率変化。ｍＲＮＡ発現は、各カプシドバリアントに関連するバーコードのディープシーケンシングによって定量化した。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で表されている。＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１（対照としてＡＡＶｒｈ７４を用いたダネットのＭＣＴによる一元配置分散分析）。 カニクイザルにおいて進化した筋指向性カプシドバリアントの特性評価。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの三頭筋、カニクイザルの三頭筋、及びヒト前斜角筋における（ＩＴＧＢ６）インテグリンベータ－６（グレースケール）及びアイソタイプ対照（グレースケール）の代表的な免疫蛍光画像。スケールバー：４００μｍ。
本明細書における図面は、例示の目的のためのものにすぎず、必ずしも縮尺通りに描かれているわけではない。
一般的定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。分子生物学における一般的な用語及び技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）、Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）、及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出され得る。
本明細書で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別段明らかに示さない限り、単数及び複数の両方の指示対象が含まれる。
用語「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象、状況または置換基が生じる場合も生じない場合もあること、及び該記載が、該事象または状況が生じる例、及びそれが生じない例を含むことを意味する。
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内に含まれるすべての数及び分数、ならびに記述された端点を含む。該範囲の各々の端点は、他方の端点と関連して、及び他方の端点と独立しての両方で有意であることがさらに理解されよう。本明細書に開示される多くの値が存在すること、及び各値はまた、それ自体の値に加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も同様に開示される。範囲は、「約」ある特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。同様に、値が、先行する「約」の使用によって近似として表される場合、該特定の値はさらなる実施形態を形成することが理解されよう。例えば、値「約１０」が開示される場合、「１０」も同様に開示される。
かかる範囲の形式は、便宜及び簡潔性のために使用され、よって、範囲の限度として明白に記述される数値だけでなく、その範囲内に包含される個々の数値または副次的範囲のすべてを各数値及び副次的範囲が明白に記述されているものとして含むように柔軟な様式で解釈されるべきであることを理解されたい。説明するために、「約０．１％～５％」の数値範囲は、約０．１％～約５％の明白に記述された値だけでなく、示された範囲内の個々の値（例えば、約１％、約２％、約３％、及び約４％）ならびに副次的範囲（例えば、約０．５％～約１．１％、約５％～約２．４％、約０．５％～約３．２％、及び約０．５％～約４．４％、ならびに他の可能性のある副次的範囲）も含むように解釈されるべきである。範囲が表される場合、さらなる実施形態は、一方の特定の値から及び／または他方の特定の値までを含む。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値（文脈が別段明らかに示さない限り、下限の単位の十分の一まで）及びその記述された範囲における任意の他の記述された値または介在値が本開示に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、そのより小さな範囲に含まれる場合があり、記述された範囲における任意の特に除外される限度次第で、同様に本開示に包含される。記述された範囲が上下限の一方または両方を含む場合、含まれる上下限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。例えば、記述された範囲が上下限の一方または両方を含む場合、含まれる上下限のいずれかまたはその両方を除外する範囲も本開示に含まれ、例えば、「ｘ～ｙ」という表現は、「ｘ］～「ｙ」の範囲及び「ｘ」を超え「ｙ」未満の範囲を含む。範囲はまた、上限、例えば、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以下」として表すことができ、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲ならびに「ｘ未満」、「ｙ未満」、及び「ｚ未満」の範囲を含むように解釈されるべきである。同様に、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以上」という表現は、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲ならびに「ｘ超」、「ｙ超」、及び「ｚ超」の範囲を含むように解釈されるべきである。また、「約「ｘ」～「ｙ」」という表現（「ｘ」及び「ｙ」は数値である）は、「約「ｘ」～約「ｙ」」を含む。
本明細書で使用される用語「約」または「およそ」は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間的継続時間等に言及する場合、特定の値の及びそれからの変動、例えば、特定の値の及びそれからの＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、及び＋／－０．１％以下の変動を、かかる変動が開示された発明において実施するのに適切である限り、包含することを意味する。修飾語「約」または「およそ」が言及する値はまた、それ自体で、具体的に、及び好ましく開示されることを理解されたい。本明細書で使用される、用語「約」「おおよその」「～でまたは約」及び「実質的に」は、問題となる量または値が、正確な値または特許請求の範囲で記述されるまたは本明細書で教示されるものと同等の結果または効果を提供する値であり得ることを意味し得る。すなわち、量、サイズ、製剤、パラメータ、及び他の定量値及び特性は、正確ではなく、正確である必要はないが、おおよそ及び／またはより大きくまたはより小さい場合があり、所望により、許容範囲、換算率、四捨五入、測定誤差等、ならびに同等の結果または効果が得られるような当業者に知られている他の要素を反映することが理解される。いくつかの状況では、同等の結果または効果を提供する値は、合理的に決定することはできない。通常、量、サイズ、製剤、パラメータまたは他の量もしくは特性は、「約」、「おおよその」、または「～でまたは約」である（そのように明示的に記述されているかどうかにかかわらない）。「約」、「おおよその」、または「～でまたは約」が定量的値の前で使用される場合、該パラメータにはまた、具体的に別段記述されない限り、特定の定量的値自体が含まれることが理解される。
本明細書で使用される、「生物学的サンプル」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞残屑を含み得る。生物学的サンプルは、「体液」を含み得る（またはそれに由来し得る）。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ液、外リンパ液、滲出液、糞便、女性膣液、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（鼻汁及び痰を含む）、心膜液、腹膜液、胸膜液、膿、分泌物、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物及びそれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生物学的サンプルには、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物が含まれる。体液は、例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順によって哺乳類生物から得られ得る。
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳類には、マウス、サル、ヒト、牧場動物、スポーツ動物、及びペットが含まれるがこれらに限定されない。インビボで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの後代も包含される。
様々な実施形態が以下に記載されている。特定の実施形態は、網羅的な記載としてまたは本明細書で論じられるより広い実施形態への限定として意図されていないことが留意されるべきである。特定の実施形態と併せて記載されている１つの実施形態は、必ずしもその実施形態に限定されるわけではなく、任意の他の実施形態（複数可）とともに実施され得る。本明細書を通して「１つの実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書中の様々な箇所における「１つの実施形態では」、「実施形態では」、または「例示的な実施形態」という表現の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではないが、そうである場合がある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な様式で組み合わされ得る。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴は含まない一方で、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内であることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求された実施形態のいずれかは、任意の組み合わせで使用され得る。
本明細書で引用されるすべての刊行物、公開された特許文献、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
概説
本明細書に開示する実施形態は、カーゴに連結されても他の方法でカーゴと関連してもよい筋特異的標的化部分を提供する。本明細書に開示する実施形態は、１つ以上の筋特異的標的化部分を組み込み得るポリペプチド及び粒子を提供する。該ポリペプチド及び／または粒子は、カーゴに連結されても、カーゴに結合されても、カーゴを封入しても、他の方法でカーゴを組み込んでもよく、それにより該カーゴを該標的化部分（複数可）と関連付ける。
本明細書に開示する実施形態は、本明細書にさらに記載される１つ以上のｎ量体モチーフを含み得る筋特異的標的化部分を提供する。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、改良されたｍｙｏＡＡＶモチーフである。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、該標的化部分の筋特異性を付与し得る。
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、該モチーフの最初の３つのアミノ酸としてＲ－Ｇ－Ｄを含まない。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、第二世代のＲＧＤモチーフである。いくつかの実施形態では、該第二世代のＲＧＤモチーフを含むｎ量体モチーフは、第二世代のＲＧＤモチーフを含まないｎ量体モチーフより高い筋特異性、標的化、及び／または効力を有する。
本明細書に開示する実施形態は、細胞特異的及び／または種特異的指向性を操作されたＡＡＶ粒子に付与するように操作され得る操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを提供する。
本明細書に開示する実施形態はまた、バリアントカプシドタンパク質等の、修飾された表面構造のバリアントの多様なライブラリの生成を体系的に指示することを含み得る、操作されたカプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法を提供する。操作されたカプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法の実施形態はまた、特定の細胞、組織、及び／または器官型を標的とすることが可能なカプシドバリアントのストリンジェントな選択を含み得る。操作されたカプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法の実施形態は、少なくとも２つ以上の種において効率的及び／または均一な形質導入が可能なカプシドバリアントのストリンジェントな選択を含み得る。
本明細書に開示する実施形態は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶを産生することが可能なベクター及びその系を提供する。
本明細書に開示する実施形態は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶ粒子を産生することが可能であり得る細胞を提供する。いくつかの実施形態では、該細胞は、１つ以上の本明細書に記載のベクターまたはその系を含む。
本明細書に開示する実施形態は、本明細書に記載の操作されたカプシドを含み得る操作されたＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶは細胞に送達されるカーゴポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、遺伝子組み換えポリヌクレオチドである。
本明細書に開示する実施形態は、製剤を提供し、これは、操作されたＡＡＶベクターもしくはその系、操作されたＡＡＶのカプシド、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドを含む操作されたＡＡＶ粒子、及び／または操作されたＡＡＶのカプシドを含む本明細書に記載の操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶベクターもしくはその系を含み得る。いくつかの実施形態では、該製剤はまた、医薬的に許容される担体を含み得る。本明細書に記載の製剤は、それを必要とする対象に送達される場合もあれば細胞に送達される場合もある。
本明細書に開示する実施形態はまた、キットを提供し、これは、１つ以上の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、操作されたＡＡＶのカプシド、操作されたＡＡＶ粒子、細胞、または他の成分及びそれらの組み合わせならびに本明細書に記載の医薬製剤のうちの１つ以上を含む。実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、操作されたＡＡＶのカプシド、操作されたＡＡＶ粒子、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、組み合わせキットとして提供され得る。
本明細書に開示する実施形態は、本明細書に記載の細胞特異的指向性を有する操作されたＡＡＶを、例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用する方法を提供する。このように、本明細書に記載の操作されたＡＡＶは、疾患の治療及び／または予防を必要とする対象におけるその治療及び／または予防に使用され得る。本明細書に開示する実施形態はまた、該操作されたＡＡＶのカプシド、操作されたＡＡＶウイルス粒子、操作されたＡＡＶベクターもしくはその系及びまたはその製剤を細胞に送達する方法を提供する。同様に本明細書に提供するのは、操作されたＡＡＶ粒子、操作されたＡＡＶのカプシド、操作されたＡＡＶのカプシドベクターもしくはその系、操作された細胞、及び／またはその製剤を、それを必要とする対象に送達することによる、該対象の治療方法である。
操作されたＡＡＶならびに操作されたＡＡＶを作製及び使用する方法の実施形態のさらなる特徴及び利点は、本明細書でさらに記載される。
筋特異的標的化部分及びその組成物
本明細書に記載するのは、筋細胞を特異的に標的化すること、これに結合すること、これと関連すること、または他の方法でこれと特異的に相互作用することが可能であり得る標的化部分である。いくつかの実施形態では、該標的化部分は、ｎ量体モチーフである場合もあれば、それを含む場合もある。
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、第二世代のＲＧＤモチーフを含む。用語「第二世代のＲＧＤモチーフ」とは、アミノ酸モチーフＲ－Ｇ－Ｄの存在を含むｎ量体モチーフを指し、ＸｍＲＧＤＸｎからなる一般式を有し、ここで、Ｘｍ及びＸｎは、各々独立して、任意のアミノ酸から選択され、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり、ｍは、１～４である。例示的なｎ量体モチーフならびに筋肉を標的とすることが可能な適切なｎ量体モチーフを生成及び同定する方法は、本明細書の他の箇所により詳細に記載される。
いくつかの実施形態では、該標的化部分は、複数のｎ量体モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、該標的化部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのｎ量体モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、該標的化部分に含まれるすべてのｎ量体モチーフは、同じであることができる。複数のｎ量体モチーフが含まれるいくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフのうちの少なくとも２つは、互いに異なる。複数のｎ量体モチーフが含まれるいくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフのすべてが互いに異なる。いくつかの実施形態では、該標的化部分に含まれる各ｎ量体モチーフは、表２～３、図１４Ｆのいずれかに記載のもののいずれか１つである場合もあれば、本明細書の他の箇所に記載の図面及び実施例に提供されるもののいずれかである場合もある。いくつかの実施形態では、第二世代のＲＧＤモチーフを含むｎ量体モチーフは、第二世代のＲＧＤモチーフを含まないｎ量体モチーフより高い筋特異性、標的化、及び／または効力を付与する。いくつかの実施形態では、第二世代のＲＧＤモチーフを含むｎ量体モチーフは、Ｒ－Ｇ－Ｄを該モチーフの最初の３つのアミノ酸として有するｎ量体モチーフより高い筋特異性、標的化、及び／または効力を付与する。
いくつかの実施形態では、ｎ量体モチーフの最初の１、２、３、または４つのアミノ酸は、それが挿入され、挿入位置に先行するポリペプチドの１、２、３、または４つのアミノ酸を置換することができる。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフが挿入されるポリペプチドの１つ以上のアミノ酸を置換するｎ量体モチーフのアミノ酸は、ｎ量体モチーフの「ＲＧＤ」の前または直前に挿入される。例として、例えば、表２～３に示される１０量体の挿入物の１つ以上では、示される最初の３つのアミノ酸は、それらが挿入され得るポリペプチド内の１～３のアミノ酸を置換することができる。別の非限定的な例としてＡＡＶを使用すると、該ｎ量体モチーフのうちの１つ以上は、例えば、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸５８８と５８９の間に挿入することができ、該挿入物は、アミノ酸５８６、５８７、及び５８８を置換することができ、挿入後の該ｎ量体モチーフの直前のアミノ酸は、残基５８５になる。この原理は、任意の他の挿入の状況に適用され得ること、及びこれが必ずしもＡＡＶ９のカプシドの残基５８８と５８９の間の挿入にも別のＡＡＶのカプシドの等価位置の挿入にも限定されないことが理解されよう。さらに、いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフが挿入されるポリペプチドにおいて、該ｎ量体モチーフによってアミノ酸が置換されないことも理解されよう。
該筋特異的標的化部分は、カーゴに連結されても他の方法でカーゴと関連してもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の本明細書に記載の筋特異的標的化部分は、カーゴに直接結合される。いくつかの実施形態では、１つ以上の本明細書に記載の筋特異的標的化部分は、カーゴに、例えば、リンカー分子を介して間接的に連結される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の筋特異的標的化部分は、カーゴに連結された、カーゴに結合した、カーゴを封入する、及び／またはカーゴを含むポリペプチドまたは他の粒子に連結し、関連する。
例示的な粒子としては、ウイルス粒子（例えば、バクテリオファージのカプシドを含めてウイルスのカプシド）、ポリソーム、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、エキソソーム、ミセル等が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用される「ナノ粒子」という用語は、均質または不均質材料のナノスケールの沈着物を含む。ナノ粒子は、形状が規則的でも不規則でもよく、複合ナノスケール粒子を形成する複数の共析出粒子から形成されてもよい。ナノ粒子は、一般的に形状が球状であってもよく、複数の共析出した通常は球状の粒子から形成される複合形状を有してもよい。ナノ粒子についての例示的な形状としては、球状、棒状、楕円状、円筒状、円盤状等が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該ナノ粒子は、実質的に球状の形状を有する。
本明細書で使用される、用語「特異的」は、２つの部分の間の記載された相互作用に関して使用される場合、第一の部分及び第二の部分の非共有結合性物理的関連であって、該第一の部分と第二の部分との間の関連が、いずれかの部分と、結合が生じる環境に存在するほとんどまたはすべての他の部分との関連よりも少なくとも２倍強く、少なくとも５倍強く、少なくとも１０倍強く、少なくとも５０倍強く、少なくとも１００倍強く、またはそれ以上強いものを指す。２つ以上の実体の結合は、平衡解離定数であるＫｄが、用いられる条件下で、例えば、細胞内または細胞生存と調和するもの等の生理的条件下で、１０－３Ｍ以下、１０－４Ｍ以下、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、または１０－１２Ｍ以下である場合、特異的と見なされ得る。いくつかの実施形態では、特異的結合は、複数のより弱い相互作用（例えば、複数の個々の相互作用であって、各々の個々の相互作用が、１０－３Ｍを超えるＫｄを特徴とするもの）によって達成され得る。いくつかの実施形態では、「分子認識」と称され得る特異的結合は、各実体上の官能基の相補的配置に依存する２つの実体間の飽和結合相互作用である。特異的相互作用の例としては、プライマー－ポリヌクレオチド相互作用、アプタマー－アプタマー標的相互作用、抗体－抗原相互作用、アビジン－ビオチン相互作用、リガンド－受容体相互作用、金属－キレート相互作用、相補性核酸間のハイブリダイゼーション等が挙げられる。
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフ（複数可）に加えて、該標的化部分は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、該標的化部分は、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、バクテリオファージ、レトロウイルスタンパク質が挙げられるがこれらに限定されないウイルスタンパク質、例えば、カプシドタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｎ量体モチーフは、該ｎ量体モチーフが、ウイルスのカプシドの外側である（すなわち、その表面に提示される）ように、該ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸の間に配置される。
いくつかの実施形態では、１つ以上の本明細書に記載の筋特異的標的化部分を含む組成物は、増加した筋細胞能力、筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。本明細書で使用される、用語「筋特異的」、「筋細胞特異性」、「筋細胞能力」等は、本発明の筋特異的標的化部分及びかかる筋特異的標的化部分を組み込む組成物の、非筋細胞と比較して筋細胞に対して増加した特異性、選択性、または効力を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋特異的標的化部分または筋特異的標的化部分を含む組成物の細胞特異性、もしくは選択性、もしくは効力、またはそれらの組み合わせは、非筋細胞と比較して筋細胞に対して／において、少なくとも２倍～少なくとも５００倍特異的、選択的、及び／または強力である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋特異的標的化部分の／における特異性、または選択性、または効力は、非筋細胞と比較して筋細胞に対して、少なくとも２倍から／または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００倍特異的または選択的である。
いくつかの実施形態において選択肢に記載される、本明細書に記載の筋特異的標的化部分及び／または１つ以上の該筋特異的標的化部分を含む組成物は、減少した非筋細胞能力、非筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋特異的標的化部分及び／または１つ以上の該筋特異的標的化部分を含む組成物は、筋細胞と比較して非筋細胞に対して／において、特異性、選択性、及び／または効力が少なくとも２倍～少なくとも５００倍低い。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋特異的標的化部分の／における特異性、または選択性、または効力は、筋細胞と比較して非筋細胞に対して、少なくとも２倍から／または３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００倍特異性または選択性が低い。
筋特異的標的化部分を組み込む組成物の免疫原性は、例えば、１～１００倍またはそれを超えて減少し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性は、１から／または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００倍またはそれを超えて減少する。
カーゴは、本明細書に記載の筋特異的標的化部分に連結することまたはこれと関連することが可能な任意の分子を含み得る。カーゴとしては、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、リボタンパク質、脂質、糖、医薬的に活性な薬剤（例えば、薬物、造影剤及び他の診断用薬等）、化合物、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該カーゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、必須腫瘍タンパク質及び遺伝子の翻訳または転写を阻害するリボザイムのためのガイド配列、ホルモン、免疫修飾物質、解熱剤、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛剤、抗痙攣剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染薬、放射線増感剤、化学療法薬、放射性化合物、造影剤、ならびにそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、該カーゴは、筋肉の疾患または障害を治療または予防することが可能である。いくつかの実施形態では、該筋肉の疾患または障害は、（ａ）自己免疫疾患、（ｂ）がん、（ｃ）筋ジストロフィー、（ｄ）神経筋疾患、（ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症、（ｆ）伸長リピート病、（ｇ）ドミナントネガティブ疾患、（ｈ）心筋症、（ｉ）ウイルス性疾患、（ｊ）早老性疾患、または（ｋ）それらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、該伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。いくつかの実施形態では、該筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。いくつかの実施形態では、該糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。いくつかの実施形態では、該ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である。いくつかの実施形態では、該神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
いくつかの実施形態では、該カーゴは、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、もしくはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を含むリボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、もしくは他の遺伝子組み換えもしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、該カーゴは、遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
いくつかの実施形態では、該カーゴは、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
いくつかの実施形態では、該カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、該ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４、またはそれらの組み合わせ、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む。
操作されたウイルスのカプシド及びポリヌクレオチドのコード化
本明細書に記載するのは、細胞特異的指向性、例えば、筋特異的指向性を操作されたウイルス粒子に付与するように操作され得る操作されたウイルスのカプシド、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のカプシドの様々な実施形態である。操作されたウイルスのカプシドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはＡＡＶのカプシドであり得る。該操作されたカプシドは、操作されたウイルス粒子（例えば、操作されたレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはＡＡＶウイルス粒子）に含めることができ、該操作されたウイルス粒子に、細胞特異的指向性、低免疫原性、またはその両方を付与することができる。本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドは、１つ以上の本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドタンパク質を含み得る。本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドは、本明細書の他の箇所に記載のｎ量体モチーフを含むまたはそれからなる筋特異的標的化部分を含み得る本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドタンパク質を１つ以上含み得る。
該操作されたウイルスのカプシド及び／またはカプシドタンパク質は、１つ以上の操作されたウイルスのカプシドポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、該操作されたウイルスのカプシドポリヌクレオチドは、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、操作されたレンチウイルスのカプシドポリヌクレオチド、操作されたレトロウイルスのカプシドポリヌクレオチド、または操作されたアデノウイルスのカプシドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、操作されたウイルスのカプシドポリヌクレオチド（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、操作されたレンチウイルスのカプシドポリヌクレオチド、操作されたレトロウイルスのカプシドポリヌクレオチド、または操作されたアデノウイルスのカプシドポリヌクレオチド）は、３’ポリアデニル化シグナルを含み得る。該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルであり得る。
該操作されたウイルスのカプシドは、野生型ウイルスのカプシドのバリアントであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドは、野生型ＡＡＶのカプシドのバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、該野生型ＡＡＶのカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３カプシドタンパク質またはそれらの組み合わせから構成され得る。換言すれば、該操作されたＡＡＶのカプシドは、野生型ＶＰ１、野生型ＶＰ２、及び／または野生型ＶＰ３カプシドタンパク質の１つ以上のバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、該参照野生型ＡＡＶのカプシドの血清型は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、該野生型ＡＡＶのカプシドの血清型は、ＡＡＶ－９であり得る。該操作されたＡＡＶのカプシドは、該参照野生型ＡＡＶのカプシドのものとは異なる指向性を有し得る。
該操作されたウイルスのカプシドは、１～６０個の操作されたカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたウイルスのカプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の操作されたカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたウイルスのカプシドは、０～５９個の野生型ウイルスのカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたウイルスのカプシドは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９個の野生型ウイルスのカプシドタンパク質を含み得る。
いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドは、１～６０個の操作されたカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の操作されたカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドは、０～５９個の野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９個の野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質を含み得る。
いくつかの実施形態では、該操作されたウイルスのカプシドタンパク質は、ｎ量体のアミノ酸モチーフを有することができ、ここで、ｎは、少なくとも３個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、操作されたＡＡＶのカプシドは、６量体または７量体のアミノ酸モチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、該ｎ量体のアミノ酸モチーフは、野生型ウイルスタンパク質（ＶＰ）（またはカプシドタンパク質）の２つのアミノ酸の間に挿入され得る。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、ウイルスのカプシドタンパク質の可変アミノ酸領域内の２つのアミノ酸の間に挿入され得る。
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフは、ＡＡＶのカプシドタンパク質の可変アミノ酸領域内の２つのアミノ酸の間に挿入され得る。各野生型ＡＡＶウイルスタンパク質のコアは、８本鎖ベータバレルモチーフ（ベータＢ～ベータＩ）及びアルファ－ヘリックス（アルファＡ）を含み、これらは自律的に増殖するパルボウイルスのカプシドに保存される（例えば、ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（１２）：６９４７－６９５８参照）。構造的可変領域（ＶＲ）は、カプシド表面における局所的バリエーションを生成するためにクラスター化するベータ鎖と接続する表面ループにおいて生じる。ＡＡＶは、１２個の可変領域（超可変領域とも称される）を有する（例えば、Ｗｅｉｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｎ．２０１１．“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ．”Ｉｎ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．（ｅｄｓ．）Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ参照）。いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ量体モチーフは、野生型ＡＶＶのカプシドタンパク質における１２個の可変領域のうちの１つ以上における２つのアミノ酸の間に挿入され得る。いくつかの実施形態では、該１つ以上のｎ量体モチーフは各々、ＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＸ、ＶＲ－Ｘ、ＶＲ－ＸＩ、ＶＲ－ＸＩＩ、またはそれらの組み合わせにおける２つのアミノ酸の間に挿入され得る。いくつかの実施形態では、該ｎ量体は、カプシドタンパク質のＶＲ－ＩＩＩにおける２つのアミノ酸の間に挿入され得る。いくつかの実施形態では、該操作されたカプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸２６２と２６９の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸３２７と３３２の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸３８２と３８６の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸４５２と４６０の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸４８８と５０５の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸５４５と５５８の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸５８１と５９３の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸７０４と７１４の間の任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されたｎ量体を有し得る。いくつかの実施形態では、該操作されたカプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸５８８と５８９の間に挿入されたｎ量体を有し得る。いくつかの実施形態では、該操作されたカプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸５８８と５８９の間に挿入された７量体モチーフを有し得る。配列番号１は、少なくとも上記で論じられる挿入部位を参照するための参照ＡＡＶ９カプシド配列である。ｎ量体は、他の血清型のＡＡＶウイルスタンパク質における類似位置において挿入され得ることが理解されよう。いくつかの実施形態では、先に論じられているように、該ｎ量体（複数可）は、ＡＡＶウイルスタンパク質内の任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入することができ、いくつかの実施形態では、該挿入は、可変領域において行われる。
いくつかの実施形態では、ｎ量体モチーフの最初の１、２、３、または４つのアミノ酸は、それが挿入され、挿入位置に先行するポリペプチドの１、２、３、または４つのアミノ酸を置換することができる。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフが挿入されるポリペプチドの１つ以上のアミノ酸を置換するｎ量体モチーフのアミノ酸は、ｎ量体モチーフの「ＲＧＤ」の前または直前に挿入される。例として、例えば、表２～３に示される１０量体の挿入物の１つ以上では、示される最初の３つのアミノ酸は、それらが挿入され得るポリペプチド内の１～３のアミノ酸を置換することができる。別の非限定的な例としてＡＡＶを使用すると、該ｎ量体モチーフのうちの１つ以上は、例えば、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸５８８と５８９の間に挿入することができ、該挿入物は、アミノ酸５８６、５８７、及び５８８を置換することができ、挿入後の該ｎ量体モチーフの直前のアミノ酸は、残基５８５になる。この原理は、任意の他の挿入の状況に適用され得ること、及びこれが必ずしもＡＡＶ９のカプシドの残基５８８と５８９の間の挿入にも別のＡＡＶのカプシドの等価位置の挿入にも限定されないことが理解されよう。さらに、いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフが挿入されるポリペプチドにおいて、該ｎ量体モチーフによってアミノ酸が置換されないことも理解されよう。
配列番号１ ＡＡＶ９のカプシド参照配列。
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
いくつかの実施形態では、該ｎ量体は、アミノ酸であることができ、本明細書における表２～３、図１４Ｆ、及び／または実施例に示す任意のアミノ酸モチーフである場合もあれば、表２～３、図１４Ｆ、及び／または実施例に示す核酸によってコードされる場合もある。いくつかの実施形態では、ＡＡＶまたは他のウイルスのカプシドへの該ｎ量体の挿入により、本発明の細胞、組織、器官、特定の操作されたＡＡＶもしくは他のウイルスのカプシドまたは該ｎ量体モチーフもしくはカプシドタンパク質を含む他の組成物がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフを含む操作されたカプシドまたは他の組成物は、骨組織及び／または細胞、肺組織及び／または細胞、肝臓組織及び／または細胞、膀胱組織及び／または細胞、腎臓組織及び／または細胞、心臓組織及び／または細胞、骨格筋組織及び／または細胞、平滑筋及び／または細胞、ニューロン組織及び／または細胞、腸組織及び／または細胞、膵臓組織及び／または細胞、副腎組織及び／または細胞、脳組織及び／または細胞、腱組織または細胞、皮膚組織及び／または細胞、脾臓組織及び／または細胞、眼組織及び／または細胞、血球、滑液細胞、免疫細胞（特定のタイプの免疫細胞に対する特異性を含む）、ならびにそれらの組み合わせに対して特異性を有する。いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフを含む操作されたカプシドまたは他の組成物は、骨格筋組織及び／または細胞ならびに平滑筋組織及び／または細胞が挙げられるがこれらに限定されない筋細胞に対して特異性を有する。
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶのカプシドもしくは他のウイルスのカプシドまたは組成物は、筋特異的であり得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドもしくは他のウイルスのカプシドまたは他の組成物の筋特異性は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶもしくは他のウイルスのカプシドまたは他の組成物に組み込まれた筋特異的ｎ量体モチーフによって付与される。理論に拘束されることを意図するものではないが、該ｎ量体モチーフは、該操作されたＡＡＶのカプシドもしくは他のウイルスのカプシドまたは他の組成物のドメインまたは領域に、またはその中に３Ｄ構造を付与し、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドもしくは他のウイルスのカプシドまたは他の組成物を含むウイルス粒子または他の組成物の相互作用が、筋細胞の細胞表面受容体及び／または他の表面分子との相互作用を増大または改善する（例えば、親和性を増大する）と考えられる。いくつかの実施形態では、該細胞表面受容体は、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）である。いくつかの実施形態では、該細胞表面受容体は、筋細胞特異的ＡＡＶ受容体である。いくつかの実施形態では、該細胞表面受容体または他の分子は、筋細胞の表面で選択的に発現される細胞表面受容体または他の分子である。いくつかの実施形態では、該細胞表面受容体または分子は、インテグリンまたはそのダイマーである。いくつかの実施形態では、該細胞表面受容体または分子は、Ｖｂ６インテグリンヘテロダイマーである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋特異的カプシド、ｎ量体モチーフ、または筋特異的標的化部分を含む本明細書に記載の筋特異的な操作されたウイルス粒子または他の組成物は、他の細胞型及び／または他のウイルス粒子（ＡＡＶを含むがこれに限定されない）ならびに本発明の筋特異的ｎ量体モチーフを含まない他の組成物と比較して、筋細胞における取り込み、送達率、形質導入率、効率、量、またはそれらの組み合わせが改善され得る。
本明細書に同様に記載するのは、本明細書に記載の操作された筋特異的標的化部分または他の組成物（操作されたＡＡＶのカプシドを含むがこれに限定されない）をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、該操作されたポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載の操作されたウイルス粒子を生成するために使用され得るウイルスベクター系のウイルスゲノムドナーとなるように構成されるポリヌクレオチドに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載の操作されたＡＡＶ粒子を生成するために使用され得るＡＡＶベクター系のＡＡＶゲノムドナーとなるように構成されるポリヌクレオチドに含まれ得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドをコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化テールに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、該ポリアデニル化テールは、ＳＶ４０のポリアデニル化テールであり得る。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶのカプシドをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、該プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、該組織特異的プロモーターは、筋肉（例えば、心筋、骨格筋、及び／または平滑筋）、ニューロン及び支持細胞（例えば、星状膠細胞、グリア細胞、シュワン細胞等）、脂肪、脾臓、肝臓、腎臓、免疫細胞、髄液細胞、滑液細胞、皮膚細胞、軟骨、腱、結合組織、骨、膵臓、副腎、血球、骨髄細胞、胎盤、内皮細胞、ならびにそれらの組み合わせに特異的である。いくつかの実施形態では、該プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。適切な組織特異的プロモーター及び構成的プロモーターは、本明細書の他の箇所に論じられており、当技術分野では一般に知られており、商業的に利用可能であり得る。
適切な筋特異的プロモーターとしては、ＣＫ８、ＭＨＣＫ７、ミオグロビンプロモーター（Ｍｂ）、デスミンプロモーター、筋クレアチンキナーゼプロモーター（ＭＣＫ）及びそのバリアント、ならびにＳＰｃ５－１２合成プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な免疫細胞特異的プロモーターとしては、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞）、ＣＤ４３プロモーター（白血球及び血小板）、ＣＤ６８（マクロファージ）、及びＳＶ４０／ＣＤ４３プロモーター（白血球及び血小板）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な血球特異的プロモーターとしては、ＣＤ４３プロモーター（白血球及び血小板）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞）、ＩＮＦ－ベータ（造血細胞）、ＷＡＳＰプロモーター（造血細胞）、ＳＶ４０／ＣＤ４３プロモーター（白血球及び血小板）、及びＳＶ４０／ＣＤ４５プロモーター（造血細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な膵臓特異的プロモーターとしては、エラスターゼ－１プロモーターが挙げられるがこれに限定されない。
適切な内皮細胞特異的プロモーターとしては、Ｆｉｔ－１プロモーター及びＩＣＡＭ－２プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な神経組織／細胞特異的プロモーターとしては、ＧＦＡＰプロモーター（星状膠細胞）、ＳＹＮ１プロモーター（ニューロン）、及びＮＳＥ／ＲＵ５’（成熟神経細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な腎臓特異的プロモーターとしては、Ｎｐｈｓ１プロモーター（有足細胞）が挙げられるがこれに限定されない。
適切な骨特異的プロモーターとしては、ＯＧ－２プロモーター（骨芽細胞、象牙芽細胞）が挙げられるがこれに限定されない。
適切な肺特異的プロモーターとしては、ＳＰ－Ｂプロモーター（肺）が挙げられるがこれに限定されない。
適切な肝臓特異的プロモーターとしては、ＳＶ４０／Ａ１ｂプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。
適切な心臓特異的プロモーターとしては、アルファ－ＭＨＣが挙げられるがこれに限定されない。
適切な構成的プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＥＦ１アルファ、ＣＡＧ、及びベータ－アクチンが挙げられるがこれらに限定されない。
非筋細胞特異性が低下したＡＡＶ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｎ量体モチーフ（複数可）は、１つ以上の非筋細胞型に対する特異性が低下した（または検出可能な、測定可能な、もしくは臨床的に意義のある相互作用がない）ＡＡＶタンパク質（例えば、ＡＡＶのカプシドタンパク質）に挿入される。例示的な非筋細胞型としては、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、中枢または末梢神経系細胞、骨、免疫、胃、腸、目、皮膚細胞等が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該非筋細胞は、肝臓細胞である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶのカプシドタンパク質は、対応する野生型ＡＡＶのカプシドポリペプチドと比較して、非筋細胞における取り込みが低減または排除された、操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質である。
ある特定の例示的な実施形態では、該非筋細胞は、肝臓細胞である。
ある特定の例示的な実施形態では、該野生型のカプシドポリペプチドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質は、非筋細胞における取り込みが低減または排除される１つ以上の変異を含む。
ある特定の例示的な実施形態では、該１つ以上の変異は、ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の
ａ．２６７位、
ｂ．２６９位
ｃ．５０４位、
ｄ．５０５位、
ｅ．５９０位、
ｆ．もしくはそれらの任意の組み合わせにあるか、または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドでのそれに対応する１つ以上の位置にある。
ある特定の例示的な実施形態では、該非ＡＡＶ９のカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での変異は、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６９位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での変異は、ＳまたはＸのＴへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での変異は、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０５位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での変異は、ＰまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での変異は、ＱまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である。
ある特定の例示的な実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位、２６９位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、該２６７位での変異は、ＧからＡへの変異であり、該２６９位での変異は、ＳからＴへの変異である。
ある特定の例示的な実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、該５９０位での変異は、ＱからＡへの変異である。
ある特定の例示的な実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位、５０５位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、該５０４位での変異は、ＧからＡへの変異であり、該５０５位での変異は、ＰからＡへの変異である。
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフ（複数可）が挿入され得るＡＡＶのカプシドタンパク質は、参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／２１７９１１号に記載の配列番号４または配列番号５と、８０～１００（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、から／または１００）パーセント同一であり得る。これらの配列はまた、それぞれ、配列番号３３０及び３３１として本明細書に組み込まれる。これらのＡＡＶ９のカプシドタンパク質の肝臓特異性が低下したバリアントを考慮する場合、残基２６７及び／または２６９は、関連する変異または同等のものを含む必要があることが理解されよう。
配列番号３３０：
Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ
配列番号３３１
Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ
いくつかの実施形態では、該ｎ量体モチーフ（複数可）が挿入され得るＡＡＶのカプシドタンパク質は、非ＣＮＳ細胞、特に肝臓細胞に対する特異性が低下したＡｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．２０１４．５：３０７５，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４０７５）に記載のもののいずれかと、８０～１００（例えば、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、から／または１００）パーセント同一であり得る。Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．２０１４．５：３０７５，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４０７５）は、参照により、全体として表されているものとして本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、該修飾されたＡＡＶは、野生型ＡＡＶまたは対照と比較して、非筋肉に対する特異性が、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントまたは倍低下している可能性がある。いくつかの実施形態では、該修飾されたＡＡＶは、１つ以上の非筋細胞において、測定可能または検出可能な取り込み及び／または発現を有さない可能性がある。
操作されたＡＡＶのカプシドを生成する方法
同様に本明細書に提供するのは、操作されたＡＡＶのカプシドを生成する方法である。該操作されたＡＡＶのカプシドバリアントは、野生型ＡＡＶのカプシドのバリアントであり得る。図６～８は、本明細書に記載のバリアントのモチーフを有する操作されたＡＡＶのカプシドを生成することが可能な方法の様々な実施形態を説明することができる。一般に、ＡＡＶのカプシドライブラリは、適切なＡＡＶの産生細胞株において以前に記載された操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドを各々が含む操作されたカプシドベクターを発現することによって生成され得る。例えば、図８を参照されたい。図８は、ヘルパーによるＡＡＶ粒子産生の方法を示しているが、これは、ヘルパーを使用しない方法を介しても同様に行われ得ることが理解されよう。これにより、１つ以上の所望の細胞特異的な操作されたＡＡＶのカプシドバリアントを含み得るＡＡＶのカプシドのライブラリが生成され得る。図６に示すように、該ＡＡＶのカプシドライブラリは、第一回のｍＲＮＡベースの選択用に、様々な非ヒト動物に投与され得る。図１に示すように、ＡＡＶ及び関連するベクターによる形質導入プロセスにより、該細胞を形質導入したウイルスのゲノムを反映するｍＲＮＡ分子の産生がもたらされ得る。本明細書における実施例で少なくとも論じられるように、ｍＲＮＡベースの選択は、細胞を機能的に形質導入することが可能なウイルス粒子を決定するのにより特異的かつ有効であり得るが、その理由は、それが、ウイルスＤＮＡの存在を測定することによって該細胞におけるウイルス粒子の存在を単に検出することとは対照的に、産生された機能性生成物に基づいているからである。
第一回の投与後、所望のカプシドバリアントを有する１つ以上の操作されたＡＡＶウイルス粒子は次いで、フィルタリングされたＡＡＶのカプシドライブラリを形成するために使用され得る。所望のＡＡＶウイルス粒子は、該カプシドバリアントのｍＲＮＡ発現を測定し、どのバリアントが所望ではない細胞型（複数可）と比較して所望の細胞型（複数可）において高度に発現するかを決定することによって同定され得る。所望の細胞、組織、及び／または器官型で高度に発現するものが、所望のＡＡＶのカプシドバリアント粒子である。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶのカプシドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、該所望の細胞、組織、または器官において選択的活性を有する組織特異的プロモーターの制御下にある。
該第一回で同定された操作されたＡＡＶのカプシドバリアント粒子は次いで、様々な非ヒト動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、第二回の選択及び同定において使用される動物は、第一回の選択及び同定に使用された動物と同じではない。第一回と同様に、投与後、所望の細胞、組織、及び／または器官型（複数可）において最上位の発現バリアントが、該細胞におけるウイルスｍＲＮＡ発現を測定することによって同定され得る。第二回の後に同定された最上位のバリアントは次いで、任意にバーコード化され、任意にプールされ得る。いくつかの実施形態では、該第二回の最上位バリアントは次いで、特に該最上位バリアントの最終使用がヒトにおけるものである場合、該最上位の細胞特異的バリアント（複数可）を同定するために非ヒト霊長類に投与され得る。各回での投与は、全身性であり得る。
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶのカプシドバリアントを生成する方法は、以下のステップを含み得る：（ａ）細胞において操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のベクター系を発現させ、操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを産生するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）において産生された操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを採取するステップ、（ｃ）操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを１つ以上の第一の対象に投与するステップであって、該操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントは、細胞において操作されたＡＡＶのカプシドバリアントベクターまたはその系を発現させ、該細胞が産生した操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを採取することによって産生されるステップ、及び（ｄ）該１つ以上の第一の対象における１つ以上の特定の細胞または特定の細胞型によって有意に高いレベルで産生された１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシドバリアントを同定するステップ。これに関連して、「有意に高い」とは、１５ｃｍのディッシュあたり約２ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ベクターゲノムに及び得る力価を指すことができる。
該方法は、さらに、以下のステップを含み得る：（ｅ）ステップ（ｄ）において同定されたいくつかのまたはすべての操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを１つ以上の第二の対象に投与するステップ、及び（ｆ）該１つ以上の第二の対象における１つ以上の特定の細胞または特定の細胞型において有意に高いレベルで産生された１つ以上の操作されたＡＡＶウイルス粒子のカプシドバリアントを同定するステップ。ステップ（ａ）における細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）、ステップ（ｅ）、またはその両方における投与は、全身性である。いくつかの実施形態では、１つ以上の第一の対象、１つ以上の第二の対象、またはその両方は、非ヒト哺乳類である。いくつかの実施形態では、１つ以上の第一の対象、１つ以上の第二の対象、またはその両方は、各々独立して、野生型非ヒト哺乳類、ヒト化非ヒト哺乳類、疾患特異的非ヒト哺乳類モデル、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、該バリアントモチーフのさらなる最適化が行われ得る。いくつかの実施形態では、該第一及び／または第二世代のモチーフ（カプシドのＲＧＤ含有モチーフを含む）は、さらに、例えば、図１１に示すように、及び本明細書における実施例にさらに論じられるように、カプシドバリアントを最適化するために使用され得る。
本明細書に記載のポリヌクレオチド及びベクター系はまた、細胞に送達され得るカーゴ分子を含むように生成され得るウイルス粒子及び他の組成物を生成するためにも使用され得る。
操作されたベクター及びベクター系
同様に本明細書に提供するのは、操作されたウイルスポリヌクレオチド（例えば、操作されたＡＡＶポリヌクレオチド）が挙げられるがこれに限定されない１つ以上の本発明のｎ量体モチーフをコードすることができる本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドの１つ以上を含むことができるベクター及びベクター系である。いくつかの実施形態では、本発明のｎ量体モチーフをコードし得るポリヌクレオチド（複数可）は、表２～３、図１４に記載のいずれか、及び／または本明細書の他の箇所に記載のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、表２～３、図１４のいずれかに記載の、及び／または本明細書の他の箇所に記載の任意のｎ量体モチーフをコードし得る。この状況で使用される場合、操作されたウイルスのカプシドポリヌクレオチドとは、本明細書の他の箇所に記載の操作されたウイルスのカプシドをコードすることが可能な本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つ以上及び／または本明細書の他の箇所に記載の１つ以上の操作されたウイルスのカプシドタンパク質をコードすることが可能なポリヌクレオチド（複数可）を指す。さらに、該ベクターが、本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドポリヌクレオチドを含む場合、該ベクターは、特にそのように言及されていない場合であっても、操作されたベクターまたはその系もまた指すこと及び考慮することができる。実施形態では、該ベクターは、本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシドの１つ以上の要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。該ベクター及びその系は、本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシド、粒子、または他の組成物の１つ以上の成分を発現し得る細菌、真菌、酵母、植物細胞、動物細胞、及びトランスジェニック動物の産生に有用であり得る。本開示の範囲に含まれるのは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含むベクターである。本明細書に記載の操作されたウイルスのカプシド及びその系の一部であるポリヌクレオチドの１つ以上は、ベクターまたはベクター系に含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、３’ポリアデニル化シグナルを有する操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該３’ポリアデニル化は、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態では、該ベクターは、スプライス制御要素を有さない。いくつかの実施形態では、該ベクターは、１つ以上の最低限のスプライス制御要素を含む。いくつかの実施形態では、該ベクターは、さらに、修飾されたスプライス制御要素を含むことができ、該修飾により、該スプライス制御要素が不活化される。いくつかの実施形態では、該修飾されたスプライス制御要素は、スプライシングを、ｒｅｐタンパク質ポリヌクレオチドと該操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシドタンパク質バリアントポリヌクレオチドの間で誘導するために十分なポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、該スプライシングを誘導するのに十分であり得るポリヌクレオチド配列は、スプライスアクセプターまたはスプライスドナーである。いくつかの実施形態では、該ウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載の操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該ベクターは、１つ以上の最低限のスプライス制御要素、修飾されたスプライス制御要素、スプライスアクセプター、及び／またはスプライスドナーを含まない。
該ベクター及び／またはベクター系を使用して、例えば、産生細胞等の細胞において、１つ以上の該操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド及び／または他のポリヌクレオチドを発現させ、本明細書の他の箇所に記載の本発明のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシドまたは他の組成物を含む操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドまたは他の組成物を含む操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子及び／または他の組成物（例えば、ポリペプチド、粒子等）を産生することができる。本明細書に記載のベクター及びベクター系の他の使用もまた、本開示の範囲内に含まれる。一般に、及び本明細書を通して、該用語は、ある環境から別の環境への実体の移動を可能にするまたは促進するツールである。当業者によって理解されるいくつかの状況では、「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すための当技術分野の用語であり得る。ベクターは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得るプラスミド、ファージ、またはコスミド等のレプリコンであり得る。通常、ベクターは、適切な制御要素に関連している場合、複製が可能である。
ベクターとしては、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子、１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、及び当技術分野で知られている他の類型のポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術等によって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのベクターに存在する。ウイルスベクターにはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドが含まれる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組み換えＤＮＡ技術において実用性のある一般的な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。
組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）から構成され得る。これは、該組み換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の制御要素を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」及び「作動可能なように連結された」は、本明細書では互換的に使用され、本明細書の他の箇所でさらに定義される。ベクターという状況において、用語「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてまたはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御要素（複数可）に連結されることを意味することが意図されている。有利なベクターには、アデノ随伴ウイルスが含まれ、かかるベクター型は、特定の細胞型、例えば、所望の細胞特異的指向性を有する操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシドポリヌクレオチドを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを標的とするために選択することもできる。該ベクター及びベクター系のこれら及び他の実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、バイシストロニックベクターであり得る。いくつかの実施形態では、バイシストロニックベクターは、本明細書に記載の１つ以上の操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系の要素に使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系の要素の発現は、適切な構成的または組織特異的プロモーターによって駆動され得る。該操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシド系の要素がＲＮＡである場合、その発現は、Ｕ６プロモーター等のＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、その２つが組み合わされる。
細胞ベースのベクター増幅及び発現
ベクターは、適切な宿主細胞における本明細書に記載の本発明のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシド系または他の組成物の１つ以上の要素（例えば、核酸転写物、タンパク質、酵素、及びそれらの組み合わせ）の発現用にデザインされ得る。いくつかの実施形態では、該適切な宿主細胞は、原核細胞である。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターは、ウイルスベースでも非ウイルスベースでもよい。いくつかの実施形態では、該適切な宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、該適切な宿主細胞は、適切な細菌細胞である。適切な細菌細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種の細菌からの細菌細胞が挙げられるがこれに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉの多くの適切な株が、ベクターの発現のために当技術分野で知られている。これらとしては、Ｐｉｒ１、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、Ｓｔｂｌ４、ＴＯＰ１０、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、及びＸＬ１０ Ｇｏｌｄが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該宿主細胞は、適切な昆虫細胞である。適切な昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからのものが挙げられる。Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の適切な株としては、Ｓｆ９及びＳｆ２１が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該宿主細胞は、適切な酵母細胞である。いくつかの実施形態では、該酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのものであり得る。いくつかの実施形態では、該宿主細胞は、適切な哺乳類細胞である。多くの哺乳類細胞型がベクターを発現させるために開発されてきた。適切な哺乳類細胞としては、ＨＥＫ２９３、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞、ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、ＣＡＤ、Ｐ１９、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｎ２ａ、ＭＣＦ－７、Ｙ７９、ＳＯ－Ｒｂ５０、ＨｅｐＧ Ｇ２、ＤＩＫＸ－Ｘ１１、Ｊ５５８Ｌ、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、及びニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに論じられている。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、酵母発現ベクターであり得る。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。本明細書で使用される、「酵母発現ベクター」とは、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含むとともに、該核酸（複数可）の発現を制御する任意の所望の要素、ならびに該酵母細胞内で該発現ベクターの複製及び維持を可能にする任意の要素をさらに含み得る核酸を指す。多くの適切な酵母発現ベクター及びその特徴は、当技術分野で知られている。例えば、様々なベクター及び技術は、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に示されている。酵母ベクターは、これらに限定されないが、動原体（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター等のプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター等のターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求性、抗生、または他の選択マーカー）を含み得る。酵母で使用するための発現ベクターの例としては、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組み込み型プラスミド、酵母複製型プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドが挙げられ得る。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、バキュロウイルスベクターまたは発現ベクターであり、昆虫細胞におけるポリヌクレオチド及び／またはタンパク質の発現に適切であり得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる。ｒＡＡＶ（組み換えアデノ随伴ウイルス）ベクターは好ましくは、昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞において産生され、無血清浮遊培養で増殖する。無血清昆虫細胞は、商業的ベンダー、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる（ＥＸ－ＣＥＬＬ ４０５）。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、哺乳類発現ベクターである。いくつかの実施形態では、該哺乳類発現ベクターは、哺乳類細胞において１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを発現させることが可能である。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が挙げられるがこれらに限定されない。該哺乳類発現ベクターは、哺乳類細胞において１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはタンパク質の発現を制御することが可能な１つ以上の適切な制御要素を含み得る。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示し、当技術分野で知られている他のものに由来する。適切な制御要素に関するさらなる詳細は、本明細書の他の箇所に記載されている。
原核細胞及び真核細胞の両方のための他の適切な発現ベクター及びベクター系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９のチャプター１６及び１７を参照されたい。
いくつかの実施形態では、該組み換え哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することが可能である（例えば、組織特異的制御要素が核酸を発現させるために使用される）。組織特異的制御要素は、当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０、Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター、米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達学的に調節されているプロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。これらの原核細胞及び真核細胞ベクターに関しては、その内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，７５０，０５９号に言及されている。他の実施形態は、その点に関して、その内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／０９２，０８５号に言及されているウイルスベクターを利用することができる。組織特異的制御要素は、当技術分野で知られており、この点に関して、その内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，７７６，３２１号に言及されている。いくつかの実施形態では、制御要素は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の要素に作動可能に連結され、該操作されたＡＡＶのカプシド系の該１つ以上の要素の発現を駆動することができる。
ベクターを、原核生物または原核細胞に導入し増殖させてもよい。いくつかの実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するために、または真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクターとして使用される（例えば、ウイルスベクターのパッケージング系の一部としてプラスミドを増幅させる）。いくつかの実施形態では、原核生物は、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するように、ベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させるために使用される。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、融合ベクターでも融合発現ベクターでもよい。いくつかの実施形態では、融合ベクターは、多数のアミノ酸を、そこでコードされるタンパク質に、例えば、組み換えタンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方に付加する。かかる融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば、（ｉ）組み換えタンパク質の発現を増加させ、（ｉｉ）組み換えタンパク質の溶解性を増加させ、及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって組み換えタンパク質の精製を補助する目的を果たす。いくつかの実施形態では、原核生物におけるポリヌクレオチド（ノンコーディングポリヌクレオチド等）及びタンパク質の発現は、融合または非融合ポリヌクレオチド及び／またはタンパク質のいずれかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて行われ得る。いくつかの実施形態では、該融合発現ベクターは、該融合ベクターの骨格または他の融合部分及び該組み換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の接合点で導入され得るタンパク質分解切断部位を含むことで、該融合ポリヌクレオチドまたはタンパク質の精製の後に融合ベクター骨格または他の融合部位からの組み換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の分離を可能にし得る。かかる酵素、及びそれらの同種認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが挙げられる。例示的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組み換えタンパク質に融合させる。適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された送達系の要素の発現が、本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物（本明細書の他の箇所により詳細に記載されている操作された遺伝子導入剤粒子が挙げられるがこれに限定されない）の生成を指示するように、本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物の１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターが宿主細胞に導入される。例えば、本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物の異なる要素は、別々のベクターの別々の制御要素に各々作動可能に連結され得る。本明細書に記載の操作された送達系の異なる要素のＲＮＡ（複数可）は、動物もしくは哺乳類またはその細胞に送達され、本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物の異なる要素を構成的に、または誘導的に、または条件付きで発現し、本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物の１つ以上の要素を組み込むか、あるいは本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシド系または他の組成物の１つ以上の要素を組み込み、及び／またはそれを発現する１つ以上の細胞を含む動物もしくは哺乳類またはその細胞を産生することができる。
いくつかの実施形態では、同じまたは異なる制御要素（複数可）から発現される要素の２つ以上は、第一のベクターに含まれない系の任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターと、単一のベクターにおいて組み合わされ得る。単一のベクターにおいて組み合わされる本発明の操作されたポリヌクレオチドは、任意の適切な配向で配置されてもよく、例えば、１つの要素は第二の要素に対して５’（「上流」）に位置しても３’（「下流」）に位置してもよい。１つの要素のコーディング配列は、第二の要素のコーディング配列と同じ鎖に位置しても反対の鎖に位置してもよく、同じ方向に配向されても反対の方向に配向されてもよい。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターは、１つ以上のイントロン配列に埋め込まれた本明細書に記載のｎ量体モチーフを含む操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドタンパク質または他の組成物の１つ以上（例えば、各々が異なるイントロンに含まれるか、２つ以上が少なくとも１つのイントロンに含まれるか、またはすべてが単一のイントロンに含まれる）をコードする転写物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、本発明の操作されたポリヌクレオチド（操作されたウイルスのポリヌクレオチドが挙げられるがこれに限定されない）は、同じプロモーターに作動可能に連結され、それから発現され得る。
ベクターの特徴
該ベクターは、該ベクター、送達されるポリヌクレオチド、それから生成されるウイルス粒子、またはそれから発現するポリペプチドに１つ以上の機能を付与し得る追加の特徴を含み得る。かかる特徴としては、制御要素、選択マーカー、分子識別子（例えば、分子バーコード）、安定化要素等が挙げられるがこれらに限定されない。当業者には、該発現ベクター及び含まれる追加の特徴のデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベル等の要素に依存し得ることが理解されよう。
制御要素
実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／またはそのベクター（本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）は、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る１つ以上の制御要素を含み得る。用語「制御要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列）を含むことが意図されている。かかる制御要素は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御要素には、多くの宿主細胞型においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの及びある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現を指示し得る。制御要素はまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的または発達段階依存的に発現を指示する場合があり、これは組織または細胞型特異的である場合もない場合もある。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、Ｕ６及びＨ１プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。同様に用語「制御要素」に包含されるのは、エンハンサー要素、例えば、ＷＰＲＥ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）、ＳＶ４０エンハンサー、及びウサギβ－グロビンのエクソン２と３の間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）である。
いくつかの実施形態では、該制御配列は、その内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，７７６，３２１号、米国特許公開第２０１１／００２７２３９号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０２８９２９号に記載されている制御配列であり得る。いくつかの実施形態では、該ベクターは、最小プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、該最小プロモーターは、Ｍｅｃｐ２プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、またはＵ６である。さらなる実施形態では、該最小プロモーターは、組織特異的である。いくつかの実施形態では、該ベクターポリヌクレオチドの最小プロモーター及びポリヌクレオチド配列の長さは、４．４Ｋｂ未満である。
ポリヌクレオチドを発現させるため、該ベクターは、細胞における遺伝子の転写及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を指示する１つ以上の転写及び／または翻訳開始制御配列、例えば、プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが用いられ得る。哺乳類細胞に適切な構成的プロモーターは、当技術分野で一般に知られており、ＳＶ４０、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、β－アクチン、ＲＳＶ、及びＰＧＫを含むがこれらに限定されない。細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞に適切な構成的プロモーター、例えば、細菌発現用のＴ－７プロモーター及び酵母における発現用のアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターが、当技術分野で一般に知られている。
いくつかの実施形態では、該制御要素は、制御されたプロモーターであり得る。「制御されたプロモーター」とは、構成的ではなく、時間的及び／または空間的に制御された様式で遺伝子発現を指示するプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、該制御されたプロモーターは、本明細書の他の箇所で先に論じられている組織特異的プロモーターである。制御されたプロモーターには、条件付きプロモーター及び誘導性プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、条件付きプロモーターは、ある特定の環境条件下で、及び／または発達の特定状態の間に、特定の細胞型でポリヌクレオチドの発現を指示するために用いられ得る。適切な組織特異的プロモーターとしては、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＡＰＯＡ２、ＳＥＲＰＩＮ Ａ１（ｈＡＡＴ）、ＣＹＰ３Ａ４、及びＭＩＲ１２２）、膵臓細胞プロモーター（例えば、ＩＮＳ、ＩＲＳ２、Ｐｄｘ１、Ａｌｘ３、Ｐｐｙ）、心臓特異的プロモーター（例えば、Ｍｙｈ６（アルファＭＨＣ）、ＭＹＬ２（ＭＬＣ－２ｖ）、ＴＮＩ３（ｃＴｎｌ）、ＮＰＰＡ（ＡＮＦ）、Ｓｌｃ８ａ１（Ｎｃｘ１））、中枢神経系細胞プロモーター（ＳＹＮ１、ＧＦＡＰ、ＩＮＡ、ＮＥＳ、ＭＯＢＰ、ＭＢＰ、ＴＨ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３ベータ））、皮膚細胞特異的プロモーター（例えば、ＦＬＧ、Ｋ１４、ＴＧＭ３）、免疫細胞特異的プロモーター、（例えば、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター）、泌尿生殖器細胞特異的プロモーター（例えば、Ｐｂｓｎ、Ｕｐｋ２、Ｓｂｐ、Ｆｅｒ１ｌ４）、内皮細胞特異的プロモーター（例えば、ＥＮＧ）、多能性及び胚胚芽層細胞特異的プロモーター（例えば、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、合成Ｏｃｔ４、Ｔブラキウリ、ＮＥＳ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＭＩＲ１２２）、ならびに筋細胞特異的プロモーター（例えば、デスミン）を挙げることができるがこれらに限定されない。他の組織及び／または細胞特異的プロモーターは、本明細書の他の箇所で論じられており、当技術分野で一般に知られ得るものであり、本開示の範囲内である。
誘導性／条件付きプロモーターは、正の誘導性／条件付きプロモーター（例えば、活性化された活性化因子、または誘導因子（化合物、環境条件、もしくは他の刺激）との適切な相互作用によりポリヌクレオチドの転写を活性化するプロモーター、または負の／条件付き誘導性プロモーター（例えば、プロモーターのリプレッサー条件が除かれるまで抑制される（例えば、リプレッサーによって結合した）プロモーター（例えば、誘導因子は、プロモーターに結合したリプレッサーに結合し、リプレッサーによるプロモーターの解放またはプロモーター環境から化学的リプレッサーの除去を刺激する）であり得る。該誘導因子は、化合物、環境条件、または他の刺激であり得る。したがって、誘導性／条件付きプロモーターは、任意の適切な刺激、例えば、化学的、生物学的、または他の分子物質、温度、光、及び／またはｐＨに対して反応性であり得る。適切な誘導性／条件付きプロモーターとしては、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃプロモーター、ｐＢａｄ、ＡｌｃＡ、ＬｅｘＡ、Ｈｓｐ７０プロモーター、Ｈｓｐ９０プロモーター、ｐＤａｗｎ、ＸＶＥ／ＯｌｅｘＡ、ＧＶＧ、及びｐＯｐ／ＬｈＧＲが挙げられるがこれらに限定されない。
植物細胞における発現が所望される場合、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の成分は典型的には、植物プロモーター、すなわち、植物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なるタイプのプロモーターの使用が想定される。いくつかの実施形態では、植物における操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシド系ベクターの包含は、ウイルスベクターの産生目的のためのものであり得る。
構成的植物プロモーターは、すべてのまたはほぼすべての植物組織において該植物のすべてのまたはほぼすべての発達段階の間に、それが制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現（「構成的発現」と称される）させることができるプロモーターである。構成的プロモーターの１つの非限定的な例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または異なる発達段階における、または異なる環境条件に反応して遺伝子の発現を指示し得る。特定の実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシド系の成分の１つ以上は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等の構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的プロモーターは、特定の植物組織内のある特定の細胞型、例えば、葉もしくは根における維管束細胞または種子の特定の細胞における発現の向上を標的とするために利用され得る。本発明の操作されたＡＡＶのカプシド系及び他の組成物において使用するための具体的なプロモーターの例は、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５、Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２、及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１に見出される。
誘導性であり、遺伝子編集または遺伝子発現の時空制御を可能にし得るプロモーターの例としては、エネルギー形態を使用し得る。エネルギー形態には、音エネルギー、電磁波放射、化学エネルギー及び／または熱エネルギーが挙げられ得るがこれらに限定されない。誘導系の例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－ＯｎもしくはＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、または光誘導系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、もしくはクリプトクロム）、例えば、配列特異的に転写活性の変化を指示する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。光誘導系の成分は、本明細書に記載の本発明の操作されたＡＡＶのカプシド系または他の組成物の１つ以上の要素、光応答性シトクロムヘテロダイマー（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、該ベクターは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０１８４２３号及び米国公開第２０１５／０２９１９６６号、第２０１７／０１６６９０３号、第２０１９／０２０３２１２号に提供される誘導性ＤＮＡ結合タンパク質の１つ以上を含むことができ、これらには、例えば、誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及び使用方法の実施形態が記載されており、本発明での使用に適応され得る。
いくつかの実施形態では、一過性または誘導性発現は、例えば、化学的に制御されたプロモーターを含めることによって達成され得る、すなわち、外因性化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する。遺伝子発現の調節はまた、化学的抑制性プロモーターを含めることによって得ることができ、この場合、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する。化学的誘導性プロモーターとしては、ベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤によって活性化されるトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ｌｌ－２７、ＷＯ９３／０１２９４）、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１プロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が挙げられるがこれらに限定されない。抗生物質によって制御されるプロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７、米国特許第５，８１４，６１８号及び第５，７８９，１５６号）も本明細書で同様に使用され得る。
いくつかの実施形態では、該ベクターまたはその系は、特定の細胞成分または細胞小器官に／において本発明の操作されたポリヌクレオチド（例えば、操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド）を移行及び／または発現させることが可能な１つ以上の要素を含み得る。かかる細胞小器官としては、核、リボソーム、小胞体、ゴルジ装置、葉緑体、ミトコンドリア、空胞、リソソーム、細胞骨格、細胞膜、細胞壁、ペルオキシソーム、中心小体等を挙げることができるがこれらに限定されない。
選択マーカー及びタグ
本発明の操作されたポリヌクレオチド（例えば、操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド）の１つ以上は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る選択マーカーまたはタグをコードするまたは該選択マーカーまたはタグであるポリヌクレオチドに作動可能に連結され、それに融合され、または他の方法でそれを含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、該ポリペプチド選択マーカーをコードするポリペプチドは、該選択マーカーポリペプチドが、翻訳された場合に、操作されたポリペプチド（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリペプチド）のＮ末端及びＣ末端の間の２つのアミノ酸の間に、または該操作されたポリペプチド（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリペプチド）のＮ末端及び／またはＣ末端に挿入されるように、本発明の操作されたポリヌクレオチド（例えば、操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド）に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、該選択マーカーまたはタグは、ポリヌクレオチドバーコードまたは固有の分子識別子（ＵＭＩ）である。
かかる選択マーカーまたはタグをコードするポリヌクレオチドは、選択マーカーまたはタグの発現を可能にするための適切な様式で本明細書に記載の操作されたＡＶＶのカプシド系の１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチドに組み込まれ得ることが理解されよう。かかる技術及び方法は、本明細書の他の箇所に記載されており、本開示の観点から当業者にはすぐに理解されよう。多くのかかる選択マーカー及びタグは、当技術分野で一般に知られており、本開示の範囲内であることが意図される。
適切な選択マーカー及びタグとしては、親和性タグ、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、可溶化タグ、例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）、ＭＢＰ、及びＧＳＴ、クロマトグラフィータグ、例えば、ポリアニオン性アミノ酸からなるもの、例えば、ＦＬＡＧタグ、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＮＥタグ、特定の酵素修飾（例えば、ビオチンリガーゼによるビオチン化）または化学修飾（例えば、蛍光画像のためのＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２との反応）を可能にし得るタンパク質タグ、制限酵素または他の酵素切断部位を含むＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント、スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、バスタ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））等の抗生物質を含む別の毒性化合物に対する抵抗性を提供する産物をコードするＤＮＡセグメント、レシピエント細胞において別段に欠いている産物をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）、容易に同定され得る産物をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント（例えば、表現型マーカー、例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、及び細胞表面タンパク質）、ＰＣＲのための１つ以上の新たなプライマー部位を生成し得るポリヌクレオチド（例えば、以前には並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ修飾酵素、化学物質等によって作用しないまたは作用するＤＮＡ配列、エピトープタグ（例えば、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ及びＨｉｓタグ）、ならびに、分子バーコードまたは固有の分子識別子（ＵＭＩ）を生成するＤＮＡ配列、その同定を可能にする特定の修飾（例えば、メチル化）に必要とされるＤＮＡ配列が挙げられるがこれらに限定されない。他の適切なマーカーは、当業者には理解されよう。
選択マーカー及びタグは、ＧＳまたはＧＧほどの短いものから（ＧＧＧＧＧ）３（配列番号３４）または（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３５）までのグリシンまたはグリシンセリンリンカー等の適切なリンカーを介して本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系もしくは他の組成物及び／または系の１つ以上の成分に作動可能に連結され得る。他の適切なリンカーは、本明細書の他の箇所に記載されている。
該ベクターまたはベクター系は、１つ以上の標的化部分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該標的化部分をコードするポリヌクレオチドは、該ウイルス粒子が特定の細胞、組織、器官等に標的化され得るように、それらが、産生されたウイルス粒子（複数可）内で及び／またはその上で発現されるように、該ベクターまたはベクター系、例えば、ウイルスベクター系に含まれ得る。いくつかの実施形態では、該標的化部分をコードするポリヌクレオチドは、本発明の操作されたポリヌクレオチド（複数可）（例えば、操作されたウイルス（例えば、ＡＶＶ）のカプシドポリヌクレオチド（複数可））及び／またはそれから発現される生成物が、該標的化部分を含み、特定の細胞、組織、器官等に標的化され得るように、該ベクターまたはベクター系に含まれ得る。いくつかの実施形態、例えば、非ウイルス担体等では、該標的化部分は、該担体（例えば、ポリマー、脂質、無機粒子等）に結合することができ、該担体及び任意の結合されたまたは関連する本発明の操作されたポリヌクレオチド（複数可）、本明細書に記載の本発明の操作されたポリペプチド、または他の組成物の特定の細胞、組織、器官等への標的化が可能であり得る。いくつかの実施形態では、該特定の細胞は、筋細胞である。
無細胞ベクター及びポリヌクレオチド発現
いくつかの実施形態では、本発明のｎ量体モチーフをコードするポリヌクレオチドは、無細胞インビトロ系においてベクターまたは適切なポリヌクレオチドから発現され得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の特徴をコードするポリヌクレオチドは、無細胞インビトロ系においてベクターまたは適切なポリヌクレオチドから発現され得る。換言すれば、該ポリヌクレオチドは、インビトロで転写され、任意に翻訳され得る。インビトロ転写／翻訳系及び適切なベクターは、当技術分野で一般に知られており、市販されている。通常、インビトロ転写及びインビトロ翻訳系は、それぞれ、細胞環境外でＲＮＡ及びタンパク質合成のプロセスを再現する。インビトロ転写のためのベクター及び適切なポリヌクレオチドとしては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３、ポリヌクレオチドまたはベクターを転写するために適切なポリメラーゼによって認識され、作用し得るプロモーター制御配列が挙げられ得る。
インビトロ翻訳は、独立型（例えば、精製されたポリリボヌクレオチドの翻訳）の場合もあれば、転写に連結／結合される場合もある。いくつかの実施形態では、該無細胞（またはインビトロ）翻訳系は、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、及び／またはＥ．ｃｏｌｉからの抽出物を含み得る。該抽出物は、外因性ＲＮＡの翻訳に必要な様々な高分子成分（例えば、７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ、シンターゼ、開始、延長因子、終結因子等）を含み得る。アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（クレアチンホスフェート及びクレアチンホスホキナーゼ（真核細胞系））（細菌系のためのピルビン酸ホスホエノール及びピルビン酸キナーゼ）、ならびに他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋等）が挙げられるがこれらに限定されない他の成分を翻訳反応中に含めても追加してもよい。前述したように、インビトロ翻訳は、ＲＮＡ出発物質に基づく場合もＤＮＡ出発物質に基づく場合もある。いくつかの翻訳系は、出発物質としてＲＮＡ鋳型を利用し得る（例えば、網状赤血球溶血液及び小麦胚芽抽出物）。いくつかの翻訳系は、出発物質としてＤＮＡ鋳型を利用し得る（例えば、Ｅ ｃｏｌｉベースの系）。これらの系では、転写及び翻訳は連動され、最初にＤＮＡがＲＮＡに転写され、これがその後翻訳される。適切な標準的で連動した無細胞翻訳系は当技術分野で一般に知られており、商業的に利用可能である。
ベクターポリヌクレオチドのコドン最適化
本明細書の他の箇所に記載の通り、本明細書に記載の本発明のｎ量体モチーフ及び／または他のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系のポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、ｎ量体モチーフをコードする任意にコドン最適化されたポリヌクレオチドに加えて、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の実施形態が挙げられるがこれに限定されない、本明細書に記載のベクターに含まれる１つ以上のポリヌクレオチド（「ベクターポリヌクレオチド」）がコドン最適化され得る。通常、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しつつ、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれより多く、またはそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって目的の宿主細胞における発現の向上のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用頻度の差異）はしばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、ひいては、とりわけ、翻訳されているコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は通常、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な“Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ”で容易に利用可能であり、これらの表は多数の方法で適応され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も利用可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質のコーディング配列における１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン使用頻度に関して、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、またはＣｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２ Ｍａｒ ２５；２５７（６）：３０２６－３１が参照される。藻類を含む植物におけるコドン使用頻度に関しては、Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ，ａｎｄ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０ Ｊａｎ；９２（１）：１－１１．、及びＣｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ，Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９ Ｊａｎ ２５；１７（２）：４７７－９８、またはＳｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙａｎｅｌｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ ＢＲ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９８ Ａｐｒ；４６（４）：４４９－５９が参照される。
該ベクターポリヌクレオチドは、特定の細胞型、組織型、器官型、及び／または対象型における発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、真核生物、例えば、ヒトにおける発現のために（すなわち、ヒトまたはヒト細胞における発現のために最適化されている）、または本明細書の他の箇所に記載の別の動物（例えば、哺乳類または鳥類）等の別の真核生物のために最適化された配列である。かかるコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、特定の細胞型のために最適化されたコドンである。かかる細胞型としては、上皮細胞（皮膚細胞、胃腸管を覆う細胞、他の中空器官を覆う細胞を含む）、神経細胞（神経、脳細胞、脊柱細胞、神経支持細胞（例えば、星状膠細胞、グリア細胞、シュワン細胞等）、筋肉細胞（例えば、心筋、平滑筋細胞、及び骨格筋細胞）、結合組織細胞（脂肪及び他の軟部組織充填細胞、骨細胞、腱細胞、軟骨細胞）、血球、幹細胞及び他の前駆細胞、免疫系細胞、胚細胞、ならびにそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。かかるコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、特定の組織型のために最適化されたコドンである。かかる組織型としては、筋肉組織、結合組織、結合組織、神経組織、及び上皮組織を挙げることができるがこれらに限定されない。かかるコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、特定の器官のために最適化されたコドンである。かかる器官としては、筋肉、皮膚、腸、肝臓、脾臓、脳、肺、胃、心臓、腎臓、胆嚢、膵臓、膀胱、甲状腺、骨、血管、血液、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。かかるコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ベクターポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。該真核細胞は、ヒト、または本明細書で論じられる非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、もしくは非ヒト哺乳類もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない特定の生物、例えば、植物もしくは哺乳類のものでもそれに由来するものでもよい。
非ウイルスベクター及び担体
いくつかの実施形態では、該ベクターは、非ウイルスベクターまたは担体である。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ウイルスベクターと比較して減少した毒性及び／または免疫原性及び／または増加したバイオセイフティーの利点（複数可）を有し得る。「非ウイルスベクター及び担体」という専門用語は、この状況において本明細書で使用される場合、本明細書に記載の本発明の操作されたカプシドポリヌクレオチド（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド）または他の組成物に結合し、それを組み込み、それに連結し、及び／または他の方法で相互作用することが可能であり得るとともに、該ポリヌクレオチドを細胞に運ぶこと及び／または該ポリヌクレオチドを発現することが可能であり得る、ウイルスまたはウイルスゲノムの１つ以上の成分（非ウイルスベクターによって送達及び／または発現される任意のヌクレオチドを除外する）に基づいていない分子及び／または組成物を指す。これは、送達されるウイルスベースのポリヌクレオチドの包含を排除しないことが理解されよう。例えば、送達されるｇＲＮＡがウイルス成分に対して仕向けられ、それが他の非ウイルスベクターまたは担体に挿入され、または他の方法で連結される場合、かかるベクターを「ウイルスベクター」とはしない。非ウイルスベクター及び担体としては、むき出しのポリヌクレオチド、化学ベースの担体、ポリヌクレオチド（非ウイルス）ベースのベクター、及び粒子ベースの担体が挙げられる。用語「ベクター」は、非ウイルスベクター及び担体の状況で使用される場合、ポリヌクレオチドベクターを指し、この状況で使用される「担体」は、送達されるポリヌクレオチド、例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドに結合され、または他の方法で相互作用する非核酸またはポリヌクレオチド分子または組成物を指すことが理解されよう。
むき出しのポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書の他の箇所に記載されている本発明の１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドは、むき出しのポリヌクレオチドに含まれ得る。本明細書で使用される「むき出しのポリヌクレオチド」という専門用語は、しばしば環境因子及び／または分解から保護することを補助し得る別の分子（例えば、タンパク質、脂質、及び／または他の分子）に関連していないポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される、～に関連するとは、～に連結する、～に接着する、～に吸着される、～に封入される、～にまたは内に封入される、～と混合される等が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載の本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの１つ以上を含むむき出しのポリヌクレオチドは、宿主細胞に直接送達され、任意にそこで発現し得る。該むき出しのポリヌクレオチドは、任意の適切な二次元及び三次元構造を有し得る。非限定的な例として、むき出しのポリヌクレオチドは、一本鎖分子、二本鎖分子、環状分子（例えば、プラスミド及び人工染色体）、一本鎖の部分及び二本鎖の部分を含む分子（例えば、リボザイム）等であり得る。いくつかの実施形態では、該むき出しのポリヌクレオチドは、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）または他のポリヌクレオチドのみを含む。いくつかの実施形態では、該むき出しのポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載されている本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）または他のポリヌクレオチドに加えて他の核酸及び／またはポリヌクレオチドを含み得る。該むき出しのポリヌクレオチドは、１つ以上のトランスポゾン系の要素を含み得る。トランスポゾン及びその系は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。
非ウイルスポリヌクレオチドベクター
いくつかの実施形態では、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドの１つ以上は、非ウイルスポリヌクレオチドベクターに含まれ得る。適切な非ウイルスポリヌクレオチドベクターとしては、トランスポゾンベクター及びベクター系、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ＡＲ（抗生物質耐性）フリープラスミド及びミニプラスミド、環状共有結合閉鎖ベクター（例えば、ミニサークル、ミニベクター、ミニノット）、線状共有結合閉鎖ベクター（「ダンベル形状」）、ＭＩＤＧＥ（最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）ベクター、ＭｉＬＶ（マイクロ線状ベクター）ベクター、ミニストリング、ミニイントロンプラスミド、ＰＳＫ系（分離後殺傷系）、ＯＲＴ（オペレーターリプレッサータイトレーション）プラスミド等が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｈａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｇｅｎｅｓ．８（２）：６５を参照されたい。
いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、条件付き複製起点を有し得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、ＯＲＴプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現を有し得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、１つ以上の分離後殺傷系遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、ＡＲフリーである。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、ミニベクターである。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、１つ以上のＣｐＧモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、１つ以上の骨格／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）を含み得る。例えば、Ｍｉｒｋｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８４．Ｃｅｌｌ．３９：２２３－２３２，Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．８９：１１３－１５２を参照されたい。この技術及びベクターは、本発明において使用するために適応され得る。Ｓ／ＭＡＲは、核マトリックスへのＤＮＡループ塩基の結合を介して染色体の空間的組織化において役割を果たすＡＴリッチ配列である。Ｓ／ＭＡＲはしばしば、プロモーター、エンハンサー、及びＤＮＡ複製起点等の制御要素の近くに見られる。１またはＳ／ＭＡＲの包含は、細胞周期あたり１回の複製を容易化して、娘細胞において該非ウイルスポリヌクレオチドベクターをエピソームとして維持し得る。実施形態では、該Ｓ／ＭＡＲ配列は、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターに含まれる活性的に転写されるポリヌクレオチド（例えば、１つ以上の本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドもしくは他のポリヌクレオチドまたは分子）の下流に位置する。いくつかの実施形態では、該Ｓ／ＭＡＲは、ベータ－インターフェロン遺伝子クラスターからのＳ／ＭＡＲであり得る。例えば、Ｖｅｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４２：ｅ５３、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５９：１０２４－１０３３、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１６．８：７０２－７１１、Ｋｏｉｒａｌａ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８０１：７０３－７０９、及びＮｅｈｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２３３－２４４を参照されたい。この技術及びベクターは、本発明において使用するために適応され得る。
いくつかの実施形態では、該非ウイルスベクターは、トランスポゾンベクターまたはその系である。本明細書で使用される、「トランスポゾン」（転移因子とも称される）は、ゲノムの位置を別の位置に移動させることが可能なポリヌクレオチド配列を指す。いくつかのクラスのトランスポゾンが存在する。トランスポゾンとしては、レトロトランスポゾン及びＤＮＡトランスポゾンが挙げられる。レトロトランスポゾンでは、当該ポリヌクレオチドが新たなゲノムまたはポリヌクレオチドに転移するために、該移動する（または転移する）ポリヌクレオチドの転写を必要とする。ＤＮＡトランスポゾンは、当該ポリヌクレオチドが新たなゲノムまたはポリヌクレオチドに転移するために、該移動する（または転移する）ポリヌクレオチドの逆転写を必要としないものである。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、レトロトランスポゾンベクターであり得る。いくつかの実施形態では、該レトロトランスポゾンベクターは、長い末端反復を含む。いくつかの実施形態では、該レトロトランスポゾンベクターは、長い末端反復を含まない。いくつかの実施形態では、該非ウイルスポリヌクレオチドベクターは、ＤＮＡトランスポゾンベクターであり得る。ＤＮＡトランスポゾンベクターは、トランスポサーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、該トランスポゾンベクターは、転移がそれ自体では自発的に起こらないことを意味する非自律型トランスポゾンベクターとして構成される。これらの実施形態の一部では、トランスポゾンベクターは、転移のために必要とされるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を欠く。いくつかの実施形態では、該非自律型トランスポゾンベクターは、１つ以上のＡｃ要素を欠く。
いくつかの実施形態では、非ウイルスポリヌクレオチドトランスポゾンベクター系は、トランスポゾン逆方向末端反復（ＴＩＲ）によって５’及び３’末端で挟まれた本明細書に記載の本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）もしくは他のポリヌクレオチド、または分子を含む第一のポリヌクレオチドベクター、ならびにトランスポサーゼの発現を駆動するためのプロモーターに連結されたトランスポサーゼをコードすることが可能なポリヌクレオチドを含む第二のポリヌクレオチドベクターを含み得る。その両方が同じ細胞で発現される場合、該トランスポサーゼは、該第二のベクターから発現することができ、該第一のベクター上のＴＩＲ間の物質（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）もしくは他のポリヌクレオチドまたは分子）を転移させ、それを宿主細胞のゲノムにおける１つ以上の位置に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、該トランスポゾンベクターまたはその系は、遺伝子トラップとして構成され得る。いくつかの実施形態では、該ＴＩＲは、強力なスプライスアクセプター部位と、それに続くレポーター及び／または他の遺伝子（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）もしくは他のポリヌクレオチドまたは分子の１つ以上）及び強力なポリＡテールを挟むように構成され得る。このベクターまたはその系を使用して転移が生じる場合、該トランスポゾンは、遺伝子のイントロンに挿入することができ、挿入されたレポーターまたは他の遺伝子は、ミススプライシングプロセスを誘発し、結果として、トラップされた遺伝子を不活化し得る。
任意の適切なトランスポゾン系が使用され得る。適切なトランスポゾン及びその系としては、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系（Ｔｃ１／マリナースーパーファミリー）（例えば、Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ．９１（４）：５０１－５１０参照）、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリー）（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３ １１０（２５）：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７及びＹｕｓａ ｅｔ ａｌ．２０１１．ＰＮＡＳ．１０８（４）：１５３１－１５３６参照）、Ｔｏｌ２（スーパーファミリーｈＡＴ）、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｔｃ１／マリナースーパーファミリー）（例えば、Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１（２３）：６８７３－６８８１参照）ならびにそれらのバリアントを挙げることができる。
化学担体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）もしくは他のポリヌクレオチドまたは他の分子は、化学担体と連結され得る。ポリヌクレオチドの送達に適し得る化学担体は、以下のクラスに大きく分類される:（ｉ）無機粒子、（ｉｉ）脂質ベース、（ｉｉｉ）ポリマーベース、及び（ｉｖ）ペプチドベース。それらは、（１）ポリヌクレオチド（本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）等）と縮合複合体形成し得るもの、（２）特定の細胞を標的化することが可能なもの、（３）本発明のポリヌクレオチドまたは他の分子（操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）等）の宿主細胞の核またはサイトゾルへの送達を増加させることが可能なもの、（４）宿主細胞のサイトゾルにおけるＤＮＡ／ＲＮＡから分解することが可能なもの、及び（５）持続放出または制御放出が可能なものとして分類され得る。任意の１つの所与の化学担体は、複数の分類からの特徴を含み得ることが理解されよう。本明細書で使用される、「粒子」という用語は、本明細書に記載の本発明の組成物（本明細書に記載の粒子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び他の組成物を含む）の送達用の任意の適切なサイズの粒子を指す。適切なサイズとしては、マクロ、マイクロ、及びナノサイズの粒子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、無機粒子であり得る。いくつかの実施形態では、該無機粒子は、ナノ粒子であり得る。該無機粒子は、様々なサイズ、形状、及び／または多孔度によって構成及び最適化され得る。いくつかの実施形態では、該無機粒子は、細網内皮系から脱出するように最適化される。いくつかの実施形態では、該無機粒子は、封入された分子を分解から保護するように最適化され得る。この状況において非ウイルス担体として使用され得る適切な無機粒子としては、リン酸カルシウム、シリカ、金属（例えば、金、白金、銀、パラジウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、ルテニウム、水銀、銅、レニウム、チタン、ニオブ、タンタル、及びそれらの組み合わせ）、磁性化合物、粒子、及び材料（例えば、超磁性酸化鉄及びマグネタイト）、量子ドット、フラーレン（例えば、カーボンナノ粒子、ナノチューブ、ナノストリング等）、ならびにそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。他の適切な無機非ウイルス担体は、本明細書の他の箇所に論じられている。
いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、脂質ベースであり得る。適切な脂質ベースの担体もまた、本明細書にさらに詳しく記載されている。いくつかの実施形態では、該脂質ベースの担体としては、送達されるポリヌクレオチドの負電荷と結合することまたは他の方法で相互作用することが可能なカチオン性脂質または両親媒性脂質（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド等）。いくつかの実施形態では、非ウイルス化学担体系は、ポリヌクレオチド（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可）もしくは他の組成物または他の分子）及び脂質（例えば、カチオン性脂質）を含み得る。これらはまた、当技術分野ではリポプレックスとも呼ばれる。リポプレックスの他の実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、該非ウイルス脂質系担体は、脂質ナノエマルションであり得る。脂質ナノエマルションは、非混和性液体の別の安定化された乳化剤分散液によって形成することができ、約２００ｎｍの粒子を有し、これは、該脂質、水、及び界面活性剤からなり、これらは、送達されるポリヌクレオチド（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可））を含むことができる。いくつかの実施形態では、該脂質ベースの非ウイルス担体は、固体脂質粒子またはナノ粒子であり得る。
いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、ペプチドベースであり得る。いくつかの実施形態では、該ペプチドベースの非ウイルス担体は、１つ以上のカチオン性アミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、該アミノ酸の３５～４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９または１００％がカチオン性である。いくつかの実施形態では、ペプチド担体は、他のタイプの担体（例えば、これらの担体を官能化するポリマーベースの担体及び脂質ベースの担体）と併せて使用され得る。いくつかの実施形態では、該官能化は、宿主細胞の標的化である。該ポリマーベースの非ウイルス担体に含まれ得る適切なポリマーとしては、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ポリ（ＤＬ－ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、デンドリマー（例えば、米国特許公開第２０１７／００７９９１６号参照。その技術及び組成物は、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドとの使用に適応させることができる）、ポリメタクリレート、及びそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、外部刺激、例えば、ｐＨ、温度、浸透圧、特定の分子または組成（例えば、カルシウム、ＮａＣｌ等）の濃度、圧力等に反応して、該非ウイルス担体に関連しているまたは結合している操作された送達系のポリヌクレオチドを放出するように構成され得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、本明細書に記載の本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドまたは他の組成物の１つ以上及び環境刺激要因の応答要素、及び任意に刺激要因を含むように構成される粒子であり得る。いくつかの実施形態では、該粒子は、ポリメタクリレート及びポリアクリレートの群から選択され得るポリマーを含み得る。いくつかの実施形態では、該非ウイルス粒子は、米国特許公開第２０１５０２３２８８３号及び第２００５０１２３５９６号に記載の組成物のマイクロ粒子の１つ以上の実施形態を含み得る。これらの技術及び組成は、本発明での使用に適応させることができる。
いくつかの実施形態では、該非ウイルス担体は、ポリマーベースの担体であり得る。いくつかの実施形態では、該ポリマーは、カチオン性または主にカチオン性であり、電荷依存的に、送達される負電荷を有するポリヌクレオチド（例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可））と相互作用することができる。ポリマーベースの系は、本明細書の他の箇所により詳細に記載されている。
ウイルスベクター
いくつかの実施形態では、該ベクターは、ウイルスベクターである。この状況で本明細書で使用される「ウイルスベクター」という専門用語は、ポリヌクレオチドベースのベクターを指し、これは、ポリヌクレオチド、例えば、本発明の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、カーゴ、もしくは他の組成物または分子を発現すること及びウイルス粒子にパッケージングすること、ならびに単独で使用された場合または１つ以上の他のウイルスベクター（例えば、ウイルスベクター系において）とともに使用された場合に、かかるウイルス粒子を産生することが可能であり得るウイルスの１つ以上の要素を含むまたはその１つ以上の要素に基づく。ウイルスベクター及びその系は、本明細書に記載の本発明の１つ以上の組成物（任意のウイルス粒子及び関連するカーゴが挙げられるがこれらに限定されない）の送達及び／または発現及び／または生成用のウイルス粒子を産生するために使用され得る。該ウイルスベクターは、複数のベクターを含むウイルスベクター系の一部であり得る。いくつかの実施形態では、複数のウイルスベクターを組み込む系は、これらの系の安全性を高めることができる。適切なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベースのベクター、アデノ随伴ベクター、ヘルパー依存型アデノウイルス（ＨｄＡｄ）ベクター、ハウブリッドアデノウイルスベクター等を挙げることができる。ウイルスベクター及びそれから産生されるウイルス粒子の他の実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、該ウイルスベクターは、これらの系の安全性を改善するための複製能力のないウイルス粒子を産生するように構成される。
アデノウイルスベクター、ヘルパー依存型アデノウイルスベクター、及びハイブリッドアデノウイルスベクター
いくつかの実施形態では、該ベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、該アデノウイルスベクターは、該ベクターまたはその系を使用して産生されるウイルス粒子が血清型２、５、または９となり得るように要素を含み得る。いくつかの実施形態では、該アデノウイルス粒子を介して送達されるポリヌクレオチドは、最大で約８ｋｂであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、サイズが約０．００１ｋｂ～約８ｋｂに及び得る送達されるＤＮＡポリヌクレオチドを含み得る。アデノウイルスベクターは、いくつかの状況での使用が成功している（例えば、Ｔｅｒａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｌａｎｃｅｔ．３５５：１９１１－１９１２、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．２００２．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：８９５－９１３、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１１４５－１１５９、及びＫａｙ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７－２６１参照）。該操作されたＡＡＶのカプシドは、かかる操作されたＡＡＶのカプシドを含むアデノウイルス粒子を産生するためのアデノウイルスベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターまたはその系であり得る。これらはまた、当技術分野で「腹なし（ｇｕｔｌｅｓｓ）」または「腹なし（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターと称され、アデノウイルスベクターの修飾世代である（例えば、Ｔｈｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ．４４３：Ｅ５－７参照）。ヘルパー依存型アデノウイルスベクター系の実施形態では、１つのベクター（ヘルパー）が、複製に必要とされるウイルス遺伝子のすべてを含み得るが、パッケージングドメインにおいて条件付き遺伝子欠損を含む。該系の第二のベクターは、ウイルスゲノムの末端、１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、及び天然パッケージング認識シグナルのみを含むことができ、これらは、細胞から選択的パッケージング放出を可能とし得る（例えば、Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６１：７２５－７２７参照）。ヘルパー依存型アデノウイルスベクター系は、いくつかの状況において遺伝子送達のために成功している（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：６４３－６５０、Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６１：７２５－７２７、Ｃｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（４）：４４３－４５２、Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：１８－Ｓ２７、Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５７９－５８７、Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９２６－９３３、及びＭｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．１９９９．ＰＮＡＳ．９６：１２８１６－１２８２１参照）。これらの刊行物に記載されている技術及びベクターは、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドの包含及び送達のために適応され得る。いくつかの実施形態では、ヘルパー依存型アデノウイルスベクターまたはその系から産生されるウイルス粒子を介して送達されるポリヌクレオチドは、最大で約３８ｋｂであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、サイズが約０．００１ｋｂ～約３７ｋｂの範囲であり得る送達されるＤＮＡポリヌクレオチドを含み得る（例えば、Ｒｏｓｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．５：００１参照）。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、ハイブリッドアデノウイルスベクターまたはその系である。ハイブリッドアデノウイルスベクターは、遺伝子欠失アデノウイルスベクターの高い形質導入効率、ならびにアデノ随伴、レトロウイルス、レンチウイルス、及びトランスポゾンベースの遺伝子導入の長期ゲノム組み込み潜在性から構成される。いくつかの実施形態では、かかるハイブリッドベクター系は、安定な形質導入及び制限された組み込み部位をもたらし得る。例えば、Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｌｏｏｄ．９５：８２０－８２８；Ｍｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７０９－２７１６、Ｋｕｂｏ ａｎｄ Ｍｉｔａｎｉ．２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（５）：２９６４－２９７１、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．８（１０）ｅ７６７７１、及びＣｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（４）：６６７－６７４）を参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の操作されたＡＡＶのカプシド系において使用するために修飾及び適応され得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、レトロウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルスの１つ以上の特徴を含み得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、スプマレトロウイルスまたはフォーミーウイルス（ＦＶ）の１つ以上の特徴を含み得る。例えば、Ｅｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１４６－１５６及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１８３４－１８４１を参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の操作されたＡＡＶのカプシド系において使用するために修飾及び適応され得る。ハイブリッドアデノウイルスベクターまたはその系におけるＦＶからの１つ以上の特徴を使用する利点としては、それから生成されたウイルス粒子が広い範囲の細胞に感染する能力、他のレトロウイルスと比較して大きなパッケージング容量、及び休眠（非分裂）細胞において存続する能力を挙げることができる。例えば、Ｅｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５６：１４６－１５６及びＳｈｕｊｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：７６－８２も参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の操作されたＡＡＶのカプシド系において使用するために修飾及び適応され得る。
アデノ随伴ベクター
実施形態では、該操作されたベクターまたはその系は、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり得る。例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）、及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい。ＡＡＶは、それらの特徴の一部においてアデノウイルスベクターと同様であるが、それらの複製及び／または病原性においていくらかの欠陥を有し、よって、アデノウイルスベクターよりも安全であり得る。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶは、観察可能な副作用を伴わずにヒト細胞の１９番染色体上の特定の部位に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクター、その系、及び／またはＡＡＶ粒子の容量は、最大で約４．７ｋｂであり得る。該ＡＡＶベクターまたはその系は、本明細書に記載の１つ以上の操作されたカプシドポリヌクレオチドを含み得る。
該ＡＡＶベクターまたはその系は、１つ以上の制御分子を含み得る。いくつかの実施形態では、該制御分子は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー等であることができ、これらは、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターまたはその系は、１つ以上の制御タンパク質をコードし得る１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該１つ以上の制御タンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、それらのバリアント、及びそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、該プロモーターは、先に論じられている組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、該組織特異的プロモーターは、本明細書に記載の操作されたカプシドＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドの発現を駆動し得る。
該ＡＡＶベクターまたはその系は、１つ以上のカプシドタンパク質、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質をコードし得る１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。該操作されたカプシドタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のタンパク質シェル（操作されたカプシド）へと集合することが可能であり得る。該操作されたカプシドは、細胞、組織、及び／または器官特異的指向性を有し得る。
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターまたはその系は、１つ以上のアデノウイルスヘルパー因子または１つ以上のアデノウイルスヘルパー因子をコードし得るポリヌクレオチドを含み得る。かかるアデノウイルスヘルパー因子としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ ＲＮＡを挙げることができるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、産生宿主細胞株は、アデノウイルスヘルパー因子の１つ以上を発現する。
該ＡＡＶベクターまたはその系は、特定の血清型を有するＡＡＶ粒子を生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、該血清型は、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、該ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－９またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的とされる細胞に関連するＡＡＶからＡＡＶを選択することができ、例えば、脳及び／または神経細胞を標的とするためにＡＡＶ血清型１、２、５、９もしくはハイブリッドカプシドＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－９またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ、心臓組織を標的とするためにＡＡＶ－４を選択することができ、肝臓への送達のためにＡＡＶ－８を選択することができる。したがって、いくつかの実施形態では、脳及び／または神経細胞を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはその系は、血清型１、２、５を有するＡＡＶ粒子またはハイブリッドカプシドＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５またはそれらの任意の組み合わせを生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、心臓組織を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはその系は、ＡＡＶ－４血清型を有するＡＡＶ粒子を生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、肝臓を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはその系は、ＡＡＶ－８血清型を有するＡＡＶを生成するように構成され得る。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０も参照されたい。
異なる血清型は、いくらかのレベルの細胞、組織、及び／または器官特異性を提供し得るが、各血清型は、依然として多重指向性であり、よって、血清型が形質導入するのにあまり効率的ではない組織を標的とするためにその血清型を使用する場合は組織毒性をもたし得ることが理解されよう。したがって、特定の血清型のＡＡＶを選択することによりいくらかの組織標的化能力を達成することに加えて、該ＡＡＶ血清型の指向性は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドによって修飾され得ることが理解されよう。本明細書の他の箇所に記載されているように、任意の血清型の野生型ＡＡＶバリアントは、本明細書に記載の方法を介して生成され、参照野生型ＡＡＶ血清型のものと同じまたは異なる場合がある特定の細胞特異的指向性を有することが決定され得る。いくつかの実施形態では、野生型血清型の細胞、組織、及び／または特異性は強化され得る（例えば、血清型がすでに偏っている特定の細胞型に対してより選択的または特異的となる）。例えば、野生型ＡＡＶ－９は、ヒトにおける筋肉及び脳の方向に偏る（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０参照）。本明細書に記載の野生型ＡＡＶ－９の操作されたＡＡＶのカプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントを含めることにより、例えば、脳に対する偏りを減少または排除することができ、及び／または比較すると脳特異性が減少したように見えるように筋特異性が増加し、これにより野生型ＡＡＶ－９と比較して筋肉に対する特異性が向上する。前述したように、野生型ＡＡＶ血清型の操作されたカプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントの包含は、野生型参照ＡＡＶ血清型とは異なる指向性を有し得る。例えば、ＡＡＶ－９の操作されたＡＡＶのカプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントは、ヒトにおける筋肉または脳以外の組織に対する特異性を有し得る。
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターまたはその系である。ハイブリッドＡＡＶは、少なくとも１つの異なる血清型に由来するカプシドにパッケージングされた１つの血清型からの要素を有するゲノムを含むＡＡＶである。例えば、産生されるのがｒＡＡＶ２／５である場合、また、産生方法が上で論じたヘルパーフリー一過性トランスフェクション法に基づく場合、第一のプラスミド及び第三のプラスミド（アデノヘルパープラスミド）は、ｒＡＡＶ２産生について論述されたもの同じとなる。しかしながら、第二のプラスミドであるｐＲｅｐＣａｐは異なる。ｐＲｅｐ２／Ｃａｐ５と呼ばれるこのプラスミドにおいて、Ｒｅｐ遺伝子は依然としてＡＡＶ２に由来する一方で、Ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来し得る。産生スキームは、ＡＡＶ２産生について上述したアプローチと同じである。得られるｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／５と呼ばれ、そのゲノムは組み換えＡＡＶ２に基づく一方で、カプシドはＡＡＶ５に基づく。このＡＡＶ２／５ハイブリッドウイルスによって示される細胞または組織指向性は、ＡＡＶ５のものと同じとなるはずであることが想定される。野生型ハイブリッドＡＡＶ粒子は、先に論じられている非ハイブリッド野生型血清型と同じ特異性の問題を有することが理解されよう。
該野生型ベースのハイブリッドＡＡＶ系によって達成される利点は、本明細書の他の箇所に記載されている操作されたＡＡＶのカプシドを含み得るハイブリッドＡＡＶを生成することによって組み合わされ得る操作されたＡＡＶのカプシドで達成され得る向上し、カスタマイズされた細胞特異性と組み合わされ得る。ハイブリッドＡＡＶは、該操作されたＡＡＶのカプシドがそのバリアントである参照野生型血清型とは異なる血清型からの要素を有するゲノムを含む操作されたＡＡＶのカプシドを含み得ることが理解されよう。例えば、ＡＡＶ－２血清型からの成分（例えば、ｒｅｐ要素）を含むゲノムをパッケージングするために使用されるＡＡＶ－９血清型のバリアントである操作されたＡＡＶのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶが産生され得る。先に論じられている野生型ベースのハイブリッドＡＡＶと同様に、得られるＡＡＶ粒子の指向性は、操作されたＡＡＶのカプシドのものとなる。
これらの細胞に関するある特定の野生型ＡＡＶ血清型の作表は、表１として以下に再現されたＧｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）に見出され得る。さらなる指向性の詳細は、先に論じられているようにＳｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０に見出され得る。
Figure 2023534999000002
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターまたはその系は、ＡＡＶ ｒｈ．７４またはＡＡＶ ｒｈ．１０である。
いくつかの実施形態では、該ＡＡＶベクターまたはその系は、レトロウイルスベクターに関して記載されているものと同様に、「腹なし」ベクターとして構成される。いくつかの実施形態では、「腹なし」ＡＡＶベクターまたはその系は、目的の異種配列（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可））と連携してゲノム増幅及びパッケージングに関与するシス作用性ウイルスＤＮＡ要素を有し得る。
ベクターの構築
本明細書に記載のベクターは、任意の適切なプロセスまたは技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の適切な組み換え及び／またはクローニング方法または技術が、本明細書に記載のベクター（複数可）のために使用され得る。適切な組み換え及び／またはクローニング技術及び／または方法としては、米国出願公開第ＵＳ２００４－０１７１１５６Ａ１に記載されているものを挙げることができるがこれに限定されない。他の適切な方法及び技術は、本明細書の他の箇所に記載されている。
組み換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）、及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含めた多数の刊行物に記載されている。それらの技術及び／または方法のいずれかが、本明細書に記載のＡＡＶまたは他のベクターを構築するために使用及び／または適応され得る。ＡＡＶベクターは、本明細書の他の箇所で論じられている。
いくつかの実施形態では、該ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニングサイト」とも称される）を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多く、またはそれ以上の挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流及び／または下流に位置する。
本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の要素の発現のための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその成分は、前述の文献、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）において使用されている通りであり、本明細書でより詳細に論じられている。
ウイルスベクターからのウイルス粒子産生
ＡＡＶ粒子産生
本明細書に記載されているもの等の、ＡＡＶベクター及びその系からＡＡＶ粒子を産生するための２つの主要な戦略が存在し、これはアデノウイルスヘルパー因子がどのように提供されるかに依存する（ヘルパー対ヘルパーフリー）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター及びその系からＡＡＶ粒子を産生する方法は、得られるＡＡＶ粒子（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可））によってパッケージングされ、送達されるポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターとともにＡＡＶ複製及びカプシドをコードするポリヌクレオチドを安定的に担持する細胞株へのアデノウイルス感染を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター及びその系からＡＡＶ粒子を生成する方法は、「ヘルパーフリー」の方法であることができ、これは、適切な産生細胞株を３つのベクター（例えば、プラスミドベクター）：（１）２つのＩＴＲ間に目的のポリヌクレオチド（例えば、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド（複数可））を含むＡＡＶベクター、（２）ＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐをコードするポリヌクレオチド、及びヘルパーポリヌクレオチドを担持するベクターで共トランスフェクションすることを含む。当業者には、ヘルパー及びヘルパーフリーの両方である様々な方法及びそのバリエーションならびに各系の異なる利点が理解されよう。
本明細書に記載の操作されたＡＡＶベクター及びその系は、これらの方法のいずれかによって産生され得る。
ベクター及びウイルス粒子送達
本明細書に記載のベクター（非ウイルス担体を含む）は、宿主細胞に導入され、それにより転写物、タンパク質、またはペプチド（本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、操作されたＡＡＶのカプシド系転写産物、タンパク質、酵素、それらの変異形態、それらの融合タンパク質等）、及びウイルス粒子（例えば、ウイルスベクター及びその系からのもの）が産生され得る。
１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドは、先行記載されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたは他のプラスミドもしくはウイルスベクター型を使用して、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号（アデノウイルスのための製剤、用量）、第８，４０４，６５８号（ＡＡＶのための製剤、用量）及び第５，８４６，９４６号（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスを伴う臨床試験及び該臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を使用して送達され得る。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号におけるもの及びＡＡＶを含む臨床試験におけるものの通りであり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号におけるもの及びアデノウイルスを含む臨床試験におけるものの通りであり得る。
プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号におけるもの及びプラスミドを含む臨床研究におけるものの通りであり得る。いくつかの実施形態では、用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、男性成人ヒト）に基づき、またはそれに外挿され得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳類のために調整され得る。投与の頻度は、患者または対象の年齢、性別、全般的健康状態、他の状態ならびに対処されている特定の状態または症状を含めた通常の要因に応じて、医学的または獣医学的実践者（例えば、医師、獣医師）の領域の範囲内である。該ウイルスベクターは、目的の組織または細胞に注射され、または他の方法で送達され得る。
インビボ送達の観点から、ＡＡＶは、いくつかの理由、例えば、低毒性（これは、免疫反応を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る）及び宿主ゲノムに組み込まれないことによる挿入変異生成を引き起こす可能性の低さのため、他のウイルスベクターよりも有利である。
本明細書に記載のベクター（複数可）及びウイルス粒子は、インビトロ、インビボ、及びまたはエキソビボで宿主細胞に送達され得る。送達は、物理的方法、化学的方法、及び生物学的方法が挙げられるがこれらに限定されない任意の適切な方法によって行われ得る。物理的送達方法は、細胞の膜障壁を弱めるための物理的な力を用いて、ベクターの細胞内送達を容易化する方法である。適切な物理的方法としては、針（例えば、注射）、バリスティックポリヌクレオチド（例えば、パーティクルボンバードメント、マイクロプロジェクタイル遺伝子導入、及び遺伝子銃）、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーション、及び機械的マッサージが挙げられるがこれらに限定されない。化学的方法は、細胞膜透過性または他の特性（複数可）の変化を引き起こすための化学物質を用いて、細胞へのベクターの進入を容易化する方法である。例えば、細胞膜の透過性の変化を引き起こし得る環境ｐＨが変更され得る。生物学的方法は、宿主細胞の生物学的プロセスまたは生物学的特性に依存し、それを利用して、細胞へのベクターの（担体を用いたまたは用いない）輸送を容易化するものである。例えば、該ベクター及び／またはその担体は、細胞におけるエンドサイトーシスまたは同様のプロセスを刺激して、細胞へのベクターの取り込みを容易化し得る。
粒子を介した細胞への操作されたＡＡＶのカプシド系成分（例えば、操作されたＡＡＶのカプシド及び／またはカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の送達。本明細書で使用される、用語「粒子」は、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系成分の送達のための任意の適切なサイズの粒子を指す。適切なサイズとしては、マクロ、マイクロ、及びナノサイズの粒子が挙げられる。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシド系成分（例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及びそれらの組み合わせ）のいずれかは、本明細書に記載の１つ以上の粒子またはその成分に結合され、連結され、組み込まれ、他の方法で関連付けられ得る。本明細書に記載の粒子は次いで、適切な経路及び／または技術によって細胞または生物に投与され得る。いくつかの実施形態では、粒子送達は、該ポリヌクレオチドまたはベクター成分の送達用に選択され、その送達に有利であり得る。実施形態では、粒子送達はまた、本明細書の他の箇所に記載されている他の操作されたカプシド系分子及び製剤に有利であり得ることが理解されよう。
操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドを含む操作されたウイルス粒子
本明細書に同様に記載するのは、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている操作されたウイルス粒子（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（本明細書及び本明細書の他の箇所では「操作されたウイルス粒子（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」とも呼ばれる）であり、これは、操作されたウイルスのカプシド（例えば、ＡＡＶのカプシド、「操作されたＡＡＶ粒子」と呼ばれる）を含み得る。該操作されたＡＡＶ粒子は、すでに記載の通り、少なくとも１つの操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質を含むアデノウイルスベースの粒子、ヘルパーアデノウイルスベースの粒子、ＡＡＶベースの粒子、またはハイブリッドアデノウイルスベースの粒子であり得ることが理解されよう。操作されたＡＡＶのカプシドは、本明細書の他の箇所に記載の１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質を含むものである。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶ粒子は、１～６０個の本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶ粒子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の操作されたカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶ粒子は、０～５９個の野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶ粒子は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９個の野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質を含み得る。該操作されたＡＡＶ粒子は、したがって、１つ以上の先に記載したｎ量体モチーフを含み得る。
該操作されたＡＡＶ粒子は、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを含み得る。カーゴポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所により詳細に論じられている。ウイルスベクター及び非ウイルスベクターから該操作されたＡＡＶ粒子を作製する方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。該操作されたウイルス粒子を含む製剤は、本明細書の他の箇所に記載されている。
カーゴポリヌクレオチド
カーゴは、本明細書の他の箇所にも記載されている。いくつかの実施形態では、該カーゴは、カーゴポリヌクレオチドであり、操作されたウイルス粒子にパッケージングされ、その後細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、送達は、筋特異的である。該操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド、他のウイルス（例えば、ＡＡＶ）のポリヌクレオチド（複数可）、及び／またはベクターのポリヌクレオチドは、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、該１つ以上のカーゴポリヌクレオチドは、該操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド（複数可）に作動可能に連結することができ、本発明のウイルス（例えば、ＡＡＶ）系の操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のゲノムの一部になり得る。該カーゴポリヌクレオチドは、操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子にパッケージングすることができ、これが例えば、細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、それが送達される細胞のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または転写物）を修飾することが可能であり得る。本明細書で使用される、「遺伝子」とは、染色体の特定の位置を占め、生物の特徴（複数可）または特性（複数可）に対する遺伝的指令を含むＤＮＡの配列に対応する遺伝単位を指すことができる。遺伝子という用語は、ゲノムの翻訳領域及び／または未翻訳の領域を指すことができる。「遺伝子」とは、特定のＤＮＡ配列を指すことができ、これが転写されてＲＮＡ転写物になり、これが翻訳されてポリペプチドになる場合もあれば、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない触媒ＲＮＡ分子である場合もある。ポリヌクレオチド、遺伝子、転写物等の修飾としては、遺伝子編集ならびに従来の組み換え遺伝子組み換え技術（例えば、全体的または部分的遺伝子挿入、欠失、及び変異誘発（例えば、全体的または部分的遺伝子挿入、欠失及び変異誘発（例えば、挿入及び欠失変異誘発）技術が挙げられるがこれらに限定されないすべての遺伝子操作技術が挙げられる。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ワクチンであるかまたはそれをコードし得るポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、がんに対する免疫反応を刺激し得る。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、結腸直腸癌または膵臓癌に対する免疫反応を刺激し得る。いくつかの実施形態では、該ワクチンは、ｈＣＧ産生細胞、例えば、ｈＣＧ産生がん細胞にとって不安定な環境を創出し得る。
遺伝子組み換えカーゴポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、単独でまたは系の一部として送達された場合、該系の他の成分とともに送達されたかどうかにかかわらず、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用し得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。かかる系としては、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が挙げられるがこれに限定されない。他の遺伝子組み換え系、例えば、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ、モルホリノ等は、１つ以上の成分が本明細書に記載の操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子によって送達され得る遺伝子組み換え系の他の非限定的な例である。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、遺伝子編集系またはその成分である。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子またはその成分である。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、遺伝子組み換え系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系）の１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、単独でまたは系の一部として送達される場合、該系の他の成分とともに送達されるかどうかにかかわらず、筋肉もしくは骨格障害、神経疾患もしくは障害、及び／またはウイルス（一本鎖ＲＮＡウイルス等）の疾患、障害、またはその症状を治療または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用し得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、系の他の成分とともに送達されるかどうかにかかわらず、早老性疾患（例えば、早老性ラミノパシー）、グリコーゲン蓄積症、免疫障害（例えば、自己免疫疾患）、がん、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、６肢帯型筋ジストロフィー疾患（ＬＧＭＤ）、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ポンペ病、または他のＣＮＳ関連疾患、例えば、ハンチントン病及び他の伸長リピート病を治療または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用する。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、系の他の成分とともに送達されるかどうかにかかわらず、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る米国特許出願公開第２０１９０２８４５５５号に記載されているもののいずれか等のＧＡＡ遺伝子を修飾することができるように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用する。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８、または他の筋特異的プロモーターに連結されたオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、タンパク質の機能性のために最適化されたジストロフィン遺伝子の選択された領域のみを含むマイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該選択された領域としては、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４が挙げられる。例えば、Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｈａｕｓｅｒ ＭＡ，ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２；８（３）：２５３－２６１を参照されたい。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドは、臨床試験ＮＣＴ０３３７５１６４及びＮＣＴ０３７６９１１６に供されているＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィン遺伝子またはＳＲＰ－９００１として知られているｒＡＡＶ剤によって送達される。このマイクロジストロフィン遺伝子構築物は、ＮＴ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒンジ領域を表すＨを含む。Ｅｎｇｌａｎｄ ＳＢ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３（６２５４）：１８０－１８２、Ｗｅｌｌｓ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１９９５；４（８）：１２４５－１２５０，Ｓａｌｖａ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７；１５（２）：３２０－３２９、Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２０１２；５２７（２）：９０－９９、Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１３；２２（２４）：４９２９－４９３７、Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ＶＭ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７；４：１５９－１６８、Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２；８（３）：２５３－２６１、Ｎｅｌｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；２７（１２）：２０９０－２１００。いくつかの実施形態では、該選択された領域は、スペクトリン様リピート２及び３を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ｎＮＯＳドメインを含む。いくつかの実施形態では、該ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピート１６及び／または１７から構成される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１６及び１７を含む。いくつかの実施形態では、該ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピートＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４から構成される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、筋特異的プロモーターに連結される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドは、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８、ＳＮＰ１８、ＳＰ００３３、ＳＰ００５１、ＳＰ０１７３、ｔｍＣＫ、または別の筋特異的プロモーターに連結される。
いくつかの実施形態では、該カーゴマイクロジストロフィンは、ＡＢＤ（アクチン結合ドメイン）、１つ以上のヒンジ領域（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、ならびに１つ以上のスペクトリン様リピート（例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２４’及び任意にジストログリカン結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィンは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＤＢＤから構成される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィンは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲから構成される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１’－Ｒ２４’－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、マイクロジストロフィン遺伝子をコードし得るポリヌクレオチドであり、該マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート、Ｒ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３及びＲ２４を含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒンジ領域（Ｈ）４及び／またはＨ１を含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、Ｎ末端アクチン結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒト全長ジストロフィンタンパク質のＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含む。該マイクロジストロフィン遺伝子は、ｎＮＯＳドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、該ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピート１６及び／または１７から構成される。いくつかの実施形態では、該マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１６及び１７を含む。該マイクロジストロフィン遺伝子は、参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得るＷＯ２０１９１１８８０６Ａ１及びＷＯ２０１６／１１５５４３に記載されている通りであり得る。いくつかの実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、ヒト全長ジストロフィンタンパク質のＮ末端からＣ末端に、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジ領域１（Ｈｌ）、スペクトリン様リピートＲｌ、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４、ヒンジ領域４（Ｈ４）、ならびにＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含む５－リピートマイクロジストロフィンタンパク質をコードし得る。この５－リピートマイクロジストロフィン及び関連するジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質配列は、ＷＯ２０１６／１１５５４３に記載されている。いくつかの実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、現在、識別番号ＮＣＴ０３３６８７４２を有する臨床試験中のＳＧＴ００１として知られている薬剤の一部であるマイクロジストロフィン遺伝子に対応し得る。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ミニジス遺伝子またはベクターである。いくつかの実施形態では、該ミニジス遺伝子またはベクターは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２０－Ｒ２１、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２０－Ｒ２１－Ｒ２２－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ、またはＨ３－Ｒ２０－Ｒ２１－Ｒ２２－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴから構成され得る。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ＳＣＧＢ ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、該ＳＧＣＢ ｃＤＮＡは、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８プロモーター、ＳＮＰ１８プロモーター、ＳＰ００３３プロモーター、ＳＰ００５１、ＳＰ０１７３プロモーター、ｔｍＣＫプロモーターまたは別の筋特異的プロモーターに連結される。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ベータ－サルコグリカンｃＤＮＡ、アルファ－サルコグリカンｃＤＮＡ、ジスフェリンｃＤＮＡ、ガンマ－サルコグリカンｃＤＮＡ、Ｃａｌｐｉｎ－３ ｃＤＮＡ、ＳＧＳＨ ｃＤＮＡ（例えば、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２）、ニューロトロピン３ ｃＤＮＡ、アノクタミン－５ ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、系の他の成分とともに送達されるかどうかにかかわらず、ハンチントン病等の伸長リピート病に関連する遺伝子または遺伝子産物、例えば、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る米国特許出願公開第２０１９０１００７５５号、米国特許第１００６６２２８号に記載されているものを治療、予防、及び／または修飾するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用する。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、アンチセンスオリゴマーまたはＲＮＡ分子、例えば、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０２５１３９８号、第ＵＳ２０１５０２６７２０２号、第ＵＳ２０１９００１５４４０号、第ＵＳ２０１４０２８７９８３号、第ＵＳ２０１８０２１６１１１号、ＷＯ／２０１７／０６２８３５、第ＵＳ２０１９０１７７７２３号、第ＵＳ２０１７００５１２７８号、第ＵＳ２０１８０２７１８９３号、ＷＯ／２０１６／１４９６５、米国特許第１００７６５３６号、ＷＯ／２０１８／００５８０、ＷＯ／２０１８／１１８６６、ＷＯ／２０１９／０５９９７３に記載されているものである。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、系の他の成分とともに送達されるかどうかにかかわらず、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、インフルエンザ、ウエストナイルウイルス、ＳＡＲＳ、Ｃ型肝炎、デング熱、エボラ、マールブルグ、及び／またはカリシウイルスを治療または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを修飾するように作用する。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、アンチセンス抗ウイルス化合物、例えば、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得るＵＳ８７０３７３５Ｂ２に記載されているもののいずれかであり得る。
本明細書に記載のカーゴ分子によって修飾することが可能な追加の例示的な遺伝子的及び遺伝子関連疾患及び遺伝子は、本明細書の他の箇所に列挙されており、例えば、表４～５を参照されたい。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、ＧＡＬＧＴ２遺伝子を付加または修飾し得る。欠損ジストロフィンを補充するように作用する代わりに、ＧＡＬＧＴ２遺伝子療法は、疾患において変異も欠損もしていないタンパク質の発現を増加させることによって、ジストロフィンの非存在を補う方法で筋肉の構造的全体性を強化する。ＧＡＬＧＴ２は、特定のジストロフィン変異にかかわらず、ＤＭＤを治療する潜在性を提供し、また、他の筋肉ジストロフィーにおける実用性を有する。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る米国特許公開第ＵＳ２０１８／０１６１３５９号及び第ＵＳ２０１９／００５４１１３号におけるもの等のモルホリノである。いくつかの実施形態では、該モルホリノは、モルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）またはペプチド連結モルホリノＰＰＭＯである。ＰＭＯベースのプラットフォームは、ｍＲＮＡ転写を変化させることによって遺伝子疾患を治療するために使用され得る。ＰＭＯは、ＲＮＡの天然フレームワーク後にモデル化される合成化学構造である。ＰＭＯは、ＲＮＡに見られる同じ核酸塩基を有するのに対し、それらは、５角のリボース環の代わりに６角のモルホリン環に結合する。また、該モルホリン環は、ＲＮＡに見られるホスホジエステル結合の代わりにホスホロジアミデート結合によって互いに接続される。ＰＭＯ及びＰＰＭＯは、エクソンスキッピング及び翻訳抑制のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、例えば、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る国際特許出願公開第ＷＯ２０１７１０６３０４Ａ１号に記載されているようなペプチド－オリゴマーコンジュゲートであり得る。
いくつかの実施形態では、該モルホリノは、エテプリルセンに見られるモルホリノであり、これは、ジストロフィンｍＲＮＡのエクソン５１を標的とするのに有効であり得る。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、例えば、その内容が参照により全体として本明細書に表されているものとして組み込まれ、本発明との使用に適応され得る米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３１５９７７Ａ１号及び第ＵＳ２０１８／０１０５８１号に記載されているもの等の、ＤＭＤの状況におけるエクソンスキッピングを生成し得る。
エクソンスキッピング
いくつかの実施形態では、該ヌクレオチド配列は、エクソンスキッピングを誘導することが可能な核酸をコードし得る。かかるコードされた核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチド系であり得る。本明細書で使用される、用語「エクソンスキッピング」は、１つ以上の相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を用いたｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライスドナー及び／またはアクセプター部位の標的化によるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングの修飾を指す。１つ以上のスプライスドナーまたはアクセプター部位へのスプライセオソームのアクセスを遮断することにより、ＡＯＮは、スプライシング反応を防止し、それにより完全にプロセシングされたｍＲＮＡから１つ以上のエクソンの欠失を引き起こし得る。エクソンスキッピングは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの成熟プロセス中に核において達成され得る。いくつかの例では、エクソンスキッピングは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライスドナー配列と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによって標的とされたエクソンのスプライシングに関与する重要な配列のマスキングを含み得る。
いくつかの実施形態では、該ヌクレオチド配列は、ジストロフィンｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチド系をコードする。例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソンｘ内のナンセンスまたはフレームシフト変異は、カルボキシ末端切断型非機能性ジストロフィンタンパク質をもたらす。その成熟ｍＲＮＡ転写物の発現は、エクソンｘによってコードされるアミノ酸が欠失しているが、それらの欠失アミノ酸に対してＮ末端及びＣ末端の両方のジストロフィンアミノ酸を含む機能性ジストロフィンタンパク質をもたらし得る。
該ヌクレオチド配列は、エクソン１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、またはそれらの任意の組み合わせでエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチド系をコードし得る。該ヌクレオチド配列は、エクソン４３、４４、５０、５１、５２、５５、またはそれらの任意の組み合わせでエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチド系をコードし得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系カーゴ分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）または他の粒子は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分子を含むことができ、これは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分子をコードし得る。いくつかの実施形態では、該ポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲカスケードタンパク質、ｇＲＮＡ、またはそれらの組み合わせをコードする。他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の分子は、本明細書の他の箇所に記載されており、ポリペプチドとしてまたはポリヌクレオチドとしてのいずれかで送達され得る。
通常、本明細書において及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）等の文献において使用されるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現に関与する、またはその活性を指示する転写物及び他の要素を集合的に指し、それには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況において「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセス部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況において「スペーサー」とも称される）、またはその用語が本明細書で使用される通りである「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９等のＣａｓをガイドするためのＲＮＡ（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡもしくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写産物が含まれる。通常、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況においてプロトスペーサーとも称される）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照されたい。
ある特定の実施形態では、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）またはＰＡＭ様モチーフは、本明細書に開示するエフェクタータンパク質複合体が目的の標的遺伝子座に結合することを指示する。いくつかの実施形態では、該ＰＡＭは、５’ＰＡＭでよい（すなわち、該プロトスペーサーの５’末端の上流に位置し得る）。他の実施形態では、該ＰＡＭは、３’ＰＡＭでよい（すなわち、該プロトスペーサーの５’末端の下流に位置し得る）。用語「ＰＡＭ」は、「ＰＦＳ」または「プロトスペーサーフランキング部位」または「プロトスペーサーフランキング配列」という用語と同義で使用され得る。
好ましい実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識し得る。ある特定の実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈ（ＨはＡ、ＣまたはＵである）である３’ＰＡＭを認識し得る。
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の状況において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされた配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。用語「標的ＲＮＡ」は、標的配列であるかまたはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。換言すれば、該標的ＲＮＡは、ｇＲＮＡ、すなわち、ガイド配列の一部が相補性を有するようにデザインされており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びｇＲＮＡを含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が指示されるＲＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
ある特定の例示的な実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子を使用して送達され得る。該ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質であり得る。コドン最適化配列の例としては、この場合は、真核生物、例えば、ヒトにおける発現用に最適化された配列（すなわち、ヒトにおける発現用に最適化されている）、または本明細書で論じられる別の真核生物、動物もしくは哺乳類用に最適化された配列である。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）におけるＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であることが理解されるとともに、ヒト以外の宿主種用のコドン最適化、または特定の器官用のコドン最適化のためのコドン最適化が既知である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質をコードする酵素コーディング配列が、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現用にコドン最適化される。該真核細胞は、ヒト、または本明細書で論じられる非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、もしくは非ヒト哺乳類もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない特定の生物、例えば、植物もしくは哺乳類のものでもそれに由来するものでもよい。いくつかの実施形態では、人間または動物に対して実質的な医学的な利点をもたらすことなく苦痛を与える可能性があるヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を修飾するプロセス及び／または動物の遺伝的同一性を修飾するプロセス、ならびにかかるプロセスの結果として得られる動物も除外され得る。通常、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しつつ、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれより多く、またはそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって目的の宿主細胞における発現の向上のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用頻度の差異）はしばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、ひいては、とりわけ、翻訳されているコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は通常、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用頻度表は、例えば、ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な“Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ”で容易に利用可能であり、これらの表は多数の方法で適応され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も利用可能である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓのコーディング配列における１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上の核酸が、１つ以上の目的の遺伝子のプロモーターを含む制御要素と当該細胞内で作動可能に接続されて提供または導入される、Ｃａｓトランスジェニック細胞を提供することを含み得る。本明細書で使用される、「Ｃａｓトランスジェニック細胞」という用語は、Ｃａｓ遺伝子がゲノム的に組み込まれた細胞、例えば、真核細胞を指す。該細胞の性質、型、または起源は、本発明に準じて特に限定しない。また、該Ｃａｓ導入遺伝子が細胞に導入される方法は、様々でよく、当技術分野で知られている任意の方法でよい。ある特定の実施形態では、該Ｃａｓトランスジェニック細胞は、単離された細胞に該Ｃａｓ導入遺伝子を導入することによって得られる。ある特定の他の実施形態では、該Ｃａｓ導入遺伝子細胞は、Ｃａｓトランスジェニック生物から細胞を単離することによって得られる。例を用いて、無制限に、本明細書で言及したＣａｓトランスジェニック細胞は、Ｃａｓトランスジェニック真核生物、例えば、Ｃａｓノックイン真核生物から得てもよい。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４６６７）が参照される。Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された、Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許公開第２０１２００１７２９０号及び第２０１１０２６５１９８号の方法が、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修飾され得る。Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された、Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許公開第２０１３０２３６９４６号の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修飾され得る。さらなる例を用いて、Ｃａｓ９ノックインマウスを記載する、参照により本明細書に組み込まれるＰｌａｔｔ ｅｔ．ａｌ．（Ｃｅｌｌ；１５９（２）：４４０－４５５（２０１４））が参照される。該Ｃａｓ導入遺伝子は、さらに、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－ポリＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを含み、それによって、ＣｒｅリコンビナーゼによってＣａｓの発現を誘導可能にすることができる。代替的に、該Ｃａｓトランスジェニック細胞は、該Ｃａｓ導入遺伝子を単離された細胞に導入することによって得てもよい。導入遺伝子用の送達系は、当技術分野で周知である。例を用いて、該Ｃａｓ導入遺伝子は、例えば、本明細書の他の箇所に記載のベクター（例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス）及び／または粒子及び／またはナノ粒子送達を用いて真核細胞に送達され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系成分を送達するためのレンチウイルス及びレトロウイルス系、ならびに非ウイルス系は、当技術分野で一般に知られている。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系成分用のＡＡＶ及びアデノウイルスベースの系は、当技術分野で一般に知られているとともに、本明細書に記載されている（例えば、本発明の操作されたＡＡＶ）。
当業者には、本明細書で言及する細胞、例えば、Ｃａｓトランスジェニック細胞は、本明細書で言及するように、さらに、Ｃａｓ遺伝子の組み込みを有する他に、またはＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡと複合体を形成した場合にＣａｓの配列特異的作用から生じる変異の他にゲノム変化を含んでもよいことが理解されよう。
ある特定の実施形態では、本発明は、例えば、細胞内にＣａｓ及び／またはＣａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡ（すなわち、ガイドＲＮＡ）を送達または導入するためであるが、これらの成分を（例えば、原核細胞で）増殖させるためでもあるベクターを含む。これは、本明細書に記載の操作されたＡＡＶ粒子によってまだ送達されていない１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分または他の遺伝子組み換え系成分の送達に加えてであることができる。本明細書で使用される、「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移動を可能にするまたは促進するツールである。それは、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得るプラスミド、ファージ、またはコスミド等のレプリコンである。通常、ベクターは、適切な制御要素に関連している場合、複製が可能である。一般に、用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターとしては、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子、１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子、及び当技術分野で知られている他の類型のポリヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術等によって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのベクターに存在する。ウイルスベクターにはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって担持されるポリヌクレオチドが含まれる。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組み換えＤＮＡ技術において実用性のある一般的な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。
組み換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含み得る。これは、該組み換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の制御要素を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系においてまたはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で制御要素（複数可）に連結されることを意味することが意図されている。組み換え及びクローニング方法に関しては、その内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０１７１１５６号が参照される。したがって、本明細書に開示する実施形態はまた、該ＣＲＩＳＰＲエフェクター系を含むトランスジェニック細胞も含み得る。ある特定の例示的な実施形態では、該トランスジェニック細胞は、個々の別々の量で機能し得る。換言すれば、マスキング構築物を含むサンプルが、例えば、適切な送達用小胞で細胞に送達されてもよく、該標的が該送達用小胞に存在する場合、該ＣＲＩＳＰＲエフェクターは活性化され、検出可能なシグナルが生成される。
該ベクター（複数可）は、制御要素（複数可）、例えば、プロモーター（複数可）を含み得る。該ベクター（複数可）は、Ｃａｓのコーディング配列を含むことができ、及び／または単一、場合によっては少なくとも３または８または１６または３２または４８または５０個のガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）、例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～８、３～１６、３～３０、３～３２、３～４８、３～５０個のＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡｓ）のコーディング配列を含むこともできる。単一のベクターにおいて、ＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）ごとにプロモーターを含むことができ、有利には、最大約１６個のＲＮＡを含む場合、及び、単一のベクターが１６個を超えるＲＮＡを提供する場合、１つ以上のプロモーターが、該複数のＲＮＡの発現を駆動することができ、例えば、３２個のＲＮＡが存在する場合、各プロモーターは、２つのＲＮＡの発現を駆動することができ、４８個のＲＮＡが存在する場合、各プロモーターは、３つのＲＮＡの発現を駆動することができる。単純計算及び既知のクローニングプロトコル及び本開示の教示により、当業者には、本発明を、ＡＡＶ等の適切な例示的なベクター及びＵ６プロモーター等の適切なプロモーターのために該ＲＮＡ（複数可）について容易に実践することができる。例えば、ＡＡＶのパッケージング限度は、約４．７ｋｂである。単一のＵ６－ｇＲＮＡ（プラスクローニング用の制限酵素認識部位）の長さは３６１ｂｐである。したがって、当業者には、約１２～１６、例えば、１３個のＵ６－ｇＲＮＡカセットを単一のベクターに容易に入れることができる。これは、任意の適切な方法、例えば、ＴＡＬＥアセンブリに使用されるゴールデンゲート法（ｇｅｎｏｍｅ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔａｌｅｆｆｅｃｔｏｒｓ／）で組み立てることができる。当業者には、タンデムガイド法を使用して、Ｕ６－ｇＲＮＡの数を約１．５倍にすること、例えば、１２～１６、例えば、１３個を約１８～２４、例えば、約１９個のＵ６－ｇＲＮＡまで増やすこともできる。したがって、当業者には、単一のベクター、例えば、ＡＡＶベクターに約１８～２４、例えば、約１９個のプロモーター－ＲＮＡ、例えば、Ｕ６－ｇＲＮＡを入れることが容易にできる。ベクター内のプロモーター及びＲＮＡの数を増やすためのさらなる手段は、単一のプロモーター（例えば、Ｕ６）を使用して、切断可能な配列によって分離されたＲＮＡのアレイを発現させることである。ベクター内のプロモーター－ＲＮＡの数を増やすためのなおさらなる手段は、コーディング配列または遺伝子のイントロンに含まれる切断可能な配列によって分離されたプロモーター－ＲＮＡのアレイを発現させることであり、この例では、ポリメラーゼＩＩプロモーターを使用することが有利であり、これにより、発現の向上を示すことができ、また、組織特異的に長いＲＮＡの転写を可能にすることができる（例えば、ｎａｒ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４／７／ｅ５３．ｓｈｏｒｔ及びｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｍｔ／ｊｏｕｒｎａｌ／ｖ１６／ｎ９／ａｂｓ／ｍｔ２００８１４４ａ．ｈｔｍｌ参照）。有利な実施形態では、ＡＡＶは、最大約５０個の遺伝子を標的とするＵ６タンデムｇＲＮＡをパッケージングしてもよい。したがって、当技術分野の知識から、及び本開示における教示から、当業者には、特に、本明細書に論じられるＲＮＡまたはガイドの数に関して、必要以上の実験を行うことなく、１つ以上のプロモーターの制御下で、またはこれに作動可能にもしくは機能的に連結された複数のＲＮＡまたはガイドを発現するベクター（複数可）、例えば、単一のベクターを作製及び使用することが容易にできる。
該ガイドＲＮＡ（複数可）のコーディング配列及び／またはＣａｓのコーディング配列は、制御要素（複数可）に機能的にまたは作動可能に連結することができるため、該制御要素（複数可）が発現を駆動する。該プロモーター（複数可）は、構成的プロモーター（複数可）及び／または条件付きプロモーター（複数可）及び／または誘導性プロモーター（複数可）及び／または組織特異的プロモーター（複数可）であり得る。該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｔ７、Ｕ６、Ｈ１、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターからなる群から選択され得る。有利なプロモーターは、Ｕ６である。
本発明に従う使用のためのさらなるエフェクターは、ｃａｓ１遺伝子に近いこと、例えば、これに限定されないが、ｃａｓ１遺伝子の開始から２０ｋｂ及びｃａｓ１遺伝子の終わりから２０ｋｂの領域内であることによって同定され得る。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン及び少なくとも５００個のアミノ酸を含み、Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核生物ゲノムにおいてＣａｓ遺伝子またはＣＲＩＳＰＲアレイの２０ｋｂ上流または下流内に天然に存在する。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ １２、Ｃａｓ １２ａ、Ｃａｓ １３ａ、Ｃａｓ １３ｂ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの修飾型が挙げられる。ある特定の例示的な実施形態では、該Ｃ２ｃ２エフェクタータンパク質は、原核生物ゲノムにおいてＣａｓ１遺伝子の２０ｋｂ上流または下流内に天然に存在する。用語「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）は、当技術分野では周知である。さらなるガイダンスを用いて、本明細書で使用される、タンパク質の「ホモログ」とは、それがホモログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を行う同じ種のタンパク質である。ホモログなタンパク質は、必ずしもではないが、構造的に関連していてもよく、または一部のみが構造的に関連している。本明細書で使用される、タンパク質の「オルソログ」とは、それがオルソログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を行う異なる種のタンパク質である。オルソログなタンパク質は、必ずしもではないが、構造的に関連していてもよく、または一部のみが構造的に関連している。
いくつかの実施形態では、核酸標的化系の１つ以上の要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化系を含む特定の生物に由来する。ある特定の実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ標的化系は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに見出される。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、標的化されたコラテラルｓｓＲＮＡ切断活性を含む。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、二重ＨＥＰＮドメインを含む。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１３ａのＨｅｌｉｃａｌ－１ドメインの対応ドメインを欠く。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、以前に特徴づけられたクラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターより小さく、メジアンサイズは９２８ａａである。このメジアンサイズは、Ｃａｓ１３ｃのものより１９０ａａ（１７％）小さく、Ｃａｓ１３ｂのものより２００ａａ（１８％）超小さく、Ｃａｓ１３ａのものより３００ａａ（２６％）超小さい。ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質は、フランキング配列（例えばＰＦＳ、ＰＡＭ）を必要としない。
ある特定の実施形態では、該エフェクタータンパク質の遺伝子座構造は、ＷＹＬドメインを含むアクセサリータンパク質（最初に同定されたこれらのドメインの群に保存された３つのアミノ酸にちなんでこのように表示される。例えば、ＷＹＬドメインＩＰＲ０２６８８１参照）を含む。ある特定の実施形態では、該ＷＹＬドメインアクセサリータンパク質は、少なくとも１つのヘリックスターンヘリックス（ＨＴＨ）またはリボンヘリックスヘリックス（ＲＨＨ）ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、該ＷＹＬドメインを含むアクセサリータンパク質は、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質の標的化された及びコラテラルｓｓＲＮＡ切断活性の両方を増加させる。ある特定の実施形態では、該ＷＹＬドメインを含むアクセサリータンパク質は、Ｎ末端ＲＨＨドメイン、及び元のＷＹＬモチーフに対応する不変のチロシン－ロイシンダブレットを含めた主として疎水性の保存残基のパターンを含む。ある特定の実施形態では、該ＷＹＬドメインを含むアクセサリータンパク質は、ＷＹＬ１である。ＷＹＬ１は、主にＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓに関連する単一のＷＹＬドメインタンパク質である。
他の例示的な実施形態では、該ＶＩ型ＲＮＡ標的化Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１３ｄである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ１３ｄは、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｒａｅｕｍ ＤＳＭ１５７０２（ＥｓＣａｓ１３ｄ）またはＲｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｎ１５．ＭＧＳ－５７（ＲｓｐＣａｓ１３ｄ）（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｓ１３ｄ Ｉｓ ａ Ｃｏｍｐａｃｔ ＲＮＡ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｙｐｅ ＶＩ ＣＲＩＳＰＲ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ＷＹＬ－Ｄｏｍａｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２０１８），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１８．０２．０２８参照）である。ＲｓｐＣａｓ１３ｄ及びＥｓＣａｓ１３ｄは、フランキング配列（例えば、ＰＦＳ、ＰＡＭ）が必要ない。
本明細書に提供する方法、系、及びツールは、参照により全体として本明細書に組み込まれるＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖ．１，ｎ．，５（２０１８）；ＤＯＩ：１０．１０８９／ｃｒｉｓｐｒ．２０１８．００３３、特にｐ．３２６の図１に記載のＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型のＣａｓタンパク質であり得るクラス１のＣＲＩＳＰＲタンパク質との使用のためにデザインされ得る。該クラス１系は、通常、多タンパク質エフェクター複合体を使用し、これは、いくつかの実施形態では、補助タンパク質、例えば、抗ウイルス防御（カスケード）用ＣＲＩＳＰＲ関連複合体と呼ばれる複合体における１つ以上のタンパク質、１つ以上の適応タンパク質（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、ＲＮＡヌクレアーゼ）、及び／または１つ以上のアクセサリータンパク質（例えば、Ｃａｓ４、ＤＮＡヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ロスマンフォールド（ＣＡＲＦ）ドメイン含有タンパク質、及び／またはＲＮＡトランスクリプターゼを含むことができる。クラス１系は配列類似性が限られているが、クラス１系のタンパク質は、１つ以上のリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）ファミリーのサブユニット、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７を含めたそれらの同様の構造によって識別され得る。ＲＡＭＰタンパク質は、１つ以上のＲＮＡ認識モチーフドメインを有することを特徴とする。大きいサブユニット（例えば、ｃａｓ８またはｃａｓ１０）及び小さいサブユニット（例えば、ｃａｓ１１）もまた、Ｃｌａｓｓ１系に特有である。例えば、図１及び２を参照されたい。Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ．２０１９ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ ３７４：２０１８００８７，ＤＯＩ：１０．１０９８／ｒｓｔｂ．２０１８．００８７。１つの実施形態では、クラス１系は、シグネチャータンパク質Ｃａｓ３を特徴とする。特定のクラス１タンパク質におけるカスケードは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡに結合し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのプロセシングに直接関与するヌクレアーゼである追加のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ６またはＣａｓ５を動員する複数のＣａｓタンパク質の専用複合体を含み得る。１つの実施形態では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上のＣａｓ５サブユニット及び２つ以上のＣａｓ７サブユニットを含むエフェクター複合体を含む。クラス１サブタイプには、Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、及びＩ－Ｆ型、ＩＶ－Ａ及びＩＶ－Ｂ型、及びＩＩＩ－Ａ、ＩＩＩ－Ｄ、ＩＩＩ－Ｃ、及びＩＩＩ－Ｂ型が含まれる。クラス１系にはまた、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ及びＩ－Ｕバリアントを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓバリアントが含まれ、これには、Ｔｎ７様トランスポゾンの大きなファミリーによってコードされるサブタイプＩ－Ｆのバージョン及び同様に分解されるサブタイプＩ－Ｂ系をコードするＴｎ７様トランスポゾンのより小さな群を含む、トランスポゾン及びプラスミドによって担持されるバリアントが含まれ得る。Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１４（３５）（２０１７）；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０９０３５１１４、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖ．１ ，ｎ５，Ｆｉｇｕｒｅ ５も参照されたい。
Ｃａｓ分子
いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、Ｃａｓポリペプチドまたはその断片をコードし得るＣａｓポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドである場合もあれば、それを含む場合もある。任意のＣａｓ分子は、カーゴ分子であり得る。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子は、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のＣａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、Ｉ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、ＩＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、ＩＶ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、Ｖ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、ＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓポリペプチドは、ＶＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの修飾型が挙げられる。
ガイド配列
本明細書で使用される、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の状況における用語「ガイド配列」及び「ガイド分子」は、標的核酸配列とハイブリダイズするために、及び核酸標的化複合体の該標的核酸配列との配列特異的結合を指示するために十分な該標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。本明細書に開示する方法を使用して作製されたガイド配列は、完全長ガイド配列、切断型ガイド配列、完全長ｓｇＲＮＡ配列、切断型ｓｇＲＮＡ配列、またはＥ＋ＦｓｇＲＮＡ配列であり得る。各ｇＲＮＡは、同じまたは異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えば、アプタマー）を含むようにデザインされ得る。各ｇＲＮＡは、転写開始部位（すなわち、ＴＳＳ）の上流のプロモーター領域－１０００から＋１核酸、好ましくは、－２００核酸に結合するようにデザインされ得る。この位置決めにより、遺伝子活性化（例えば、転写活性化因子）または遺伝子阻害（例えば、転写リプレッサー）に影響を与える機能ドメインが改善される。修飾されたｇＲＮＡは、組成物に含まれる１つ以上の標的遺伝子座を標的とする１つ以上の修飾されたｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つのｇＲＮＡ、少なくとも５つのｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）であり得る。かかる複数のｇＲＮＡ配列は、タンデムに配列することができ、好ましくは、ダイレクトリピートによって分離される。
いくつかの実施形態では、所与の標的配列に対する該ガイド配列の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。ある特定の例示的な実施形態では、該ガイド分子は、該ガイド配列と該標的配列の間にＲＮＡ二本鎖が形成されるように、該標的配列と少なくとも１つのミスマッチを有するようにデザインされ得るガイド配列を含む。したがって、該相補性の程度は、好ましくは、９９％未満である。例えば、該ガイド配列が２４個のヌクレオチドからなる場合、該相補性の程度は、より具体的には約９６％以下である。特定の実施形態では、該ガイド配列は、全ガイド配列にわたる相補性の程度が、さらに減少するように、２つ以上の隣接するミスマッチヌクレオチドのストレッチを有するようにデザインされる。例えば、該ガイド配列が２４個のヌクレオチドからなる場合、該相補性の程度は、該２つ以上のミスマッチヌクレオチドのストレッチが、２、３、４、５、６または７個のヌクレオチド等を包含するかどうかに応じて、より具体的には約９６％以下、より具体的には、約９２％以下、より具体的には、約８８％以下、より具体的には、約８４％以下、より具体的には、約８０％以下、より具体的には、約７６％以下、より具体的には、約７２％以下である。いくつかの実施形態では、該１つ以上のミスマッチヌクレオチドのストレッチの他に、該相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。最適アラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内の）が標的核酸配列に対する核酸標的化複合体の配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含めた核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の成分は、該核酸標的化複合体の成分をコードするベクターでのトランスフェクション等によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され、続いて本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ等によって、該標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）が評価され得る。同様に、標的核酸配列（またはその前後の配列）の切断は、該標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めた核酸標的化複合体の成分を提供し、該試験及び対照ガイド配列反応の間の該標的配列でのまたはその前後の結合または切断率を比較することによって試験管において評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者には思い浮かぶであろう。ガイド配列、よって核酸標的化ガイドＲＮＡは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択され得る。
本明細書で使用される、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座エフェクタータンパク質の「ｃｒＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡ」または「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」または「１つ以上の核酸成分」という用語は、標的核酸配列とハイブリダイズするために、及び核酸標的化複合体の該標的核酸配列との配列特異的結合を指示するために十分な該標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、該相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。最適アラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内の）が標的核酸配列に対する核酸標的化複合体の配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含めた核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲ系の成分は、該核酸標的化複合体の成分をコードするベクターでのトランスフェクション等によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され、続いて本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ等によって、該標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）が評価され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、該標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めた核酸標的化複合体の成分を提供し、該試験及び対照ガイド配列反応の間の該標的配列での結合または切断率を比較することによって試験管において評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者には思い浮かぶであろう。ガイド配列、よって核酸標的化ガイドは、任意の標的核酸配列を標的とするように選択され得る。該標的配列は、ＤＮＡでよい。該標的配列は、任意のＲＮＡ配列でよい。いくつかの実施形態では、該標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び細胞質低分子ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、該標的配列は、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、該標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、該標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドは、該核酸標的化ガイド内の二次構造の程度を減少させるために選択される。いくつかの実施形態では、該核酸標的化ガイドのヌクレオチドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％もしくはそれ未満、またはそれ以下が、最適に折り畳まれた場合に自己相補性塩基対合に関与する。最適なフォールディングは、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づく。１つのかかるアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって記載されているｍＦｏｌｄである。別の例示的なフォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用する、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｅｎｎａにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発されたオンラインウエブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４、及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２参照）。
ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態では、該ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結されたダイレクトリピート配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態では、該ダイレクトリピート配列は、該ガイド配列またはスペーサー配列から上流（すなわち、５’）に位置し得る。他の実施形態では、該ダイレクトリピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から下流（すなわち、３’）に位置し得る。
ある特定の実施形態では、該ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。ある特定の実施形態では、該ダイレクトリピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
ある特定の実施形態では、該ガイドＲＮＡのスペーサーの長さは、１５～３５ｎｔである。ある特定の実施形態では、該ガイドＲＮＡのスペーサーの長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、該スペーサーの長さは、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、もしくは１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、もしくは２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、もしくは２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、もしくは２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、もしくは３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、もしくは３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列または類似の用語には、ハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間の、その２つの短い方の長さに沿った相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ配列及びｃｒＲＮＡ配列は、その２つの間のハイブリダイゼーションがヘアピン等の二次構造を有する転写物を産生するように、単一の転写物内に含まれる。本発明の実施形態では、該転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、該転写物は、２、３、４または５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、該転写物は、最大で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最後の「Ｎ」の５’の配列の部分及びループの上流は、該ｔｒａｃｒメイト配列に対応し、該ループの３’の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。
一般に、相補性の程度は、ｓｃａ配列及びｔｒａｃｒ配列の最適アラインメントに関し、その２つの配列の短い方の長さに沿ったものである。最適アラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、該ｓｃａ配列またはｔｒａｃｒ配列のいずれかにおける自己相補性等の二次構造をさらに考慮し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列とｓｃａ配列との間の、その２つの短い方の長さに沿った相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ系は、前述の文献、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）において使用されるものでよく、まとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現またはその指示に関与する転写物及び他の要素を指し、それには、Ｃａｓ遺伝子、特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９の場合はＣａｓ９遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況において「直接リピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセス部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況において「スペーサー」とも称される）、またはその用語が本明細書で使用される通りである「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡもしくはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が含まれる。通常、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況においてプロトスペーサーとも称される）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の状況において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するようにデザインされた配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列に対する相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列のセクションは、本明細書ではシード配列と呼ばれる。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置し、細胞内に存在するミトコンドリア、細胞小器官、小胞、リポソームまたは粒子内のまたはそれに由来する核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、特に非核内使用の場合、ＮＬＳは好ましくない。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上の核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、１つ以上のＮＬＳ及び１つ以上のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピートは、以下の基準のうちのいずれかまたはすべてを満たす反復モチーフを検索することによってインシリコで同定され得る：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂのウィンドウに見出される、２．２０～５０ｂｐに及ぶ、及び３．２０～５０ｂｐの間隔。いくつかの実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば、１と２、２と３、または１と３が使用され得る。いくつかの実施形態では、３つすべての基準が使用され得る。
本発明の実施形態では、用語、ガイド配列及びガイドＲＮＡ、すなわち、Ｃａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドすることが可能なＲＮＡは、前述の文献、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）の通り、同義で使用される。一般に、ガイド配列は、標的核酸配列とハイブリダイズするために、及びＣＲＩＳＰＲ複合体の該標的配列との配列特異的結合を指示するために十分な該標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、該ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。最適アラインメントは、配列をアラインするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドである。好ましくは、該ガイド配列は、１０ ３０ヌクレオチド長である。ガイド配列が標的核酸配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分は、ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでのトランスフェクション等によって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され、続いて本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ等によって、該標的配列内の優先的切断が評価され得る。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、該標的配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の成分を提供し、該試験及び対照ガイド配列反応の間の該標的配列での結合または切断率を比較することによって試験管において評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者には思い浮かぶであろう。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系のいくつかの実施形態では、該ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくは１００％であるか、またはそれより大きい可能性があり、ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチドであってよく、あるいはガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、またはそれより少ないヌクレオチドであってよく、有利には、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが３０または５０ヌクレオチドである。しかしながら、本発明の実施形態は、オフターゲット相互作用を低減するためのものであり、例えば、相補性が低い標的配列とのガイドの相互作用を低減するためのものである。実際、該例では、本発明が、８０％超～約９５％の相補性、例えば、８３％～８４％または８８～８９％または９４～９５％の相補性を有する標的配列とオフターゲット配列間を区別する（例えば、１８ヌクレオチドを有する標的と１、２または３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットを区別する）ことができるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系をもたらす変異を含むことが示される。したがって、本発明の状況において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％もしくは９５％もしくは９５．５％もしくは９６％もしくは９６．５％もしくは９７％もしくは９７．５％もしくは９８％もしくは９８．５％もしくは９９％もしくは９９．５％もしくは９９．９％超であるか、または１００％である。オフターゲットは、該配列と該ガイドとの間が、１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満の相補性であり、オフターゲットは、該配列と該ガイドとの間が、１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
本発明に従う特に好ましい実施形態では、該ガイドＲＮＡ（Ｃａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能）は、（１）真核細胞のゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズすることが可能なガイド配列、（２）ｔｒａｃｒ配列、及び（３）ｔｒａｃｒメイト配列を含み得る。（１）～（３）のすべては、単一のＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡに存在する（５’から３’に配置される）場合もあれば、ｔｒａｃｒＲＮＡがガイド及びｔｒａｃｒ配列を含むＲＮＡと異なるＲＮＡである場合もある。ｔｒａｃｒは、ｔｒａｃｒメイト配列にハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的配列に向ける。該ｔｒａｃｒＲＮＡが該ガイド及びｔｒａｃｒ配列を含むＲＮＡとは異なるＲＮＡに存在する場合、各ＲＮＡの長さは、それぞれの天然の長さよりも短くなるように最適化してもよく、各々を独立して化学修飾し、細胞のＲＮａｓｅによる分解から保護しても他の方法で安定性を増加させてもよい。
本明細書に記載の本発明の方法は、本明細書に論じるベクターを細胞に送達することを含む本明細書に論じる真核細胞での１つ以上の変異の誘導（インビトロで、すなわち、単離された真核細胞内で）を含む。該変異（複数可）としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介した細胞（複数可）の各標的配列での１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列での１～７５個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列での１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介した該細胞（複数可）の各標的配列での５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列での１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換が挙げられる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。該変異としては、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可）を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を挙げることができる。
毒性及びオフターゲット効果を最小化するため、送達されるＣａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞または非ヒト真核生物動物モデルにて異なる濃度を調べ、ディープシーケンシングを使用して潜在的オフターゲットゲノム遺伝子座での修飾の程度を分析することによって決定され得る。代替的には、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小化するために、ＣａｓニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９）が、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡ対とともに送達され得る。毒性及びオフターゲット効果を最小化するガイド配列及び戦略は、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）におけるもの、または、本明細書の変異を介するものであり得る。
通常、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む）の形成により、標的配列においてまたはその近く（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）で一方または両方の鎖の切断がもたらされる。理論に拘束されることを望むものではないが、野生型ｔｒａｃｒ配列のすべてまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチド）を含み、またはそれからなり得るｔｒａｃｒ配列はまた、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列のすべてまたは一部への、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーション等によって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、天然に存在しない核酸及び／または天然に存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログ、及び／または化学修飾を含む。天然に存在しない核酸としては、例えば、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドの混合物を挙げることができる。天然に存在しないヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、リボース、リン酸、及び／または塩基部分で修飾され得る。本発明の実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチド及び非リボヌクレオチドを含む。１つのかかる実施形態では、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチド及び１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明の実施形態では、該ガイドは、１つ以上の天然に存在しないヌクレチドまたはヌクレチドアナログ、例えば、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合を有するヌクレオチド、リボース環の２’と４’炭素間にメチレン架橋を含むロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。修飾ヌクレオチドの他の例としては、２’－Ｏ－メチルアナログ、２’－デオキシアナログ、２－チオウリジンアナログ、Ｎ６－メチルアデノシンアナログ、または２’－フルオロアナログが挙げられる。修飾ヌクレオチドのさらなる例としては、２’位での化学部分の結合が挙げられ、ペプチド、核局在配列（ＮＬＳ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。修飾塩基のさらなる例としては、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシンが挙げられるがこれらに限定されない。ガイドＲＮＡの化学修飾の例としては、１つ以上の末端ヌクレオチドでの２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、または２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）の組み込みが挙げられるがこれらに限定されない。かかる化学修飾されたガイドは、未修飾のガイドと比較して、安定性の向上及び活性の向上を含み得るが、オンターゲット対オフターゲット特異性は、予測されない（Ｈｅｎｄｅｌ，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２９０，２０１５年６月２９日オンラインで公開、Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８：９０１－９０４、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２，３：１５４、Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１５，１１２：１１８７０－１１８７５、Ｓｈａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，ＭｅｄＣｈｅｍＣｏｍｍ．，２０１４，５：１４５４－１４７１、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５） ３３（９）：９８５－９８９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１，００６６ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０１７－００６６、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１８）４６（２）：７９２－８０３参照）。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの５’及び／または３’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグを含めた様々な官能基で修飾される（Ｋｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３３：７４－８３参照）。ある特定の実施形態では、ガイドは、標的ＤＮＡに結合する領域にリボヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはＣ２ｃ１に結合する領域に１つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログを含む。本発明の実施形態では、デオキシリボヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログは、操作されたガイド構造、例えば、これらに限定されないが、５’及び／または３’末端、ステムループ領域、及びシード領域に組み込まれる。ある特定の実施形態では、該修飾は、ステムループ領域の５’ハンドルにはない。ガイドのステムループ領域の５’ハンドルでの化学修飾は、その機能を無効にし得る（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６参照）。ある特定の実施形態では、ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５個のヌクレオチドが化学修飾される。いくつかの実施形態では、ガイドの３’または５’末端のいずれかで３～５個のヌクレオチドが化学修飾される。いくつかの実施形態では、シード領域では、若干の修飾、例えば、２’－Ｆ修飾のみが導入される。いくつかの実施形態では、２’－Ｆ修飾は、ガイドの３’末端に導入される。ある特定の実施形態では、該ガイドの５’及び／または３’末端で３～５個のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、または２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）で化学修飾される。かかる修飾により、ゲノム編集効率が向上され得る（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３（９）：９８５－９８９、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１８）４６（２）：７９２－８０３参照）。ある特定の実施形態では、遺伝子破壊のレベルの向上のため、ガイドのホスホジエステル結合のすべてがホスホロチオエート（ＰＳ）で置換される。ある特定の実施形態では、該ガイドの５’末端及び／または３’末端の５個を超えるヌクレオチドが、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－ＦまたはＳ－拘束エチル（ｃＥｔ）で化学修飾される。かかる化学修飾されたガイドは、高レベルの遺伝子破壊を媒介することができる（Ｒａｇｄａｒｍ ｅｔ ａｌ．，０２１５，ＰＮＡＳ，Ｅ７１１０－Ｅ７１１１参照）。本発明の実施形態では、ガイドは、その３’末端及び／または５’末端に化学部分を含むように修飾される。かかる部分としては、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ローダミン、ペプチド、核局在配列（ＮＬＳ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）が挙げられるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、該化学部分は、該ガイドに、リンカー、例えば、アルキル鎖によってコンジュゲートされる。ある特定の実施形態では、該修飾されたガイドの化学部分は、該ガイドを別の分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、またはナノ粒子に結合させるために使用され得る。かかる化学修飾されたガイドは、ＣＲＩＳＰＲ系によって一般に編集される細胞を特定または濃縮するために使用され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ｅＬｉｆｅ，２０１７，６：ｅ２５３１２，ＤＯＩ：１０．７５５４参照）。いくつかの実施形態では、該３’及び５’末端の各々で３つのヌクレオチドが化学修飾される。特定の実施形態では、該修飾は、２’－Ｏ－メチルまたはホスホロチオエートアナログを含む。特定の実施形態では、テトラループの１２個のヌクレオチド及びステムループ領域の１６個のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルアナログで置換される。かかる化学修飾により、インビボ編集及び安定性が改善される（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８），２２：２２２７－２２３５参照）。いくつかの実施形態では、該ガイドの６０を超えるまたは７０を超えるヌクレオチドが化学修飾される。いくつかの実施形態では、この修飾は、２’－Ｏ－メチルもしくは２’－フルオロヌクレオチドアナログによるヌクレオチドの置換またはホスホジエステル結合のホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、該化学修飾は、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される際にヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドヌクレオチドの２’－Ｏ－メチルもしくは２’－フルオロ修飾または該ガイドの３’末端の２０から３０もしくはそれを超えるヌクレオチドのＰＳ修飾を含む。特定の実施形態では、該化学修飾はさらに、該ガイドの５’末端における２’－Ｏ－メチルアナログまたはシード及びテール領域における２’－フルオロアナログを含む。かかる化学修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する安定性が改善され、ゲノム編集活性または効率が維持されまたは高まるが、すべてのヌクレオチドの修飾は、当該ガイドの機能を無効にし得る（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１８），３５（１２）：１１７９－１１８７参照）。かかる化学修飾は、限られた数のヌクレアーゼとＲＮＡの２’－ＯＨの相互作用の知識を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構造の知識によって導かれ得る（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１８），３５（１２）：１１７９－１１８７参照）。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡヌクレオチドで置換されてもよい。いくつかの実施形態では、５’末端テール／シードのガイド領域の最大２、４、６、８、１０、または１２個のＲＮＡヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡヌクレオチドの３’末端の大部分が、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。特定の実施形態では、該３’末端の１６個のガイドＲＮＡヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。特定の実施形態では、該５’末端テール／シード領域の８個のガイドＲＮＡヌクレオチド及び該３’末端の１６個のＲＮＡヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体が形成される際にヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドＲＮＡヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。複数のＲＮＡヌクレオチドのＤＮＡヌクレオチドでのかかる置換により、未修飾のガイドと比較して、オフターゲット活性は低下するがオンターゲット活性は同様である。しかしながら、３’末端のすべてのＲＮＡヌクレオチドの置換は、当該ガイドの機能を無効にし得る（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）１４，３１１－３１６参照）。かかる修飾は、限られた数のヌクレアーゼとＲＮＡの２’－ＯＨの相互作用の知識を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の構造の知識によって導かれ得る（Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２０１８）１４，３１１－３１６参照）。
本発明の１つの実施形態では、該ガイドは、５’ハンドルを有し、ガイドセグメントがさらにシード領域及び３’末端を含むＣｐｆ１用に修飾されたｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、該修飾されたガイドは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６ Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ Ｃｐｆ１（Ｌｂ３Ｃｐｆ１）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ Ｃｐｆ１（ＢｐＣｐｆ１）、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７ Ｃｐｆ１（ＰｂＣｐｆ１）、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０ Ｃｐｆ１（ＰｅＣｐｆ１）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ Ｃｐｆ１（ＬｉＣｐｆ１）、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣ＿Ｋ０８Ｄ１７ Ｃｐｆ１（ＳｓＣｐｆ１）、Ｌ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０ Ｃｐｆ１（Ｌｂ２Ｃｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ Ｃｐｆ１（ＰｃＣｐｆ１）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ Ｃｐｆ１（ＰｍＣｐｆ１）、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ Ｃｐｆ１（ＣＭｔＣｐｆ１）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ Ｃｐｆ１（ＥｅＣｐｆ１）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７ Ｃｐｆ１（ＭｂＣｐｆ１）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ Ｃｐｆ１（ＰｄＣｐｆ１）、またはＬ．ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）のうちのいずれか１つのＣｐｆ１とともに使用され得る。
いくつかの実施形態では、該ガイドに対する修飾は、化学修飾、挿入、欠失または分割である。いくつかの実施形態では、該化学修飾としては、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログ、２’－デオキシアナログ、２－チオウリジンアナログ、Ｎ６－メチルアデノシンアナログ、２’－フルオロアナログ、２－アミノプリン、５－ブロモ－ウリジン、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１－メチルプソイドウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、イノシン、７－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、Ｓ－拘束エチル（ｃＥｔ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、または２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）の組み込みが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該ガイドは、１つ以上のホスホロチオエート修飾を含む。ある特定の実施形態では、該ガイドの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２５個のヌクレオチドが化学修飾される。いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態では、該シード領域の１つ以上のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態では、３’末端の１つ以上のヌクレオチドが化学修飾される。ある特定の実施形態では、該５’ハンドルのヌクレオチドのいずれも化学修飾されない。いくつかの実施形態では、該シード領域の化学修飾は、若干の修飾、例えば、２’－フルオロアナログの組み込みである。特定の実施形態では、該シード領域の１つのヌクレオチドが２’－フルオロアナログで置換される。いくつかの実施形態では、３’末端の５または１０個ヌクレオチドが化学修飾される。該Ｃｐｆ１ ＣｒＲＮＡの３’末端でのかかる化学修飾により、遺伝子切断効率が改善される（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１７，１：００６６参照）。特定の実施形態では、該３’末端において５つのヌクレオチドが２’－フルオロアナログで置換される。特定の実施形態では、該３’末端において１０個のヌクレオチドが２’－フルオロアナログで置換される。特定の実施形態では、該３’末端において５個のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル（Ｍ）アナログで置換される。いくつかの実施形態では、３’及び５’末端の各々で３つのヌクレオチドが化学修飾される。特定の実施形態では、該修飾は、２’－Ｏ－メチルまたはホスホロチオエートアナログを含む。特定の実施形態では、テトラループの１２個のヌクレオチド及びステムループ領域の１６個のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチルアナログで置換される。かかる化学修飾により、インビボ編集及び安定性が改善される（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８），２２：２２２７－２２３５参照）。
いくつかの実施形態では、該ガイドの５’ハンドルのループが修飾される。いくつかの実施形態では、該ガイドの５’ハンドルのループは、欠失、挿入、分割、または化学修飾を有するように修飾される。ある特定の実施形態では、該ループは、３、４、または５個のヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、該ループは、ＵＣＵＵ、ＵＵＵＵ、ＵＡＵＵ、またはＵＧＵＵの配列を含む。いくつかの実施形態では、該ガイド分子は、別々の非共有結合的に連結された配列でステムループを形成し、これは、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。
合成的に連結されたガイド
１つの実施形態では、該ガイドは、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含み、これらは化学的に連結されるか、または非ホスホジエステル結合を介してコンジュゲートされる。１つの実施形態では、該ガイドは、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒメイト配列を含み、これらは化学的に連結されるか、または非ヌクレオチドループを介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、非ホスホジエステル共有結合リンカーを介して結合される。該共有結合リンカーの例としては、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリアジン、ヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルフォン（ｆｕｌｆｏｎｅ）、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性結合、ディールス・アルダー付加環化対または閉環メタセシス対等の基を形成するＣ－Ｃ結合、及びマイケル反応対からなる群から選択される化学部分が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、第一に標準的なホスホルアミダイト合成プロトコル（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．，ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌ ２８８，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（２０１２））を使用して合成される。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒまたはｔｒａｃｒメイト配列を官能化し、当技術分野で知られている標準的なプロトコルを使用して、連結反応用に適切な官能基を含めることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３））。官能基の例としては、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハライド、カルボン酸の活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド（ｈｙｄｒｏｚｉｄｅ）、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スルホニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、及びアジドが挙げられるがこれらに限定されない。該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列が官能化された後、共有結合的化学結合または連結がこれら２つのヌクレオチド間で形成され得る。化学結合の例としては、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリアジン、ヒドロゾン（ｈｙｄｒｏｚｏｎｅ）、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、フルフォン（ｆｕｌｆｏｎｅ）、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光解離性結合、ディールス・アルダー付加環化対または閉環メタセシス対等の基を形成するＣ－Ｃ結合、及びマイケル反応対に基づくものが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、化学合成され得る。いくつかの実施形態では、該化学合成は、２’－アセトキシエチルオルソエステル（２’－ＡＣＥ）（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）または２’－チオノカルバメート（２’－ＴＣ）化学（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０１１）１３３：１１５４０－１１５４６、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１５）３３：９８５－９８９）による自動固相オリゴヌクレオチド合成機械を使用する
いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、様々なバイオコンジュゲーション反応、ループ、架橋、及び非ヌクレオチド連結を使用して、糖、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合、プリン及びピリミジン残基の修飾を介して共有結合され得る。Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００９）４８：６９７４－６９９８、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（２００４）８：５７０－９、Ｂｅｈｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ （２００８）１８：３０５－１９、Ｗａｔｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ （２００８）１３：８４２－５５、Ｓｈｕｋｌａ，ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ （２０１０）５：３２８－４９。
いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、クリックケミストリーを使用して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、トリアゾールリンカーを使用して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、アルキン及びアジドに関与するヒュスゲン１，３－双極子付加環化反応を使用して共有結合され、高度に安定なトリアゾールリンカーを得ることができる（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２０１５）１７：１８０９－１８１２、ＷＯ２０１６／１８６７４５）。いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡ及び３’－アジドｃｒＲＮＡを結合することによって共有結合され得る。いくつかの実施形態では、該５’－ヘキシンｔｒａｃｒＲＮＡ及び３’－アジドｃｒＲＮＡのいずれかまたは両方を、２’－アセトキシエチルオルソエステル（２’－ＡＣＥ）基で保護することができ、これがその後Ｄｈａｒｍａｃｏｎのプロトコルを使用して除去され得る（Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１１８２０－１１８２１、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３１７：３－１８）。
いくつかの実施形態では、該ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒメイト配列は、スペーサー、アタッチメント、バイオコンジュゲート、クロモフォア、レポーター基、色素標識ＲＮＡ、及び天然に存在しないヌクレオチドアナログ等の部分を含むリンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）を介して共有結合され得る。より具体的には、本発明の目的のための適切なスペーサーとしては、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレングリコールまたはエチレングリコールとプロピレングリコールの混合物）、ポリアミン基（例えば、スペルミン、スペルミジン及びそれらのポリマー誘導体）、ポリエステル（例えば、ポリ（アクリル酸エチル））、ポリホスホジエステル、アルキレン、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。適切なアタッチメントとしては、リンカーにさらなる特性を付加するために該リンカーに付加され得る任意の部分、例えば、これに限定されないが、蛍光ラベルを含む。適切なバイオコンジュゲートとしては、ペプチド、グリコシド、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロール、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、多糖が挙げられるがこれらに限定されない。適切なクロモフォア、レポーター基、及び色素標識ＲＮＡとしては、蛍光色素、例えば、フルオレセイン及びローダミン、化学発光、電気化学発光、及び生物発光マーカー化合物が挙げられるがこれらに限定されない。２つのＲＮＡ成分をコンジュゲートする例示的なリンカーのデザインは、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０１５０７５号にも記載されている。
該リンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）は、任意の長さでよい。いくつかの実施形態では、該リンカーは、約０～１６ヌクレオチドに相当する長さを有する。いくつかの実施形態では、該リンカーは、約０～８ヌクレオチドに相当する長さを有する。いくつかの実施形態では、該リンカーは、約０～４ヌクレオチドに相当する長さを有する。いくつかの実施形態では、該リンカーは、約２ヌクレオチドに相当する長さを有する。例示的なリンカーのデザインは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／００８７３０号にも記載されている。
典型的なＩＩ型Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡは（５’から３’の方向に）：ガイド配列、ポリＵトラクト、第一の相補的ストレッチ（「リピート」）、ループ（テトラループ）、第二の相補的ストレッチ（該リピートに相補的な「アンチリピート」）、ステム、ならびにさらなるステムループ及びステム及びポリＡ（ＲＮＡでは多くの場合ポリＵ）テール（ターミネーター）を含む。好ましい実施形態では、ガイド構造のある特定の実施形態は保持され、ガイド構造のある特定の実施形態は、例えば、特徴の加減または置換によって修飾され得る一方、ガイド構造のある特定の他の実施形態は維持される。挿入、欠失、及び置換が挙げられるがこれらに限定されない操作されたｓｇＲＮＡ修飾に好ましい位置としては、ガイド末端及びＣＲＩＳＰＲタンパク質及び／または標的と複合体を形成した際に曝露されるｓｇＲＮＡの領域、例えば、テトラループ及び／またはループ２が挙げられる。
ある特定の実施形態では、本発明のガイドは、アダプタータンパク質用の特定の結合部位（例えば、アプタマー）を含み、これは、１つ以上の機能ドメインを（例えば、融合タンパク質を介して）含み得る。かかるガイドがＣＲＩＳＰＲ複合体（すなわち、ガイド及び標的に結合するＣＲＩＳＰＲ酵素）を形成する場合、該アダプタータンパク質が結合し、該アダプタータンパク質に関連している該機能ドメインは、該属性機能が有効であるために有利な空間的定位に配置される。例えば、該機能ドメインが転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）の場合、該転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を与えるようにする空間的定位に配置される。同様に、転写リプレッサーは、標的の転写に影響を与えるように有利に配置され、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）は、該標的を切断または部分的に切断するために有利に配置される。
当業者には、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが、アダプター＋機能ドメインの適切な配置が可能ではない（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因する）ガイドに対する修飾が、意図されていない修飾であることが理解されよう。１つ以上の修飾されたガイドは、本明細書に記載の通り、テトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３で、好ましくは、テトラループまたはステムループ２のいずれかで、最も好ましくは、テトラループ及びステムループ２の両方で修飾され得る。
リピート：アンチリピート二本鎖は、ｓｇＲＮＡの二次構造から明らかであろう。それは、通常、ポリＵトラクトの後（５’から３’の方向に）かつテトラループの前の第一の相補的ストレッチ、及びテトラループの後（５’から３’の方向に）かつポリＡトラクトの前の第二の相補的ストレッチでよい。該第一の相補的ストレッチは（「リピート」）は、該第二の相補的ストレッチ（「アンチリピート」）に相補的である。したがって、それらは、ワトソン・クリック塩基対合し、互いに折り畳まれた際にｄｓＲＮＡの二本鎖を形成する。したがって、該アンチリピート配列は、Ａ－ＵまたはＣ－Ｇ塩基対合の観点から、ただし、該アンチリピートがテトラループに起因して逆方向であるという観点からも該リピートの相補配列である。
本発明の実施形態では、ガイド構造の修飾は、ステムループ２での塩基の置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ステムループ２の「ａｃｔｔ」（ＲＮＡでは「ａｃｕｕ」）及び「ａａｇｔ」（ＲＮＡでは「ａａｇｕ」）塩基は、「ｃｇｃｃ」及び「ｇｃｇｇ」で置換される。いくつかの実施形態では、ステムループ２の「ａｃｔｔ」及び［ａａｇｔ」塩基は、４ヌクレオチドの相補的ＧＣリッチ領域で置換される。いくつかの実施形態では、該４ヌクレオチドの相補的ＧＣリッチ領域は、「ｃｇｃｃ」及び「ｇｃｇｇ」（両方とも５’から３’の方向に）である。いくつかの実施形態では、該４ヌクレオチドの相補的ＧＣリッチ領域は、「ｇｃｇｇ」及び「ｃｇｃｃ」（両方とも５’から３’の方向に）である。該４ヌクレオチドの相補的ＧＣリッチ領域の他のＣとＧの組み合わせは、ＣＣＣＣ及びＧＧＧＧを含めて明らかであろう。
１つの実施形態では、該ステムループ２、例えば、「ＡＣＴＴｇｔｔｔＡＡＧＴ」（配列番号３６）は、任意の「ＸＸＸＸｇｔｔｔＹＹＹＹ」（配列番号３７）で置換することができ、例えば、ここでＸＸＸＸ及びＹＹＹＹは、互いに塩基対合してステムを創出する任意のヌクレオチドの相補的なセットを表す。
１つの実施形態では、該ステムは、相補的なＸ及びＹの配列を含む少なくとも約４ｂｐを含むが、より多くのステム、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２塩基対、またはより少ない、例えば、３、２塩基対もまた企図される。したがって、例えば、Ｘ２～１２及びＹ２～１２（Ｘ及びＹは、任意のヌクレオチドの相補的なセットを表す）が企図され得る。１つの実施形態では、Ｘ及びＹのヌクレオチドでできているステムは、「ｇｔｔｔ」とともに、全体二次構造において完全なヘアピンを形成し、これが有利である可能性があり、塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量であることができる。１つの実施形態では、任意の相補的Ｘ：Ｙ塩基対合配列（例えば、長さに関して）は、全ｓｇＲＮＡの二次構造が維持される限り許容される。１つの実施形態では、該ステムは、それがＤＲ：ｔｒａｃｒ二本鎖、及び３つのステムループを有するという点において、全ｓｇＲＮＡの二次構造を破壊しないＸ：Ｙ塩基対合の形態であり得る。１つの実施形態では、ＡＣＴＴとＡＡＧＴ（またはＸ：Ｙ塩基対でできている任意の代替的なステム）を接続する「ｇｔｔｔ」テトラループは、ｓｇＲＮＡの全体二次構造を破壊しない同じ長さ（例えば、４塩基対）またはより長い任意の配列であることができる。１つの実施形態では、該ステムループは、ステムループ２をさらに伸ばすものであることができ、例えば、ＭＳ２アプタマーであり得る。１つの実施形態では、ステムループ３「ＧＧＣＡＣＣＧａｇｔＣＧＧＴＧＣ」（配列番号３８）は、同様に「ＸＸＸＸＸＸＸａｇｔＹＹＹＹＹＹＹ」（配列番号３９）の形態をとることができ、例えば、ここで、Ｘ７及びＹ７は、互いに塩基対合してステムを創出する任意のヌクレオチドの相補的なセットを表す。１つの実施形態では、該ステムは、相補的なＸ及びＹの配列を含む約７ｂｐを含むが、より多くのまたはより少ない塩基対のステムもまた企図される。１つの実施形態では、Ｘ及びＹのヌクレオチドでできているステムは、「ａｇｔ」とともに、全体二次構造において完全なヘアピンを形成する。１つの実施形態では、任意の相補的Ｘ：Ｙ塩基対合配列は、全ｓｇＲＮＡの二次構造が維持される限り許容される。１つの実施形態では、該ステムは、それがＤＲ：ｔｒａｃｒ二本鎖、及び３つのステムループを有するという点において、全ｓｇＲＮＡの二次構造を破壊しないＸ：Ｙ塩基対合の形態であり得る。１つの実施形態では、該ステムループ３の「ａｇｔ」配列は、アプタマー、例えば、ＭＳ２アプタマーまたは該ステムループ３の構造を他の方法で一般に維持する配列によって延長または置換され得る。代替的なステムループ２及び／または３の１つの実施形態では、各ＸとＹの対は任意の塩基対を指すことができる。１つの実施形態では、非ワトソン・クリック塩基対合が企図され、かかる対合は、ステムループのその位置の構造を他の方法で通常は維持する。
１つの実施形態では、該ＤＲ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、形態：ｇＹＹＹＹａｇ（Ｎ）ＮＮＮＮｘｘｘｘＮＮＮＮ（ＡＡＮ）ｕｕＲＲＲＲｕ（配列番号４０）（ヌクレオチドに関する標準ＩＵＰＡＣ命名法使用）で置換することができ、ここで、（Ｎ）及び（ＡＡＮ）は、該二本鎖におけるバルジの一部を表し、「ｘｘｘｘ」は、リンカー配列を表す。ダイレクトリピートのＮＮＮＮは、該ｔｒａｃｒＲＮＡの対応するＮＮＮＮ部分と塩基対合する限り、任意のものでよい。１つの実施形態では、該ＤＲ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖は、全体構造を変化させない限り、任意の長さ（ｘｘｘｘ．．．）、任意の塩基組成のリンカーで接続することができる。
１つの実施形態では、該ｓｇＲＮＡの構造要件は、二本鎖及び３個のステムループを有することである。ほとんどの実施形態では、多くの特定の塩基要件に対する実際の構造要件は、該ＤＲ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖の構造は維持されるべきであるが、該構造を創出する配列、すなわち、ステム、ループ、バルジ等が変更されてもよいという点で緩い。
アプタマー
第一のアプタマー／ＲＮＡ結合タンパク質対を有する１つのガイドは、活性化因子に連結または融合され得る一方、第二のアプタマー／ＲＮＡ結合タンパク質対を有する第二のガイドは、リプレッサーに連結または融合され得る。該ガイドは、異なる標的（遺伝子座）に対するため、１つの遺伝子が活性化され、１つが抑制される。例えば、以下の概要がかかるアプローチを示す：
ガイド１－ＭＳ２アプタマー－－－－－－－ＭＳ２ ＲＮＡ結合タンパク質－－－－－－－ＶＰ６４活性化因子、及び
ガイド２－ＰＰ７アプタマー－－－－－－－ＰＰ７ ＲＮＡ結合タンパク質－－－－－－－ＳＩＤ４ｘリプレッサー。
本発明はまた、直交ＰＰ７／ＭＳ２遺伝子標的化に関する。この例では、異なる遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡは、ＭＳ２－ＶＰ６４またはＰＰ７－ＳＩＤ４Ｘを動員するために異なるＲＮＡループで修飾され、これらがそれぞれ、標的遺伝子座を活性化及び抑制する。ＰＰ７は、バクテリオファージＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのＲＮＡ結合コートタンパク質である。ＭＳ２同様、それは特定のＲＮＡ配列及び二次構造に結合する。ＰＰ７ ＲＮＡ認識モチーフは、ＭＳ２のものとは異なる。その結果として、ＰＰ７とＭＳ２は、異なるゲノム遺伝子座で同時に異なる効果を媒介するように多重化され得る。例えば、遺伝子座Ａを標的とするｓｇＲＮＡは、ＭＳ２ループで修飾することができ、ＭＳ２－ＶＰ６４活性化因子を動員する一方、遺伝子座Ｂを標的とする別のｓｇＲＮＡは、ＰＰ７ループで修飾することができ、ＰＰ７－ＳＩＤ４Ｘリプレッサードメインを動員する。したがって、同じ細胞で、ｄＣａｓ９が直交的な遺伝子座特異的な修飾を媒介する。この原理は、Ｑ－ベータ等の他の直交ＲＮＡ結合タンパク質を組み込むことに拡大することができる。
直交的な抑制のための代替的な選択肢としては、相互作用的抑制的機能を有するノンコーディングＲＮＡループをガイドに（該ガイドに組み込まれるＭＳ２／ＰＰ７ループと同様の位置または該ガイドの３’末端のいずれかで）組み込むことが挙げられる。例えば、ガイドは、ノンコーディング（であるが抑制的であることが既知の）ＲＮＡループとともにデザインされる（例えば、哺乳類細胞でＲＮＡポリメラーゼＩＩを妨げるＡｌｕリプレッサー（ＲＮＡにおいて）を使用する）。該Ａｌｕ ＲＮＡ配列は、本明細書で使用される、ＭＳ２ ＲＮＡ配列の代わりに（例えば、テトラループ及び／またはステムループ２で）、及び／または該ガイドの３’末端に配置される。これにより、該テトラループ及び／またはステムループ２位置で、可能性のあるＭＳ２、ＰＰ７またはＡｌｕの組み合わせ、ならびに任意に、該ガイドの３’末端でのＡｌｕの付加（リンカーを伴うまたは伴わない）がもたらされる。
２つの異なるアプタマー（異なるＲＮＡ）の使用により、活性化因子－アダプタータンパク質融合及びリプレッサー－アダプター融合が異なるガイドとともに使用できるようになり、１つの遺伝子の発現が活性化される一方、別の遺伝子が抑制される。それらは、それらの異なるガイドと併せて、多重化アプローチにおいて一緒にまたは実質的に一緒に投与され得る。例えば、１０または２０または３０等の多数のかかる修飾されたガイドは、すべて同時に使用することができる一方、比較的少数のＣａｓ９を多数の修飾されたガイドとともに使用することができるため、１つのみ（または少なくとも最小数）のＣａｓ９が送達され得る。該アダプタータンパク質は、１つ以上の活性化因子または１つ以上のリプレッサーと関連（好ましくは、連結または融合）し得る。例えば、該アダプタータンパク質は、第一の活性化因子及び第二の活性化因子と関連し得る。該第一及び第二の活性化因子は、同じでもよいが、好ましくは、異なる活性化因子である。例えば、一方がＶＰ６４であり、他方がｐ６５である場合があるが、これらは単なる例であり、他の転写活性化因子が想定される。３つ以上またはさらに４つ以上の活性化因子（またはリプレッサー）を使用してもよいが、パッケージサイズは、５個を超える異なる機能ドメイン数を制限する場合もある。リンカーが好ましくはアダプタータンパク質への直接融合にわたって使用され、２つ以上の機能ドメインがアダプタータンパク質と関連する。適切なリンカーは、ＧｌｙＳｅｒリンカーを含み得る。
酵素－ガイド複合体が全体として２つ以上の機能ドメインと関連し得ることもまた想定される。例えば、２つ以上の機能ドメインが酵素と関連してもよいし、２つ以上の機能ドメインがガイドと関連してもよく（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）、１つ以上の機能ドメインが酵素と関連し、１つ以上の機能ドメインがガイドと関連してもよい（１つ以上のアダプタータンパク質を介して）。
該アダプタータンパク質と該活性化因子またはリプレッサー間の融合は、リンカーを含んでもよい。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーであるＧＧＧＳを使用することができる。それらは、必要に応じて、適切な長さを得るために３つ（（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３５））または６、９もしくは１２またはそれより多くのリピートで使用することができる。リンカーは、該ＲＮＡ結合タンパク質と該機能ドメイン（活性化因子またはリプレッサー）間で使用することも、該ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ９）と該機能ドメイン（活性化因子またはリプレッサー）間で使用することもできる。該リンカーは、使用者に適量の「機械的柔軟性」を操作させる。
不活性型ガイド（ｄｅａｄ ｇｕｉｄｅ）
１つの実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合を成功させると同時に、ヌクレアーゼ活性を達成させない（すなわち、ヌクレアーゼ活性がない／インデル活性がない）方法で修飾されるガイド配列を提供する。説明のため、かかる修飾されたガイド配列は、「不活性型ガイド」または「不活性型ガイド配列」と呼ばれる。これらの不活性型ガイドまたは不活性型ガイド配列は、ヌクレアーゼ活性に関しては触媒的に不活性または立体配座的に不活性であると考えられ得る。ヌクレアーゼ活性は、当技術分野で一般に使用されるｓｕｒｖｅｙｏｒ分析またはディープシーケンシング、好ましくはｓｕｒｖｅｙｏｒ分析を使用して測定され得る。同様に、不活性型ガイド配列は、触媒活性を促進する能力またはオンターゲットとオフターゲットの結合活性を区別する能力に関しては生産的な塩基対合に十分に関与しない可能性がある。簡潔には、該ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、遺伝子に対するＣＲＩＳＰＲ標的部分を精製及び増幅することならびに該ＣＲＩＳＰＲ標的部位を増幅するプライマーとヘテロ二本鎖を形成することを含む。再アニール後、その産物を、製造業者が推奨するプロトコルに従って、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ及びＳＵＲＶＥＹＯＲエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｉｃｓ）で処理し、ゲルで分析し、参照バンドの強度に基づいて定量化する。
したがって、関連する実施形態では、本発明は、天然に存在しないまたは操作された組成のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を提供し、これは、本明細書に記載の機能的Ｃａｓ９、及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、該ｇＲＮＡは、不活性型ガイド配列を含み、それにより、該ｇＲＮＡは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって検出した場合に該系の非変異Ｃａｓ９酵素のヌクレアーゼ活性に起因する検出可能なインデル活性を含まずに、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が細胞内で目的のゲノム遺伝子座に向けられるように、標的配列にハイブリダイズすることが可能である。省略する目的で、ｇＲＮＡがＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによって検出した場合に該系の非変異Ｃａｓ９酵素のヌクレアーゼ活性に起因する検出可能なインデル活性を含まずに、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が細胞内で目的のゲノム遺伝子座に向けられるように標的配列にハイブリダイズすることが可能な不活性型ガイド配列を含むｇＲＮＡは、本明細書では「不活性型ｇＲＮＡ」と呼ばれる。本明細書の他の箇所に記載の本発明のｇＲＮＡのいずれかは、不活性型ｇＲＮＡ／本明細書で以下に記載する不活性型ガイド配列を含むｇＲＮＡとして使用され得ることが理解されよう。本明細書の他の箇所に記載の方法、生成物、組成物及び使用のいずれかが、不活性型ｇＲＮＡ／以下でさらに詳細に記載する不活性型ガイド配列を含むｇＲＮＡとともに等しく適用可能である。さらなる指針を用いて、以下の特定の実施形態及び実施形態を提供する。
不活性型ガイド配列が、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価され得る。例えば、試験される不活性型ガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の成分を、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、該ＣＲＩＳＰＲ配列の成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって提供した後、該標的配列内での選択的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行ってもよい。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、該標的配列、試験される不活性型ガイド配列及び試験不活性型ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含めたＣＲＩＳＰＲ複合体の成分を提供し、該試験及び対照ガイド配列反応の間の該標的配列での結合または切断率を比較することによって試験管において評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者には思い浮かぶであろう。不活性型ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択され得る。いくつかの実施形態では、該標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。
本明細書でさらに説明するように、いくつかの構造パラメータにより、かかる不活性型ガイドに達するための適切なフレームワークが可能になる。不活性型ガイド配列は、活性型Ｃａｓ９特異的インデル形成をもたらすそれぞれのガイド配列より短い。不活性型ガイドは、活性型Ｃａｓ９特異的インデル形成に至る同じＣａｓ９に向けられるそれぞれのガイドより、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％短い。
以下で説明し、当技術分野で知られるように、ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９特異性の１つの実施形態は、ダイレクトリピート配列であり、これは、かかるガイドに適切に連結されるものである。特に、これは、Ｃａｓ９の起源に応じて該ダイレクトリピート配列がデザインされるということを暗示する。したがって、有効な不活性型ガイド配列に利用可能な構造データは、Ｃａｓ９特異的同等物をデザインする際に使用され得る。例えば、２つ以上のＣａｓ９エフェクタータンパク質のオーソロガスヌクレアーゼドメインＲｕｖＣ間の構造的類似性を使用して、デザインが同等の不活性型ガイドを転写してもよい。したがって、本明細書における不活性型ガイドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的への結合を成功させると同時に、ヌクレアーゼ活性を達成させない、かかるＣａｓ９特異的同等物を反映するように長さ及び配列を適切に修飾してもよい。
本明細書の状況における不活性型ガイドの使用及び最新の技術により、インビトロ、エキソビボ、及びインビボ用途において、多重遺伝子標的化、特に、二方向性の多重遺伝子標的化が可能になるネットワーク生物学及び／またはシステム生物学のための驚くべき予想外のプラットフォームが提供される。不活性型ガイドの使用の前に、例えば、遺伝子活性の活性化、抑制、及び／またはサイレンシングの複数の標的に対処することは困難であり、場合によって不可能である。不活性型ガイドを使用すると、複数の標的、ひいては複数の活性が、例えば、同じ細胞で、同じ動物で、または同じ患者で対処され得る。かかる多重化は、同時に行われる場合もあれば、所望の時間枠に調整される場合もある。
例えば、該不活性型ガイドはここで、最初にｇＲＮＡをヌクレアーゼ活性をもたらすことなく遺伝子標的化の手段として使用することを可能にし、同時に、活性化または抑制のために向けられた手段を提供する。不活性型ガイドを含むガイドＲＮＡは、遺伝子活性の活性化または抑制を可能にする方法で、要素、特に、遺伝子エフェクター（例えば、遺伝子活性の活性化因子またはリプレッサー）の機能的配置を可能にする本明細書の他の箇所に記載のタンパク質アダプター（例えば、アプタマー）をさらに含むように修飾され得る。１つの例は、アプタマーの組み込みであり、本明細書に説明されており、最新の技術である。不活性型ガイドを含むｇＲＮＡをタンパク質と相互作用するアプタマーを組み込むように操作することにより（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｃｏｍｐｌｅｘ，”ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４１３６、参照により本明細書に組み込まれる）、複数の異なるエフェクタードメインからなる合成転写活性化複合体が組み立てられ得る。これは、天然の転写活性化プロセス後にモデル化され得る。例えば、エフェクター（例えば、活性化因子またはリプレッサー、活性化因子またはリプレッサーとの融合タンパク質としての二量体化ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質）と選択的に結合するアプタマー、またはエフェクター（例えば、活性化因子またはリプレッサー）にそれ自体結合するタンパク質を、不活性型ｇＲＮＡのテトラループ及び／またはステムループ２に付加してもよい。ＭＳ２の場合、融合タンパク質ＭＳ２－ＶＰ６４は、該テトラループ及び／またはステムループ２に結合し、次に、例えば、Ｎｅｕｒｏｇ２に関する転写の上方制御を媒介する。他の転写活性化因子は、例えば、ＶＰ６４．Ｐ６５、ＨＳＦ１、及びＭｙｏＤ１である。本概念の単なる例に基づいて、該ＭＳ２ステムループのＰＰ７と相互作用するステムループでの置換を使用して、抑制要素を動員してもよい。
したがって、１つの実施形態は、不活性型ガイドを含む本発明のｇＲＮＡであり、該ｇＲＮＡはさらに、本明細書に記載の遺伝子活性化または抑制をもたらす修飾を含む。該不活性型ｇＲＮＡは、１つ以上のアプタマーを含み得る。該アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子または遺伝子リプレッサーに特異的であり得る。代替的に、該アプタマーは、特定の遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子または遺伝子リプレッサーに特異的でありかつこれを動員／これに結合するタンパク質に特異的であり得る。活性化因子またはリプレッサーの動員に関して複数の部位が存在する場合、これらの部位は、活性化因子またはリプレッサーのいずれかに特異的であることが好ましい。活性化因子またはリプレッサーの結合に関して複数の部位が存在する場合、これの部位は、同じ活性化因子または同じリプレッサーに特異的であり得る。これらの部位は、異なる活性化因子または異なるリプレッサーに特異的であってもよい。該遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子、遺伝子リプレッサーは、融合タンパク質の形態で存在してもよい。
実施形態では、本明細書に記載の不活性型ｇＲＮＡまたは本明細書に記載のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、２つ以上のアダプタータンパク質を含む天然に存在しないまたは操作された組成物を含み、各タンパク質は、１つ以上の機能ドメインと関連しており、該アダプタータンパク質は、該不活性型ｇＲＮＡの少なくとも１つのループに挿入された異なるＲＮＡ配列（複数可）に結合する。
したがって、実施形態は、天然に存在しないまたは操作された組成物を提供し、該組成物は、細胞内で目的のゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズすることが可能な本明細書で定義される不活性型ガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、少なくとも１つ以上の核局在配列を含み任意に少なくとも１つの変異を含むＣａｓ９を含み、該不活性型ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列（複数可）の挿入によって修飾され、該アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインと関連しているか、または、該不活性型ｇＲＮＡは、少なくとも１つのノンコーディング機能ループを有するように修飾され、該組成物は、２つ以上のアダプタータンパク質を含み、各タンパク質は、１つ以上の機能ドメインと関連している。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質は、該機能ドメインを含む融合タンパク質であり、該融合タンパク質は、任意に、該アダプタータンパク質と該機能ドメインとの間にリンカーを含み、該リンカーは、任意にＧｌｙＳｅｒリンカーを含む。
ある特定の実施形態では、該不活性型ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、該２つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列（複数可）の挿入によって修飾されない。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質に関連している１つ以上の機能ドメインは、転写活性化ドメインである。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質に関連している１つ以上の機能ドメインは、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡまたはＳＥＴ７／９を含む転写活性化ドメインである。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質に関連している１つ以上の機能ドメインは、転写リプレッサードメインである。
ある特定の実施形態では、該転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢドメインである。
ある特定の実施形態では、該転写リプレッサードメインは、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメインまたはＳＩＤ４Ｘドメインである。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質に関連している１つ以上の機能ドメインの少なくとも１つは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＤＮＡ組み込み活性ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性または核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
ある特定の実施形態では、該ＤＮＡ切断活性は、Ｆｏｋ１ヌクレアーゼに起因する。
ある特定の実施形態では、該不活性型ｇＲＮＡは、不活性型ｇＲＮＡが該アダプタータンパク質に結合し、さらに該Ｃａｓ９及び標的に結合した後、該機能ドメインがその属性機能で機能することができる空間的定位に存在するように修飾される。
ある特定の実施形態では、該不活性型ｇＲＮＡの少なくとも１つのループは、テトラループ及び／またはループ２である。ある特定の実施形態では、該不活性型ｇＲＮＡのテトラループ及びループ２は、該異なるＲＮＡ配列（複数可）の挿入によって修飾される。
ある特定の実施形態では、１つ以上のアダプタータンパク質に結合する異なるＲＮＡ配列（複数可）の挿入は、アプタマー配列である。ある特定の実施形態では、該アプタマー配列は、同じアプタマータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。ある特定の実施形態では、該アプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的な２つ以上のアプタマー配列である。
ある特定の実施形態では、該アダプタータンパク質は、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、ΦＣｂ５、ΦＣｂ８ｒ、ΦＣｂ１２ｒ、ΦＣｂ２３ｒ、７ｓ、ＰＲＲ１を含む。
ある特定の実施形態では、該細胞は、真核細胞である。ある特定の実施形態では、該真核細胞は、哺乳類細胞、任意にマウス細胞である。ある特定の実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。
ある特定の実施形態では、第一のアダプタータンパク質は、ｐ６５ドメインに関連し、第二のアダプタータンパク質は、ＨＳＦ１ドメインに関連している。
ある特定の実施形態では、該組成物は、少なくとも３つの機能ドメインを有するＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を含み、その少なくとも１つは、該Ｃａｓ９と関連しており、その少なくとも２つは、不活性型ｇＲＮＡと関連している。
ある特定の実施形態では、該組成物はさらに、第二のｇＲＮＡを含み、該第二のｇＲＮＡは、第二のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系が、該第二のゲノム遺伝子座において、該系のＣａｓ９酵素のヌクレアーゼ活性に起因する検出可能なインデル活性を含んで細胞内で第二の目的のゲノム遺伝子座に向けられるように第二の標的配列にハイブリダイズすることが可能な活性型ｇＲＮＡである。
ある特定の実施形態では、該組成物はさらに、複数の不活性型ｇＲＮＡ及び／または複数の活性型ｇＲＮＡを含む。
本発明の１つの実施形態は、該ｇＲＮＡ足場のモジュラリティ及びカスタマイズ性を利用して、異なる結合部位（特にアプタマー）を有する一連のｇＲＮＡ足場を確立し、異なるタイプのエフェクターを直交的に動員するためのものである。この場合もやはり、例示及びより広範な概念の説明のため、該ＭＳ２ステムループのＰＰ７と相互作用するステムループでの置換を使用して、抑制要素を結合／動員し、多重化された二方向性の転写制御を可能にしてもよい。したがって、一般に、不活性型ガイドを含むｇＲＮＡは、多重転写制御及び好ましい二方法性の転写制御をもたらすために使用され得る。この転写制御は、遺伝子の最も好ましいものである。例えば、不活性型ガイド（複数可）を含む１つ以上のｇＲＮＡが、１つ以上の標的遺伝子の活性化の標的化において使用され得る。同時に、不活性型ガイド（複数可）を含む１つ以上のｇＲＮＡは、１つ以上の標的遺伝子の抑制の標的化において使用され得る。かかる配列は、様々な異なる組み合わせに適用される場合があり、例えば、該標的遺伝子は、第一に抑制され、その後適切な時期に、他の標的が活性化されるか、または選択された遺伝子が抑制されると同時に、選択された遺伝子が活性化され、その後さらに活性化及び／または抑制される。結果として、１つ以上の生物系の複数の成分が、有利にも一緒に対処され得る。
実施形態では、本発明は、本明細書に記載の不活性型ｇＲＮＡまたはＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体または組成物をコードする核酸分子（複数可）を提供する。
実施形態では、本発明は、本明細書で定義される不活性型ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を含むベクター系を提供する。ある特定の実施形態では、該ベクター系はさらに、Ｃａｓ９をコードする核酸分子（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、該ベクター系は、さらに、（活性型）ｇＲＮＡをコードする核酸分子（複数可）を含む。ある特定の実施形態では、該核酸分子または該ベクターはさらに、該ガイド配列（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子及び／またはＣａｓ９及び／または任意に各局在化配列（複数可）をコードする核酸分子に作動可能に連結された真核細胞において作動可能な制御要素（複数可）を含む。
別の実施形態では、構造分析を使用して、ＤＮＡ結合を可能にするが、ＤＮＡ切断はしない該不活性型ガイドと該活性Ｃａｓ９ヌクレアーゼ間の相互作用を調べてもよい。このようにして、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性に重要なアミノ酸が測定される。かかるアミノ酸の修飾により、遺伝子編集に使用されるＣａｓ９酵素が改良される。
さらなる実施形態は、本明細書で説明される不活性型ガイドの使用と、本明細書に説明される当技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲの他の用途を組み合わせることである。例えば、標的化された多重遺伝子活性化もしくは抑制または標的化された多重二方向性遺伝子活性化／抑制のための不活性型ガイド（複数可）を含むｇＲＮＡを、本明細書で説明されるヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むｇＲＮＡと組み合わせてもよい。ヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むかかるｇＲＮＡはさらに、遺伝子活性（例えば、アプタマー）を抑制する修飾を含んでも含まなくてもよい。ヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むかかるｇＲＮＡはさらに、遺伝子活性（例えば、アプタマー）を活性化する修飾を含んでも含まなくてもよい。かかる方法で、多重遺伝子制御のためのさらなる手段が導入される（例えば、ヌクレアーゼ活性を含まない／インデル活性を含まない多重遺伝子標的化活性化は、ヌクレアーゼ活性を有する遺伝子標的化抑制と同時にまたは組み合わせて提供され得る）。
例えば、１）１つ以上の遺伝子を標的とし、さらに遺伝子活性化因子の動員のための適切なアプタマーで修飾された不活性型ガイド（複数可）を含む１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、好ましくは、１～１０、より好ましくは、１～５）を使用することを、２）１つ以上の遺伝子を標的とし、さらに遺伝子リプレッサーの動員のための適切なアプタマーで修飾された不活性型ガイド（複数可）を含む１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、好ましくは、１～１０、より好ましくは、１～５）と組み合わせてもよい。１）及び２）は、その後３）１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、好ましくは、１～１０、より好ましくは、１～５）と組み合わせてもよい。この組み合わせは、次に、１）＋２）＋３）とともに、４）１つ以上の遺伝子を標的とし、さらに遺伝子活性化因子の動員のための適切なアプタマーで修飾された１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、好ましくは、１～１０、より好ましくは、１～５）で行われてもよい。この組み合わせは、次に、１）＋２）＋３）＋４）とともに、５）１つ以上の遺伝子を標的とし、さらに遺伝子リプレッサーの動員のための適切なアプタマーで修飾された１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、好ましくは、１～１０、より好ましくは、１～５）で行われてもよい。結果として、様々な使用及び組み合わせが本発明に含まれる。例えば、組み合わせ１）＋２）、組み合わせ１）＋３）、組み合わせ２）＋３）、組み合わせ１）＋２）＋３）、組み合わせ１）＋２）＋３）＋４）、組み合わせ１）＋３）＋４）、組み合わせ２）＋３）＋４）、組み合わせ１）＋２）＋４）、組み合わせ１）＋２）＋３）＋４）＋５）、組み合わせ１）＋３）＋４）＋５）、組み合わせ２）＋３）＋４）＋５）、組み合わせ１）＋２）＋４）＋５）、組み合わせ１）＋２）＋３）＋５）、組み合わせ１）＋３）＋５）、組み合わせ２）＋３）＋５）、組み合わせ１）＋２）＋５）。
実施形態では、本発明は、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を標的遺伝子座にガイドするための不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列（不活性型ガイド配列）をデザインするため、評価するため、または選択するためのアルゴリズムを提供する。特に、不活性型ガイドＲＮＡの特異性が、ｉ）ＧＣ含量及びｉｉ）標的化配列の長さに関連し、これらを変化させることによって最適化され得ることが確認された。実施形態では、本発明は、オフターゲット結合または不活性型ガイドＲＮＡの相互作用を最小化する不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列をデザインするためのまたは評価するためのアルゴリズムを提供する。本発明の実施形態では、生物においてＣＲＩＳＰＲ系を遺伝子座に向けるための不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択するためのアルゴリズムは、ａ）該遺伝子座に１つ以上のＣＲＩＳＰＲモチーフを配置し、各ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の２０ヌクレオチド（ｎｔ）配列を、ｉ）該配列のＧＣ含量を測定すること、及びｉｉ）該生物のゲノムにおいて該ＣＲＩＳＰＲモチーフに最も近い下流の１５ヌクレオチドのオフターゲットマッチがあるかどうかを判断することによって分析すること、ならびにｃ）該配列のＧＣ含量が７０％以下であり、オフターゲットマッチが特定されない場合に、該１５ヌクレオチドの配列を不活性型ガイドＲＮＡでの使用に選択することを含む。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が６０％以下の場合に標的化配列に選択される。ある特定の実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下または３０％以下の場合に標的化配列に選択される。実施形態では、該遺伝子座の２つ以上の配列が分析され、最も低いＧＣ含量、または次に最も低いＧＣ含量、または次に最も低いＧＣ含量を有する配列が選択される。実施形態では、該配列は、該生物のゲノムにおいてオフターゲットマッチが特定されない場合に標的化配列に選択される。実施形態では、該標的化配列は、該ゲノムの調節配列においてオフターゲットマッチが特定されない場合に選択される。
実施形態では、本発明は、生物において官能化ＣＲＩＳＰＲ系を遺伝子座に向けるための不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択する方法を提供し、該方法は、ａ）該遺伝子座に１つ以上のＣＲＩＳＰＲモチーフを配置すること、ｂ）各ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の２０ｎｔを、ｉ）該配列のＧＣ含量を測定すること、及びｉｉ）該生物のゲノムにおいて該配列の最初の１５ｎｔのオフターゲットマッチがあるかどうかを判断することによって分析すること、ｃ）該配列のＧＣ含量が７０％以下であり、オフターゲットマッチが特定されない場合に、該配列をガイドＲＮＡでの使用に選択することを含む。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が５０％以下の場合に選択される。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が４０％以下の場合に選択される。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が３０％以下の場合に選択される。実施形態では、２つ以上の配列が分析され、最も低いＧＣ含量を有する配列が選択される。実施形態では、オフターゲットマッチが該生物の調節配列において特定される。実施形態では、該遺伝子座は、調節領域である。実施形態は、上記の方法に従って選択された標的化配列を含む不活性型ガイドＲＮＡを提供する。
実施形態では、本発明は、生物において官能化ＣＲＩＳＰＲ系を遺伝子座に標的化するための不活性型ガイドＲＮＡを提供する。本発明の実施形態では、該不活性型ガイドＲＮＡは、標的化配列を含み、該標的配列のＣＧ含量は７０％以下であり、該標的化配列の最初の１５ｎｔは、該生物の別の遺伝子座の調節配列におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。ある特定の実施形態では、該標的化配列のＧＣ含量は、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下または３０％以下である。ある特定の実施形態では、該標的化配列のＧＣ含量は、７０％～６０％または６０％～５０％または５０％～４０％または４０％～３０％である。実施形態では、該標的化配列は、該遺伝子座の潜在的な標的化配列の中で最も低いＣＧ含量を有する。
本発明の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１５ｎｔは、該標的配列にマッチする。別の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１４ｎｔが該標的配列にマッチする。別の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１３ｎｔが該標的配列にマッチする。別の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１２ｎｔが該標的配列にマッチする。別の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１１ｎｔが該標的配列にマッチする。別の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１０ｎｔが該標的配列にマッチする。本発明の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１５ｎｔは、別の遺伝子座の調節領域におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。他の実施形態では、最初の１４ｎｔ、または該不活性型ガイドの最初の１３ｎｔ、または該不活性型ガイドの最初の１２ｎｔ、または該不活性型ガイドの最初の１１ｎｔ、または該不活性型ガイドの最初の１０ｎｔは、別の遺伝子座の調節領域におけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。他の実施形態では、該不活性型ガイドの最初の１５ｎｔ、または１４ｎｔ、または１３ｎｔ、または１２ｎｔ、または１１ｎｔは、該ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲモチーフから下流のオフターゲット配列にマッチしない。
ある特定の実施形態では、該不活性型ガイドＲＮＡは、該標的配列にマッチしないさらなるヌクレオチドを３’末端に含む。したがって、ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の最初の１５ｎｔ、または１４ｎｔ、または１３ｎｔ、または１２ｎｔ、または１１ｎｔを含む不活性型ガイドＲＮＡは、３’末端で１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、またはそれより長く延長され得る。
本発明は、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）または官能化Ｃａｓ９系（これは、官能化Ｃａｓ９または官能化ガイドを含み得る）が挙げられるがこれらに限定されないＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を遺伝子座に向けるための方法を提供する。実施形態では、本発明は、不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択し、生物において官能化ＣＲＩＳＰＲ系を遺伝子座に向ける方法を提供する。実施形態では、本発明は、不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択し、官能化Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって標的遺伝子座の遺伝子調節をもたらす方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、標的遺伝子の調節をもたらす一方で、オフターゲット効果を最小限に抑えるために使用される。実施形態では、本発明は、２つ以上の不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択し、官能化Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって２つ以上の標的遺伝子座の遺伝子調節をもたらす方法を提供する。ある特定の実施形態では、該方法は、２つ以上の標的遺伝子座の調節をもたらす一方で、オフターゲット効果を最小限に抑えるために使用される。
実施形態では、本発明は、生物において官能化Ｃａｓ９を遺伝子座に向けるための不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択する方法を提供し、該方法は、ａ）該遺伝子座に１つ以上のＣＲＩＳＰＲモチーフを配置すること、ｂ）各ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の配列を、ｉ）該ＣＲＩＳＰＲモチーフに隣接する１０～１５ｎｔを選択すること、ｉｉ）該配列のＧＣ含量を測定することによって分析すること、ならびにｃ）該配列のＧＣ含量が４０％以上である場合に、該１０～１５ｎｔの配列を標的化配列としてガイドＲＮＡでの使用に選択することを含む。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が５０％以上の場合に選択される。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が６０％以上の場合に選択される。実施形態では、該配列は、該ＧＣ含量が７０％以上の場合に選択される。実施形態では、２つ以上の配列が分析され、最も高いＧＣ含量を有する配列が選択される。実施形態では、該方法はさらに、該ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の配列にマッチしない選択された配列の３’末端にヌクレオチドを付加することを含む。実施形態は、上記の方法に従って選択された標的化配列を含む不活性型ガイドＲＮＡを提供する。
実施形態では、本発明は、生物において官能化ＣＲＩＳＰＲ系を遺伝子座に向けるための不活性型ガイドＲＮＡを提供し、該不活性型ガイドＲＮＡの標的化配列は、該遺伝子座のＣＲＩＳＰＲモチーフに隣接する１０～１５ヌクレオチドからなり、該標的配列のＣＧ含量は、５０％以上である。ある特定の実施形態では、該不活性型ガイドＲＮＡはさらに、該遺伝子座のＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の配列にマッチしない標的化配列の３’末端に付加されたヌクレオチドを含む。
実施形態では、本発明は、１つ以上の、または２つ以上の遺伝子座に向けられる単一のエフェクターを提供する。ある特定の実施形態では、該エフェクターは、Ｃａｓ９と関連し、１つ以上の、または２つ以上の選択された不活性型ガイドＲＮＡは、該Ｃａｓ９と関連するエフェクターを、１つ以上の、または２つ以上の選択された標的遺伝子座に向けるために使用される。ある特定の実施形態では、該エフェクターは、１つ以上の、または２つ以上の選択された不活性型ガイドＲＮＡと関連し、各選択された不活性型ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９酵素と複合体を形成すると、その関連するエフェクターを、該不活性型ガイドＲＮＡ標的に局在させる。かかるＣＲＩＳＰＲ系の１つの非限定的な例は、同じ転写因子による制御下にある１つ以上の、または２つ以上の遺伝子座の活性を調節する。
実施形態では、本発明は、１つ以上の遺伝子座に向けられる２つ以上のエフェクターを提供する。ある特定の実施形態では、２つ以上の不活性型ガイドＲＮＡが使用され、該２つ以上のエフェクターの各々は、選択された不活性型ガイドＲＮＡと関連し、該２つ以上のエフェクターの各々は、その不活性型ガイドＲＮＡの選択された標的に局在化される。かかるＣＲＩＳＰＲ系の１つの非限定的な例は、異なる転写因子による制御下にある１つ以上の、または２つ以上の遺伝子座の活性を調節する。したがって、１つの非限定的な実施形態では、２つ以上の転写因子が単一の遺伝子の異なる調節配列に局在化される。別の非限定的な実施形態では、２つ以上の転写因子が異なる遺伝子の異なる調節配列に局在化される。ある特定の実施形態では、１つの転写因子は活性化因子である。ある特定の実施形態では、１つの転写因子は阻害因子である。ある特定の実施形態では、１つの転写因子は活性化因子であり、別の転写因子は阻害因子である。ある特定の実施形態では、同じ調節経路の異なる成分を発現する遺伝子座が調節される。ある特定の実施形態では、異なる調節経路の成分を発現する遺伝子座が調節される。
実施形態では、本発明はまた、活性Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって媒介される標的ＤＮＡの切断または標的結合及び遺伝子調節に特異的な不活性型ガイドＲＮＡをデザイン及び選択するための方法及びアルゴリズムを提供する。ある特定の実施形態では、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、１つの遺伝子座で標的ＤＮＡを切断すると同時に別の遺伝子座に結合し、その調節を促進する活性Ｃａｓ９を使用して、直交的遺伝子制御を提供する。
実施形態では、本発明は、生物において、切断することなく官能化Ｃａｓ９を遺伝子座に向けるための不活性型ガイドＲＮＡ標的化配列を選択する方法を提供し、該方法は、ａ）該遺伝子座に１つ以上のＣＲＩＳＰＲモチーフを配置すること、ｂ）各ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の配列を、ｉ）該ＣＲＩＳＰＲモチーフに隣接する１０～１５ｎｔを選択すること、ｉｉ）該配列のＧＣ含量を測定することによって分析すること、ならびにｃ）該配列のＧＣ含量が３０％以上、４０％以上である場合に、該１０～１５ｎｔの配列を標的化配列として不活性型ガイドＲＮＡでの使用に選択することを含む。ある特定の実施形態では、該標的化配列のＧＣ含量は、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、または７０％以上である。ある特定の実施形態では、該標的化配列のＧＣ含量は、３０％～４０％または４０％～５０％または５０％～６０％または６０％～７０％である。本発明の実施形態では、遺伝子座における２つ以上の配列が分析され、最も高いＧＣ含量を有する配列が選択される。
本発明の実施形態では、ＧＣ含量が評価される標的化配列の部分は、ＰＡＭに最も近い１５個の標的ヌクレオチドのうちの１０～１５個の連続したヌクレオチドである。本発明の実施形態では、ＧＣ含量が考慮されるガイドの部分は、ＰＡＭに最も近い１５個のヌクレオチドのうちの１０～１１個のヌクレオチドまたは１１～１２個のヌクレオチドまたは１２～１３個のヌクレオチドまたは１３個、または１４個、または１５個の連続したヌクレオチドである。
実施形態では、本発明はさらに、ＣＲＩＳＰＲ系の遺伝子座の切断を促進する一方で機能的活性化または阻害を回避する不活性型ガイドＲＮＡを識別するためのアルゴリズムを提供する。１６～２０ヌクレオチドの不活性型ガイドＲＮＡにおけるＧＣ含量の増加は、ＤＮＡ切断の増加及び機能的活性化の減少と同時に起こることが認められる。
いくつかの実施形態では、官能化Ｃａｓ９の効率は、ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の標的配列にマッチしないガイドＲＮＡの３’末端にヌクレオチドを付加することによって増加し得る。例えば、１１～１５ｎｔ長の不活性型ガイドＲＮＡのうち、より短いガイドは、標的の切断を促進する傾向が弱い可能性があると同時に、ＣＲＩＳＰＲ系の結合及び機能的制御の促進において効率が良くない。ある特定の実施形態では、該不活性型ガイドＲＮＡの３’末端に、該標的配列とマッチしないヌクレオチドを付加することにより、活性化効率が上がる一方で、望ましくない標的切断は増加しない。実施形態では、本発明はまた、ＤＮＡの結合及び遺伝子調節におけるＣＲＩＳＰＲ系の機能を効果的に促進する一方でＤＮＡの切断を促進しない改善された不活性型ガイドＲＮＡを識別するための方法及びアルゴリズムを提供する。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲモチーフの下流の最初の１５ｎｔ、または１４ｎｔ、または１３ｎｔ、または１２ｎｔ、または１１ｎｔを含み、該標的とミスマッチするヌクレオチドによって、３’末端で長さが１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、またはそれより長く延長される不活性型ガイドＲＮＡを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、選択的直交的遺伝子制御をもたらす方法を提供する。本明細書における本開示から分かるように、本発明の不活性型ガイドの選択は、ガイドの長さ及びＧＣ含量を考慮に入れると、機能的Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系による効果的及び選択的転写制御を提供し、例えば、活性化または阻害による遺伝子座の転写を調節し、オフターゲット効果を最小限に抑える。したがって、個々の標的遺伝子座の効果的な調節を提供することにより、本発明はまた２つ以上の標的遺伝子座の効果的な直交的調節を提供する。
ある特定の実施形態では、直交的遺伝子制御は、２つ以上の標的遺伝子座の活性化または阻害による。ある特定の実施形態では、直交的遺伝子制御は、１つ以上の標的遺伝子座の活性化または阻害及び１つ以上の標的遺伝子座の切断による。
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法またはアルゴリズムに従って開示または作製される、１つ以上の遺伝子産物の発現が変更された１つ以上の不活性型ガイドＲＮＡを含む天然に存在しないＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む細胞を提供する。本発明の実施形態では、２つ以上の遺伝子産物の細胞における発現が変更されている。本発明はまた、かかる細胞に由来する細胞株を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法またはアルゴリズムに従って開示または作製される１つ以上の不活性型ガイドＲＮＡを含む天然に存在しないＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む１つ以上の細胞を含む多細胞生物を提供する。１つの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法またはアルゴリズムに従って開示または作製される１つ以上の不活性型ガイドＲＮＡを含む天然に存在しないＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む細胞、細胞株、または多細胞生物に由来する産物を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の不活性型ガイド（複数可）を含むｇＲＮＡの使用であり、任意に、本明細書に記載のまたは最先端のガイド（複数可）を含むｇＲＮＡと組み合わされ、Ｃａｓ９の過剰発現または好ましくは、Ｃａｓ９のノックインのいずれかのために操作された系（例えば、細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニックマウス、誘導性トランスジェニック動物、誘導性トランスジェニックマウス）と組み合わされる。結果として、単一の系（例えば、トランスジェニック動物、細胞）が、系／ネットワーク生物学における多重遺伝子修飾の基礎となり得る。該不活性型ガイドのために、これは、今やインビトロ、エキソビボ、及びインビボで可能である。
例えば、該Ｃａｓ９が提供された後、１つ以上の不活性型ｇＲＮＡが多重遺伝子調節、好ましくは、多重二方向性遺伝子調節を指示するように提供される。該１つ以上の不活性型ｇＲＮＡは、必要であればまたは必要に応じて、空間的及び時間的に適切な方法で提供され得る（例えば、組織特異的なＣａｓ９発現の誘導）。該トランスジェニック／誘導性Ｃａｓ９が、目的の細胞、組織、動物において提供される（例えば、発現される）ことにより、不活性型ガイドを含むｇＲＮＡまたはガイドを含むｇＲＮＡの両方が等しく有効である。同様に、本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載の不活性型ガイド（複数可）を含むｇＲＮＡの使用であり、任意に、本明細書に記載のまたは最先端のガイド（複数可）を含むｇＲＮＡと組み合わされ、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓをノックアウトするために操作された系（例えば、細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニックマウス、誘導性トランスジェニック動物、誘導性トランスジェニックマウス）と組み合わされる。
結果として、本明細書に記載の不活性型ガイドと本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲの用途及び当技術分野で既知のＣＲＩＳＰＲの用途との組み合わせにより、系（例えば、ネットワーク生物学）の多重スクリーニングのための高効率の正確な方法がもたらされる。かかるスクリーニングにより、例えば、疾患、特に、遺伝子関連疾患に関与する遺伝子を同定するための遺伝子活性の特定の組み合わせ（例えば、オン／オフの組み合わせ）の同定が可能になる。かかるスクリーニングの好ましい用途は、がんである。同様に、かかる疾患の治療のためのスクリーニングは、本発明に含まれる。細胞または動物は、疾患または疾患様作用につながる異常な状態に曝露され得る。候補となる組成物が提供され、所望の多重環境での作用についてスクリーニングされ得る。例えば、患者のがん細胞が、それらを死に至らしめる遺伝子の組み合わせに関してスクリーニングされ得るとともに、次いでこの情報を適切な治療を確立するために使用する。
１つの実施形態では、本発明は、１つ以上の本明細書に記載の成分を含むキットを提供する。該キットは、本明細書に記載の不活性型ガイドを、本明細書に記載のガイドとともに、またはそれなしで含み得る。
本明細書に提供する構造情報により、不活性型ｇＲＮＡ構造を、全Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の機能を最適化するための操作または変更を可能にする不活性型ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ及びＣａｓ９の相互作用の調査が可能になる。例えば、該不活性型ｇＲＮＡのループは、ＲＮＡに結合することができるアダプタータンパク質の挿入によって、該Ｃａｓ９タンパク質にぶつかることなく延長され得る。これらのアダプタータンパク質はさらに、１つ以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質または融合を動員することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、該機能ドメインは、転写活性化ドメイン、好ましくは、ＶＰ６４である。いくつかの実施形態では、該機能ドメインは、転写抑制ドメイン、好ましくは、ＫＲＡＢである。いくつかの実施形態では、該転写抑制ドメインは、ＳＩＤ、またはＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。いくつかの実施形態では、該機能ドメインは、後成的修飾ドメインであり、後成的修飾酵素が提供される。いくつかの実施形態では、該機能ドメインは、活性化ドメインであり、これは、該Ｐ６５活性化ドメインであり得る。
本発明の実施形態は、上記の要素が単一の組成物に含まれるものまたは個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には、宿主に適用され、ゲノムレベルで機能的効果が引き出され得る。
一般に、該不活性型ｇＲＮＡは、（例えば、融合タンパク質を介して）結合するための１つ以上の機能ドメインを含むアダプタータンパク質用の特異的結合部位（例えば、アプタマー）を提供する方法で修飾される。該修飾された不活性型ｇＲＮＡは、該不活性型ｇＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ複合体を形成した（すなわち、Ｃａｓ９が不活性型ｇＲＮＡ及び標的に結合）後に、該アダプタータンパク質が結合し、該アダプタータンパク質の機能ドメインが、該属性機能が有効であるために有利である空間的定位に配置されるように修飾される。例えば、該機能ドメインが転写活性化因子（例えば、ＶＰ６４またはｐ６５）である場合、該転写活性化因子は、それが該標的の転写に作用する空間的定位に配置される。同様に、転写リプレッサーは、該標的の転写に作用するために有利に配置され、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）は、該標的を切断または部分的に切断するために有利に配置される。
当業者には、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが、該アダプター＋機能ドメインを適切に配置しない（例えば、該ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因する）不活性型ｇＲＮＡへの修飾は、意図されたものではない修飾であることが理解されよう。該１つ以上の修飾された不活性型ｇＲＮＡは、本明細書に記載の通り、テトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３で、好ましくは、テトラループまたはステムループ２のいずれかで、最も好ましくは、テトラループとステムループ２の両方で修飾され得る。
本明細書で説明される通り、該機能ドメインは、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及び分子スイッチ（例えば、光誘導性）からなる群に由来する１つ以上のドメインであり得る。場合によっては、さらに少なくとも１つのＮＬＳが提供されることが有利である。ある場合には、該ＮＬＳをＮ末端に配置することが有利である。複数の機能ドメインが含まれる場合、該機能ドメインは、同じでも異なってもよい。
該不活性型ｇＲＮＡは、同じまたは異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えば、アプタマー）を含むようにデザインされ得る。該不活性型ｇＲＮＡは、転写開始部位（すなわち、ＴＳＳ）の上流のプロモーター領域－１０００から＋１核酸、好ましくは、－２００核酸に結合するようにデザインされ得る。この位置決めにより、遺伝子活性化（例えば、転写活性化因子）または遺伝子阻害（例えば、転写リプレッサー）に影響を与える機能ドメインが改善される。該修飾された不活性型ｇＲＮＡは、組成物に含まれる１つ以上の標的遺伝子座を標的とする１つ以上の修飾された不活性型ｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１つのｇＲＮＡ、少なくとも２つのｇＲＮＡ、少なくとも５つのｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも２０個のｇＲＮＡ、少なくとも３０個のｇＲＮＡ、少なくとも５０個のｇＲＮＡ）であり得る。
該アダプタータンパク質は、該修飾された不活性型ｇＲＮＡに導入されたアプタマーまたは認識部位に結合し、該不活性型ｇＲＮＡが該ＣＲＩＳＰＲ複合体に組み込まれた後、１つ以上の機能ドメインの適切な配置を可能にし、該標的に属性機能の影響を与える任意の数のタンパク質でよい。本出願で詳細に説明される通り、それはコートタンパク質、好ましくは、バクテリオファージコートタンパク質でよい。かかるアダプタータンパク質に関連する機能ドメイン（例えば、融合タンパク質の形態で）としては、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、及び分子スイッチ（例えば、光誘導性）からなる群に由来する１つ以上のドメインを含み得る。好ましいドメインは、Ｆｏｋ１、ＶＰ６４、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１である。該機能ドメインが転写活性化因子または転写リプレッサーである場合、さらに少なくともＮＬＳが好ましくはＮ末端に提供されることが有利である。該アダプタータンパク質は、かかる機能ドメインを結合するために既知のリンカーを使用してもよい。複数の機能ドメインが含まれる場合、該機能ドメインは、同じでも異なってもよい。該アダプタータンパク質は、かかる機能ドメインを結合するために既知のリンカーを利用し得る。
したがって、該修飾された不活性型ｇＲＮＡ、該（不活性化）Ｃａｓ９（機能ドメインを含むまたは含まない）、及び１つ以上の機能ドメインを含む結合タンパク質は、各々、組成物に含まれてもよく、個々にまたはまとめて宿主に投与され得る。代替的に、これらの成分は、宿主への投与のために単一の組成物で提供され得る。宿主への投与は、宿主への送達に関して当業者に既知のまたは本明細書に記載のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター）を介して行われ得る。本明細書で説明される通り、異なる選択マーカー（例えば、レンチウイルスのｇＲＮＡ選択のため）の使用及びｇＲＮＡの濃度（例えば、複数のｇＲＮＡが使用されるかどうかに依存する）は、作用の向上を引き出すために有利なものでよい。
本概念に基づいて、ＤＮＡの切断、遺伝子活性化、または遺伝子の不活性化を含めたゲノム遺伝子座事象を引き出すためのいくつかの変化が適切である。提供される組成物を使用して、当業者は、有利にかつ特異的に単一または複数の遺伝子座を、同じまたは異なる機能ドメインで標的化し、１つ以上のゲノム遺伝子座事象を引き出すことができる。該組成物は、細胞内のライブラリのスクリーニング及びインビボでの機能モデリングのための多種多様な方法に適用され得る（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡの遺伝子活性化及び機能の確認、機能獲得型モデリング、機能喪失型モデリング、本発明の組成物を、最適化及びスクリーニングの目的で細胞株及びトランスジェニック動物を確立するための使用）。
本発明は、本発明の組成物を、本発明または出願に先行するものと見なされない条件付きまたは誘導性ＣＲＩＳＰＲトランスジェニック細胞／動物を確立及び利用するために使用することを包含する。例えば、該標的細胞は、Ｃａｓ９を、条件付きでまたは誘導可能に（例えば、Ｃｒｅ依存的構築物の形態で）含み、及び／または該アダプタータンパク質を、条件付きでまたは誘導可能に含み、かつ該標的細胞に導入されたベクターの発現に際して、該ベクターは、該標的細胞におけるＣａｓ９の発現及び／またはアダプターの発現の条件を誘導または引き起こすものを発現する。ＣＲＩＳＰＲ複合体を創出する既知の方法を使用して、本発明の教示及び組成物を適用することによって、機能ドメインが作用する誘導性ゲノム事象もまた本発明の実施形態である。この一例は、ＣＲＩＳＰＲノックイン／条件付きトランスジェニック動物（例として、例えば、Ｌｏｘ－Ｓｔｏｐ－ポリＡ－Ｌｏｘ（ＬＳＬ）カセットを含むマウス）の創出ならびにそれに続く、本明細書に記載の１つ以上の修飾された不活性型ｇＲＮＡ（例えば、遺伝子活性化のため、目的の標的遺伝子のＴＳＳに対して－２００ヌクレオチド）をもたらす１つ以上の組成物（例えば、コートタンパク質によって認識される１つ以上のアプタマー、例えば、ＭＳ２で修飾された不活性型ｇＲＮＡ）、本明細書に記載の１つ以上のアダプタータンパク質（１つ以上のＶＰ６４に連結したＭＳ２結合タンパク質）及び該条件付き動物を誘導する手段（例えば、Ｃａｓ９発現を誘導可能にするためのＣｒｅリコンビナーゼ）の送達である。代替的に、該アダプタータンパク質は、スクリーニング目的の有効なモデルを提供するために、条件付きまたは誘導性要素として、条件付きまたは誘導性Ｃａｓ９とともに提供されてもよく、これは、有利には、幅広い用途に対して最小限のデザイン及び特定の不活性型ｇＲＮＡの投与のみを必要とする。
別の実施形態では、該不活性型ガイドはさらに、特異性を改善するように修飾される。保護された不活性型ガイドが合成されてもよく、それにより、二次構造が該不活性型ガイドの３’末端に導入され、その特異性が改善される。保護されたガイドＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）は、細胞内で目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列及び保護鎖を含み、該保護鎖は、任意に、該ガイド配列に相補的であり、該ガイド配列は、該保護鎖に一部ハイブリダイズすることが可能であり得る。該ｐｇＲＮＡは、任意に、伸長配列を含む。該ｐｇＲＮＡ－標的ＤＮＡハイブリダイゼーションの熱力学は、該ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの間で相補的な塩基の数によって特定される。「熱力学的保護」を採用することによって、不活性型ｇＲＮＡの特異性が、保護配列の付加により改善され得る。例えば、１つの方法は、該不活性型ｇＲＮＡ内のガイド配列の３’末端に、様々な長さの相補的保護鎖を付加する。結果として、該保護鎖は、該不活性型ｇＲＮＡの少なくとも一部に結合し、保護されたｇＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）を提供する。次に、本明細書における不活性型ｇＲＮＡの基準は、本記載の実施形態を使用して容易に保護され、ｐｇＲＮＡがもたらされ得る。該保護鎖は、別々のＲＮＡ転写物もしくは鎖または該不活性型ｇＲＮＡガイド配列の３’末端に結合したキメラ型のいずれかであり得る。
多重（タンデム）標的化法におけるタンデムガイド及び使用
本発明者らは、本明細書に定義するＣＲＩＳＰＲ酵素が、活性を失うことなく複数のＲＮＡガイドを採用することができることを示した。これにより、本明細書に定義するＣＲＩＳＰＲ酵素、系または複合体を、複数のＤＮＡ標的、遺伝子または遺伝子座を標的化するために、本明細書に定義する単一の酵素、系または複合体とともに使用することが可能になる。該ガイドＲＮＡは、任意に本明細書に定義するダイレクトリピート等のヌクレオチド配列によって分離されて、タンデムに配列され得る。該異なるガイドＲＮＡの位置がタンデムであることは、活性に影響しない。用語「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系」、「ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ複合体」、「ＣＲＩＳＰＲ複合体」及び「ＣＲＩＳＰＲ系」は同義で使用される。また、用語「ＣＲＩＳＰＲ酵素」、「Ｃａｓ酵素」、または「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素」は同義で使用され得る。好ましい実施形態では、かかるＣＲＩＳＰＲ酵素、ＣＲＩＳＰ－Ｃａｓ酵素またはＣａｓ酵素は、Ｃａｓ９であるか、または本明細書の他の箇所に記載のその修飾されたもしくは変異したバリアントのいずれか１つである。
１つの実施形態では、本発明は、天然に存在しないまたは操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくは、クラス２のＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくは、本明細書に記載のＶ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、これに限定されないが、本明細書の他の箇所に記載のタンデムまたは多重標的化に使用されるＣａｓ９を提供する。本明細書の他の箇所に記載の本発明のＣＲＩＳＰＲ（またはＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓもしくはＣａｓ）酵素、複合体、または系のいずれかがかかるアプローチに使用され得ることが理解される。本明細書の他の箇所に記載の任意の方法、産物、組成物及び使用は、以下にさらに詳述される多重またはタンデム標的化アプローチと同様に適用可能である。さらなる指針を用いて、以下の特定の実施形態及び実施形態を提供する。
１つの実施形態では、本発明は、複数の遺伝子座を標的化するための本明細書に定義するＣａｓ９酵素、複合体または系の使用を提供する。１つの実施形態では、これは、複数の（タンデムまたは多重）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を使用して確立され得る。
１つの実施形態では、本発明は、タンデムまたは多重標的化のための本明細書に定義するＣａｓ９酵素、複合体または系の１つ以上の要素の使用方法を提供し、かかるＣＲＩＳＰ系は、複数のガイドＲＮＡ配列を含む。好ましくは、該ｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列、例えば、本明細書の他の箇所で定義されるダイレクトリピートによって分離される。
本明細書に定義するＣａｓ９酵素、系または複合体は、複数の標的ポリヌクレオチドを修飾するための有効な手段を提供する。本明細書に定義するＣａｓ９酵素、系または複合体は、非常に多数の細胞型において、１つ以上の標的ポリヌクレオチドを修飾（例えば、削除、挿入、移行、不活性化、活性化）することを含めた多種多様な有用性を有する。したがって、本発明の本明細書に定義するＣａｓ９酵素、系または複合体は、例えば、遺伝子治療、薬物スクリーニング、疾患の診断、及び予測において、単一のＣＲＩＳＰＲ系内での複数の遺伝子座の標的化を含めて広範囲の用途を有する。
１つの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの不安定化ドメインを関連して有するＣａｓ９タンパク質を有する本明細書に定義するＣａｓ９酵素、系または複合体、すなわち、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、及び複数のガイドＲＮＡを提供し、該複数のガイドＲＮＡは、複数の核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子を標的とし、それによって、かかる複数のガイドＲＮＡの各々は、その対応する核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子を特異的に標的とする。各核酸分子標的、例えば、ＤＮＡ分子は、遺伝子産物をコードする場合もあれば、遺伝子座を包含することもある。複数のガイドＲＮＡを使用することにより、複数の遺伝子座または複数の遺伝子の標的化が可能になる。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、該遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を切断する場合がある。いくつかの実施形態では、該遺伝子産物の発現が変更される。該Ｃａｓ９タンパク質及び該ガイドＲＮＡは、天然には一緒に存在しない。本発明は、タンデムに配列されたガイド配列を含むガイドＲＮＡを包含する。本発明はさらに、真核細胞での発現のためにコドン最適されたＣａｓ９タンパク質のコーディング配列を包含する。好ましい実施形態では、該真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞または酵母細胞であり、より好ましい実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。該遺伝子産物の発現は、減少し得る。該Ｃａｓ９酵素は、ＣＲＩＳＰＲ系または複合体の一部を形成する場合があり、これはさらに、一連の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、２５、３０、または３０を超えるガイド配列を含むタンデムに配列されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、各々が細胞における目的のゲノム遺伝子座の標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能である。いくつかの実施形態では、該機能的Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系または複合体は、該複数の標的配列に結合する。いくつかの実施形態では、該機能的ＣＲＩＳＰＲ系または複合体は、該複数の標的配列を編集する場合があり、例えば、該標的配列は、ゲノム遺伝子座を含む場合があり、いくつかの実施形態では、遺伝子発現の変更がある場合がある。いくつかの実施形態では、該機能的ＣＲＩＳＰＲ系または複合体は、さらなる機能ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、複数の遺伝子産物の発現を変更または修飾するための方法を提供する。該方法は、かかる標的核酸、例えば、ＤＮＡ分子を含む細胞、または標的核酸、例えば、ＤＮＡ分子を含みかつ発現する細胞に導入することを含んでよく、例えば、該標的核酸は、遺伝子産物をコードする場合もあれば、遺伝子産物の発現をもたらす場合もある（例えば、調節配列）。
好ましい実施形態では、多重標的化に使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であるか、または該ＣＲＩＳＰＲ系もしくは複合体は、Ｃａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、該多重標的化に使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＡｓＣａｓ９であるか、または該多重標的化に使用されるＣＲＩＳＰＲ系もしくは複合体は、ＡｓＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＬｂＣａｓ９であるか、または該ＣＲＩＳＰＲ系もしくは複合体は、ＬｂＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、該多重標的化に使用されるＣａｓ９酵素は、ＤＮＡの両方の鎖を切断して、二重鎖切断（ＤＳＢ）を産生する。いくつかの実施形態では、該多重標的化に使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、該多重標的化に使用されるＣａｓ９酵素は、二重ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、該多重標的化に使用されるＣａｓ９酵素は、本明細書の他の箇所で定義されるＤＤ Ｃａｓ９酵素等のＣａｓ９酵素である。
いくつかの一般的な実施形態では、該多重標的化に使用されるＣａｓ９酵素は、１つ以上の機能ドメインと関連している。いくつかのより具体的な実施形態では、該多重標的化に使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素は、本明細書の他の箇所で定義される不活性型Ｃａｓ９である。
実施形態では、本発明は、本明細書に定義する多重標的化に使用されるＣａｓ９酵素、系もしくは複合体または本明細書に定義するポリヌクレオチドを送達する手段を提供する。かかる送達手段の非限定的な例は、例えば、本明細書に論じる該複合体の成分（複数可）を送達する粒子（複数可）、該ポリヌクレオチド（複数可）を含むベクター（複数可）である（例えば、該ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする、該ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするヌクレオチドを提供する）。いくつかの実施形態では、該ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ、もしくはレンチウイルスであり得る。プラスミドによる、例えば、ＨＥＫ細胞への一過性トランスフェクションは、特にＡＡＶのサイズ制限があり、Ｃａｓ９がＡＡＶに収まる間に、さらなるガイドＲＮＡで上限に達する可能性があることを考慮すると有利であり得る。
同様に提供するのは、多重標的化に使用される本明細書で使用されるＣａｓ９酵素、複合体または系を構成的に発現するモデルである。該生物は、トランスジェニックであってもよく、本ベクターでトランスフェクトされたものであってもよく、そのようにトランスフェクトされた生物の子孫であってもよい。さらなる実施形態では、本発明は、本明細書に定義するＣＲＩＳＰＲ酵素、系及び複合体または本明細書に記載するポリヌクレオチドもしくはベクターを含む組成物を提供する。同様に提供するのは、複数のガイドＲＮＡを、好ましくはタンデムに配列された構成で含むＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系または複合体である。かかる異なるガイドＲＮＡは、ダイレクトリピート等のヌクレオチド配列で分離されてもよい。
同様に提供するのは、対象、例えば、治療を必要とする対象を治療する方法であり、該対象を、本明細書に記載のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系もしくは複合体をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはベクターのいずれかで形質転換することによって遺伝子編集を誘導すること及びそれらを該対象に投与することを含む。適切な修復鋳型もまた提供され、例えば、かかる修復鋳型を含むベクターによって送達される。同様に提供するのは、対象、例えば、治療を必要とする対象を治療する方法であり、該対象を、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換することによって複数の標的遺伝子座の転写活性化または抑制を誘導することを含み、かかるポリヌクレオチドまたはベクターは、好ましくはタンデムに配列された複数のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９酵素、複合体または系をコードするかまたは含む。任意の治療がエキソビボ、例えば、細胞培養で行われる場合、用語「対象」は、「細胞または細胞培養」という表現で置き換えてもよいことが理解されよう。
本明細書の他の箇所で定義される治療の方法に使用するための、好ましくはタンデムに配列された複数のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９酵素、複合体もしくは系を含む組成物、またはかかる好ましくはタンデムに配列された複数のガイドＲＮＡを含むＣａｓ９酵素、複合体もしくは系をコードするもしくは含むポリヌクレオチドもしくはベクターもまた提供する。かかる組成物を含む成分のキットもまた提供され得る。かかる治療方法のための薬剤の製造におけるかかる組成物の使用もまた提供する。スクリーニングにおけるＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系の使用、例えば、機能獲得スクリーニングもまた本発明によって提供される。人工的に遺伝子を過剰発現させた細胞は、例えば、負のフィードバックループによって、徐々に該遺伝子を下方制御することが可能である（均衡状態を取り戻す）。該スクリーニングを開始するまでに、調節されていない遺伝子は、再び減少する可能性がある。誘導性Ｃａｓ９活性化因子を使用することにより、該スクリーニングの直前に転写を誘導することが可能になり、ひいては偽陰性のヒットの機会を最小限に抑える。したがって、スクリーニング、例えば、機能獲得スクリーニングにおける本発明の使用により、偽陰性の結果の機会が最小限に抑えられ得る。
１つの実施形態では、本発明が提供するのは、操作された天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ系であり、これは、Ｃａｓ９タンパク質及び複数のガイドＲＮＡを含み、該複数のガイドＲＮＡは各々、細胞内の遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を特異的に標的とし、それによって、該複数のガイドＲＮＡは各々、該遺伝子産物をコードするそれらの特異的なＤＮＡ分子を標的とし、該Ｃａｓ９タンパク質は、該遺伝子産物をコードする標的ＤＮＡ分子を切断し、それによって、該遺伝子産物の発現が変更される。該ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び該ガイドＲＮＡは、天然には一緒に存在しない。本発明は、好ましくはダイレクトリピート等のヌクレオチド配列によって分離され、任意にｔｒａｃｒ配列に融合された複数のガイド配列を含む複数のガイドＲＮＡを包含する。本発明の実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質であり、より好ましい実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。本発明はさらに、真核細胞での発現のためにコドン最適されたＣａｓ９タンパク質を包含する。好ましい実施形態では、該真核細胞は哺乳類細胞であり、より好ましい実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態では、該遺伝子産物の発現は、減少する。
別の実施形態では、本発明が提供するのは、１つ以上のベクターを含む操作された天然に存在しないベクター系であり、該ベクターは、各々が遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を特異的に標的とする複数のＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系ガイドＲＮＡに作動可能に連結された第一の制御要素及びＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードする作動可能に連結された第二の制御要素を含む。両方の制御要素は、該系の同じベクターに配置される場合もあれば、異なるベクターに配置される場合もある。該複数のガイドＲＮＡは、細胞内で該複数の遺伝子産物をコードする複数のＤＮＡ分子を標的とし、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、該遺伝子産物をコードする複数のＤＮＡ分子を切断する場合もあり（それが一方または両方の鎖を切断する場合もあれば、実質的にヌクレアーゼ活性を有さない場合もある）、それによって、該複数の遺伝子産物の発現が変更される。該ＣＲＩＳＰＲタンパク質及び該複数のガイドＲＮＡは、天然には一緒に存在しない。好ましい実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であり、任意に、真核細胞での発現のためにコドン最適化される。好ましい実施形態では、該真核細胞は哺乳類細胞、植物細胞または酵母細胞であり、より好ましい実施形態では、該哺乳類細胞は、ヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態では、該複数の遺伝子産物の各々の発現は変更され、好ましくは、減少する。
１つの実施形態では、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクター系を提供する。いくつかの実施形態では、該系は以下を含む：（ａ）ダイレクトリピート配列及び該ダイレクトリピート配列の上流または下流（適用され得るいずれか）の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に連結された第一の制御要素、ここで、該１つ以上のガイド配列は、発現されると、真核細胞において該１つ以上の標的配列への該ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、該ＣＲＩＳＰＲ複合体は、該１つ以上のガイド配列と複合体を形成するＣａｓ９酵素を含み、該１つ以上のガイド配列は、該１つ以上の標的配列にハイブリダイズされるもの、及び（ｂ）かかるＣａｓ９酵素をコードする酵素コーディング配列に作動可能に連結され、好ましくは、少なくとも１つの核局在配列及び／または少なくとも１つのＮＥＳを含む第二の制御要素、ここで、成分（ａ）及び（ｂ）は、該系の同じまたは異なるベクターに配置される。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、成分（ａ）はさらに、該第一の制御要素に作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を含み、ここで、該２つ以上のガイド配列は、発現されると、真核細胞において異なる標的配列へのＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ複合体は、真核細胞の核内または核外で、検出可能な量のかかるＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を促進するために十分な強度の１つ以上の核局在配列及び／または１つ以上のＮＥＳを含む。いくつかの実施形態では、該第一の制御要素は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該第二の制御要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該ガイド配列の各々は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１６～３０、または１６～２５、または１６～２０ヌクレオチド長である。
組み換え発現ベクターは、宿主細胞内での該核酸の発現に適した形態で、本明細書に定義する複数の標的化に使用されるＣａｓ９酵素、系または複合体をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、これは、該組み換え発現ベクターが、１つ以上の制御要素を含み、これは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得るとともに、発現される核酸配列に作動可能に連結されることを意味する。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に定義する複数の標的化に使用されるＣａｓ９酵素、系または複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターで一過性にまたは非一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、それが対象に自然に存在するようにトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、対象から採取される。いくつかの実施形態では、該細胞は、対象から採取した細胞、例えば、細胞株に由来する。組織培養用の多種多様な細胞株が当技術分野で既知であり、本明細書の他の箇所で例示されている。細胞株は、当業者に既知の様々な起源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に定義する複数の標的化に使用されるＣａｓ９酵素、系または複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞株を確立するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複数の標的化に使用されるＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系または複合体の成分で一過性にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、またはＲＮＡでのトランスフェクションによって）、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系または複合体の活性を介して修飾された細胞を使用して、該修飾を含むが、任意の他の外因性配列を欠いている細胞を含む新たな細胞株が確立される。いくつかの実施形態では、本明細書に定義する複数の標的化に使用されるＣａｓ９酵素、系もしくは複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターで一過性にもしくは非一過性にトランスフェクトされた細胞、またはかかる細胞に由来する細胞株は、１つ以上の試験化合物の評価に使用される。
用語「制御要素」は、本明細書の他の箇所で定義される通りである。
有利なベクターとしては、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスが挙げられ、かかるベクター型もまた、特定の細胞型を標的化するために選択され得る。
１つの実施形態では、本発明は、（ａ）ダイレクトリピート配列及び該ダイレクトリピート配列の上流または下流（適用され得るいずれか）の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に連結された第一の制御要素、ここで、該ガイド配列（複数可）は、発現されると、真核細胞において該それぞれの標的配列（複数可）への該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体は、該１つ以上のガイド配列と複合体を形成するＣａｓ９酵素を含み、該１つ以上のガイド配列は、該それぞれの標的配列（複数可）にハイブリダイズされるもの、及び／または（ｂ）かかるＣａｓ９酵素をコードする酵素コーディング配列に作動可能に連結され、好ましくは、少なくとも１つの核局在配列及び／またはＮＥＳを含む第二の制御要素を含む真核生物宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、該宿主細胞は、成分（ａ）及び（ｂ）を含む。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、成分（ａ）、成分（ｂ）、または成分（ａ）及び（ｂ）は、該宿主真核細胞のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの実施形態では、成分（ａ）はさらに、該第一の制御要素に作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を含み、任意にダイレクトリピートによって分離され、ここで、該２つ以上のガイド配列の各々は、発現されると、真核細胞において異なる標的配列へのＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、真核細胞の核内及び／または核外で、検出可能な量のかかるＣＲＩＳＰＲ酵素の蓄積を促進するために十分な強度の１つ以上の核局在配列及び／または核外移行シグナル配列もしくはＮＥＳを含む。
いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅのＣａｓ９に由来し、本明細書の他の箇所で定義されるＣａｓ９のさらなる改変または変異を含んでもよく、キメラＣａｓ９であることも可能である。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、真核細胞での発現用にコドン最適化される。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置で、１本または２本の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、該第一の制御要素は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該第二の制御要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該１つ以上のガイド配列は、（各々）少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１６～３０、または１６～２５、または１６～２０ヌクレオチド長である。複数のガイドＲＮＡが使用される場合、それらは、好ましくは、ダイレクトリピート配列によって分離される。
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞等の宿主細胞内で、複数の標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ複合体を、例えば、複数の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それによって複数の標的ポリヌクレオチドを修飾するために、かかる複数の標的ポリヌクレオチドに結合させることを含み、該Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ複合体は、各々がかかる標的ポリヌクレオチド内の特定の標的配列にハイブリダイズされている複数のガイド配列と複合体を形成するＣａｓ９酵素を含み、かかる複数のガイド配列は、ダイレクトリピート配列に連結される。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る（例えば、シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡを提供するため）。いくつかの実施形態では、かかる切断は、該標的配列の各々の位置で、かかるＣａｓ９酵素によって１本または２本の鎖を切断することを含む。いくつかの実施形態では、かかる切断により、該複数の標的遺伝子の転写が減少する。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組み換えによって１つ以上のかかる切断された標的ポリヌクレオチドを修復することを含み、かかる修飾は、１つ以上のかかる標的ポリヌクレオチドのうちの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。いくつかの実施形態では、かかる変異は、１つ以上の該標的配列を含む遺伝子から発現したタンパク質における１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、１つ以上のベクターをかかる真核細胞に送達することを含み、該１つ以上のベクターは、該Ｃａｓ９酵素及び該ダイレクトリピート配列に連結された複数のガイドＲＮＡ配列のうちの１つ以上の発現を促進する。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、かかるベクターは、対象において真核細胞に送達される。いくつかの実施形態では、かかる修飾は、細胞培養中のかかる真核細胞において行われる。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、かかる修飾の前に対象からかかる真核細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、かかる真核細胞及び／またはそれに由来する細胞をかかる対象に戻すことを含む。
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞において複数のポリヌクレオチドの発現を修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体を、複数のポリヌクレオチドに結合させ、かかる結合がかかるポリヌクレオチドの発現を増加または減少させるようにすることを含み、該Ｃａｓ９ＣＲＩＳＰＲ複合体は、各々がかかるポリヌクレオチド内のそれ自体の標的配列に特異的にハイブリダイズされている複数のガイド配列と複合体を形成するＣａｓ９酵素を含み、かかるガイド配列は、ダイレクトリピート配列に連結される。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、１つ以上のベクターをかかる真核細胞に送達することを含み、該１つ以上のベクターは、該Ｃａｓ９酵素及び該ダイレクトリピート配列に連結された複数のガイド配列のうちの１つ以上の発現を促進する。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。
１つの実施形態では、本発明は、ダイレクトリピート配列の上流または下流（適用され得るいずれか）の複数のガイドＲＮＡ配列を含む組み換えポリヌクレオチドを提供し、該ガイド配列の各々は、発現されると、真核細胞に存在するその対応する標的配列へのＣａｓ９ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する。いくつかの実施形態では、該標的配列は、真核細胞に存在するウイルスの配列である。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、該標的配列は、がん原遺伝子またはがん遺伝子である。
本発明の実施形態は、細胞内で目的のゲノム遺伝子座における標的配列にハイブリダイズすることが可能なガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び少なくとも１つ以上の核局在配列を含み得る本明細書に定義するＣａｓ９を含み得る天然に存在しないまたは操作された組成物を包含する。
本発明の実施形態は、本明細書に記載の組成物のいずれかを細胞に導入することにより、該細胞内の遺伝子発現を変化させるように目的のゲノム遺伝子座を修飾する方法を包含する。
本発明の実施形態は、上記の要素が、単一の組成物に含まれるもの、または個々の組成物に含まれるものである。これらの組成物は、有利には、該ゲノムのレベルに機能的効果を生じさせるように宿主に適用され得る。
かかる操作されたＡＡＶのカプシドを発現する操作された細胞及び生物
本明細書に提供するのは、操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、及び／またはベクター系のうちの１つ以上を含み得る操作された細胞である。いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、該操作された細胞内で発現され得る。いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、本明細書の他の箇所に記載の操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子を産生することが可能であり得る。同様に本明細書に提供するのは、１つ以上の本明細書に記載の操作された細胞を含み得る修飾されたまたは操作された生物である。該操作された細胞は、本明細書の他の箇所に記載の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドに応じてまたはそれとは無関係にカーゴ分子（例えば、カーゴポリヌクレオチド）を発現するように操作され得る。
多種多様な動物、植物、藻類、真菌、酵母等、及び動物、植物、藻類、真菌、酵母細胞または組織系が、本明細書の他の箇所に言及される様々な形質転換方法を使用して、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の核酸構築物を発現するように操作され得る。これにより、例えば、産生目的のための操作されたＡＡＶのカプシド粒子を産生することができる生物、操作されたＡＡＶのカプシドデザイン及び／または生成、及び／またはモデル生物が産生され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、植物、動物、藻類、真菌、及び／または酵母の１つ以上の細胞または組織系に安定にまたは一過性に導入され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシド系のポリヌクレオチドは、植物、動物、藻類、真菌、及び／または酵母の１つ以上の細胞または組織系にゲノム的に導入される。該修飾された生物及び系のさらなる実施形態は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系の１つ以上の成分は、該植物、動物、藻類、真菌、酵母の１つ以上の細胞、または組織系で発現される。
操作された細胞
本明細書に記載するのは、本明細書の他の箇所に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、及び／またはベクター系のうちの１つ以上を含み得る操作された細胞の様々な実施形態である。いくつかの実施形態では、該細胞は、１つ以上の該操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドを発現することができ、１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシド粒子を産生することができ、これらは、本明細書でさらに詳述される。かかる細胞は、本明細書では「産生細胞」とも呼ばれる。これらの操作された細胞は、本明細書の他の箇所に記載の「修飾された細胞」とは、該修飾された細胞が必ずしも産生細胞ではない（すなわち、それらは、操作されたＧＴＡ送達粒子を作製しない）という点から、それらが、該細胞に操作されたＡＡＶのカプシド粒子を産生することを可能にする本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、操作されたＡＡＶのカプシドベクターまたは他のベクターのうちの１つ以上を含まない限り異なることが理解されよう。修飾された細胞は、操作されたＡＡＶのカプシド粒子のレシピエント細胞であることができ、いくつかの実施形態では、該レシピエント細胞に送達された該操作されたＡＡＶのカプシド粒子（複数可）及び／またはカーゴポリヌクレオチドによって修飾され得る。修飾された細胞は、本明細書の他の箇所により詳細に論じられる。修飾という用語は、レシピエント細胞であることに左右されない細胞の修飾に関連して使用され得る。例えば、単離された細胞は、操作されたＡＡＶのカプシド分子を受ける前に修飾され得る。
実施形態では、本発明は、非ヒト真核生物、例えば、本記載の実施形態のいずれかに従う本明細書に記載の操作された送達系の１つ以上の成分を含む真核生物宿主細胞を含めた多細胞真核生物を提供する。他の実施形態では、本発明は、真核生物、好ましくは、本記載の実施形態のいずれかに従う本明細書に記載の操作された送達系の１つ以上の成分を含む真核生物宿主細胞を含む多細胞真核生物を提供する。いくつかの実施形態では、該生物は、ＡＡＶの宿主である。
特定の実施形態では、得られる植物、藻類、真菌、酵母等、細胞または部分は、該細胞のすべてまたは一部のゲノムに組み込まれた外因性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物である。
該操作された細胞は、原核細胞であることができる。該原核細胞は、細菌細胞であり得る。該原核細胞は、古細菌細胞であり得る。該細菌細胞は、任意の適切な細菌細胞であり得る。適切な細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｄｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｄｏａｌｔｅｒｍｏｎａｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に由来し得る。適切な細菌細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ細胞、Ｒｏｄｈｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ細胞、Ｐｓｅｄｏａｌｔｅｒｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細菌の適切な株としては、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１－ＳＩ、ＢＬ２１－ＡＩ、Ｔｕｎｅｒ、Ｔｕｎｅｒ ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ、ＡＤ４９４、ＢＬ２ｔｒｘＢ、ＨＭＳ１７４、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＢＬＲ、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ及びＡｒｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）が挙げられるがこれらに限定されない。
該操作された細胞は、真核細胞であることができる。該真核細胞は、ヒト、または本明細書で論じられる非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、もしくは非ヒト哺乳類もしくは霊長類が挙げられるがこれらに限定されない植物または哺乳類等の特定の生物のものでもそれに由来してもよい。いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、細胞株であり得る。細胞株の例としては、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞、１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられるがこれらに限定されない。細胞株は、当業者に既知の様々な起源から入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）参照）。
いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、筋細胞（例えば、心筋、骨格筋、及び／または平滑筋）、骨細胞、血球、免疫細胞（Ｂ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞等を含むがこれらに限定されない）、腎臓細胞、膀胱細胞、肺細胞、心臓細胞、肝臓細胞、脳細胞、ニューロン、皮膚細胞、胃細胞、神経支持細胞、腸細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞または他の前駆細胞、副腎細胞、軟骨細胞、及びそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、真菌細胞であることができる。本明細書で使用される、「真菌細胞」とは、真菌界の任意の真核細胞型を指す。真菌界の門には、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａが含まれる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌が含まれ得る。いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、酵母細胞である。
本明細書で使用される、用語「酵母細胞」は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門の任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されることなく、実験室及び工業環境で使用される多くのタイプの酵母がＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ門の一部である。いくつかの実施形態では、該酵母細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、またはＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ細胞である。他の酵母細胞には、限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、及びＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、別名Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ及びＣａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、糸状真菌細胞である。本明細書で使用される、用語「糸状真菌細胞」は、糸、すなわち、菌糸（ｈｙｐｈａｅ）または菌糸（ｍｙｃｅｌｉａ）で成長する任意の真菌細胞型を指す。糸状真菌細胞の例には、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、工業用菌株である。本明細書で使用される、「工業用菌株」とは、工業的プロセス、例えば、商業的または工業的規模での産物の産生において使用されるまたはそれから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業用菌株は、典型的には工業的プロセスにおいて使用される真菌種を指す場合もあれば、非工業的目的（例えば、実験室研究）のためにも使用され得る真菌種の単離物を指す場合もある。工業的プロセスの例としては、発酵（例えば、食料または飲料製品の産生におけるもの）、蒸留、バイオ燃料産生、化合物の産生、及びポリペプチドの産生を挙げてもよい。工業用菌株の例としては、限定されないが、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用される、「倍数体」細胞とは、ゲノムが複数のコピーに存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、倍数体状態で天然に見られる細胞型を指す場合もあれば、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）倍数体状態で存在するように誘導された細胞を指す場合もある。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指す場合もあれば、目的の特定のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指す場合もある。
いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用される、「二倍体」細胞とは、ゲノムが２つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、二倍体状態で天然に見られる細胞型を指す場合もあれば、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）二倍体状態で存在するように誘導された細胞を指す場合もある。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、単数体または二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指す場合もあれば、目的の特定のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指す場合もある。いくつかの実施形態では、該真菌細胞は、単数体細胞である。本明細書で使用される、「単数体」細胞とは、ゲノムが１つのコピーで存在する任意の細胞を指し得る。単数体細胞は、単数体状態で天然に見られる細胞型を指す場合もあれば、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または修飾を介して）単数体状態で存在するように誘導された細胞を指す場合もある。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、単数体または二倍体状態で維持され得る。単数体細胞は、ゲノム全体が単数体である細胞を指す場合もあれば、目的の特定のゲノム遺伝子座において単数体である細胞を指す場合もある。
いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、対象から得られた細胞である。いくつかの実施形態では、該対象は、健康または非罹患対象である。いくつかの実施形態では、該対象は、操作されたＡＡＶのカプシド粒子が産生される際に、それが所望の生理的及び／または生物学的特性に関連し得る及び／または所望の生理的及び／または生物学的特性を修飾することが可能であり得る１つ以上のカーゴポリヌクレオチドをパッケージングし得るように、所望の生理的及び／または生物学的特性を有する対象である。したがって、産生された操作されたＡＡＶのカプシド粒子のカーゴポリヌクレオチドは、所望の特性をレシピエント細胞に移すことが可能であり得る。いくつかの実施形態では、該カーゴポリヌクレオチドは、該操作された細胞が所望の生理的及び／または生物学的特性を有するように、該操作された細胞のポリヌクレオチドを修飾することが可能である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の本明細書に記載のベクターでトランスフェクトされた細胞は、１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞株を確立するために使用される。
該操作された細胞は、操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及び／または粒子を産生するために使用され得る。いくつかの実施形態では、該操作されたウイルス（例えば、ＡＡＶ）のカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及び／または粒子は、産生され、採取され、及び／またはそれを必要とする対象に送達される。いくつかの実施形態では、該操作された細胞は、対象に送達される。該操作された細胞の他の使用は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、本明細書の他の箇所に記載されている製剤及び／またはキットに含まれ得る。
該操作された細胞は、後の使用のために短期間または長期間保存され得る。適切な保存方法は、当技術分野で一般に知られている。さらに、後の使用のために保存された細胞を復元する方法（例えば、解凍、再構成、及び他の方法で、該操作された細胞での保存後の代謝を刺激すること）もまた、当該技術分野で一般に知られている。
製剤
本明細書に記載の組成物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、粒子、細胞、ベクター系及びそれらの組み合わせは、医薬製剤等の製剤に含まれ得る。いくつかの実施形態では、該製剤は、本明細書に記載の１つ以上の筋特異的標的化部分を含むポリペプチド及び他の粒子を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、該製剤は、それを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系、操作された細胞、操作されたＡＡＶのカプシド粒子、及び／またはそれらの組み合わせの成分（複数可）は、対象または細胞に送達され得る製剤に含まれ得る。いくつかの実施形態では、該製剤は、医薬製剤である。本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、それを必要とする対象または細胞に単独でまたは例えば、医薬製剤における活性成分として提供され得る。したがって、同様に本明細書に記載するのは、ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む医薬製剤である。いくつかの実施形態では、該医薬製剤は、有効量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る。本明細書に記載の医薬製剤は、それを必要とする対象または細胞に投与され得る。
いくつかの実施形態では、該医薬製剤に含まれる本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上の量は、それを必要とする対象の体重または医薬製剤が投与され得る特定の患者集団の平均体重に基づいて約１ｐｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。該医薬製剤に含まれる本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上の量は、約１ｐｇ～約１０ｇまたは約１０ｎＬ～約１０ｍｌの範囲であり得る。該医薬製剤が１つ以上の細胞を含む実施形態では、該量は、約１細胞～１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０またはそれ以上の細胞の範囲であり得る。該医薬製剤が１つ以上の細胞を含む実施形態では、該量は、１ｎＬ、１μＬ、１ｍＬ、または１Ｌあたり約１細胞～１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０またはそれ以上の細胞の範囲であり得る。
操作されたＡＡＶのカプシド粒子が該製剤に含まれる実施形態では、該製剤は、１～１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、１ｘ１０１６、１ｘ１０１７、１ｘ１０１８、１ｘ１０１９、または１ｘ１０２０形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬの該操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、該製剤は、体積が０．１～１００ｍＬであることができ、１～１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、１ｘ１０１６、１ｘ１０１７、１ｘ１０１８、１ｘ１０１９、または１ｘ１０２０形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬの該操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含み得る。
医薬的に許容される担体ならびに補助成分及び薬剤
実施形態では、ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む医薬製剤はさらに、医薬的に許容される担体を含み得る。適切な医薬的に許容される担体としては、該活性組成物と有害に反応しない水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが挙げられるがこれらに限定されない。
該医薬製剤は、滅菌されてもよく、必要に応じて、該活性組成物と有害に反応しない補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を左右する塩、緩衝剤、着色、香味及び／または芳香物質等と混合されてもよい。
ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、操作されたＡＡＶのカプシド粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上に加えて、該医薬製剤はまた、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、ホルモン、免疫調節剤、解熱剤、抗不安剤、抗精神病剤、鎮痛剤、鎮痙剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗感染症剤、化学療法剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない補助活性薬剤を有効量含み得る。
適切なホルモンとしては、アミノ酸由来ホルモン（例えば、メラトニン及びチロキシン）、低分子ペプチドホルモン及びタンパク質ホルモン（例えば、チロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン）、エイコサノイド（例えば、アラキドン酸、リポキシン、及びプロスタグランジン）、ならびにステロイドホルモン（例えば、エストラジオール、テストステロン、テトラヒドロテストステロンコルチゾール）が挙げられるがこれらに限定されない。適切な免疫調節剤としては、プレドニゾン、アザチオプリン、６－ＭＰ、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１２）、サイトカイン（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－Ｋ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子、及びイミキモド）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６及びＣＸＣＬ７）、シトシンホスフェート－グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、抗体、及びアプタマー）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な解熱剤としては、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、アスピリン及び関連するサリチル酸塩（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）、パラセタモール／アセトアミノフェン、メタミゾール、ナブメトン、フェナゾン、及びキニーネが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な抗不安剤としては、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、及びトフィソパム）、セロトニン作動性抗鬱剤（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、三環式抗鬱剤、及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤）、メビカール、ファボモチゾール、セランク、ブロマンタン、エモキシピン、アザピロン、バルビツール酸、ヒドロキシジン、プレガバリン、バリドール、及びベータ遮断薬が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な抗精神病剤としては、ベンペリドール、ブロムペリドール、ドロペリドール、ハロペリドール、モペロン、ピパンペロン、チミペロン、フルスピリレン、ペンフリドール、ピモジド、アセプロマジン、クロルプロマジン、シアメマジン、ジキシラジン、フルフェナジン、レボメプロマジン、メソリダジン、ペラジン、ペリシアジン、ペルフェナジン、ピポチアジン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロチオペンジル、チオプロペラジン、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、クロルプロチキセン、クロペンチキソール、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロチアピン、ロキサピン、プロチペンジル、カルピプラミン、クロカプラミン、モリンドン、モサプラミン、スルピリド、ベラリプリド、アミスルプリド、アモキサピン、アリピプラゾール、アセナピン、クロザピン、ブロナンセリン、イロペリドン、ルラシドン、メルペロン、ネモナプリド、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、トリミプラミン、ジプラシドン、ゾテピン、アルストニー、ベフェプルノクス、ビトペルチン、ブレクスピプラゾール、カンナビジオール、カリプラジン、ピマバンセリン、ポマグルメタッドメチオニル、バビカセリン、キサノメリン、及びジクロナピンが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な鎮痛剤としては、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、オピオイド（例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルヒネ、ペチジン、ブプレノルフィン）、トラマドール、ノルエピネフリン、フルピルチン、ネホパム、オルフェナドリン、プレガバリン、ガバペンチン、シクロベンザプリン、スコポラミン、メサドン、ケトベミドン、ピリトラミド、ならびにアスピリン及び関連サリチル酸塩（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な鎮痙剤としては、メベベリン、パパベリン、シクロベンザプリン、カリソプロドール、オルフェナドリン、チザニジン、メタキサロン、メトカルバモール、クロルゾキサゾン、バクロフェン、ダントロレン、バクロフェン、チザニジン、及びダントロレンが挙げられるがこれらに限定されない。適切な抗炎症剤としては、プレドニゾン、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、及び免疫選択的抗炎症誘導体（例えば、顎下腺ペプチド－Ｔ及びその誘導体）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な抗ヒスタミン剤としては、Ｈ１－受容体アンタゴニスト（例えば、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブロモジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルプロマジン、シクリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、エバスチン、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボセチリジン、ロラタジン、メクリジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、ピリラミン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、及びトリプロリジン）、Ｈ２－受容体アンタゴニスト（例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン、及びロキサチジン）、トリトカリン、カテキン、クロモグリク酸、ネドクロミル、及びｐ２－アドレナリン作動性アゴニストが挙げられるがこれらに限定されない。
適切な抗感染症剤としては、抗アメーバ薬（例えば、ニタゾキサニド、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、クロロキン、ミルテフォシン、アンフォテリシンｂ、及びヨードキノール）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、及びネオマイシン）、駆虫剤（例えば、ピランテル、メベンダゾール、イベルメクチン、プラジカンテル、アルベンダゾール、チアベンダゾール、オキサムニキン）、抗真菌剤（例えば、アゾール抗真菌剤（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、パルコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、及びボリコナゾール）、エキノキャンディン（例えば、カスポファンギン、アニデュラファンギン、及びミカファンギン）、グリセオフルビン、テルビナフィン、フルシトシン、及びポリエン（例えば、ナイスタチン、及びアンフォテリシンｂ）、抗マラリア剤（例えば、ピリメタミン／スルファドキシン、アルテメーテル／ルメファントリン、アトバコン／プログアニル、キニーネ、ヒドロキシクロロキン、メフロキン、クロロキン、ドキシサイクリン、ピリメタミン、及びハロファントリン）、抗結核剤（例えば、アミノサリチレート（例えば、アミノサリチル酸）、イソニアジド／リファンピン、イソニアジド／ピラジンアミド／リファンピン、ベダキリン、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、及びサイクロセリン）、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン、リマンタジン、アバカビル／ラミブジン、エムトリシタビン／テノホビル、コビシスタット／エルビテグラビル／エムトリシタビン／テノホビル、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノホビル、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン、ラミブジン／ジドブジン、エムトリシタビン／テノホビル、エムトリシタビン／ロピナビル／リトナビル／テノホビル、インターフェロンアルファ－２ｖ／リバビリン、ペギンテルフェロンアルファ－２ｂ、マラビロク、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン、オセルタミビル、ザナミビル、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン、リルピビリン、デラビルジン、ネビラピン、エンテカルビル、ラミブジン、アデホビル、ソホスブビル、ジダノシン、テノホビル、アバカビル、ジドブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン、テルビブジン、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、ロピナビル／リトナビル、ボセプレビル、ダルナビル、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル、サキナビル、リバビリン、バラシクロビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びバルガンシクロビル）、カルバペネム（例えば、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、及びシラスタチン／イミペネム）、セファロスポリン（例えば、セファドロキシル、セフラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セファゾリン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフチゾキシム、及びセフタジジム）、糖ペプチド抗生剤（例えば、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、及びテラバンシン）、グリシルサイクリン（例えば、チゲサイクリン）、抗らい菌薬（例えば、クロファジミン及びサリドマイド）、リンコマイシン及びその誘導体（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド及びその誘導体（例えば、テリスロマイシン、フィダキソマイシン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、及びトロレアンドマイシン）、リネゾリド、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、リファキシミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、アズトレオナム、バシトラシン、ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、クラブラン酸／チカルシリン、ペニシリン、プロカインペニシリン、オキサシリン、ジクロキサシリン、及びナフシリン）、キノロン（例えば、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、トロバフロキサシン、及びスパルフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、スルファサラジン、及びスルフィソキサゾール）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン／サリチル酸、ドキシサイクリン／オメガ－３ポリ不飽和脂肪酸、及びテトラサイクリン）、ならびに尿路抗感染症薬（例えば、ニトロフラントイン、メテナミン、ホスホマイシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びメチレンブルー）が挙げられるがこれらに限定されない。
適切な化学療法剤としては、パクリタキセル、ブレンツキシマブベドチン、ドキソルビシン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、エベロリムス、ペメトレキセド、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリノスタット、トシツモマブ、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、ブスルファン、アレムツズマブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、ダウノルビシン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、ラムシルマブ、シタラビン、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、ダカルバジン、リュープロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来アスパラギナーゼ、アミフォスチン、エトポシド、フルタミド、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、プララトレキサート、メトトレキサート、フロクスウリジン、オビヌツズマブ、ゲムシタビン、アファチニブ、メシル酸イマチニブ、カルムスチン、エリブリン、トラスツズマブ、アルトレタミン、トポテカン、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、インターフェロンアルファ－２ａ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イキサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、トラスツズマブエムタンシン、カルフィルゾミブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、ミトタン、ビンクリスチン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、ストロンチウム－８９塩化物、メクロレタミン、マイトマイシン、ブスルファン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ビノレルビン、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、タモキシフェン、ミトキサントロン、ペグアスパラガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、カルボプラチン、ペルツズマブ、シスプラチン、ポマリドミド、プレドニゾン、アルデスロイキン、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドミド、リツキシマブ、オクトレチド、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、シルツキシマブ、オマセタキシン、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（チオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、テムシロリムス、ベンダムスチン塩酸塩、トリプトレリン、三酸化ヒ素、ラパチニブ、バルルビシン、パニツムマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、トレチノイン、アザシチジン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、イピリムマブ、ゴセレリン、ボリノスタット、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、エポチロン、タフルポシド、アザチオプリン、ドキシフルリジン、ビンデシン、及び全トランス型レチノイン酸が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上に加えて該医薬製剤に含まれる補助活性薬剤が存在する実施形態では、該補助活性薬剤の有効量等の量は、補助活性薬剤に応じて異なる。いくつかの実施形態では、該補助活性薬剤の量は、０．００１マイクログラム～約１ミリグラムの範囲である。他の実施形態では、該補助活性薬剤の量は、約０．０１ＩＵ～約１０００ＩＵの範囲である。さらなる実施形態では、該補助活性薬剤の量は、０．００１ｍＬ～約１ｍＬの範囲である。さらに他の実施形態では、補助活性薬剤の量は、医薬製剤全体の約１％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗの範囲である。追加の実施形態では、補助活性薬剤の量は、医薬製剤全体の約１％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖの範囲である。さらに他の実施形態では、補助活性薬剤の量は、医薬製剤全体の約１％ｗ／ｖ～約５０％ｗ／ｖの範囲である。
剤形
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤は、剤形であり得る。該剤形は、任意の適切な経路による投与用に適合され得る。適切な経路としては、経口（口腔内または舌下を含む）、直腸、硬膜外、頭蓋内、眼内、吸入、鼻腔内、局所（口腔内、舌下、または経皮を含む）、膣、尿道内、非経口、頭蓋内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、骨内、心臓内、関節内、海綿体内、髄腔内、硝子体内、脳内、歯肉、歯肉縁下、脳室内、及び皮内が挙げられるがこれらに限定されない。かかる製剤は、当技術分野で知られている任意の方法によって調製され得る。
経口投与用に適合された剤形は、個別の投薬量単位、例えば、カプセル、ペレットもしくは錠剤、粉末もしくは顆粒、溶液、または水性もしくは非水性液体中の懸濁液、食用フォームもしくはホイップ、または水中油型液体エマルションまたは油中水型液体エマルションであり得る。いくつかの実施形態では、経口投与用に適合された医薬製剤はまた、医薬製剤を風味付け、保存し、着色し、またはその分散を補助する１つ以上の薬剤を含む。経口投与のために調製された剤形はまた、フォーム、スプレー、または液体溶液として送達され得る液体溶液の形態であり得る。いくつかの実施形態では、該経口剤形は、標的化エフェクター融合タンパク質及び／またはその複合体または本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む組成物の治療有効量またはその適切な部分を含む約１ｎｇ～１０００ｇの医薬製剤を含み得る。該経口剤形は、それを必要とする対象に投与され得る。
適切な場合、本明細書に記載の剤形は、マイクロカプセル化され得る。
該剤形はまた、任意の成分の放出を延長または持続させるように調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、放出が遅延される成分であり得る。他の実施形態では、任意に含まれる補助成分の放出は、遅延される。成分の放出を遅延させるための適切な方法としては、ポリマー、ワックス、ゲル等の中の物質に成分をコーティングまたは埋め込むことが挙げられるがこれらに限定されない。遅延放出投薬製剤は、標準的な参考文献、例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ｔａｂｌｅｔｓ，”ｅｄｓ．Ｌｉｂｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ－Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００、及び“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ”，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）に記載されているように調製され得る。これらの参考文献は、錠剤及びカプセルならびに遅延放出剤形の錠剤及びペレット、カプセル、ならびに顆粒を調製するための賦形剤、材料、装置、及びプロセスに関する情報を提供する。該遅延放出は、約１時間～約３か月またはそれ以上の範囲であり得る。
適切なコーティング剤の例としては、セルロースポリマー、例えば、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、ならびに商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｔｈ Ｐｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、シェラック、ならびに多糖が挙げられるがこれらに限定されない。
コーティングは、所望の放出プロファイルをもたらすために、異なる比の水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、及び／またはｐＨ依存性ポリマーを用いて、水不溶性／水溶性非ポリマー性賦形剤を用いてまたは用いずに形成され得る。該コーティングは、錠剤（コーティングビーズを用いてまたは用いずに圧縮される）、カプセル（コーティングビーズを用いるまたは用いない）、ビーズ、粒子組成物を含むがこれらに限定されない剤形（マトリックスまたは単体）、限定されないが懸濁液形態としてまたはスプリンクル剤形として製剤化される「そのままの成分」のいずれかに対して実施される。
局所投与用に適合された剤形は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として製剤化され得る。眼または他の外部組織、例えば、口または皮膚の治療のためのいくつかの実施形態では、該医薬製剤は、局所軟膏またはクリームとして適用される。軟膏で製剤化される場合、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、パラフィン性または水混和性軟膏基材を用いて製剤化され得る。いくつかの実施形態では、該活性成分は、水中油クリーム基材または油中水基材を用いてクリームで製剤化され得る。口における局所投与用に適合された剤形としては、ロゼンジ、トローチ、及び口洗浄剤が挙げられる。
鼻または吸入投与用に適合された剤形としては、エアロゾル、溶液、懸濁液滴、ゲル、または乾燥粉末が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、微細化によって得られたまたは得られ得る粒子サイズが縮小した形態である吸入用に適合された剤形に含まれる。いくつかの実施形態では、サイズが減少した（例えば、微細化された）化合物またはその塩もしくは溶媒和物の粒子サイズは、当技術分野で知られている適切な方法によって測定して約０．５～約１０ミクロンのＤ５０値によって定義される。吸入による投与用に適合された剤形にはまた、粒子ダストまたはミストが含まれる。担体または賦形剤が鼻スプレーまたは液滴として投与するための液体である適切な剤形としては、活性成分（例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上及び／または補助活性剤）の水性または油性の溶液／懸濁液が含まれ、これらは様々なタイプの計量用量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器によって生成され得る。
いくつかの実施形態では、剤形は、吸入による投与に適切なエアロゾル製剤であり得る。これらの実施形態の一部では、該エアロゾル製剤は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上及び医薬的に許容される水性または非水性溶媒の溶液または微懸濁液を含み得る。エアロゾル製剤は、密閉容器において滅菌形態で単回または複数の用量で提供され得る。これらの実施形態の一部のため、該密閉容器は、計量弁が装着された単回用量または複数の用量の鼻またはエアロゾルディスペンサー（例えば、計量用量吸入具）であり、これは、容器の内容物が消費された後に廃棄されることが意図されている。
該エアロゾル剤形がエアロゾルディスペンサーに含まれる場合、該ディスペンサーは、加圧下で適切な推進剤、例えば、圧縮空気、二酸化炭素、またはヒドロフルオロカーボンが挙げられるがこれに限定されない有機推進剤を含む。他の実施形態におけるエアロゾル製剤剤形は、ポンプ噴霧器に含まれる。加圧エアロゾル製剤はまた、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上の溶液または懸濁液を含み得る。さらなる実施形態では、エアロゾル製剤はまた、例えば、製剤の安定性及び／または味及び／または微粒子質量特性（量及び／またはプロファイル）を改善するために組み込まれる共溶媒及び／または改良剤を含み得る。該エアロゾル製剤の投与は、１日１回でも１日数回、例えば、１日２、３、４、または８回でもよく、その場合、１、２、または３用量が各時点で送達される。
吸入投与のために適切な及び／または適合されたいくつかの剤形の場合、該医薬製剤は、乾燥粉末吸入可能製剤である。本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上、補助活性成分、及び／またはその医薬的に許容される塩に加えて、かかる剤形は、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトール、及び／またはデンプン等の粉末基材を含み得る。これらの実施形態の一部では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、粒子サイズ減少形態である。さらなる実施形態では、性能改良剤、例えば、Ｌ－ロイシンまたは別のアミノ酸、セロビオースオクタアセテート、及び／またはステアリン酸の金属塩、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム。
いくつかの実施形態では、該エアロゾル剤形は、各々の計量用量のエアロゾルが、既定量の活性成分、例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上の１つ以上を含むように構成され得る。
膣投与用に適合された剤形は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供され得る。直腸投与用に適合された剤形としては、座剤または浣腸が挙げられる。
非経口投与用に適合された及び／または任意のタイプの注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、骨内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿体内、歯肉、歯肉縁下、髄腔内、硝子体内、脳内、及び脳室内）用に適合された剤形は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、当該組成物を対象の血液と等張にする溶質を含み得る水性及び／または非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含み得る。非経口投与用に適合された剤形は、密閉アンプルまたはバイアルを含むがこれらに限定されない単回単位用量または複数単位用量容器で提供され得る。該用量は、凍結乾燥され、滅菌担体に再懸濁されて、投与前に用量が再構成され得る。即席注射溶液及び懸濁液は、いくつかの実施形態では、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
眼投与用に適合された剤形としては、任意に注射のために適応され得る水性及び／または非水性滅菌溶液であって、任意に抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、当該組成物を眼またはそれに含まれるまたは対象の眼の周りの液体と等張にする溶質を含み得るもの、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を挙げることができる。
いくつかの実施形態では、該剤形は、単位用量あたり既定量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。そのため、いくつかの実施形態では、かかる単位用量の既定量は、１日１回または複数回投与され得る。かかる医薬製剤は、当技術分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。
キット
同様に本明細書に記載するのは、１つ以上の本明細書に記載の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または他の成分及びそれらの組み合わせ、及び本明細書に記載の医薬製剤のうちの１つ以上を含むキットである。実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上は、組み合わせキットとして提供され得る。本明細書で使用される、用語「組み合わせキット」または「成分のキット」とは、要素の組み合わせまたはそこに含まれる活性成分等の単一の要素を包装、スクリーニング、試験、販売、上市、送達、及び／または投与するために使用される化合物、または製剤及びさらなる成分を指す。かかるさらなる成分としては、包装、シリンジ、ブリスターパッケージ、ボトル等が挙げられるがこれらに限定されない。該組み合わせキットは、１つ以上の該成分（例えば、該１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上）を含むことができるか、またはそれらの製剤は、単一の製剤（例えば、液体、凍結乾燥粉末等）で提供される場合もあれば、別々の製剤で提供される場合もある。該別々の成分または製剤は、該キット内の単一のパッケージに含まれる場合もあれば、別々のパッケージに含まれる場合もある。該キットにはまた、そこに含まれる成分及び／または製剤の含有量に関する情報及び／または指示、そこに含まれる成分（複数可）及び／または製剤（複数可）の含有量に関する安全性情報、そこに含まれる成分（複数可）及び／または製剤についての量、投薬量、使用の適応、スクリーニング方法、成分デザイン勧告及び／または情報、推奨治療計画（複数可）に関する情報を含み得る有形的表示媒体の指示書が含まれ得る。本明細書で使用される、「有形的表示媒体」とは、物理的に有形であり、またはアクセス可能であり、単なる抽象的思考または記録されていない話し言葉ではない媒体を指す。「有形的表示媒体」としては、セルロースまたはプラスチック材料上の文字、または適切なコンピュータ可読メモリ形態で記憶されたデータが挙げられるがこれらに限定されない。該データは、例えば、フラッシュメモリドライブもしくはＣＤ－ＲＯＭ等の単位素子にまたは、例えば、ウェブインタフェースを介してユーザによってアクセスされ得るサーバに記憶され得る。
１つの実施形態では、本発明は、１つ以上の本明細書に記載の成分を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、該キットは、ベクター系及び該キットを使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、該ベクター系は、１つ以上の操作されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書の他の箇所に記載の筋特異的標的化部分を含むものに作動可能に連結された制御要素及び、任意に制御要素に作動可能に連結され得るカーゴ分子を任意に含む。該１つ以上の操作されたポリヌクレオチド、例えば、本明細書の他の箇所に記載の筋特異的標的化部分を含むものは、該キット内のカーゴ分子を含む実施形態において該カーゴ分子と同じまたは異なるベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、該キットは、ベクター系及び該キットを使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、該ベクター系は、（ａ）ダイレクトリピート配列及び該ダイレクトリピート配列の上流または下流（適用され得るいずれか）の１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位に作動可能に連結された第一の制御要素、ここで、該ガイド配列は、発現されると、真核細胞において標的配列へのＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、該Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体は、該ガイド配列と複合体を形成するＣａｓ９酵素を含み、該ガイド配列は、該標的配列にハイブリダイズされるもの、及び／または（ｂ）かかるＣａｓ９酵素をコードする酵素コーディング配列に作動可能に連結され、核局在配列を含む第二の制御要素を含む。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列もまた提供され得る。いくつかの実施形態では、該キットは、該系の同じまたは異なるベクターに配置された成分（ａ）及び（ｂ）を含む。いくつかの実施形態では、成分（ａ）はさらに、該第一の制御要素に作動可能に連結された２つ以上のガイド配列を含み、ここで、該２つ以上のガイド配列の各々は、発現されると、真核細胞において異なる標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示する。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、真核細胞の核における検出可能な量のかかるＣＲＩＳＰＲ酵素の積蓄を促進するために十分な強度の１つ以上の核局在配列を含む。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ系酵素である。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、該Ｃａｓ９酵素は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ１、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ Ｃａｓ９（例えば、少なくとも１つのＤＤを有するようにまたはそれに関連するように修飾される）に由来し、Ｃａｓ９のさらなる改変または変異を含んでもよく、キメラＣａｓ９であることも可能である。いくつかの実施形態では、該ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、該ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、該標的配列の位置で１本または２本の鎖の切断を指示する。いくつかの実施形態では、該ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖切断活性を欠き、または実質的に欠く（例えば、野生型酵素またはヌクレアーゼ活性を低下させる変異または変化を有さない酵素と比較して５％以下のヌクレアーゼ活性）。いくつかの実施形態では、該第一の制御要素は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該第二の制御要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、該ガイド配列は、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１６～３０、または１６～２５、または１６～２０ヌクレオチド長である。
使用方法
一般的論述
１つ以上の該筋特異的標的化部分、操作されたＡＡＶのカプシド系ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター（複数可）、操作された細胞、操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含む組成物は一般に、１つ以上のカーゴをパッケージするため及び／またはレシピエント細胞に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、送達は、該標的化部分の特異性に基づいて細胞特異的に行われる。いくつかの実施形態では、これは、本明細書の他の箇所に記載されている１つまたはｎ量体モチーフの包含によって少なくとも部分的に影響を受け得る、操作されたＡＡＶのカプシドの指向性によって付与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の該筋特異的標的化部分、操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含む組成物は、対象もしくは細胞、組織、及び／または器官に投与することができ、当該レシピエント細胞への該カーゴの移行及び／または組み込みを促進し得る。他の実施形態では、１つ以上の該筋特異的標的化部分を含む、ポリペプチド及び他の粒子（例えば、操作されたＡＡＶのカプシド及びウイルス粒子）等の組成物を産生することが可能な操作された細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、及びベクター系等から生成され得る。これは、限定されないが、該操作されたＡＡＶのカプシド系分子（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、及びベクター系等）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の該筋特異的標的化部分を含む、ポリペプチド及び他の粒子（例えば、操作されたＡＡＶのカプシド及びウイルス粒子）等の組成物を生成することが可能な本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、及びベクター系等は、インビボ、エキソビボ、またはインビトロにおいて、細胞または組織に送達され得る。いくつかの実施形態では、対象に送達された際に、該組成物は、インビボまたはエキソビボで対象の細胞を形質転換して、１つ以上の本明細書に記載の筋特異的標的化部分を含む本明細書に記載の組成物を作製することが可能であり得る操作された細胞を産生することができ、これに含まれるのは、限定されないが、該操作されたＡＡＶのカプシド粒子であり、これは、該操作された細胞から放出され、カーゴ分子（複数可）をインビボでレシピエント細胞に送達することができるか、または該レシピエント細胞が得られる対象に再導入するためのパーソナライズされた操作された組成物（例えば、ＡＡＶのカプシド粒子）を産生することができる。
いくつかの実施形態では、操作された細胞は、対象に送達することができ、そこで、それが産生された本発明の組成物（限定されないが、操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含む）を放出することができ、それらが次いでカーゴ（例えば、カーゴポリヌクレオチド（複数可））をレシピエント細胞に送達し得る。これらの一般的なプロセスを様々な方法で使用して、対象において疾患またはその症状を治療及び／または予防すること、モデル細胞を生成すること、修飾された生物を生成すること、細胞選択及びスクリーニングアッセイを提供することが生物学的生産、及び他の様々な用途で可能である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の該筋特異的標的化部分を含むポリペプチド及び他の粒子（例えば、操作されたＡＡＶのカプシド及びウイルス粒子）等の組成物は、対象もしくは細胞、組織、及び／または器官に送達され得る。このようにして、それらを使用して、それらが含み得るまたは関連する任意のカーゴを筋細胞に送達することができる。
いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及びその系は、操作されたＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成するために使用することができ、所望の細胞特異性を有するバリアントがそこから採掘され得る。様々な実施例によって裏付けられる本明細書に提供する説明は、所望の細胞特異性を念頭に置いている者が、本明細書に記載の本発明を利用して、該所望の細胞特異性を有するカプシドを得ることができることを実証し得る。
本対象発明は、結果またはデータの送信がある研究プログラムの一部として使用され得る。コンピュータシステム（またはデジタルデバイス）は、結果を受信し、送信し、表示し、及び／または記憶するために、データ及び／または結果を分析するために、及び／または結果及び／またはデータ及び／または分析の報告書を生成するために使用され得る。コンピュータシステムは、固定媒体を有するサーバに任意に接続され得る媒体（例えば、ソフトウェア）及び／またはネットワークポート（例えば、インターネットから）からの命令を読み取り得ることができる論理装置として理解され得る。コンピュータシステムは、ＣＰＵ、ディスクドライブ、入力デバイス、例えば、キーボード及び／またはマウス、及びディスプレイ（例えば、モニター）の１つ以上を含み得る。指示書または報告書の送信等のデータ通信は、ローカルまたは遠隔地におけるサーバへ通信媒体を介して達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／または受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続、またはインターネット接続であり得る。かかる接続は、ワールドワイドウェブでの通信を提供し得る。本発明に関するデータは、受理及び／またはレシーバによるレビューのためにかかるネットワークまたは接続（またはプリントアウト等の物理的報告書の郵送を含むがこれらに限定されない、情報を送信するための任意の他の適切な手段）で送信され得ることが想定される。該レシーバは、個人、または電子システム（例えば、１つ以上のコンピュータ、及び／または１つ以上のサーバ）であり得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該コンピュータシステムは、１つ以上のプロセッサを含む。プロセッサは、コンピュータシステムの１つ以上の制御部、計算単位、及び／または他の単位に関連付けられ、または所望によりファームウェアに埋め込まれ得る。ソフトウェアで実行される場合、ルーチンは、任意のコンピュータ可読メモリ、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク、または他の適切な記憶媒体に記憶され得る。同様に、このソフトウェアは、任意の既知の送達方法（例えば、通信チャネル、例えば、電話回線、インターネット、ワイヤレス接続等によるもの、または可搬型媒体、例えば、コンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブ等を介するものを含む）を介して計算装置に送達され得る。様々な工程は、様々なブロック、オペレーション、ツール、モジュール及び技術として実行され得、これらはひいては、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアの任意の組み合わせで実行され得る。ハードウェアで実行される場合、ブロック、オペレーション、技術等の一部またはすべては、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）等で実行され得る。クライアント・サーバ、リレーショナルデータベース構築は、本発明の実施形態において使用され得る。クライアント・サーバ構築は、ネットワーク上の各コンピュータまたはプロセスがクライアントまたはサーバのいずれかであるネットワーク構築である。サーバコンピュータは典型的には、ディスクドライブ（ファイルサーバ）、プリンタ（プリントサーバ）、またはネットワークトラフィック（ネットワークサーバ）を管理するように特化された高性能コンピュータである。クライアントコンピュータには、ユーザがアプリケーションを実行するＰＣ（パーソナルコンピュータ）またはワークステーション、及び本明細書に開示される例示的な出力デバイスが含まれる。クライアントコンピュータは、ファイル、デバイス、及びさらに処理能力等のリソースについてサーバコンピュータに依存する。本発明のいくつかの実施形態では、サーバコンピュータは、データベース機能性のすべてに対処する。クライアントコンピュータは、すべてのフロントエンドデータ管理に対処するソフトウェアを有し得、また、ユーザからのデータ入力を受信し得る。コンピュータ実行可能コードを含む機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的送信媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態を取り得る。不揮発性記憶媒体には、例えば、光学または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（複数可）等における記憶デバイスのいずれか（例えば、図面に示されるデータベース等を実行するために使用され得る）が含まれる。揮発性記憶媒体には、かかるコンピュータプラットフォームのメインメモリ等のダイナミックメモリが含まれる。有形送信媒体には、同軸ケーブル、銅ワイヤ及び光ファイバー（コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む）が含まれる。搬送波送信媒体は、電気もしくは電磁信号、または音波もしくは光波、例えば、無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものの形態を取り得る。そのため、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学的媒体、パンチカードペーパーテープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を送る搬送波、かかる搬送波を送るケーブルもしくは回線、またはコンピュータがプログラミングコード及び／またはデータを読み込み得る任意の他の媒体が含まれる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行用プロセッサに運ぶのに関与し得る。したがって、本発明は、本明細書で論じられる任意の方法を実施すること、及びそれに由来するデータ及び／または結果及び／またはその分析を記憶及び／または送信すること、ならびに中間体を含む、本明細書で論じられる任意の方法を実施することに由来する生成物を包含する。
治療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド粒子、操作された細胞、及び／またはそれらの製剤が挙げられるがこれらに限定されない本明細書に記載の筋特異的標的化部分のうちの１つ以上を含む組成物は、１つ以上の疾患のための治療としてそれを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、治療される疾患は、遺伝子またはエピジェネティックベースの疾患である。いくつかの実施形態では、治療される疾患は、遺伝子またはエピジェネティックベースの疾患ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド粒子、操作された細胞、及び／またはそれらの製剤が挙げられるがこれらに限定されない本明細書に記載の筋特異的標的化部分のうちの１つ以上を含む組成物は、疾患の治療または予防（または治療または予防の一部）としてそれを必要とする対象に送達され得る。本発明の組成物、製剤、細胞等の送達によって治療及び／または予防される特定の疾患は、本発明の組成物、製剤、細胞等に連結された、それに結合した、それに含まれる、または他の方法で関連しているカーゴに依存し得ることが理解されよう。
治療され得る遺伝子疾患は、本明細書の他の箇所でより詳細に論じられている（例えば、以下の遺伝子組み換えベースの療法に関する論述参照）。他の疾患としては、以下のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない：がん、アシネトバクター感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ、アメーバ症、アナプラズマ病、住血線虫症、アニサキス症、炭疽病、Ａｃｒａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ感染症、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、バベシア症、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、バルトネラ症、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ感染症、ＢＫウイルス感染症、黒色砂毛、芽細胞増加症（Ｂｌａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ブラストミセス症、ボリビア出血熱、ボツリヌス中毒症、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺ペスト、バークホルデリア感染症、ブルーリ潰瘍、カリシウイルス感染症、カンピロバクター感染症、カンジダ症、毛頭虫症、カリオン病、猫ひっかき疾患、蜂窩織炎、シャーガス病、軟性下疳、水痘、チクングンヤ熱、クラミジア感染症、クラミジア肺炎、コレラ、クロモブラストミコーシス、ツボカビ症、肝吸虫症、クロストリジウムディフィシル大腸炎、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱、ライノウイルス／コロナウイルス感染症（一般的な風邪）、クロイツフェルト・ヤコブ病、クリミア・コンゴ出血熱、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）、サイクロスポラ症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、デスモデスムス感染症、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジナ虫症、エボラ、エキノコックス症、エーリキア症、蟯虫症、エンテロコッカス感染症、エンテロウイルス感染症、流行性発疹チフス、伝染性紅斑、突発性発疹、肝蛭症、肥大吸虫症、致死性家族性不眠症、フィラリア症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ感染症、フソバクテリウム感染症、ガス壊疽（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、ジオトリクム症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ランブル鞭毛虫症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径部肉芽腫、Ａ群レンサ球菌感染症、Ｂ群レンサ球菌感染症、インフルエンザ菌感染症、手足口病、ハンタウイルス肺症候群、ハートランドウイルス疾患、ヘリコバクターピロリ感染症、腎臓症候群を伴う出血熱、ヘンドラウイルス感染症、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅすべての群）、単純ヘルペス、ヒストプラスマ症、鉤虫感染症、ヒトボカウイルス感染症、ヒトエウィンギ（ｅｗｉｎｇｉｉ）エールリヒア症、ヒト顆粒球アナプラズマ病、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒト単球性エールリヒア症、ヒトパピローマウイルス、膜様条虫症、エプスタイン・バー感染症、単核球症、インフルエンザ、イソスポラ症、川崎病、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ感染症、クールー病、ラッサ熱、レジオネラ症（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）（レジオネラ症（Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ ｄｉｓｅａｓｅ）及びポトマック熱）、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ管フィラリア症、リンパ球性脈絡髄膜炎、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、中東呼吸器症候群、類鼻疽、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、メタゴニムス症、微胞子虫症、伝染性軟属腫、サル痘、おたふく風邪、発疹熱、マイコプラズマ肺炎、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ感染症、菌腫、ハエうじ症、結膜炎、ニパウイルス感染症、ノロウイルス、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ノカルジア症、オンコセルカ症、オピストルキス症、パラコクシジオイデス症、肺吸虫症、パスツレラ病、頭虱、コロモジラミ寄生症、ケジラミ寄生症、骨盤内炎症性疾患、百日咳、ペスト、肺炎球菌感染症、ニューモシスチス肺炎、肺炎、急性灰白髄炎、プレボテラ感染症、原発性アメーバ髄膜脳炎、進行性多巣性白質脳症、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、回帰熱、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ライノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア痘症、リフトバレー熱、ロッキー山紅斑熱、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、ＳＡＲＳ、疥癬、猩紅熱、住血吸虫症、敗血症、細菌性赤痢、帯状疱疹、天然痘、スポロトリクム症、ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡを含む）、糞線虫症、亜急性硬化性汎脳炎、梅毒、条虫症、破傷風、白癬菌属種感染症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、トラコーマ、旋毛虫病（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）、旋毛虫病（Ｔｒｉｃｈｉｎｉａｓｉｓ）、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ感染症、渓谷熱、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、ビブリオ属種感染症、ウイルス性肺炎、ウエストナイル発熱、白色砂毛、エルシニアシュードツベルクローシス、エルシニア症、黄熱病、ゼアスポラ（Ｚｅａｓｐｏｒａ）、ジカ熱、接合菌症及びそれらの組み合わせ。
本発明の実施形態を使用して治療され得る他の疾患及び障害としては、内分泌疾患（例えば、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、低血糖、グルカゴノーマ、甲状腺腫、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺炎、甲状腺癌、甲状腺ホルモン抵抗性、副甲状腺障害、骨粗鬆症、変形性骨炎、くる病、骨軟化症、下垂体機能低下症、下垂体腫瘍等）、感染症及び非感染性起源の皮膚病態、感染性または非感染性起源の眼疾患、感染性または非感染性起源の胃腸障害、感染性または非感染性起源の心臓血管疾患、感染性または非感染性起源の脳及びニューロン疾患、感染性または非感染性起源の神経系疾患、感染性または非感染性起源の筋疾患、感染性または非感染性起源の骨疾患、感染性または非感染性起源の生殖器系疾患、感染性または非感染性起源の腎臓系疾患、感染性または非感染性起源の血液疾患、感染性または非感染性起源のリンパ系疾患、感染性または非感染性起源の免疫系疾患、感染性または非感染性起源の精神疾病等が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、該治療される疾患は、筋肉または筋肉関連疾患または障害、例えば、遺伝性筋疾患または障害である。
他の疾患及び障害は、当業者には理解されよう。
養子細胞療法
一般的に言えば、養子細胞移植は、細胞（自己、同種、及び／または異種）の対象への移植を含む。該細胞は、該対象への送達の前に修飾及び／または他の方法で操作される場合もあれば、されない場合もある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、養子細胞移植療法に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作された細胞は、それを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、該細胞は、対象から単離され、本明細書に記載の本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む本発明の組成物（操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含むがこれに限定されない）を含むように、及び／またはそれを生成することが可能となるようにインビトロで操作されて操作された細胞が生成され、自己様式で対象にまたは同種もしくは異種様式で異なる対象に戻るように送達され得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、真核細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、幹細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、分化した細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、免疫細胞、血球、内分泌細胞、腎臓細胞、外分泌腺細胞、神経系細胞、血管細胞、筋肉細胞、泌尿器系細胞、骨細胞、軟部組織細胞、心臓細胞、ニューロン、または外皮系細胞であり得る。他の特定の細胞型は、当業者にはすぐに理解されよう。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、本明細書の他の箇所に記載されている操作された細胞となる（例えば、本明細書の他の箇所に記載されている１つ以上の操作された送達系分子またはベクターを含む及び／または発現する）ように操作され得る。かかる操作された細胞を作製する方法は、本明細書の他の箇所でより詳細に記載されている。
本発明による該細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋込または移植によるものを含む、任意の好都合な様式で行われ得る。該細胞または細胞集団は、患者に対して皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に投与され得る。１つの実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
該細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇあたり、当該範囲内のすべての細胞数の整数値を含めた１０４～１０９細胞の投与であり得るか、またはそれを伴い得る。いくつかの実施形態では、１０５～１０６細胞／ｋｇが送達される。養子細胞療法における投薬は、例えば、シクロホスファミドでのリンパ球枯渇の過程を伴ってまたは伴わずに、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与を伴い得る。該細胞または細胞集団は、１回以上投与され得る。別の実施形態では、該細胞の有効量は、単回投与として投与される。別の実施形態では、該細胞の有効量は、ある期間にわたって複数回投与として投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断の範囲内であり、患者の臨床的状態に依存する。該細胞または細胞集団は、任意の供給源、例えば、血液バンクまたはドナーから得てもよい。個々の必要性は異なるが、特定の疾患または病態のための所与の細胞型の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の技術の範囲内である。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態及び体重、存在する場合は同時治療の種類、治療の頻度及び所望の効果の性質に依存する。
別の実施形態では、細胞またはそれらの細胞を含む組成物の有効量は、非経口的に投与される。該投与は、静脈内投与であり得る。該投与は、組織内の注射によって直接的に行われ得る。いくつかの実施形態では、該組織は、腫瘍であり得る。
可能性のある有害な反応に対して防御するために、操作された細胞は、該細胞が特定のシグナルへの曝露に対して脆弱となる導入遺伝子の形態で、導入遺伝子安全スイッチを備え得る。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、例えば、Ｇｒｅｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６：９５で論じられているものと類似するように該操作された細胞への導入によってこのように使用され得る。かかる細胞では、ガンシクロビルまたはアシクロビル等のヌクレオシドプロドラッグの投与は、細胞死を引き起こす。代替的な安全スイッチ構築物には、例えば、２つの非機能性ｉｃａｓｐ９分子を一緒にして活性酵素を形成する小分子二量体化剤の投与によって引き起こされる誘導性カスパーゼ９が含まれる。細胞増殖制御を実行する多様な代替的アプローチが記載されている（米国特許公開第２０１３００７１４１４号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１１１４６８６２号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１４０１１９８７号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１３０４０３７１号、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，２０１４，１２３／２５：３８９５－３９０５、Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１６７３－１６８３、Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１７３５－１７３、Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８（６）：１１０７－１５（２０１０）参照）。
単離された細胞を修飾して所望の特性を有する操作された細胞を得るための方法は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、該方法は、該細胞を修飾するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用するゲノム編集が挙げられるがこれに限定されないゲノム修飾を含み得る。これは、本明細書の他の箇所に記載されている操作されたＡＡＶのカプシド系分子の導入に加わるものであり得る。
同種細胞は、宿主免疫系によって急速に拒絶される。未照射血液製剤に存在する同種白血球は、５～６日しか存続しないことが実証された（Ｂｏｎｉ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｌｏｏｄ １；１１２（１２）：４７４６－５４）。したがって、同種細胞の拒絶を防止するために、宿主の免疫系は通常、ある程度抑制されなければならない。しかしながら、養子細胞移植の場合、免疫抑制薬の使用はまた、本明細書に記載の操作された細胞等の導入された治療用細胞に対する有害効果を有する。そのため、これらの条件において養子免疫療法アプローチを効果的に使用するために、導入された細胞は、免疫抑制治療に対して抵抗性であることを必要とするであろう。よって、特定の実施形態では、本発明は、好ましくは免疫抑制剤の標的をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活化することによって、操作された細胞を修飾して免疫抑制剤に対して抵抗性とする工程をさらに含む。免疫抑制剤は、いくつかの作用機序の１つによって免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン－２受容体α－鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫抑制性代謝拮抗剤であり得るがこれらに限定されない。本発明は、操作された細胞における免疫抑制剤の標的を不活化することによって養子細胞療法のための操作された細胞に免疫抑制抵抗性を付与することが可能である。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーであり得る。
免疫チェックポイントは、免疫反応を遅延または停止させ、免疫細胞の制御不能な活動から過剰な組織損傷を防止する阻害経路である。ある特定の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、プログラム死－１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）である。追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲ等のＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーである。さらに追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＩＭ－３等のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。
さらなる免疫チェックポイントには、Ｓｒｃ相同性２ドメインを含むタンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）が含まれる（Ｗａｔｓｏｎ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．，ＳＨＰ－１：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１６ Ａｐｒ １５；４４（２）：３５６－６２）。ＳＨＰ－１は、広く発現する阻害性タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。Ｔ細胞において、それは、抗原依存性活性化及び増殖の負の制御因子である。それは細胞質タンパク質であるため、抗体媒介療法に適さないが、活性化及び増殖におけるその役割により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞等の養子移植戦略における遺伝子操作の魅力的な標的となる。免疫チェックポイントにはまた、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ／Ｖｓｔｍ３／ＷＵＣＡＭ／ＶＳＩＧ９）及びＶＩＳＴＡ（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｅｙｏｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１，ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｚ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１８）が含まれ得る。
ＷＯ２０１４１７２６０６は、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／または活性を増加させるため及びＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を減少させる（例えば、機能的に疲弊したまたは未反応性のＣＤ８＋免疫細胞を減少させる）ためのＭＴ１及び／またはＭＴ１阻害剤の使用に関する。ある特定の実施形態では、メタロチオネインは、養子移植Ｔ細胞において遺伝子編集によって標的化される。
ある特定の実施形態では、遺伝子編集の標的は、免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する少なくとも１つの標的とされた遺伝子座であり得る。かかる標的としては、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＰＤＬ１、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＶＩＳＴＡ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＭＴ１、ＭＴ２、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＨＰ－１またはＴＩＭ－３を挙げることができるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４遺伝子の発現に関与する遺伝子座が標的とされる。いくつかの実施形態では、遺伝子の組み合わせ、例えば、限定されないが、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴが標的とされる。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの遺伝子が編集される。遺伝子の対としては、ＰＤ１及びＴＣＲα、ＰＤ１及びＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲβ、ＬＡＧ３及びＴＣＲα、ＬＡＧ３及びＴＣＲβ、Ｔｉｍ３及びＴＣＲα、Ｔｉｍ３及びＴＣＲβ、ＢＴＬＡ及びＴＣＲα、ＢＴＬＡ及びＴＣＲβ、ＢＹ５５及びＴＣＲα、ＢＹ５５及びＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲα、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲα、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲβ、２Ｂ４及びＴＣＲα、２Ｂ４及びＴＣＲβを挙げることができるがこれらに限定されない。
該操作された細胞（操作されたＴ細胞等（例えば、単離された細胞はＴ細胞である）の遺伝子組み換えまたは他の修飾の前または後にかかわらず、該操作された細胞は、通常、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、及び第７，５７２，６３１号に記載されている方法を使用して活性化すること及び増殖することができる。該操作された細胞は、インビトロまたはインビボで増殖し得る。
いくつかの実施形態では、該方法は、潜在的アロ反応性ＴＣＲまたは他の受容体を排除して同種養子移植を可能とするために、本明細書の他の箇所に記載されている適切な遺伝子組み換え方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介する遺伝子編集）によってエキソビボで操作された細胞を編集することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または他の適切なゲノム修飾技術によってエキソビボで編集されて、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を回避するためにＴＣＲ（例えば、αβＴＣＲ）または他の関連受容体をコードする内因性遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされる。いくつかの実施形態では、該操作された細胞がＴ細胞である場合、該操作された細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子座を変異させるためにＣＲＩＳＰＲまたは他の適切な遺伝子組み換え方法によってエキソビボで編集される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＲＡＣの第一エクソンを標的とする１つ以上のガイド配列を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介してエキソビボで編集される。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５４－１５７（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの第一エクソンは、別の適切な遺伝子組み換え方法を使用して修飾される。いくつかの実施形態では、該方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外因性遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子座にノックインすると同時に、内因性ＴＣＲ（例えば、ＣＡＲ ｃＤＮＡの後に自己切断型Ｐ２Ａペプチドをコードするドナー配列を有する）をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲまたは他の適切な方法の使用を含む。Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、該外因性遺伝子は、内因性ＴＣＲプロモーターの下流に作動可能に挿入されるプロモーターを欠くＣＡＲのコーディング配列またはＴＣＲのコーディング配列を含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、該操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞をエキソビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介して編集して、ＨＬＡ－Ｉタンパク質をコードする内因性遺伝子をノックアウトまたはノックダウンし、該編集された細胞、例えば、操作されたＴ細胞の免疫原性を最小化することを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座を変異させるためにエキソビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介して編集され得る。いくつかの実施形態では、操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞は、Ｂ２Ｍの第一エクソンを標的とする１つ以上のガイド配列を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介してエキソビボで編集される。Ｂ２Ｍの第一エクソンはまた、別の適切な修飾方法を使用して修飾され得る。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５４－１５７（２０１７）を参照されたい。Ｂ２Ｍの第一エクソンはまた、当業者によって理解される別の適切な修飾方法を使用して修飾され得る。いくつかの実施形態では、該方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外因性遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座にノックインすると同時に、内因性Ｂ２Ｍ（例えば、ＣＡＲ ｃＤＮＡの後に自己切断型Ｐ２Ａペプチドをコードするドナー配列を有する）をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の使用を含む。Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）を参照されたい。これはまた、当業者によって理解される別の適切な修飾方法を使用しても達成され得る。いくつかの実施形態では、該外因性遺伝子は、内因性Ｂ２Ｍプロモーターの下流に作動可能に挿入されるプロモーターを欠くＣＡＲのコーディング配列またはＴＣＲのコーディング配列を含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、該操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞をエキソビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介して編集して、外因性ＣＡＲまたはＴＣＲによって標的とされる抗原をコードする内因性遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。これはまた、当業者によって理解される別の適切な修飾方法を使用しても達成され得る。いくつかの実施形態では、該操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞は、エキソビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介して編集されて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、スルビビン、マウスダブルミニッツ２ホモログ（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ １（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、リビン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３またはサイクリン（ＤＩ）（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６／０１１２１０号参照）から選択される腫瘍抗原の発現がノックアウトまたはノックダウンされる。これはまた、当業者によって理解される別の適切な修飾方法を使用しても達成され得る。いくつかの実施形態では、該操作された細胞、例えば、操作されたＴ細胞は、エキソビボでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を介して編集され、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）、またはＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＳ－１、ＣＤ３３、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ５３、ＣＤ９２、ＣＤ１００、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２００、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、またはＣＤ３６２（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／０１１８０４号参照）から選択される抗原の発現がノックアウトまたはノックダウンされる。これはまた、当業者によって理解される別の適切な修飾方法を使用しても達成され得る。
遺伝子ドライブ
本発明はまた、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドの送達を介して遺伝子ドライブを発生させるための本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物、その製剤、その細胞、ベクター系等の使用または遺伝子ドライブを発生させることが可能な１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを有する本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物（操作されたＡＡＶのカプシド粒子を含むがこれに限定されない）の生成を企図する。いくつかの実施形態では、該遺伝子ドライブは、Ｃａｓ媒介ＲＮＡガイド遺伝子ドライブ、例えば、Ｃａｓ提供ＲＮＡガイド遺伝子ドライブ、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１０５９２８号に記載の遺伝子ドライブに類似する系におけるものであり得る。この種の系は、例えば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を生殖系列細胞に導入することによって真核生殖系列細胞を変化させるための方法を提供し得る。該ガイドＲＮＡは、該生殖系列細胞のゲノムＤＮＡ上の１つ以上の標的位置と相補的となるようにデザインされ得る。該ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸配列及び該ガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、構築物上でフランキング配列の間に提供されてもよく、プロモーターは、該生殖系列細胞が該ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ及び該ガイドＲＮＡを発現し得るように配置され、任意の所望のカーゴのコーディング配列も該フランキング配列の間に位置する。該フランキング配列は典型的には、選択された標的染色体上の対応する配列と同一の配列を含むため、該フランキング配列は、該構築物によってコードされる成分とともに作用し、相同組み換え等のメカニズムによって標的切断部位でゲノムＤＮＡへの該外来核酸構築物配列の挿入を促進し、該生殖系列細胞を該外来核酸配列に対してホモ接合型にする。このように、遺伝子ドライブ系は、繁殖集団を通して所望のカーゴ遺伝子を遺伝子移入することが可能である（例えば、Ｇａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ，ＰＮＡＳ ２０１５，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２３，２０１５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２１０７７１１２；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｅＬｉｆｅ ２０１４；３：ｅ０３４０１参照）。選ばれた実施形態では、ゲノムにおける潜在的オフターゲット部位がほとんどない標的配列が選択され得る。複数のガイドＲＮＡを使用して標的遺伝子座内の複数の部位を標的とすることは、切断頻度を増加させ、ドライブ耐性アレルの進化を妨げ得る。切断型ガイドＲＮＡは、オフターゲット切断を減少させ得る。対合したニッカーゼは、特異性をさらに増加させるために単一のヌクレアーゼの代わりに使用され得る。遺伝子ドライブ構築物（遺伝子ドライブ修飾送達系構築物等）は、例えば、相同組み換え遺伝子を活性化するために及び／または非相同末端結合を抑制するために、転写制御因子をコードするカーゴ配列を含み得る。標的部位は、必須の遺伝子内から選択してもよく、これにより非相同末端結合事象は、ドライブ耐性アレルを生成するのではなく、致死性を引き起こし得る。該遺伝子ドライブ構築物は、様々な温度で様々な宿主において機能するように操作され得る（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（８）：ｅ７２３９３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７２３９３）。
移植及び異種移植
本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物、その製剤、その細胞、ベクター系等は、カーゴポリヌクレオチドを送達するために使用すること、及び／または他の方法で異なる２人の間（移植）または種間（異種移植）の移植のための組織の修飾に関与させることができる。トランスジェニック動物の生成のためのかかる技術は、本明細書の他の箇所に記載されている。種間移植技術は当技術分野で一般に知られている。例えば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチド、ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子を介して使用して送達することができ、例えば、ヒトの免疫系によって認識されるエピトープをコードする遺伝子、すなわち、異種抗原遺伝子の発現を破壊することによって、移植（例えば、エキソビボ（例えば、採取後移植前）またはインビボ（ドナーもしくはレシピエント内）での）のための器官、動物、例えば、トランスジェニックブタ（ヒトヘムオキシゲナーゼ－１トランスジェニックブタ系統等）における選択された遺伝子をノックアウト、ノックダウンまたは破壊するために使用され得る。破壊のためのブタ遺伝子候補には、例えば、α（ｌ，３）－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシチジンモノホスフェート－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１４／０６６５０５号参照）が含まれ得る。また、内因性レトロウイルスをコードする遺伝子、例えば、すべてのブタ内因性レトロウイルスをコードする遺伝子が破壊され得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＰＥＲＶｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５：Ｖｏｌ．３５０ ｎｏ．６２６４ ｐｐ．１１０１－１１０４参照）。また、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、超急性拒絶反応に対する保護を改善するためにヒトＣＤ５５遺伝子等の異種移植ドナー動物におけるさらなる遺伝子の組み込みのための部位を標的とするために使用され得る。
種間移植（ヒトからヒト等）の場合、本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物、または筋特異的標的化部分を含む組成物（例えば、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または操作された送達粒子）は、カーゴポリヌクレオチドを送達するために使用すること、及び／または他の方法で移植される組織を修飾するために関与させることができる。いくつかの実施形態では、該修飾は、免疫原性プロファイルが、レシピエントによる拒絶反応の発生を減少させるようにドナーのものよりもレシピエントの免疫原性プロファイルと類似するまたは同一となるように、１つ以上のＨＬＡ抗原または他の組織型決定基を修飾することを含み得る。関連する組織型決定基は、当技術分野で知られており（器官適合性を決定するために使用されるもの等）、免疫原性プロファイル（組織型決定基の発現シグネチャから構成される）を決定するための技術は当技術分野で一般に知られている。
いくつかの実施形態では、ドナー（例えば、採取前）またはレシピエント（移植後）は、移植された細胞、組織、及び／または器官の免疫原性プロファイルを修飾することが可能な本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物、その製剤、その細胞、ベクター系、操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または本明細書に記載の操作された送達粒子のうちの１つ以上を投与され得る。いくつかの実施形態では、該移植された細胞、組織、及び／または器官は、ドナーから採取することができ、例えば、免疫原性が低下するようにまたはレシピエントに移植された場合にいくらかの特定の特性を有するように修飾されるように採取された細胞、組織、及び／または器官を修飾することが可能な本明細書に記載の本明細書の他の箇所に記載されている筋特異的標的化部分を含む組成物、その製剤、その細胞、ベクター系、操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または本明細書に記載の操作された送達粒子が、採取された細胞、組織、及び／または器官にエキソビボで送達され得る。送達後、該細胞、組織、及び／または器官は、ドナーに移植され得る。
遺伝子的またはエピジェネティックな態様での疾患の遺伝子組み換え及び治療
筋特異的標的化部分を含む本明細書に記載の操作された送達系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または操作された送達粒子は、遺伝子的及び／またはエピジェネティックな態様を用いて遺伝子または他のポリヌクレオチドを修飾するために及び／または疾患を治療するために使用され得る。本明細書の他の箇所に記載されているように、該カーゴ分子は、ポリヌクレオチドであることができ、これを細胞に送達することができ、いくつかの実施形態では、細胞のゲノムに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、該カーゴ分子（複数可）は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系成分であり得る。いくつかの実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分は、本発明の組成物またはその製剤、例えば、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド粒子によって送達される場合、任意にレシピエント細胞で発現し、配列特異的にレシピエント細胞のゲノムを修飾するように作用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド粒子もしくは他の粒子及び／または組成物にパッケージングされ、それによって送達され得るカーゴ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓに依存しない方法を介してゲノム修飾を促進／媒介し得る。かかる非ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム修飾系は、当業者には即座に理解され、また、本明細書の他の箇所に少なくとも部分的に記載されている。いくつかの実施形態では、修飾は、特定の標的配列におけるものである。他の実施形態では、修飾は、ゲノム全体を通してランダムに見える位置におけるものである。
疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例ならびに疾患に特異的な情報は、ワールドワイドウェブで利用可能なＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から利用可能である。これらのいずれかは、本明細書に記載の方法の１つ以上によって治療されることが適切であり得る。いくつかの実施形態では、該疾患は、筋肉の疾患もしくは障害、神経筋疾患もしくは障害、または心筋症である。いくつかの実施形態では、該疾患または障害は、以下のうちの任意の１つ以上から選択される：
（ａ）自己免疫疾患、
（ｂ）がん、
（ｃ）筋ジストロフィー、
（ｄ）神経筋疾患、
（ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症、
（ｆ）伸長リピート病、
（ｇ）ドミナントネガティブ疾患、
（ｈ）心筋症、
（ｉ）ウイルス性疾患、
（ｊ）早老性疾患、または
（ｋ）それらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、該伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの実施形態では、該筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。いくつかの実施形態では、該筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。いくつかの実施形態では、該心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。いくつかの実施形態では、該糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。いくつかの実施形態では、該ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。いくつかの実施形態では、該神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
より具体的には、これらの遺伝子及び経路における変異は、不適切なタンパク質または機能に影響を及ぼす不適切な量のタンパク質の生成をもたらし得る。遺伝子、疾患及びタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／７３６，５２７号から参照により本明細書に組み込まれる。かかる遺伝子、タンパク質及び経路は、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体または他の遺伝子修飾法の標的ポリヌクレオチドであり得る。疾患関連及び／または細胞機能関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例が表４及び５に列挙されている。さらなる例は、本明細書の他の箇所に論じられている。
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したがって、本明細書に同様に記載するのは、本明細書で論じられる真核細胞または原核細胞において（インビトロで、すなわち、単離された真核細胞において）１つ以上の変異を誘導する方法であり、本明細書に記載のベクターを細胞に送達することを含む。該変異（複数可）は、細胞（複数可）の標的配列での１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での１～７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。該変異は、各標的配列での１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む。該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。該変異は、かかる細胞（複数可）の各標的配列での５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、または９９００～１００００ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、該修飾は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって媒介されるもの等の核酸成分（例えば、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可））を介したかかる細胞（複数可）の各標的配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、該修飾は、非ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系または技術を介したかかる細胞（複数可）の標的またはランダム配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。かかる技術は、操作された細胞ならびに該操作された細胞及び生物を生成する方法が論じられている場所等の本明細書の他の箇所で論じられている。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を使用する場合の毒性及びオフターゲット効果を最小化するために、送達されるＣａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞または非ヒト真核生物動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、ディープシーケンシングを使用して潜在的オフターゲットゲノム遺伝子座における修飾の程度を分析することによって決定され得る。代替的には、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小化するために、ＣａｓニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９様）が、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対とともに送達され得る。毒性及びオフターゲット効果を最小化するためのガイド配列及び戦略は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／０９３６２２号（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）におけるものであっても本明細書の変異を介するものであってもよい。
通常、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の状況では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列においてまたはその近く（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）で一方または両方の鎖が切断される。理論に拘束されることを望むものではないが、野生型ｔｒａｃｒ配列のすべてまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチド）を含んでもそれからなってもよいｔｒａｃｒ配列はまた、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列のすべてまたは一部へのｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーション等によって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。
１つの実施形態では、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、該方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ分子をカーゴ分子として有する本明細書に記載の操作された細胞及び／または本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド粒子を対象及び／または細胞に送達することを含む。送達されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子（複数可）は、標的ポリヌクレオチドに結合するために複合体を形成して、例えば、かかる標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを修飾することができ、該ＣＲＩＳＰＲ複合体は、かかる標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、かかるガイド配列は、ｔｒａｃｒメイト配列に連結することができ、これは次いでｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、かかる切断は、かかるＣＲＩＳＰＲ酵素によって該標的配列の位置で一本鎖または二本鎖を切断することを含む。いくつかの実施形態では、かかる切断は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組み換えによってかかる切断された標的ポリヌクレオチドを修復することを含み、かかる修復は、かかる標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。いくつかの実施形態では、かかる変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されたタンパク質において１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、１つ以上のベクターをかかる真核細胞に送達することを含み、ここで、１つ以上のベクターは、該ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、１つ以上のベクターは、該ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及び該ｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、かかるＣＲＩＳＰＲ酵素は、該ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及び該ｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、かかるＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象において該真核細胞に送達される。いくつかの実施形態では、かかる修飾は、細胞培養中のかかる真核細胞において行われる。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、かかる修飾の前に対象からかかる真核細胞を単離することを含む。いくつかの実施形態では、該方法はさらに、かかる真核細胞及び／またはそれに由来する細胞をかかる対象に戻すことを含む。いくつかの実施形態では、該単離された細胞は、１つ以上の操作されたＡＡＶのカプシド粒子が該単離された細胞に送達された後に該対象に戻され得る。いくつかの実施形態では、該単離された細胞は、本明細書に記載の操作された送達系の１つ以上の分子を該単離された細胞に送達した後に該対象に戻され、これにより、該単離された細胞を前述の通り操作された細胞にすることができる。
スクリーニング及び細胞選択
本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子は、スクリーニングアッセイ及び／または細胞選択アッセイにおいて使用され得る。該操作された送達系ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子は、対象及び／または細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、該細胞は、真核細胞である。該細胞は、インビトロ、エキソビボ、インサイチュ、またはインビボであり得る。本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子は、外因性分子または化合物を、それらが送達される対象または細胞に導入し得る。細胞及び／またはその属性の同定を可能にし得る外因性分子または化合物の存在を検出することができる。いくつかの実施形態では、該送達された分子または粒子は、遺伝子または他のヌクレオチドの修飾（例えば、変異、遺伝子またはポリヌクレオチドの挿入及び／または削除等）を与えることができる。いくつかの実施形態では、該ヌクレオチドの修飾は、シーケンシングによって細胞において検出され得る。いくつかの実施形態では、該ヌクレオチドの修飾により、該細胞において検出可能な表現型変化をもたらす生理的及び／または生物学的修飾を該細胞にもたらすことができ、これにより、該細胞の検出、同定、及び／または選択が可能になる。いくつかの実施形態、例えば、標的ポリヌクレオチドへのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合が細胞死をもたらす実施形態では、該表現型変化は、細胞死であり得る。本発明の実施形態は、選択マーカーも、対抗選択系を含み得る２段階プロセスも必要とすることなく特定の細胞の選択を可能にする。該細胞（複数可）は、原核細胞でも真核細胞でもよい。
１つの実施形態では、本発明は、１つ以上の細胞における遺伝子において１つ以上の変異を導入することによって１つ以上の細胞を選択する方法を提供し、該方法は、以下を含む：本明細書の他の箇所に記載の１つ以上の操作された送達系分子またはベクターを含み得る１つ以上のベクターを該細胞（複数可）に導入すること、ここで、該１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、及び／または、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、及び編集鋳型のうちの１つ以上の発現を駆動することができるか、または該細胞及び／またはそのゲノムに挿入される他のポリヌクレオチドの発現を駆動することができ、ここで、例えば、該ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／または該編集鋳型によってインビボで発現されるものは、含まれる場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素切断を無効にする１つ以上の変異を含み、該編集鋳型と該細胞（複数可）における標的ポリヌクレオチドとの相同組み換えが選択されるようにし、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、かかる遺伝子内の該標的ポリヌクレオチドの切断を達成し、ここで、該ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）該標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズされるガイド配列、及び（２）該ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、該標的ポリヌクレオチドに対する該ＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導し、それにより１つ以上の変異が導入された１つ以上の細胞が選択されるようになる。好ましい実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓタンパク質である。本発明の別の実施形態では、該選択される細胞は、真核細胞であり得る。
１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を細胞に送達するものが挙げられるがこれらに限定されない、該操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子が関与するスクリーニング方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の検出方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質を含む操作されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の１つ以上の成分は、本明細書の他の箇所に記載されている操作されたＡＡＶのカプシド系分子、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子によって細胞に送達され、ＦＩＳＨ法において使用され得る。該ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、ＤＮＡ二本鎖破断をもたらす能力を欠く不活性化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）（例えば、ｄＣａｓ９）を含むことができ、マーカー、例えば、蛍光タンパク質、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＥＧＦＰ）と融合され、中心周囲の、中心の及びテロメアのリピートをインビボで標的とするために低分子ガイドＲＮＡと共発現され得る。該ｄＣａｓ系は、ヒトゲノムにおける反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化するために使用され得る。標識されたｄＣａｓ、ｄＣａｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、操作されたＡＡＶのカプシド系分子、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子のかかる新たな適用は、特に小核体積または複合３Ｄ構造に関する場合、細胞の画像化及び機能性核構造の研究において使用され得る。（Ｃｈｅｎ Ｂ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＬＡ，Ｃｉｍｉｎｉ ＢＡ，Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｌｉ ＧＷ，Ｐａｒｋ Ｊ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＥＨ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＪＳ，Ｑｉ ＬＳ，Ｈｕａｎｇ Ｂ．２０１３．Ｄｙｎａｍｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １５５（７）：１４７９－９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１．、その教示は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系に適用及び／または適応され得る）。マーカー（例えば、蛍光マーカー）に融合されたポリヌクレオチドを含む同様のアプローチは、本明細書に記載の操作されたＡＡＶのカプシド系分子、ベクター、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子を介して細胞に送達され、細胞のゲノムに組み込まれ、及び／または他の方法でＦＩＳＨ分析のために細胞のゲノムの領域と相互作用し得る。
他の細胞小器官及び他の細胞構造を研究するための同様のアプローチは、該細胞に（例えば、本明細書に記載の操作された送達ＡＡＶのカプシド分子、操作された細胞、及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子を介して）マーカー（例えば、蛍光マーカー）に融合された１つ以上の分子を送達することによって達成することができ、該マーカーに融合された分子は、１つ以上の細胞構造を標的とすることが可能である。マーカーの存在を分析することによって、特定の細胞構造を同定及び／または画像化することができる。
いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシド系分子及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子は、細胞の中または外でのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、該スクリーニングアッセイは、操作されたＡＡＶのカプシド粒子を介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓカーゴ分子（複数可）を送達することを含み得る。
スクリーニングにおける本系の使用はまた、本発明、例えば、機能獲得スクリーニングによって提供される。遺伝子を人工的に過剰発現させた細胞は、例えば、負のフィードバックループによって、徐々に該遺伝子を下方制御することが可能である（均衡状態を取り戻す）。該スクリーニングを開始するまでに、調節されていない遺伝子は、再び減少する可能性がある。他のスクリーニングアッセイは、本明細書の他の箇所に論じられている。
実施形態では、本発明は、インビトロ送達方法に由来するまたはインビトロ送達方法の細胞を提供し、該方法は、該送達系を細胞、任意に、真核細胞と接触させること、それにより、該送達系の構成要素を該細胞に送達すること、及び任意に、該接触からのデータまたは結果を得ること、ならびに該データまたは結果を伝達することを含む。
実施形態では、本発明は、インビトロ送達方法に由来するまたはインビトロ送達方法の細胞を提供し、該方法は、該送達系を細胞、任意に、真核細胞と接触させること、それにより、該送達系の構成要素を該細胞に送達すること、及び任意に、該接触からのデータまたは結果を得ること、ならびに該データまたは結果を伝達することを含み、該細胞産物は、該送達系と接触していない細胞と比較して変化し、例えば、接触がなければ該細胞の野生型であったであろうものから変化する。実施形態では、該細胞産物は、非ヒトまたは動物である。いくつかの実施形態では、該細胞産物は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ以上の本明細書に記載のベクターで一過性にまたは非一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、それが任意に再導入される対象に自然に存在するようにトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、対象から採取される。いくつかの実施形態では、該細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞株から得られるかまたはそれに由来する。該操作されたＡＡＶのカプシド系、操作されたＡＡＶのカプシド粒子の送達メカニズム及び技術は、本明細書の他の箇所に記載されている。
いくつかの実施形態では、該操作されたＡＡＶのカプシド系分子（複数可）及び／または操作されたＡＡＶのカプシド粒子（複数可）を宿主細胞に直接導入することが想定される。例えば、該操作されたＡＡＶのカプシド系分子（複数可）は、操作されたＡＡＶのカプシド粒子にパッケージングされる１つ以上のカーゴ分子とともに送達され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたＧＴＡ粒子にパッケージングされる操作された送達分子及びカーゴ分子を細胞において発現させる方法を提供し、これは、本明細書に開示するベクター送達系のいずれかによるベクターを導入するステップを含み得る。
本発明を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１－ｍＲＮＡベースの検出方法は、ＡＡＶバリアントの選択に対してよりストリンジェントである。
図１は、ｍＲＮＡの産生をもたらすアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入メカニズムを示す。図１に示すように、ＡＡＶ粒子による細胞の機能的形質導入は、ｍＲＮＡ鎖の産生をもたらし得る。非機能的形質導入は、ウイルスゲノムがＤＮＡベースのアッセイを使用して検出可能であるにもかかわらず、かかる産物を産生しない。したがって、例えば、ＡＡＶによる形質導入を検出するためのｍＲＮＡベースの検出アッセイは、よりストリンジェントであり、細胞を機能的に形質導入することができるウイルス粒子の機能性に関するフィードバックを提供し得る。図２は、ＡＡＶバリアントのｍＲＮＡベースの選択がＤＮＡベースの選択よりもストリンジェントであり得ることを実証し得るグラフを示している。このウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。
実施例２－ｍＲＮＡベースの検出方法は、カプシドバリアントライブラリからＡＡＶのカプシドバリアントを検出するために使用され得る
図３Ａ～３Ｂは、肝臓におけるウイルスライブラリとベクターゲノムＤＮＡ（図３Ａ）及びｍＲＮＡ（図３Ｂ）との相関関係を実証し得るグラフを示している。図４Ａ～４Ｆは、異なる組織で同定されたｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。
実施例３－カプシドｍＲＮＡ発現は、組織特異的プロモーターによって駆動され得る
図５Ａ～５Ｃは、細胞型特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現を実証し得るグラフを示している。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。
実施例４－カプシドバリアントライブラリ生成、バリアントスクリーニング、及びバリアント同定
一般に、ＡＡＶのカプシドライブラリは、適切なＡＡＶ産生細胞株において前述の操作されたＡＡＶのカプシドポリヌクレオチドを各々が含む操作されたカプシドベクターを発現させることによって生成され得る。例えば、図８を参照されたい。これは、１つ以上の所望の細胞特異的な操作されたＡＡＶのカプシドバリアントを含み得るＡＡＶのカプシドライブラリを生成し得る。図７は、ＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にランダムｎ量体（ｎ＝３～１５アミノ酸）の野生型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９への挿入を示す概略図を示している。この例では、ランダム７量体をＡＡＶ９ウイルスタンパク質の可変領域ＶＩＩＩのａａ５８８～５８９に挿入し、１ベクターあたり１つのバリアントを有するウイルスゲノム含有ベクターを形成するために使用した。図８に示されているように、カプシドバリアントベクターライブラリを使用して、各カプシドバリアントがそのコーディング配列をベクターゲノムとして封入したＡＡＶ粒子を生成した。図９は、ＡＡＶのカプシドバリアントライブラリを生成するためにＡＡＶベクター系において使用され得る代表的なＡＡＶのカプシドプラスミドライブラリベクターのベクターマップを示している（例えば、図８参照）。このライブラリは、組織特異的プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下でカプシドバリアントポリヌクレオチドを用いて生成され得る。このライブラリはまた、ポリアデニル化シグナルを含むカプシドバリアントポリヌクレオチドを用いて作製された。
図６に示されているように、ＡＡＶのカプシドライブラリは、第一回のｍＲＮＡベースの選択のために様々な非ヒト動物に投与され得る。図１に示されているように、ＡＡＶ及び関連ベクターによるこの形質導入プロセスは、細胞を形質導入したウイルスのゲノムを反映するｍＲＮＡ分子の産生をもたし得る。少なくとも本明細書の実施例において実証されるように、ｍＲＮＡベースの選択は、細胞を機能的に形質導入することが可能なウイルス粒子を決定するのにより特異的かつ有効であり得るが、その理由は、それが、ウイルスＤＮＡの存在を測定することによって細胞におけるウイルス粒子の存在を単に検出することとは対照的に、産生された機能性生成物に基づいているからである。
第一回の投与後、所望のカプシドバリアントを有する１つ以上の操作されたＡＡＶウイルス粒子は次いで、フィルタリングされたＡＡＶのカプシドライブラリを形成するために使用され得る。所望のＡＡＶウイルス粒子は、このカプシドバリアントのｍＲＮＡ発現を測定し、どのバリアントが所望ではない細胞型（複数可）と比較して所望の細胞型（複数可）において高度に発現するかを決定することによって同定され得る。所望の細胞、組織、及び／または器官型で高度に発現するものが、所望のＡＡＶのカプシドバリアント粒子である。いくつかの実施形態では、このＡＡＶのカプシドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、所望の細胞、組織、または器官において選択的活性を有する組織特異的プロモーターの制御下にある。
この第一回で同定された操作されたＡＡＶのカプシドバリアント粒子は次いで、様々な非ヒト動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、第二回の選択及び同定において使用される動物は、第一回の選択及び同定に使用された動物と同じではない。第一回と同様に、投与後、所望の細胞、組織、及び／または器官型（複数可）において最上位の発現バリアントが、その細胞におけるウイルスｍＲＮＡ発現を測定することによって同定され得る。第二回の後に同定された最上位のバリアントは次いで、任意にバーコード化され、任意にプールされ得る。いくつかの実施形態では、この第二回の最上位バリアントは次いで、特に最上位バリアントの最終使用がヒトにおけるものである場合、最上位の細胞特異的バリアント（複数可）を同定するために非ヒト霊長類に投与され得る。各回での投与は、全身性であり得る。
図１０は、異なるプロモーターを使用して生成されたライブラリによってもたらされたウイルス力価（ＡＡＶ９ベクターゲノム／１５ｃｍディッシュとして計算される）を実証し得るグラフを示す。図１０に示す通り、ウイルス力価は、異なるプロモーターの使用によって有意な影響を受けなかった。
実施例５－筋指向性の改良されたＭｙｏＡＡＶのカプシド
第一及び第二世代の筋特異的ＡＡＶのカプシドを、筋特異的プロモーターを使用して開発し、得られたカプシドライブラリを、本明細書の他の箇所に記載の通り、及び／または例えば、米国仮出願第６２／８９９，４５３号、第６２／９１６，２０７号、及び第６３／０１８，４５４号に記載の通りにマウス及び非ヒト霊長類においてスクリーニングを行った。第一及び第二世代のｍｙｏＡＡＶのカプシドをさらに、先に記載の通りマウス及び非ヒト霊長類において最適化し、改良されたｍｙｏＡＡＶのカプシドを生成した（図１１参照）。表２及び３は、改良された筋特異的ｎ量体モチーフの最上位のヒット及びそれらのコーディング配列を各表内のランク順に示す。図１２は、改良されたＭｙｏＡＡＶ（ｅＭｙｏＡＡＶ）のカプシドバリアントが、全身送達後、第一世代のＭｙｏＡＡＶと比較して、より効率的にマウスの筋肉に形質導入され得ることを実証し得る。
図１３は、第一及び第二世代のｍｙｏＡＡＶのカプシドバリアントが、ヒト一次筋管の形質導入に関して、ａＶｂ６インテグリンヘテロダイマーに依存することを実証し得る。
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実施例６－操作されたＡＡＶのカプシド及び筋肉カプシドバリアントの指向進化
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、前臨床及び臨床研究におけるインビボ遺伝子置換療法及び遺伝子編集に最も一般的に使用される媒体であるが、それにもかかわらず、全身送達後の特定の組織の選択的形質導入は、いまだ課題である。天然に存在するカプシドを使用して生成した組み換えＡＡＶは、大部分は全身注射後に肝臓に隔離される。この隔離により、他の器官における形質導入効率が制限され（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｍｕｒｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）、骨格筋への遺伝素送達に特定の課題がもたらされる。筋肉は、全体重の最大４０％を構成することから、天然のカプシドバリアントによって筋肉に治療閾値を達成するには、極めて高いウイルス量（約２Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇ）を要し（Ｄｕａｎ，２０１８ａ，ｂ）、これは、ベクター製造にとって厄介な障害を生み出し、一部の最近の臨床試験で認められるように、治療制限毒性につながり得る（Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ．ａｌ．，２０２０）。
インビボ選択と連動したＡＡＶのカプシドタンパク質操作は、様々な組織への強力な遺伝子送達を可能にする有望なアプローチである。ＡＡＶのカプシドは、５つのＶＰ１、５つのＶＰ２、及び５０のＶＰ３サブユニットから組み立てられ、これらが合体して複雑な３Ｄ構造を形成し、これが全身送達後の組織指向性を決める。カプシド表面に位置するＶＰ３サブユニットにおける単一のアミノ酸変化でさえ、異なる組織へ指向性を変更する場合がある（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，２００６）。したがって、ＡＡＶのカプシドの操作戦略は、通常、様々な方法によって多様なカプシドライブラリを生成し、その後動物モデルにおいて所望の指向性を有するバリアントを選択することを含む。このアプローチは、マウス網膜（Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ならびに中枢及び末梢神経系（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を含めたいくつかの組織への送達のために最適化されたベクターを生成した。
それにもかかわらず、現在のカプシド操作アプローチは、それらの選択方法、それらが使用することができる動物モデル、及びそれらがスクリーニングすることができるライブラリの多様性に関して主要な制限がある。ＡＡＶの形質導入は、多段階プロセスであり、細胞表面の受容体への結合、細胞内移動、エンドソーム脱出、核移行、ベクターゲノムの第二鎖ＤＮＡ合成、及び導入遺伝子の発現を含み（（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｏｋａｎ，２０１６、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）、図２１Ａ）、これらのステップのいずれかにおける効率の悪さがベクターの効力を制限する可能性がある。したがって、強力なカプシドの同定の成功には、すべての形質導入の段階を効率的に進行するバリアントを選択することが必要である。ＡＡＶの形質導入に関与する遺伝子のコーディング配列及び発現における種特異的及び株特異的な差は、さらに別の課題を示し、特定のマウス株で選択されたカプシドバリアントは、他の株または他の種では強力な形質導入を得られない可能性がある（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。したがって、異なる株及び種にわたって強力なカプシドバリアントの選択を可能にする操作アプローチが非常に望ましい。
本実施例は、これらの課題に対処するためのＤＥＬＩＶＥＲ（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄｓ Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ＲＮＡ）戦略を記載する。ＤＥＬＩＶＥＲは、様々なカプシドライブラリの生成をストリンジェントな転写物ベースのインビボ選択と組み合わせ、指向進化を可能にし、続いて任意の目的の組織及び任意の動物モデルにおける強力なカプシドバリアントを同定する。ここでは、マウスにおける筋指向性カプシドの開発のためのＤＥＬＩＶＥＲの有用性を実証し、その結果を、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関する遺伝子置換試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３６２５０２及びＮＣＴ０３３６８７４２）で現在臨床的に使用されている天然に存在するＡＡＶのカプシドであるＡＡＶ９と全般的に比較する。全体として、この筋指向性ベクターは、ＡＡＶ９と比較した場合、骨格筋及び心臓組織の両方の形質導入に関して優れた効力及び選択性を実証し、大幅に低い投薬量で治療効果をもたらし、マウス及びヒトの両筋細胞に対する感染性が保存されている。筋肉で濃縮されたバリアントカプシド配列の相互比較により、最上位のバリアント間で共通のＲＧＤモチーフがさらに同定され、さらなる分析によって、ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの標的細胞発現との強力な相互作用及びそれに対する依存が明らかになった。総合すれば、本実施例は、とりわけ、治療法の発展及び横紋筋での試験のための特定の有用性を有する新たなクラスのカプシドバリアント、ならびに代替的な組織指向性を有するさらなるＡＡＶのファミリーの今後の進化のための実験的フレームワークを実証する。
結果
ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＡＡＶ９のカプシドのインビボ進化は、筋指向性バリアントのクラスを識別する
ライブラリデザインは、任意のスクリーニング活動の成功のための重要な決定因子である。本研究のためにデザインされたＡＡＶ９ベースのカプシドライブラリは、インビボでの使用のための高効力な筋指向性ベクターの識別を促進するいくつかの重要な特徴を含んでいた。第一に、各バリアントは、ＡＡＶ９のカプシドの超可変領域ＶＩＩＩのアミノ酸５８８と５８９の間に挿入されたランダム７量体ペプチドを含んでおり、すなわち、カプシド表面にこの可変領域ペプチド配列が露出するようにするデザインを含んでいた（（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、図１４Ａ）。各バリアントはまた、ユビキタスプロモーターまたは細胞型特異的哺乳類プロモーターのいずれかの制御下でその独自のカプシド配列をコードする導入遺伝子を封入し、これにより、ウイルスライブラリの生成に使用されるＨＥＫ２９３細胞（図１４Ｂ）及びインビボ送達後にそのウイルスで形質導入される動物組織（図１４Ｃ～１４Ｄ）の両方での導入遺伝子（カプシドバリアント）の発現が可能になった。
異なるマウス組織を機能的に形質導入するカプシドバリアントを選択するためのＤＥＬＩＶＥＲのストリンジェンシーを、ユビキタスＣＭＶプロモーター下でカプシドバリアントを発現させたウイルスライブラリを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて評価した。様々な組織において、このウイルスライブライに対してＤＮＡ及びｍＲＮＡレベルで濃縮されたバリアントを同定した。ベクターゲノムＤＮＡの存在に基づく選択と比較して、ｍＲＮＡ発現に基づくバリアントの選択では、少数精鋭の機能的カプシドが得られ（図２１Ｂ～２１Ｇ）、標的細胞に物理的に侵入するカプシドバリアントのごく一部のみが、これらの細胞を機能的に形質導入して、それらがコードする導入遺伝子を発現することができることが示唆された。この知見と一致して、注射したウイルスライブラリに含まれる量が多いカプシドバリアントほど、注射された動物の肝臓でそのベクターのゲノムＤＮＡレベルではより多量に存在するが、ウイルスライブラリにおける各バリアントの量と、肝臓における同じバリアントに由来する導入遺伝子のｍＲＮＡレベルの間には、ほとんど相関がなかった（図２１Ｈ～２１Ｉ）。
筋特異的プロモーターを強力な筋指向性カプシドバリアントの選択を増進するために使用することの実行可能性を次に評価した。骨格筋及び心筋は、いくつかの異なる細胞型を含むが、特に２つの細胞型、すなわち、筋線維及び心筋細胞への効果的な導入遺伝子の送達が可能なＡＡＶのカプシドが、遺伝的筋疾患に対する治療遺伝子送達にとって最も望まれている。インビボでこれらの細胞型で特異的に発現するバリアントの選択を可能にするため、本発明者らは、ＩＴＲ含有構築物を使用して、カプシドコーディング配列の発現を筋特異的ＣＫ８またはＭＨＣＫ７プロモーターによって制御したＨＥＫ２９３細胞でＡＡＶのカプシドライブラリを生成した。これらの構築物は、ユビキタスＣＭＶプロモーター下でカプシドを発現する構築物を使用して産生したものと同様のｒＡＡＶ力価を生じた（図１４Ｂ）。さらに、注射されたマウスの骨格筋及び心筋内で、ＣＫ８及びＭＨＣＫ７プロモーター下で発現したウイルスライブラリは、ＣＭＶ下で発現したものと比較してさらに高い導入遺伝子のｍＲＮＡ発現を生じ、筋線維及び心筋細胞を形質導入する機能的バリアントの同定を大きく促進した（図１４Ｃ～１４Ｄ）。
指向進化による二回のインビボ選択を行い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの複数の異なる筋肉でＭＨＣＫ７プロモーターから発現したバリアントをスクリーニングした。このプロセスは、５，０００，０００を超えるカプシドバリアントの様々なライブラリから始め、７種の筋肉（大腿四頭筋、前脛骨筋、腓腹筋、三頭筋、腹筋、横隔膜筋、及び心筋）で高発現した３０，０００バリアントを選択した（図１４Ａ及び１４Ｅ）。第二回のインビボ選択では、２つの対照を導入した。その第一は、同義コドン対照であり、ここでは、一次スクリーニングから選択された各バリアントに対して同定された同じ７量体挿入ペプチドが、同義ＤＮＡコドンを使用してコードされている。第二は、発現対照であり、ここでは、二連のウイルスライブラリを、２つの骨格筋特異的プロモーター、すなわち、ＣＫ８またはＭＨＣＫ７のいずれかの下でこれらのバリアントを発現させるために生成した（図１４Ａ）。図１４Ｆは、第二回の転写物ベースの選択後にマウス筋において最上位の高度に発現したカプシドバリアントにおける７量体挿入の配列を示す。各群において同色のバリアントは、同義ＤＮＡコドンによってコードされる。
著しくは、第二回の選択では、ＣＫ８またはＭＨＣＫ７ライブラリのいずれかから筋肉で高度に発現した最上位の１２カプシドバリアントのすべてが、この７量体挿入の最初の３つのアミノ酸位置に同じアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含んでいた。さらに示唆されるのは、それらの優れた筋肉の形質導入におけるこれらカプシドバリアントに含まれる特定のペプチド配列、すなわち、ＣＫ８群では最上位１２のうちの１０ヒット及びＭＨＣＫ７群では最上位１２のうちの８ヒットが同義対に由来した（すなわち、同義ＤＮＡコドンによってコードされた対応するバリアントも、最上位の１２の筋発現バリアント内に含まれていた）（図１４Ｆ）。
最上位５つの固有のＲＧＤ含有カプシドバリアントを使用して産生したｒＡＡＶの力価を定量化し、これらの操作されたカプシドをインビボ研究に使用することの実行可能性を評価した。ｒＡＡＶの力価の比較は、これら最上位５つのＲＧＤ含有カプシドバリアントとその親ＡＡＶ９のカプシドとの間に有意な差を示さなかった（図２２Ｅ）。最上位１２のＲＧＤ含有ヒットからの各位置でコンセンサスアミノ酸ともマッチするＲＧＤＬＴＴＰペプチドの挿入を含むバリアントをさらなる特性評価に選択し、このバリアントを「ＭｙｏＡＡＶ」と指定した。
ＭｙｏＡＡＶは、全身投与後にかつてない効率でマウス筋を形質導入する
ＭｙｏＡＡＶを使用して生成したｒＡＡＶの形質導入プロファイル及び生体内分布を全身投与後の異なるマウス組織で調べるために、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１Ｅ＋１２ｖｇ（約４Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射し、注射の２週後に、異なる組織での導入遺伝子の発現及びベクターゲノム量を分析した。採取した組織の全載蛍光画像は、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して、はるかに高い蛍光強度を示した（図１５Ａ及び２２Ａ）。重要なことには、ＭｙｏＡＡＶは、多くの遺伝的筋疾患の主要な罹患器官である心臓を、ＡＡＶ９よりも効果的に形質導入した。ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの筋線維及び心筋細胞における強力な導入遺伝子の発現を、免疫蛍光分析によってさらに確認した（図１５Ｂ及び２２Ｂ）。意外なことに、ＭｙｏＡＡＶは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、全身送達後の肝臓で比較的減少した形質導入を示し、ＡＡＶ９と比較して、このバリアントに関する肝臓標的解除の形質導入プロファイルが示唆された（図１５Ａ～１５Ｃ）。
異なる骨格筋でのＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定量化は、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して１０～２５倍高い導入遺伝子の発現を示した（図１５Ｃ）。ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現は、ＭｙｏＡＡＶを注射した動物の心臓では６．３倍であり、肝臓では２．８分の１であった（図１５Ｃ）。とりわけ、ＭｙｏＡＡＶによって改善された形質導入効率は、横紋筋組織に限られており、この操作されたカプシドバリアントは、注射した動物の肺、腎臓、脾臓、及び脳には、ＡＡＶ９と比較して、同様または低い効率で形質導入した（図１５Ｃ及び２２Ｃ）。生体内分布分析により、ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９より効果的に、ベクターゲノムをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹筋以外のすべての筋肉に送達し、全身投与後の肝臓に有意に低い数のベクターゲノムをもたらすことが実証された（図２２Ｄ）。
ヒト骨格筋の形質導入におけるＭｙｏＡＡＶの効率を次に分析した。４人の異なるドナー（男性２名及び女性２名）に由来するヒト一次筋管に、インビトロでＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）を形質導入した。ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９よりも３５～５２倍効率的に異なるドナー由来の筋管を形質導入した（図１５Ｄ）。ＭｙｏＡＡＶはまた、ＡＡＶ９と比較して、２３倍の効率でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のマウス一次筋管を形質導入した（図１５Ｄ）。
さらに、ＭｙｏＡＡＶによる筋幹細胞（衛星細胞）形質導入の効率を、６か月齢のｍｄｘ－Ａｉ９マウスにおける静脈内投与後に評価した。これらのジストロフィン欠損マウスは、ヒトＤＭＤに対する遺伝モデルであり、さらにＣｒｅ活性化型ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を担持し、これが、ＣｒｅをコードするＡＡＶによる形質導入のためのレポーターの役割を果たす。ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを注射したマウスの筋肉からの衛星細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、ＭｙｏＡＡＶを投与された動物において、有意に高いパーセンテージの衛星細胞の形質導入を示した（図２２Ｆ～２２Ｉ）。
ＭｙｏＡＡＶの全身送達後のインビボ遺伝子発現の速度を調べるため、本発明者らは、成体ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、４Ｅ＋１１ｖｇ（約１．６Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を注射し、注射後１２０日にわたって異なる時点で全身生物発光画像法を行った。ＭｙｏＡＡＶを投与されたマウスは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を注射したマウスと比較して、四肢及び体全体での導入遺伝子の発現の速度が速く、全レベルが有意に高かった（図１６Ａ～１６Ｂ及び２３Ａ）。注射の４か月後に採取したマウスの筋肉からの全器官生物発光画像法により、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの筋肉で、劇的に高いルシフェラーゼ発現が確認された（図１６Ｃ～１６Ｄ及び２３Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊに対立するものとしてＢａｌｂ／ｃＪで得られたこれらのデータにより、全身投与後のＭｙｏＡＡＶによる強力な筋肉の形質導入が、異なるマウス株にわたって保存されることがさらに実証される。
ＭｙｏＡＡＶを使用した治療用導入遺伝子の全身投与は、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルの機能改善につながる
ＭｙｏＡＡＶを治療用導入遺伝子のインビボ送達のために使用することの実行可能性を調べるため、成体ｍｄｘマウス（Ｄｍｄのエクソン２３にナンセンス変異を担持するＤＭＤのマウスモデル）に、ＳａＣａｓ９をコードする構築物を担持するＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶを、ｍｄｘ変異の５’及び３’を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに注射した（図２４Ａ～２４Ｂ）。このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介アプローチは、ｍｄｘ細胞のゲノムからエクソン２３を切除し、切断されているが依然として機能型のジストロフィンタンパク質の発現を筋肉でもたらすことがすでに分かっている（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。切断型バリアントを産生する一方で、このインフレーム欠失により、機能的タンパク質が作られるため、ＤＭＤに治療効果がもたらされる。
ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲにより、エクソン２３欠失Ｄｍｄ ｍＲＮＡが、異なるｍｄｘ筋において、全Ｄｍｄ ｍＲＮＡの３．４％～２５％に及ぶ効率で産生された。対照的に、同量のＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスの筋肉でのエクソン２３欠失ｍＲＮＡの産生の効率は、１．３％～８．７％に及ぶのみであった（図１７Ｃ）。ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現の定量化により、ＭｙｏＡＡＶ注射マウスの筋肉においては、ＡＡＶ９注射動物と比較して、６．７～１９倍高いＳａＣａｓ９発現及び３．５～７．８倍高いｇＲＮＡ発現が示された（図２４Ｃ～２４Ｄ）。
いくつかの知見は、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して、ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲでのジストロフィン発現の優れたレスキューを指摘している。免疫蛍光及びウエスタンブロット分析により、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して、ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したマウスの筋肉でのジストロフィンの復元がより高く、広がっていることが確認された（図１７Ａ～１７Ｂ）。ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを投与した動物の前脛骨筋（ＴＡ）の生理的評価により、媒体またはＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ注射対照のいずれかと比較した場合、ＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスにおいて有意に高い比筋力（図１７Ｄ）及び遠心性収縮後の筋力の低下のパーセントの減少（図１７Ｅ）が実証された。したがって、ＭｙｏＡＡＶは、従来の広く使用されているＡＡＶ９と比較して、筋肉への治療遺伝子編集複合体の送達に関して顕著に高い効力を示す。
低用量の全身投与後の遺伝子置換に関するＭｙｏＡＡＶの性能を、Ｘ連鎖筋細管ミオパシー（ＸＬＭＴＭ）のマウスモデルで評価した。Ｍｔｍ１ノックアウト（ＫＯ）マウスは、ＸＬＭＴＭの優れた遺伝及び表現型モデルを提供し、それらは、著明な筋肉疲労、運動機能の喪失及び寿命の劇的な短縮を示す。４週齢のＭｔｍ１ ＫＯマウスに、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＭＨＣＫ７プロモーターの制御下で発現されるヒトＭＴＭ１（ｈＭＴＭ１）（ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１）をコードするＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶを注射した。本発明者らは、７か月にわたって各群に関して体重、活動、及び生存を測定した（図１７Ｆ及び２４Ｅ）。この実験で使用したウイルスの量は、ＸＬＭＴＭに関する現在進行中のヒト臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３１９９４６９）で使用されている量の５０～１５０分の１であり、ＸＬＭＴＭ遺伝子治療に関してすでに公開されている前臨床試験（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｅｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）で使用された量の１５～２５０分の１であった。
ＭｙｏＡＡＶ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスは、機能及び生存に著しい改善を示した。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスはすべて、活動が最小限であり、注射後１１～２１週で人道的な安楽死の終点に達した。対照的に、同量のＭｙｏＡＡＶ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスはすべて、野生型マウスと同様の軌道で生存し、この試験を通してＡＡＶ９を注射したマウスと比較して体重も増加し、著しく活動的であった（図１７Ｇ～１７Ｋ）。
ＭｙｏＡＡＶは、マウス及びヒト一次筋管の形質導入に関してインテグリンヘテロダイマーに依存する
本発明者らの選択からのＭｙｏＡＡＶ及び他の最上位のバリアントにおけるＲＧＤモチーフの存在を考慮して、ＭｙｏＡＡＶ形質導入におけるＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの役割を評価した。このＲＧＤモチーフは、１９８４年に、その受容体に対する結合を促進するフィブロネクチンの最小配列として最初に認められ、後にインテグリンヘテロダイマーα５β１として同定された（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９８４、Ｐｙｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ＲＧＤは、その後、いくつかの異なるインテグリンヘテロダイマー、具体的には、αＩＩｂβ３、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、及びαＶβ８の認識モチーフとして同定された（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。ＡＡＶ９－及びＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃの形質導入効率を、これら８つのヒトＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの各々を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞で比較した（図２５５Ａ～２５Ｉ）。α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、またはαＶβ８の過剰発現により、ＭｙｏＡＡＶの形質導入効率は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、ＰＵＣ１９トランスフェクト対照と比較して増加したが、ＡＡＶ９の形質導入は、これらインテグリンヘテロダイマーのいずれの過剰発現によっても向上しなかった（図１８Ａ）。
次に、異なるインテグリンヘテロダイマーがＭｙｏＡＡＶ及びＡＡＶ９の細胞表面への結合効率に与える影響を、過剰発現実験を通して評価した。これら８つのＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの各々またはＰＵＣ１９対照プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面に結合したベクターゲノムを定量したところ、α８β１、αＶβ６、及び比較的程度は小さいが、αＶβ１が、ＡＡＶ９ではなくＭｙｏＡＡＶのインテグリントランスフェクト細胞への結合を、ＰＵＣ１９トランスフェクト対照と比較して高めることが分かった（図１８Ｂ）。２つの異なるｐａｎ－αＶインテグリンアンタゴニスト（ＣＷＨＭ－１２及びＧＬＰＧ－０１８７）が一次細胞におけるＭｙｏＡＡＶの形質導入効率に与える影響もまた調べた。両方の阻害剤がマウス（図１８Ｃ及び２６Ａ）とヒト（図１８Ｄ及び２６Ｂ～２６Ｈ）の両一次骨格筋の筋管において用量依存的にＭｙｏＡＡＶの形質導入を妨げたが、ＡＡＶ９の形質導入効率に対する用量依存効果を有した阻害剤はなかった。これらの結果は、αＶ含有インテグリンヘテロダイマーの阻害により、ＭｙｏＡＡＶがマウス及びヒトの両一次筋管を形質導入する能力がほとんど完全に排除されることを実証する。
個々のαＶ含有インテグリンヘテロダイマーがＭｙｏＡＡＶの結合親和性に与える影響をさらに明らかにするために、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）組み換えタンパク質とともにＭｙｏＡＡＶまたはＡＡＶ９を予備インキュベートした後、ヒト一次筋管をこれらのウイルスで形質導入した。意外なことに、αＶβ６の濃度を増加させてＭｙｏＡＡＶを予備インキュベートすることにより、ヒト一次筋管の形質導入が用量依存的に阻害されるが、本発明者らが調べた他の組み換えタンパク質のいずれも、ＭｙｏＡＡＶまたはＡＡＶ９のいずれかによる細胞の形質導入に用量依存的な効果を有さなかった（図１８Ｅ～１８Ｆ）。反対に、ヒト筋管を抗αＶβ６抗体の濃度を増加させて予備インキュベートすることにより、ＭｙｏＡＡＶによる形質導入効率は用量依存的に減少し、ＡＡＶ９による筋管の形質導入には影響を与えなかった（図１８Ｇ）。これらのデータは、ＭｙｏＡＡＶの形質導入を促進する能力を有するαＶ含有インテグリンヘテロダイマーの中でも、αＶβ６は、このカプシドバリアントに対する結合の親和性が最も高いことを示唆している。さらに、αＶβ６は、ＭｙｏＡＡＶによるそれらの最適な形質導入を可能にするためにヒト筋細胞の表面で利用可能であるはずである。
以前に同定されたＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）へのＭｙｏＡＡＶ形質導入の依存性を評価した。以前に同定されたＡＡＶ受容体は、ＡＡＶ４及びＡＡＶｒｈ３２．３３以外の最も知られたＡＡＶ血清型の効果的な形質導入に必要な急速に細胞内に取り込まれる細胞膜タンパク質である（Ｄｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲノックアウト（ＫＯ）及び親ＨＥＫ２９３ＦＴ野生型（ＷＴ）細胞をＡＡＶ４－、ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したところ、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９と同様に、ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、ＡＡＶＲの発現を必要とすることが分かった。（図１８Ｈ）。
インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲが、ＭｙｏＡＡＶの形質導入において重複した役割を果たすかどうかを調べるため、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、またはαＶβ８をＡＡＶＲの過剰発現の存在下または非存在下でＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞で過剰発現させ、その後その細胞をＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した。これらの結果は、インテグリンヘテロダイマーの過剰発現によりＡＡＶＲ ＫＯ細胞で、モックトランスフェクト対照と比較してＭｙｏＡＡＶの形質導入効率が増加する一方、インテグリンの過剰発現は、ＡＡＶＲを過剰発現するＡＡＶＲ ＫＯ細胞またはＷＴ ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で観察されたレベルまで形質導入をレスキューするには十分ではないことを実証した（図２６Ｉ）。これらのデータは、インテグリンヘテロダイマーとＡＡＶＲは、ＭｙｏＡＡＶの形質導入において異なる役割を果たすこと及び異なる段階で利用される可能性があることを示唆している。
ＤＥＬＩＶＥＲを使用したインビボ進化のさらなる回により、第二世代のＲＧＤ含有筋指向性バリアントが生成される
ＭｙｏＡＡＶによる筋管の形質導入に対するＲＧＤモチーフのインテグリンヘテロダイマーとの相互作用の重要性を考慮し、かつ理論に拘束されることなく、このモチーフに隣接するアミノ酸を修飾することにより、この相互作用を改善することができ、さらにいっそう強力な筋指向性カプシドバリアントが生成されると考えられる。ＭｙｏＡＡＶの超可変領域ＶＩＩＩ表面ループの予測構造に基づいて、このＲＧＤモチーフの上流の５８６、５８７、及び５８８位ならびに下流の５９２、５９３、５９４、及び５９５位のアミノ酸を、ＭｙｏＡＡＶの表面ループに配置される可能性があるとして同定した（図１９Ａ）。各々５８９、５９０、及び５９１位でＲＧＤモチーフを固定し、上記の隣接位置に様々なアミノ酸を有する多様なカプシドのライブラリを生成した（図１９Ｂ）。
ＤＥＬＩＶＥＲを使用した筋指向性バリアントに関する二回のインビボ選択をＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びｍｄｘマウスで行った。第二回のウイルスライブラリを、２つの異なる用量（１匹あたり１Ｅ＋１２ｖｇ及び１Ｅ＋１１ｖｇ）で注射し、高用量及び低用量の両方で筋肉組織を効率的に形質導入するバリアントを同定した（図１９Ｂ）。本発明者らは、これらの選択から本発明者らの最上位のヒットのうち、グリシン及びアラニンが５８８位で濃縮され、グルタミンが５９２位で濃縮されることを見出した。ＧＰＧＲＧＤＱＴＴＬ（配列番号２）配列を含むバリアントが、第二回の選択から１Ｅ＋１２と１Ｅ＋１１の両用量で最も厳選された筋指向性カプシドとして浮上した（図１９Ｂ）。この第二世代のバリアントを、「改良されたＭｙｏＡＡＶ」（ＥＭｙｏＡＡＶ）と指定し、これをさらなる特性評価に用いた。
ＥＭｙｏＡＡＶの形質導入効率を、低用量のウイルスの全身送達後に異なるマウス組織でＡＡＶ９及びＭｙｏＡＡＶと比較して評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２Ｅ＋１１ｖｇ（約８Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ－、またはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射し、異なる組織での導入遺伝子の発現及びベクターゲノムの生体内分布を分析した。全組織の蛍光画像は、ＥＭｙｏＡＡＶによる全身遺伝子送達により、高いレベルの導入遺伝子の発現が異なる骨格筋にわたってＭｙｏＡＡＶまたはＡＡＶ９と比較してもたらされることを実証した（図１９Ｃ～１９Ｄ）。ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定量化により、ＥＭｙｏＡＡＶがＡＡＶ９よりマウス骨格筋を１０～８０倍効率的に、及び心臓を１７倍効率的に形質導入することが明らかになった。さらに、導入遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ＥＭｙｏＡＡＶを注射した動物の肝臓では、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して２．５分の１であった（図１９Ｅ）。同様に、ベクターゲノムの生体内分布分析により、ＥＭｙｏＡＡＶを注射したマウスは、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、骨格筋及び心臓では２倍体ゲノムあたり有意に高いベクターゲノムを有し、肝臓では２倍体ゲノムあたり有意に低いベクターゲノムを有することが示された（図２７Ａ）。
ヒト一次筋管の形質導入に関するＥＭｙｏＡＡＶの効率及びインテグリン依存性を次に分析した。意外なことに、ＥＭｙｏＡＡＶは、ヒト一次筋管をＡＡＶ９と比較して１２８倍効率的に、及びＭｙｏＡＡＶより４．１倍高く形質導入した（図１９Ｆ）。ｐａｎ－αＶインテグリンアンタゴニストＧＬＰＧ－０１８７の濃度を増加させると、用量依存的にＥＭｙｏＡＡＶの形質導入効率が低下し（図１９Ｇ）、ＥＭｙｏＡＡＶの感染性が、標的細胞で発現されるαＶ含有インテグリンヘテロダイマーに依然として依存することが確認された。
異なる個々のαＶインテグリンヘテロダイマーに関するＥＭｙｏＡＡＶの結合親和性を評価するために、ＥＭｙｏＡＡＶまたはＡＡＶ９を、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）組み換えタンパク質とともに予備インキュベートした後、ヒト一次筋管を形質導入した。興味深いことに、及びＭｙｏＡＡＶを用いたこれらの同じアッセイで得られた結果（図１８Ｅ）とは対照的に、調べた４種すべてのαＶ含有インテグリンヘテロダイマーは、ＥＭｙｏＡＡＶによるヒト筋管の形質導入を用量依存的に阻害した（図１９Ｈ～１９Ｉ）一方、ＡＡＶ９の形質導入には用量依存効果はなかった。この結果は、ＥＭｙｏＡＡＶに含まれるアミノ酸置換が、主にαＶβ６に依存するＭｙｏＡＡＶと比較した場合に、より広いクラスのαＶインテグリンヘテロダイマーへのより高親和性結合を可能にすることを示唆している。
ＤＥＬＩＶＥＲを使用して進化させた最上位の第一世代及び第二世代のカプシドバリアントのαＶβ６ヘテロダイマーに対する依存性を評価した。ヒト一次筋管を抗αＶβ６抗体とともに予備インキュベートした後、最上位の第一世代（ＲＧＤＬＴＴＰ（配列番号１２）、ＲＧＤＬＳＴＰ（配列番号８）、ＲＧＤＬＮＱＹ（配列番号９）、ＲＧＤＡＴＥＬ（配列番号１０）、ＲＧＤＴＭＳＫ（配列番号１１））及び第二世代（ＧＰＧＲＧＤＱＴＴＬ（配列番号２）、ＡＥＧＲＧＤＱＹＴＲ（配列番号３）、ＡＴＧＲＧＤＬＧＱＡ（配列番号４）、ＡＶＡＲＧＤＱＧＬＩ（配列番号５）、ＮＩＳＲＧＤＱＧＹＱ（配列番号６）、ＡＰＡＲＧＤＱＧＳＱ（配列番号７））バリアントでこれらの細胞を形質導入した。抗体結合は、これらのバリアントのすべてによってある程度までヒト筋管の形質導入を阻害したが、第一世代のカプシドは、筋管の形質導入に関してαＶβ６に有意により大きく依存していた（図２７Ｂ）。
ＥＭｙｏＡＡＶは、低用量のウイルスの注射後に大きな治療可能性を示す
最後に、ヒト神経筋疾患に対して現在臨床試験中であるカプシドと比較して、ＥＭｙｏＡＡＶの治療関連度を調べた。具体的には、ＤＭＤの場合、ＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４の両方が現在進行中の臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３６２５０２、ＮＣＴ０３３６８７４２、及びＮＣＴ０３７６９１１６）において調査中である。筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターから発現され、ＡＡＶｒｈ７４ベクターを使用して送達される機能補完ジストロフィンミニ遺伝子（マイクロジストロフィンと呼ばれる）の全身投与は、４人のＤＭＤ患者を含めた最近報告されたヒト臨床試験で有望な結果を示している。この試験では、２Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇの高ウイルス量の投与により、筋肉での導入遺伝子の発現及び疾患表現型の機能改善がもたらされた（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ＥＭｙｏＡＡＶによる遺伝子送達を、ＡＡＶｒｈ７４とＡＡＶ９の両ベクターのものと比較し、さらにＤＭＤのＤＢＡ－ｍｄｘマウスモデルにおいて性能を調べた。縦方向のインビボ画像化実験において、本発明者らは、成体ＢＡＢＬ／ｃＪマウスに、低用量（２Ｅ＋１１ｖｇ、約８Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを意味する）のＣＭＶ－Ｆｌｕｃレポーター遺伝子をコードするＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ９、またはＥＭｙｏＡＡＶを注射した。ＥＭｙｏＡＡＶを注射した動物は、分析時点のすべてで、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ９を投与されたマウスと比較して、劇的に高い生物発光シグナルを四肢及び体全体で示した（図１９Ｊ～１９Ｋ）。次に、マイクロジストロフィン導入遺伝子（ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧ）を担持するＭｙｏＡＡＶまたはＡＡＶ９のＤＭＤのＤＢＡ－ｍｄｘマウスモデルへの全身送達を、同じ低用量（２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）の各ＡＡＶを使用して調べた。ＭｙｏＡＡＶを注射した動物は、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、複数の筋肉群において、筋細胞膜に局在した、比較的大きな、より広がったマイクロジストロフィンの発現を示した（図２０Ａ）。ウエスタンブロットにより、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、高レベルのマイクロジストロフィンタンパク質が確認された（図２０Ｂ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、ＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧを注射したマウスの骨格筋において、ＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧと比較して、７．６～１５倍高いレベルのマイクロジストロフィンｍＲＮＡが示された（図２０Ｃ）。
最後に、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスにおけるベクターゲノム量及び筋機能を、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して評価した。ＭｙｏＡＡＶは、ＡＡＶ９と比較して、ＤＢＡ－ｍｄｘマウスの骨格筋では、２倍体ゲノムあたり１２～４６倍の数のベクターゲノムを送達し、肝臓では、２倍体ゲノムあたり２．５分の１のベクターゲノムを送達した（図２０Ｄ）。著しくは、ＡＡＶ９を注射した動物では、２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの数が筋肉と比較して肝臓で４０倍を超えた一方で、ＭｙｏＡＡＶを注射したマウスでは、肝臓と筋肉では同様のレベルであった。比筋力及び遠心性損傷後の筋力の低下のパーセントの定量化により、ＭｙｏＡＡＶを注射したＤＢＡ－ｍｄｘマウスのＴＡ筋が、同量のＡＡＶ９を投与されたマウスの筋肉及び媒体を注射したマウスと比較して、有意に高い比筋力を回復したこと、及び損傷からの保護の程度がより大きいことが実証された（図２０Ｅ～２０Ｆ）。
方法詳細
構築物
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを生成するために使用したプラスミドは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＧＦＰコーディング配列、及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ ｐＡ）をｐＺａｃ２．１ ＡＡＶプラスミド骨格に、ギブソン・アセンブリを使用してクローニングすることによって生成した。ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃ及びＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃを生成するために使用した構築物は、ｐＺａｃ２．１－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ－ｂＧＨ ｐＡにおけるＥＧＦＰコーディング配列を、Ｎｌｕｃ及びＦｌｕｃコーディング配列でそれぞれ置換することによって産生した。このｐＺａｃ２．１構築物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｒｅから入手した。ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃｒｅ及びＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲウイルスを生成するために使用したプラスミドは以前に記載された（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。このプラスミドライブラリのレシピエントプラスミドは、ＣＭＶ、ＭＨＣＫ７（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７）、またはＣＫ８（Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）プロモーター、ＡＡＶ２ ｒｅｐのスプライシング配列（（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）に記載の配列から修飾されて、保存されたスプライスドナーを含む（Ｆａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｐｉｎｔｅｌ，２００８））、Ｑ４８６及びＱ５８８の直後にＢｓｍＢＩ制限酵素認識部位を含むＡＡＶ９のカプシドコーディング配列、ならびにＳＶ４０ポリアデニル化シグナルをｐＺａｃ２．１の骨格にギブソン・アセンブリを使用してクローニングすることによって生成した。インテグリンタンパク質及びＡＡＶＲをコードする構築物を生成するために、ヒトインテグリンαＶ、α５、α８、αＩＩｂ、β１、β３、β５、β６、β８、及びＡＡＶＲのコーディング配列をヒト骨格筋ｃＤＮＡから増幅した。これらのアンプリコンをｐＵＣ５７骨格のヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターの下流かつＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列の上流にギブソン・アセンブリを使用して挿入した。ＡＡＶ－ＭＨＣＫ７－ヒトＭＴＭ１を生成するために使用したプラスミドは、ＭＨＣＫ７プロモーター、ｐＣＩ－ｎｅｏ哺乳類発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのキメライントロン、ヒトＭＴＭ１コーディング配列、及びｂＧＨ ｐＡをｐＺａｃ２．１ ＡＡＶプラスミド骨格にギブソン・アセンブリを使用してクローニングすることによって生成した。ｐＺａｃ２．１－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧは、ＣＫ８プロモーター、５リピートマイクロジストロフィンのコーディング配列（Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＦＬＡＧタグ、及び合成ポリアデニル化シグナル（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９）をｐＺａｃ２．１骨格のＩＴＲ間に組み込むことによってクローニングした。
カプシドライブラリの生成
第一回の選択のためのカプシドライブラリを調製するため、本発明者らは、ＣＭＶまたはＭＨＣＫ７プロモーターを含むＡＡＶライブラリのレシピエントプラスミドをＢｓｍＢＩで消化した。本発明者らは、ランダム７量体をコードする断片を、ｌｉｂ－Ｆ（（５’－ＧＣＡＡＣＡＴＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＧ－３’（配列番号７６９））及びＮＮＫ－Ｒ（５’－ＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＴＧＣＧＣＣＴＧＴＧＣＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮＮＭＮ
ＮＴＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号７７０））プライマーを使用し、鋳型としてＡＡＶ９のカプシドコーディング配列を使用して増幅し、この断片を消化したライブラリレシピエントプラスミドに、ギブソン・アセンブリを使用して組み込んだ。第二回のプラスミドライブラリを生成するため、本発明者らは、第一回で選択したバリアントをコードするオリゴヌクレオチドのプール、及びＡｇｉｌｅｎｔによって合成された同義ＤＮＡコドン複製を使用した。これらオリゴヌクレオチドライブラリのプールをＮＮＫ－Ｒプライマーの代わりに使用して、消化したライブラリのレシピエントプラスミドにギブソン・アセンブリ用のアンプリコンを生成した。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの１日前に、１５ｃｍのディッシュに２ｘ１０７細胞／ディッシュで播種した。各プレートを、１６μｇのｐＡＬＤＸ－８０ヘルパープラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、８μｇのＲｅｐ－ＡＡＰプラスミド（Ｂｅｎ Ｄｅｖｅｒｍａｎからの寄贈（Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６））、８μｇのｐＵＣ１９及び１０ｎｇのプラスミドライブラリでＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してトランスフェクトした。カプシドライブラリを細胞及び培地から採取し、以前に記載された通りにイオジキサノール勾配を使用して超遠心分離によって精製した（Ｒｏｓｅｍａｒｙ Ｃ Ｃｈａｌｌｉｓ，２０１８）。
組み換えＡＡＶの産生及び精製
ＨＥＫ２９３細胞を１５ｃｍのディッシュに２ｘ１０７細胞／ディッシュの密度で播種した。翌日、各プレートを、１６μｇのｐＡＬＤＸ－８０ヘルパープラスミド（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）、８μｇのＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、及び８μｇのＩＴＲ含有プラスミドで、ＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してトランスフェクトした。組み換えウイルスを細胞及び培地から採取し、以前に記載された通りにイオジキサノール勾配を使用して超遠心分離によって精製した（Ｒｏｓｅｍａｒｙ Ｃ Ｃｈａｌｌｉｓ，２０１８）。ＡＡＶの力価をｔａｑｍａｎベースのｑＰＣＲによって定量化した。
インビボ選択
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１Ｅ＋１２ｖｇのカプシドライブラリを注射した。注射の２週後、マウスをＰＢＳで灌流し、複数の骨格筋（前脛骨筋、大腿四頭筋、腓腹筋、三頭筋、腹筋及び横隔膜）ならびに心臓を採取した。全ＲＮＡ及びＤＮＡをこれらの組織からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して抽出した。ｍＲＮＡをオリゴｄＴビーズ（ＮＥＢ）を使用して全ＲＮＡサンプルから濃縮し、ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及びカプシド特異的プライマー（５’－ＧＡＡＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＣＧＴＧＴＧＡＧＧ－３’（配列番号７７１））を使用して行った。カプシドバリアントのＤＮＡ及び発現されたｍＲＮＡを、それぞれこれらＤＮＡ及びｃＤＮＡサンプルから、７量体挿入物の上流に結合するプライマー（５’－ＡＣＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡ－３’（配列番号７７２））及び下流に結合するプライマー（５’－ＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣ－３’（配列番号７７３））で、Ｑ５ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２ｘマスターミックスを使用して増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター及び固有のインデックス（ＮＥＢ Ｅ７６００Ｓ）を含むアンプリコンを量子ビットを使用して定量化し、等モル比でプールし、Ｎｅｘｔｓｅｑにてシーケンシングした。
次世代シーケンシングデータ分析及びウイルスライブラリデザイン
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのリードを、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２－ｖ２．１７．１を使用して逆多重化した。得られたＦＡＳＴＱ配列をフィルタリングし、可変領域の周辺の対応する構築物配列に直接マッチしたもののみを維持し、そこから２１ｂｐのバリアントを抽出した。ペアードエンドシーケンシングのランの場合、このバリアントをさらにフィルタリングして、フォワード及びリバースの両リードで一致したバリアントのみを維持した。バリアントをサンプルごとに計数し、１００万分のリード（ＲＰＭ）としてシーケンシングの深度によって正規化した。さらなる正規化もまた、必要に応じて、バリアントのＲＰＭを、一致したウイルスライブラリサンプルにおける同じバリアントのＲＰＭで除することによって行った。さらなる分析を単純にするため、１０リード未満のサンプルバリアントを後の分析のために廃棄した。バリアントを、ウイルスライブラリのＲＰＭで除したサンプルＲＰＭのＲＰＭ比を使用してランク付けし、最も高いスコアのバリアントを第二回の選択で使用するために識別した。選択されたアミノ酸バリアントごとに、同義ＤＮＡコドンによる同じアミノ酸をコードするバリアントを第二回のライブラリのデザインに対照として含めた。シーケンシングされたサンプルにすでに観察されている同義バリアントを有するバリアントの場合、最も高いスコアの同義バリアントを第二回のデザインに含めた。シーケンシングされたサンプルの中に同義型がないバリアントの場合、同義バリアントをコンピュータ的に、可能であれば元のアミノ酸配列の可能性のあるコドンを各々異なるコドンにランダム化し、ひいては元のＤＮＡ配列を最大限にスクランブリングすることによって生成した。さらに、本発明者らは、これらオリゴの５％を終止コドンを含むランダムバリアントにデザインし、ウイルスライブラリの産生中の交差パッケージングを制御した。デザインされたバリアントを使用した第二回の選択からのシーケンシングデータを処理して上記の通り計数し、そのオリゴデザインプールにマッチしないバリアントをフィルタリングして除去するさらなる制限を行った。
エクソンスキッピング、導入遺伝子発現、及びベクターゲノム定量化
ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ及びＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ実験では、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して組織サンプルから抽出した。ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ及びマイクロジストロフィン実験からのサンプルの場合、抽出したＲＮＡをＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＶＩＬＯ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して作製した。エクソン４－５連結に対するｔａｑｍａｎアッセイを全Ｄｍｄ転写物の定量化に使用し、エクソン２２－２４連結に対する別のアッセイをエクソン２３欠失転写物の定量化に使用した。エクソン４－５及びエクソン２２－２４アンプリコンの各々の場合、標準曲線は、各ランにｔａｑｍａｎアッセイの標的配列を含むｇｂｌｏｃｋを増幅させて生成した。Ｄｍｄ転写物及びエクソン２３欠失転写物の全量をこれらの標準曲線に基づいて定量化した。これらの組織サンプルにおけるＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現を、ｔａｑｍａｎアッセイを使用して定量化した。マウスＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡをＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現の定量化のためのハウスキーピング対照として使用した。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ実験からのサンプルの場合、抽出されたＲＮＡをＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で処理し、ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、オリゴｄＴプライマーで生成した。マウスベータアクチンｍＲＮＡをマイクロジストロフィン発現の定量化のためのハウスキーピング対照として使用した。マウスＧＡＰＤＨ及びベータアクチンｍＲＮＡ（ハウスキーピング対照）を、予め指定したｔａｑｍａｎアッセイであるＩＤＴのＭｍ．ＰＴ．３９ａ．１及びＭｍ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８４３．ｇをそれぞれ使用して定量化した。ベクターゲノム定量化実験では、全ＤＮＡを組織サンプルから迅速ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）を使用して抽出した。２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムの数を、導入遺伝子（ＥＧＦＰもしくはマイクロジストロフィン）またはマウスＧＡＰＤＨ ＤＮＡを増幅するようにデザインされたｔａｑｍａｎアッセイを使用してｑＰＣＲに基づいて定量化した。各サンプルにおける導入遺伝子及びＧＡＰＤＨ分子の絶対数を、各ランにおいて異なる量のｔａｑｍａｎアッセイ標的配列を増幅することによって生成した標準曲線を使用して定量化した。
インビトロＡＡＶ形質導入及び結合実験
ヒト及びマウスの一次筋管をそれぞれヒト筋芽細胞及びマウス衛星細胞から分化させた。一次ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｌｏｎｚａ）をＳｋＧＭ－２培地（Ｌｏｎｚａ）にて３７℃、５％ＣＯ２で維持した。一次マウス衛星細胞は、以前に記載された通り（Ｃｅｒｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスから単離し、マウス筋幹細胞増殖培地（２０％ドナーウマ血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を含むＦ１０（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、及び５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）含有）で６日間増殖させた。ヒト及びマウス筋芽細胞をコラーゲン及びラミニン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でコートした９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、１５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。プレーティングの２４時間後、培地を２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に変更し、筋芽細胞を４～６日間筋管に分化させた後、それらをＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－Ｃｋ８－Ｎｌｕｃで５Ｅ＋３ｖｇ／細胞で形質導入した。インテグリンの過剰発現実験の場合、ＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、３５，０００細胞／ウェルにて播種した。このインテグリンの過剰発現実験では、細胞を、異なる対のインテグリン構築物で、合計１００ｎｇのプラスミドライブラリ／ウェルにて、ＰＥＩ ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して翌日トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を１Ｅ＋４ｖｇ／細胞のＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した。このインテグリンの過剰発現及び形質導入分析実験では、プレートの培地の体積に等しいＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、発光を、形質導入後２４時間でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダーにて測定した。このインテグリンの過剰発現及び結合分析実験では、エンドサイトーシスを阻害するために細胞を氷冷し、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－Ｎｌｕｃをこれらの細胞に１Ｅ＋４ｖｇ／細胞にてトランスフェクションの７２時間後に加えた。細胞を氷上で３０分間保持し、それらをＰＢＳで３回洗浄した後、迅速ＤＮＡ抽出溶液（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に溶解した。ベクターゲノム及び２倍体ゲノムを、ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって、Ｎｌｕｃコーディング配列及びヒトＧＡＰＤＨゲノム遺伝子座を標的とするアッセイを使用して定量化した。ＡＡＶＲ依存性実験では、ＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ、及びＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＷＴ細胞を３５，０００細胞／ウェルにて９６ウェルのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。翌日、細胞をＡＡＶ２－、ＡＡＶ４－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで１Ｅ＋３ｖｇ／細胞にて形質導入した。ＡＡＶＲレスキュー実験の場合、ＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯとＨＥＫ２９３ＦＴ ＷＴ細胞を３３．３ｎｇの各インテグリン構築物またはｐＵＣ１９及び３３．３ｎｇのＡＡＶＲ構築物またはｐＵＣ１９でトランスフェクトした。合計１００ｎｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションごとに使用した。トランスフェクションの４８後、細胞をＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで１Ｅ＋３ｖｇ／細胞にて形質導入した。Ｎａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質導入の２４時間後にプレートに含まれる培地の体積に等しい体積で加え、発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌマイクロプレートリーダーを使用して測定した。
小分子及び抗体阻害実験
ｐａｎ－アルファＶインテグリンアンタゴニストＣＷＨＭ－１２及びＧＬＰＧ０１８７（ＭｅｄＣｈｅｍ Ｅｘｐｒｅｓｓ）または抗αＶβ６抗体（ａｂ７７９０６、ａｂｃａｍ）を、２％ウマ血清を含むＤＭＥＭに特定の濃度で希釈した。培地を分化した筋管から除去し、希釈した阻害剤で置換し、その後筋管を氷上で３０分間インキュベートしてエンドサイトーシスを阻害した。このインキュベーション後、ＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ－、またはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－Ｎｌｕｃを細胞に５Ｅ＋３ｖｇ／細胞で加え、これらのプレートを組織培養インキュベータに戻した。形質導入の２４時間後、ルシフェラーゼ強度をＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
組み換えタンパク質阻害実験
ヒト一次骨格筋筋芽細胞（Ｌｏｎｚａ）を、２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ中、９６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコートプレートにさらにコラーゲン及びラミニンをコートしたプレートにて筋管に分化させた。ＭｙｏＡＡＶ－、ＡＡＶ９－、またはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃを、組み換え可溶性ヒトインテグリンヘテロダイマーαＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはマルトース結合タンパク質（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と３７℃で３０分間予備インキュベートした。ウイルス及びタンパク質を次いで細胞に１Ｅ＋４ｖｇ／細胞にて加えた。細胞を３７℃に２４時間戻し、その後ルシフェラーゼ強度をＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。
マウス及びＡＡＶ注射
すべての動物の世話及び実験手順は、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、ならびにＨａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ及びＢｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｈｏｓｐｉｔａｌのＩＡＣＵＣに従った。以下のマウスをＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した：ｍｄｘ（ＪＡＸ、＃００１８０１）、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＪＡＸ、＃０００６６４）、ＤＢＡ／２Ｊ（ＪＡＸ、０００６７１）、ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘ（ＪＡＸ、０１３１４１）、及びＢＡＬＢ／ｃＪマウス（ＪＡＸ、＃０００６５１）。ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ実験の場合、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－もしくはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰ、または２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ－、もしくはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのいずれかを注射した。ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲの実験の場合、８週齢のｍｄｘマウスに、４．５Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－ＳａＣａｓ９及び９Ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ－ｇＲＮＡを注射した。インビボ画像化実験では、本発明者らは、８週齢のＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、もしくはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃ、または２Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶｒｈ７４－、ＡＡＶ９－、もしくはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｆｌｕｃのいずれかを注射した。衛星細胞の形質導入実験では、６か月齢のｍｄｘ；Ａｉ９マウスに４Ｅ＋１１ｖｇのＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを注射した。ＭＴＭ１ ＫＯマウスに２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射した。本発明者らは、ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスに、２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－、またはＥＭｙｏＡＡＶ－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧを注射した。すべての注射は、眼窩後方に行った。
マウスの活動測定
ａｃｔｉｍｅｔｅｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、マウスごとに２週間おきに立ち上がり行動の回数を測定した。各動物をａｃｔｉｍｅｔｅｒのケージに５分間入れ、この期間の立ち上がり行動の数をＡｃｔｉｔｒａｃｋソフトウェアを使用して定量した。自発的な回し車の回転の測定のため、５週齢でマウスを個室に収容し、生涯を通じて薄型のワイヤレス回し車（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を備えたケージで飼育した。動物は回し車に自由に出入りし、自発的にその上で走ることができた。各回し車の回転を継続的に記録し、データを週１回ダウンロードし、その際に回し車を清掃し、適切に操作するかどうかを点検した。データを正規化するため、各週の全活動を１時間あたりの車の回転の合計の平均として表した。
免疫蛍光
ＡＡＶ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したＣ６７ＢＬ／６Ｊマウスから採取した組織の場合、サンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で室温（ＲＴ）にて１時間固定し、ＤＰＢＳで３回洗浄した。固定組織を３０％スクロースに４Ｃで浸漬して浸水させ、Ｏ．Ｃ．Ｔコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ）に包埋し、液体窒素低温イソペンタン中で凍結させた。ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスから採取した筋肉を、解剖の直後に液体窒素低温イソペンタン中で凍結させた。組織をＣＭ１８６０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、厚さ１２μｍで分割した。組織切片のラミニン及びジストロフィン免疫染色を以前に記載された通りに行った（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧ免疫染色では、組織切片をウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）で、ジストロフィン免疫染色と同じプロトコルを使用して染色した。肝臓サンプルのレクチン染色の場合、組織切片をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で３×５分洗浄し、Ｄｙｌｉｇｈｔ ５９４（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で標識したＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ Ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン１０μｇ／ｍｌで１０分間、ＲＴにてインキュベートし、ＰＢＳＴで３×５分洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）１０μｇ／ｍｌで５分間染色し、ＰＢＳＴで２×５分洗浄し、ＤＡＰＩを含まないＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ退色防止封入媒体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用してマウントした。インビトロで分化した筋管をミオシン重鎖（ＭＨＣ）に関して以前に記載された通りに免疫染色した（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
ウエスタンブロット
ジストロフィンのウエスタンブロットでは、タンパク質をＲＩＰＡ緩衝液（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して筋肉サンプルから抽出した。全タンパク質（２５μｇ）を、酢酸トリス３～８％ステインフリーポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した電気泳動により分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏｒａｄ）に転写した。各ゲルの最初の３レーンに関しては、これらのレーンのすべてに関して全タンパク質量が同じ（２５μｇ）になるように、同じ筋肉型からのｍｄｘタンパク質に、異なるパーセンテージの野生型筋タンパク質を希釈した。これらの膜を５％脱脂乳（Ｂｉｏｒａｄ）を含むＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）でＲＴにて１時間ブロックした。ジストロフィン及びＧＡＰＤＨ（ローディング対照）を、ジストロフィンに対する一次抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ、ａｂ１５２７７）及びＧＡＰＤＨに対する一次抗体（１：２５０００、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｓｃ－３２２３３）に続いて、ヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ結合（１：５０００、ａｂｃａｍ ａｂ９７０５１）またはウマ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ結合（１：５０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７６Ｐ２）二次抗体でそれぞれ検出した。ジストロフィンとＧＡＰＤＨのサイズが大きく異なること及び必要な電気泳動時間が異なることから、同じタンパク質サンプルを２つの酢酸トリス３～８％ゲルで泳動し、ジストロフィン及びＧＡＰＤＨブロットを生成させた。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｅ画像化システム（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を使用して、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ ＥＣＬキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の使用後に化学発光を検出した。全タンパク質中のジストロフィンの相対量をＩｍａｇｅ Ｊを使用して計算したジストロフィンとＧＡＰＤＨシグナルの比によって半定量的に評価し、任意単位（Ａ．Ｕ．）で示した。マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧウエスタンブロットでは、ＡＡＶ９及びＥＭｙｏＡＡＶを注射したマウスの前脛骨筋、大腿四頭筋、三頭筋、及び心臓からの組織溶解物のタンパク質含量をＰｉｅｒｃｅ６６０ｎｍタンパク質アッセイ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。各サンプルから２０μｇの全タンパク質を、４～２０％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分画し、製造業者（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の指示に従って、湿潤転写タンクにてＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を５％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中で１時間ブロックし、各々ＴＢＳＴを使用して３×１０分間洗浄し、ＦＬＡＧタグに対する一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｆ７４２５、１：４００）またはＧＡＰＤＨに対する一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－３２２３３、１：２５，０００）とともに４℃で１６時間インキュベートした。これらの膜を次いで各々ＴＢＳＴを用いて３×１０分間洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ（Ａｂｃａｍ ａｂ９７０５１、１：５０００）または抗マウス（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ７０７６Ｐ２、１：５０００）二次抗体中で１時間、室温にてインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で現像し、ＣＣＤ撮像装置を使用して画像化した。
インテグリンα８及びαＩＩｂのウエスタンブロットの場合、全細胞抽出物をｐＵＣ１９、α８、またはαＩＩｂインテグリン一本鎖を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞からＮＰ－４０溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１％ＮＰ－４０）中での溶解及び細胞残屑を除去するための遠心分離によって調製した。各サンプルから２μｇの全タンパク質を４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で電気泳動させ、ＰＶＤＦ膜に転写した。この膜を５％ｗ／ｖ脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ中で１時間ブロックし、インテグリンα８に対する一次抗体（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＭＡ５－３１４４９）、インテグリンαＩＩｂに対する一次抗体（１：５０００、ａｂｃａｍ ａｂ１３４１３１）、またはα－チューブリンに対する一次抗体（１：５０００、ａｂｃａｍ ａｂ７２９１）とともに４℃で１６時間インキュベートした。これらの膜を次いで各々ＴＢＳＴを用いて３×１０分間洗浄し、１：１０，０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体中で１時間、室温にてインキュベートした。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で現像した。α８ブロットをＣＣＤ撮像装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を使用して画像化し、αＩＩｂブロットを、Ｘ線フィルムにて、露光時間２０秒及び１５分で、それぞれ、α－チューブリン及びαＩＩｂのセクションについて画像化した。
フローサイトメトリー
ｐＵＣ１９またはインテグリン一本鎖を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に採取し、染色緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。これらの細胞を次いで、染色緩衝液に希釈した一次抗体中、４℃にて１時間染色した。細胞を染色緩衝液で３回洗浄した。インテグリンβ８抗体で染色したサンプルに関しては、細胞を、染色緩衝液で希釈したＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２－４０１０－８２）とともに４℃で３０分間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、染色緩衝液に再懸濁し、ＣｙｔｏＦＬＥＸ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して分析した。このフローサイトメトリーデータをＦｌｏｗ Ｊｏで分析した。
マウス衛星細胞の単離、培養、及び分化
ＡＡＶ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを注射したｍｄｘ－Ａｉ９マウスからの衛星細胞の単離を、以前に記載された通りに行った（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。注射した動物から単離された衛星細胞を、コラーゲン／ラミニンコートプレートにて、衛星細胞増殖培地（２０％ドナーウマ血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を含むＦ１０（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、及び５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）含有）に播種した。増殖培地を１日おきに交換した。６日間後、衛星細胞を採取し、細胞数を計数し、細胞を９６ウェルプレートの複数のウェルに１０，０００細胞／ウェルの密度にて分化用に再プレーティングした。翌日、増殖培地を分化培地（２％ドナーウマ血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ））に交換した。分化の開始から６０時間後、筋管を４％ＰＦＡで固定した。
筋生理学分析
マウスを前脛骨筋のインサイチュ評価のため、以前に記載された通りに調製した（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。筋力を２０～２００Ｈｚに及ぶ９つの異なる刺激周波数で記録した。得られたデータを、Ｐ＝Ｐｍｉｎ＋（（Ｐｍａｘ－Ｐｍｉｎ）／（１＋（Ｋ／ｆ）Ｈ））の形式のＳ字形曲線によってフィットさせた。式中、Ｐは、刺激周波数ｆでの筋力であり、Ｐｍｉｎは、最小の筋力、Ｐｍａｘは、最大の筋力、Ｋは、この曲線の変曲点での刺激周波数であり、Ｈは、ヒル係数または傾きである（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。パラメータＫは、変曲点での筋力を計算するために使用し、中間筋力またはＰｉｎｔと呼んだ。次に、ＴＡを一連の５回の等尺性－遠心性収縮に供し、損傷（１００ｍｓの固定端収縮の直後に、４線維長／ｓで、最終長が１．２線維長までの積極的伸展）に対するその感受性を評価した。このシリーズは、等尺性筋力の損失を、プロトコル前及びプロトコル後の筋力間の相対的差異として定量化することができるように、等尺性収縮によってひとくくりにした。線維長及びＴＡの断面積を以前に記載された通りに計算した（Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
生物発光画像
マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（Ｇｏｌｄｂｉｏ）を注射し、イソフルランで麻酔した後、画像化した。生物発光画像は、Ｄ－ルシフェリン注射の５分後に、２分に１画像の速度で２５分間取得した。全及び平均放射輝度を同じサイズの目的の領域（ＲＯＩ）から、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ４．７．３ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して測定した。画像化時間にわたってキャプチャされた最も高い放射輝度を、反応速度曲線のピークとして決定し、分析用に選定した。解剖した筋肉から放射輝度を測定するため、Ｄ－ルシフェリン注射の１２分後にマウスを安楽死させた。解剖した筋肉をペトリ皿に置き、ＩＶＩＳスペクトルを使用して生物発光画像化を行った。
参考文献
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Ｃｅｒｌｅｔｔｉ，Ｍ．，Ｊｕｒｇａ，Ｓ．，Ｗｉｔｃｚａｋ，Ｃ．Ａ．，Ｈｉｒｓｈｍａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｈａｄｒａｃｈ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｏｏｄｙｅａｒ，Ｌ．Ｊ．，ａｎｄ Ｗａｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．（２００８）．Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｓｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌ １３４，３７－４７．
Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｙ．，Ｊａｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｙｏｏ，Ｂ．Ｂ．，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ，Ａ．，Ｒａｖｉ，Ｎ．，Ｗｕ，Ｗ．Ｌ．，Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｇｕａｒｄａｄｏ，Ｌ．，Ｌｏｉｓ，Ｃ．，Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｄｅｖｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＡＡＶｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２０，１１７２－１１７９．
Ｃｈａｎ，Ｓ．，Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｉ．，ａｎｄ Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｗ．（２００７）．Ｂｒａｎｃｈｅｄ ｆｉｂｅｒｓ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｄｘ ｍｕｓｃｌｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｏｒｃｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｌｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９３，Ｃ９８５－９９２．
Ｃｈｉｌｄｅｒｓ，Ｍ．Ｋ．，Ｊｏｕｂｅｒｔ，Ｒ．，Ｐｏｕｌａｒｄ，Ｋ．，Ｍｏａｌ，Ｃ．，Ｇｒａｎｇｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｄｏｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ａ．，Ｌａｗｌｏｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｒｉｄｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｊａｍｅｔ，Ｔ．，Ｄａｎｉｅｌｅ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒ ｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６，２２０ｒａ２１０．
Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｌ．Ｃ．，Ｋｌｉｍｃｚａｋ，Ｒ．Ｒ．，Ｖｉｓｅｌ，Ｍ．，Ｙｉｎ，Ｌ．，Ｍｅｒｉｇａｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｆｌａｎｎｅｒｙ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．（２０１３）．Ｉｎ ｖｉｖｏ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｕｔｅｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｔｒｅｏｕｓ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ５，１８９ｒａ１７６．
Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．，Ａｌｄｒｉｎ－Ｋｉｒｋ，Ｐ．，Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｔ．，Ｎｏｌｂｒａｎｔ，Ｓ．，Ｈａｒｔｎｏｒ，Ｍ．，Ｍｕｄａｎｎａｙａｋｅ，Ｊ．，Ｐａｒｍａｒ，Ｍ．，ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ｔ．（２０１９）．Ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃａｐｓｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｔａｉｌｏｒｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．
Ｄｅｖｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｐｒａｖｄｏ，Ｐ．Ｌ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｂ．Ｐ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｙ．，Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ａ．，Ｗｕ，Ｗ．Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｎ．，Ｐａｓｃａ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｃｒｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄｓ ＡＡＶ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３４，２０４－２０９．
ＤｉＭａｔｔｉａ，Ｍ．Ａ．，Ｎａｍ，Ｈ．Ｊ．，Ｖａｎ Ｖｌｉｅｔ，Ｋ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｍ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ａ．，Ｇｕｒｄａ，Ｂ．Ｌ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｒ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｎ．Ｈ．，Ｓｉｎｋｏｖｉｔｓ，Ｒ．Ｓ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８６，６９４７－６９５８．
Ｄｉｎｇ，Ｗ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．，Ｙａｎ，Ｚ．，ａｎｄ Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｆ．（２００５）．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２，８７３－８８０．
Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１８ａ）．Ｍｉｃｒｏ－Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｇｏｅｓ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２９，７３３－７３６．
Ｄｕａｎ，Ｄ．（２０１８ｂ）．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶ Ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，２３３７－２３５６．
Ｄｕｄｅｋ，Ａ．Ｍ．，Ｐｉｌｌａｙ，Ｓ．，Ｐｕｓｃｈｎｉｋ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｇａｍｉｎｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｆ．，Ｑｉｕ，Ｊ．，Ｃａｒｅｔｔｅ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ，Ｌ．Ｈ．（２０１８）．Ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｅ Ｒｏｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） Ｅｎｔｒｙ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＡＡＶ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９２．
Ｅｌｖｅｒｍａｎ，Ｍ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｃｋ，Ｄ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｌａｗｌｏｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｍｅｎｇ，Ｈ．，Ｂｅｇｇｓ，Ａ．Ｈ．，Ｂｕｊ－Ｂｅｌｌｏ，Ａ．，Ｐｏｕｌａｒｄ，Ｋ．，Ｍａｒｓｈ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ａ ｃａｎｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒ ｍｙｏｐａｔｈｙ．Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ ５６，９４３－９５３．
Ｆａｒｒｉｓ，Ｋ．Ｄ．，ａｎｄ Ｐｉｎｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．（２００８）．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ（ＡＡＶ） ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ ｐｒｅ－ｍＲＮＡｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９，１４２１－１４２７．
Ｇａｏ，Ｇ．，Ｌｕ，Ｙ．，Ｃａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，Ｇｒａｎｔ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｆｉｇｕｅｒｅｄｏ，Ｊ．，Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２００６）．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １３，７７－８７．
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．Ｄ．，Ｍｅｓｓｅｍｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｐｅａｃｋｅｒ，Ｂ．，Ａｓｈｒａｆｉ Ｋａｋｈｋｉ，Ｓ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ－Ｃｅｌｅｉｒｏ，Ｍ．，Ｓｈｗａｒｔｚ，Ｙ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｅｍ ａｎｄ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２７，１２５４－１２６４ ｅ１２５７．
Ｈａｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｗａｓａｌａ，Ｎ．Ｂ．，Ｐａｎ，Ｘ．，Ｋｏｄｉｐｐｉｌｉ，Ｋ．，Ｙｕｅ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｙａｏ，Ｇ．，Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｂ．，Ｄｕａｎ，Ｓ．Ｘ．，Ｒａｍｏｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ａ Ｆｉｖｅ－Ｒｅｐｅａｔ Ｍｉｃｒｏ－Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ Ｇｅｎｅ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｄ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｅｖｅｒｅ ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ６，２１６－２３０．
Ｈａｎｌｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｍｅｌｔｚｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｂｕｚｈｄｙｇａｎ，Ｔ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｅｎａ－Ｅｓｔｅｖｅｓ，Ｍ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｅ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｔ．Ｐ．，Ｒａｚｍｐｏｕｒ，Ｒ．，Ｇｏｎｇ，Ｙ．，Ｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｒｏｂｕｓｔ ＣＮＳ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １５，３２０－３３２．
Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，Ｋａｔｚ，Ｎ．，Ｂｕｚａ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｙｅｒ，Ｃ．，Ｇｏｏｄｅ，Ｔ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｋ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１８）．Ｓｅｖｅｒｅ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＳＭＮ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２９，２８５－２９８．
Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｑ．，Ｋａｔｚ，Ｎ．，Ｂｕｚａ，Ｅ．Ｌ．，Ｂｅｌｌ，Ｐ．，ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．（２０１８）．Ｔｈｅ Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ Ａｒｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ Ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６，６６４－６６８．
Ｌｅｖｉｔｔ，Ｎ．，Ｂｒｉｇｇｓ，Ｄ．，Ｇｉｌ，Ａ．，ａｎｄ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎ．Ｊ．（１９８９）．Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙ（Ａ） ｓｉｔｅ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３，１０１９－１０２５．
Ｌｉ，Ｃ．，ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（２０２０）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２１，２５５－２７２．
Ｍａｃｋ，Ｄ．Ｌ．，Ｐｏｕｌａｒｄ，Ｋ．，Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｍ．Ａ．，Ｌａｔｏｕｒｎｅｒｉｅ，Ｖ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｒａｎｇｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｅｌｖｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｅｎａｒｄ，Ｊ．，Ｖｅｒｏｎ，Ｐ．，Ｂｕｓｃａｒａ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶ８－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｄｒｉｖｅｓ Ｗｈｏｌｅ－Ｂｏｄｙ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｏｔｕｂｕｌａｒ Ｍｙｏｐａｔｈｙ ｉｎ Ｄｏｇｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２５，８３９－８５４．
Ｍｅｎｄｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．，Ｓａｈｅｎｋ，Ｚ．，Ｌｅｈｍａｎ，Ｋ．，Ｎｅａｓｅ，Ｃ．，Ｌｏｗｅｓ，Ｌ．Ｐ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎ．Ｆ．，Ｉａｍｍａｒｉｎｏ，Ｍ．Ａ．，Ａｌｆａｎｏ，Ｌ．Ｎ．，Ｎｉｃｈｏｌｌ，Ａ．，Ａｌ－Ｚａｉｄｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７．ｍｉｃｒｏ－ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ ｉｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ Ｗｉｔｈ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ： Ａ Ｎｏｎｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．
Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｌ．，Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｙ．，Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．，ａｎｄ Ｓｔｅｄｍａｎ，Ｈ．Ｈ．（２０２０）．Ｂｒｏａｄｅｒ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｌｉｖｅｒ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｌｅｔｈａｌ Ｓｅｐｓｉｓ ｉｎ Ｔｗｏ Ｂｏｙｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｈｉｇｈ－Ｄｏｓｅ ＡＡＶ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２８，１７５３－１７５５．
Ｍｕｒｒｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｎａｕｇｈｔｏｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｍｅａｄｏｗｓ，Ａ．Ｓ．，Ｗａｒｅ，Ｔ．Ａ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｊ．，Ｂｒｅｍｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｌ．，Ｂｏｌｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒＡＡＶ９－ｈＮＡＧＬＵ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ ＩＩＩＢ： ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２５，７２－８４．
Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｈａｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｒｉｖｅｒａ，Ｒ．Ｍ．，Ｍａｄｈａｖａｎ，Ｓ．，Ｐａｎ，Ｘ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０３－４０７．
Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８４）．Ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｃａｎ ｂｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３０９，３０－３３．
Ｐｉｌｌａｙ，Ｓ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｎ．Ｌ．，Ｐｕｓｃｈｎｉｋ，Ａ．Ｓ．，Ｄａｖｕｌｃｕ，Ｏ．，Ｄｉｅｐ，Ｊ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｊａｅ，Ｌ．Ｔ．，Ｗｏｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｇａｍｉｎｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５３０，１０８－１１２．
Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ，Ｎ．，Ｓｈｅｎ，Ｓ．，Ｙａｄａｖ，Ｓ．，Ｄｅｂｂｉｎｋ，Ｋ．，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｌ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｓｏｋａｎ，Ａ．（２０１１）．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｌｉｖｅｒ－ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＡＶ９ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９，１０７０－１０７８．
Ｐｙｔｅｌａ，Ｒ．，Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １４０ ｋｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｆ ａ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ４０，１９１－１９８．
Ｒｏｓｅｍａｒｙ Ｃ Ｃｈａｌｌｉｓ，Ｓ．Ｒ．Ｋ．，Ｋｅｎ Ｙ Ｃｈａｎ，Ｃｏｌｌｉｎ Ｃｈａｌｌｉｓ，Ｍｉｎ Ｊ Ｊａｎｇ，Ｐｒａｄｅｅｐ Ｓ Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，Ｊｏｈｎ Ｄ Ｔｏｍｐｋｉｎｓ，Ｋａｌｙａｎａｍ Ｓｈｉｖｋｕｍａｒ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｅ Ｄｅｖｅｒｍａｎ，Ｖｉｖｉａｎａ Ｇｒａｄｉｎａｒｕ（２０１８）．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．ｂｉｏＲｘｉｖ．
Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９６）．ＲＧＤ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２，６９７－７１５．
Ｓａｌｖａ，Ｍ．Ｚ．，Ｈｉｍｅｄａ，Ｃ．Ｌ．，Ｔａｉ，Ｐ．Ｗ．，Ｎｉｓｈｉｕｃｈｉ，Ｅ．，Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ，Ｐ．，Ａｌｌｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｉｎｎ，Ｅ．Ｅ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｑ．Ｇ．，Ｂｌａｎｋｉｎｓｈｉｐ，Ｍ．Ｊ．，Ｍｅｕｓｅ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｒＡＡＶ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，３２０－３２９．
Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９９９）．ＡｌｐｈａＶｂｅｔａ５ ｉｎｔｅｇｒｉｎ： ａ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ５，７８－８２．
Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｗ．，Ｃｈｅｗ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｉｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，Ｍａｅｓｎｅｒ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｅ．Ｙ．，Ｘｉａｏ，Ｒ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０７－４１１．
Ｗｕ，Ｚ．，Ａｓｏｋａｎ，Ａ．，Ｇｒｉｅｇｅｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ，Ｌ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（２００６）．Ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｃａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｔｉｔｅｒ，ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ，ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８０，１１３９３－１１３９７．
Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．，Ｒｅｎｇｏ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．（２００８）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，１０７３－１０８０．
実施例７－種間で強力な筋指向性遺伝子送達を可能にする操作されたＡＡＶのカプシドバリアントのクラスの指向進化。
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は前臨床及び臨床研究におけるインビボ遺伝子置換療法及び遺伝子編集に最も一般的に使用される媒体であるが、それにもかかわらず、全身送達後の特定の組織の選択的形質導入は、いまだ課題である。天然に存在するカプシドを使用して生成した組み換えＡＡＶは、大部分は全身注射後に肝臓に隔離される。この隔離により、他の器官における形質導入効率が制限され（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｍｕｒｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）、骨格筋への遺伝素送達に特定の課題がもたらされる。筋肉は、全体重の最大４０％を構成することから、天然のカプシドバリアントによって筋肉に治療閾値を達成するには、極めて高いウイルス量（約２Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇ）を要し（Ｄｕａｎ，２０１８）、これは、ベクター製造にとって厄介な障害を生み出し、一部の最近の臨床試験で認められるように、治療制限毒性につながり得る（Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ．ａｌ．，２０２０）。
インビボ選択と連動したＡＡＶのカプシドタンパク質操作は、様々な組織への強力な遺伝子送達を可能にする有望なアプローチである。ＡＡＶのカプシドの指向進化戦略は、典型的には、様々な方法によって多様なカプシドライブラリを生成し、その後動物モデルにおいて所望の指向性を有するバリアントを選択することを含む。このアプローチは、いくつかの組織への送達のために最適化されたベクターを生成した（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｄａｌｋａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｋｏｒｂｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｘｉａｏ，２０１３）。
ＡＡＶの形質導入は、多段階プロセスであり、細胞表面の受容体への結合、細胞内移動、エンドソーム脱出、核移行、ベクターゲノムの第二鎖ＤＮＡ合成、及び導入遺伝子の発現を含み（（Ｂｅｒｒｙ ａｎｄ Ａｓｏｋａｎ，２０１６、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５）、図Ｓ１Ａ）、これらのステップのいずれかにおける効率の悪さがベクターの効力を制限する可能性がある。したがって、強力なカプシドの同定の成功には、すべての形質導入の段階を効率的に進行するバリアントを選択することが必要である。しかしながら、インビボカプシド指向進化戦略のほとんどは、成功したカプシドバリアントを、目的の組織において、導入遺伝子のｍＲＮＡではなく、ベクターゲノムＤＮＡの存在に基づいて選択する（Ｌｉ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２０２０）。ＡＡＶの形質導入に関与する遺伝子のコーディング配列及び発現における種特異的及び株特異的な差は、さらに別の課題を示し、特定のマウス株で選択されたカプシドバリアントは、他の株または他の種では強力な形質導入を得られない可能性がある（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１８）。したがって、異なる株及び種にわたる機能的カプシドバリアントのストリンジェントな選択を可能にする指向進化アプローチが非常に適切であり、必要である。
本実施例は、少なくとも、様々なカプシドライブラリの生成をストリンジェントな転写物ベースのインビボ選択と組み合わせ、指向進化を可能にし、続いて任意の目的の組織及び任意の動物モデルにおける機能的なカプシドバリアントを同定するＤＥＬＩＶＥＲ（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｃａｐｓｉｄｓ Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ＲＮＡ）戦略を説明及び実証する。本実施例は、マウス及び非ヒト霊長類における筋指向性カプシドの開発のためのＤＥＬＩＶＥＲの有用性を実証し、本発明者らの結果を、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関する遺伝子置換試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３６２５０２、ＮＣＴ０３３６８７４２、ＮＣＴ０３３７５１６４、及びＮＣＴ０３７６９１１６）で現在臨床的に使用されている天然に存在するＡＡＶのカプシドであるＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ７４と比較する。全体として、この筋指向性ベクターは、ＡＡＶ９と比較した場合、骨格筋及び心臓組織の両方の形質導入に関して優れた効力及び選択性を実証し、大幅に低い投薬量で治療効果をもたらし、マウス、ＮＨＰ、及びヒトの筋細胞にわたって形質導入効力が保存されている。マウス及びＮＨＰにおいて筋肉で濃縮されたバリアントカプシド配列の相互比較により、最上位のバリアント間で共通のＲＧＤモチーフが同定され、さらなる分析によって、ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの標的細胞発現との強力な相互作用及びそれに対する依存が明らかになった。総合すれば、本実施例は、治療法の発展及び横紋筋での試験のための特定の有用性を有するクラスのＡＡＶのカプシドバリアント、ならびに代替的な組織指向性を有するさらなるＡＡＶのファミリーの今後の進化のための実験的フレームワークを提供する。
結果
ＤＥＬＩＶＥＲを使用したＡＡＶ９のカプシドのインビボ進化は、筋指向性バリアントのクラスを識別する
本研究のためにデザインされたＡＡＶ９ベースのカプシドライブラリは、インビボでの使用のための高効力な筋指向性ベクターの同定を促進するいくつかの重要な特徴を含んでいた。第一に、各バリアントは、ＡＡＶ９のカプシドの超可変領域ＶＩＩＩのアミノ酸５８８と５８９の間に挿入されたランダム７量体ペプチドを含んでおり、すなわち、カプシド表面にこの可変領域ペプチド配列が露出するようにするデザインを含んでいた（（Ｂｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０２０、ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、図１４Ａ）。各バリアントはまた、ユビキタスプロモーターまたは細胞型特異的哺乳類プロモーターのいずれかの制御下でその独自のカプシド配列をコードする導入遺伝子を封入し、これにより、ウイルスライブラリの生成に使用されるＨＥＫ２９３細胞（図１４Ｂ）及びインビボ送達後にそのウイルスで形質導入される動物組織（図１４Ｃ～１４Ｄ）の両方での導入遺伝子（カプシドバリアント）の発現が可能になった。
異なるマウス組織を機能的に形質導入するカプシドバリアントを選択するためのＤＥＬＩＶＥＲのストリンジェンシーを、ユビキタスＣＭＶプロモーター下でカプシドバリアントを発現させたウイルスライブラリを使用して、最初にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて評価した。様々な組織において、このウイルスライブライに対してＤＮＡ及びｍＲＮＡレベルで濃縮されたバリアントを同定した。ベクターゲノムＤＮＡの存在に基づく選択と比較して、ｍＲＮＡ発現に基づくバリアントの選択では、少数精鋭の機能的カプシドが得られ（図２１Ａ～２１Ｇ）、標的細胞に物理的に侵入するカプシドバリアントのごく一部のみが、これらの細胞を機能的に形質導入して、それらがコードする導入遺伝子を発現することができることが示唆された。この知見と一致して、注射したウイルスライブラリに含まれる量が多いカプシドバリアントほど、注射された動物の肝臓でそのベクターのゲノムＤＮＡレベルではより多量に存在するが、ウイルスライブラリにおける各バリアントの量と、肝臓における同じバリアントに由来する導入遺伝子のｍＲＮＡレベルの間には、ほとんど相関がなかった（図２１Ｈ～２１Ｉ）。
次に、筋特異的プロモーターを強力な筋指向性カプシドバリアントの選択を増進するために使用することの実行可能性を評価した。骨格筋及び心筋は、いくつかの異なる細胞型を含むが、特に２つの細胞型、すなわち、筋線維及び心筋細胞への効果的な導入遺伝子の送達が可能なＡＡＶのカプシドが、遺伝的筋疾患に対する治療遺伝子送達にとって最も望まれている。インビボでこれらの細胞型で特異的に発現するバリアントの選択を可能にするため、本発明者らは、ＩＴＲ含有構築物を使用して、カプシドコーディング配列の発現を筋特異的ＣＫ８またはＭＨＣＫ７プロモーターによって制御したＨＥＫ２９３細胞でＡＡＶのカプシドライブラリを生成した。これらの構築物は、ユビキタスＣＭＶプロモーター下でカプシドを発現する構築物を使用して産生したものと同様のｒＡＡＶ力価を生じた（図１４Ｂ）。さらに、注射されたマウスの骨格筋及び心筋内で、ＣＫ８またはＭＨＣＫ７プロモーター下で発現したウイルスライブラリは、ＣＭＶ下で発現したものと比較して同様または高い導入遺伝子のｍＲＮＡ発現を生じ、筋線維及び心筋細胞を形質導入する機能的バリアントの同定を大きく促進した（図１４Ｃ～１４Ｄ）。
指向進化による二回のインビボ選択を行い、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの複数の異なる筋肉でＭＨＣＫ７プロモーターから発現したカプシドバリアントをスクリーニングした。第一回のウイルスライブラリのシーケンシングにより、５，０００，０００を超える固有のカプシドバリアントが同定された。第一回の選択後、本発明者らは、７種の筋肉（大腿四頭筋、前脛骨筋、腓腹筋、三頭筋、腹筋、横隔膜筋、及び心筋）で高発現した３０，０００バリアントを選択した（図１４Ａ及び１４Ｅ）。第二回のインビボ選択では、２つの対照を導入した。その第一は、同義コドン対照であり、ここでは、一次スクリーニングから選択された各バリアントに対して同定された同じ７量体挿入ペプチドが、同義ＤＮＡコドンを使用してコードされている。第二は、発現対照であり、ここでは、二連のウイルスライブラリを、２つの骨格筋特異的プロモーター、すなわち、ＣＫ８またはＭＨＣＫ７のいずれかの下でこれらのバリアントを発現させるために生成した（図１４Ａ）。
著しくは、第二回の選択では、ＣＫ８またはＭＨＣＫ７ライブラリのいずれかから筋肉で高度に発現した最上位の１２カプシドバリアントのすべてが、この７量体挿入の最初の３つのアミノ酸位置に同じアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフを含んでいた。さらに示唆されるのは、それらの優れた筋肉の形質導入におけるこれらカプシドバリアントに含まれる特定のペプチド配列、すなわち、ＣＫ８群では最上位１２のうちの１０ヒット及びＭＨＣＫ７群では最上位１２のうちの８ヒットが同義対に由来した（すなわち、同義ＤＮＡコドンによってコードされた対応するバリアントも、最上位の１２の筋発現バリアント内に含まれていた）（図１４Ｆ）。
最上位５つの固有のＲＧＤ含有カプシドバリアントを使用して産生したｒＡＡＶの力価を定量化し、これらの操作されたカプシドをインビボ研究に使用することの実行可能性を評価した。ｒＡＡＶの力価の比較は、これら最上位５つのＲＧＤ含有カプシドバリアントとその親ＡＡＶ９のカプシドとの間に有意な差を示さなかった（図２２Ｅ）。最上位１２のＲＧＤ含有ヒットからの各位置でコンセンサスアミノ酸ともマッチするＲＧＤＬＴＴＰ（配列番号１２）ペプチドの挿入を含むバリアントをさらなる特性評価に選択し、このバリアントを「ＭｙｏＡＡＶ １Ａ」と指定した（これは、本明細書の他の箇所ではＭｙｏＡＡＶとも呼ばれる）。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、全身投与後に高効率でマウス筋を形質導入する
ＭｙｏＡＡＶ １Ａを使用して生成したｒＡＡＶの形質導入プロファイル及び生体内分布を全身投与後の異なるマウス組織で調べるために、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１Ｅ＋１２ｖｇ（約４Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射し、注射の２週後に、異なる組織での導入遺伝子の発現及びベクターゲノム量を分析した。採取した組織の全載蛍光画像は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して、はるかに高い蛍光強度を示した（図１５Ａ及び２２Ａ）。重要なことには、ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、多くの遺伝的筋疾患の主要な罹患器官である心臓を、ＡＡＶ９よりも効果的に形質導入した。ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウスの筋線維及び心筋細胞における強力な導入遺伝子の発現を、免疫蛍光分析によってさらに確認した（図１５Ｂ及び２２Ｂ）。意外なことに、ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、全身送達後の肝臓で比較的減少した形質導入を示し、ＡＡＶ９と比較して、このバリアントに関する肝臓標的解除の形質導入プロファイルが示唆された（図１５Ａ～１５Ｃ）。
オス及びメスのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの異なる骨格筋でのＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定量化は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して１０～２９倍高い導入遺伝子の発現を示した（図１５Ｃ）。ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した動物の心臓では６．３倍であり、肝臓では２．８分の１であった（図１５Ｃ）。とりわけ、ＭｙｏＡＡＶ １Ａによって改善された形質導入効率は、横紋筋組織に限られており、この操作されたカプシドバリアントは、注射した動物の肺、腎臓、脾臓、及び脳には、ＡＡＶ９と比較して、同様または低い効率で形質導入した（図１５Ｃ及び２２Ｃ）。ウエスタンブロット分析により、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した動物の腓腹筋及び三頭筋で劇的に高いＥＧＦＰタンパク質の発現及び肝臓で低いＥＧＦＰ発現が確認された（図２２Ｊ）。生体内分布分析により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＡＡＶ９より効果的に、ベクターゲノムをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腹筋以外のすべての筋肉に送達し、全身投与後の肝臓に有意に低い数のベクターゲノムをもたらすことが実証された（図２２Ｄ）。
異なるマウス株におけるＭｙｏＡＡＶ １Ａの全身投与後の筋肉の形質導入効率を評価するため、ＢＡＬＢ／ｃＪ及びＤＢＡ／２Ｊのバックグラウンドからのオス及びメスに、１Ｅ＋１２ｖｇ（約４Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射し、注射したマウスの異なる組織における導入遺伝子の発現を比較した。全器官画像及びＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定量化により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの強力な筋肉形質導入及び肝臓標的解除特性が、ＢＡＬＢ／ｃＪ及びＤＢＡ／２Ｊマウスにも及ぶことが分かった（図２９Ａ～２９Ｅ）。
ＡＡＶ９と比較したＭｙｏＡＡＶ １Ａの筋肉内送達後の筋肉の形質導入効率も評価した。２Ｅ＋１０ｖｇのＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰのＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＴＡ筋への筋肉内投与により、ＡＡＶ９を注射したマウスの筋肉と比較して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した筋肉において、ウエスタンブロット及び免疫蛍光で分析して、１４倍のＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現、及び劇的に高いＥＧＦＰタンパク質の発現がもたらされた（図２２Ｅ～２２Ｆ及び２２Ｋ）。
全身ＭｙｏＡＡＶ １Ａ投与後の肝臓障害の可能性を調べるため、本発明者らは、媒体（食塩水）、または１Ｅ＋１２ｖｇ（約４Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ１Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）酵素のレベルを、注射前、ならびに注射の１４日及び２８日後に測定した。ＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射したマウスの血清におけるＡＬＴ及びＡＳＴ酵素のレベルは、媒体を注射した動物と比較して有意差はなく、本発明者らが注射した用量では肝臓障害がほとんどないことが示唆された（図２２Ｇ、２２Ｈ）。ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＥＧＦＰを注射したマウスから単離された血清によるＡＡＶ９及びＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入の阻害の分析により、ＡＡＶ９に対して産生された抗体が、ＭｙｏＡＡＶ １Ａと交差反応し、逆もまた同様であることが実証された（図２９Ｋ～２９Ｌ）。
次に、ヒト骨格筋の形質導入におけるＭｙｏＡＡＶ １Ａの効率を分析した。４人の異なるドナー（男性２名及び女性２名）に由来するヒト一次筋管に、インビトロでＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＫ８－ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）を形質導入した。ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、ＡＡＶ９よりも３５～５２倍効率的に異なるドナー由来の筋管を形質導入した（図１５Ｄ）。ＭｙｏＡＡＶ １Ａはまた、ＡＡＶ９と比較して、２３倍の効率でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスのマウス一次筋管を形質導入した（図１５Ｄ）。
さらに、ＭｙｏＡＡＶ １Ａによる筋幹細胞（衛星細胞）形質導入の効率を、６か月齢のｍｄｘ－Ａｉ９マウスにおける静脈内投与後に評価した。これらのジストロフィン欠損マウスは、ヒトＤＭＤに対する遺伝モデルであり、さらにＣｒｅ活性化型ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を担持し、これが、ＣｒｅをコードするＡＡＶによる形質導入のためのレポーターの役割を果たす。ＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｃｒｅを注射したマウスの筋肉からの衛星細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを投与された動物において、有意に高いパーセンテージの衛星細胞の形質導入を示した（図２２Ｉ～２２Ｋ）。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａの全身送達後のインビボ遺伝子発現の速度を調べるため、成体ＢＡＬＢ／ｃＪマウスに、４Ｅ＋１１ｖｇ（約１．６Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）を注射し、注射後１２０日にわたって異なる時点で全身生物発光画像法を行った。ＭｙｏＡＡＶ １Ａを投与されたマウスは、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９を注射したマウスと比較して、四肢及び体全体での導入遺伝子の発現の速度が速く、全レベルが有意に高かった（図１６Ａ～１６Ｂ）。注射の４か月後に採取したマウスの筋肉からの全器官生物発光画像法により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した動物の筋肉で、劇的に高いルシフェラーゼ発現が確認された（図２９Ｍ～２９Ｏ）。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａが効果的にＤＢＡ／２Ｊ及びＢＡＬＢ／ｃＪのバックグラウンドからのマウスにおける全身投与後の異なる骨格筋を形質導入すること、及び筋肉内送達後の筋肉の形質導入において極めて強力であることをさらに裏付けるさらなる結果を図２９Ｆ～２９Ｌに示す。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａを使用した治療用導入遺伝子の全身投与は、ＤＭＤ及びＸ連鎖筋細管ミオパシー（ＸＬＭＴＭ）のマウスモデルの機能改善につながる
ＭｙｏＡＡＶ １Ａを治療用導入遺伝子のインビボ送達のために使用することの実行可能性を調べるため、成体ｍｄｘマウス（Ｄｍｄのエクソン２３にナンセンス変異を担持するＤＭＤのマウスモデル）に、ＳａＣａｓ９をコードする構築物を担持するＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶ １Ａを、ｍｄｘ変異の５’及び３’を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とともに注射した（図２４Ａ～２４Ｂ）。本出願者らは、このＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介アプローチが、ｍｄｘ細胞のゲノムからエクソン２３を切除し、切断されているが依然として機能型のジストロフィンタンパク質の発現を筋肉でもたらすことを以前に示した（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。切断型バリアントを産生する一方で、このインフレーム欠失により、機能的タンパク質が作られるため、ＤＭＤに治療効果がもたらされる。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲにより、エクソン２３欠失Ｄｍｄ ｍＲＮＡが、異なるｍｄｘ筋において、全Ｄｍｄ ｍＲＮＡの３．４％～２５％に及ぶ効率で産生された。対照的に、同量のＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスの筋肉でのエクソン２３欠失ｍＲＮＡの産生の効率は、１．３％～８．７％に及ぶのみであった（図４Ｃ）。ＳａＣａｓ９及びｇＲＮＡ発現の定量化により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ注射マウスの筋肉においては、ＡＡＶ９注射動物と比較して、６．７～１９倍高いＳａＣａｓ９発現及び３．５～７．８倍高いｇＲＮＡ発現が示された（図２４Ｆ、２４Ｃ）。
いくつかの知見は、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲでのジストロフィン発現の優れたレスキューを指摘している。免疫蛍光及びウエスタンブロット分析により、ＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲと比較して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したマウスの筋肉でのジストロフィンの復元がより高く、広がっていることが確認された（図１８Ｉ～１８Ｊ及び２４Ｆ）。ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを投与した動物の前脛骨筋（ＴＡ）の生理的評価により、媒体またはＡＡＶ９－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ注射対照のいずれかと比較した場合、ＭｙｏＡＡＶ １－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲを注射したｍｄｘマウスにおいて有意に高い比筋力（図４Ｄ）及び遠心性収縮後の筋力の低下のパーセントの減少（図１８Ｅ）が実証された。したがって、ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、従来の広く使用されているＡＡＶ９と比較して、筋肉への治療遺伝子編集複合体の送達に関して顕著に高い効力を示す。
低用量の全身投与後の遺伝子置換に関するＭｙｏＡＡＶ １Ａの性能を、ＸＬＭＴＭのマウスモデルでさらに評価した。Ｍｔｍ１ノックアウト（ＫＯ）マウスは、ＸＬＭＴＭの優れた遺伝及び表現型モデルを提供し、それらは、著明な筋肉疲労、運動機能の喪失及び寿命の劇的な短縮を示す。４週齢のＭｔｍ１ ＫＯマウスに、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＭＨＣＫ７プロモーターの制御下で発現されるヒトＭＴＭ１（ｈＭＴＭ１）をコードするＡＡＶ９またはＭｙｏＡＡＶ １Ａを注射した（図２４Ｅ）。本発明者らは、８か月にわたって各群に関して体重、活動、及び生存を測定した（図１８Ｆ）。この実験で本発明者らが使用したウイルスの量は、ＸＬＭＴＭに関する現在進行中のヒトでの臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３１９９４６９）で使用されている量の５０～１５０分の１であり、ＸＬＭＴＭ遺伝子治療に関してすでに公開されている前臨床試験（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｅｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）で使用された量の１５～２５０分の１であった。
ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスは、機能及び生存に著しい改善を示した。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスはすべて、活動が最小限であり、注射後１１～２１週で人道的な安楽死の終点に達した。対照的に、同量のＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスはすべて、野生型マウスと同様の軌道で生存し、この試験を通してＡＡＶ９を注射したマウスと比較して体重も増加し、著しく活動的であった（図２９Ｇ～２９Ｊ及び２４Ｇ）。注射したマウスの腓腹筋、大腿四頭筋、心臓、及び肝臓におけるＡＡＶ投与の４週後のｈＭＴＭ１ ｍＲＮＡ発現及びベクターゲノムの生体内分布の定量化により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射した動物と比較して、有意に高い導入遺伝子の発現及びｖｇ／ｄｇが示された一方、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスの肝臓のｈＭＴＭ１の発現及びｖｇ数／ｄｇは、ＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射した動物より低かった（図１７Ｌ及び１７Ｍ）。ウエスタンブロット分析により、媒体またはＡＡＶ９－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射した対照のいずれかと比較して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスの腓腹筋及び大腿四頭筋において高いｈＭＴＭ１タンパク質の発現が確認され（図１７Ｎ）、長趾伸筋（ＥＤＬ）の生理分析により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＭＨＣＫ７－ｈＭＴＭ１を注射したマウスにおいて有意に高い比筋力が示された（図１７Ｏ）。
それぞれ、ＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルにおけるＭｙｏＡＡＶ－Ｄｍｄ ＣＲＩＳＰＲ及びＭｙｏＡＡＶ－ヒトＭＴＭ１の全身投与からのさらなる結果を、図１７Ａ～１７Ｉ及び１７Ｋに示す。ＭｙｏＡＡＶ １Ａは、マウス及びヒト一次筋管の形質導入に関してインテグリンヘテロダイマーに依存している。
この選択からのＭｙｏＡＡＶ及び他の最上位のバリアントのすべてにおけるＲＧＤモチーフの存在を考慮して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ形質導入におけるＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの役割を評価した。このＲＧＤモチーフは、１９８４年に、その受容体に対する結合を促進するフィブロネクチンの最小配列として最初に認められ、後にインテグリンヘテロダイマーα５β１として同定された（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，１９８４、Ｐｙｔｅｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ＲＧＤは、その後、いくつかの異なるインテグリンヘテロダイマー、具体的には、αＩＩｂβ３、α５β１、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、及びαＶβ８の認識モチーフとして同定された（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。これら８つのヒトＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの各々をコードするプラスミドまたは対照としてのｐＵＣ１９プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃの形質導入効率を比較した。α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、またはαＶβ８の過剰発現により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入効率は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、ｐＵＣ１９トランスフェクト対照と比較して増加した（図１８Ｉ及び２５Ａ～２５Ｋ）。
次に、異なるインテグリンヘテロダイマーがＭｙｏＡＡＶ １Ａの細胞表面への結合効率に与える影響を、過剰発現実験を通して分析した。これら８つのＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの各々またはｐＵＣ１９対照プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の表面に結合したベクターゲノムを定量したところ、αＶβ６、及び比較的程度は小さいが、α８β１及びαＶβ１が、ＭｙｏＡＡＶ １Ａのインテグリントランスフェクト細胞への結合をｐＵＣ１９トランスフェクト対照と比較して高めることが分かった（図１８Ｊ）。２つの異なるｐａｎ－αＶインテグリンアンタゴニスト（ＣＷＨＭ－１２及びＧＬＰＧ－０１８７）が一次細胞におけるＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入効率に与える影響もまた調べた。両方の阻害剤がマウス（図２６Ａ及び２６Ｊ）とヒト（図１８Ｋ、１８Ｄ及び２６Ｃ～２６Ｈ）の両一次骨格筋の筋管において用量依存的にＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入を妨げたが、ＡＡＶ９の形質導入効率に対する用量依存効果を有した阻害剤はなかった。これらの結果は、αＶ含有インテグリンヘテロダイマーの阻害により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａがマウス及びヒトの両一次筋管を形質導入する能力がほとんど完全に排除されることを実証する。
個々のαＶ含有インテグリンヘテロダイマーがＭｙｏＡＡＶ １Ａの結合親和性に与える影響をさらに明らかにするために、本発明者らは、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）組み換えタンパク質とともにＭｙｏＡＡＶ １ＡまたはＡＡＶ９を予備インキュベートした後、ヒト一次筋管をこれらのウイルスで形質導入した。意外なことに、αＶβ６の濃度を増加させてＭｙｏＡＡＶ １Ａを予備インキュベートすることにより、ヒト一次筋管の形質導入が用量依存的に阻害されるが、本発明者らが調べた他の組み換えタンパク質のいずれも、ＭｙｏＡＡＶ １ＡまたはＡＡＶ９のいずれかによる細胞の形質導入に用量依存的な効果を有さなかった（図１８Ｅ、１８Ｆ）。反対に、ヒト筋管を抗αＶβ６抗体の濃度を増加させて予備インキュベートすることにより、ＭｙｏＡＡＶ １Ａによる形質導入効率は用量依存的に減少し、ＡＡＶ９による筋管の形質導入には影響を与えなかった（図１８Ｇ、１８Ｌ）。これらのデータは、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入を促進する能力を有するαＶ含有インテグリンヘテロダイマーの中でも、αＶβ６は、このカプシドバリアントに対する結合の親和性が最も高いことを示唆している。さらに、αＶβ６は、ＭｙｏＡＡＶ １Ａによるそれらの最適な形質導入を可能にするためにヒト筋細胞の表面で利用可能であるはずである。
細胞へのＡＡＶ９の形質導入及び結合における末端シアル酸を有するグリカンの重要性（Ｂｅｌｌ ｅｔ． ａｌ．，２０１１）を考慮して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入及び結合におけるグリカン及びシアル酸の役割を次に評価した。細胞表面でグリカンへのシアル酸の結合を切断するノイラミニダーゼ（ＮＡ）でＨＥＫ２９３細胞を処理することにより、未処理の対照と比較して、処理した細胞に対して、ＭｙｏＡＡＶ １Ａによって１７２倍高い形質導入及び４倍効率的な結合がもたらされた（図２６Ｋ、２６Ｌ）。ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入及び結合に末端ガラクトースが重要であるかどうかをさらに調べた。細胞表面の末端ガラクトースに結合するＥｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉレクチン（ＥＣＬ）を、ＮＡ処理ＨＥＫ２９３細胞に加えることで、ＡＡＶ９及びＭｙｏＡＡＶ １Ａの両方による結合及び形質導入を大きく阻害したが、ＡＡＶ２の結合及び形質導入には影響を与えなかった（図２６Ｍ、２６Ｎ）。これらの結果により、ＡＡＶ９と同様、細胞へのＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入及び結合は、細胞表面のシアル酸の除去及びガラクトースの露出によって増進されることが実証された。
以前に同定されたＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）へのＭｙｏＡＡＶ １Ａ形質導入の依存性を評価した。ＡＡＶＲは、ＡＡＶ４及びＡＡＶｒｈ３２．３３以外の最も知られたＡＡＶ血清型の効果的な形質導入に必要な急速に細胞内に取り込まれる細胞膜タンパク質である（Ｄｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８、Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲノックアウト（ＫＯ）及び親ＨＥＫ２９３ＦＴ野生型（ＷＴ）細胞をＡＡＶ４－、ＡＡＶ２－、ＡＡＶ９－、またはＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入したところ、ＡＡＶ２及びＡＡＶ９と同様に、ＭｙｏＡＡＶの形質導入は、ＡＡＶＲの発現を必要とすることが分かった（図２６Ｏ）。
インテグリンヘテロダイマー及びＡＡＶＲが、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入において重複した役割を果たすかどうかを調べるため、本発明者らは、α８β１、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、またはαＶβ８をＡＡＶＲの過剰発現の存在下または非存在下でＨＥＫ２９３ＦＴ ＡＡＶＲ ＫＯ細胞で過剰発現させ、その後その細胞をＭｙｏＡＡＶ １Ａ－ＣＭＶ－Ｎｌｕｃで形質導入した。これらの結果は、インテグリンヘテロダイマーの過剰発現によりＡＡＶＲ ＫＯ細胞で、モックトランスフェクト対照と比較してＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入効率が増加する一方、インテグリンの過剰発現は、ＡＡＶＲを過剰発現するＡＡＶＲ ＫＯ細胞またはＷＴ ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞で観察されたレベルまで形質導入をレスキューするには十分ではないことを実証した（図２６Ｉ）。このデータは、インテグリンヘテロダイマーとＡＡＶＲは、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの形質導入において異なる役割を果たすこと及び異なる段階で利用される可能性があることを示唆している。
ＤＥＬＩＶＥＲを使用したインビボ進化のさらなる回により、第二世代のＲＧＤ含有筋指向性バリアントがマウスにおいて生成される
ＭｙｏＡＡＶ １Ａによる筋管の形質導入に対するＲＧＤモチーフのインテグリンヘテロダイマーとの相互作用の重要性を考慮して、このモチーフに隣接するアミノ酸を修飾することにより、この相互作用を改善することができ、さらにいっそう強力な筋指向性カプシドバリアントが生成されると仮定した。ＭｙｏＡＡＶ １Ａの超可変領域ＶＩＩＩ表面ループの予測構造に基づいて、本発明者らは、このＲＧＤモチーフの上流の５８６、５８７、及び５８８位ならびに下流の５９２、５９３、５９４、及び５９５位のアミノ酸を、ＭｙｏＡＡＶ １Ａの表面ループに配置される可能性があるとして同定した（図１９Ａ）。各々５８９、５９０、及び５９１位でＲＧＤモチーフを固定し、上記の隣接位置に様々なアミノ酸を有する多様なカプシドのライブラリを次いで生成した（図１９Ｂ）。
ＤＥＬＩＶＥＲを使用した筋指向性バリアントに関する二回のインビボ選択をＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びｍｄｘマウスで行った。第二回のＲＧＤ固定ウイルスライブラリを、２つの異なる用量（１匹あたり１Ｅ＋１２ｖｇ及び１Ｅ＋１１ｖｇ）で注射し、高用量及び低用量の両方で筋肉組織を効率的に形質導入するバリアントを同定した（図１９Ｂ）。これらの選択から本発明者らの最上位のヒットのうち、グリシン及びアラニンが５８８位で濃縮され、グルタミンが５９２位で濃縮されることが分かった。ＧＰＧＲＧＤＱＴＴＬ（配列番号２）配列を含むバリアントが、第二回の選択から１Ｅ＋１２と１Ｅ＋１１の両用量で最も厳選された筋指向性カプシドとして浮上した（図１９Ｂ）。この第二世代のバリアントを、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａと指定し（本書ではＥＭｙｏＡＡＶまたは改良されたＭｙｏＡＡＶとも呼ばれる）、これをさらなる特性評価に用いた。
ＭｙｏＡＡＶ ２Ａの形質導入効率を、低用量のウイルスの全身送達後に異なるマウス組織で評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、２Ｅ＋１１ｖｇ（約８Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ９－、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ－、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＭＶ－ＥＧＦＰを注射し、異なる組織での導入遺伝子の発現及びベクターゲノムの生体内分布を分析した。全組織の蛍光画像は、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａによる全身遺伝子送達により、高いレベルの導入遺伝子の発現が異なる骨格筋にわたってＭｙｏＡＡＶ １ＡまたはＡＡＶ９と比較してもたらされることを実証した（図１９Ｃ～１９Ｄ）。ＥＧＦＰ ｍＲＮＡの定量化により、ＭｙｏＡＡＶ ２ＡがＡＡＶ９よりマウス骨格筋を１０～８０倍効率的に、及び心臓を１７倍効率的に形質導入することが明らかになった。さらに、導入遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射した動物の肝臓では、ＡＡＶ９を注射したマウスと比較して２．５分の１であった（図１９Ｅ）。同様に、ベクターゲノムの生体内分布分析により、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したマウスは、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、骨格筋及び心臓では有意に高いｖｇ／ｄｇを有し、肝臓では有意に低いｖｇ／ｄｇを有することが示された（図１９Ｌ）。
次に、ヒト一次筋管の形質導入に関するＭｙｏＡＡＶ ２Ａの効率及びインテグリン依存性。意外なことに、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａは、ヒト一次筋管をＡＡＶ９と比較して１２８倍効率的に、及びＭｙｏＡＡＶ １Ａより４．１倍高く形質導入した（図１９Ｆ）。ｐａｎ－αＶインテグリンアンタゴニストＧＬＰＧ－０１８７の濃度を増加させると、用量依存的にＭｙｏＡＡＶ ２Ａの形質導入効率が低下し（図１９Ｇ）、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａの感染性が、標的細胞で発現されるαＶ含有インテグリンヘテロダイマーに依然として依存することが確認された。
異なる個々のαＶインテグリンヘテロダイマーに関するＭｙｏＡＡＶ ２Ａの結合親和性を評価するために、本発明者らは、ＭｙｏＡＡＶ ２ＡまたはＡＡＶ９を、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）組み換えタンパク質とともに予備インキュベートした後、ヒト一次筋管を形質導入した。興味深いことに、及びＭｙｏＡＡＶ １Ａを用いたこれらの同じアッセイで得られた結果（図１８Ｅ）とは対照的に、調べた４種すべてのαＶ含有インテグリンヘテロダイマーは、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａによるヒト筋管の形質導入を用量依存的に阻害した（図１９Ｈ）一方、ＡＡＶ９の形質導入には用量依存効果はなかった（図１９Ｉ）。この結果は、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａに含まれるアミノ酸置換が、主にαＶβ６に依存するＭｙｏＡＡＶ １Ａと比較した場合に、より広いクラスのαＶインテグリンヘテロダイマーへのより高親和性結合を可能にすることを示唆している。
マウスにおいてＤＥＬＩＶＥＲを使用して進化させた最上位の第一世代及び第二世代のカプシドバリアントの依存性をαＶβ６ヘテロダイマーについて試験した。ヒト一次筋管を抗αＶβ６抗体とともに予備インキュベートした後、最上位の第一世代（ＭｙｏＡＡＶ １Ａ、ＭｙｏＡＡＶ １Ｂ、ＭｙｏＡＡＶ １Ｃ、ＭｙｏＡＡＶ １Ｅ、ＭｙｏＡＡＶ １Ｆ）及び第二世代（ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ｂ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ｃ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ｄ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ｅ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ｆ）マウスバリアントでこれらの細胞を形質導入した。抗体結合は、これらのバリアントのすべてによってある程度までヒト筋管の形質導入を阻害したが、第一世代のカプシドは、筋管の形質導入に関してαＶβ６に有意により大きく依存していた（図１９Ｍ）。
ＭｙｏＡＡＶ ２Ａは、低用量のウイルスの注射後に大きな治療可能性を示す
ヒト神経筋疾患に対して現在臨床試験中であるカプシドと比較して、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａの潜在的な今後の治療関連度を評価するため、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａの形質導入効率を、ＤＭＤに関して現在進行中の臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３６２５０２、ＮＣＴ０３３６８７４２、及びＮＣＴ０３７６９１１６）において調査中のＡＡＶ９とＡＡＶｒｈ７４の両方と比較した。筋特異的ＭＨＣＫ７プロモーターから発現され、ＡＡＶｒｈ７４ベクターを使用して送達される機能補完ジストロフィンミニ遺伝子（マイクロジストロフィンと呼ばれる）の全身投与は、４人のＤＭＤ患者を含めた最近報告されたヒト臨床試験で有望な結果を示している。この試験では、２Ｅ＋１４ｖｇ／ｋｇの高ウイルス量の投与により、筋肉での導入遺伝子の発現及び疾患表現型の機能改善がもたらされた（Ｍｅｎｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ＭｙｏＡＡＶ ２Ａによる遺伝子送達を、ＡＡＶｒｈ７４とＡＡＶ９の両ベクターのものと比較し、さらにＤＭＤのＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスモデルにおいて性能を調べた。縦方向のインビボ画像化実験において、本発明者らは、成体ＢＡＢＬ／ｃＪマウスに、低用量（２Ｅ＋１１ｖｇ、約８Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを意味する）のＣＭＶ－Ｆｌｕｃレポーター遺伝子をコードするＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ９、またはＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射した。ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したマウスは、ＡＡＶｒｈ７４またはＡＡＶ９を投与されたマウスと比較して、劇的に高い生物発光シグナルを四肢及び体全体で示した（図１９Ｊ～１９Ｋ）。次に、マイクロジストロフィン導入遺伝子（ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧ）を担持するＭｙｏＡＡＶ ２ＡまたはＡＡＶ９のＤＭＤのＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスモデルへの全身送達を、同じ低用量（２Ｅ＋１３ｖｇ／ｋｇ）の各ＡＡＶを使用して調べた。ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射した動物は、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、複数の筋肉群において、筋細胞膜に局在した、比較的大きな、より広がったマイクロジストロフィンの発現を示した（図２０Ａ）。ウエスタンブロットにより、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したマウスの筋肉において、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して、高レベルのマイクロジストロフィンタンパク質が確認された（図２０Ｂ）。定量的ＲＴ－ＰＣＲにより、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧを注射したマウスの骨格筋において、ＡＡＶ９－ＣＫ８－マイクロジストロフィン－ＦＬＡＧと比較して、７．６～１５倍高いレベルのマイクロジストロフィンｍＲＮＡが示された（図２０Ｃ）。
最後に、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したマウスにおけるベクターゲノム量及び筋機能を、ＡＡＶ９を注射した動物と比較して評価した。ＭｙｏＡＡＶ ２Ａは、ＡＡＶ９と比較して、ＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスの骨格筋では、１２～４６倍の数のｖｇ／ｄｇを送達し、肝臓では、２．５分の１のｖｇ／ｄｇを送達した（図２０Ｄ）。著しくは、ＡＡＶ９を注射した動物では、ｖｇ数／ｄｇが筋肉と比較して肝臓で４０倍を超えた一方で、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したマウスでは、肝臓と筋肉では同様のレベルであった。比筋力及び遠心性損傷後の筋力の低下のパーセントの定量化により、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａを注射したＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘマウスのＴＡ筋が、同量のＡＡＶ９を投与されたマウスの筋肉及び媒体を注射した動物と比較して、有意に高い比筋力を回復したこと、及び損傷からの保護の程度がより大きいことが実証された（図２０Ｅ～２０Ｆ）。
インビボ指向進化により、カニクイザルにおける最上位のヒットとしてカプシドバリアントのＭｙｏＡＡＶクラスが同定される
ＮＨＰにおいて、全身投与後に強力な筋指向性遺伝子送達を可能にするカプシドバリアントを同定するために、ＡＡＶ９のインビボ指向進化を、ＤＥＬＩＶＥＲを使用してカニクイザルにおいて行った。５８８位でのランダム７量体ペプチドの挿入から開始する２回のインビボ選択で、最上位のヒットとしてＲＧＤモチーフを含む６個のバリアントが同定された（図２８Ａ）。これらの結果により、全身投与後の霊長類におけるＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドの高筋指向性の証拠が提供された。種間で強力な筋肉の形質導入を可能にするさらに進化したＭｙｏＡＡＶクラスのバリアントを選択するために、マウスにおける本発明者らの第一回のＲＧＤ固定選択から同定された最上位１２０，０００バリアントを使用してＮＨＰにおけるインビボ選択の回を行った（図２８Ｂ）。興味深いことに、本発明者らがＮＨＰにおいて同定した最上位のヒットにおいてＲＧＤモチーフ後の最初の位置でチロシンが濃縮されていることが分かった。
ＮＨＰで同定された筋指向性が最も高いバリアント（ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ～Ｆ及びＭｙｏＡＡＶ４Ａ～Ｅ）、ならびに高効率でヒト一次筋管を形質導入したマウスで同定された４つの筋指向性バリアント（ＭｙｏＡＡＶ １Ｃ、ＭｙｏＡＡＶ １Ｅ、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａ、及びＭｙｏＡＡＶ ２Ｅ）の形質導入効率（図２８Ｃ）を、マウス及びＮＨＰでＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶ９とともに評価した。ＣＢｈプロモーターの制御下でヒトフラタキシン（ｈＦＸＮ）導入遺伝子をコードするため、ｒＡＡＶを、各々のカプシドバリアント、ならびにＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶ９を使用して生成した。これらのカプシドの各々を用いて産生した組み換えＡＡＶは、導入遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に固有のバーコードのセットを含んでいた（図２８Ｄ）。等しい力価のこれら１７ウイルスすべてを含むｒＡＡＶのプールを調製し、そのプールを次いでカニクイザル及びマウスの両方に投与した。ＮＨＰの異なる組織における導入遺伝子のｍＲＮＡ発現の定量化により、カニクイザルでは、ＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶ９と比較して、異なる骨格筋の形質導入においてＭｙｏＡＡＶ ４Ａ、ＭｙｏＡＡＶ ４Ｅ、ＭｙｏＡＡＶ ３Ａ、及びＭｙｏＡＡＶ ４Ｃが最も強力なバリアントであることが同定された（図２８Ｄ～２８Ｅ及び３０Ｂ）。これら４つのバリアントはまた、ＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶ９と比較して、異なるマウスの骨格筋も極めて効果的に形質導入し、マウス及びＮＨＰの両方において、肝臓を標的解除する（図３０Ａ及び２８Ｅ）。
最上位４つのカプシドの生産収率を評価するために、本発明者らは、最上位４つのバリアントならびにＡＡＶｒｈ７４及びＡＡＶ９でｒＡＡＶを６つの異なる導入遺伝子を使用して産生した。ＡＡＶ９は、本発明者らが調べたカプシドの中で最良のプロデューサーであり、ＭｙｏＡＡＶバリアントのすべてがＡＡＶｒｈ７４と比較して、同様または高いウイルス力価を生じた（図２８Ｆ）。
これら最上位４つのカプシドバリアントの形質導入の依存度及び親和性を次に、αＶインテグリンヘテロダイマーで評価した。ＧＬＰＧ－０１８７の濃度を増加させると、ヒト一次筋管においてこれら４つのバリアントのすべての形質導入が用量依存的に減少した（図２８Ｇ）。これらのカプシドバリアントを、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ６、αＶβ８、またはＭＢＰとともに予備インキュベートすることにより、これら４つの最上位のバリアントのすべてが、αＶβ６に対して最も高い親和性を有し、αＶβ８及びαＶβ３がそれに続くことが示された（図２８Ｈ～２８Ｉ）。これらの結果と一致して、αＶβ６抗体の濃度を増加させてヒト一次筋管を処理することにより、これら４つのバリアントのすべてにより、形質導入が用量依存的に減少した（図２８Ｊ）。さらに、これら最上位の４つのバリアントの形質導入効率をＡＡＶＲ ＫＯ及び野生型細胞で分析することにより、これらのすべてのバリアントが、形質導入に関してＡＡＶＲに依存することが明らかになった（図２８Ｋ）。
最後に、ＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントのαＶβ６に対する高い依存性及び親和性を考慮して、本発明者らは、αＶとのみヘテロダイマーを形成する（Ｈｙｎｅｓ，２００２）インテグリンβ６の発現を、マウス、ＮＨＰ及びヒト筋肉で分析した。免疫蛍光分析により、３種すべてからの筋肉において、インテグリンβ６の発現が示された（図３０Ｃ）。
考察
本実施例は、少なくとも、任意の組織及び／または目的の細胞型への強力な遺伝子送達に効果的なＡＡＶのカプシドバリアントを操作及び選択するための戦略を説明及び実証する。ＤＥＬＩＶＥＲは、ストリンジェントかつ広く適用可能ＡＡＶのカプシド操作戦略に必要な３つの重要な特徴を組み合わせている：（ｉ）ＤＥＬＩＶＥＲは、インビボで細胞に物理的に結合または侵入するだけでなく、その組織を機能的に形質導入し、それらの導入遺伝子を特定の細胞型で発現するカプシドバリアントの選択を可能にする。（ｉｉ）ＤＥＬＩＶＥＲは、任意の哺乳類種に、インビボまたはインビトロで適用することが可能であり、前臨床動物モデルからヒトへの応用に直結し得るベクター系の同定が可能になる。（ｉｉｉ）ＤＥＬＩＶＥＲは、極めて多様なカプシドライブラリのスクリーニングを支援し、指向進化のアプローチと完全に適合する。
最終的に、ＤＥＬＩＶＥＲ系の開発への関心は、より強力かつ精選されたウイルスベクターの創出を介したゲノム医療の促進に対するその潜在的利益に根差し、本研究で同定された筋指向性のＡＡＶのカプシドバリアントは、この用途に重要な概念実証の役割を果たす。しかしながら、カプシドの筋肉能力を増加させることと同様に重要なのは、肝臓の形質導入を減少させることであった。肝臓は、天然に存在するＡＡＶのカプシドによる主な形質導入部位であり、大型動物モデル（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８）及びヒト患者（Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）における高用量のＡＡＶベクター投与と関連する毒性の標的である。特に、２つの遺伝子治療試験（臨床試験識別子ＮＣＴ０３３６８７４２及びＮＣＴ０３１９９４６９）が、肝臓毒性と関連する重大な副作用のためにＦＤＡによって臨床試験差し止めとなった。遺伝的筋疾患のためのＡＡＶベースの遺伝子治療の臨床応用におけるこれらの最近の後退（Ｍｏｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２０２０）は、筋肉への送達のための異例の難題を強調しており、本実施例に記載のもの等の強力な筋指向性のＡＡＶバリアントに対する明確な必要性を示す。
ＤＥＬＩＶＥＲを適用して、新規なＡＡＶカプシドを開発した。これは、全身投与された場合に、全身の骨格筋に、臨床試験及び前臨床開発努力で現在使用されているカプシドより高い効率及び選択性、ならびに潜在的により好ましい安全性プロファイルで遺伝子カーゴを輸送することができる。２回のストリンジェントな転写物ベースの選択により、筋肉の形質導入に関して普及しているカプシドの１０倍を超える効率を示したＭｙｏＡＡＶ １Ａを含めた新規なクラスのＲＧＤ含有カプシドバリアントが発見された。さらに、ＤＥＬＩＶＥＲを使用して選択された筋指向性ＡＡＶは、著しく低下した肝臓の標的化を示した。これらの２つの属性により、この新たなクラスのＡＡＶのカプシドが、治療レベルの標的細胞の形質導入を達成するために必要なウイルスの用量を減少させること及び、治療効果にとってそれが不要である肝臓細胞での形質導入の潜在的に有害な結果を軽減することができることが示唆される。
ＤＥＬＩＶＥＲは、インテグリンヘテロダイマーに結合することが知られている重要なＲＧＤモチーフを有する多くのバリアントを同定し、さらなる研究により、マウス及びヒトの一次筋管を形質導入するためのこのモチーフの機能的重要性が示唆された。マウス及びＮＨＰにおける筋肉標的化カプシドのスクリーニングにより、挿入された７量体ペプチドの最初の３つのアミノ酸としてＲＧＤを含むバリアントの著しい濃縮が特定された。インビボ選択からの最上位のバリアントはインテグリンヘテロダイマーとの相互作用を示し、可溶性のインテグリンヘテロダイマー、抗インテグリン抗体、及び小分子アンタゴニストによって、標的細胞の形質導入から遮断することができた。この観察されたインテグリン依存性は、マウス及びヒトの一次筋管の間で保存され、ＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドの形質導入に関する共通の作用機序が示唆された。ＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドのインテグリンとの相互作用は、これらのバリアントによる標的細胞の形質導入にも必要であった以前に同定されたＡＡＶ結合タンパク質ＡＡＶＲと並行して作用すると思われる。ＲＧＤ結合インテグリンヘテロダイマーの中で、αＶβ６は、最も高い結合親和性を示し、本発明者らが同定した最上位のバリアントによるそれらの形質導入を可能にするためにヒト筋細胞の表面で特に必要であった。これらの観察は、ＲＧＤモチーフを欠いているが、一見して関連するＮＧＲモチーフを介してα５β１及びαＶβ５をウイルス内在化のための共受容体として含むインテグリンヘテロダイマーを利用する、ＡＡＶ２の先行研究の観点から特に興味深い（Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，２００６、Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。
筋肉へのＡＡＶによる遺伝子送達のための分子基盤の基礎となるＲＧＤインテグリンヘテロダイマー相互作用を理解するためにはさらに多くの研究が必要であるが、本発明者らが発見したクラスの筋指向性ベクターに対するその重要性により、必須のＲＧＤモチーフの周辺の隣接残基を体系的に変更することによって、本発明者らがこれらのカプシドをさらに進化させることができるようになった。この第二回の進化により、ＭｙｏＡＡＶ １Ａよりさらに高い親和性でインテグリンヘテロダイマーの広いサブセットを結合することが可能なさらなるバリアントが同定された。マウスにおける最上位の第二世代のバリアントであるＭｙｏＡＡＶ ２Ａは、インビボ及びインビトロの両アッセイで筋肉の形質導入に対して劇的に向上した効力（ＡＡＶ９のものに対して最大１２８倍）を示した一方で、肝臓では低い形質導入を維持し、その成功は、他の目的の標的組織に対する超高効力のベクターの反復的開発のためのフレームワークを提供する。
ゲノム医療を促進する本発明者らの目的で、本発明者らは、ＭｙｏＡＡＶ １Ａ及びＭｙｏＡＡＶ ２Ａを、ヒトの遺伝的筋疾患のために現在開発及び試験中の遺伝子編集及び遺伝子治療アプローチのための送達ベクターとして適用した。これらの研究では、ＤＮＡの標的化切除及び転写物の「再構成」（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）または完全長もしくは小型化された治療用導入遺伝子による遺伝的相補性（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７）が機能的利益を以前に示している確立したＤＭＤ及びＸＬＭＴＭのマウスモデルを使用した。両方のモデルで、注目に値する治療効果が認められ、疾患を標的とするタンパク質の発現のレスキュー、筋肉の強度及び性能の有意な増加が含まれ、ＸＬＭＴＭの場合は、疾患が誘導する死亡からの著しいレスキューが含まれ、ＭｙｏＡＡＶ １Ａを投与した動物で観察された寿命が、未処理及びＡＡＶ９を投与した対照の平均寿命を超えて劇的に延長した。
これらの治療結果は、それらが、先に公開された同じ遺伝子治療アプローチに基づく前臨床研究（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｅｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１７、Ｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１７）または現在進行中のヒト臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３３６２５０２、ＮＣＴ０３３６８７４２、ＮＣＴ０３７６９１１６、及びＮＣＴ０３１９９４６９）で使用されている用量の１０～２５０分の１の用量の治療用ベクターの注射後に達成されたことを考慮すると、いっそう注目に値する。これらの新たなＡＡＶバリアントによる治療効果の達成に対する投薬量の要求が低いことは、発現及び安全性プロファイルの改善ならびに製造コストの減少を含めた臨床応用における多大な利益を有し得る。
最終的に、ＮＨＰでのインビボ指向進化後に、ＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドからのバリアントを、筋指向性が最も高いバリアントとして同定した。これらの結果は、これらのバリアントが、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＤＢＡ／２Ｊ、ｍｄｘ、及びＤＢＡ／２Ｊ－ｍｄｘを含めた複数の近交系マウス株、ならびにカニクイザル、ならびに複数のドナーから得られたヒト一次筋管の培養における筋肉の形質導入に対して広い活性を示したことから、マウス、ＮＨＰ、及びヒトにわたるこれらＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドバリアントの直接適用性を示唆している。さらに、マウス及びヒトの両筋細胞におけるＭｙｏＡＡＶクラスのカプシドの感染性に対するインテグリンヘテロダイマーの必要性は、マウス及びヒトの筋肉で保存されている形質導入様式を強く示唆し、これにより、広範囲の遺伝的筋疾患に対する新たな遺伝子治療アプローチを開発及び実行するための予定が加速され得る。
Ｗｅｉｎｍａｎｎらによる最近の刊行物（Ｗｅｉｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）により、マウスにおいて全身投与後に、１８３の野生型及び修飾されたＡＡＶのカプシドの形質導入効率の試験後の筋指向性カプシドバリアントの同定が報告された。興味深いことに、Ｗｅｉｎｍａｎｎらがスクリーニングから同定した筋指向性バリアントは、カプシド表面で提示されるＲＧＤモチーフを含んでおり、本発明者らの知見の独立した検証の役割を果たし得る。しかしながら、その著者らは、ＮＨＰ及びヒト細胞においてそのバリアントによる形質導入のメカニズム及び形質導入効率を特性評価しなかった。マウス及びＮＨＰにおけるカプシドのインビボ指向進化からの本実施例の知見により、挿入されたペプチドにおけるＲＧＤモチーフ周囲のアミノ酸の配列が、異なる種でのカプシドの形質導入効率の特徴付けにおいて重要な役割を果たすことが実証される。マウス及びＮＨＰにおけるインビボ指向進化から同定された筋指向性が最も高いバリアントはすべてＲＧＤモチーフを含むが、本実施例で論じる通り、各々の種における最上位のヒットとして同定された個々のバリアントに対するこのモチーフの周囲のアミノ酸配列は異なる。例えば、ＭｙｏＡＡＶ ２Ａは、マウスにおいて本発明者らが同定した最上位の第二世代のバリアントであり、マウス筋の形質導入においては高効力であるが、ＮＨＰの筋肉を全身投与後に高効率では形質導入しない。実際、本明細書においてこれらのＮＨＰ選択から同定されたバリアントのすべては、ＮＨＰにおいて組み換えＡＡＶとしての全身送達後に筋肉の形質導入について調べた場合、マウスにおいて同定されたバリアントより効率が良かった。幸運にも、本発明者らのＮＨＰ選択からの最上位のカプシドバリアントは、マウス筋の形質導入においても高効力であり、治療法の開発に極めて適するものになる。これらの結果は、霊長類において最も効力の高いカプシドバリアントを選択するためにストリンジェントな選択戦略でインビボ指向進化を使用することの重要性を強調している。
要約すれば、本実施例は、種間で高効力の筋指向性のＡＡＶのカプシドバリアントのファミリーの進化、操作、及びメカニズム特性を説明及び実証する。本明細書で同様に実証するのは、複数の遺伝的筋疾患のマウスモデルにおいて、これらベクターの低用量であるにもかかわらない治療効果である。これらのベクターは、多数の筋骨格障害のための筋指向性治療遺伝子送達を促進する可能性を有する。さらに広く見れば、ここに記載されているＤＥＬＩＶＥＲ系は、体内の任意の組織または細胞型に対して正確なＡＡＶのカプシドバリアントを同定するために高度に適応できるプラットフォーム、すなわち、分野及び領域の壁を超えて、このベクター系の臨床的及び実験的応用を大きく広げることができる革新を提供する。さらなる組織及び器官系へのＤＥＬＩＶＥＲの採用は、様々なヒトの疾患のための新規な遺伝子治療及び他のゲノム医療アプローチの開発及び変換の促進に遠大な影響を与えるであろう。
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Ｎｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｈａｋｉｍ，Ｃ．Ｈ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｔｈａｋｏｒｅ，Ｐ．Ｉ．，Ｍｏｒｅｂ，Ｅ．Ａ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｒｉｖｅｒａ，Ｒ．Ｍ．，Ｍａｄｈａｖａｎ，Ｓ．，Ｐａｎ，Ｘ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０３－４０７．
Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８４）．Ｃｅｌｌ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｃａｎ ｂｅ ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｎａｔｕｒｅ ３０９，３０－３３．
Ｐｉｌｌａｙ，Ｓ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｎ．Ｌ．，Ｐｕｓｃｈｎｉｋ，Ａ．Ｓ．，Ｄａｖｕｌｃｕ，Ｏ．，Ｄｉｅｐ，Ｊ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｊａｅ，Ｌ．Ｔ．，Ｗｏｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｎａｇａｍｉｎｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ５３０，１０８－１１２．
Ｐｙｔｅｌａ，Ｒ．，Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．，ａｎｄ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８５）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ １４０ ｋｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｏｆ ａ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ ４０，１９１－１９８．
Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９６）．ＲＧＤ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２，６９７－７１５．
Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９９９）．ＡｌｐｈａＶｂｅｔａ５ ｉｎｔｅｇｒｉｎ： ａ ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ５，７８－８２．
Ｔａｂｅｂｏｒｄｂａｒ，Ｍ．，Ｚｈｕ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｗ．，Ｃｈｅｗ，Ｗ．Ｌ．，Ｗｉｄｒｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｘ．，Ｍａｅｓｎｅｒ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｅ．Ｙ．，Ｘｉａｏ，Ｒ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｕｓｃｌｅ ａｎｄ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，４０７－４１１．
Ｔｓｅ，Ｌ．Ｖ．，Ｋｌｉｎｃ，Ｋ．Ａ．，Ｍａｄｉｇａｎ，Ｖ．Ｊ．，Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ Ｒｉｖｅｒａ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｌ．Ｆ．，Ｈａｖｌｉｋ，Ｌ．Ｐ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｋ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，ａｎｄ Ａｓｏｋａｎ，Ａ．（２０１７）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４，Ｅ４８１２－Ｅ４８２１．
Ｗｅｉｎｍａｎｎ，Ｊ．，Ｗｅｉｓ，Ｓ．，Ｓｉｐｐｅｌ，Ｊ．，Ｔｕｌａｌａｍｂａ，Ｗ．，Ｒｅｍｅｓ，Ａ．，Ｅｌ Ａｎｄａｒｉ，Ｊ．，Ｈｅｒｒｍａｎｎ，Ａ．Ｋ．，Ｐｈａｍ，Ｑ．Ｈ．，Ｂｏｒｏｗｓｋｉ，Ｃ．，Ｈｉｌｌｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｙｏｔｒｏｐｉｃ ＡＡＶ ｂｙ ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｒｃｏｄｅｄ ｃａｐｓｉｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １１，５４３２．
Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，Ｄｒｏｕｉｎ，Ｌ．Ｍ．，Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．，Ｑｉａｏ，Ｃ．，Ｐｕ，Ｄ．，Ｈｕ，Ｘ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｚ．，Ｌｉ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）．Ａ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ｅｖｏｌｖｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，３９４６－３９５１．
Ｙａｎｇ，Ｌ．，ａｎｄ Ｘｉａｏ，Ｘ．（２０１３）．Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ： ｔｈｅ ｓｔｏｒｙ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌ Ｊ １０，５０．
Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ，Ｃ．，Ｓｏｌｔｙｓ，Ｓ．，Ｒｅｎｇｏ，Ｇ．，ａｎｄ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．（２００８）．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＡＡＶ ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １－９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｒｏｐｉｓｍ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６，１０７３－１０８０．
本発明の記載される方法、医薬組成物、及びキットの様々な修飾及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者には明らかであろう。本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる修飾が可能であること及び特許請求された本発明が、かかる特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。実際に、当業者には明らかである本発明を実施するための記載された態様の様々な修飾は、本発明の範囲内であることが意図されている。本出願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意の変形、使用、または適応であって、本発明に関する分野において既知の慣行実務の範囲内に入り、かつ本明細書で前述の本質的特徴に適用され得る本開示からのかかる逸脱を含むものを包含することが意図される。

Claims (113)

  1. 以下を含む組成物：
    筋肉細胞を標的とするのに有効な標的化部分であって、前記標的化部分は、１つ以上のｎ量体モチーフを含み、前記１つ以上のｎ量体モチーフのうちの少なくとも１つのｎ量体モチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎを含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘｍ及びＸｎは、各々独立して、任意のアミノ酸から選択され、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり、ｍは、１～４である前記標的化部分、及び
    任意のカーゴであって、前記標的化部分に連結されているか、または他の方法で関連している前記カーゴ。
  2. 前記少なくとも１つのｎ量体モチーフが、表２（配列番号２～７、２０～２１、４１～４０９）、表３（配列番号２、２８、３０～３２、５５、７６、９６、１０３、１３５、１５８、２０７、２１４、２５２、３０６、３１６、３９８、４１０～７６８）、図１４Ｆ（配列番号８～１２、１４～１８）のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせに示すものである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記標的化部分が、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～２のいずれか１項に記載の組成物。
  4. 前記標的化部分が、ウイルスタンパク質を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記ウイルスタンパク質が、カプシドタンパク質である、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ウイルスタンパク質が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質である、請求項４～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記ｎ量体モチーフが、ウイルスのカプシドの外側であるように、前記ｎ量体モチーフが前記ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸の間に配置される、請求項５～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 前記ｎ量体モチーフが、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４、もしくはそれらの任意の組み合わせの間の、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続したアミノ酸の間に挿入される請求項６～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記ｎ量体モチーフが、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるアミノ酸５８８と５８９の間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入される、請求項６～８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 操作されたウイルス粒子である、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記操作されたウイルス粒子が、操作されたＡＡＶウイルス粒子である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記ＡＡＶウイルス粒子が、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ｎ量体モチーフが、３～１５アミノ酸である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 非筋細胞に対する特異性が低減または排除されている、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記非筋細胞が肝臓細胞である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記ウイルスのカプシドが、対応する野生型ＡＡＶのカプシドポリペプチドと比較して、非筋細胞における取り込みが低減または排除された、操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質である、請求項５～１４のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記野生型のカプシドポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、非筋細胞における取り込みが低減または排除される１つ以上の変異を含む、請求項１６～１７のいずれか１項に記載の組成物。
  19. 前記１つ以上の変異が、ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の
    ａ．２６７位、
    ｂ．２６９位
    ｃ．５０４位、
    ｄ．５０５位、
    ｅ．５９０位、
    ｆ．もしくはそれらの任意の組み合わせにあるか、または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドでのそれに対応する１つ以上の位置にある、請求項１８に記載の組成物。
  20. 前記非ＡＡＶ９のカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６９位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＳまたはＸのＴへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の組成物。
  23. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の組成物。
  24. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０５位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＰまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の組成物。
  25. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＱまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項１９に記載の組成物。
  26. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位、２６９位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記２６７位での変異が、ＧからＡへの変異であり、前記２６９位での変異が、ＳからＴへの変異である、請求項１８に記載の組成物。
  27. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記５９０位での変異が、ＱからＡへの変異である、請求項１８に記載の組成物。
  28. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位、５０５位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記５０４位での変異が、ＧからＡへの変異であり、前記５０５位での変異が、ＰからＡへの変異である、請求項１８に記載の組成物。
  29. 前記任意のカーゴが、筋肉の疾患または障害を治療または予防することが可能である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記筋肉の疾患または障害が、
    ａ．自己免疫疾患、
    ｂ．がん、
    ｃ．筋ジストロフィー、
    ｄ．神経筋疾患、
    ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症、
    ｆ．伸長リピート病、
    ｇ．ドミナントネガティブ疾患、
    ｈ．心筋症、
    ｉ．ウイルス性疾患、
    ｊ．早老性疾患、または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記カーゴが、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、もしくはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を含むリボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、もしくは他の遺伝子組み換えもしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１～３０のいずれか１項に記載の組成物。
  32. 前記カーゴが、遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項１～３１のいずれか１項に記載の組成物。
  33. 前記カーゴが、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の組成物。
  34. 前記カーゴが、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の組成物。
  35. 前記ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子が、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記伸長リピート病が、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２９～３５のいずれかに記載の組成物。
  37. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項２９～３６のいずれかに記載の組成物。
  38. 前記筋強直性ジストロフィーが、１型または２型である、請求項３６に記載の組成物。
  39. 前記心筋症が、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である、請求項２９～３８のいずれかに記載の組成物。
  40. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症が、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項２９～３９のいずれかに記載の組成物。
  41. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患が、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記神経筋疾患が、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項２９～４１のいずれかに記載の組成物。
  43. 増加した筋細胞能力、筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１～４２のいずれか１項に記載の組成物。
  44. 以下を含むベクターを含むベクター系：
    筋細胞を標的とするのに有効な１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、各標的化部分が、１つ以上のｎ量体モチーフを含み、前記１つ以上のｎ量体モチーフのうちの少なくとも１つのｎ量体モチーフが、ＸｍＲＧＤＸｎを含むかまたはそれからなり、ここで、Ｘｍ及びＸｎは、各々独立して、任意のアミノ酸から選択され、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、または９であり、ｍは、１～４であり、前記１つ以上のポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、前記少なくとも１つのｎ量体モチーフを少なくともコードする、前記１つ以上のポリヌクレオチド、及び
    任意に、１つ以上の前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された制御要素。
  45. 前記少なくとも１つのｎ量体モチーフが、表２（配列番号２～７、２０～２１、４１～４０９）、表３（配列番号２、２８、３０～３２、５５、７６、９６、１０３、１３５、１５８、２０７、２１４、２５２、３０６、３１６、３９８、４１０～７６８）、図１４Ｆ（配列番号８～１２、１４～１８）のいずれか１つ、またはそれらの任意の組み合わせに示すものである、請求項４４に記載のベクター系。
  46. さらにカーゴを含む、請求項４４～４５のいずれか１項に記載のベクター系。
  47. 前記カーゴが、カーゴポリヌクレオチドであり、任意に、前記標的化部分をコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドの１つ以上に連結される、請求項４６に記載のベクター系。
  48. 前記カーゴポリヌクレオチドが、前記標的化部分をコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターに存在する、請求項４６～４７のいずれかに記載のベクター系。
  49. 存在する場合に前記カーゴを含むウイルス粒子を産生することが可能である、請求項４４～４８のいずれかに記載のベクター系。
  50. １つ以上の前記標的化部分を含むウイルスポリペプチドを産生することが可能である、請求項４４～４９のいずれかに記載のベクター系。
  51. 前記ウイルスポリペプチドが、カプシドポリペプチドである、請求項５０に記載のベクター系。
  52. 前記カプシドポリペプチドが、ＡＡＶのカプシドポリペプチドである、請求項５１に記載のベクター系。
  53. ＡＡＶウイルス粒子を産生することが可能である、請求項４４～５１のいずれかに記載のベクター系。
  54. 前記ＡＡＶウイルス粒子が、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である、請求項５３に記載のベクター系。
  55. 前記カプシドポリペプチドが、操作されたＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである、請求項５１～５４のいずれか１項に記載のベクター系。
  56. 前記１つのｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、前記ｎ量体モチーフ（複数可）が前記ウイルスのカプシドの外側となるように前記ウイルスポリペプチドの２つのアミノ酸に対応する２つのコドン間に挿入される、請求項５０～５５のいずれかに記載のベクター系。
  57. 前記１つ以上のｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドのアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４、もしくはそれらの任意の組み合わせの間の、またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続したアミノ酸に対応する２つのコドンの間に挿入される、請求項５６に記載のベクター系。
  58. 前記１つ以上のｎ量体モチーフをコードする１つ以上のポリヌクレオチドが、ＡＡＶ９のカプシドポリヌクレオチドにおけるアミノ酸５８８と５８９に対応するコドンの間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入される、請求項５７に記載のベクター系。
  59. 前記カプシドタンパク質が、対応する野生型ＡＡＶのカプシドポリペプチドと比較して、非筋細胞における取り込みが低減または排除された、操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質である、請求項５１～５８のいずれか１項に記載のベクター系。
  60. 前記非筋細胞が肝臓細胞である、請求項５９に記載のベクター系。
  61. 前記野生型のカプシドポリペプチドが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである、請求項５９～６０のいずれか１項に記載のベクター系。
  62. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、非筋細胞における取り込みが低減または排除される１つ以上の変異を含む、請求項６９～６１のいずれか１項に記載のベクター系。
  63. 前記１つ以上の変異が、前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の
    ａ．２６７位、
    ｂ．２６９位
    ｃ．５０４位、
    ｄ．５０５位、
    ｅ．５９０位、
    ｆ．もしくはそれらの任意の組み合わせにあるか、または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドでのそれに対応する１つ以上の位置にある、請求項６２に記載のベクター系。
  64. 前記非ＡＡＶ９のカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０のカプシドポリペプチドである、請求項６３に記載のベクター系。
  65. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項６３に記載のベクター系。
  66. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６９位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＳまたはＸのＴへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項６３に記載のベクター系。
  67. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＧまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項６３に記載のベクター系。
  68. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０５位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＰまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項６３に記載のベクター系。
  69. 前記ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位または非ＡＡＶ９のカプシドポリペプチドにおけるそれに対応する位置での前記変異が、ＱまたはＸのＡへの変異であり、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸である、請求項６３に記載のベクター系。
  70. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の２６７位、２６９位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記２６７位での変異が、ＧからＡへの変異であり、前記２６９位での変異が、ＳからＴへの変異である、請求項６２に記載のベクター系。
  71. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５９０位に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記５９０位での変異が、ＱからＡへの変異である、請求項６２に記載のベクター系。
  72. 前記操作されたＡＡＶのカプシドタンパク質が、野生型ＡＡＶ９のカプシドタンパク質（配列番号１）の５０４位、５０５位またはその両方に変異を含む操作されたＡＡＶ９のカプシドポリペプチドであり、前記５０４位での変異が、ＧからＡへの変異であり、前記５０５位での変異が、ＰからＡへの変異である、請求項６２に記載のベクター系。
  73. 前記１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む前記ベクターが、スプライス制御要素を含まない、請求項４４～７２のいずれか１項に記載のベクター系。
  74. さらに、ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４３～７３のいずれか１項に記載のベクター系。
  75. 前記ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、請求項７４に記載のベクター系。
  76. 前記ウイルスｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、前記１つ以上の標的化部分のすべてまたは一部を各々がコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターにある、請求項７４～７５のいずれか１項に記載のベクター系。
  77. 前記ウイルスｒｅｐタンパク質が、制御要素に作動可能に連結される、請求項７４～７６のいずれか１項に記載のベクター系。
  78. 請求項４４～７７のいずれかに記載のベクター系によってコードされる及び／または産生されるポリペプチド。
  79. ウイルスポリペプチドである、請求項７８に記載のポリペプチド。
  80. 前記ウイルスポリペプチドが、ＡＡＶポリペプチドである、請求項７９に記載のポリペプチド。
  81. 請求項４３～７７のいずれか１項に記載のベクター系によって産生される及び／または請求項７８～７９のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む粒子。
  82. 前記粒子が、ウイルス粒子である、請求項８１に記載の粒子。
  83. 前記ウイルス粒子が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子、レンチウイルス粒子、またはレトロウイルス粒子である、請求項８２に記載の粒子。
  84. 前記ウイルス粒子が、筋特異的指向性を有する、請求項８３に記載の粒子。
  85. 前記カーゴが、筋肉の疾患または障害を治療または予防することが可能である、請求項４６～７７のいずれか１項に記載のベクター系、請求項７８～８０のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項８１～８４のいずれか１項に記載の粒子。
  86. 前記筋肉の疾患または障害が、
    （ａ）自己免疫疾患、
    （ｂ）がん、
    （ｃ）筋ジストロフィー、
    （ｄ）神経筋疾患、
    （ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症、
    （ｆ）伸長リピート病、
    （ｇ）ドミナントネガティブ疾患、
    （ｈ）心筋症、
    （ｉ）ウイルス性疾患、
    （ｊ）早老性疾患、または
    （ｋ）それらの任意の組み合わせ
    である、請求項８５に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  87. 前記カーゴが、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドもしくはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、もしくはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系分子を含むリボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、もしくは他の遺伝子組み換えもしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項８５～８６のいずれか１項に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  88. 前記カーゴが、遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項８５～８７のいずれか１項に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  89. 前記カーゴが、ジストロフィン遺伝子のエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項８５～８８のいずれか１項に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  90. 前記カーゴが、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である、請求項８５～８９のいずれかに記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  91. 前記ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子が、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む、請求項９０に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  92. 前記伸長リピート病が、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項８６～９１のいずれか１項に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  93. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項８６～９２のいずれか１項に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  94. 前記筋強直性ジストロフィーが、１型または２型である、請求項９３に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  95. 前記心筋症が、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である、請求項８５～９４のいずれかに記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  96. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症が、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項８５～９５のいずれかに記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  97. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患が、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である、請求項９６に記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  98. 前記神経筋疾患が、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項８５～９７のいずれかに記載のベクター系、ポリペプチド、または粒子。
  99. 前記ポリペプチド、前記粒子、またはその両方が、増加した筋細胞能力、筋細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項７８～９８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは粒子。
  100. 以下を含む細胞：
    ａ．請求項１～４３のいずれかに記載の組成物、
    ｂ．請求項４４～７７及び８５～９８のいずれか１項に記載のベクター系、
    ｃ．請求項８１～８４及び８５～９９のいずれか１項に記載のポリペプチド、
    ｄ．請求項８１～９９のいずれか１項に記載の粒子、または
    ｅ．それらの組み合わせ。
  101. 原核細胞である、請求項１００に記載の細胞。
  102. 真核細胞である、請求項１００に記載の細胞。
  103. 以下を含む医薬製剤：
    ａ．請求項１～４３のいずれかに記載の組成物、
    ｂ．請求項４４～７７及び８５～９８のいずれか１項に記載のベクター系、
    ｃ．請求項８１～８４及び８５～９９のいずれか１項に記載のポリペプチド、
    ｄ．請求項８１～９９のいずれか１項に記載の粒子、
    ｅ．請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の細胞、または
    ｆ．それらの組み合わせ、及び
    医薬的に許容される担体。
  104. ａ．請求項１～４３のいずれかに記載の組成物、
    ｂ．請求項４４～７７及び８５～９８のいずれか１項に記載のベクター系、
    ｃ．請求項８１～８４及び８５～９９のいずれか１項に記載のポリペプチド、
    ｄ．請求項８１～９９のいずれか１項に記載の粒子、
    ｅ．請求項１００～１０２のいずれか１項に記載の細胞、
    ｆ．
    ｇ．請求項１０３に記載の医薬製剤、または
    ｈ．それらの組み合わせ
    を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  105. 前記対象が、筋肉の疾患または障害を有する、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記筋肉の疾患または障害が、
    ａ．自己免疫疾患、
    ｂ．がん、
    ｃ．筋ジストロフィー、
    ｄ．神経筋疾患、
    ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症、
    ｆ．伸長リピート病、
    ｇ．ドミナントネガティブ疾患、
    ｈ．心筋症、
    ｉ．ウイルス性疾患、
    ｊ．早老性疾患、または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記伸長リピート病が、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項１０５に記載の方法。
  108. 前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項１０５～１０６のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記筋強直性ジストロフィーが、１型または２型である、請求項１０７に記載の方法。
  110. 前記心筋症が、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である、請求項１０５～１０９のいずれかに記載の方法。
  111. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症が、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項１０５～１０６のいずれかに記載の方法。
  112. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患が、ＭＰＳ ＩＩＩＡ型、ＩＩＩＢ型、ＩＩＩＣ型、またはＩＩＩＤ型である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記神経筋疾患が、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項１０４～１１２のいずれかに記載の方法。
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