JP2022551986A - 修飾筋肉標的化組成物 - Google Patents

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Abstract

本明細書には、筋肉細胞を特異的に標的とすることが可能であり得、かつｎ－ｍｅｒモチーフを含み得る標的化部位が記載されている。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフを含有する。本明細書には、１つ以上の標的化部位をコードし、及び／または含有し得るベクターシステム、粒子、ポリペプチドも記載されている。本明細書には、本明細書に記載の標的化部位の１つ以上を使用して、カーゴを筋肉細胞などの細胞に送達する方法も記載されている。【選択図】図７

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ」というタイトルの米国仮特許出願番号６２／９１６，２０７；２０１９年１０月１６日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ」というタイトルの米国仮特許出願番号６２／９１６，２２１；２０２０年４月３０日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄｓ」というタイトルの米国仮特許出願番号６３／０１８，４５４；及び２０２０年７月２２日に出願された「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｓｃｌｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ」というタイトルの米国仮特許出願番号６３／０５５，２５２の利益及び優先権を主張し、これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、２０２０年１０月１６日に作成され、１，８００，０００バイトのサイズを有するＢＲＯＤ－５００５ＷＰ．ｔｘｔというタイトルのＡＳＣＩＩ．ｔｘｔファイルとして電子形式で提出された配列表を含む。配列表の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される主題は一般に、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及びそのシステムを含むがこれらに限定されない筋肉標的化組成物、組成物、ならびにその使用を対象とする。
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法及び遺伝子編集のためのビヒクルを送達するために最も一般的に使用されている。それにもかかわらず、天然カプシドバリアントを含有するｒＡＡＶは、細胞指向性が限られている。実際に、今日使用されているｒＡＡＶは、全身送達後に主に肝臓に感染する。さらに、天然カプシドバリアントを有するこれらの従来のｒＡＡＶによる他の細胞タイプ、組織、及び器官における従来のｒＡＡＶの形質導入効率は限られている。そのため、肝臓以外の細胞、組織、及び器官（例えば、神経系、骨格筋、及び心臓筋肉）に影響を及ぼす疾患のためのＡＡＶ媒介ポリヌクレオチド送達は典型的には、多くの用量のウイルス（典型的には約１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ）の注射を必要とし、これはしばしば肝臓毒性をもたらす。さらに、従来のｒＡＡＶを使用する場合に多くの用量が必要とされるので、成人患者に投薬するために必要とされる十分な量の治療用ｒＡＡＶを製造することは極めて困難である。また、遺伝子発現及び生理学における相違により、マウス及び霊長類モデルでは、ウイルスカプシドに対する反応が異なる。異なるウイルス粒子の形質導入効率は、異なる種間で異なり、結果として、マウスにおける前臨床研究はしばしば、ヒトを含む霊長類における結果を正確に反映しない。このように、様々な遺伝子疾患の処置において使用するための改善されたｒＡＡＶに対する必要性が存在する。
本明細書における特定の例示的な実施形態では、筋肉細胞を標的とするのに有効な標的化部位であって、標的化部位は、ｎ－ｍｅｒモチーフを含む、標的化部位、及びカーゴであって、カーゴは、標的化部位に連結されており、またはそうなければ関連付けられている、カーゴを含む、組成物が記載されている。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフを含む。
特定の例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎの式（式中、ｍは０～４アミノ酸であり、ｎは０～１５アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する。
特定の例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、式ＲＧＤＸｎ（式中、ｎは４または５であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、配列番号１３～５０、１２７７～２４９３、３７３７～４９７９、６６４７～８３１３、８３１４～８５０２、または８６９２～８８８９のうちのいずれか１つである。
特定の例示的な実施形態では、標的化部位は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の例示的な実施形態では、標的化部位は、ウイルスタンパク質を含む。
特定の例示的な実施形態では、ウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質である。
特定の例示的な実施形態では、ウイルスタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質である。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ｎ－ｍｅｒモチーフが、ウイルスカプシドタンパク質が一部であるウイルスカプシドの外部となるように、ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸間に配置される。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４の間、もしくはそれらの任意の組み合わせまたはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されている。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸５８８と５８９との間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入されている。
特定の例示的な実施形態では、組成物は、修飾ウイルス粒子である。
特定の例示的な実施形態では、修飾ウイルス粒子は、修飾ＡＡＶウイルス粒子である。
特定の例示的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、筋肉疾患または障害を処置または予防することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、筋肉疾患または障害は、
ａ．自己免疫疾患；
ｂ．がん；
ｃ．筋ジストロフィー；
ｄ．神経筋疾患；
ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
ｆ．伸長リピート病；
ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
ｈ．心筋症；
ｉ．ウイルス性疾患；
ｊ．早老性疾患；または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、
ａ．モルホリノ；
ｂ．ペプチド連結モルホリノ；
ｃ．アンチセンスオリゴヌクレオチド；
ｄ．ＰＭＯ、治療用導入遺伝子；
ｅ．治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ．ＰＰＭＯ；
ｇ．１つ以上のペプチドまたはポリペプチド；
ｈ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
ｉ．リボヌクレオタンパク質であって、リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を含む、リボヌクレオタンパク質；
ｊ．治療用導入遺伝子ＲＮＡ、または他の遺伝子改変もしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質；または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。
特定の例示的な実施形態では、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、１’、２、３、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれらの任意の組み合わせ、及び任意にｎＮＯＳドメイン、アクチン結合ドメイン、１つ以上のヒンジ領域、ジストログリカン結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、筋肉特異的プロモーターに機能可能に連結されている。
特定の例示的な実施形態では、伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
特定の例示的な実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
特定の例示的な実施形態では、筋強直性ジストロフィーは、１型または２型筋強直性ジストロフィーである。
特定の例示的な実施形態では、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー関連心筋症、またはダノン病である。
特定の例示的な実施形態では、糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
特定の例示的な実施形態では、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。
特定の例示的な実施形態では、神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
特定の例示的な実施形態では、組成物は、増加した筋肉細胞効力、筋肉細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
本明細書における特定の例示的な実施形態では、筋肉細胞を標的とするのに有効な１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、各標的化部位は、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフを含み、各ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフであり、各ポリヌクレオチドは、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフの１つ以上を少なくともコードする、１つ以上のポリヌクレオチド；及び任意に、１つ以上のポリヌクレオチドの１つ以上に機能的に連結された制御要素を含むベクターを含むベクターシステムが記載されている。
特定の例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎの式（式中、ｍは０～４アミノ酸であり、ｎは０～１５アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する。
特定の例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、式ＲＧＤＸｎ（式中、ｎは４または５であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、配列番号１３～５０、１２７７～２４９３、３７３７～４９７９、６６４７～８３１３、８３１４～８５０２、または８６９２～８８８９のうちのいずれか１つである。
特定の例示的な実施形態では、ベクターシステムは、カーゴをさらに含む。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、カーゴポリヌクレオチドであり、標的化部位をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、制御要素、またはその両方の１つ以上に任意に連結されている。
特定の例示的な実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、標的化部位をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターに存在する。
特定の例示的な実施形態では、ベクターシステムは、カーゴを含有するウイルス粒子を生成することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、ベクターシステムは、標的化部位の１つ以上を含むウイルスカプシドポリペプチドを生成することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、ベクターシステムは、ＡＡＶウイルス粒子を生成することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である。
特定の例示的な実施形態では、カプシドポリペプチドは、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドである。
特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフ（複数可）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ｎ－ｍｅｒモチーフの少なくとも１つがウイルスカプシドの外部となるようにウイルスタンパク質の２つのアミノ酸に対応する２つのコドン間に挿入されている。
特定の例示的な実施形態では、２つのコドンは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４の間、もしくはそれらの任意の組み合わせまたはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続アミノ酸に対応する。
特定の例示的な実施形態では、２つのコドンは、ＡＡＶ９カプシドポリヌクレオチドにおけるアミノ酸５８８及び５８９またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置に対応する。
特定の例示的な実施形態では、１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターは、スプライス制御要素を含まない。
特定の例示的な実施形態では、ベクターシステムは、ウイルス性ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス性ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質である。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス性ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターにある。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス性ｒｅｐタンパク質は、制御要素に機能的に連結されている。
本明細書における特定の例示的な実施形態では、本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］のいずれかに記載されるベクターシステムを発現させることによって生成されるポリペプチドが記載されている。
特定の例示的な実施形態では、ポリペプチドは、ウイルス性ポリペプチドである。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス性ポリペプチドは、ＡＡＶポリペプチドである。
本明細書における特定の例示的な実施形態では、本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］のいずれかに記載されるベクターシステムを発現させることによって生成される粒子が記載されている。
特定の例示的な実施形態では、粒子は、ウイルス粒子である。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である。
特定の例示的な実施形態では、ウイルス粒子は、筋肉特異的指向性を有する。
特定の例示的な実施形態では、本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］のいずれかに記載されるベクターシステム、本明細書、例えば、段落［００５８］～［００６０］のいずれか１つに記載されるポリペプチド、または本明細書、例えば、段落［００６１］～［００６４］のいずれか１つに記載される粒子が記載されており、カーゴは、筋肉疾患または障害を処置または予防することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、筋肉疾患または障害は、
ａ．自己免疫疾患；
ｂ．がん；
ｃ．筋ジストロフィー；
ｄ．神経筋疾患；
ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
ｆ．伸長リピート病；
ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
ｈ．心筋症；
ｉ．ウイルス性疾患；
ｊ．早老性疾患；または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、
ａ．モルホリノ；
ｂ．ペプチド連結モルホリノ；
ｃ．アンチセンスオリゴヌクレオチド；
ｄ．ＰＭＯ、治療用導入遺伝子；
ｅ．治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｆ．ＰＰＭＯ；
ｇ．１つ以上のペプチドまたはポリペプチド；
ｈ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
ｉ．リボヌクレオタンパク質であって、リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を含む、リボヌクレオタンパク質；
ｊ．治療用導入遺伝子ＲＮＡ、または他の遺伝子改変もしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質；または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。
特定の例示的な実施形態では、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、１’、２、３、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれらの任意の組み合わせ、及び任意にｎＮＯＳドメイン、アクチン結合ドメイン、１つ以上のヒンジ領域、ジストログリカン結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
特定の例示的な実施形態では、伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
特定の例示的な実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
特定の例示的な実施形態では、筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。
特定の例示的な実施形態では、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。
特定の例示的な実施形態では、糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
特定の例示的な実施形態では、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。
特定の例示的な実施形態では、神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
特定の例示的な実施形態では、ポリペプチド、粒子、またはその両方は、増加した筋肉細胞効力、筋肉細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
ａ．本明細書、例えば、段落［０００７］～［００３７］のいずれか１つに記載される組成物；
ｂ．本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］または［００６５］～［００７８］のいずれか１つに記載されるベクターシステム；
ｃ．本明細書、例えば、段落［００５８］～［００６０］または［００６５］～［００７９］のいずれか１つに記載されるポリペプチド；
ｄ．本明細書、例えば、段落［００６１］～［００７９］のいずれか１つに記載される粒子；または
ｅ．それらの組み合わせ
を含む細胞。
特定の例示的な実施形態では、細胞は、原核である。
特定の例示的な実施形態では、細胞は、真核である。
ａ．本明細書、例えば、段落［０００７］～［００３７］のいずれか１つに記載される組成物；
ｂ．本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］または［００６５］～［００７８］のいずれか１つに記載されるベクターシステム；
ｃ．本明細書、例えば、段落［００５８］～［００６０］または［００６５］～［００７９］のいずれか１つに記載されるポリペプチド；
ｄ．本明細書、例えば、段落［００６１］～［００７９］のいずれか１つに記載される粒子；
ｅ．本明細書、例えば、段落［００８０］～［００８２］のいずれか１つに記載される細胞；または
ｆ．それらの組み合わせ；及び
薬学的に許容可能な担体
を含む薬学的製剤。
ａ．本明細書、例えば、段落［０００７］～［００３７］のいずれか１つに記載される組成物；
ｂ．本明細書、例えば、段落［００３８］～［００５７］または［００６５］～［００７８］のいずれか１つに記載されるベクターシステム；
ｃ．本明細書、例えば、段落［００５８］～［００６０］または［００６５］～［００７９］のいずれか１つに記載されるポリペプチド；
ｄ．本明細書、例えば、段落［００６１］～［００７９］のいずれか１つに記載される粒子；
ｅ．本明細書、例えば、段落［００８０］～［００８２］のいずれか１つに記載される細胞；
ｆ．本明細書、例えば、段落［００８３］に記載される薬学的製剤；または
ｇ．それらの組み合わせ
を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
特定の例示的な実施形態では、それを必要とする対象は、筋肉疾患または障害を有する。
特定の例示的な実施形態では、筋肉疾患または障害は、
ａ．自己免疫疾患；
ｂ．がん；
ｃ．筋ジストロフィー；
ｄ．神経筋疾患；
ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
ｆ．伸長リピート病；
ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
ｈ．心筋症；
ｉ．ウイルス性疾患；
ｊ．早老性疾患；または
ｋ．それらの任意の組み合わせ
である。
特定の例示的な実施形態では、伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。
特定の例示的な実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。
特定の例示的な実施形態では、筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。
特定の例示的な実施形態では、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。
特定の例示的な実施形態では、糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。
特定の例示的な実施形態では、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。
特定の例示的な実施形態では、神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
例示的な実施形態のこれらの及び他の実施形態、目的、特徴、及び利点は、説明された例示的な実施形態の以下の詳細な説明を考慮して当業者に明らかになる。
本発明の特徴及び利点の理解は、本発明の原理が利用され得る例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られる。
導入遺伝子からのｍＲＮＡの生成をもたらす、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入メカニズムを示している。 ＡＡＶバリアントのｍＲＮＡベースの選択が、ＤＮＡベースの選択よりも厳格であり得ることを実証し得るグラフを示している。ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 Ａ～Ｂは、肝臓におけるウイルスライブラリとベクターゲノムＤＮＡ（図３Ａ）及びｍＲＮＡ（図３Ｂ）との間の相関関係を実証し得るグラフを示している。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 異なる組織において同定された、ＤＮＡレベルで存在し、ｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。この実験のため、ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。 細胞タイプ特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現を実証し得るグラフを示している。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋肉特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞タイプ特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 細胞タイプ特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現を実証し得るグラフを示している。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋肉特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞タイプ特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 細胞タイプ特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現を実証し得るグラフを示している。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋肉特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。細胞タイプ特異的プロモーターからの発現レベルは、各組織における構成的ＣＭＶプロモーターからの発現レベルに基づいて正規化した。 種にわたる組織特異的遺伝子送達のためのカプシドバリアントを生成及び選択する方法の実施形態を示す概略図を示している。 ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にランダムｎ－ｍｅｒ（ｎ＝３～１５アミノ酸）の野生型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９への挿入を示す概略図を示している。 ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にバリアントＡＡＶ粒子生成を示す概略図を示している。各カプシドバリアントは、それ自体のコーディング配列をベクターゲノムとして封入している。 ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成するためにＡＡＶベクターシステムにおいて使用され得る代表的なＡＡＶカプシドプラスミドライブラリベクター（例えば、図８を参照されたい）の概略的ベクターマップを示している。 異なる構成的及び細胞タイプ特異的哺乳動物プロモーターを含有するコンストラクトによってもたらされたウイルス力価（ＡＡＶ９ベクターゲノム／１５ｃｍディッシュとして計算される）を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第２ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第２ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第２ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第２ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。 Ａ～Ｂは、同義コドンによってコードされるバリアントの存在量間の相関関係を実証し得るグラフを示している。 ２つの異なる筋肉特異的プロモーター（ＭＨＣＫ７及びＣＫ８）の制御下で発現した同じバリアントの存在量間の相関関係を実証し得るグラフを示している。 野生型ＡＡＶ９カプシドと同様の力価を有するｒＡＡＶを生成する筋肉指向性カプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像を示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－Ｇとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像のパネルを示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像のパネルを示している。 種にわたる筋肉指向性遺伝子送達のための有力なカプシドバリアントの選択の概略図を示している。 異なる系統のマウスにおける選択を実証し得る表が、上位の筋肉指向性ヒットと同じバリアントを同定することを示している。 異なる系統のマウスにおける選択を実証し得る表が、上位の筋肉指向性ヒットと同じバリアントを同定することを示している。 異なる系統のマウスにおける選択を実証し得る表が、上位の筋肉指向性ヒットと同じバリアントを同定することを示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス筋肉形質導入の比較を実証し得る画像を示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得るグラフを示している。 ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のベクターゲノム生体内分布の比較を実証し得るグラフを示している。 ＡＡＶ９及びＡＡＶ８と比較して、ＭｙｏＡＡＶによる筋肉におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現のより速い動態を実証し得る画像を示している。 ＡＡＶ９及びＡＡＶ８と比較して、ＭｙｏＡＡＶによる筋肉におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現のより速い動態を実証し得る画像を示している。 ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲと比較したＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲによるモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正のメカニズムを実証し得る。 ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲと比較したＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを用いたモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正を実証し得る。 ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲと比較したＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを用いたモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正を実証し得る。 ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲと比較したＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを用いたモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正を実証し得る。 ＭｙｏＡＡＶが受容体としてのインテグリンヘテロ二量体を使用して細胞に入ることを実証し得る。 ｍｙｏＡＡＶが、ＡＡＶ９よりも５０～１００倍効率的にマウス及びヒトの両方の一次筋管を形質導入し得ることを実証し得るグラフを示している。 インテグリンアルファＶ小分子阻害剤がＭｙｏＡＡＶによるヒト一次筋管の形質導入を抑制することを実証し得る。 インテグリンアルファＶ小分子阻害剤がＭｙｏＡＡＶによるヒト一次筋管の形質導入を抑制することを実証し得る。
本明細書における図面は、例示の目的のためのものにすぎず、必ずしも縮尺通りに描かれているわけではない。
一般的定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。分子生物学における一般的な用語及び技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｏｔｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ（Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔにより出版、２００８）（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版、１９９４）（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版、１９９５）（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及び Ｍａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）で見ることができる。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈が別段明らかに示さない限り、単数及び複数の両方の言及が含まれる。
用語「任意の」または「任意に」は、その後に記載される事象、状況または置換基が生じる場合があり、または生じない場合があること、及びその記載が、その事象または状況が生じる場合、及びそれが生じない場合を含むことを意味する。
端点による数値範囲の記述は、それぞれの範囲内に含まれるすべての数及び分数、ならびに記述された端点を含む。範囲の各々の端点は、他方の端点と関連して、及び他方の端点と独立しての両方で有意であることがさらに理解される。本明細書に開示される多くの値が存在すること、及び各値はまた、それ自体の値に加えて「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、そのときは「約１０」も開示される。範囲は、「約」ある特定の値から、及び／または「約」別の特定の値までとして本明細書で表され得る。同様に、値が、先行する「約」の使用によって近似として表される場合、特定の値はさらなる実施形態を形成することが理解される。例えば、値「約１０」が開示される場合、そのときは「１０」も開示される。
そのような範囲形式は、便宜及び簡潔性のために使用され、よって、範囲の限度として明白に記述される数値だけでなく、その範囲内に包含される個々の数値または副次的範囲のすべてを各数値及び副次的範囲が明白に記述されているかのように含むように柔軟な様式で解釈されるべきであることを理解されたい。説明するために、「約０．１％～５％」の数値範囲は、約０．１％～約５％の明白に記述された値だけでなく、示された範囲内の個々の値（例えば、約１％、約２％、約３％、及び約４％）及び副次的範囲（例えば、約０．５％～約１．１％；約５％～約２．４％；約０．５％～約３．２％、及び約０．５％～約４．４％、ならびに他の可能性のある副次的範囲）も含むように解釈されるべきである。範囲が表される場合、さらなる実施形態は、一方の特定の値から及び／または他方の特定の値までを含む。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値（文脈が別段明らかに示さない限り、下限の単位の十分の一まで）及びその記述された範囲における任意の他の記述された値または介在値が本開示に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立して、そのより小さな範囲に含まれ、また、記述された範囲における任意の特に除外される限度次第で、本開示に包含され得る。記述された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたはその両方を除外する範囲も本開示に含まれる。例えば、記述された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のいずれかまたはその両方を除外する範囲も本開示に含まれ、例えば、語句「ｘ～ｙ」は、「ｘ］～「ｙ」の範囲及び「ｘ」を超え「ｙ」未満の範囲を含む。範囲はまた、上限、例えば、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以下」として表され得、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲ならびに「ｘ未満」、「ｙ未満」、及び「ｚ未満」の範囲を含むように解釈されるべきである。同様に、語句「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以上」は、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲ならびに「ｘ超」、「ｙ超」、及び「ｚ超」の範囲を含むように解釈されるべきである。また、語句「約「ｘ」～「ｙ」」（「ｘ」及び「ｙ」は数値である）は、「約「ｘ」～約「ｙ」」を含む。
本明細書で使用される用語「約」または「およそ」は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量、時間的継続時間などに言及する場合、特定の値の及びそれからの変動、例えば、特定の値の及びそれからの＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、及び＋／－０．１％以下の変動を、そのような変動が開示された発明において実施するのに適切である限り、包含することを意味する。修飾語「約」または「およそ」が言及する値はまた、それ自体で、具体的に、及び好ましく開示されることを理解されたい。本明細書で使用される場合、用語「約」「おおよその」「でまたは約」及び「実質的に」は、問題となる量または値が、正確な値または特許請求の範囲で記述されるまたは本明細書で教示されるものと同等の結果または効果を提供する値であり得ることを意味し得る。すなわち、量、サイズ、製剤、パラメータ、及び他の定量値及び特性は、正確ではなく、正確である必要はないが、おおよそ及び／またはより大きくまたはより小さい場合があり、所望により、許容範囲、換算率、四捨五入、測定誤差など、ならびに同等の結果または効果が得られるような当業者に知られている他の要素を反映することが理解される。いくつかの状況では、同等の結果または効果を提供する値は、合理的に決定することはできない。通常、量、サイズ、製剤、パラメータまたは他の量または特性は、「約」、「おおよその」、または「でまたは約」である（そのように明示的に記述されているかどうかにかかわらない）。「約」、「おおよその」、または「でまたは約」が定量的値の前で使用される場合、パラメータにはまた、特に別段記述されない限り、特定の定量的値自体が含まれることが理解される。
本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞デブリを含有し得る。生物学的サンプルは、「体液」を含有し得る（またはそれに由来し得る）。本発明は、体液が、羊水、房水、硝子体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ液、外リンパ液、滲出液、糞便、女性射精物、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（鼻汁及び痰を含む）、心膜液、腹膜液、胸膜液、膿、分泌物、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物及びそれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生物学的サンプルには、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物が含まれる。体液は、例えば、穿刺、または他の収集もしくはサンプリング手順によって哺乳動物生物から得られ得る。
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、牧場動物、スポーツ動物、及びペットが含まれるがこれらに限定されない。ｉｎ ｖｉｖｏで得られたまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された生物学的実体の組織、細胞及びそれらの子孫も包含される。
様々な実施形態が以下に記載されている。特定の実施形態は、網羅的な記載としてまたは本明細書で論述されるより広い実施形態への限定として意図されていないことが留意されるべきである。特定の実施形態と併せて記載されている１つの実施形態は、必ずしもその実施形態に限定されるわけではなく、任意の他の実施形態（複数可）と共に実施され得る。本明細書を通して「１つの実施形態」、「実施形態」、「例示的な実施形態」に対する言及は、実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書中の様々な箇所における語句「一実施形態では」、「実施形態では」、または「例示的な実施形態」の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではないが、そうである場合がある。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、任意の好適な様式で組み合わされ得る。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴は含まない一方で、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内であることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求された実施形態のいずれかは、任意の組み合わせで使用され得る。
米国仮出願番号６２／８９９，４５３及び国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／５０５３４を参照する。
本明細書で引用されるすべての刊行物、公開された特許文献、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、公開された特許文献、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
概説
本明細書に開示される実施形態は、カーゴに連結され、またはそうでなければ関連付けられ得る筋肉特異的標的化部位を提供する。本明細書に開示される実施形態は、筋肉特異的標的化部位の１つ以上を組み込み得るポリペプチド及び粒子を提供する。ポリペプチド及び／または粒子は、カーゴに連結され、カーゴに結合され、カーゴを封入し、またはそうでなければカーゴを組み込み、それによりカーゴを標的化部位（複数可）と関連付け得る。
本明細書に開示される実施形態は、本明細書にさらに記載されるｎ－ｍｅｒモチーフ、本明細書にさらに記載されるＲＧＤモチーフ、またはその両方の１つ以上を含有し得る筋肉特異的標的化部位を提供する。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフ及び／またはＲＧＤモチーフは、標的化部位の筋肉特異性を付与し得る。
本明細書に開示される実施形態は、細胞特異的及び／または種特異的指向性を修飾ＡＡＶ粒子に付与するように修飾され得る修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを提供する。
本明細書に開示される実施形態はまた、バリアントカプシドタンパク質などの、改変された表面構造のバリアントの多様なライブラリの生成を体系的に誘導することを含み得る、修飾カプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法を提供する。修飾カプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法の実施形態はまた、特定の細胞、組織、及び／または器官タイプを標的とすることが可能なカプシドバリアントの厳格な選択を含み得る。修飾カプシドを有するｒＡＡＶを生成する方法の実施形態は、少なくとも２つ以上の種において効率的及び／または均一な形質導入が可能なカプシドバリアントの厳格な選択を含み得る。
本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶを生成することが可能なベクター及びそのシステムを提供する。
本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶ粒子を生成することが可能であり得る細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターまたはそのシステムを含む。
本明細書に開示される実施形態は、本明細書に記載の修飾カプシドを含み得る修飾ＡＡＶを提供する。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶは、細胞に送達されるカーゴポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、遺伝子改変ポリヌクレオチドである。
本明細書に開示される実施形態は、修飾ＡＡＶベクターまたはそのシステム、修飾ＡＡＶカプシド、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドを含む修飾ＡＡＶ粒子、及び／または修飾ＡＡＶカプシド、及び／または修飾ＡＡＶベクターまたはそのシステムを含有する本明細書に記載の修飾細胞を含有し得る製剤を提供する。いくつかの実施形態では、製剤はまた、薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書に記載の製剤は、それを必要とする対象または細胞に送達され得る。
本明細書に開示される実施形態はまた、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、修飾ＡＡＶカプシド、修飾ＡＡＶ粒子、細胞、または他の成分の１つ以上及びそれらの組み合わせならびに本明細書に記載の薬学的製剤の１つ以上を含有するキットを提供する。実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、修飾ＡＡＶカプシド、修飾ＡＡＶ粒子細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、組み合わせキットとして提供され得る。
本明細書に開示される実施形態は、例えば、治療用ポリヌクレオチドを細胞に送達するために、本明細書に記載の細胞特異的指向性を有する修飾ＡＡＶを使用する方法を提供する。このように、本明細書に記載の修飾ＡＡＶは、それを必要とする対象において疾患を処置及び／または予防するために使用され得る。本明細書に開示される実施形態はまた、修飾ＡＡＶカプシド、修飾ＡＡＶウイルス粒子、修飾ＡＡＶベクターまたはそのシステム及び／またはその製剤を細胞に送達する方法を提供する。本明細書では、修飾ＡＡＶ粒子、修飾ＡＡＶカプシド、修飾ＡＡＶカプシドベクターまたはそのシステム、修飾細胞、及び／またはその製剤を対象に送達することによってそれを必要とする対象を処置する方法も提供される。
修飾ＡＡＶならびに修飾ＡＡＶを作製及び使用する方法の実施形態の追加の特徴及び利点が本明細書にさらに記載されている。
筋肉特異的標的化部位及びその組成物
本明細書には、筋肉細胞を特異的に標的とし、筋肉細胞に結合し、筋肉細胞と関連し、またはそうでなければ筋肉細胞と特異的に相互作用することが可能な標的化部位が記載されている。ｎ－ｍｅｒモチーフは、それが組み込まれ、連結され、結合され、またはそうでなければ関連付けられるカーゴなどの別の分子に細胞及び／または組織タイプ標的化能力を付与し得る短いペプチドモチーフである。１つの例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、カプシド表面で発現し、組織特異的標的化能力をウイルス粒子に付与するようにウイルスカプシドに組み込まれて、ウイルス粒子及びそれに含まれる任意のカーゴの組織特異的送達を容易化する。特定の例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、約１～２０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である。ｎ－ｍｅｒモチーフという用語は、ＲＧＤモチーフを有するｎ－ｍｅｒモチーフ及びそれを有さないもの（本明細書で「非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフ」と称される）の両方を包含する。いくつかの例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、筋肉細胞／組織特異性を付与する。いくつかの例示的な実施形態では、筋肉細胞／組織特異性を付与するｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフである。いくつかの例示的な実施形態では、筋肉細胞／組織特異性を付与するｎ－ｍｅｒモチーフは、非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフである。
いくつかの実施形態では、標的化部位は、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフの各々が、独立して、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフから選択される１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフであり、またはそれを含む。ｎ－ｍｅｒモチーフ、ＲＧＤモチーフ及び非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフは、本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、標的化部位は、複数のｎ－ｍｅｒモチーフの各々が、独立して、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフから選択される、複数のｎ－ｍｅｒモチーフを含む。いくつかの実施形態では、標的化部位は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のｎ－ｍｅｒモチーフを含み得、各ｎ－ｍｅｒモチーフは、独立して、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフから選択される。いくつかの実施形態では、標的化部位に含まれるｎ－ｍｅｒモチーフのすべては、同じであり得る（すなわち、同じアミノ酸配列を有する）。複数のｎ－ｍｅｒモチーフが含まれるいくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフの少なくとも２つは、互いに異なる（すなわち、異なるアミノ酸配列を有する）。複数のｎ－ｍｅｒモチーフが含まれるいくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフのすべては、互いに異なる。いくつかの実施形態では、標的化部位に含まれる各ｎ－ｍｅｒモチーフは、配列番号１３～５０、１２７７～２４９３、３７３７～４９７９、６６４７～８３１３、８３１４～８５０２、または８６９２～８８８９に対応する、表１～６及び８～９のいずれかに示されるもののいずれか１つであり得る。
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いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、「ＲＧＤ」モチーフであり、またはそれを含む。「ＲＧＤ」モチーフは、３つの連続アミノ酸としてｎ－ｍｅｒモチーフのその順序でアミノ酸Ｒ、Ｇ、Ｄの存在を有するｎ－ｍｅｒモチーフを指す。いくつかの実施形態では、ＲＧＤモチーフは、一般式ＸｍＲＧＤＸｎ（式中、ｍは０～４アミノ酸であり得、ｎは０～１５アミノ酸であり得、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各アミノ酸はそれぞれ独立して、他のものから選択され得、任意のアミノ酸の群から選択され得る）を有し得る。ｍ＝０またはｎ＝０である場合、これは、ＲＧＤモチーフにおける「ＲＧＤ」に先行するアミノ酸がないこと及び／またはＲＧＤモチーフにおける「ＲＧＤ」に続くアミノ酸がないことを意味することが理解される。いくつかの実施形態では、ｍ＝０である場合、ＲＧＤは、ＲＧＤモチーフの最初の３アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ｎ＝０である場合、ＲＧＤは、ＲＧＤモチーフの最後の３アミノ酸である。いくつかの実施形態では、ｍ＝０及びｎ＝０である場合、ＲＧＤモチーフは、アミノ酸ＲＧＤのみを含有する。例示的なＲＧＤモチーフは、例えば、表１～６及び８～９に示されている。
いくつかの例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、Ｘ１ＲＧＤＸ２（配列番号９１００）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３（配列番号９１０１）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４（配列番号９１０２）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（配列番号９１０３）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号９１０４）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号９１０５）Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号９１０６）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９１０７）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号９１０８）、Ｘ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号９１０９）、またはＸ１ＲＧＤＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号９１１０）である。
いくつかの例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３（配列番号９１１１）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４（配列番号９１１２）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５（配列番号９１１３）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号９１１４）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号９１１５）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号９１１６）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９１１７）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号９１１８）、Ｘ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号９１１９）、またはＸ１Ｘ２ＲＧＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号９１２０）である。
いくつかの例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４（配列番号９１２１）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５（配列番号９１２２）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６（配列番号９１２３）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（配列番号９１２４）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号９１２５）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９１２６）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号９１２７）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号９１２８）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３ＲＧＤＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号９１２９）である。
いくつかの例示的な実施形態では、ＲＧＤモチーフは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５（配列番号９１３０）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６（配列番号９１３１）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７（配列番号９１３２）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号９１３３）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（配列番号９１３４）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号９１３５）、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号９１３６）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＧＤＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号９１３７）である。
いくつかの実施形態では、ＲＧＤモチーフは、ｎ－ｍｅｒモチーフの最初の３つの連続アミノ酸としてアミノ酸ＲＧＤを有する（すなわち、ｍ＝０）。いくつかの例示的な実施形態では、ｎ－ｍｅｒは、ＲＧＤまたはＲＧＤＸｎ（式中、ｎは１～１５アミノ酸であり得、Ｘは任意のアミノ酸であり得、存在する各アミノ酸はそれぞれ独立して、他のものから選択され得、任意のアミノ酸の群から選択され得る）の配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤ（３－ｍｅｒ）、ＲＧＤＸ１（４－ｍｅｒ）、ＲＧＤＸ１Ｘ２（５－ｍｅｒ）（配列番号２）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３（６－ｍｅｒ）（配列番号３）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（７ｍｅｒ）（配列番号４）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（８ｍｅｒ）（配列番号５）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（９－ｍｅｒ）（配列番号６）、ＲＧＤ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７（１０－ｍｅｒ）（配列番号７）、ＲＧＤ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（１１－ｍｅｒ）（配列番号８）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９（１２－ｍｅｒ）（配列番号９）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（１３－ｍｅｒ）（配列番号１０）、ＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（１４－ｍｅｒ）（配列番号１１）、またはＲＧＤＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（１５－ｍｅｒ）（配列番号１２）（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２はそれぞれ独立して、任意のアミノ酸から選択される）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ１は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｍ、Ｖ、Ｑ、またはＭである。いくつかの実施形態では、Ｘ２は、Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、Ａ、またはＩである。いくつかの実施形態では、Ｘ３は、Ｔ、Ｅ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ａ、またはＤである。いくつかの実施形態では、Ｘ４は、Ｐ、Ｙ、Ｋ、Ｌ、Ｈ、Ｔ、またはＳである。いくつかの実施形態では、ＲＧＤモチーフを含むｎ－ｍｅｒモチーフは、筋肉特異的修飾ＡＡＶカプシドに含まれる。
いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、表１～６のいずれか１つにおけるものであり得る。いくつかの実施形態では、表１～６及び８～９のいずれかにおけるｎ－ｍｅｒモチーフは、筋肉特異的修飾カプシドに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、表４～６のいずれか１つにおけるものであり得る。いくつかの実施形態では、表４～６及び８～９のいずれかにおけるｎ－ｍｅｒモチーフは、筋肉特異的修飾カプシドに含まれ得る。
筋肉特異的標的化部位は、カーゴに連結され、またはそうでなければ関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の筋肉特異的標的化部位は、カーゴに直接的に結合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の筋肉特異的標的化部位は、例えば、リンカー分子を介してカーゴに間接的に連結され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の筋肉特異的標的化部位は、カーゴに連結した、カーゴに結合された、カーゴを封入する、及び／または、カーゴを含有するポリペプチドまたは他の粒子に関連付けられるように連結される。
例示的な粒子には、限定されないが、ウイルス粒子（例えば、バクテリオファージカプシドを含むウイルスカプシド）、ポリソーム、リポソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、エクソソーム、ミセルなどが含まれる。用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用される場合、同種または異種物質のナノスケールの沈着物を含む。ナノ粒子は、形状が規則的または不規則的であり得、複合ナノスケール粒子を形成する複数の共沈着粒子のから形成され得る。ナノ粒子は通常、形状が球状であり、または複数の共沈着した通常は球状の粒子から形成された複合形状を有し得る。ナノ粒子についての例示的な形状には、球状、棒状、楕円状、円筒状、円盤状などが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、実質的に球状の形状を有する。
本明細書で使用される場合、用語「特異的」は、２つの部位の間の記載された相互作用に関して使用される場合、第１の部位及び第２の部位の非共有結合性物理的関連性であって、第１の部位と第２の部位との間の関連性が、いずれかの部位と、結合が生じる環境に存在するほとんどまたはすべての他の部位との関連性よりも少なくとも２倍強く、少なくとも５倍強く、少なくとも１０倍強く、少なくとも５０倍強く、少なくとも１００倍強く、またはそれ以上強いものを指す。２つ以上の実体の結合は、平衡解離定数であるＫｄが、用いられる条件下で、例えば、細胞内または細胞生存と調和するものなどの生理的条件下で、１０－３Ｍ以下、１０－４Ｍ以下、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、または１０－１２Ｍ以下である場合、特異的と考えられ得る。いくつかの実施形態では、特異的結合は、複数のより弱い相互作用（例えば、複数の個々の相互作用であって、各々の個々の相互作用が、１０－３Ｍを超えるＫｄによって特性化されるもの）によって達成され得る。いくつかの実施形態では、「分子認識」と称され得る特異的結合は、各実体上の官能基の相補的配置に依存する２つの実体間の飽和可能結合相互作用である。特異的相互作用の例には、プライマー－ポリヌクレオチド相互作用、アプタマー－アプタマー標的相互作用、抗体－抗原相互作用、アビジン－ビオチン相互作用、リガンド－受容体相互作用、金属－キレート相互作用、相補性核酸間のハイブリダイゼーションなどが含まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフに加えて、標的化部位は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはそれらの組み合わせを含み得る。
修飾筋肉標的化ウイルスカプシド
いくつかの実施形態では、筋肉修飾筋肉特異的標的化部位は、ウイルスカプシドタンパク質に組み込まれ、これはひいては修飾ウイルス粒子の修飾ウイルスカプシドに組み込まれ得、よって、筋肉特異的ウイルス粒子を提供する。筋肉特異的修飾ウイルス粒子は、筋肉細胞にカーゴを送達するために有用であり得る。いくつかの実施形態では、標的化部位は、レンチウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、バクテリオファージ、レトロウイルスタンパク質を含むがこれらに限定されないカプシドタンパク質などのウイルスタンパク質に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフ（ＲＧＤまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフなど）は、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフのうちの１つ以上がウイルスカプシドの外部となる（すなわち、ウイルスカプシドの表面上に提示される）ように、ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸の間に配置される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する組成物は、増加した筋肉細胞効力、筋肉細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する。
カーゴには、本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位に連結され、または関連付けられることが可能な任意の分子が含まれる。カーゴには、限定されないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、リボタンパク質、脂質、糖類、薬学的活性剤（例えば、薬物、造影剤及び他の診断剤など）、化学的化合物、及びそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、カーゴは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド（複数可）、ポリペプチド（複数可）、抗体（複数可）、アプタマー（複数可）、リボザイム（複数可）、必須腫瘍タンパク質及び遺伝子の翻訳または転写を阻害するリボザイムのためのガイド配列（複数可）、ホルモン（複数可）、免疫調節剤（複数可）、解熱剤（複数可）、抗不安剤（複数可）、抗精神病剤（複数可）、鎮痛剤（複数可）、鎮痙剤（複数可）、抗炎症剤（複数可）、抗ヒスタミン剤（複数可）、抗感染症剤（複数可）、放射線増感剤（複数可）、化学療法剤（複数可）、放射性化合物（複数可）、造影剤（複数可）、遺伝子改変剤（複数可）、及びそれらの組み合わせであり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、カーゴは、筋肉疾患または障害を処置または予防することが可能である。いくつかの実施形態では、筋肉疾患または障害は、（ａ）自己免疫疾患；（ｂ）がん；（ｃ）筋ジストロフィー；（ｄ）神経筋疾患；（ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症；（ｆ）伸長リピート病；（ｇ）ドミナントネガティブ疾患；（ｈ）心筋症；（ｉ）ウイルス性疾患；（ｊ）早老性疾患；または（ｋ）それらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。いくつかの実施形態では、筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。いくつかの実施形態では、糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。いくつかの実施形態では、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。いくつかの実施形態では、神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
いくつかの実施形態では、カーゴは、モルホリノ、ペプチド連結モルホリノ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ、治療用導入遺伝子、治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＰＰＭＯ、１つ以上のペプチド、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、リボヌクレオタンパク質であって、リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を含む、リボヌクレオタンパク質、治療用導入遺伝子ＲＮＡ、または他の遺伝子改変もしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、カーゴは、遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
いくつかの実施形態では、カーゴは、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である。
いくつかの実施形態では、カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である。いくつかの実施形態では、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、２、３、１６、１７、及び２４、ならびに任意にｎＮＯＳドメインを含む。
修飾筋肉標的化ＡＡＶカプシド及びＡＡＶ
いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的標的化部位は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドに組み込まれる。本明細書には、細胞特異的指向性を修飾ＡＡＶ粒子に付与するように修飾され得る修飾ＡＡＶカプシドの様々な実施形態が記載されている。修飾カプシドは、修飾ウイルス粒子に含まれ得、細胞特異的指向性、減少した免疫原性、またはその両方を修飾ＡＡＶ粒子に付与し得る。本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドは、本明細書に記載の１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフの１つ以上は、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフであり、またはそれを含有する。そのようなモチーフは、本明細書の他の個所でより詳細に定義され、記載されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質に組み込まれる１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフの１つ以上は、ｎ－ｍｅｒモチーフ（複数可）を有する修飾カプシドを有するＡＡＶウイルス粒子に筋肉特異性を付与し得る。
修飾ＡＡＶカプシド及び／またはカプシドタンパク質は、１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドは、３’ポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルであり得る。
修飾ＡＡＶカプシドは、野生型ＡＡＶカプシドのバリアントであり得る。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３カプシドタンパク質またはそれらの組み合わせから構成され得る。すなわち、修飾ＡＡＶカプシドは、野生型ＶＰ１、野生型ＶＰ２、及び／または野生型ＶＰ３カプシドタンパク質の１つ以上のバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、参照野生型ＡＡＶカプシドの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、野生型ＡＡＶカプシドの血清型は、ＡＡＶ－９であり得る。修飾ＡＡＶカプシドは、参照野生型ＡＡＶカプシドのものとは異なる指向性を有し得る。
修飾ＡＡＶカプシドは、１～６０個の修飾カプシドタンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９から／または６０個の修飾カプシドタンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドは、０～５９個の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８から／または５９個の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含有し得る。
いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質は、ｎ－ｍｅｒアミノ酸モチーフ（ｎは、少なくとも３アミノ酸であり得る）を有する。いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドは、６－ｍｅｒまたは７－ｍｅｒアミノ酸モチーフを有し得る。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒアミノ酸モチーフは、野生型ウイルスタンパク質（ＶＰ）（またはカプシドタンパク質）における２つのアミノ酸間に挿入される。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＡＡＶカプシドタンパク質における可変アミノ酸領域における２つのアミノ酸の間に挿入され得る。各野生型ＡＡＶウイルスタンパク質のコアは、自立性パロウイルスカプシドに保存されている八本鎖ベータバレルモチーフ（ベータＢからベータＩ）及びアルファヘリックス（アルファＡ）を含有する（例えば、ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（１２）：６９４７－６９５８を参照されたい）。構造的可変領域（ＶＲ）は、カプシド表面における局所的バリエーションを生成するためにクラスター化するベータ鎖と接続する表面ループにおいて生じる。ＡＡＶは、１２個の可変領域（超可変領域とも称される）を有する（例えば、Ｗｅｉｔｚｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｎｄｅｎ．２０１１．“Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ．” Ｉｎ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．，Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．（ｅｄｓ．）Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフは、野生型ＡＶＶカプシドタンパク質における１２個の可変領域の１つ以上における２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフはそれぞれ、ＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＸ、ＶＲ－Ｘ、ＶＲ－ＸＩ、ＶＲ－ＸＩＩ、またはそれらの組み合わせにおける２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒは、カプシドタンパク質のＶＲ－ＩＩＩにおける２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態では、修飾カプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸２６２及び２６９の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸３２７及び３３２の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸３８２及び３８６の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸４５２及び４６０の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸４８８及び５０５の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸５４５及び５５８の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸５８１及び５９３の間の任意の２つの連続アミノ酸の間、アミノ酸７０４及び７１４の間の任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されたｎ－ｍｅｒを有し得る。いくつかの実施形態では、修飾カプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸５８８及び５８９の間に挿入されたｎ－ｍｅｒを有し得る。いくつかの実施形態では、修飾カプシドは、ＡＡＶ９ウイルスタンパク質のアミノ酸５８８及び５８９の間に挿入された７－ｍｅｒモチーフを有し得る。配列番号１は、少なくとも上記で論述される挿入部位を参照するための参照ＡＡＶ９カプシド配列である。ｎ－ｍｅｒは、他の血清型のＡＡＶウイルスタンパク質における類似位置において挿入され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、先に論述されているように、ｎ－ｍｅｒ（複数可）は、ＡＡＶウイルスタンパク質内の任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入され得、いくつかの実施形態では、挿入は、可変領域において行われる。
配列番号１ ＡＡＶ９カプシド参照配列．
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ
いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒモチーフは、表１～３に示される核酸によって示される、またはコードされる任意のアミノ酸モチーフであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドにおけるｎ－ｍｅｒモチーフの挿入は、細胞、組織、器官に特異的な修飾ＡＡＶカプシドをもたらし得る。いくつかの実施形態では、修飾カプシドは、筋肉細胞に対する特異性（または指向性）を有する。いくつかの実施形態では、修飾カプシドは、骨組織及び／または細胞、肺組織及び／または細胞、肝臓組織及び／または細胞、膀胱組織及び／または細胞、腎臓組織及び／または細胞、心臓組織及び／または細胞、骨格筋組織及び／または細胞、平滑筋及び／または細胞、ニューロン組織及び／または細胞、腸組織及び／または細胞、膵臓組織及び／または細胞、副腎組織及び／または細胞、脳組織及び／または細胞、腱組織または細胞、皮膚組織及び／または細胞、脾臓組織及び／または細胞、眼組織及び／または細胞、血液細胞、滑液細胞、免疫細胞（特定のタイプの免疫細胞に対する特異性を含む）、ならびにそれらの組み合わせに対する特異性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、筋肉特異的である。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドの筋肉特異性は、修飾ＡＡＶカプシドに組み込まれた筋肉特異的ｎ－ｍｅｒモチーフによって付与される。理論に縛られることを意図するものではないが、ｎ－ｍｅｒモチーフは、前記修飾ＡＡＶカプシドを含有する修飾ＡＡＶの相互作用が、筋肉細胞の表面上の細胞表面受容体及び／または他の分子との増加または改善した相互作用（例えば、増加した親和性）を有するように修飾ＡＡＶカプシドのドメインまたは領域にまたはその中に３Ｄ構造を付与すると考えられる。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体は、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）である。いくつかの実施形態では、細胞表面受容体は、筋肉細胞特異的ＡＡＶ受容体である。いくつかの実施形態では、筋肉特異的カプシドを含有する筋肉特異的修飾ＡＡＶは、本明細書に記載される筋肉特異的修飾ＡＡＶカプシドを含有しない他の細胞タイプ及び／または他のＡＡＶと比較して、筋肉細胞における増加した形質導入速度、効率、量、またはそれらの組み合わせを有し得る。
筋肉特異的標的化部位を生成する方法
本明細書では、修飾ＡＡＶカプシドを生成する方法も提供される。修飾ＡＡＶカプシドバリアントは、野生型ＡＡＶカプシドのバリアントであり得る。図６～８は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドを生成することが可能な方法の様々な実施形態を説明し得る。通常、ＡＡＶカプシドライブラリは、適切なＡＡＶプロデューサー細胞株において前述の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドをそれぞれ含有する修飾カプシドベクターを発現させることによって生成され得る。例えば、図８を参照されたい。図８は、ヘルパー依存性のＡＡＶ粒子生成方法を示していることが理解されるが、これは、ヘルパーフリーの方法を介して同様に行われ得ることが理解される。これは、１つ以上の所望の細胞特異的修飾ＡＡＶカプシドバリアントを含有し得るＡＡＶカプシドライブラリを生成し得る。図６に示されているように、ＡＡＶカプシドライブラリは、第１ラウンドのｍＲＮＡベースの選択のために様々な非ヒト動物に投与され得る。図１に示されているように、ＡＡＶ及び関連ベクターによる形質導入プロセスは、細胞を形質導入したウイルスのゲノムを反映するｍＲＮＡ分子の生成をもたし得る。少なくとも本明細書の実施例において実証されるように、ｍＲＮＡベースの選択は、細胞を機能的に形質導入することが可能なウイルス粒子を決定するのにより特異的かつ有効であり得るが、その理由は、それが、ウイルスＤＮＡの存在を測定することによって細胞におけるウイルス粒子の存在を単に検出することとは対照的に、生成された機能性生成物に基づいているからである。
第１ラウンドの投与後、所望のカプシドバリアントを有する１つ以上の修飾ＡＡＶウイルス粒子は次いで、フィルタリングされたＡＡＶカプシドライブラリを形成するために使用され得る。所望のＡＡＶウイルス粒子は、カプシドバリアントのｍＲＮＡ発現を測定し、どのバリアントが所望ではない細胞タイプ（複数可）と比較して所望の細胞タイプ（複数可）において高度に発現するかを決定することによって同定され得る。所望の細胞、組織、及び／または器官タイプで高度に発現するものは、所望のＡＡＶカプシドバリアント粒子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、所望の細胞、組織、または器官において選択的活性を有する組織特異的プロモーターの制御下にある。
第１ラウンドから同定された修飾ＡＡＶカプシドバリアント粒子は次いで、様々な非ヒト動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、選択及び同定の第２ラウンドにおいて使用される動物は、第１ラウンドの選択及び同定のために使用されたそれらの動物と同じではない。ラウンド１と同様に、投与後、所望の細胞、組織、及び／または器官タイプ（複数可）における上位発現バリアントが、細胞におけるウイルスｍＲＮＡ発現を測定することによって同定され得る。ラウンド２後に同定された上位バリアントは次いで、任意にバーコーディングされ、任意にプールされ得る。いくつかの実施形態では、第２ラウンドからの上位バリアントは次いで、特に上位バリアントの最終使用がヒトにおけるものである場合、上位細胞特異的バリアント（複数可）を同定するために非ヒト霊長類に投与され得る。各ラウンドでの投与は、全身性であり得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドバリアントを生成する方法は、（ａ）細胞において修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含有する本明細書に記載のベクターシステムを発現させて、修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを生成する工程；（ｂ）工程（ａ）において生成された修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを収集する工程；（ｃ）修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを１つ以上の第１の対象に投与する工程であって、修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントは、細胞において修飾ＡＡＶカプシドバリアントベクターまたはそのシステムを発現させ、細胞によって生成された修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを収集することによって生成される、工程；及び（ｄ）１つ以上の第１の対象における１つ以上の特定の細胞または特定の細胞タイプによって有意に高いレベルで生成される１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドバリアントを同定する工程を含み得る。この文脈において、「有意に高い」は、１５ｃｍディッシュ当たり約２ｘ１０１１～約６ｘ１０１２ベクターゲノムの間の範囲であり得る力価を指し得る。
方法は、（ｅ）工程（ｄ）において同定されたいくつかのまたはすべての修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを１つ以上の第２の対象に投与する工程；及び（ｆ）１つ以上の第２の対象における１つ以上の特定の細胞または特定の細胞タイプにおいて有意に高いレベルで生成される１つ以上の修飾ＡＡＶウイルス粒子カプシドバリアントを同定する工程をさらに含み得る。工程（ａ）における細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）、工程（ｅ）、またはその両方における投与は、全身性である。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１の対象、１つ以上の第２の対象、またはその両方は、非ヒト哺乳動物である。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１の対象、１つ以上の第２の対象、またはその両方は、それぞれ独立して、野生型非ヒト哺乳動物、ヒト化非ヒト哺乳動物、疾患特異的非ヒト哺乳動物モデル、及び非ヒト霊長類からなる群から選択される。
筋肉特異的標的化部位を開発する他の方法及び詳細は、例えば、米国仮出願整理番号６２／８９９，４５３、６２／９１６，２０７、６３／０１８，４５４、６３／０５５，２５２、及び６２／９１６，２２１ならびに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／５０５３４に記載されている。
修飾筋肉特異的標的化部位をコードするポリヌクレオチド、ベクター、及びベクターシステム
本明細書には、１つ以上の筋肉特異的修飾標的化部位をコードするポリヌクレオチドならびにそのベクター及び／またはベクターシステムが記載されている。いくつかの実施形態では、コーディングポリヌクレオチド、ベクター、及び／またはベクターシステムは、修飾筋肉特異的標的化部位を発現及び／または生成するために、修飾筋肉特異的標的化部位を１つ以上の他のポリペプチドに連結させるために、及び／または本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含むカーゴを任意に含有するウイルス粒子などの粒子を生成するために使用され得る。用語「修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、修飾筋肉特異的標的化部位をコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「コードする」は、ＤＮＡがＲＮＡに転写され得、次いでそれがタンパク質を形成し得るアミノ酸配列に翻訳され得る原理を指す。よって、後続のポリヌクレオチド（ＲＮＡ種など）またはタンパク質をコードすると言われるポリヌクレオチドはまた、コーディングポリヌクレオチドと称され得、後に転写及び／または翻訳されるＤＮＡ分子ならびに翻訳されるＲＮＡ分子を指す。
本明細書では、本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）の１つ以上を含有し得るベクター及びベクターシステムも提供される。この文脈において、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドは、本明細書の他の個所に記載されている修飾ＡＡＶカプシドをコードすることが可能な本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／または本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードすることが可能なポリヌクレオチド（複数可）の任意の１つ以上を指す。さらに、ベクターが本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）を含む場合、ベクターはまた、修飾ベクターまたはそのシステムと称され、かつみなされ得るが、特にそのようなものとして示されない。実施形態では、ベクターは、本明細書に記載のＡＡＶカプシドなどの修飾ウイルスカプシドの１つ以上の要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有し得る。ベクター及びそのシステムは、本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位または筋肉特異的標的化部位を含有する組成物を発現し得る細菌、真菌、酵母、植物細胞、動物細胞、及びトランスジェニック動物の生成において有用であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター及びそのシステムは、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドの１つ以上の成分を発現し得る細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞、またはトランスジェニック生物（例えば、植物、動物）の生成において有用であり得る。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列の１つ以上を含有するベクターは、本開示の範囲内である。本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシド及びそのシステムの一部であるポリヌクレオチドの１つ以上は、ベクターまたはベクターシステムに含まれ得る。
ベクター及び／またはベクターシステムは、例えば、プロデューサー細胞などの細胞において修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）の１つ以上を発現させて、本明細書の他の個所に記載されている修飾ウイルスカプシドを含有する修飾ウイルス粒子（例えば、修飾ＡＡＶカプシドを含有するＡＡＶ）を生成するために使用され得る。本明細書に記載のベクター及びベクターシステムのための他の使用もまた、本開示の範囲内である。一般的に、また、本明細書を通して、その用語は、実体をある環境から別の環境に移行することを可能にし、または容易化するツールである。当業者によって理解されるいくつかの文脈では、「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すための当該技術分野の用語であり得る。ベクターは、挿入セグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得るプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり得る。通常、ベクターは、適切な制御要素に関連付けられた場合、複製が可能である。
ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的二本鎖の核酸分子；１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で知られている他の類型のポリヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。１つのタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントが標準的な分子クローニング技術などによって挿入され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ウイルス由来のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためのベクターに存在する。ウイルスベクターにはまた、宿主細胞へのトランスフェクションのためのウイルスによって保有されるポリヌクレオチドが含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能である。そのようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ技術において実用性のある一般的な発現ベクターはしばしば、プラスミドの形態である。
組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）から構成され得、これは、組換え発現ベクターには、発現させられる核酸配列と機能的に連結された、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の制御要素が含まれることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「機能可能に連結された」及び「機能的に連結された」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書の他の個所でさらに定義される。ベクターの文脈において、用語「機能可能に連結された」は、対象となるヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおいてまたはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で制御要素（複数可）に連結されることを意味することが意図されている。有利なベクターには、アデノ随伴ウイルスが含まれ、そのようなベクターのタイプ、例えば、筋肉特異的指向性などの所望の細胞特異的指向性を有する修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含有するそれらの修飾ＡＡＶベクターはまた、特定の細胞タイプを標的とすることについて選択され得る。ベクター及びベクターシステムのこれらの及び他の実施形態は、本明細書の他の個所に記載されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、バイシストロニックベクターであり得る。いくつかの実施形態では、バイシストロニックベクターは、本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）システムを発現させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）の発現は、好適な構成的または組織特異的プロモーターによって誘導され得る。そのような実施形態は、筋肉特異的標的化部位を生成するのに有利であり得、これは本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。修飾ＡＡＶカプシドシステムの要素がＲＮＡである場合、その発現は、Ｕ６プロモーターなどのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターによって誘導され得る。いくつかの実施形態では、その２つが組み合わされる。
細胞ベースのベクター増幅及び発現
ベクターは、好適な宿主細胞における本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）もしくは１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）を含むシステムまたはその生成物（例えば、核酸転写産物、タンパク質、酵素、及びそれらの組み合わせ）の発現のために設計され得る。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、原核細胞である。好適な宿主細胞には、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が含まれるがこれらに限定されない。ベクターは、ウイルスベースまたは非ウイルスベースであり得る。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、好適な細菌細胞である。好適な細菌細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種の細菌からの細菌細胞が含まれるがこれに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉの多くの好適な株が、ベクターの発現のために当該技術分野で知られている。これらには、Ｐｉｒ１、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、Ｓｔｂｌ４、ＴＯＰ１０、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ、及びＸＬ１０ Ｇｏｌｄが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適な昆虫細胞である。好適な昆虫細胞には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからのものが含まれる。Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の好適な株には、Ｓｆ９及びＳｆ２１が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適な酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのものであり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、好適な哺乳動物細胞である。多くのタイプの哺乳動物細胞がベクターを発現させるために開発されてきた。好適な哺乳動物細胞には、ＨＥＫ２９３、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、マウス骨髄腫細胞、ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、ＣＡＤ、Ｐ１９、ＮＩＨ ３Ｔ３、Ｌ９２９、Ｎ２ａ、ＭＣＦ－７、Ｙ７９、ＳＯ－Ｒｂ５０、ＨｅｐＧ Ｇ２、ＤＩＫＸ－Ｘ１１、Ｊ５５８Ｌ、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、及びニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）が含まれるがこれらに限定されない。好適な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに論述されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、酵母発現ベクターであり得る。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。本明細書で使用される場合、「酵母発現ベクター」は、ＲＮＡ及び／またはポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含有する核酸を指し、核酸（複数可）の発現を制御する任意の所望の要素、ならびに酵母細胞内で発現ベクターの複製及び維持を可能とする任意に要素をさらに含有し得る。多くの好適な酵母発現ベクター及びその特徴は、当該技術分野で知られている；例えば、様々なベクター及び技術は、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｘｉａｏ，Ｗ．，ｅｄ．（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００７）及びＢｕｃｋｈｏｌｚ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｍ．Ａ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９（１１）：１０６７－７２に示されている。酵母ベクターは、限定されないが、セントロメア（ＣＥＮ）配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、対象となる配列または遺伝子に機能可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーターなどのターミネーター、複製起点、及びマーカー遺伝子（例えば、栄養要求性、抗生物質、または他の選択マーカー）を含有し得る。酵母において使用するための発現ベクターの例には、プラスミド、酵母人工染色体、２μプラスミド、酵母組み込み型プラスミド、酵母複製型プラスミド、シャトルベクター、及びエピソームプラスミドが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、バキュロウイルスベクターまたは発現ベクターであり、昆虫細胞におけるポリヌクレオチド及び／またはタンパク質の発現に好適であり得る。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が含まれる。ｒＡＡＶ（組換えアデノ随伴ウイルス）ベクターは好ましくは、昆虫細胞、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞において生成され、無血清浮遊培養で増殖させられる。無血清昆虫細胞は、商業的ベンダー、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ＥＸ－ＣＥＬＬ ４０５）から購入することができる。
いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物細胞において１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドを発現させることが可能である。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７－１９５）が含まれるがこれらに限定されない。哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物細胞において１つ以上のポリヌクレオチド及び／またはタンパク質の発現を制御することが可能な１つ以上の好適な制御要素を含み得る。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０、ならびに本明細書に開示される及び当該技術分野で知られている他のものに由来する。好適な制御要素に関するさらなる詳細は、本明細書の他の個所に記載されている。
原核細胞及び真核細胞の両方のための他の好適な発現ベクター及びベクターシステムについては、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプにおいて優先的に核酸の発現を誘導することが可能である（例えば、組織特異的制御要素が核酸を発現させるために使用される）。組織特異的制御要素は、当該技術分野で知られている。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８－２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５－２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９－７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１－７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許番号４，８７３，３１６及び欧州出願公開番号２６４，１６６）が含まれる。発達制御プロモーター、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４－３７９）及びα－フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７－５４６）も包含される。これらの原核及び真核ベクターに関しては、米国特許６，７５０，０５９（その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に言及される。他の実施形態は、ウイルスベクターを利用し得、それに関して米国特許出願１３／０９２，０８５（その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に言及される。組織特異的制御要素は、当該技術分野で知られており、この点に関して、米国特許７，７７６，３２１（その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に言及される。いくつかの実施形態では、制御要素は、１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）及び／または１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）を含むシステムまたはその生成物の１つ以上の要素に機能可能に連結されまたは結合され得、これにより、本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）またはそのシステムの１つ以上の要素の発現を誘導する。
ベクターは、原核細胞または原核細胞において導入され、増殖させられ得る。いくつかの実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するためにまたは真核細胞に導入されるベクターの生成における中間ベクターとして（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅させる）使用される。いくつかの実施形態では、原核生物は、宿主細胞または宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するように、ベクターのコピーを増幅し、１つ以上の核酸を発現させるために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、融合ベクターまたは融合発現ベクターであり得る。いくつかの実施形態では、融合ベクターは、多数のアミノ酸を、それにおいてコードされたタンパク質に、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方に付加する。そのような融合ベクターは、１つ以上の目的を果たすように機能し、例えば、（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させる；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解性を増加させる；及び（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を補助するように機能し得る。いくつかの実施形態では、原核生物におけるポリヌクレオチド（ノンコーディングポリヌクレオチドなど）及びタンパク質の発現は、融合または非融合ポリヌクレオチド及び／またはタンパク質のいずれかの発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて行われ得る。いくつかの実施形態では、融合発現ベクターは、融合ベクター骨格または他の融合部位及び組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の接合点で導入され得るタンパク質分解切断部位を含むことで、融合ポリヌクレオチドまたはタンパク質の精製の後に融合ベクター骨格または他の融合部位からの組換えポリヌクレオチドまたはタンパク質の分離を可能にし得る。そのような酵素、及びそれらの類似認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。例示的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１－４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が含まれ、これらはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させる。好適な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０－８９）が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）、ベクター、及び／またはそのベクターシステムの発現を誘導する１つ以上のベクターは、本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドを含むがこれに限定されない）、ベクター、及び／またはベクターシステムの発現が、修飾筋肉特異的標的化部位及び／または本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含む組成物または修飾筋肉特異的送達システムの形成を誘導するように宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的送達システムは、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含有する修飾カプシドを含有する修飾ＡＡＶ粒子などのウイルス粒子である。例えば、修飾筋肉特異的送達システムの異なる要素は、同じまたは別のベクター上で別の制御要素に機能可能に連結され得る。１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含み得る本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの異なる要素のＲＮＡ（複数可）は、動物または哺乳動物またはその細胞に送達されて、本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの異なる要素を構成的に、誘導的に、または条件付きで発現し、または本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の要素を組み込み、及び／または発現する１つ以上の細胞を含有する動物または哺乳動物またはその細胞を生成し得る。
いくつかの実施形態では、同じまたは異なる制御要素（複数可）から発現する要素の２つ以上は、第１のベクターに含まれないシステムの任意の成分を提供する１つ以上の追加のベクターと共に、単一のベクターにおいて組み合わされ得る。単一のベクターにおいて組み合わされる修飾筋肉特異的送達システムポリヌクレオチド（修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドを含むがこれらに限定されない）は、任意の好適な配向で配置され得、例えば、１つ目の要素は２番目の要素に対して５’（「上流」）または３’（「下流」）に位置する。１つ目の要素のコーディング配列は、２つ目の要素のコーディング配列の同じまたは反対の鎖に位置し、同じまたは反対の方向で配向され得る。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターは、１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれた１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（例えば、異なるイントロンにおける各々、少なくとも１つのイントロンにおける２つ以上、または単一のイントロンにおけるすべて）をコードする転写産物の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、２つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドは、同じプロモーターに機能可能に連結され、それから発現し得る。
ベクターの特徴
ベクターは、ベクター、送達されるポリヌクレオチド、それから生成されるウイルス粒子、またはそれから発現するポリペプチドに１つ以上の機能を付与し得る追加の特徴を含み得る。そのような特徴には、制御要素、選択マーカー、分子識別子（例えば、分子バーコード）、安定化要素などが含まれるがこれらに限定されない。含まれる発現ベクター及び追加の特徴の設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどのような要素に依存し得ることが当業者によって理解される。
制御要素
実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチド及び／またはそのベクター（本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドなど）は、ポリヌクレオチドに機能的に連結され得る１つ以上の制御要素を含み得る。用語「制御要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御要素（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ－Ｕ配列）が含まれることが意図されている。そのような制御要素は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。制御要素には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を誘導するもの及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を誘導するもの（例えば、組織特異的制御配列）が含まれる。組織特異的プロモーターは、主に対象となる所望の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞タイプ（例えば、リンパ球）における発現を誘導し得る。制御要素はまた、時間依存的様式、例えば、細胞周期依存的または発達段階依存的様式で発現を誘導し得、これは組織または細胞タイプ特異的である場合があり、またはそうではない場合がある。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、またはそれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例には、Ｕ６及びＨ１プロモーターが含まれるがこれらに限定されない。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例には、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１－５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが含まれるがこれらに限定されない。エンハンサー要素、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ－ＩのＬＴＲにおけるＲ－Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６－４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ－グロビンのエクソン２及び３の間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７－３１，１９８１）も用語「制御要素」に包含される。
いくつかの実施形態では、制御配列は、米国特許番号７，７７６，３２１、米国特許公開番号２０１１／００２７２３９、及びＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８９２９（これらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている制御配列であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、最小プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、最小プロモーターは、Ｍｅｃｐ２プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、またはＵ６である。さらなる実施形態では、最小プロモーターは、組織特異的である。いくつかの実施形態では、ベクターポリヌクレオチド最小プロモーター及びポリヌクレオチド配列の長さは、４．４Ｋｂ未満である。
ポリヌクレオチドを発現させるため、ベクターは、細胞における遺伝子の転写及び／またはコードされたタンパク質の翻訳を誘導する１つ以上の転写及び／または翻訳開始制御配列、例えば、プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが用いられ得る。哺乳動物細胞のための好適な構成的プロモーターは通常、当該技術分野で知られており、ＳＶ４０、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、β－アクチン、ＲＳＶ、及びＰＧＫが含まれるがこれらに限定されない。細菌細胞、酵母細胞、及び真菌細胞のための好適な構成的プロモーター、例えば、細菌発現のためのＴ－７プロモーター及び酵母における発現のためのアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターは通常、当該技術分野で知られている。
いくつかの実施形態では、制御要素は、制御されたプロモーターであり得る。「制御されたプロモーター」は、構成的ではなく、時間的及び／または空間的に制御された様式で遺伝子発現を誘導するプロモーターを指し、組織特異的、組織優先的及び誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、制御されたプロモーターは、本明細書の他の個所で先に論述されている組織特異的プロモーターある。制御されたプロモーターには、条件付きプロモーター及び誘導性プロモーターが含まれる。いくつかの実施形態では、条件付きプロモーターは、特定の環境条件下で、及び／または発達の特定状態の間に、特定の細胞タイプでポリヌクレオチドの発現を誘導するために用いられ得る。好適な組織特異的プロモーターには、肝臓特異的プロモーター（例えば、ＡＰＯＡ２、ＳＥＲＰＩＮ Ａ１（ｈＡＡＴ）、ＣＹＰ３Ａ４、及びＭＩＲ１２２）、膵臓細胞プロモーター（例えば、ＩＮＳ、ＩＲＳ２、Ｐｄｘ１、Ａｌｘ３、Ｐｐｙ）、心臓特異的プロモーター（例えば、Ｍｙｈ６（アルファＭＨＣ）、ＭＹＬ２（ＭＬＣ－２ｖ）、ＴＮＩ３（ｃＴｎｌ）、ＮＰＰＡ（ＡＮＦ）、Ｓｌｃ８ａ１（Ｎｃｘ１））、中枢神経系細胞プロモーター（ＳＹＮ１、ＧＦＡＰ、ＩＮＡ、ＮＥＳ、ＭＯＢＰ、ＭＢＰ、ＴＨ、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３ベータ））、皮膚細胞特異的プロモーター（例えば、ＦＬＧ、Ｋ１４、ＴＧＭ３）、免疫細胞特異的プロモーター、（例えば、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ４３プロモーター、ＣＤ１４プロモーター、ＣＤ４５プロモーター、ＣＤ６８プロモーター）、泌尿生殖器細胞特異的プロモーター（例えば、Ｐｂｓｎ、Ｕｐｋ２、Ｓｂｐ、Ｆｅｒ１ｌ４）、内皮細胞特異的プロモーター（例えば、ＥＮＧ）、多能性及び胚胚芽層細胞特異的プロモーター（例えば、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、合成Ｏｃｔ４、Ｔブラキウリ、ＮＥＳ、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＭＩＲ１２２）、及び筋肉細胞特異的プロモーター（例えば、デスミン）が含まれ得るがこれらに限定されない。他の組織及び／または細胞特異的プロモーターは、本明細書の他の個所で論述されており、通常、当該技術分野で知られ得るものであり、本開示の範囲内である。
誘導性／条件付きプロモーターは、正の誘導性／条件付きプロモーター（例えば、活性化した活性化因子、またはインデューサー（化合物、環境条件、または他の刺激物）との適切な相互作用によりポリヌクレオチドの転写を活性化するプロモーター、または負の／条件付き誘導性プロモーター（例えば、プロモーターのリプレッサー条件が除かれるまで抑制される（例えば、リプレッサーによって結合した）プロモーター（例えば、インデューサーは、プロモーターに結合したリプレッサーに結合し、リプレッサーによるプロモーターの解放またはプロモーター環境から化学的リプレッサーの除去を刺激する）であり得る。インデューサーは、化合物、環境条件、または他の刺激物であり得る。よって、誘導性／条件付きプロモーターは、任意の好適な刺激物、例えば、化学的、生物学的、または他の分子物質、温度、光、及び／またはｐＨに対して反応性であり得る。好適な誘導性／条件付きプロモーターには、Ｔｅｔ－Ｏｎ、Ｔｅｔ－Ｏｆｆ、Ｌａｃプロモーター、ｐＢａｄ、ＡｌｃＡ、ＬｅｘＡ、Ｈｓｐ７０プロモーター、Ｈｓｐ９０プロモーター、ｐＤａｗｎ、ＸＶＥ／ＯｌｅｘＡ、ＧＶＧ、及びｐＯｐ／ＬｈＧＲが含まれるがこれらに限定されない。
植物細胞における発現が所望される場合、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステムの成分は典型的には、植物プロモーター、すなわち、植物細胞において機能可能なプロモーターの制御下に置かれる。異なるタイプのプロモーターの使用が想定される。いくつかの実施形態では、植物における修飾ＡＡＶカプシドシステムベクターの包含は、ＡＡＶベクター生成目的のためのものであり得る。
構成的植物プロモーターは、すべてのまたはほぼすべての植物組織において植物のすべてのまたはほぼすべての発達段階の間に制御するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現（「構成的発現」と称される）させることができるプロモーターである。構成的プロモーターの１つの非限定的な例は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターである。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞タイプにおける、または異なる発達段階における、または異なる環境条件に反応して遺伝子の発現を誘導し得る。特定の実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドシステム成分の１つ以上は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターなどの構成的プロモーターの制御下で発現し、組織優先的プロモーターは、特定の植物組織内の特定の細胞タイプ、例えば、葉もしくは根における維管束細胞または種子の特定の細胞における発現の向上を標的とするために利用され得る。修飾ＡＡＶカプシドシステムにおいて使用するための具体的なプロモーターの例は、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：７９２－８０３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｊ １２：２５５－６５；Ｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ，（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：２０７－１８、Ｋｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９：７５９－７２、及びＣａｐａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：６８１－９１に見られる。
誘導性であり、遺伝子編集または遺伝子発現の時空制御を可能にし得るプロモーターの例は、エネルギーの形態を使用し得る。エネルギーの形態には、音エネルギー、電磁波放射、化学的エネルギー及び／または熱エネルギーが含まれ得るがこれらに限定されない。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、または光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、またはクリプトクロム）、例えば、配列特異的様式で転写活性の変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が含まれる。光誘導性システムの成分は、本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の要素、光反応性シトクロムヘテロ二量体（例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１４／０１８４２３及び米国公開２０１５／０２９１９６６、２０１７／０１６６９０３、２０１９／０２０３２１２で提供された誘導性ＤＮＡ結合タンパク質の１つ以上を含み得、これらには、例えば、誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及び使用方法の実施形態が記載されており、本発明と共に使用するために適応され得る。
いくつかの実施形態では、一過性または誘導性発現は、例えば、化学的に制御されたプロモーターを含めることによって達成され得る、すなわち、外因性化学物質の適用が遺伝子発現を誘導する。遺伝子発現の調節はまた、化学的抑制性プロモーターを含めることによって得られ得、この場合、化学物質の適用が遺伝子発現を抑制する。化学的誘導性プロモーターには、ベンゼンスルホンアミド除草剤薬害軽減剤によって活性化されるトウモロコシｌｎ２－２プロモーター（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３８：５６８－７７）、発芽前除草剤として使用される疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター（ＧＳＴ－ｌｌ－２７、ＷＯ９３／０１２９４）、及びサリチル酸によって活性化されるタバコＰＲ－１プロモーター（Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６８：８０３－７）が含まれるがこれらに限定されない。抗生物質によって制御されるプロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性及びテトラサイクリン抑制性プロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．，（１９９１ ）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２７：２２９－３７；米国特許番号５，８１４，６１８及び５，７８９，１５６）も本明細書で使用され得る。
いくつかの実施形態では、ベクターまたはそのシステムは、特定の細胞成分または細胞小器官に／において修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドを移行及び／または発現させることが可能な１つ以上の要素を含み得る。そのような細胞小器官には、核、リボソーム、小胞体、ゴルジ装置、葉緑体、ミトコンドリア、空胞、リソソーム、細胞骨格、細胞膜、細胞壁、ペルオキシソーム、中心小体などが含まれ得るがこれらに限定されない。
選択マーカー及びタグ
修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドの１つ以上は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る選択マーカーまたはタグであり、またはそれをコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結され、それに融合され、またはそうでなければそれを含むように改変され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチド選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、修飾筋肉特異的送達システムポリヌクレオチドに組み込まれ、これにより選択マーカーポリヌクレオチドは、翻訳された場合、修飾筋肉特異的標的化部位ポリペプチド（修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むがこれに限定されない）のＮ末端とＣ末端との間の２つのアミノ酸の間または修飾筋肉特異的標的化部位ポリペプチド（修飾ＡＡＶカプシドポリペプチドを含むがこれに限定されない）のＮ末端及び／またはＣ末端で挿入される。いくつかの実施形態では、選択マーカーまたはタグは、ポリヌクレオチドバーコードまたは固有分子識別子（ＵＭＩ）である。
用語「バーコード」は、本明細書で使用される場合、関連分子、例えば、標的分子及び／または標的核酸のための識別子として、または関連分子源、例えば、細胞起源の識別子として使用されるヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の短い配列を指す。バーコードはまた、核酸断片の起源を同定するために使用され得る任意の独自の天然に存在しない核酸配列を指し得る。発明のメカニズムを理解する必要はないが、バーコード配列は、複数の種が一緒にシーケンシングされ得るようにシングルセル、ウイルスベクター、標識リガンド（例えば、アプタマー）、タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｇＲＮＡまたはｃＤＮＡに関連付けられたバーコードの高品質な個々のリードを提供すると考えられる。
バーコーディングは、特許公開ＷＯ２０１４０４７５６１Ａ１「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ」（その全体が本明細書に組み込まれる）に開示される組成物または方法のいずれかに基づいて実施され得る。特定の実施形態では、バーコーディングは、エラー修正スキームを使用する（Ｔ．Ｋ．Ｍｏｏｎ，Ｅｒｒｏｒ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｄｉｎｇ：Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．１，２００５））。理論に縛られることなく、シングルセルからの増幅配列は、各細胞に関連付けられたバーコードに基づいて一緒にシーケンシングされ、解明され得る。
好ましい実施形態では、シーケンシングは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を使用して実施される。用語「固有分子識別子」（ＵＭＩ）は、本明細書で使用される場合、固有の増幅生成物を検出及び定量するために分子タグを使用する方法において使用されるシーケンシングリンカーまたは核酸バーコードのサブタイプを指す。ＵＭＩは、複数のクローンから単一のクローンを介する効果を区別するために使用される。用語「クローン」は、本明細書で使用される場合、シーケンシングされる単一のｍＲＮＡまたは標的核酸を指し得る。ＵＭＩはまた、増幅生成物を生じさせた転写産物の数、または本明細書に記載される標的バーコードの場合は結合事象の数を決定するために使用され得る。好ましい実施形態では、増幅は、ＰＣＲまたは多重置換増幅（ＭＤＡ）による。
そのような選択マーカーまたはタグをコードするポリヌクレオチドは、選択マーカーまたはタグの発現を可能とするための適切な様式で本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチドに組み込まれ得ることが理解される。そのような技術及び方法は、本明細書の他の個所に記載されており、本開示の観点から当業者によってすぐに理解される。多くのそのような選択マーカー及びタグは通常、当該技術分野で知られており、本開示の範囲内であることが意図されている。
好適な選択マーカー及びタグには、親和性タグ、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ；可溶化タグ、例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ（ＮＡＮＰ）、ＭＢＰ、及びＧＳＴ；クロマトグラフィータグ、例えば、ポリアニオン性アミノ酸からなるもの、例えば、ＦＬＡＧタグ；エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＮＥタグ；特定の酵素的改変（例えば、ビオチンリガーゼによるビオチン化）または化学的改変（例えば、蛍光イメージングのためのＦｌＡｓＨ－ＥＤＴ２との反応）を可能にし得るタンパク質タグ、制限酵素または他の酵素切断部位を含有するＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント；スペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、バスタ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ））などの抗生物質を含む毒性化合物に対する抵抗性を提供する生成物をコードするＤＮＡセグメント；レシピエント細胞において欠いている生成物をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；容易に同定され得る生成物をコードするＤＮＡ及び／またはＲＮＡセグメント（例えば、表現型マーカー、例えば、β－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ；蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）、赤色（ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ、及び細胞表面タンパク質）；ＰＣＲのための１つ以上の新たなプライマー部位を生成し得るポリヌクレオチド（例えば、以前には並置されていなかった２つのＤＮＡ配列の並置）、制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ改変酵素、化学物質などによって作用しないまたは作用するＤＮＡ配列；エピトープタグ（例えば、ＧＦＰ、ＦＬＡＧ及びＨｉｓタグ）、ならびに、分子バーコードまたは固有分子識別子（ＵＭＩ）を生成するＤＮＡ配列、その同定を可能にする特定の改変（例えば、メチル化）に必要とされるＤＮＡ配列が含まれるがこれらに限定されない。他の好適なマーカーは、当業者によって理解される。
選択マーカー及びタグは、ＧＳまたはＧＧほどの短いものから（ＧＧＧＧＧ）３（配列番号５１）または（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号５６）までのグリシンまたはグリシンセリンリンカーなどの好適なリンカーを介して本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステムの１つ以上の成分に機能可能に連結され得る。他の好適なリンカーは、本明細書の他の個所に記載されている。
ベクターまたはベクターシステムは、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位（複数可）をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、標的化部位をコードするポリヌクレオチドは、ウイルス粒子が特定の細胞、組織、器官などに標的化され得るように生成されたウイルス粒子（複数可）内で及び／または上で発現するようにベクターまたはウイルスベクターシステムなどのベクターシステムに含まれ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位をコードするポリヌクレオチドは、修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）及び／またはそれから発現する生成物が標的化部位を含むように、また、筋肉細胞、筋肉組織、または筋肉を含有する器官（例えば、心臓）などの特定の細胞、組織、器官などに標的化され得るようにベクターまたはベクターシステムに含まれる。非ウイルス性担体などのいくつかの実施形態では、標的化部位は、担体（例えば、ポリマー、脂質、無機分子など）に結合され得、担体及び任意の結合または関連付けられた修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）を筋肉細胞、筋肉組織、または筋肉を含有する器官（例えば、心臓）などの特定の細胞、組織、器官などに標的化することが可能であり得る。
無細胞ベクター及びポリヌクレオチド発現
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含有する修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の特徴をコードするポリヌクレオチドは、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムにおいてベクターまたは好適なポリヌクレオチドから発現され得る。すなわち、ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、任意に翻訳され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システム及び適切なベクターは通常、当該技術分野で知られており、市販されている。通常、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及びｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、それぞれ、細胞環境外でＲＮＡ及びタンパク質合成のプロセスを再現する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのベクター及び好適なポリヌクレオチドには、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ３、ポリヌクレオチドまたはベクターを転写するために適切なポリメラーゼによって認識され、作用し得るプロモーター制御配列が含まれ得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳は、独立型（例えば、精製されたポリリボヌクレオチドの翻訳）であり、または転写に連結／結合され得る。いくつかの実施形態では、無細胞（またはｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳システムは、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽、及び／またはＥ．ｃｏｌｉからの抽出物を含み得る。抽出物は、外因性ＲＮＡの翻訳に必要な様々なマクロ分子成分（例えば、７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル－ｔＲＮＡ、合成酵素、開始、延長因子、終結因子など）を含み得る。アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生システム（クレアチンホスフェート及びクレアチンホスホキナーゼ（真核系））（細菌系のためのピルビン酸ホスホエノール及びピルビン酸キナーゼ）、及び他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）を含むがこれらに限定されない他の成分が翻訳反応中に含められ、付加され得る。前述したように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳は、ＲＮＡまたはＤＮＡ出発物質に基づき得る。いくつかの翻訳システムは、出発物質としてＲＮＡ鋳型を利用し得る（例えば、網状赤血球ライセート及び小麦胚芽抽出物）。いくつかの翻訳システムは、出発物質としてＤＮＡ鋳型を利用し得る（例えば、Ｅ ｃｏｌｉベースのシステム）。これらのシステムでは、転写及び翻訳は連動され、ＤＮＡはまずＲＮＡに転写され、その後翻訳される。好適な標準的で連動した無細胞翻訳システムは通常、当該技術分野で知られており、市販されている。
ベクターポリヌクレオチドのコドン最適化
本明細書の他の個所に記載されているように、本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の実施形態をコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの実施形態をコードする任意にコドン最適化されたポリヌクレオチドに加えて、本明細書に記載のベクターに含有される１つ以上のポリヌクレオチド（「ベクターポリヌクレオチド」）がコドン最適化され得る。通常、コドン最適化は、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０もしくはそれより多く、またはそれ以上のコドン）を、その宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって対象となる宿主細胞における発現の向上のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用頻度の差異）はしばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関し、ひいては、とりわけ、翻訳されているコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優勢は通常、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンを反映するものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で利用可能な“Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ”で容易に利用可能であり、これらの表は多数の方法で適応され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞における発現のための特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も利用可能である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質をコードする配列における１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくはそれ以上、またはすべてのコドン）は、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン使用頻度に関して、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌで利用可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、またはＣｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ，Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８２ Ｍａｒ ２５；２５７（６）：３０２６－３１が参照される。藻類を含む植物におけるコドン使用頻度に関して、Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ，ａｎｄ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０ Ｊａｎ；９２（１）：１－１１．；ならびにＣｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ，Ｍｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９ Ｊａｎ ２５；１７（２）：４７７－９８；またはＳｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙａｎｅｌｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ，Ｍｏｒｔｏｎ ＢＲ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９８ Ａｐｒ；４６（４）：４４９－５９が参照される。
ベクターポリヌクレオチドは、特定の細胞タイプ、組織タイプ、器官タイプ、及び／または対象タイプにおける発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、真核生物、例えば、ヒトにおける発現のために（すなわち、ヒトまたはヒト細胞における発現のために最適化されている）、または本明細書の他の個所に記載されているような別の動物（例えば、哺乳動物またはトリ）などの別の真核生物のために最適化された配列である。そのようなコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、特定の細胞タイプのために最適化されたコドンである。そのような細胞タイプには、上皮細胞（皮膚細胞、胃腸管を覆う細胞、他の中空器官を覆う細胞を含む）、神経細胞（神経、脳細胞、脊柱細胞、神経支持細胞（例えば、星状細胞、グリア細胞、シュワン細胞など）、筋肉細胞（例えば、心臓筋肉、平滑筋細胞、及び骨格筋細胞）、結合組織細胞（脂肪及び他の軟部組織充填細胞、骨細胞、腱細胞、軟骨細胞）、血液細胞、幹細胞及び他の前駆細胞、免疫系細胞、胚細胞、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。そのようなコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、特定の組織タイプのために最適化されたコドンである。そのような組織タイプには、筋肉組織、結合組織、結合組織、神経組織、及び上皮組織が含まれ得るがこれらに限定されない。そのようなコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、特定の器官のために最適化されたコドンである。そのような器官には、筋肉、皮膚、腸、肝臓、脾臓、脳、肺、胃、心臓、腎臓、胆嚢、膵臓、膀胱、甲状腺、骨、血管、血液、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。そのようなコドン最適化配列は、本明細書における記載の観点から当業者の領域の範囲内である。
いくつかの実施形態では、ベクターポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物、例えば、植物もしくは哺乳動物（ヒト、または本明細書で論述される非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、もしくは非ヒト哺乳動物もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない）のものまたはそれに由来するものであり得る。
非ウイルスベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、非ウイルスベクターまたは担体である。いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、ウイルスベクターと比較して減少した毒性及び／または免疫原性及び／または増加したバイオセイフティーの利点（複数可）を有し得る。当該技術分野の「非ウイルスベクター及び担体」という用語は、この文脈において本明細書で使用される場合、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドに結合し、それを組み込み、それに連結し、及び／またはそうでなければそれと相互作用することが可能であり得、かつポリヌクレオチドを細胞に運ぶこと及び／またはポリヌクレオチドを発現することが可能であり得る、ウイルスまたはウイルスゲノムの１つ以上の成分（非ウイルスベクターによって送達及び／または発現される任意のヌクレオチドを除外する）に基づいていない分子及び／または組成物を指す。これは、送達されるウイルスベースのポリヌクレオチドの包含を排除しないことが理解される。例えば、送達されるｇＲＮＡがウイルス成分に対して仕向けられ、それが他の非ウイルスベクターまたは担体に挿入され、またはそうでなければ連結される場合、これは、前記ベクターを「ウイルスベクター」としないであろう。非ウイルスベクター及び担体には、むき出しのポリヌクレオチド、化学ベースの担体、ポリヌクレオチド（非ウイルス）ベースのベクター、及び粒子ベースの担体が含まれる。用語「ベクター」は、非ウイルスベクター及び担体の文脈で使用される場合、ポリヌクレオチドベクターを指し、この文脈で使用される「担体」は、送達されるポリヌクレオチド、例えば、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドに結合され、またはそうでなければそれと相互作用する非核酸またはポリヌクレオチド分子または組成物を指すことが理解される。
むき出しのポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドは、むき出しのポリヌクレオチドに含まれ得る。当該技術の「むき出しのポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、しばしば環境因子及び／または分解から保護することを補助し得る別の分子（例えば、タンパク質、脂質、及び／または他の分子）に関連付けられていないポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用される場合、に関連付けられたには、に連結された、に接着された、に吸着された、に封入された、にまたは内に封入された、と混合されたなどが含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドの１つ以上を含むむき出しのポリヌクレオチドは、宿主細胞に直接的に送達され、その中で任意に発現させられ得る。むき出しのポリヌクレオチドは、任意の好適な二次元及び三次元構造を有し得る。非限定的な例として、むき出しのポリヌクレオチドは、一本鎖分子、二本鎖分子、環状分子（例えば、プラスミド及び人工染色体）、一本鎖の部分及び二本鎖の部分を含有する分子（例えば、リボザイム）などであり得る。いくつかの実施形態では、むき出しのポリヌクレオチドは、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）のみを含有する。いくつかの実施形態では、むき出しのポリヌクレオチドは、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）に加えて他の核酸及び／またはポリヌクレオチドを含有し得る。むき出しのポリヌクレオチドは、トランスポゾンシステムの１つ以上の要素を含み得る。トランスポゾン及びそのシステムは、本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。
非ウイルス性ポリヌクレオチドベクター
いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドの１つ以上は、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターに含まれ得る。好適な非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターには、トランスポゾンベクター及びベクターシステム、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ＡＲ（抗生物質耐性）フリープラスミド及びミニプラスミド、環状共有結合性閉鎖ベクター（例えば、ミニサークル、ミニベクター、ミニノット）、線状共有結合性閉鎖ベクター（「ダンベル形状」）、ＭＩＤＧＥ（最小限の免疫学的に定義された（ｍｉｎｉｍａｌｉｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ）遺伝子発現）ベクター、ＭｉＬＶ（マイクロ線状ベクター）ベクター、ミニストリング、ミニイントロンプラスミド、ＰＳＫシステム（分離後殺傷システム）、ＯＲＴ（オペレーターリプレッサータイトレーション）プラスミドなどが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Ｈａｒｄｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｇｅｎｅｓ．８（２）：６５を参照されたい。
いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、条件付き複製起点を有し得る。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、ＯＲＴプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現を有し得る。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、１つ以上の分離後殺傷システム遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、ＡＲフリーである。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、ミニベクターである。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、１つ以上のＣｐＧモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、１つ以上の骨格／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）を含み得る。例えば、Ｍｉｒｋｏｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．１９８４．Ｃｅｌｌ．３９：２２３－２３２，Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．８９：１１３－１５２を参照されたい。この技術及びベクターは、本発明において使用するために適応され得る。Ｓ／ＭＡＲは、核マトリックスへのＤＮＡループ塩基の結合を介して染色体の空間的組織化において役割を果たすＡＴリッチ配列である。Ｓ／ＭＡＲはしばしば、プロモーター、エンハンサー、及びＤＮＡ複製起点などの制御要素の近くに見られる。１またはＳ／ＭＡＲの包含は、細胞周期当たり１回の複製を容易化して、娘細胞において非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターをエピソームとして維持し得る。実施形態では、Ｓ／ＭＡＲ配列は、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターに含まれる活性的に転写されるポリヌクレオチド（例えば、本発明の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド）の下流に位置する。いくつかの実施形態では、Ｓ／ＭＡＲは、ベータ－インターフェロン遺伝子クラスターからのＳ／ＭＡＲであり得る。例えば、Ｖｅｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４２：ｅ５３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５９：１０２４－１０３３；Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１６．８：７０２－７１１；Ｋｏｉｒａｌａ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８０１：７０３－７０９；及びＮｅｈｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２３３－２４４を参照されたい。この技術及びベクターは、本発明において使用するために適応され得る。
いくつかの実施形態では、非ウイルスベクターは、トランスポゾンベクターまたはそのシステムである。本明細書で使用される場合、「トランスポゾン」（移動性要素とも称される）は、ゲノムにおける形成位置を別の位置に移動させることが可能なポリヌクレオチド配列を指す。いくつかのクラスのトランスポゾンが存在する。トランスポゾンには、レトロトランスポゾン及びＤＮＡトランスポゾンが含まれる。レトロトランスポゾンは、ポリヌクレオチドを新たなゲノムまたはポリヌクレオチドに転移させるために、移動させられる（または転移させられる）ポリヌクレオチドの転写を必要とする。ＤＮＡトランスポゾンは、ポリヌクレオチドを新たなゲノムまたはポリヌクレオチドに転移させるために、移動させられる（または転移させられる）ポリヌクレオチドの逆転写を必要としないものである。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、レトロトランスポゾンベクターであり得る。いくつかの実施形態では、レトロトランスポゾンベクターは、長い末端反復を含む。いくつかの実施形態では、レトロトランスポゾンベクターは、長い末端反復を含まない。いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドベクターは、ＤＮＡトランスポゾンベクターであり得る。ＤＮＡトランスポゾンベクターは、トランスポサーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターは、転移がそれ自体では自発的に起こらないことを意味する非自律的トランスポゾンベクターとして構成される。これらの実施形態の一部では、トランスポゾンベクターは、転移のために必要とされるタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を欠く。いくつかの実施形態では、非自律的トランスポゾンベクターは、１つ以上のＡｃ要素を欠く。
いくつかの実施形態では、非ウイルス性ポリヌクレオチドトランスポゾンベクターシステムは、トランスポゾン末端反転リピート（ＴＩＲ）によって５’及び３’末端で挟まれた本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）を含有する第１のポリヌクレオチドベクター及びトランスポサーゼの発現を誘導するためのプロモーターに連結されたトランスポサーゼをコードすることが可能なポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチドベクターを含み得る。その両方が同じ細胞で発現する場合、トランスポサーゼは、第２のベクターから発現し得、第１のベクター上のＴＩＲ間の物質（例えば、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可））を転移させ、それを宿主細胞のゲノムにおける１つ以上の位置に組み込み得る。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベクターまたはそのシステムは、遺伝子トラップとして構成され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＲは、強力なスプライスアクセプター部位と、それに続くレポーター及び／または他の遺伝子（例えば、本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）の１つ以上）及び強力なポリＡテールを挟むように構成され得る。このベクターまたはそのシステムを使用して転移が生じる場合、トランスポゾンは、遺伝子のイントロンに挿入し得、挿入されたレポーターまたは他の遺伝子は、ミススプライシングプロセスを誘発し、結果として、トラップされた遺伝子を不活化し得る。
任意の好適なトランスポゾンシステムが使用され得る。好適なトランスポゾン及びそのシステムには、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム（Ｔｃ１／マリナースーパーファミリー）（例えば、Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｃｅｌｌ．９１（４）：５０１－５１０を参照されたい）、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ｐｉｇｇｙＢａｃスーパーファミリー）（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３ １１０（２５）：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７及びＹｕｓａ ｅｔ ａｌ．２０１１．ＰＮＡＳ．１０８（４）：１５３１－１５３６を参照されたい）、Ｔｏｌ２（スーパーファミリーｈＡＴ）、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｔｃ１／マリナースーパーファミリー）（例えば、Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１（２３）：６８７３－６８８１を参照されたい）ならびにそれらのバリアントが含まれ得る。
ウイルスベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。当該技術分野の「ウイルスベクター」という用語は、この文脈において本明細書で使用される場合、ウイルス粒子内に本発明の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを発現及びパッケージングし、単独でまたは１つ以上の他のウイルスベクター（ウイルスベクターシステムにおけるものなど）と共に使用された場合に、前記ウイルス粒子を生成することが可能であり得るウイルスの１つ以上の要素からのまたはそれに基づく１つ以上の要素を含有するポリヌクレオチドベースのベクターを指す。本明細書に記載の修飾筋肉特異的システムの１つ以上の成分の送達及び／または発現のためのウイルス粒子を生成するためにウイルスベクター及びそのシステム使用され得る。ウイルスベクターは、複数のベクターを含むウイルスベクターシステムの一部であり得る。いくつかの実施形態では、複数のウイルスベクターを組み込むシステムは、これらのシステムの安全性を向上させ得る。好適なウイルスベクターには、アデノウイルスベースのベクター、アデノ随伴ベクター、ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨｄＡｄ）ベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクターなどが含まれ得る。ウイルスベクター及びそれから生成されるウイルス粒子の他の実施形態は、本明細書の他の個所に記載されている。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、これらのシステムの安全性の改善のために複製不能ウイルス粒子を生成するように構成される。
アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター、及びハイブリッドアデノウイルスベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターであり得る。したがって、本発明は、アデノウイルス科内のウイルス、例えば、アタデノウイルス、例えば、ヒツジアタデノウイルスＤ、アビアデノウイルス、例えば、トリアビアデノウイルスＡ、イクタデノウイルス、例えば、チョウザメイクタデノウイルスＡ、マスタデノウイルス（すべてのヒトアデノウイルスなどのアデノウイルスを含む）、例えば、ヒトマスタデノウイルスＣ、及びシアデノウイルス、例えば、カエルシアデノウイルスＡに適用可能である。よって、アデノウイルス科内のウイルスは、他の科メンバーに適用可能なアデノウイルスに関して本明細書における論述と共に本発明内のものとして企図される。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、ベクターまたはそのシステムを使用して生成されるウイルス粒子が血清型２、５、または９となり得るように要素を含み得る。いくつかの実施形態では、アデノウイルス粒子を介して送達されるポリヌクレオチドは、最大で約８ｋｂであり得る。よって、いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、サイズが約０．００１ｋｂ～約８ｋｂの範囲であり得る送達されるＤＮＡポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの背景におけるアデノウイルスベクターの使用が成功している（例えば、Ｔｅｒａｍａｔｏ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｌａｎｃｅｔ．３５５：１９１１－１９１２；Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．２００２．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：８９５－９１３；Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１１４５－１１５９；及びＫａｙ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７－２６１を参照されたい）。修飾筋肉特異的標的化部位（複数可）は、修飾筋肉特異的標的化部位（複数可）を含有する前記修飾ＡＡＶカプシドを含有するアデノウイルス粒子を生成するためにアデノウイルスベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターまたはそのシステムであり得る。これらはまた、当該技術分野で「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」または「中身除去（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターと称され、アデノウイルスベクターの改変世代である（例えば、Ｔｈｒａｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｎａｔｕｒｅ．４４３：Ｅ５－７を参照されたい）。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターシステムの実施形態では、１つ目のベクター（ヘルパー）が、複製に必要とされるウイルス遺伝子のすべてを含有し得るが、パッケージングドメインにおいて条件付き遺伝子欠損を含有する。システムの２つ目のベクターは、ウイルスゲノムの末端、１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド、及びネイティブパッケージング認識シグナルのみを含有し得、これらは、細胞から選択的パッケージング放出を可能とし得る（例えば、Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６１：７２５－７２７を参照されたい）。ヘルパー依存性アデノウイルスベクターシステムは、いくつかの背景において遺伝子送達のために成功している（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：６４３－６５０；Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３６１：７２５－７２７；Ｃｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（４）：４４３－４５２；Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：１８－Ｓ２７；Ｃｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．２００５．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５７９－５８７；Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９２６－９３３；及びＭｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．１９９９．ＰＮＡＳ．９６：１２８１６－１２８２１を参照されたい）。これらの刊行物に記載されている技術及びベクターは、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドの包含のために適応され得る。いくつかの実施形態では、ヘルパー依存性アデノウイルスベクターまたはそのシステムから生成される修飾筋肉特異的標的化部位またはコーディングポリヌクレオチドを含有するウイルス粒子は、最大で約３８ｋｂであり得る。よって、いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、サイズが約０．００１ｋｂ～約３７ｋｂの範囲であり得る（例えば、Ｒｏｓｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｙｎｄｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｓｕｐｐｌ．５：００１を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ベクターは、ハイブリッド－アデノウイルスベクターまたはそのシステムである。ハイブリッドアデノウイルスベクターは、遺伝子欠失アデノウイルスベクターの高い形質導入効率、ならびにアデノ随伴、レトロウイルス、レンチウイルス、及びトランスポゾンベースの遺伝子移行の長期ゲノム組み込み潜在性から構成される。いくつかの実施形態では、そのようなハイブリッドベクターシステムは、安定な形質導入及び制限された組み込み部位をもたらし得る。例えば、Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．２０００．Ｂｌｏｏｄ．９５：８２０－８２８；Ｍｏｒｒａｌ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：２７０９－２７１６；Ｋｕｂｏ ａｎｄ Ｍｉｔａｎｉ．２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（５）：２９６４－２９７１；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．ＰｌｏＳ Ｏｎｅ．８（１０）ｅ７６７７１；及びＣｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（４）：６６７－６７４）を参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の修飾ＡＡＶ筋肉特異的送達システムにおいて使用するために改変及び適応され得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッド－アデノウイルスベクターは、レトロウイルス及び／またはアデノ随伴ウイルスの１つ以上の特徴を含み得る。いくつかの実施形態では、ハイブリッド－アデノウイルスベクターは、スプマレトロウイルスまたはフォーミーウイルス（ＦＶ）の１つ以上の特徴を含み得る。例えば、Ｅｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１４６－１５６及びＬｉｕ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１８３４－１８４１を参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の修飾ＡＡＶカプシドシステムにおいて使用するために改変及び適応され得る。ハイブリッド－アデノウイルスベクターまたはそのシステムにおけるＦＶからの１つ以上の特徴を使用する利点には、それから生成されたウイルス粒子が広い範囲の細胞に感染する能力、他のレトロウイルスと比較して大きなパッケージング容量、及び休眠（非分裂）細胞において存続する能力が含まれ得る。例えば、Ｅｈｒｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５６：１４６－１５６及びＳｈｕｊｉ ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９：７６－８２も参照されたい。それらに記載されている技術及びベクターは、本発明の修飾ＡＡＶカプシドシステムにおいて使用するために改変及び適応され得る。
アデノ随伴ベクター
実施形態では、修飾ベクターまたはそのシステムは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）であり得る。例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許番号４，７９７，３６８；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい。ＡＡＶは、それらの特徴の一部においてアデノウイルスベクターと同様であるが、それらの複製及び／または病原性においていくらかの欠陥を有し、よって、アデノウイルスベクターよりも安全であり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、観察可能な副作用を伴わずにヒト細胞の１９番染色体上の特定の部位に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター、そのシステム、及び／またはＡＡＶ粒子の容量は、最大で約４．７ｋｂであり得る。ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、本明細書に記載の１つ以上の修飾カプシドポリヌクレオチドを含み得る。
ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、１つ以上の制御分子を含み得る。いくつかの実施形態では、制御分子は、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなどであり得、これらは、本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、１つ以上の制御タンパク質をコードし得る１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の制御タンパク質は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、それらのバリアント、及びそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、先に論述されている組織特異的プロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターは、本明細書に記載の修飾カプシドＡＡＶカプシドポリヌクレオチドの発現を誘導し得る。これは、例えば、先に記載され、６２／８９９，４５３、６２／９１６，２０７、６３／０１８，４５４、６３／０５５，２５２、及び６２／９１６，２２１ならびに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／５０５３４に示されている筋肉特異的標的化部位を決定するのに有利であり得る。
ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、１つ以上のカプシドタンパク質、例えば、本明細書の他の個所に記載されている修飾ＡＡＶカプシドタンパク質をコードし得る１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。修飾カプシドタンパク質は、ＡＡＶウイルス粒子のタンパク質シェル（修飾カプシド）へと集合することが可能であり得る。修飾カプシドは、細胞、組織、及び／または器官特異的指向性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドに含まれる１つ以上の筋肉特異的標的化部位は、本明細書の他の個所でより詳細に記載されているＲＧＤモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、１つ以上のアデノウイルスヘルパー要素または１つ以上のアデノウイルスヘルパー要素をコードし得るポリヌクレオチドを含み得る。そのようなアデノウイルスヘルパー要素には、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４ＯＲＦ６、及びＶＡ ＲＮＡが含まれ得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、生成宿主細胞株は、アデノウイルスヘルパー要素の１つ以上を発現する。
ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、特定の血清型を有するＡＡＶ粒子を生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－９またはそれらの任意の組み合わせであり得る。標的とされる細胞に関連するＡＡＶからＡＡＶを選択することができ；例えば、脳及び／またはニューロン細胞を標的とするためにＡＡＶ血清型１、２、５、９もしくはハイブリッドカプシドＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－９またはそれらの任意の組み合わせを選択することができ；心臓組織を標的とするためにＡＡＶ－４を選択することができ；肝臓への送達のためにＡＡＶ－８を選択することができる。よって、いくつかの実施形態では、脳及び／またはニューロン細胞を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはそのシステムは、血清型１、２、５を有するＡＡＶ粒子またはハイブリッドカプシドＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－５またはそれらの任意の組み合わせを生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、心臓組織を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはそのシステムは、ＡＡＶ－４血清型を有するＡＡＶ粒子を生成するように構成され得る。いくつかの実施形態では、肝臓を標的とすることが可能なＡＡＶ粒子を生成することが可能なＡＡＶベクターまたはそのシステムは、ＡＡＶ－８血清型を有するＡＡＶを生成するように構成され得る。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０も参照されたい。
異なる血清型は、いくらかのレベルの細胞、組織、及び／または器官特異性を提供し得るが、各血清型は、依然として多重指向性であり、よって、血清型が形質導入するのにあまり効率的ではない組織を標的とするためにその血清型を使用する場合は組織毒性をもたし得ることが理解される。よって、特定の血清型のＡＡＶを選択することによりいくらかの組織標的化能力を達成することに加えて、ＡＡＶ血清型の指向性は、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドによって改変され得ることが理解される。本明細書の他の個所に記載されているように、任意の血清型の野生型ＡＡＶのバリアントは、本明細書に記載の方法を介して生成され、参照野生型ＡＡＶ血清型のものと同じまたは異なる場合がる特定の細胞特異的指向性を有することが決定され得る。いくつかの実施形態では、野生型血清型の細胞、組織、及び／または特異性は強化され得る（例えば、血清型がすでに偏っている特定の細胞タイプに対してより選択的または特異的となる）。例えば、野生型ＡＡＶ－９は、ヒトにおける筋肉及び脳の方向に偏る（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０を参照されたい）。本明細書に記載される野生型ＡＡＶ－９の修飾ＡＡＶカプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントを含めることにより、例えば、脳に対する偏りが減少または排除され得、及び／または比較すると脳特異性が減少したようにみえるように筋肉特異性が増加し、これにより野生型ＡＡＶ－９と比較して筋肉に対する特異性を向上させる。前述したように、野生型ＡＡＶ血清型の修飾カプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントの包含は、野生型参照ＡＡＶ血清型とは異なる指向性を有し得る。例えば、ＡＡＶ－９の修飾ＡＡＶカプシド及び／またはカプシドタンパク質バリアントは、ヒトにおける筋肉または脳以外の組織に対する特異性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ハイブリッドＡＡＶベクターまたはそのシステムである。ハイブリッドＡＡＶは、少なくとも１つの異なる血清型に由来するカプシドにパッケージングされた１つの血清型からの要素を有するゲノムを含むＡＡＶである。例えば、生成されるのがｒＡＡＶ２／５である場合、また、生成方法が上で論述したヘルパーフリー一過性トランスフェクション法に基づく場合、第１のプラスミド及び第３のプラスミド（アデノヘルパープラスミド）は、ｒＡＡＶ２生成について論述されたもの同じとなる。しかしながら、第２のプラスミドであるｐＲｅｐＣａｐは異なる。ｐＲｅｐ２／Ｃａｐ５と呼ばれるこのプラスミドにおいて、Ｒｅｐ遺伝子は依然としてＡＡＶ２に由来する一方で、Ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ５に由来し得る。生成スキームは、ＡＡＶ２生成について上述したアプローチと同じである。得られるｒＡＡＶはｒＡＡＶ２／５と呼ばれ、そのゲノムは組換えＡＡＶ２に基づく一方で、カプシドはＡＡＶ５に基づく。このＡＡＶ２／５ハイブリッドウイルスによって示される細胞または組織指向性は、ＡＡＶ５のものと同じとなるはずであることが想定される。野生型ハイブリッドＡＡＶ粒子は、先に論述されている非ハイブリッド野生型血清型と同じ特異性の問題を有することが理解される。
野生型ベースのハイブリッドＡＡＶシステムによって達成される利点は、本明細書の他の個所に記載されている修飾ＡＡＶカプシドを含み得るハイブリッドＡＡＶを生成することによって組み合わされ得る修飾ＡＡＶカプシドで達成され得る向上し、カスタマイズされた細胞特異性と組み合わされ得る。ハイブリッドＡＡＶは、修飾ＡＡＶカプシドがそのバリアントである参照野生型血清型とは異なる血清型からの要素を有するゲノムを含有する修飾ＡＡＶカプシドを含有し得ることが理解される。例えば、ＡＡＶ－２血清型からの成分（例えば、ｒｅｐ要素）を含有するゲノムをパッケージングするために使用されるＡＡＶ－９血清型のバリアントである修飾ＡＡＶカプシドを含むハイブリッドＡＡＶが生成され得る。先に論述されている野生型ベースのハイブリッドＡＡＶと同様に、得られるＡＡＶ粒子の指向性は、修飾ＡＡＶカプシドのものとなる。
これらの細胞に関する特定の野生型ＡＡＶ血清型の作表は、表７として以下に再現されたＧｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）で見ることができる。さらなる指向性の詳細は、先に論述されているようにＳｒｉｖａｓｔａｖａ．２０１７．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．２１：７５－８０で見ることができる。
Figure 2022551986000102
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、ＡＡＶ ｒｈ．７４またはＡＡＶ ｒｈ．１０である。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、レトロウイルスベクターに関して記載されているものと同様に、「ガットレス」ベクターとして構成される。いくつかの実施形態では、「ガットレス」ＡＡＶベクターまたはそのシステムは、対象となる異種配列（例えば、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド（複数可））と連携してゲノム増幅及びパッケージングに関与するシス作用性ウイルス性ＤＮＡ要素を有し得る。
レトロウイルス及びレンチウイルスベクター
いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的送達システムまたはその成分は、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターであり、またはそれに組み込まれる。レトロウイルスベクターは、最大で６～１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング容量を有するシス作用性の長い末端リピートから構成され得る。最小限のシス作用性ＬＴＲは、標的細胞に治療用遺伝子を組み込んで永続的導入遺伝子発現を提供するために後に使用されるベクターの複製及びパッケージングに十分である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのための好適なレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが含まれ得る（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１－２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５－１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８－５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４－２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０－２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。そのため、レトロウイルス遺伝子移行システムの選択は、標的組織に依存し得る。
レトロウイルスの指向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化し、標的細胞の潜在的標的集団を拡大し得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入し、または感染させることができるレトロウイルスベクターであり、本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。レトロウイルスはまた、特定の細胞タイプのみがレンチウイルスによって感染するように、挿入された導入遺伝子の条件付き発現を可能とするように修飾され得る。最終生成物が筋肉特異的ウイルス粒子であるいくつかの実施形態では、指向性は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス粒子のカプシドタンパク質及び／またはカプシド内に組み込まれる本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位の存在によって少なくとも部分的に定義される。
レンチウイルスは、分裂細胞及び分裂後細胞の両方に感染し、それらの遺伝子を発現する能力を有する複雑なレトロウイルスである。レンチウイルスアプローチを使用する利点には、非分裂細胞を形質導入し、またはそれに感染する能力及び典型的には高いウイルス力価をもたらすそれらの能力が含まれ得、これにより、生成及び送達の効率または有効性が上昇し得る。好適なレンチウイルスベクターには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのレンチウイルスベクター、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ベースのレンチウイルスベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）ベースのレンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、ビスナ．マエディウイルス（ＶＭＶ）ベースのレンチウイルスベクター、山羊関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）ベースのレンチウイルスベクター、ウシ免疫欠損症ウイルス（ＢＩＶ）ベースのレンチウイルスベクター、及びウマ感染性貧血（ＥＩＡＶ）ベースのレンチウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターシステムが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＦＩＶベースのレンチウイルスベクターシステムが使用され得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＥＩＡＶベースのレンチウイルスベクターまたはベクターシステムである。ＥＩＡＶベクターは、眼遺伝子療法などの他の背景において発現、パッケージング、及び／または送達を媒介するために使用されてきた（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５－２８５を参照されたい）。別の実施形態では、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０－９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照されたい）であり、これは、加齢黄斑変性症の湿式型の処置のために網膜下注射を介して送達される血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子療法ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）を記載している。これらの刊行物に記載されているこれらのベクターのいずれかは、本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの要素のために改変され得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムは、第一世代レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムであり得る。第一世代レンチウイルスベクターは、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子、他の追加のウイルスタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）及び他の付随遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒｍ ｖｐｕ、ｎｅｆ、及びそれらの組み合わせ）、制御遺伝子（例えば、ｔａｔ及び／またはｒｅｖ）を含むレンチウイルスゲノムの大部分ならびにＬＴＲ間の対象となる遺伝子を含有し得る。第一世代レンチウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで複製が可能であり得るウイルス粒子の生成をもたらし得、いくつかの場合または適用のために適切ではない場合がある。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムは、第二世代レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムであり得る。第二世代レンチウイルスベクターは、１つ以上の付随病原性要素を含有せず、同じレンチウイルスベクター上にウイルス粒子生成に必要なすべての成分を含有しない。これは、複製不能ウイルス粒子の生成をもたらし、よって、第一世代レンチウイルスベクターを上回ってこれらのシステム安全性を向上させ得る。いくつかの実施形態では、第二世代ベクターは、１つ以上の付随病原性要素（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒｍ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、及びそれらの組み合わせ）を欠く。第一世代レンチウイルスベクターとは異なり、ポリヌクレオチドをウイルス粒子内に発現及びパッケージングするのに必要なすべての特徴を含む単一の第二世代レンチウイルスベクターはない。いくつかの実施形態では、エンベロープ及びパッケージング成分は、２つの異なるベクター間で分けられ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ、及びｔａｔ遺伝子は第１のベクターに含まれ、エンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）は第２のベクターに含まれる。対象となる遺伝子、そのプロモーター、及びＬＴＲは、複製不能ウイルス粒子を生成するための他の２つのベクター（パッケージング及びエンベロープベクター）と併せて使用され得る第３のベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムは、第三世代レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムであり得る。第三世代レンチウイルスベクター及びそのベクターシステムは、第一世代及び第二世代レンチウイルスベクター及びそのシステムと比べて向上した安全性を有し、その理由は、例えば、ウイルスゲノムの様々な成分が、２つ以上の異なるベクター間で分けられるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで一緒に使用されてウイルス粒子を生成し、それらはｔａｔ遺伝子を欠き得（構成的活性プロモーターがＬＴＲの上流に含まれる場合）、また、それらは、ＬＴＲの破壊されたプロモーター／エンハンサー活性を有する自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターを生成するために３’ＬＴＲにおける１つ以上の欠失を含み得るからである。いくつかの実施形態では、第三世代レンチウイルスベクターシステムは、（ｉ）５’及び３’ＬＴＲ（ベクターを自己不活性化とするためにＬＴＲの一方または両方に存在する１つ以上の欠失を任意に含み得る）によって挟まれた対象となるポリヌクレオチド及び上流プロモーターを含有するベクタープラスミド；（ｉｉ）パッケージングベクター上に存在する特徴の発現を誘導するためにシステム（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｒｅｖ）及び上流制御配列（例えば、プロモーター（複数可））によって生成されるウイルス粒子にポリヌクレオチドをパッケージングする際に関与する１つ以上の遺伝子を含有し得る「パッケージングベクター（複数可）」、及び（ｉｉｉ）１つ以上のエンベロープタンパク質遺伝子及び上流プロモーターを含有する「エンベロープベクター」を含み得る。特定の実施形態では、第三世代レンチウイルスベクターシステムは、少なくとも２つのパッケージングベクターを含み得、ｒｅｖ遺伝子とは異なるベクターにｇａｇ－ｐｏｌが存在する。
いくつかの実施形態では、ＨＩＶｔａｔ／ｒｅｖ、核小体局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッドリボザイムによって共有される共通エクソンを標的とするｓｉＲＮＡを有する自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３を参照されたい）が使用され、及び／または本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに適応され得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルス粒子の偽型及び感染性または指向性は、レンチウイルスベクターまたはそのシステムに含まれるエンベロープタンパク質（複数可）のタイプを変化させることによって調整され得る。本明細書で使用される場合、「エンベロープタンパク質」または「外側タンパク質」は、カプシドタンパク質ではないウイルス粒子の表面に露出したタンパク質を意味する。例えば、エンベロープまたは外側タンパク質は典型的には、ウイルスのエンベロープに埋め込まれたタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターまたはそのベクターシステムは、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を含み得る。ＶＳＶ－Ｇは、宿主細胞上に存在するＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）またはＬＤＬＲファミリーメンバーへのウイルス結合を媒介し、宿主細胞によるウイルス粒子のエンドサイトーシスを引き起こす。ＬＤＬＲは、多様な細胞によって発現されるので、ＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を発現するウイルス粒子は、多様な細胞タイプに感染し、または形質導入し得る。他の好適なエンベロープタンパク質が、本明細書に記載のレンチウイルスベクターまたはそのシステムから生成されるウイルス粒子によって感染することが使用者によって望まれる宿主細胞に基づいて組み込まれ得、それには、ネコ内因性ウイルスエンベロープタンパク質（ＲＤ１１４）（例えば、Ｈａｎａｗａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．２００２ ５（３）２４２－２５１を参照されたい）、改変シンドビスウイルスエンベロープタンパク質（例えば、Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４（１４）６９２３－６９３４；Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：８０１６－８０２０；Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１１：５４９－５５８；Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３５５：７１－８１；Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１１：６５５－６６３，Ｍｏｒｉｚｏｎｏ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：３４６－３５２を参照されたい）、ヒヒレトロウイルスエンベロープタンパク質（例えば、Ｇｉｒａｒｄ－Ｇａｇｎｅｐａｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｂｌｏｏｄ．１２４：１２２１－１２３１を参照されたい）；ツパイアパラミクソウイルス糖タンパク質（例えば、Ｅｎｋｉｒｃｈ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０：１６－２３を参照されたい）；麻疹ウイルス糖タンパク質（例えば、Ｆｕｎｋｅ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．１６（８）：１４２７－１４３６を参照されたい）、狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質、ＭＬＶエンベロープタンパク質、エボラエンベロープタンパク質、バキュロウイルスエンベロープタンパク質、フィロウイルスエンベロープタンパク質、肝炎Ｅ１及びＥ２エンベロープタンパク質、ＨＩＶのｇｐ４１及びｇｐ１２０、血球凝集素、ノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質、ならびにそれらの組み合わせが含まれ得るがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、得られるレンチウイルス粒子の指向性は、細胞標的化ペプチドが得られるレンチウイルス粒子の表面に発現するように、細胞標的化ペプチドをレンチウイルスベクターに組み込むことによって調整され得る。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞標的化タンパク質に融合されたエンベロープタンパク質を含有し得る（例えば、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７７７－７９０；Ｂｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１２（ｅ１００５４６１）；及びＦｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３．２１：８４９－８５９を参照されたい。
いくつかの実施形態では、レンチウイルス粒子を特定の細胞タイプに標的化するためにスプリット－インテイン媒介アプローチが使用され得る（例えば、Ｃｈａｍｏｕｎ－Ｅｍａｎｅｕｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：２６１１－２６１７，Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２６：２１５－２３３を参照されたい。これらの実施形態では、レンチウイルスベクターは、細胞標的化ペプチドに融合されたＮｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅからの天然スプリットインテインのスプライシング欠損バリアントの一方の半分を含有し得、同じまたは異なるレンチウイルスベクターは、結合欠損性融合適格性ウイルスエンベロープタンパク質などのエンベロープタンパク質に融合されたスプリットインテインの他方の半分を含有し得る。これは、細胞結合タンパク質を偽型レンチウイルス粒子に連結させるための分子状Ｖｅｌｃｒｏリンカーとして機能し得るスプリットインテインを含むレンチウイルスベクターまたはベクターシステムからのウイルス粒子の生成をもたし得る。このアプローチは、表面不適合性が、例えば、細胞標的化ペプチドの使用を制限し得る場合に使用に有利であり得る。
いくつかの実施形態では、共有結合形成性タンパク質－ペプチド対が本明細書に記載のレンチウイルスベクターの１つ以上に組み込まれて、細胞標的化ペプチドをウイルス粒子にコンジュゲートさせ得る（例えば、Ｋａｓａｒａｎｅｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ（８）Ｎｏ．１０９９０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＩｎａＤタンパク質のＮ末端ＰＤＺドメイン（ＰＤＺ１）及びＮｏｒｐＡからのそのペンタペプチドリガンド（ＴＥＦＣＡ）を含み得、これは細胞標的化ペプチドを共有結合（例えば、ジスルフィド結合）を介してウイルス粒子にコンジュゲートし得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＺ１タンパク質は、任意に結合欠損性及び／または融合適合性ウイルスエンベロープタンパク質であり得るエンベロープタンパク質に融合され、レンチウイルスベクターに含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＴＥＦＣＡは、細胞標的化ペプチドに融合され得、ＴＥＦＣＡ－ＣＰＴ融合コンストラクトは、ＰＤＺ１－エンベロープタンパク質コンストラクトと同じまたは異なるレンチウイルスベクターに組み込まれ得る。ウイルス生成中に、ＰＤＺ１とＴＥＦＣＡとの間の特異的相互作用は、細胞標的化ペプチドで共有結合で官能化されたウイルス粒子の生成を容易化し、よって、細胞標的化ペプチドとその結合パートナーを発現する細胞との間の特異的相互作用に基づいて特定の細胞タイプを標的とすることが可能である。このアプローチは、表面不適合性が、例えば、細胞標的化ペプチドの使用を制限し得る場合に使用に有利であり得る。
パーキンソン病の処置におけるものとしてのレンチウイルスベクターが開示されている。例えば、米国特許公開番号２０１２０２９５９６０及び米国特許番号７３０３９１０及び７３５１５８５を参照されたい。眼疾患の処置のためのレンチウイルスベクターが開示されている。例えば、米国特許公開番号２００６０２８１１８０、２００９０００７２８４、ＵＳ２０１１０１１７１８９；ＵＳ２００９００１７５４３；ＵＳ２００７００５４９６１、ＵＳ２０１００３１７１０９を参照されたい。脳への送達のためのレンチウイルスベクターが開示されている。例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１１０２９３５７１；ＵＳ２０１１０２９３５７１、ＵＳ２００４００１３６４８、ＵＳ２００７００２５９７０、ＵＳ２００９０１１１１０６及び米国特許番号ＵＳ７２５９０１５を参照されたい。これらのシステムまたはそのバリアントのいずれかは、修飾筋肉特異的ポリヌクレオチドを細胞に送達するために及び／または細胞への筋肉特異的送達のための本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位を組み込むために使用され得る。
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターシステムは、１つ以上のトランスファープラスミドを含み得る。トランスファープラスミドは、様々な他のベクター骨格から生成され得、例えば、ベクター及び／またはベクターシステムの安全性を向上させ得る、ウイルス力価を増加させ得る、及び／またはウイルス粒子に発現及び／またはパッケージングされる所望の挿入物の発現を増加させまたはそうでなければ強化し得る、システムにおける他のレトロウイルス及び／またはレンチウイルスベクターと共に作用し得る１つ以上の特徴を含み得る。トランスファープラスミドに含まれ得る好適な特徴には、５’ＬＴＲ、３’ＬＴＲ、ＳＩＮ／ＬＴＲ、複製起点（Ｏｒｉ）、選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、Ｐｓｉ（Ψ）、ＲＲＥ（ｒｅｖ反応要素）、ｃＰＰＴ（セントラルポリプリントラクト）、プロモーター、ＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎転写後制御要素）、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ｐＵＣ起点、ＳＶ４０起点、Ｆ１起点、及びそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
別の実施形態では、コカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスまたはレンチウイルスベクター粒子が企図される（例えば、ｔｈｅ Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒに譲渡された米国特許公開番号２０１２０１６４１１８を参照されたい）。コカルウイルスは、ベシクロウイルス属であり、哺乳動物における水胞性口炎の原因物質である。コカルウイルスは元々、トリニダードにおけるダニから単離され（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンにおいて昆虫、ウシ、及びウマから感染症が同定された。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、感染した節足動物から天然に単離され、それらがベクター媒介性であることを示唆している。ベシクロウイルスに対する抗体は、そのウイルスが風土病であり、実験室で獲得される地方の地域で生活している人々の間で一般的であり；ヒトにおける感染症は、インフルエンザ様症状をもたらす。コカルウイルスエンベロープ糖タンパク質は、ＶＳＶ－Ｇインディアナとアミノ酸レベルで７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生的比較は、コカルウイルスが、ベシクロウイルスの中でＶＳＶ－Ｇインディアナ株とは血清学的に区別されるが、それと最も密接して関連していることを示している。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６－２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９－１００６（１９８４）。コカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／または１つ以上の付随タンパク質（複数可）及びコカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の実施形態では、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及び付随タンパク質は、レンチウイルス及び／またはガンマレトロウイルスである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、得られるウイルスまたはシュードウイルス粒子がコカルベシクロウイルスエンベロープ偽型となるように、１つ以上のコカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質のためのコーディングポリペプチドを含有し得る。
単純ヘルペスウイルスベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベースのベクターまたはそのシステムであり得る。ＨＳＶシステムは、糖タンパク質Ｈ欠損性変異体ＨＳＶゲノムから構成される機能不全感染単一コピー（ＤＩＳＣ）ウイルスを含み得る。欠損性ＨＳＶが補完細胞において増殖した場合、それら自体のゲノムを永続的に複製する後続の細胞に感染することが可能であるが、より感染性のある粒子を生成することはできないウイルス粒子が生成され得る。例えば、２００９．Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ．Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：１４２７－１４３６を参照されたい。それに記載されている技術及びベクターは、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて使用するために改変及び適応され得る。ＨＳＶベクターまたはそのシステムが利用されるいくつかの実施形態では、宿主細胞は、補完細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ＨＳＶベクターまたはそのシステムは、最大で１５０ｋｂのポリヌクレオチドカーゴを送達することが可能なウイルス粒子を生成することが可能であり得る。よって、いくつかの実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターまたはそのシステムに含まれる修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド（複数可）は、合計で約０．００１～約１５０ｋｂであり得る。ＨＳＶベースのベクター及びそのシステムの使用は、神経障害の様々なモデルを含むいくつかの背景において成功している。例えば、Ｃｏｃｋｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：１８４－２０４；Ｋａｆｒｉ Ｔ．２００４．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：３６７－３９０；Ｂａｌａｇｇａｎ ａｎｄ Ａｌｉ．２０１２．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９：１４５－１５３；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．２００２．１７：１－９；Ａｚｚｏｕｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｒｕｏｓｃｉ．２２Ｌ１０３０２－１０３１２；及びＢｅｔｃｈｅｎ ａｎｄ Ｋａｐｌｉｔｔ．２００３．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６：４８７－４９３を参照されたい。これらのシステムまたはそのバリアントのいずれかは、修飾筋肉特異的ポリヌクレオチドを細胞に送達するため及び／または細胞への筋肉特異的送達のための本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位を組み込むために使用され得る。
ポックスウイルスベクター
いくつかの実施形態では、ベクターは、ポックスウイルスベクターまたはそのシステムであり得る。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスベクターは、本発明のかかるウイルスによってパッケージングされ得る１つ以上のカーゴの細胞質発現をもたし得る。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスベクターまたはそのシステムの容量は、約２５ｋｂまたはそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、ポックスウイルスベクターまたはそのシステムは、本明細書に記載の１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド及び／または筋肉特異的標的化部位、修飾カプシドタンパク質、及び／またはカプシドを含み得る。
植物への送達のためのウイルスベクター
システム及び組成物は、ウイルスビヒクルを使用して植物細胞に送達され得る。植物細胞は、後に収集され、必要に応じて、例えば、ヒトまたは非ヒト動物のための療法として使用され得る筋肉特異的標的化部位（複数可）を含有し得る組成物（タンパク質など）を発現するように修飾され得る。特定の実施形態では、組成物及びシステムは、植物ウイルスベクターを使用して植物細胞において導入され得る（例えば、Ｓｃｈｏｌｔｈｏｆ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ．１９９６；３４：２９９－３２３に記載されているように）。そのようなウイルスベクターは、ＤＮＡウイルス、例えば、ジェミニウイルス（例えば、キャベツ葉巻ウイルス、マメ黄化萎縮ウイルス、小麦萎縮ウイルス、トマト葉巻ウイルス、トウモロコシ線条ウイルス、タバコ葉巻ウイルス、またはトマトゴールデンモザイクウイルス）またはナノウイルス（例えば、ソラマメ壊疽性黄化ウイルス）からのベクターであり得る。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルス、例えば、トブラウイルス（例えば、タバコ茎えそウイルス、タバコモザイクウイルス）、ポテックスウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＸ）、またはホルデイウイルス（例えば、ムギ斑葉モザイクウイルス）からのベクターであり得る。植物ウイルスの複製ゲノムは、非組み込みベクターであり得る。
ベクター構築
本明細書に記載のベクターは、任意の好適なプロセスまたは技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の好適な組換え及び／またはクローニング方法または技術が、本明細書に記載のベクター（複数可）のために使用され得る。好適な組換え及び／またはクローニング技術及び／または方法には、限定されないが、米国出願公開番号ＵＳ２００４－０１７１１５６Ａ１に記載されているものが含まれ得る。他の好適な方法及び技術は、本明細書の他の個所に記載されている。
組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許番号５，１７３，４１４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含む多数の刊行物に記載されている。その技術及び／または方法のいずれかが、本明細書に記載のＡＡＶまたは他のベクターを構築するために使用及び／または適応され得る。ＡＡＶベクターは、本明細書の他の個所で論述されている。
いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニングサイト」とも称される）を有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多く、またはそれ以上の挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流及び／または下流に位置する。
本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステムの１つ以上の要素の発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその成分は、前述の文献、例えば、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）において使用されているとおりであり、本明細書でより詳細に論述されている。
ウイルスベクターからのウイルス粒子生成
ＡＡＶ粒子生成
本明細書に記載されているものなどの、ＡＡＶベクター及びそのシステムからＡＡＶ粒子を生成するための２つの主要なストラテジーが存在し、これはアデノウイルスヘルパー要素がどのように提供されるかに依存する（ヘルパー対ヘルパーフリー）。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター及びそのシステムからＡＡＶ粒子を生成する方法は、得られるＡＡＶ粒子（例えば、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド（複数可））によってパッケージングされ、送達されるポリヌクレオチドを含有するＡＡＶベクターと共にＡＡＶ複製及びカプシドをコードするポリヌクレオチドを安定的に保有する細胞株へのアデノウイルス感染を含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクター及びそのシステムからＡＡＶ粒子を生成する方法は、「ヘルパーフリー」の方法であり得、これは、適切な生成細胞株を３つのベクター（例えば、プラスミドベクター）：（１）２つのＩＴＲ間に対象となるポリヌクレオチド（例えば、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド（複数可））を含有するＡＡＶベクター；（２）ＡＡＶ Ｒｅｐ－Ｃａｐをコードするポリヌクレオチド；及びヘルパーポリヌクレオチドを保有するベクターで共トランスフェクションすることを含む。当業者は、ヘルパー及びヘルパーフリーの両方である様々な方法及びそのバリエーションならびに各システムの異なる利点を理解する。
本明細書に記載の修飾ＡＡＶベクター及びそのシステムは、これらの方法のいずれかによって生成され得る。
レトロウイルス生成
いくつかの実施形態では、１つ以上のウイルスベクター及び／またはそのシステムは、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドまたは他のペイロードを含有するウイルス粒子の生成のための好適な細胞株に送達され得る。本明細書に記載のウイルスベクター及びそのシステムからのウイルス生成のための好適な宿主細胞は、当該技術分野で知られており、市販されている。例えば、好適な宿主細胞には、ＨＥＫ２９３細胞及びそのバリアント（ＨＥＫ ２９３Ｔ及びＨＥＫ ２９３ＴＮ細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクター及びそのシステムからのウイルス生成のための好適な宿主細胞は、パッケージングに関与する１つ以上の遺伝子（例えば、ｐｏｌ、ｇａｇ、及び／またはＶＳＶ－Ｇ）及び／または他のサポート遺伝子を安定に発現し得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクター及びそのシステムからのウイルス生成のための好適な宿主細胞への１つ以上のウイルスベクターの送達の後、細胞は、ベクターからのウイルス遺伝子発現、送達されるポリヌクレオチドまたは他のカーゴ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムポリヌクレオチド）のパッケージング、ならびにウイルス粒子構築、及び成熟ウイルス粒子の培地への分泌を可能とするための適切な長さの時間、インキュベーションされる。様々な他の方法及び技術が当業者に一般的に知られている。
成熟ウイルス粒子は、好適な方法によって培地から収集され得る。いくつかの実施形態では、これは、ウイルスを濃縮するための遠心分離を含み得る。収集されたウイルス粒子を含有する組成物の力価は、好適な方法を使用して得られ得る。そのような方法は、好適な細胞株（例えば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞）を形質導入すること及び好適な方法によってその細胞株における形質導入効率、感染性を決定することを含み得る。好適な方法には、ＰＣＲベースの方法、フローサイトメトリー、及び抗生物質選択ベースの方法が含まれる。様々な他の方法及び技術が当業者に一般的に知られている。ウイルス粒子の濃度は、必要に応じて調整され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子を含有する得られた組成物は、１Ｘ１０１～１Ｘ１０２０粒子／ｍＬを含有し得る。
レンチウイルスは、本明細書に記載の任意のレンチウイルスベクターまたはベクターシステムから調製され得る。１つの例示的な実施形態では、ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド骨格を含有する）をクローニングした後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴがＴ－７５フラスコにおいて５０％コンフルエンスとなるように播種され、その翌日に１０％ウシ胎仔血清を有し、抗生物質を有さないＤＭＥＭ中でトランスフェクションされ得る。２０時間後、培地はＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地と交換され得、レンチウイルスベクターのトランスフェクションが４時間後に行われ得る。細胞は、１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び適切なパッケージングプラスミド（例えば、５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－ｇ偽型）、ならびに７．５ｕｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ））でトランスフェクションされ得る。トランスフェクションは、カチオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を有する４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中で行われ得る。６時間後、培地は、１０％ウシ胎仔血清を有する抗生物質非含有ＤＭＥＭに交換され得る。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用し得るが、無血清方法が好ましい。
トランスフェクションし、生成細胞（パッケージング細胞とも称される）がパッケージングされるカーゴを有するウイルス粒子をパッケージング及び生成した後、レンチウイルス粒子は精製され得る。例示的な実施形態では、ウイルスを含有する上清が４８時間後に収集され得る。収集されたウイルスを含有する上清はまず、デブリが除去され、０．４５ｕｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターを介して濾過され得る。それらは次いで、超遠心分離機において２４，０００ｒｐｍで２時間回転され得る。得られたウイルス含有ペレットは、４℃で一晩５０ｕｌのＤＭＥＭに再懸濁され得る。それらは次いで、分注され、直ちに使用され得るか、または保存のために－８０℃で直ちに凍結され得る。
ベクター及びウイルス粒子送達
本明細書に記載のベクター（非ウイルス性担体を含む）は、宿主細胞に導入され、それにより転写産物、タンパク質、またはペプチド（本明細書に記載される核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む）（例えば、修飾ＡＡＶカプシドシステム転写産物、タンパク質、酵素、それらの変異体形態、それらの融合タンパク質など）、及びウイルス粒子（ウイルスベクター及びそのシステムからのものなど）が生成され得る。
１つ以上の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドは、先行記載されているアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルスまたは他のプラスミドもしくはウイルスベクタータイプを使用して、特に、例えば、米国特許番号８，４５４，９７２（アデノウイルスのための製剤、用量）、８，４０４，６５８（ＡＡＶのための製剤、用量）及び５，８４６，９４６（ＤＮＡプラスミドのための製剤、用量）ならびにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスを伴う臨床試験及び臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を使用して送達され得る。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許番号８，４５４，９７２におけるもの及びＡＡＶを含む臨床試験におけるもののとおりであり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許番号８，４０４，６５８におけるもの及びアデノウイルスを含む臨床試験におけるもののとおりであり得る。
プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許番号５，８４６，９４６におけるもの及びプラスミドを含む臨床研究におけるもののとおりであり得る。いくつかの実施形態では、用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、男性成人ヒト）に基づき、またはそれに外挿され得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物のために調整され得る。投与の頻度は、患者または対象の年齢、性別、全般的健康状態、他の状態ならびに対処されている特定の状態または症状を含む通常の要因に応じて、医学的または獣医学的実践者（例えば、医師、獣医師）の領域の範囲内である。ウイルスベクターは、対象となる組織または細胞に注射され、またはそうでなければ送達され得る。
ｉｎ ｖｉｖｏ送達の観点から、ＡＡＶは、いくつかの理由、例えば、低い毒性（これは、免疫反応を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因し得る）及び宿主ゲノムに組み込まれないことによる挿入変異生成を引き起こす低い可能性のため、他のウイルスベクターよりも有利である。
本明細書に記載のベクター（複数可）及びウイルス粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、及びまたはｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞に送達され得る。送達は、物理的方法、化学的方法、及び生物学的方法を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって行われ得る。物理的送達方法は、細胞の膜障壁を弱めるための物理的な力を用いて、ベクターの細胞内送達を容易化するそれらの方法である。好適な物理的方法には、針（例えば、注射）、弾道ポリヌクレオチド（例えば、パーティクルボンバードメント、マイクロプロジェクタイル遺伝子移行、及び遺伝子銃）、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーション、及び機械的マッサージが含まれるがこれらに限定されない。化学的方法は、細胞膜透過性または他の特性（複数可）の変化を引き起こすための化学物質を用いて、細胞へのベクターの進入を容易化するそれらの方法である。例えば、細胞膜の透過性の変化を引き起こし得る環境ｐＨが変更され得る。生物学的方法は、宿主細胞の生物学的プロセスまたは生物学的特性に依存し、またはそれを利用して、細胞へのベクターの（担体を用いたまたは用いない）輸送を容易化するものである。例えば、ベクター及び／またはその担体は、細胞におけるエンドサイトーシスまたは同様のプロセスを刺激して、細胞へのベクターの取り込みを容易化し得る。
粒子を介した細胞への修飾ＡＡＶカプシドシステム成分（例えば、修飾ＡＡＶカプシド及び／またはカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド）の送達。用語「粒子」は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステム成分の送達のための任意の好適なサイズの粒子を指す。好適なサイズには、マクロ、マイクロ、及びナノサイズの粒子が含まれる。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドシステム成分（例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター及びそれらの組み合わせ）のいずれかは、本明細書に記載される１つ以上の粒子またはその成分に結合され、連結され、組み込まれ、そうでなければ関連付けられ得る。本明細書に記載の粒子は次いで、適切な経路及び／または技術によって細胞または生物に投与され得る。いくつかの実施形態では、粒子送達は、ポリヌクレオチドまたはベクター成分の送達のために選択され、有利であり得る。実施形態では、粒子送達はまた、本明細書の他の個所に記載されている他の修飾カプシドシステム分子及び製剤のために有利であり得ることが理解される。
修飾ウイルス粒子
本明細書には、修飾筋肉特異的カプシド（例えば、本明細書の他の個所で詳細に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を有する１つ以上の修飾カプシドポリペプチドを含有するカプシド）を含有し得る修飾ウイルス粒子（本明細書で「修飾ウイルス粒子」とも称される）も記載されている。本明細書には、カーゴとして、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドを含有するウイルス粒子も記載されている。
修飾ウイルス粒子は、レンチウイルスベース、レトロウイルスベース、ポックスウイルスベース、ヘルペスウイルスベース、アデノウイルスベースの粒子、ヘルパーアデノウイルスベースの粒子、ＡＡＶベースの粒子、またはハイブリッドアデノウイルスベースの粒子であって、前述されている少なくとも１つの修飾カプシドタンパク質を含有するものであり得ることが理解される。修飾ウイルスカプシドは、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の筋肉特異的標的化部位を含有する１つ以上の修飾カプシドタンパク質を含有するものである。いくつかの実施形態では、修飾ウイルスカプシドは、修飾ＡＡＶカプシドである。
いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の１～６０個の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶ粒子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の修飾カプシドタンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶ粒子は、０～５９個の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶ粒子は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９個の野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含有し得る。よって、修飾ＡＡＶ粒子は、前述されている１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ｎ－ｍｅｒは、ＲＧＤモチーフである。
修飾ウイルス粒子はそれぞれ、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを含み得る。カーゴポリヌクレオチドは、本明細書の他の個所でより詳細に論述されている。ウイルスベクター及び非ウイルスベクターから修飾ＡＡＶ粒子を作製する方法は、本明細書の他の個所に記載されている。修飾ウイルス粒子を含有する製剤は、本明細書の他の個所に記載されている。
修飾非ベクター送達ビヒクル
いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位は、非ベクター送達ビヒクルに組み込まれる。いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位は、非ベクター送達ビヒクルに機能可能に連結され、またはそうでなければ結合される。本明細書で使用される場合、「結合される」は、２つ以上の分子間の共有結合性または非共有結合性相互作用を指し得る。非共有結合性相互作用には、イオン結合、静電気性相互作用、ファンデルワールス力、双極子－双極子相互作用、双極子誘導双極子相互作用、ロンドン分散力、水素結合、ハロゲン結合、電磁的相互作用、π－π相互作用、カチオン－π相互作用、アニオン－π相互作用、極性π－相互作用、及び疎水性作用が含まれ得る。いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位は、非ベクター送達ビヒクルに機能可能に連結されており、またはそうでなければ結合されている組成物（タンパク質またはポリヌクレオチドなど）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的標的化部位は、筋肉特異的標的化部位が非ベクター送達ビヒクルの表面に存在するように、機能的に連結され、またはそうでなければ結合される。送達ビヒクルは、非ウイルス性ビヒクルを含み得る。通常、核酸及び／またはタンパク質を送達することが可能な方法及びビヒクルは、本明細書に記載のシステム組成物を送達するために使用され得る。非ウイルス性ビヒクルの例には、脂質ナノ粒子、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）、ＤＮＡナノクルー、金属ナノ粒子、ストレプトリジンＯ、多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）、脂質被覆メソ多孔性シリカ粒子、及び他の無機ナノ粒子が含まれる。
脂質粒子
送達ビヒクルは、脂質粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びリポソームを含み得る。リポフェクションは、例えば、米国特許番号５，０４９，３８６、４，９４６，７８７；及び４，８９７，３５５に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開番号ＷＯ９１／１７４２４及びＷＯ９１／１６０２４のものが含まれる。免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）；米国特許４，１８６，１８３、４，２１７，３４４、４，２３５，８７１、４，２６１，９７５、４，４８５，０５４、４，５０１，７２８、４，７７４，０８５、４，８３７，０２８、及び４，９４６，７８７を参照されたい）。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
ＬＮＰは、カチオン性脂質粒子（例えば、リポソーム）内に核酸を封入し得、比較的容易に細胞に送達され得る。いくつかの例では、脂質ナノ粒子は、いかなるウイルス性成分も含有せず、これは安全性及び免疫原性の問題を最小化するのに役立つ。脂質粒子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏ送達のために使用され得る。脂質粒子は、様々なスケール細胞集団のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＤＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ及び／またはｇＲＮＡのコーディング配列を含むもの）及び／またはＲＮＡ分子（例えば、ＣａｓのｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）を送達するために使用され得る。特定の場合では、ＬＮＰは、Ｃａｓ／ｇＲＮＡのＲＮＰ複合体を送達するために使用され得る。
ＬＮＰにおける成分は、カチオン性脂質１，２－ジリネオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、ｌ，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレイルオキシケト－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ－ＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２－ＤＭＡ）、（３－ｏ－［２’’－（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］－ｌ，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリコール（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）、Ｒ－３－［（ｒｏ－メトキシ－ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］－ｌ，２－ジミリスチルオキシルプロピル－３－アミン（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ、及びそれらの任意の組み合わせを含み得る。ＬＮＰの調製及び封入は、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６－２２００，Ｄｅｃ．２０１１）から適応され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達ビヒクルは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及び／またはその成分（複数可）を含有するウイルス粒子を送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子（複数可）は、静電気性相互作用などを介して脂質粒子に吸着され得、及び／またはリンカーを介してリポソームに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、核酸を含有し、その場合、核酸骨格ホスフェートのカチオン性脂質窒素原子に対する電荷比は、約１：１．５～７または約１：４である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰはまた、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物を含む。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、生物学的に不活性な化合物である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、その表面または分子それ自体にいかなる電荷も保有しない。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルグルコース（ＨＥＧ）ベースのポリマー、ポリヒドロキシエチルデンプン（ポリＨＥＳ）及びポリプロピレンである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ、ＨＥＧ、ポリＨＥＳ、及びポリプロピレンの重量は、約５００～１０，０００Ｄａの間または約２０００～５０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、遮蔽化合物は、ＰＥＧ２０００またはＰＥＧ５０００である。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１つ以上のヘルパー脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、蛍光体脂質またはステロイドであり得る。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、組成物の総脂質含有量の約２０ｍｏｌ％～８０ｍｏｌ％の間である。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質成分は、ＬＮＰの総脂質含有量の約３５ｍｏｌ％～６５ｍｏｌ％の間である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＬＮＰの総脂質含有量の５０ｍｏｌ％の脂質及び５０ｍｏｌ％のヘルパー脂質を含む。
他の非限定的な例示的なＬＮＰ送達ビヒクルは、米国特許公開番号ＵＳ２０１６０１７４５４６、ＵＳ２０１４０３０１９５１、ＵＳ２０１５０１０５５３８、ＵＳ２０１５０２５０７２５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１７ Ｊａｎ ３１．ｐｉｉ：Ｓ０１６８－３６５９（１７）３００３８－Ｘ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｏｎｒｅｌ．２０１７．０１．０３７．［プリント版の出版前にオンラインで先行公開］；Ａｌｔｉｎｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ｓｃｉ．，４（１２）：１７７３－８０，Ｎｏｖ．１５，２０１６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１３（１１）：２８６８－７３ Ｍａｒｃｈ １５，２０１６；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ，１０（１１）：ｅ０１４１８６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４１８６０．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１５，Ｎｏｖ．３，２０１５；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｇｅｎ Ｒｅｓ．１０（５）：６８９－９０，Ｍａｙ ２０１５；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．，３（９）：１３９８－４０３，Ｓｅｐ．２０１４；及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｎｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．，５３（１１）：２８９３－８，Ｍａｒ．１０，２０１４；Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）（２０１４年５月１１日にオンラインで出版），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４；Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９－２９；Ａｌｅｋｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６８（２３）：９７８８－９８（Ｄｅｃ．１，２００８），Ｓｔｒｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５０（１）：７６－８（Ｊａｎ．２０１２），Ｓｃｈｕｌｔｈｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，３２（３６）：４１４１－４８（Ｄｅｃ．２０，２０１４），ａｎｄ Ｆｅｈｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２２（４）：８１１－２０（Ａｐｒ．２２，２０１４）；Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３；ＷＯ２０１２１３５０２５；ＵＳ２０１４０３４８９００；ＵＳ２０１４０３２８７５９；ＵＳ２０１４０３０８３０４；ＷＯ２００５／１０５１５２；ＷＯ２００６／０６９７８２；ＷＯ２００７／１２１９４７；ＵＳ２０１５／０８２０８０；ＵＳ２０１２０２５１６１８；７，９８２，０２７；７，７９９，５６５；８，０５８，０６９；８，２８３，３３３；７，９０１，７０８；７，７４５，６５１；７，８０３，３９７；８，１０１，７４１；８，１８８，２６３；７，９１５，３９９；８，２３６，９４３及び７，８３８，６５８ならびに欧州特許番号１７６６０３５；１５１９７１４；１７８１５９３及び１６６４３１６に記載されている。
リポソーム
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、リポソームであり得る。リポソームは、内部の水性区画を囲む単層または多層脂質二重層及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重層から構成される球状小胞構造である。いくつかの実施形態では、リポソームは、生体適合性で非毒性であり、親水性及び脂溶性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、それらの装填物を生物膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通って輸送することができる。
リポソームは、いくつかの異なるタイプの脂質、例えば、リン脂質から作製され得る。リポソームは、天然リン脂質及び脂質、例えば、ｌ，２－ジステアロリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵黄ホスファチジルコリン、モノシアロガングリオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
いくつかの他の添加剤が、それらの構造及び特性を改変するためにリポソームに添加され得る。例えば、リポソームは、例えば、安定性を向上させるために及び／またはリポソーム内部のカーゴの漏出を防止するために、コレステロール、スフィンゴミエリン、及び／またはｌ，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム及び／またはその成分（複数可）を含有するウイルス粒子を送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子（複数可）は、静電気性相互作用などを介してリポソームに吸着され得、及び／またはリンカーを介してリポソームに結合され得る。
いくつかの実施形態では、リポソームは、トロイの木馬リポソームであり得る（当該技術分野で分子トロイの木馬としても知られている）、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇを参照されたい。その教示は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを生成及び／または送達するために適用及び／または適応され得る。
他の非限定的な例示的なリポソームは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，４０３－０７（２０１２）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１３（１１）２８６８－２８７３（２０１６）；Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９；ＷＯ２００８／０４２９７３；米国特許番号８，０７１，０８２；ＷＯ２０１４／１８６３６６；２０１６０２５７９５１；ＵＳ２０１６０１２９１２０；ＵＳ２０１６０２４４７６１；２０１２０２５１６１８；ＷＯ２０１３／０９３６４８に記載されているもの；リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ．ＲＴＭ．（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ．ＲＴＭ．２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ．ＲＴＭ．３０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ．ＲＴＭ．ＲＮＡｉＭＡＸ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ．ＲＴＭ．ＬＴＸ）、ＳＡＩＮＴ－ＲＥＤ（Ｓｙｎｖｏｌｕｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＤＯＰＥ、サイトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、及びユーフェクチン（Ｅｕｆｅｃｔｉｎ）（ＪＢＬ，Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。
安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）であり得る。ＳＮＡＬＰは、イオン化可能な脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）（例えば、低ｐＨでカチオン性）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの例では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、３－Ｎ－［（ｗ－メトキシポリエチレングリコール）２０００）カルバモイル］－ｌ，２－ジミレスチルオキシプロピルアミン（ｄｉｍｙｒｅｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ）、及びカチオン性ｌ，２－ジリノレイルオキシ－３－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。いくつかの例では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール、ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＰＥＧ－ｃＤＭＡ、及びｌ，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ；Ｎ－ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡｏ）を含み得る。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを送達するために使用され得る他の非限定的な例示的なＳＮＡＬＰは、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６；Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６－９０５；Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１－６７３（２００９）；及びＳｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２－１７７に記載されている任意のそのようなＳＮＡＬＰであり得る。
他の脂質
脂質粒子はまた、１つ以上の他のタイプの脂質、例えば、カチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ４、Ｃ１２－２００及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含み得る。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、例えば、ＵＳ２０１１０２９３７０３に記載されているもののいずれかなどのリピドイドであり、またはそれを含み得る。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９－８５３３に記載されているもののいずれかなどのアミノ脂質であり、またはそれを含み得る。
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、例えば、Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１５４－１５７に記載されているもののいずれかなどの脂質エンベロープであり、またはそれを含み得る。
リポプレックス／ポリプレックス
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、リポプレックス及び／またはポリプレックスを含む。リポプレックスは、負に荷電した細胞膜に結合し、細胞内へのエンドサイトーシスを誘導し得る。リポプレックスの例は、脂質（複数可）及び非脂質成分を含む複合体であり得る。リポプレックス及びポリプレックスの例には、ＦｕＧＥＮＥ－６試薬、脂質及び他の成分を含有する非リポソーム溶液、双性イオン性アミノ脂質（ＺＡＬ）、Ｃａ２ｐ（例えば、ＤＮＡ／Ｃａ２＋マイクロ複合体を形成する）、ポリエテンイミン（ＰＥＩ）（例えば、分岐状ＰＥＩ）、ならびにポリ（Ｌ－リジン）（ＰＬＬ）が含まれる。
糖ベースの粒子
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、糖ベースの粒子であり得る。いくつかの実施形態では、糖ベースの粒子は、ＷＯ２０１４１１８２７２；ＵＳ２００２０１５０６２６；Ｎａｉｒ，ＪＫ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３６（４９），１６９５８－１６９６１；Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２０１５，２６（８），ｐｐ １４５１－１４５５；に記載されているもののいずれかなどのＧａｌＮＡｃであり、またはそれを含み得る。
細胞浸透性ペプチド
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。ＣＰＰは、様々な分子カーゴ（例えば、ナノサイズの粒子から小さな化学分子及びＤＮＡの大きな断片まで）の細胞取り込みを容易化する短いペプチドである。
ＣＰＰは、異なるサイズ、アミノ酸配列、及び電荷のものであり得る。いくつかの例では、ＣＰＰは、細胞膜を移動させ、様々な分子カーゴの細胞質または細胞小器官への送達を容易化し得る。ＣＰＰは、異なるメカニズム、例えば、膜における直接浸透、エンドサイトーシス媒介進入、及び一時的構造の形成による転移を介して細胞に導入され得る。
ＣＰＰは、リジンまたはアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸の高い相対的存在量を含有するか、または極性／荷電アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかのアミノ酸組成を有し得る。これらの２つのタイプの構造は、それぞれ、ポリカチオン性または両親媒性と称される。第３のクラスのＣＰＰは、低い正味電荷を有する極性残基のみを含有する疎水性ペプチドであり、または細胞取り込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。別のタイプのＣＰＰは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）からのトランス活性化転写活性化因子（Ｔａｔ）である。ＣＰＰの例には、ペネトラチン、Ｔａｔ（４８－６０）、トランスポータン、及び（Ｒ－ＡｈＸ－Ｒ４）（Ａｈｘはアミノヘキサノイルを指す）、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇｓ配列、グアニンリッチ分子トランスポーター、及びスイートアローペプチドが含まれる。ＣＰＰ及び関連出願の例にはまた、米国特許８，３７２，９５１に記載されているものが含まれる。
ＣＰＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの作業のために非常に容易に使用され得、各カーゴ及び細胞タイプのための広範な最適化が通常は必要とされる。いくつかの例では、ＣＰＰは、Ｃａｓタンパク質に直接的に共有結合し得、これは次いで、ｇＲＮＡと複合体化され、細胞に送達される。いくつかの例では、ＣＰＰ－Ｃａｓ及びＣＰＰ－ｇＲＮＡの複数の細胞への分離送達が実施され得る。ＣＰＰもまた、ＲＮＰを送達するために使用され得る。
ＣＰＰは、組成物及びシステムを植物に送達するために使用され得る。いくつかの例では、ＣＰＰは、成分を植物プロトプラストに送達するために使用され得、これは次いで、植物細胞及びさらには植物に再生される。
ＤＮＡナノクルー
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ＤＮＡナノクルーを含む。ＤＮＡナノクルーは、スフィア様構造のＤＮＡ（例えば、毛糸玉の形状を有する）を指す。ナノクルーは、構造の自己構築を補助する回文配列を用いたローリングサークル増幅によって合成され得る。スフィアは次いで、ペイロードで装填され得る。ＤＮＡナノクルーの例は、Ｓｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１４ Ｏｃｔ ２２；１３６（４２）：１４７２２－５；及びＳｕｎ Ｗ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１５ Ｏｃｔ ５；５４（４１）：１２０２９－３３に記載されている。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓ：ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体内のｇＲＮＡに部分的に相補的となる回文配列を有し得る。ＤＮＡナノクルーは、コーティングされ、例えば、ＰＥＩでコーティングされて、エンドソーム脱出が誘導され得る。
金属ナノ粒子
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰまたは金コロイドとも称される）を含む。金ナノ粒子は、カーゴとの複合体、例えば、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ ＲＮＰを形成し得る。金ナノ粒子は、コーティングされ、例えば、シリケート及びエンドソーム破壊ポリマー、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）でコーティングされ得る。金ナノ粒子の例には、ＡｕｒａＳｅｎｓｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））コンストラクト、及びＭｏｕｔ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．ＡＣＳ Ｎａｎｏ １１：２４５２－８；Ｌｅｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｎａｔ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ １：８８９－９０１に記載されているものが含まれる。他の金属ナノ粒子も、カーゴ（複数可）と複合体化され得る。そのような金属粒子には、タングステン、パラジウム、ロジウム、白金、及びイリジウム粒子が含まれる。他の非限定的な例示的な金属ナノ粒子は、ＵＳ２０１００１２９７９３に記載されている。
ｉＴＯＰ
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ｉＴＯＰを含む。ｉＴＯＰは、任意の形質導入ペプチドとは無関係に、ネイティブタンパク質の非常に効率的な細胞内送達を誘導する小分子の組み合わせを指す。ｉＴＯＰは、細胞外マクロ分子の細胞へのマクロ飲作用性取り込みを引き起こすために形質導入化合物（プロパンベタイン）と共にＮａＣｌ媒介高浸透圧を使用してオスモサイトーシス及びプロパンベタインによる誘導形質導入のために使用され得る。ｉＴＯＰ法及び試薬の例には、Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ ＤＳ，Ｐａｇｌｉｅｒｏ ＲＪ，Ｐｒａｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ １６１：６７４－６９０に記載されているものが含まれる。
ポリマーベースの粒子
いくつかの実施形態では、送達ビヒクルは、ポリマーベースの粒子（例えば、ナノ粒子）を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリマーベースの粒子は、ウイルスの膜融合メカニズムを模倣し得る。ポリマーベースの粒子は、インフルエンザウイルス機構の合成コピーであり得、酸性区画の形成を伴うプロセスであるエンドサイトーシス経路を介して細胞が取り込む様々なタイプの核酸（（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ）とトランスフェクション複合体を形成し得る。後期エンドソームにおける低いｐＨは、粒子表面を疎水性とし、膜通過を容易化する化学的スイッチとして作用する。サイトゾルに入ると、粒子は、細胞作用のためにそのペイロードを放出する。この活性エンドソーム脱出技術は、天然取り込み経路を使用しているので、安全であり、トランスフェクション効率を最大化する。いくつかの実施形態では、ポリマーベースの粒子は、アルキル化及びカルボキシアルキル化分岐ポリエチレンイミンを含み得る。いくつかの例では、ポリマーベースの粒子は、ＶＩＲＯＭＥＲ、例えば、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＮＡｉ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＲＥＤ、ＶＩＲＯＭＥＲ ｍＲＮＡ、ＶＩＲＯＭＥＲ ＣＲＩＳＰＲである。本明細書においてシステム及び組成物を送達する例示的な方法には、Ｂａｗａｇｅ ＳＳ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｃａｓ１３ａ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ＲＮＡ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／３７０４６０ｖ１．ｆｕｌｌ ｄｏｉ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／３７０４６０，Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）ＲＥＤ，ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．１６９９３．６１２８１，Ｖｉｒｏｍｅｒ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ － Ｆａｃｔｂｏｏｋ ２０１８：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，ｕｓｅｒｓ’ ｄａｔａ．，ｄｏｉ：１０．１３１４０／ＲＧ．２．２．２３９１２．１６６４２に記載されているものが含まれる。他の例示的な及び非限定的なポリマー性粒子は、ＵＳ２０１７００７９９１６、ＵＳ２０１６０３６７６８６、ＵＳ２０１１０２１２１７９、ＵＳ２０１３０３０２４０１、６，００７，８４５、５，８５５，９１３、５，９８５，３０９、５，５４３，１５８、ＷＯ２０１２１３５０２５、ＵＳ２０１３０２５２２８１、ＵＳ２０１３０２４５１０７、ＵＳ２０１３０２４４２７９；ＵＳ２００５００１９９２３、２００８０２６７９０３に記載されている。
ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）
送達ビヒクルは、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）であり得る。ＳＬＯは、哺乳動物細胞膜において細孔を生成することによって作用するＡ群連鎖球菌によって生成される毒素である。ＳＬＯは、可逆的様式で作用し得、これにより、全体の生存率を損なうことなく、タンパク質（例えば、最大で１００ｋＤａ）を細胞のサイトゾルに送達することが可能となる。ＳＬＯの例には、Ｓｉｅｒｉｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７１：４４６－５５；Ｗａｌｅｖ Ｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８：３１８５－９０；Ｔｅｎｇ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｅｌｉｆｅ ６：ｅ２５４６０に記載されているものが含まれる。
多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）
送達ビヒクルは、多機能性エンベロープ型ナノデバイス（ＭＥＮＤ）を含み得る。ＭＥＮＤは、縮合プラスミドＤＮＡ、ＰＬＬコア、及び脂質膜シェルを含み得る。ＭＥＮＤは、細胞透過性ペプチド（例えば、ステアリルオクタアルギニン）をさらに含み得る。細胞浸透性ペプチドは、脂質シェル内にあり得る。脂質エンベロープは、１つ以上の機能性成分、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、血管循環時間を増加させるため）、特定の組織／細胞の標的化のためのリガンド、追加の細胞透過性ペプチド（例えば、より多い細胞送達のため）、エンドソーム脱出を強化するための脂質、及び核送達タグのうちの１つ以上で改変され得る。いくつかの例では、ＭＥＮＤは、細胞核及びミトコンドリアを標的とし得るテトラ層状ＭＥＮＤ（Ｔ－ＭＥＮＤ）であり得る。特定の例では、ＭＥＮＤは、膀胱癌細胞を標的とし得る、ＰＥＧ－ペプチド－ＤＯＰＥコンジュゲートＭＥＮＤ（ＰＰＤ－ＭＥＮＤ）であり得る。ＭＥＮＤの例には、Ｋｏｇｕｒｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ９８：３１７－２３；Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ４５：１１１３－２１に記載されているものが含まれる。
カーゴポリヌクレオチド
修飾筋肉特異的送達システムポリヌクレオチド、ウイルスカプシドポリヌクレオチド、他のＡＡＶポリヌクレオチド（複数可）、及び／またはベクターポリヌクレオチド、ウイルス粒子、及び／または非ベクター送達ビヒクルは、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドは、修飾筋肉特異的送達システムポリヌクレオチド（複数可）に機能可能に連結され、いくつかの実施形態では、本発明の修飾ウイルスシステムの修飾ウイルスゲノムの一部である。カーゴポリヌクレオチドは、例えば、細胞に送達され得る修飾ウイルス粒子にパッケージングされ得る。いくつかの実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、それが送達される細胞のポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または転写産物）を改変することが可能であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、欠陥ポリペプチドを修正するための置換ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、染色体上の特定の位置を占め、かつ生物における特性（複数可）または形質（複数可）のための遺伝子的指示を含有するＤＮＡの配列に対応する遺伝性単位を指し得る。遺伝子という用語は、ゲノムの翻訳及び／または非翻訳領域を指し得る。「遺伝子」は、ポリペプチドに翻訳され得、またはｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ及びｓｈＲＮＡを含むがこれらに限定されない触媒ＲＮＡ分子であり得るＲＮＡ転写産物に転写されるＤＮＡの特定の配列を指し得る。ポリヌクレオチド、遺伝子、転写産物などの改変には、遺伝子編集ならびに従来の組換え遺伝子改変技術（例えば、全体的または部分的遺伝子挿入、欠失、及び変異誘発（例えば、挿入及び欠失変異誘発）技術を含むがこれらに限定されないすべての遺伝子修飾技術が含まれる。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ワクチンであり、またはそれをコードし得るポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ワクチンは、がんに対する免疫反応を刺激し得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、大腸または膵臓癌に対する免疫反応を刺激し得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ｈＣＧ生成細胞、例えば、ｈＣＧ生成がん細胞のための不安定な環境を生成し得る。
いくつかの実施形態では、カーゴは、ポリヌクレオチドであって、それ自体またはその生成物が、筋肉疾患またはその症状を処置するのに有効であり得るものである。
遺伝子改変カーゴポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、単独でまたはシステムの一部として送達される場合、システムの他の成分と共に送達されるかどうかにかかわらず、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するために作用し得る、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。そのようなシステムには、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが含まれるがこれに限定されない。他の遺伝子改変システム、例えば、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Ｃｒｅ－Ｌｏｘ、モルホリノなどは、１つ以上の成分が本明細書に記載の修飾ＡＡＶ粒子によって送達され得る遺伝子可変システムの他の非限定的な例である。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、遺伝子編集システムまたはその成分である。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子またはその成分である。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、遺伝子改変システム（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムなど）の１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ｇＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、単独でまたはシステムの一部として送達される場合、システムの他の成分と共に送達されるかされないかにかかわらず、筋肉または骨格障害、神経疾患または障害、及び／またはウイルス（一本鎖ＲＮＡウイルスなど）の疾患、障害、またはその症状を処置または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するように作用し得るポリヌクレオチドまたはポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、システムの他の成分と共に送達されるかされないかにかかわらず、早老性疾患（例えば、早老性ラミノパシー）、グリコーゲン蓄積症、免疫障害（自己免疫疾患など）、がん、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、６肢帯型筋ジストロフィー疾患（ＬＧＭＤ）、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ポンペ病、または他のＣＮＳ関連疾患、例えば、ハンチントン及び他の伸長リピート病を処置または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するように作用する。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、システムの他の成分と共に送達されるかされないかにかかわらず、米国特許出願公開２０１９０２８４５５５（その内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る）に記載されているもののいずれかなどのＧＡＡ遺伝子を改変するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するように作用する。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８、または他の筋肉特異的プロモーターに連結されたオリゴヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、タンパク質機能性のために最適化されたジストロフィン遺伝子の選択された領域のみを含有するマイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、選択された領域には、スペクトリン様リピート１、２、３、及び２４が含まれる。例えば、Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，Ｈａｕｓｅｒ ＭＡ，ＤｅｌｌｏＲｕｓｓｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｒ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２；８（３）：２５３－２６１を参照されたい。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドは、臨床試験ＮＣＴ０３３７５１６４及びＮＣＴ０３７６９１１６に供されているＡＡＶｒｈ７４．ＭＨＣＫ７マイクロジストロフィン遺伝子またはＳＲＰ－９００１として知られているｒＡＡＶ剤によって送達される。このマイクロジストロフィン遺伝子コンストラクトは、ＮＴ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒンジ領域を表すＨを含む。Ｅｎｇｌａｎｄ ＳＢ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３４３（６２５４）：１８０－１８２；Ｗｅｌｌｓ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１９９５；４（８）：１２４５－１２５０，Ｓａｌｖａ ＭＺ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００７；１５（２）：３２０－３２９；Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ．２０１２；５２７（２）：９０－９９；Ｒｏｄｉｎｏ－Ｋｌａｐａｃ ＬＲ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１３；２２（２４）：４９２９－４９３７；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ ＶＭ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７；４：１５９－１６８；Ｈａｒｐｅｒ ＳＱ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００２；８（３）：２５３－２６１；Ｎｅｌｓｏｎ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１８；２７（１２）：２０９０－２１００。いくつかの実施形態では、選択された領域は、スペクトリン様リピート２及び３を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ｎＮＯＳドメインを含有する。いくつかの実施形態では、ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピート１６及び／または１７から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１６及び１７を含む。いくつかの実施形態では、ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピートＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、筋肉特異的プロモーターに連結される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンオリゴヌクレオチドは、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８、ＳＮＰ１８、ＳＰ００３３、ＳＰ００５１、ＳＰ０１７３、ｔｍＣＫ、または別の筋肉特異的プロモーターに連結される。
いくつかの実施形態では、カーゴマイクロジストロフィンは、ＡＢＤ（アクチン結合ドメイン）、１つ以上のヒンジ領域（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４）、及び１つ以上のスペクトリン様リピート（例えば、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２４’及び任意にジストログリカン結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＤＢＤから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィンは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｈ２－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１’－Ｒ２４’－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴを含む。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、スペクトリン様リピートＲ１、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３及びＲ２４を含有する、マイクロジストロフィン遺伝子をコードし得るポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒンジ領域（Ｈ）４及び／またはＨ１を含有する。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、Ｎ末端アクチン結合ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、ヒト全長ジストロフィンタンパク質のＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含有する。マイクロジストロフィン遺伝子は、ｎＮＯＳドメインを含有し得る。いくつかの実施形態では、ｎＮＯＳドメインは、スペクトリン様リピート１６及び／または１７から構成される。いくつかの実施形態では、マイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１６及び１７を含む。マイクロジストロフィン遺伝子は、ＷＯ２０１９１１８８０６Ａ１及びＷＯ２０１６／１１５５４３に記載されているとおりであり得、これらは、本明細書においてそれらの全体が示されているかのように参照により組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る。いくつかの実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、ヒト全長ジストロフィンタンパク質のＮ末端からＣ末端まで、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、ヒンジ領域１（Ｈｌ）、スペクトリン様リピートＲｌ、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ２３、及びＲ２４、ヒンジ領域４（Ｈ４）、ならびにＣ末端ジストログリカン結合ドメインを含有する５－リピートマイクロジストロフィンタンパク質をコードし得る。この５－リピートマイクロジストロフィン及び関連するジストロフィンミニ遺伝子のタンパク質配列は、ＷＯ２０１６／１１５５４３に記載されている。いくつかの実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、現在、識別番号ＮＣＴ０３３６８７４２を有する臨床試験中のＳＧＴ００１として知られている薬剤の一部であるマイクロジストロフィン遺伝子に対応し得る。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ミニジス遺伝子またはベクターである。いくつかの実施形態では、ミニジス遺伝子またはベクターは、ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２０－Ｒ２１；ＡＢＤ－Ｈ１－Ｒ１－Ｒ２－Ｒ３－Ｒ１６－Ｒ１７－Ｈ３－Ｒ２０－Ｒ２１－Ｒ２２－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ；またはＨ３－Ｒ２０－Ｒ２１－Ｒ２２－Ｒ２３－Ｒ２４－Ｈ４－ＣＲ－ＣＴから構成され得る。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＳＣＧＢ ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＳＧＣＢ ｃＤＮＡは、ＭＨＣＫ７、ＣＫ８プロモーター、ＳＮＰ１８プロモーター、ＳＰ００３３プロモーター、ＳＰ００５１、ＳＰ０１７３プロモーター、ｔｍＣＫプロモーターまたは別の筋肉特異的プロモーターに連結される。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ベータ－サルコグリカンｃＤＮＡ、アルファ－サルコグリカンｃＤＮＡ、ジスフェリンｃＤＮＡ、ガンマ－サルコグリカンｃＤＮＡ、Ｃａｌｐｉｎ－３ ｃＤＮＡ、ＳＧＳＨ ｃＤＮＡ（例えば、ＬＹＳ－ＳＡＦ３０２）、ニューロトロピン３ ｃＤＮＡ、アノクタミン－５ ｃＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、システムの他の成分と共に送達されるかされないかにかかわらず、ハンチントン病などの伸長リピート病に関連する遺伝子または遺伝子産物、例えば、米国特許出願公開２０１９０１００７５５、米国特許１００６６２２８（これらの内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る）に記載されているものを処置、予防、及び／または改変するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するように作用する。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、アンチセンスオリゴマーまたはＲＮＡ分子、例えば、米国特許出願公開ＵＳ２０１６０２５１３９８、ＵＳ２０１５０２６７２０２、ＵＳ２０１９００１５４４０、ＵＳ２０１４０２８７９８３、ＵＳ２０１８０２１６１１１、ＷＯ／２０１７／０６２８３５、ＵＳ２０１９０１７７７２３、ＵＳ２０１７００５１２７８、ＵＳ２０１８０２７１８９３、ＷＯ／２０１６／１４９６５、米国特許１００７６５３６、ＷＯ／２０１８／００５８０、ＷＯ／２０１８／１１８６６、ＷＯ／２０１９／０５９９７３（これらの内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る）に記載されているものである。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、システムの他の成分と共に送達されるかされないかにかかわらず、一本鎖ＲＮＡウイルス、例えば、インフルエンザ、ウエストナイルウイルス、ＳＡＲＳ、Ｃ型肝炎、デング熱、エボラ、マールブルグ、及び／またはカリシウイルスを処置または予防するように、それが送達される細胞のゲノム、エピゲノム、及び／またはトランスクリプトームを改変するように作用する。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、アンチセンス抗ウイルス化合物、例えば、ＵＳ８７０３７３５Ｂ２（その内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る）に記載されているもののいずれかであり得る。
本明細書に記載のカーゴ分子によって改変することが可能な追加の例示的な遺伝子的及び遺伝子関連疾患及び遺伝子は、本明細書の他の個所に列挙されており、例えば、表Ａ～Ｂを参照されたい。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＧＡＬＧＴ２遺伝子を付加または改変し得る。欠損ジストロフィンを補充するように作用する代わりに、ＧＡＬＧＴ２遺伝子療法は、疾患において変異も欠損もしていないタンパク質の発現を増加させることによって、ジストロフィンの非存在を補う方法で筋肉の構造的全体性を強化する。ＧＡＬＧＴ２は、特定のジストロフィン変異にかかわらず、ＤＭＤを処置する潜在性を提供し、また、他の筋肉ジストロフィーにおける実用性を有する。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、ＵＳ２０１８０１６１３５９、ＵＳ２０１９００５４１１３（これらの内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれる）におけるものなどのモルホリノであり、本発明と共に使用するために適応され得る。いくつかの実施形態では、モルホリノは、モルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）またはペプチド連結モルホリノＰＰＭＯである。ＰＭＯベースのプラットフォームは、ｍＲＮＡ転写を変化させることによって遺伝子疾患を処置するために使用され得る。ＰＭＯは、ＲＮＡの天然フレームワーク後にモデル化される合成化学構造である。ＰＭＯは、ＲＮＡに見られる同じ核酸塩基を有するのに対し、それらは、５辺リボース環の代わりに６辺モルホリン環に結合する。また、モルホリン環は、ＲＮＡに見られるホスホジエステル結合の代わりにホスホロジアミデート結合によって互いに接続される。ＰＭＯ及びＰＰＭＯは、エクソンスキッピング及び翻訳抑制のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、例えば、ＷＯ２０１７１０６３０４Ａ１（この内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれる）に記載されているようなペプチド－オリゴマーコンジュゲートであり、本発明と共に使用するために適応され得る。
いくつかの実施形態では、モルホリノは、エテプリルセンに見られるモルホリノであり、これは、ジストロフィンｍＲＮＡのエクソン５１を標的とするのに有効であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、例えば、ＵＳ２０１４０３１５９７７Ａ１、ＵＳ２０１８０１０５８１（これらの内容は、それらの全体が本明細書に表示されているかのように参照により組み込まれる）に記載されているものなどの、ＤＭＤの文脈におけるエクソンスキッピングを生成し得、本発明と共に使用するために適応され得る。
エクソンスキッピング
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、エクソンスキッピングを誘導することが可能な核酸をコードし得る。そのようなコードされる核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドシステムであり得る。本明細書で使用される場合、用語「エクソンスキッピング」は、１つ以上の相補性アンチセンスオリゴヌクレオチド（複数可）（ＡＯＮ）を用いたｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライスドナー及び／またはアクセプター部位の標的化によるｐｒｅ－ｍＲＮＡスプライシングの改変を指す。１つ以上のスプライスドナーまたはアクセプター部位へのスプライセオソームのアクセスを遮断することにより、ＡＯＮは、スプライシング反応を防止し、それにより完全にプロセシングされたｍＲＮＡから１つ以上のエクソンの欠失を引き起こし得る。エクソンスキッピングは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡの成熟プロセス中に核において達成され得る。いくつかの例では、エクソンスキッピングは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライスドナー配列と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用することによって標的とされたエクソンのスプライシングに関与する重要な配列のマスキングを含み得る。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ジストロフィンｍＲＮＡにおけるエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドシステムをコードする。例えば、ジストロフィン遺伝子のエクソンｘ内のナンセンスまたはフレームシフト変異は、カルボキシ末端切断型非機能性ジストロフィンタンパク質をもたらす。その成熟ｍＲＮＡ転写産物の発現は、エクソンｘによってコードされるアミノ酸が欠失しているが、それらの欠失アミノ酸に対してＮ末端及びＣ末端の両方のジストロフィンアミノ酸を含む機能性ジストロフィンタンパク質をもたらし得る。
ヌクレオチド配列は、エクソン１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、４５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、またはそれらの任意の組み合わせでエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドシステムをコードし得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、エクソン４３、４４、５０、５１、５２、５５、またはそれらの任意の組み合わせでエクソンスキッピングを誘導することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスヌクレオチドシステムをコードし得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムカーゴ分子
通常、本明細書において及びＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの文献において使用されるＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現に関与する、またはその活性を誘導する転写産物及び他の要素を集合的に指し、それには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「直接リピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理部分的直接リピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「スペーサー」とも称される）、またはその用語が本明細書で使用されるとおりである「ＲＮＡ（複数可）」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするためのＲＮＡ（複数可）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写産物が含まれる。通常、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈においてプロトスペーサーとも称される）の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特性化される。例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，ＤＯＩ：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２０１５．１０．００８を参照されたい。
クラス１システム
本明細書で提供される方法、システム、及びツールは、クラス１ＣＲＩＳＰＲタンパク質と共に使用するために設計され得る。特定の例示的な実施形態では、クラス１システムは、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８：６７－８１（Ｆｅｂ ２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている、特に図１、ｐ．３２６に記載されているＩ型、ＩＩＩ型またはＩＶ型Ｃａｓタンパク質であり得る。クラス１システムは典型的には、多タンパク質エフェクター複合体を使用し、これは、いくつかの実施形態では、補佐的タンパク質、例えば、抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体（カスケード）と称される複合体における１つ以上のタンパク質、１つ以上の適応タンパク質（例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、ＲＮＡヌクレアーゼ）、及び／または１つ以上の付随タンパク質（例えば、Ｃａｓ４、ＤＮＡヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ関連ロスマンフォールド（ＣＡＲＦ）ドメイン含有タンパク質、及び／またはＲＮＡ転写酵素を含み得る。クラス１システムは、限られた配列類似性を有するが、クラス１システムタンパク質は、１つ以上のリピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）ファミリーサブユニット、例えば、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７を含むそれらの類似する構造によって同定され得る。ＲＡＭＰタンパク質は、１つ以上のＲＮＡ認識モチーフドメインを有することによって特性化される。大型サブユニット（例えば、ｃａｓ８またはｃａｓ１０）及び小型サブユニット（例えば、ｃａｓ１１）もクラス１システムの典型である。例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ＥＶ，Ｍａｋａｒｏｖａ ＫＳ．２０１９ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ ３７４：２０１８００８７，ＤＯＩ：１０．１０９８／ｒｓｔｂ．２０１８．００８７の図１及び２を参照されたい。一態様では、クラス１システムは、シグネチャータンパク質Ｃａｓ３によって特性化される。特定のクラス１タンパク質におけるカスケードは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡに結合し、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの処理に直接関与するヌクレアーゼである追加のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ６またはＣａｓ５を動員する複数のＣａｓタンパク質の専用複合体を含み得る。一態様では、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、１つ以上のＣａｓ５サブユニット及び２つ以上のＣａｓ７サブユニットを含むエフェクター複合体を含む。クラス１サブタイプには、Ｉ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｕ、Ｉ－Ｄ、Ｉ－Ｅ、及びＩ－Ｆ型、ＩＶ－Ａ及びＩＶ－Ｂ型、及びＩＩＩ－Ａ、ＩＩＩ－Ｄ、ＩＩＩ－Ｃ、及びＩＩＩ－Ｂ型が含まれる。クラス１システムにはまた、タイプＩ－Ａ、Ｉ－Ｂ、Ｉ－Ｅ、Ｉ－Ｆ及びＩ－Ｕバリアントを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓバリアントが含まれ、これには、Ｔｎ７様トランスポゾンの大きなファミリーによってコードされるサブタイプＩ－Ｆのバージョン及び同様に分解されるサブタイプＩ－ＢシステムをコードするＴｎ７様トランスポゾンのより小さな群を含む、トランスポゾン及びプラスミドによって保有されるバリアントが含まれ得る。Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １１４（３５）（２０１７）；ＤＯＩ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１７０９０３５１１４；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖ．１ ，ｎ５，Ｆｉｇｕｒｅ ５も参照されたい。
クラス２システム
本明細書の他の個所でより詳細に記載されている組成物、システム、及び方法は、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと共に使用するために設計及び適応され得る。よって、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、クラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。クラス２システムは、それらが単一の大きなマルチドメインエフェクタータンパク質を有するという点でクラス１システムと区別される。特定の例示的な実施形態では、クラス２システムは、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型システムであり得、これは、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｃｌａｓｓ ２ ａｎｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ” Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１８：６７－８１（Ｆｅｂ ２０２０）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。クラス２システムの各タイプは、サブタイプにさらに分けられる。Ｍａｒｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．２０２０、特に図２を参照されたい。クラス２、ＩＩ型システムは、４種のサブタイプ：ＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、ＩＩ－Ｃ１、及びＩＩ－Ｃ２に分けられ得る。クラス２、Ｖ型システムは、１７種のサブタイプ：Ｖ－Ａ、Ｖ－Ｂ１、Ｖ－Ｂ２、Ｖ－Ｃ、Ｖ－Ｄ、Ｖ－Ｅ、Ｖ－Ｆ１、Ｖ－Ｆ１（Ｖ－Ｕ３）、Ｖ－Ｆ２、Ｖ－Ｆ３、Ｖ－Ｇ、Ｖ－Ｈ、Ｖ－Ｉ、Ｖ－Ｋ（Ｖ－Ｕ５）、Ｖ－Ｕ１、Ｖ－Ｕ２、及びＶ－Ｕ４に分けられ得る。クラス２、ＩＶ型システムは、５種のサブタイプ：ＶＩ－Ａ、ＶＩ－Ｂ１、ＶＩ－Ｂ２、ＶＩ－Ｃ、及びＶＩ－Ｄに分けられ得る。
これらのタイプの特徴の区別は、それらのエフェクター複合体が単一の大きなマルチドメインタンパク質からなることである。Ｖ型システムは、標的ＤＮＡの一方の鎖の切断にそれぞれ関与する２つの核ドメインを含有し、かつＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン配列内に挿入されたＨＮＨヌクレアーゼを有するＩＩ型エフェクター（例えば、Ｃａｓ９）とは異なる。Ｖ型システム（例えば、Ｃａｓ１２）は、両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインのみを含有する。ＶＩ型（Ｃａｓ１３）は、ＩＩ及びＶ型システムのエフェクターとは無関係であり、２つのＨＥＰＮドメインを含有し、ＲＮＡを標的とする。Ｃａｓ１３タンパク質はまた、標的認識によって引き起こされる付随活性を示す。いくつかのＶ型システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの状況で２つの一本鎖ＤＮＡでこの付随活性を保有することが見出された。
いくつかの実施形態では、クラス２システムは、ＩＩ型システムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ－Ｂ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ－Ｃ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＩＩ－Ｃ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型システムは、Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態では、ＩＩ型システムは、Ｃａｓ９を含む。
いくつかの実施形態では、クラス２システムは、Ｖ型システムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｂ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｂ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｆ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｆ１（Ｖ－Ｕ３）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｆ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｆ３ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｉ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｋ（Ｖ－Ｕ５）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｕ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｕ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｖ－Ｕ４ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１４、及び／またはＣａｓΦを含む。
いくつかの実施形態では、クラス２システムは、ＶＩ型システムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＩ－Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＩ－Ｂ１ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＩ－Ｂ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＩ－Ｃ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＶＩ－Ｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ（２９／３０群）、Ｃａｓ１３ｃ、及び／またはＣａｓ１３ｄを含む。
Ｃａｓ分子
いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、Ｃａｓポリペプチドまたはその断片をコードし得るＣａｓポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドであり、またはそれを含み得る。任意のＣａｓ分子は、カーゴ分子であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、クラスＩ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムＣａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、カーゴ分子は、クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムＣａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｉ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＩＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＩＶ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｖ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＶＩ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、ＶＩＩ型Ｃａｓポリペプチドである。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変バージョンが含まれる。カーゴとして含まれ得る他の好適なＣａｓタンパク質またはコーディングポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに関する論述などと共に本明細書の他の個所に記載されている。
特殊型Ｃａｓベースシステム
いくつかの実施形態では、システムは、特殊な機能または活性を発揮することが可能なＣａｓベースのシステムである。例えば、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の機能性ドメインに融合され、機能可能に連結され、またはそうでなければ関連付けられ得る。特定の例示的な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的不活性（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｄｅａｄ）Ｃａｓタンパク質（「ｄＣａｓ」）であり得、及び／またはニッカーゼ活性を有し得る。ニッカーゼは、二本鎖標的のうち一方の鎖のみを切断するＣａｓタンパク質である。そのような実施形態では、ｄＣａｓまたはニッカーゼは、機能性ドメインを標的配列にまたはその近くに送達する配列特異的標的機能性を提供する。Ｃａｓタンパク質に融合され、機能可能に連結され、またはそうでなければ関連付けられ得る例示的な機能性ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメイン、核外搬出シグナル（ＮＥＳ）ドメイン、翻訳活性化ドメイン、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、及びＳＥＴ７／９）、翻訳開始ドメイン、転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、及びＳＩＤドメイン、例えば、ＳＩＤ４Ｘドメイン）、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、ヒストン改変ドメイン（例えば、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、光誘導性／制御可能ドメイン、化学的誘導性／制御可能ドメイン、トランスポサーゼドメイン、相同組換え機構ドメイン、リコンビナーゼドメイン、インテグラーゼドメイン、及びそれらの組み合わせであり得、またはそれを含み得るがこれらに限定されない。触媒的不活性Ｃａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９（国際特許公開番号ＷＯ２０１４／２０４７２５、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐｔ １２；１５４（６）：１３８０－１３８９）、Ｃａｓ１２（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８，２０９５（２０１７）、及びＣａｓ１３（国際特許公開番号ＷＯ２０１９／００５８８４及びＷＯ２０１９／０６０７４６）を生成するための方法は、当該技術分野で知られており、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、機能性ドメインは、以下の活性のうちの１つ以上を有し得る：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳開始活性、翻訳抑制活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン改変活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、分子スイッチ活性、化学的誘導性、光誘導性、及び核酸結合活性。いくつかの実施形態では、１つ以上の機能性ドメインは、エピトープタグまたはレポーターを含み得る。エピトープタグの非限定的な例には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが含まれる。レポーターの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）が含まれるがこれらに限定されない。
１つ以上の機能性ドメイン（複数可）は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の末端で、末端の近くに、及び／または末端の近傍に位置し得る。２つ以上の機能性ドメインを有する実施形態では、その２つの各々は、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の末端で、または末端の近くに、または末端の近傍に位置し得る。機能性ドメインがエフェクタータンパク質に機能可能に連結されているものなどのいくつかの実施形態では、１つ以上の機能性ドメインは、好適なリンカー（ＧｌｙＳｅｒリンカーを含むがこれに限定されない）を介してエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）に繋がれ、または連結され得る。複数の機能性ドメインが存在する場合、機能性ドメインは、同じまたは異なる場合がある。いくつかの実施形態では、機能性ドメインのすべては同じである。いくつかの実施形態では、機能性ドメインのすべては互いに異なる。いくつかの実施形態では、機能性ドメインの少なくとも２つは互いに異なる。いくつかの実施形態では、機能性ドメインの少なくとも２つは互いに同じである。
他の好適な機能性ドメインは、例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１９／０１８４２３で見ることができる。
分割ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、分割ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである。例えば、Ｚｅｔｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（２）：１３９－１４２及び国際特許公開ＷＯ２０１９／０１８４２３を参照されたい。これらの組成物及び技術は、本発明において使用され、及び／または本発明と共に使用するために適応され得る。分割ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、本明細書において及び本明細書でさらに詳細に参照により本明細書に組み込まれる文献において示されている。特定の実施形態では、分割ＣＲＩＳＰＲタンパク質の各部分は、特異的結合対のメンバーに結合され、互いに結合した場合、特異的結合対のメンバーは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質の部分を近接して維持する。特定の実施形態では、分割ＣＲＩＳＰＲタンパク質の各部分は、誘導性結合対に関連付けられる。誘導性結合対は、誘導性結合対のメンバーの両方に結合するタンパク質または小分子によって「オン」または「オフ」の切り替えが可能であるものである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は好ましくは、ドメイン間で分割され、ドメインをインタクトなままとし得る。特定の実施形態では、前記Ｃａｓ分割ドメイン（例えば、Ｃａｓ９の場合はＲｕｖＣ及びＨＮＨドメイン）は、前記分割Ｃａｓドメイン（複数可）が藻類細胞における標的核酸配列を処理するように、細胞に同時にまたは順次に導入され得る。野生型Ｃａｓと比較した分割Ｃａｓのサイズ減少は、システムを細胞に送達する他の方法、例えば、本明細書に記載される細胞浸透性ペプチドの使用を可能とする。
ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基編集
いくつかの実施形態では、本明細書の他の個所に記載されている本発明のポリヌクレオチドは、塩基編集システムを使用して改変され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質が、ヌクレオチドデアミナーゼに接続または融合される。よって、いくつかの実施形態では、Ｃａｓベースのシステムが、塩基編集システムであり得る。本明細書で使用される場合、「塩基編集」は通常、改変するためのヌクレオチドの切除を含まない、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓベースまたはＣａｓベースのシステムを介するポリヌクレオチド改変のプロセスを指す。塩基編集は、従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して生成され得る過剰な不要な編集副生成物を生成することなく、正確な位置で塩基対を変換し得る。
特定の例示的な実施形態では、ヌクレオチドデアミナーゼは、限定されないが、クラス２のＩＩ型及びＶ型システムなどのＤＮＡ結合Ｃａｓタンパク質と組み合わせて使用されるＤＮＡ塩基エディタであり得る。２つのクラスのＤＮＡ塩基エディタが一般に知られている：シトシン塩基エディタ（ＣＢＥ）及びアデニン塩基エディタ（ＡＢＥ）。ＣＢＥは、Ｃ・Ｇ塩基対をＴ・Ａ塩基対に変換し（Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３；及びＬｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３６：３２４－３２７）、ＡＢＥは、Ａ・Ｔ塩基対をＧ・Ｃ塩基対に変換する。まとめると、ＣＢＥ及びＡＢＥは、４つすべての可能性のある転位変異（ＣからＴ、ＡからＧ、ＴからＣ、及びＧからＡ）を媒介し得る。Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ．２０１８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９（１２）：７７０－７８８、特に図１ｂ、２ａ～２ｃ、３ａ～３ｆ、及び表１。いくつかの実施形態では、塩基編集システムは、ＣＢＥ及び／またはＡＢＥを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の他の個所に記載されている本発明のポリヌクレオチドは、塩基編集システムを使用して改変され得る。Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ．２０１８．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｔ．１９（１２）：７７０－７８８。塩基エディタはまた、通常、ＤＮＡドナー鋳型を必要とせず、及び／または相同組換え修復に依存しない。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３；及びＧａｕｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ．５５１：４６４－４７１。ＤＮＡにおける標的遺伝子座に結合すると、システムのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間の塩基対合は、「Ｒ－ループ」におけるｓｓＤＮＡの小セグメントの転移をもたらす。Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．１５６：９３５－９４９。ｓｓＤＮＡバブル内のＤＮＡ塩基は、デアミナーゼなどの酵素成分によって改変される。いくつかのシステムでは、触媒的に機能しなくなったＣａｓタンパク質は、バリアントまたは改変Ｃａｓであり得、ニッカーゼ機能性を有し得、非編集ＤＮＡ鎖に切り目を入れて、鋳型として編集鎖を使用して細胞が非編集鎖を修復するように誘導し得る。Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ．５３３：４２０－４２４；Ｎｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５３；及びＧａｕｄｅｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ．５５１：４６４－４７１。
他の例示的なＶ型塩基編集システムは、国際特許公開番号ＷＯ２０１８／２１３７０８、ＷＯ２０１８／２１３７２６、ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２０７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２２５、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７３０７（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
特定の例示的な実施形態では、塩基編集システムは、ＲＮＡ塩基編集システムであり得る。ＤＮＡ塩基エディタと同様に、ヌクレオチド塩基を変換することが可能なヌクレオチドデアミナーゼがＣａｓタンパク質に融合され得る。しかしながら、これらの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡに結合することが可能である必要がある。例示的なＲＮＡ結合Ｃａｓタンパク質には、ＲＮＡ結合Ｃａｓ９、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９（「ＦｎＣａｓ９」）、及びクラス２ＶＩ型Ｃａｓシステムが含まれるがこれらに限定されない。ヌクレオチドデアミナーゼは、シチジンデアミナーゼもしくはアデノシンデアミナーゼ、またはシチジンデアミナーゼ活性を有するように修飾されたアデノシンデアミナーゼであり得る。特定の例示的な実施形態では、ＲＮＡ塩基エディタは、発現したｍＲＮＡにおいて翻訳後改変部位を欠失させ、または導入するために使用され得る。編集が改変細胞において永続的であるＤＮＡ塩基エディタとは対照的に、ＲＮＡ塩基エディタは、例えば、特定の免疫反応を調節する際に、より細かい時間的制御が必要とされ得る編集を提供し得る。例示的なＶＩ型ＲＮＡ塩基編集システムは、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８：１０１９－１０２７、国際特許公開番号ＷＯ２０１９／００５８８４、ＷＯ２０１９／００５８８６、及びＷＯ２０１９／０７１０４８、ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００１８／０５１７９及びＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６７２０７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＲＮＡ塩基編集目的のために適応され得る例示的なＦｎＣａｓ９システムは、国際特許公開番号ＷＯ２０１６／１０６２３６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＣＢＥ及びＡＢＥを再構成可能な半分に分割するためのスプリットインテインアプローチの使用を含む、塩基編集システムの送達のための例示的な方法は、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４４１－０１９－０５０５－５（２０１９）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
プライムエディタ
いくつかの実施形態では、本明細書の他の個所に記載されている本発明のポリヌクレオチドは、プライム編集システムを使用して改変され得る。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７を参照されたい。塩基編集システムと同様に、プライム編集システムは、二本鎖破断を生じさせずにポリヌクレオチドの標的化改変が可能であり得、ドナー鋳型を必要としない。さらにプライム編集システムは、可能性のある１２種すべての組み合わせ交換が可能であり得る。プライム編集は、「捜索及び置換」方法論を介して機能し得、標的とされる挿入、欠失、可能性のある１２種すべての塩基から塩基への変換及びそれらの組み合わせを媒介し得る。通常、ＰＥ１、ＰＥ２、及びＰＥ３（同文献）によって例示されるプライム編集システムは、ｐｅｇＲＮＡ上の伸長部から標的ポリヌクレオチドへの遺伝子情報の直接コピーを容易化するために、ＲＮＡプログラム化ニッカーゼ及びプライム編集伸長ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）に融合された、またはそうでなければ連結され、もしくは関連付けられた逆転写酵素を含み得る。本発明と共に使用され得る実施形態には、これら及びそのバリアントが含まれる。プライム編集は、副生成物がほとんどなく、従来のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと比較してより高いまたは同様の効率を伴って、従来のＣＲＩＰＳＲ－Ｃａｓシステムよりもオフターゲット活性が低いという利点を有し得る。
いくつかの実施形態では、プライム編集ガイド分子は、標的ポリヌクレオチド情報（例えば、配列）を特定し、標的ポリヌクレオチドを置き換える新たなポリヌクレオチドカーゴを含有し得る。ガイド分子から標的ポリヌクレオチドへの移行を開始させるために、ＰＥシステムは、標的側で標的ポリヌクレオチドに切り目を入れて３’ヒドロキシル基を露出させ得、標的ポリヌクレオチドにおける標的部位への直接的なガイド分子（例えば、プライム編集ガイド分子またはｐｅｇガイド分子）の編集コーディング伸長領域の逆転写を引き起こし得る。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７、特に図１ｂ、１ｃ、関連する論述、及び補充論述を参照されたい。
いくつかの実施形態では、プライム編集システムは、ニッカーゼ活性を有するＣａｓポリペプチド、逆転写酵素、及びガイド分子から構成され得る。Ｃａｓポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠き得る。ガイド分子は、標的結合配列ならびにプライマー結合配列及び編集されたポリヌクレオチド配列を含有する鋳型を含み得る。ガイド分子、Ｃａｓポリペプチド、及び／または逆転写酵素は、互いに連結され、またはそうでなければ互いに関連付けられて、エフェクター複合体を形成し、標的配列を編集し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、クラス２、Ｖ型Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼである）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、逆転写酵素に融合される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、逆転写酵素に連結される。
いくつかの実施形態では、プライム編集システムは、ＰＥ１システムまたはそのバリアント、ＰＥ２システムまたはそのバリアント、またはＰＥ３（例えば、ＰＥ３、ＰＥ３ｂ）システムであり得る。例えば、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７、特に２～３頁、図２ａ、３ａ～３ｆ、４ａ～４ｂ、拡大データ図３ａ～３ｂ、及び４を参照されたい。
ｐｅｇガイド分子は、長さが約１０～約２００またはそれ以上のヌクレオチド、例えば、長さが１０から／または１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。ｐｅｇガイド分子の最適化は、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｎａｔｕｒｅ．５７６：１４９－１５７、特に３頁、図２ａ～２ｂ、及び拡大データ図５ａ～ｃに記載されているように達成され得る。
ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポサーゼ（ＣＡＳＴ）システム
いくつかの実施形態では、本明細書の他の個所に記載されている本発明のポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポサーゼ（「ＣＡＳＴ」）システムを使用して改変され得る。ＣＡＳＴシステムは、触媒的に不活性な、または触媒的に活性となるように修飾されたＣａｓタンパク質を含み得、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡ転移を触媒するトランスポサーゼ（またはそのサブユニット）をさらに含み得る。そのようなシステムは、宿主細胞修復機構に依存せずに、ＤＮＡ分子における標的部位でＤＮＡ配列を挿入することができる。ＣＡＳＴシステムは、クラス１またはクラス２ＣＡＳＴシステムであり得る。例示的なクラス１システムは、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１３２３（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例示的なクラス２システムは、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１０／１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｘ９１８１（２０１９）、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６６８３５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ガイド配列
いくつかの実施形態では、カーゴは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのための１つ以上のガイド分子であり、またはそれを含む。ガイド分子、ガイド配列及びガイドポリヌクレオチドという用語は、Ｃａｓを標的ゲノム遺伝子座にガイドすることが可能なポリヌクレオチドを指し、国際特許公開番号ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などの前述の引用文献におけるもののように互換的に使用される。通常、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するための、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。ガイド分子は、ポリヌクレオチドであり得る。
ガイド配列（核酸標的化ガイドＲＮＡ内の）が標的核酸配列に対する核酸標的化複合体の配列特異的結合を誘導する能力は、任意の好適なアッセイによって評価され得る。例えば、試験されるガイド配列を含む、核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化ＣＲＩＳＰＲシステムの成分は、核酸標的化複合体の成分をコードするベクターでのトランスフェクションなどによって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供され、続いてＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．２００４．ＤＮＡ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．３６（４）７０２－７０７）などによって、標的核酸配列内の優先的標的化（例えば、切断）が評価され得る。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、試験されるガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の成分を提供し、試験及び対照ガイド配列反応の間の標的配列での結合または切断率を比較することによって試験管において評価され得る。他のアッセイが可能であり、当業者は思いつくであろう。
いくつかの実施形態では、ガイド分子は、ＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓまたはＣａｓベースのシステムに含まれるガイド分子（複数可）（本明細書で互換的にガイドポリヌクレオチド及びガイド配列とも称される）は、標的核酸配列とハイブリダイズし、標的核酸配列に対する核酸標的化複合体の配列特異的結合を誘導するのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上であり得る。最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定され得、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで利用可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が含まれる。
ガイド配列、及びよって、核酸標的化ガイドは、任意の標的核酸配列を標的とするために選択され得る。標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び細胞質低分子ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドは、核酸標的化ガイド内の二次構造の程度を減少させるために選択される。いくつかの実施形態では、核酸標的化ガイドのヌクレオチドの約７５％、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％もしくはそれ未満、またはそれ以下が、最適に折り畳まれた場合に自己相補性塩基対合に関与する。最適なフォールディングは、任意の好適なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定され得る。いくつかのプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの計算に基づく。１つのそのようなアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３－１４８）によって記載されているｍＦｏｌｄである。別の例示的なフォールディングアルゴリズムは、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用する、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＶｉｅｎｎａにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発されたオンラインウエブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１－６２を参照されたい）。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、直接リピート（ＤＲ）配列及びガイド配列またはスペーサー配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる場合がある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または連結された直接リピート配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなる場合がある。特定の実施形態では、直接リピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から上流（すなわち、５’）に位置し得る。他の実施形態では、直接リピート配列は、ガイド配列またはスペーサー配列から下流（すなわち、３’）に位置し得る。
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ステムループ、好ましくは単一のステムループを含む。特定の実施形態では、直接リピート配列は、ステムループ、好ましくは単一のステムループを形成する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、１５～３５ｎｔである。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー長さは、少なくとも１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサー長さは、１５～１７ｎｔ、例えば、１５、１６、または１７ｎｔ、１７～２０ｎｔ、例えば、１７、１８、１９、または２０ｎｔ、２０～２４ｎｔ、例えば、２０、２１、２２、２３、または２４ｎｔ、２３～２５ｎｔ、例えば、２３、２４、または２５ｎｔ、２４～２７ｎｔ、例えば、２４、２５、２６、または２７ｎｔ、２７～３０ｎｔ、例えば、２７、２８、２９、または３０ｎｔ、３０～３５ｎｔ、例えば、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ｎｔ、または３５ｎｔ以上である。
「ｔｒａｃｒＲＮＡ」配列または類似用語には、ハイブリダイズするｃｒＲＮＡ配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とｃｒＲＮＡ配列との間の、その２つの短い方の長さに沿った相補性の程度は、最適にアライメントされた場合、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｃｒＲＮＡ配列は、その２つの間のハイブリダイゼーションがヘアピンなどの二次構造を有する転写産物を生成するように、単一の転写産物内に含まれる。
通常、相補性の程度は、ｓｃａ配列及びｔｒａｃｒ配列の最適なアライメントに関し、その２つの配列の短い方の長さに沿ったものである。最適なアライメントは、任意の好適なアライメントアルゴリズムによって決定され得、ｓｃａ配列またはｔｒａｃｒ配列のいずれかにおける自己相補性などの二次構造をさらに考慮し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列とｓｃａ配列との間の、その２つの短い方の長さに沿った相補性の程度は、最適にアライメントされた場合、約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％もしくはそれより大きく、またはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくは１００％またはそれより大きい場合があり；ガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５もしくはそれより大きく、またはそれ以上のヌクレオチドであり得；またはガイドまたはＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、長さが約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２未満、またはそれ以下のヌクレオチドであり得；ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが３０または５０ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、９４．５％または９５％または９５．５％または９６％または９６．５％または９７％または９７．５％または９８％または９８．５％または９９％または９９．５％または９９．９％、または１００％より大きい。オフターゲットは、その配列とガイドとの間の１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％または９４％または９３％または９２％または９１％または９０％または８９％または８８％または８７％または８６％または８５％または８４％または８３％または８２％または８１％または８０％未満の相補性であり、オフターゲットが、その配列とガイドとの間の１００％または９９．９％または９９．５％または９９％または９９％または９８．５％または９８％または９７．５％または９７％または９６．５％または９６％または９５．５％または９５％または９４．５％の相補性であることが有利である。
本発明によるいくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ（Ｃａｓを標的遺伝子座にガイドすることが可能である）は、（１）真核細胞におけるゲノム標的遺伝子座とハイブリダイズすることが可能なガイド配列；（２）ｔｒａｃｒ配列；及び（３）ｔｒａｃｒメイト配列を含み得る。（１）～（３）のすべては、単一のＲＮＡ、すなわち、ｓｇＲＮＡ（５’から３’方向に配置される）に存在し得、またはｔｒａｃｒＲＮＡは、ガイド及びｔｒａｃｒ配列を含有するＲＮＡとは異なるＲＮＡであり得る。ｔｒａｃｒは、ｔｒａｃｒメイト配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を標的配列に誘導する。ｔｒａｃｒＲＮＡがガイド及びｔｒａｃｒ配列を含有するＲＮＡとは異なるＲＮＡに存在する場合、各ＲＮＡの長さは、それらのそれぞれのネイティブ長さから短くなるように最適化され得、各々は、独立して、細胞性ＲＮアーゼによる分解から保護するようにまたはそうでなければ安定性を増加させるように化学的に改変され得る。
ガイド配列に対する多くの改変は、当該技術分野で知られており、本発明の文脈内でさらに企図される。様々な改変は、標的配列への結合の特異性を増加させるため及び／またはＣａｓタンパク質の活性を増加させるため及び／またはオフターゲット効果を減少させるために使用され得る。例示的なガイド配列改変は、国際特許出願番号ＰＣＴＵＳ２０１９／０４５５８２、特に段落［０１７８］～［０３３３］（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
標的配列、ＰＡＭ、及びＰＦＳ
標的配列
ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。用語「標的ＲＮＡ」は、標的配列であり、またはそれを含むＲＮＡポリヌクレオチドを指す。すなわち、標的ポリヌクレオチドは、ガイド配列の一部が相補性を有するように設計されており、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質及びガイド分子を含む複合体によって媒介されるエフェクター機能が誘導されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。
ガイド配列は、標的ポリヌクレオチドにおける標的配列に特異的に結合し得る。標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などまたはそれ以上）の標的配列を有し得る。標的ポリヌクレオチドは、ベクターにあり得る。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡであり得る。標的ポリヌクレオチドは、エピソームであり得る。標的ポリヌクレオチドの他の形態は、本明細書の他の個所に記載されている。
標的配列は、ＤＮＡであり得る。標的配列は、任意のＲＮＡ配列であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及び細胞質低分子ＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列（本明細書で標的ポリヌクレオチドとも称される）は、ｍＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及びｒＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、標的配列は、ｎｃＲＮＡ、及びｌｎｃＲＮＡからなる群から選択されるＲＮＡ分子内の配列であり得る。いくつかのより好ましい実施形態では、標的配列は、ｍＲＮＡ分子またはｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子内の配列であり得る。
ＰＡＭ及びＰＦＳ要素
ＰＡＭ要素は、Ｃａｓタンパク質によって認識され、結合され得る配列である。次いでＣａｓタンパク質／エフェクター複合体は、ＰＡＭ要素に隣接した位置でｄｓＤＮＡをほどき得る。ＲＮＡを標的とするＣａｓタンパク質及びそれを含むシステムは、ＰＡＭ配列を必要としないことが理解される（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｎａｔｕｒｅ．４６３：５６８－５７１）。代わりに、多くは、本明細書の他の個所で論述されるＰＦＳに依存する。特定の実施形態では、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）またはＰＦＳ（プロトスペーサーフランキング配列または部位）、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列に関連付けられるべきである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の特質に応じて、標的配列は、ＤＮＡ二本鎖におけるその相補性配列（本明細書で非標的配列とも称される）がＰＡＭの上流または下流となるように選択されるべきである。実施形態では、標的配列の相補性配列は、ＰＡＭの下流もしくは３’またはＰＡＭの上流もしくは５’である。ＰＡＭの正確な配列及び長さの条件は使用されるＣａｓタンパク質に応じて異なるが、ＰＡＭは典型的には、プロトスペーサー（すなわち、標的配列）に隣接する２～５塩基対配列である。異なるＣａｓタンパク質についての天然ＰＡＭ配列の例は、本明細書で以下に提供され、当業者は、所与のＣａｓタンパク質を用いて使用するためのさらなるＰＡＭ配列を同定することができる。
異なるＰＡＭ配列を認識する能力は、システムに含まれるＣａｓポリペプチド（複数可）に依存する。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。以下の表１０（Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９から）は、いくつかのＣａｓポリペプチド及びそれらが認識するＰＡＭ配列を示している。
Figure 2022551986000103
好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、３’ＰＡＭを認識し得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質は、５’Ｈ（ＨはＡ、ＣまたはＵである）である３’ＰＡＭを認識し得る。
さらに、Ｃａｓタンパク質上のＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインの修飾は、例えば、Ｃａｓ９について、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１５ Ｊｕｌ ２３；５２３（７５６１）：４８１－５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４５９２に記載されているように、ＰＡＭ特異性のプログラミングを可能とし、標的部位認識忠実性を改善し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の多用途性を増加させ得る。本明細書でさらに詳述されているように、当業者は、Ｃａｓ１３タンパク質が同様に改変され得ることを理解する。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃｐｆ１ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ Ａｌｔｅｒｅｄ ＰＡＭ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，” ｂｉｏＲｘｉｖ ０９１６１１；ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０９１６１１（Ｄｅｃ．４，２０１６）。Ｄｏｅｎｃｈらは、６つの内因性マウス遺伝子及び３つの内因性ヒト遺伝子のパネルのすべての可能性のある標的部位にわたってタイリングするｓｇＲＮＡのプールを作製し、それらの標的遺伝子のヌルアレルを生成するそれらの能力を抗体染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。その著者は、ＰＡＭの最適化が活性を改善し、また、ｓｇＲＮＡを設計するためのオンラインツールを提供したことを示した。
ＰＡＭ配列は、市販されているオンラインの適切な設計ツールを使用してポリヌクレオチドにおいて同定され得る。そのような自由に利用可能なツールには、ＣＲＩＳＰＲＦｉｎｄｅｒ及びＣＲＩＳＰＲＴａｒｇｅｔが含まれるがこれらに限定されない。Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．２００９．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５５（Ｐｔ．３）：７３３－７４０；Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９０．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｂｉｓｗａｓｓ ｅｔ ａｌ．２０１３ ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．１０：８１７－８２７；及びＧｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．２００７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５：Ｗ５２－５７。ＰＡＭ同定のための実験アプローチには、プラスミド枯渇アッセイ（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３－２３９；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０：１１１６－１１２１；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｎａｔｕｒｅ．５２３：４８１－４８５）、ＰＡＭ－ＳＣＮＡＲと呼ばれるハイスループットｉｎ ｖｉｖｏモデルによるスクリーニング（Ｐａｔｔａｎａｙａｋ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３９－８４３及びＬｅｅｎａｙ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１６：２５３）、及びネガティブスクリーニング（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１５．Ｃｅｌｌ．１６３：７５９－７７１）が含まれ得るがこれらに限定されない。
前述したように、ＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは典型的には、ＰＡＭ配列に依存しない。代わりに、そのようなシステムは典型的には、ＰＡＭの代わりにプロトスペーサーフランキング部位（ＰＦＳ）を認識する。したがって、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは典型的には、ＰＡＭの代わりにプロトスペーサーフランキング部位（ＰＦＳ）を認識する。ＰＦＳは、ＲＮＡ標的のためのＰＡＭの類似物を表す。ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３を用いる。Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉから同定されたＣａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）（ＬＳｈＣＡｓ１３ａ）などの、今日まで分析されたいくつかのＣａｓ１３タンパク質は、標的ＲＮＡの３’末端でＧに対する特異的識別を有する。対応するｃｒＲＮＡリピート部位におけるＣの存在は、この位置でのヌクレオチド対合が拒絶されることを示し得る。しかしながら、いくつかのＣａｓ１３タンパク質（例えば、ＬｗａＣＡｓ１３ａ及びＰｓｐＣａｓ１３ｂ）は、ＰＦＳ優先性を有さないようである。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。
いくつかのＶＩ型タンパク質、例えば、サブタイプＢは、Ｄ（Ｇ、Ｔ、Ａ）の５’－認識及びＮＡＮまたはＮＮＡの３’－モチーフ要件を有する。１つの例は、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ ｚｏｏｈｅｌｃｕｍで同定されたＣａｓ１３ｂタンパク質（ＢｚＣａｓ１３ｂ）である。例えば、Ｇｌｅｄｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．２０１９．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１６（４）：５０４－５１７を参照されたい。
全体的なＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、基質（例えば、標的配列）認識について、ＤＮＡを標的とするもの（例えば、Ｖ型及びＩＩ型）よりも少ない制限ルールを有するようである。
核標的化及び輸送に関連する配列
いくつかの実施形態では、細胞を修飾するための組成物における１つ以上の成分（例えば、Ｃａｓタンパク質及び／またはデアミナーゼ）は、核標的化及び輸送に関連する１つ以上の配列を含み得る。そのような配列は、組成物における１つ以上の成分が細胞内の配列を標的とするのを容易化し得る。本開示の方法において使用されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及び／またはヌクレオチドデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインの核への標的化を改善するために、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を有するこれらの成分の一方または両方を提供することが有利であり得る。
いくつかの実施形態では、本開示の文脈において使用されるＮＬＳは、タンパク質とは異種である。ＮＬＳの非限定的な例には、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５２）またはＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号５３）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５４）を有するヌクレオプラスミン双節型ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５５）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号５７）を有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号５８）を有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－アルファからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号５９）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列号９０８８）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号９０８９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号９０９０）；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号９０９１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号９０９２）及びＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号９０９３）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号９０９４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号９０９５）；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号９０９６）；及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号９０９７）に由来するＮＬＳ配列が含まれる。通常、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核において検出可能な量のＤＮＡ標的化Ｃａｓタンパクの蓄積を誘導するのに十分な強度のものである。通常、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質におけるＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ（複数可）、またはこれらの要素の組み合わせに由来し得る。核における蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、細胞内の位置が、例えば、核の位置を検出するための手段（例えば、ＤＡＰＩなどの核に特異的な染色）と組み合わせて可視化され得るように、核酸標的化タンパク質に融合され得る。細胞核は、細胞から単離され得、次いでその内容物は、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析され得る。核における蓄積はまた、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質に曝露されていない、または１つ以上のＮＬＳを欠くＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはデアミナーゼタンパク質に曝露された対照と比較して、間接的に、例えば、標的配列における核酸標的化複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、デアミナーゼ活性についてのアッセイ）、またはＤＮＡ標的化複合体形成及び／またはＤＮＡ標的化によって影響を受けた遺伝子発現活性の変化についてのアッセイによって決定され得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及び／またはヌクレオチドデアミナーゼタンパク質は、１つ以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異種ＮＬＳを備え得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、アミノ末端でまたはその近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多く、またはそれ以上のＮＬＳ、カルボキシ末端でまたはその近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０もしくはそれより多く、またはそれ以上のＮＬＳ、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端で０または少なくとも１つ以上のＮＬＳ及びカルボキシ末端で０または１つ以上のＮＬＳ）を含む。複数のＮＬＳが存在する場合、各々は、単一のＮＬＳが、複数のコピーで及び／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、他のものから独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がＮ末端またはＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸内にある場合、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端に近いと考えられる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の好ましい実施形態では、ＮＬＳは、タンパク質のＣ末端に結合される。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質及びデアミナーゼタンパク質は、別々のタンパク質として細胞に送達され、または細胞内で発現する。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の各々は、本明細書に記載される１つ以上のＮＬＳを備え得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質は、融合タンパク質として細胞に送達され、または細胞で発現する。これらの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ及びデアミナーゼタンパク質の一方または両方は、１つ以上のＮＬＳを備える。ヌクレオチドデアミナーゼが上述したアダプタータンパク質（ＭＳ２など）に融合される場合、１つ以上のＮＬＳがアダプタータンパク質に提供され得る（但し、これがアプタマー結合を妨げない場合に限る）。特定の実施形態では、１つ以上のＮＬＳ配列はまた、ヌクレオチドデアミナーゼとＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質との間のリンカー配列として機能し得る。
特定の実施形態では、本開示のガイドは、ヌクレオチドデアミナーゼまたはその触媒ドメインに連結または融合され得る、アダプタータンパク質のための特異的結合部位（例えば、アプタマー）を含む。そのようなガイドがＣＲＩＳＰＲ複合体（例えば、ガイド及び標的に結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質）を形成する場合、アダプタータンパク質が結合し、アダプタータンパク質に関連付けられたヌクレオチドデアミナーゼまたはその触媒ドメインは、帰属した機能が有効となるのに有利な空間的配向で配置される。
当業者は、アダプター＋ヌクレオチドデアミナーゼの結合を可能にするが、アダプター＋ヌクレオチドデアミナーゼの適切な配置が可能ではない（例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の三次元構造内の立体障害に起因する）ガイドに対する改変が、意図されていない改変であることを理解する。１つ以上の改変ガイドは、本明細書に記載されるように、テトラループ、ステムループ１、ステムループ２、またはステムループ３で、好ましくはテトラループまたはステムループ２のいずれかで、いくつかの場合では、テトラループ及びステムループ２の両方で改変され得る。
いくつかの実施形態では、システムにおける成分（例えば、不活性Ｃａｓタンパク質、ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメイン、またはそれらの組み合わせ）は、１つ以上の核外搬出シグナル（ＮＥＳ）、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、または任意のそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの場合では、ＮＥＳは、ＨＩＶ Ｒｅｖ ＮＥＳであり得る。特定の場合では、ＮＥＳは、ＭＡＰＫ ＮＥＳであり得る。成分がタンパク質である場合、ＮＥＳまたはＮＬＳは、成分のＣ末端にあり得る。代替的には、または追加的に、ＮＥＳまたはＮＬＳは、成分のＮ末端にあり得る。いくつかの例では、Ｃａｓタンパク質及び任意に前記ヌクレオチドデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、１つ以上の異種核外搬出シグナル（複数可）（ＮＥＳ（複数可））または核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ（複数可））、好ましくはＨＩＶ Ｒｅｖ ＮＥＳまたはＭＡＰＫ ＮＥＳ、好ましくはＣ末端を含む。
鋳型
いくつかの実施形態では、細胞を修飾するための組成物は、鋳型、例えば、組換え鋳型を含む。鋳型は、別のベクターに含まれる、または別のポリヌクレオチドとして提供される本明細書に記載される別のベクターの成分であり得る。いくつかの実施形態では、組換え鋳型は、核酸標的化複合体の一部としての核酸標的化エフェクタータンパク質によって切り目が付けられ、または切断される標的配列内またはその近くなどで、相同組換えにおいて鋳型として機能するように設計される。
実施形態では、鋳型核酸は、標的位置の配列を変化させる。実施形態では、鋳型核酸は、改変された、または天然に存在しない塩基の標的核酸への組み込みをもたらす。
鋳型配列は、標的配列との破断媒介または触媒組換えを受け得る。実施形態では、鋳型核酸は、Ｃａｓタンパク質媒介切断事象によって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含み得る。実施形態では、鋳型核酸は、第１のＣａｓタンパク質媒介事象において切断される標的配列上の第１の部位、及び第２のＣａｓタンパク質媒介事象において切断される標的配列上の第２の部位の両方に対応する配列を含み得る。
特定の実施形態では、鋳型核酸には、翻訳される配列のコーディング配列における変化をもたらす配列、例えば、タンパク質生成物におけるあるアミノ酸の別のものへの置換、例えば、変異体アレルの野生型アレルへの形質転換、野生型アレルの変異体アレルへの形質転換、及び／または終止コドンの導入、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス変異をもたらすものが含まれ得る。特定の実施形態では、鋳型核酸は、ノンコーディング配列における変化、例えば、エクソンにおけるまたは５’もしくは３’非翻訳もしくは非転写領域における変化をもたらす配列を含み得る。そのような変化には、制御要素、例えば、プロモーター、エンハンサーにおける変化、及びシス作用性またはトランス作用性制御要素における変化が含まれる。
標的遺伝子における標的位置と相同性を有する鋳型核酸は、標的配列の構造を変化させるために使用され得る。鋳型配列は、不要な構造、例えば、不要なまたは変異体ヌクレオチドを変化させるために使用され得る。鋳型核酸は、組み込まれた場合、陽性対照要素の活性の低下；陽性対照要素の活性の増加；陰性対照要素の活性の低下；陰性対照要素の活性の増加；遺伝子の発現の低下；遺伝子の発現の増加；障害または疾患に対する抵抗性の増加；ウイルス進入に対する抵抗性の増加；変異の修正または遺伝子産物の生物学的特性を付与、増加、排除もしくは低下させる不要なアミノ酸残基の変化、例えば、酵素の酵素活性の増加、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加をもたらす配列を含み得る。
鋳型核酸は、標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のヌクレオチドの配列における変化をもたらす配列を含み得る。
鋳型ポリヌクレオチドは、任意の好適な長さのもの、例えば、長さが約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。実施形態では、鋳型核酸は、長さが２０＋／－１０、３０＋／－１０、４０＋／－１０、５０＋／－１０、６０＋／－１０、７０＋／－１０、８０＋／－１０、９０＋／－１０、１００＋／－１０、１１０＋／－１０、１２０＋／－１０、１３０＋／－１０、１４０＋／－１０、１５０＋／－１０、１６０＋／－１０、１７０＋／－１０、１８０＋／－１０、１９０＋／－１０、２００＋／－１０、２１０＋／－１０、または２２０＋／－１０ヌクレオチドであり得る。実施形態では、鋳型核酸は、長さが３０＋／－２０、４０＋／－２０、５０＋／－２０、６０＋／－２０、７０＋／－２０、８０＋／－２０、９０＋／－２０、１００＋／－２０、１１０＋／－２０、１２０＋／－２０、１３０＋／－２０、１４０＋／－２０、１５０＋／－２０、１６０＋／－２０、１７０＋／－２０、１８０＋／－２０、１９０＋／－２０、２００＋／－２０、２１０＋／－２０、または２２０＋／－２０ヌクレオチドであり得る。実施形態では、鋳型核酸は、長さが１０～１，０００、２０～９００、３０～８００、４０～７００、５０～６００、５０～５００、５０～４００、５０～３００、５０～２００、または５０～１００ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部と相補的である。最適にアライメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくはそれより多くまたはそれ以上のヌクレオチド）と重複する場合がある。いくつかの実施形態では、鋳型配列及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアライメントされた場合、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド内である。
外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれる配列（例えば、変異した遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性または外因性の配列であり得る。組み込まれる配列の例には、タンパク質またはノンコーディングＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが含まれる。よって、組み込みのための配列は、適切な１つの制御配列または複数の制御配列に機能可能に連結され得る。代替的には、組み込まれる配列は、制御機能を提供し得る。
上流または下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含み得る。いくつかの方法では、例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐ～約１０００を有する。
上流または下流配列は、約２０ｂｐ～約２５００ｂｐ、例えば、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含み得る。いくつかの方法では、例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ～約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐ～約１０００を有する。
特定の実施形態では、一方または両方の相同性アームは、特定の配列リピート要素を含まないように短くされ得る。例えば、５’相同性アームは、配列リピート要素を避けるために短くされ得る。他の実施形態では、３’相同性アームは、配列リピート要素を避けるために短くされ得る。いくつかの実施形態では、５’及び３’相同性アームの両方が、特定の配列リピート要素を含まないように短くされ得る。
いくつかの方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。そのようなマーカーは、標的とされた組み込みのスクリーニングを容易にし得る。好適なマーカーの例には、制限部位、蛍光タンパク質、または選択マーカーが含まれる。本開示の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を使用して構築され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。
特定の実施形態では、変異を修正するための鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして使用するために設計され得る。一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する場合、５’及び３’相同性アームは、長さが最大で約２００塩基対（ｂｐ）、例えば、長さが少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐの範囲であり得る。
Ｓｕｚｕｋｉらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介相同性非依存性標的組み込みを介するｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集を記載しており（２０１６，Ｎａｔｕｒｅ ５４０：１４４－１４９）、これは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明と共に使用するために適応され得る。
ＴＡＬＥヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼシステムが、ポリヌクレオチドを改変するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、改善した効率及び拡大した特異性で核酸配列の標的化を可能とするそれらの組織的構造の一部としてＴＡＬＥモノマーまたはＴＡＬＥモノマーもしくは半モノマーを含む単離された天然に存在しない組換えまたは修飾ＤＮＡ結合タンパク質を使用する。
天然に存在するＴＡＬＥまたは「野生型ＴＡＬＥ」は、多数の種のプロテオバクテリアによって分泌される核酸結合タンパク質である。ＴＡＬＥポリペプチドは、長さが主に３３、３４または３５アミノ酸であり、かつ主にアミノ酸位置１２及び１３において互いに異なる高度に保存されたモノマーポリペプチドのタンデムリピートから構成される核酸結合ドメインを含有する。有利な実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチドモノマー」、「ＴＡＬＥモノマー」または「モノマー」は、ＴＡＬＥ核酸結合ドメイン内の高度に保存された反復ポリペプチド配列を指すために使用され、用語「リピート可変二残基」または「ＲＶＤ」は、ポリペプチドモノマーの位置１２及び１３における高度に可変のアミノ酸を指すために使用される。本開示を通して提供される場合、ＲＶＤのアミノ酸残基は、アミノ酸のためのＩＵＰＡＣ一文字コードを使用して示される。ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれるＴＡＬＥモノマーの一般的な表現は、Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５であり、下付きはアミノ酸位置を示し、Ｘは任意のアミノ酸を表す。Ｘ１２Ｘ１３は、ＲＶＤを示す。いくつかのポリペプチドモノマーでは、位置１３における可変アミノ酸はなく、または非存在であり、そのようなモノマーでは、ＲＶＤは単一のアミノ酸からなる。そのような場合では、ＲＶＤは、Ｘ＊として代替的に表され得、ＸはＸ１２を表し、（＊）はＸ１３が非存在であることを示す。ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥモノマーのいくつかのリピートを含み、これは、（Ｘ１－１１－（Ｘ１２Ｘ１３）－Ｘ１４－３３または３４または３５）ｚとして表され得、有利な実施形態では、ｚは少なくとも５～４０である。さらに有利な実施形態では、ｚは、少なくとも１０～２６である。
ＴＡＬＥモノマーは、そのＲＶＤにおけるアミノ酸の同一性によって決定されるヌクレオチド結合親和性を有し得る。例えば、ＮＩのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーは、アデニン（Ａ）に優先的に結合し得、ＮＧのＲＶＤを有するモノマーは、チミン（Ｔ）に優先的に結合し得、ＨＤのＲＶＤを有するモノマーは、シトシン（Ｃ）に優先的に結合し得、ＮＮのＲＶＤを有するモノマーは、アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の両方に優先的に結合し得る。いくつかの実施形態では、ＩＧのＲＶＤを有するモノマーは、Ｔに優先的に結合し得る。よって、ＴＡＬＥの核酸結合ドメインにおけるポリペプチドモノマーリピートの数及び順序は、その核酸標的特異性を決定する。いくつかの実施形態では、ＮＳのＲＶＤを有するモノマーは、４つすべての塩基対を認識し得、Ａ、Ｔ、ＧまたはＣに結合し得る。ＴＡＬＥの構造及び機能は、例えば、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０１（２００９）；Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１５１２（２００９）；及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）にさらに記載されている。
本発明の方法において使用されるポリペプチドは、特定の核酸配列を標的とするように設計されたポリペプチドモノマーリピートを含有する核酸またはＤＮＡ結合領域を有する単離された天然に存在しない組換えまたは修飾核酸結合タンパク質であり得る。
本明細書に記載されるように、ＨＮまたはＮＨのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーはグアニンに優先的に結合し、それにより、グアニンを含有する標的核酸配列に対する高い結合特異性でＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＲＮ、ＮＮ、ＮＫ、ＳＮ、ＮＨ、ＫＮ、ＨＮ、ＮＱ、ＨＨ、ＲＧ、ＫＨ、ＲＨ及びＳＳを有するポリペプチドモノマーは、グアニンに優先的に結合し得る。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＲＮ、ＮＫ、ＮＱ、ＨＨ、ＫＨ、ＲＨ、ＳＳ及びＳＮを有するポリペプチドモノマーは、グアニンに優先的に結合し得、よって、グアニンを含有する標的核酸配列に対する高い結合特異性でＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ＲＶＤ ＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ及びＳＳを有するポリペプチドモノマーは、グアニンに優先的に結合し得、それにより、グアニンを含有する標的核酸配列に対する高い結合特異性でＴＡＬＥポリペプチドの生成を可能にする。いくつかの実施形態では、グアニンに対する高い結合特異性を有するＲＶＤは、ＲＮ、ＮＨ ＲＨ及びＫＨである。さらに、ＮＶのＲＶＤを有するポリペプチドモノマーは、アデニン及びグアニンに優先的に結合し得る。いくつかの実施形態では、Ｈ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、及びＳ＊のＲＶＤを有するモノマーは、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンに同等の親和性で結合する。
核酸またはＤＮＡ結合ドメインの１つ以上のポリペプチドモノマーの既定のＮ末端からＣ末端までの順序は、本発明のポリペプチドが結合する対応する既定の標的核酸配列を決定する。本明細書で使用される場合、モノマー及び少なくとも１つ以上の半モノマーは、対象となるゲノム遺伝子座または遺伝子を「標的とするように特異的に整列される」。植物ゲノムにおいて、天然ＴＡＬＥ結合部位は常にチミン（Ｔ）から始まり、これは、ＴＡＬＥポリペプチドの非反復Ｎ末端内の暗号シグナルによって特定され得る；いくつかの場合では、この領域はリピート０と称され得る。動物ゲノムにおいて、ＴＡＬＥ結合部位は、必ずしも、チミン（Ｔ）から始まらなければならないものではなく、本発明のポリペプチドは、Ｔ、Ａ、ＧまたはＣから始まるＤＮＡ配列を標的とし得る。ＴＡＬＥモノマーのタンデムリピートは常に、反復全長ＴＡＬＥモノマーの最初の２０アミノ酸のみと同一性を共有し得る半分長のリピートまたは配列の伸長部で終わり、この半リピートは半モノマーと称され得る。そのため、標的とされる核酸またはＤＮＡの長さは、完全モノマーの数に２を足したものに等しいことになる。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、ＴＡＬＥポリペプチド結合効率は、天然に存在するＴＡＬＥのＤＮＡ結合領域のＮ末端またはＣ末端に直接的に存在する「キャップ領域」からのアミノ酸配列を、修飾ＴＡＬＥのＤＮＡ結合領域のＮ末端またはＣ末端の位置で修飾ＴＡＬＥに含めることによって増加し得る。よって、特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｎ末端キャップ領域及び／またはＣ末端キャップ領域をさらに含む。
Ｎ末端キャップ領域の例示的なアミノ酸配列は、
Ｍ Ｄ Ｐ Ｉ Ｒ Ｓ Ｒ Ｔ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｒ Ｅ Ｌ Ｌ Ｓ Ｇ Ｐ Ｑ Ｐ Ｄ Ｇ Ｖ Ｑ Ｐ Ｔ Ａ Ｄ Ｒ Ｇ Ｖ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｇ Ｇ Ｐ Ｌ Ｄ Ｇ Ｌ Ｐ Ａ Ｒ Ｒ Ｔ Ｍ Ｓ Ｒ Ｔ Ｒ Ｌ Ｐ Ｓ Ｐ Ｐ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ａ Ｆ Ｓ Ａ Ｄ Ｓ Ｆ Ｓ Ｄ Ｌ Ｌ Ｒ Ｑ Ｆ Ｄ Ｐ Ｓ Ｌ Ｆ Ｎ Ｔ Ｓ Ｌ Ｆ Ｄ Ｓ Ｌ Ｐ Ｐ Ｆ Ｇ Ａ Ｈ Ｈ Ｔ Ｅ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｅ Ｗ Ｄ Ｅ Ｖ Ｑ Ｓ Ｇ Ｌ Ｒ Ａ Ａ Ｄ Ａ Ｐ Ｐ Ｐ Ｔ Ｍ Ｒ Ｖ Ａ Ｖ Ｔ Ａ Ａ Ｒ Ｐ Ｐ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ａ Ｐ Ｒ Ｒ Ｒ Ａ Ａ Ｑ Ｐ Ｓ Ｄ Ａ Ｓ Ｐ Ａ Ａ Ｑ Ｖ Ｄ Ｌ Ｒ Ｔ Ｌ Ｇ Ｙ Ｓ Ｑ Ｑ Ｑ Ｑ Ｅ Ｋ Ｉ Ｋ Ｐ Ｋ Ｖ Ｒ Ｓ Ｔ Ｖ Ａ Ｑ Ｈ Ｈ Ｅ Ａ Ｌ Ｖ Ｇ Ｈ Ｇ Ｆ Ｔ Ｈ Ａ Ｈ Ｉ Ｖ Ａ Ｌ Ｓ Ｑ Ｈ Ｐ Ａ Ａ Ｌ Ｇ Ｔ Ｖ Ａ Ｖ Ｋ Ｙ Ｑ Ｄ Ｍ Ｉ Ａ Ａ Ｌ Ｐ Ｅ Ａ Ｔ Ｈ Ｅ Ａ Ｉ Ｖ Ｇ Ｖ Ｇ Ｋ Ｑ Ｗ Ｓ Ｇ Ａ Ｒ Ａ Ｌ Ｅ Ａ Ｌ Ｌ Ｔ Ｖ Ａ Ｇ Ｅ Ｌ Ｒ Ｇ Ｐ Ｐ Ｌ Ｑ Ｌ Ｄ Ｔ Ｇ Ｑ Ｌ Ｌ Ｋ Ｉ Ａ Ｋ Ｒ Ｇ Ｇ Ｖ Ｔ Ａ Ｖ Ｅ Ａ Ｖ Ｈ Ａ Ｗ Ｒ Ｎ Ａ Ｌ Ｔ Ｇ Ａ Ｐ Ｌ Ｎ（配列番号９０９８）
である。
Ｃ末端キャップ領域の例示的なアミノ酸配列は、
Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｅ Ｓ Ｉ Ｖ Ａ Ｑ Ｌ Ｓ Ｒ Ｐ Ｄ Ｐ Ａ Ｌ Ａ Ａ Ｌ Ｔ Ｎ Ｄ Ｈ Ｌ Ｖ Ａ Ｌ Ａ Ｃ Ｌ Ｇ Ｇ Ｒ Ｐ Ａ Ｌ Ｄ Ａ Ｖ Ｋ Ｋ Ｇ Ｌ Ｐ Ｈ Ａ Ｐ Ａ Ｌ Ｉ Ｋ Ｒ Ｔ Ｎ Ｒ Ｒ Ｉ Ｐ Ｅ Ｒ Ｔ Ｓ Ｈ Ｒ Ｖ Ａ Ｄ Ｈ Ａ Ｑ Ｖ Ｖ Ｒ Ｖ Ｌ Ｇ Ｆ Ｆ Ｑ Ｃ Ｈ Ｓ Ｈ Ｐ Ａ Ｑ Ａ Ｆ Ｄ Ｄ Ａ Ｍ Ｔ Ｑ Ｆ Ｇ Ｍ Ｓ Ｒ Ｈ Ｇ Ｌ Ｌ Ｑ Ｌ Ｆ Ｒ Ｒ Ｖ Ｇ Ｖ Ｔ Ｅ Ｌ Ｅ Ａ Ｒ Ｓ Ｇ Ｔ Ｌ Ｐ Ｐ Ａ Ｓ Ｑ Ｒ Ｗ Ｄ Ｒ Ｉ Ｌ Ｑ Ａ Ｓ Ｇ Ｍ Ｋ Ｒ Ａ Ｋ Ｐ Ｓ Ｐ Ｔ Ｓ Ｔ Ｑ Ｔ Ｐ Ｄ Ｑ Ａ Ｓ Ｌ Ｈ Ａ Ｆ Ａ Ｄ Ｓ Ｌ Ｅ Ｒ Ｄ Ｌ Ｄ Ａ Ｐ Ｓ Ｐ Ｍ Ｈ Ｅ Ｇ Ｄ Ｑ Ｔ Ｒ Ａ Ｓ（配列番号９０９９）
である。
本明細書で使用される場合、Ｎ末端キャップ領域、リピートＴＡＬＥモノマーを含むＤＮＡ結合ドメイン及びＣ末端キャップ領域の既定の「Ｎ末端」から「Ｃ末端」までの配向は、本発明のｄ－ＴＡＬＥまたはポリペプチドにおける異なるドメインの組織化のための構造的基礎を提供する。
ＤＮＡ結合領域の結合活性を向上させるためにＮ末端及び／またはＣ末端キャップ領域の全体は必要ではない。そのため、特定の実施形態では、Ｎ末端及び／またはＣ末端キャップ領域の断片は、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドに含まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｎ末端キャップ領域の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、５４、６０、７０、８０、８７、９０、９４、１００、１０２、１１０、１１７、１２０、１３０、１４０、１４７、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０または２７０アミノ酸を含んでいたＮ末端キャップ領域断片を含有する。特定の実施形態では、Ｎ末端キャップ領域断片のアミノ酸は、Ｎ末端キャップ領域のＣ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、Ｃ末端２４０アミノ酸を含むＮ末端キャップ領域断片は、全長キャップ領域と同等の結合活性を向上させるのに対し、Ｃ末端１４７アミノ酸を含む断片は、全長キャップ領域の有効性の８０％超を保持し、Ｃ末端１１７アミノ酸を含む断片は、全長キャップ領域の活性の５０％超を保持する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドは、Ｃ末端キャップ領域の少なくとも６、１０、２０、３０、３７、４０、５０、６０、６８、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１２７、１３０、１４０、１５０、１５５、１６０、１７０、１８０アミノ酸を含んでいたＣ末端キャップ領域断片を含有する。特定の実施形態では、Ｃ末端キャップ領域断片のアミノ酸は、Ｃ末端キャップ領域のＮ末端（ＤＮＡ結合領域近位端）のものである。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４９－１５３（２０１１）に記載されているように、Ｃ末端６８アミノ酸を含むＣ末端キャップ領域断片は、全長キャップ領域と同等の結合活性を向上させるのに対し、Ｃ末端２０アミノ酸を含む断片は、全長キャップ領域の有効性の５０％超を保持する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャップ領域は、本明細書で提供されるキャップ領域配列と同一の配列を有する必要はない。よって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャップ領域は、本明細書で提供されるキャップ領域アミノ酸配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり、または同一性を共有する配列を有する。配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性比較は、眼によって、またはより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムを活用して行われ得る。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性パーセント（％）を計算し得、また、２つ以上のアミノ酸または核酸配列によって共有される配列同一性を計算し得る。いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのキャップ領域は、本明細書で提供されるキャップ領域アミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、または同一性を共有する配列を有する。
配列相同性は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない当該技術分野で知られている多数のコンピュータプログラムのいずれかによって生成され得る。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージのようなアライメントを行うための好適なコンピュータプログラムも使用され得る。ソフトウェアが最適なアライメントを生成すると、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは典型的には、これを配列比較の一部として行い、数値的結果を生成する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本発明のＴＡＬＥポリペプチドは、１つ以上のエフェクタードメインに連結された核酸結合ドメインを含む。用語「エフェクタードメイン」または「制御及び機能性ドメイン」は、核酸結合ドメインによって認識される核酸配列への結合以外の活性を有するポリペプチド配列を指す。核酸結合ドメインを１つ以上のエフェクタードメインと組み合わせることにより、本発明のポリペプチドは、核酸結合ドメインが特異的に結合する特定の標的ＤＮＡ配列に、エフェクタードメインによって媒介される１つ以上の機能または活性を標的化するために使用され得る。
本明細書に記載のＴＡＬＥポリペプチドのいくつかの実施形態では、エフェクタードメインによって媒介される活性は、生物学的活性である。例えば、いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、転写阻害剤（すなわち、リプレッサードメイン）、例えば、ｍＳｉｎ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）である。ＳＩＤ４Ｘドメインまたはクルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）もしくはＫＲＡＢドメインの断片。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、転写のエンハンサー（すなわち、活性化ドメイン）、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４またはｐ６５活性化ドメインである。いくつかの実施形態では、核酸結合は、例えば、トランスポサーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リゾルバーゼ、インベルターゼ、プロテアーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヌクレアーゼ、転写リプレッサー、転写活性化因子、転写因子動員、タンパク質核局在化シグナルまたは細胞取り込みシグナルを含むがこれらに限定されないエフェクタードメインと連結される。
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、トランスポサーゼ活性、インテグラーゼ活性、リコンビナーゼ活性、リゾルバーゼ活性、インベルターゼ活性、プロテアーゼ活性、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、核局在化シグナル活性、転写リプレッサー活性、転写活性化因子活性、転写因子動員活性、または細胞取り込みシグナル活性を含むがこれらに限定されない活性を示すタンパク質ドメインである。本発明の他の好ましい実施形態は、本明細書に記載の活性の任意の組み合わせを含み得る。
メガヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼまたはそのシステムが、ポリヌクレオチドを改変するために使用され得る。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位（１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）によって特性化されるエンドデオキシリボヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼを使用するための例示的な方法は、米国特許番号８，１６３，５１４、８，１３３，６９７、８，０２１，８６７、８，１１９，３６１、８，１１９，３８１、８，１２４，３６９、及び８，１２９，１３４（参照により具体的に本明細書に組み込まれる）で見ることができる。
ＲＮＡｉ
特定の実施形態では、遺伝子改変剤は、ＲＮＡｉ（例えば、ｓｈＲＮＡ）である。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性に関して「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」は、標的遺伝子についての細胞におけるｍＲＮＡレベルの、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉分子の存在がない場合に細胞で見られるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の低下を指す。１つの好ましい実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％低下する。
本明細書で使用される場合、用語「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意のタイプの干渉ＲＮＡを指す。例えば、それは、ＲＮＡの下流プロセシングのメカニズムにかかわらず、ｓｉＲＮＡとして以前に同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすｉｎ ｖｉｖｏプロセシングの特定の方法を有すると考えられるが、そのような配列は、本明細書に記載のフランキング配列の文脈においてベクターに組み込まれ得る）。用語「ＲＮＡｉ」は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子、及び遺伝子の発現を活性化するＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸であって、その二本鎖ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子と同じ細胞において存在し、または発現した場合に遺伝子または標的遺伝子の発現を減少させ、または阻害する能力を有するものを指す。二本鎖ＲＮＡ ｓｉＲＮＡは、相補鎖によって形成され得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成し得る核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は、全長標的遺伝子、またはそのサブ配列に対応し得る。典型的には、ｓｉＲＮＡは、長さが少なくとも約１５～５０ヌクレオチドである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さが約１５～５０ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さが約１５～５０塩基対、好ましくは約１９～３０塩基ヌクレオチド、好ましくは長さが約２０～２５ヌクレオチド、例えば、長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである）。
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「低分子ヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも称される）は、ｓｉＲＮＡの１種である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い、例えば、約１９～約２５ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、それに続く約５～約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、及び類似センス鎖から構成される。代替的には、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行し得、アンチセンス鎖が続き得る。
用語「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、本明細書において互換的に使用され、内因性ＲＮＡであり、その一部は、転写後レベルでタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することが知られている。内因性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの産生利用を調節することが可能なゲノムに天然に存在する小さなＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡの産生利用を調節することが可能な、内因性マイクロＲＮＡ以外のＲＮＡ配列の任意のタイプが含まれる。マイクロＲＮＡ配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，ｐ．９９１－１００８（２００３）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１５４０（２００３）、Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８－８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５－７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５３－８５７（２００１）、及びＬａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ，９，１７５－１７９（２００３）（参照により本明細書に組み込まれる）などの刊行物に記載されている。複数のマイクロＲＮＡもまた前駆体分子に組み込まれ得る。さらに、ｍｉＲＮＡ及びまたはＲＮＡｉ経路を介して内因性遺伝子の発現を調節する目的のために人工ｍｉＲＮＡ及び短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するためのビヒクルとして細胞においてｍｉＲＮＡ様ステムループが発現され得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、２つの鎖から構成されるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子には、単一のＲＮＡ分子であって、それ自体に対して逆向きに二重となって二本鎖構造を形成する、単一のＲＮＡ分子から構成されるものが含まれる。例えば、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる、一本鎖ｍｉＲＮＡが誘導される前駆分子のステムループ構造（Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃｅｌｌ １ １６：２８１－２９７）は、ｄｓＲＮＡ分子を含む。
修飾細胞及び生物
本明細書には、修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、及び／またはベクターシステムの１つ以上を含み得る修飾細胞が記載されている。いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドの１つ以上は、修飾細胞において発現され得る。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、本明細書の他の個所に記載されている修飾筋肉特異的ウイルスカプシドタンパク質及び／または修飾筋肉特異的ウイルス粒子を生成することが可能であり得る。本明細書には、本明細書に記載の１つ以上の修飾細胞を含み得る改変または修飾生物も記載されている。修飾細胞は、本明細書の他の個所に記載されている修飾筋肉特異的ウイルスカプシドポリヌクレオチドに依存してまたは独立してカーゴ分子（例えば、カーゴポリヌクレオチド）を発現するように操作され得る。
多様な動物、植物、藻類、真菌、酵母など及び動物、植物、藻類、真菌、酵母細胞または組織システムは、本明細書の他の個所に記述された様々な形質転換方法を使用して本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の核酸コンストラクトを発現するように操作され得る。これは、修飾筋肉特異的標的化部位またはその組成物を生成し得る生物を、例えば、生成目的、修飾筋肉特異的ウイルスカプシド設計及び／または生成、及び／またはモデル生物のために生成し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ウイルスカプシドシステムの１つ以上の成分をコードするポリヌクレオチド（複数可）は、植物、動物、藻類、真菌、及び／または酵母または組織システムの１つ以上の細胞に安定的にまたは一過性で組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、修飾ウイルスカプシドシステムポリヌクレオチドの１つ以上は、植物、動物、藻類、真菌、及び／または酵母または組織システムの１つ以上の細胞にゲノム的に組み込まれる。改変生物及びシステムのさらなる実施形態は、本明細書の他の個所に記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ウイルスカプシドシステムの１つ以上の成分は、植物、動物、藻類、真菌、酵母、または組織システムの１つ以上の細胞において発現される。
修飾細胞
本明細書には、本明細書の他の個所に記載されている修飾筋肉特異的標的化部位、その組成物、及び／またはその送達システムポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、及び／またはベクターシステムの１つ以上を含み得る修飾細胞の様々な実施形態が記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、修飾筋肉特異的標的化部位ポリヌクレオチドの１つ以上を発現し得、本明細書においてより詳細に記載されている１つ以上の修飾筋肉特異的ウイルス粒子を生成し得る。そのような細胞はまた、本明細書で「プロデューサー細胞」と称される。これらの修飾細胞は、本明細書の他の個所に記載されている「改変細胞」とは次の点で異なることが理解される。すなわち、改変細胞は、必ずしもプロデューサー細胞である必要はない（すなわち、それらは修飾筋肉特異的送達粒子（すなわち、本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位によってガイドされる筋肉特異的手法で細胞にカーゴを送達し得る粒子）を生成しない（ただし、それらが、修飾ウイルス粒子を細胞が生成することを可能にするか、または１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含む組成物（タンパク質など）を生成するように改変された本明細書に記載の修飾ウイルスカプシドポリヌクレオチド、修飾ウイルスカプシドベクターまたは他のベクターの１つ以上を含む場合を除く）。
改変細胞は、１つ以上の修飾筋肉特異的標的化部位を含む送達ビヒクル（例えば、ウイルス、ベクター、または非ベクター送達ビヒクル）によって送達されるカーゴのレシピエント細胞であり得、いくつかの実施形態では、レシピエント細胞に送達される送達ビヒクル及び／またはカーゴポリヌクレオチドによって改変され得る。改変細胞は、本明細書の他の個所でより詳細に論述されている。改変という用語は、レシピエント細胞であることに依存しない細胞の改変に関連して使用され得る。例えば、単離された細胞は、本明細書に記載の修飾送達ビヒクルを受け取る前に改変され得る。
実施形態では、本発明は、非ヒト真核生物；例えば、記載される実施形態のいずれかに従って本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムの１つ以上の成分を含有する真核宿主細胞を含む多細胞真核生物を提供する。他の実施形態では、本発明は、真核生物；好ましくは、記載される実施形態のいずれかに従って本明細書に記載の修飾送達システムの１つ以上の成分を含有する真核宿主細胞を含む多細胞真核生物を提供する。いくつかの実施形態では、生物は、ＡＡＶの宿主である。
特定の実施形態では、得られる植物、藻類、真菌、酵母など、細胞または部分は、細胞のすべてまたは一部のゲノムに組み込まれた外因性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニック植物である。
修飾細胞は、原核細胞であり得る。原核細胞は、細菌細胞であり得る。原核細胞は、古細菌細胞であり得る。細菌細胞は、任意の好適な細菌細胞であり得る。好適な細菌細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｏｄｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｙｓｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｄｏａｌｔｅｒｍｏｎａｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈａｍｏｎａｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属からのものであり得る。好適な細菌細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ細胞、Ｒｏｄｈｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ細胞、Ｐｓｅｄｏａｌｔｅｒｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ細胞が含まれるがこれらに限定されない。細菌の好適な株には、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＬ２１（ＤＥ３）－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１ Ｓｔａｒ－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１－ＳＩ、ＢＬ２１－ＡＩ、Ｔｕｎｅｒ、Ｔｕｎｅｒ ｐＬｙｓＳ、Ｏｒｉｇａｍｉ、Ｏｒｉｇａｍｉ Ｂ ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ、Ｒｏｓｅｔｔａ ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ－ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ、ＡＤ４９４、ＢＬ２ｔｒｘＢ、ＨＭＳ１７４、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、ＢＬＲ、Ｃ４１（ＤＥ３）、Ｃ４３（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ及びＡｒｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（ＤＥ３）が含まれるがこれらに限定されない。
修飾細胞は、真核細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、または本明細書で論述される非ヒト真核生物もしくは動物もしくは哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、または非ヒト哺乳動物もしくは霊長類を含むがこれらに限定されない植物または哺乳動物などの特定の生物のものであり、またはそれに由来し得る。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、細胞株であり得る。細胞株の例には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック型が含まれるがこれらに限定されない。細胞株は、当業者に知られている多様な供給源から利用可能である（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、修飾または改変細胞は、筋肉細胞（例えば、心臓筋肉、骨格筋、及び／または平滑筋）、骨細胞、血液細胞、免疫細胞（Ｂ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞などを含むがこれらに限定されない）、腎臓細胞、膀胱細胞、肺細胞、心臓細胞、肝臓細胞、脳細胞、ニューロン、皮膚細胞、胃細胞、ニューロン支持細胞、腸細胞、上皮細胞、内皮細胞、幹細胞または他の前駆細胞、副腎細胞、軟骨細胞、及びそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、修飾細胞は、真菌細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「真菌細胞」は、真菌界の任意のタイプの真核細胞を指す。真菌界の門には、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ、及びＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｇｏｍｙｃｏｔａが含まれる。真菌細胞には、酵母、カビ、及び糸状菌が含まれ得る。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、酵母細胞である。
本明細書で使用される場合、用語「酵母細胞」は、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ及びＢａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ門の任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、及びカビ細胞が含まれ得る。これらの生物に限定されることなく、実験室及び工業的環境で使用される多くのタイプの酵母がＡｓｃｏｍｙｃｏｔａ門の一部である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、またはＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ細胞である。他の酵母細胞には、限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．（例えば、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、及びＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉとしても知られているＩｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、糸状真菌細胞である。本明細書で使用される場合、用語「糸状真菌細胞」は、糸、すなわち、菌糸（ｈｙｐｈａｅ）または菌糸（ｍｙｃｅｌｉａ）で成長する任意のタイプの真菌細胞を指す。糸状真菌細胞の例には、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．（例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、及びＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ．（例えば、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は、工業用株である。本明細書で使用される場合、「工業用株」は、工業的プロセス、例えば、商業的または工業的規模での生成物の生成において使用されるまたはそれから単離される真菌細胞の任意の株である。工業用株は、典型的には工業的プロセスにおいて使用される真菌種を指し得、またはそれは、非工業的目的（例えば、実験室研究）のためにも使用され得る真菌種の単離物を指し得る。工業的プロセスの例には、発酵（例えば、食料または飲料生成物の生成におけるもの）、蒸留、バイオ燃料生成、化合物の生成、及びポリペプチドの生成が含まれ得る。工業用株の例には、限定されないが、ＪＡＹ２７０及びＡＴＣＣ４１２４が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用される場合、「倍数体」細胞は、ゲノムが複数のコピーに存在する任意の細胞を指し得る。倍数体細胞は、倍数体状態で天然に見られるタイプの細胞を指し得、またはそれは、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または改変を介して）倍数体状態で存在するように誘導された細胞を指し得る。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指し得、またはそれは、対象となる特定のゲノム遺伝子座において倍数体である細胞を指し得る。
いくつかの実施形態では、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用される場合、「二倍体」細胞は、ゲノムが２つのコピーに存在する任意の細胞を指し得る。二倍体細胞は、二倍体状態で天然に見られるタイプの細胞を指し得、またはそれは、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または改変を介して）二倍体状態で存在するように誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、単数体または二倍体状態で維持され得る。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指し得、またはそれは、対象となる特定のゲノム遺伝子座において二倍体である細胞を指し得る。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、単数体細胞である。本明細書で使用される場合、「単数体」細胞は、ゲノムが１つのコピーに存在する任意の細胞を指し得る。単数体細胞は、単数体状態で天然に見られるタイプの細胞を指し得、またはそれは、（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはＤＮＡ複製の特定の制御、変化、不活性化、活性化、または改変を介して）単数体状態で存在するように誘導された細胞を指し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ２２８Ｃは、単数体または二倍体状態で維持され得る。単数体細胞は、ゲノム全体が単数体である細胞を指し得、またはそれは、対象となる特定のゲノム遺伝子座において単数体である細胞を指し得る。
いくつかの実施形態では、修飾細胞は、対象から得られる細胞である。いくつかの実施形態では、対象は、健康または非罹患対象である。いくつかの実施形態では、対象は、修飾ＡＡＶカプシド粒子が生成される場合、それが所望の生理的及び／または生物学的特性に関連し得る及び／または所望の生理的及び／または生物学的特性を改変することが可能であり得る１つ以上のカーゴポリヌクレオチドをパッケージングし得るように、所望の生理的及び／または生物学的特性を有する対象である。よって、生成された修飾ＡＡＶカプシド粒子のカーゴポリヌクレオチドは、所望の特性をレシピエント細胞に移すことが可能であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴポリヌクレオチドは、修飾細胞が所望の生理的及び／または生物学的特性を有するように、修飾細胞のポリヌクレオチドを改変することが可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のベクターでトランスフェクションされた細胞は、１つ以上のベクターに由来する配列を含む新たな細胞株を樹立するために使用される。
修飾細胞は、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及び／または粒子を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及び／または粒子は、生成され、収集され、及び／またはそれを必要とする対象に送達される。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、対象に送達される。修飾細胞のための他の用途は、本明細書の他の個所に記載されている。いくつかの実施形態では、修飾細胞は、本明細書の他の個所に記載されている製剤及び／またはキットに含まれ得る。
修飾細胞は、後の時点での使用のために短期間または長期間保存され得る。好適な保存方法は通常、当該技術分野で知られている。さらに、後の時点で使用するために保存された細胞を復元する方法（例えば、解凍、再構成、及びそうでなければ保存後に修飾細胞における代謝を刺激すること）も通常、当該技術分野で知られている。
製剤
本明細書に記載の組成物、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、粒子、細胞、ベクターシステム及びそれらの組み合わせは、薬学的製剤などの製剤に含有され得る。いくつかの実施形態では、製剤は、本明細書に記載の１つ以上の筋肉特異的標的化部位を含むポリペプチド及び他の粒子を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、製剤は、それを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾筋肉特異的標的化部位、その組成物、その送達システム、修飾細胞、修飾ウイルス粒子、及び／またはそれらの組み合わせは、対象または細胞に送達され得る製剤に含まれ得る。いくつかの実施形態では、製剤は、薬学的製剤である。本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、それを必要とする対象または細胞に単独でまたは例えば、薬学的製剤における活性成分として提供され得る。このように、本明細書には、ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、またはそれらの組み合わせの１つ以上を含有する薬学的製剤も記載されている。いくつかの実施形態では、薬学的製剤は、有効量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含有し得る。本明細書に記載の薬学的製剤は、それを必要とする対象または細胞に投与され得る。
いくつかの実施形態では、薬学的製剤に含有される本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせの１つ以上の量は、それを必要とする対象の体重または薬学的製剤が投与され得る特定の患者集団の平均体重に基づいて約１ｐｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。薬学的製剤における本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上の量は、約１ｐｇ～約１０ｇまたは約１０ｎＬ～約１０ｍｌの範囲であり得る。薬学的製剤が１つ以上の細胞を含有する実施形態では、量は、約１細胞～１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０またはそれ以上の細胞の範囲であり得る。薬学的製剤が１つ以上の細胞を含有する実施形態では、量は、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬ当たり約１細胞～１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０またはそれ以上の細胞の範囲であり得る。
修飾ＡＡＶカプシド粒子が製剤に含まれる実施形態では、製剤は、１～１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、１ｘ１０１６、１ｘ１０１７、１ｘ１０１８、１ｘ１０１９、または１ｘ１０２０形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬの修飾ＡＡＶカプシド粒子を含有し得る。いくつかの実施形態では、製剤は、体積が０．１～１００ｍＬであり、１～１ｘ１０１、１ｘ１０２、１ｘ１０３、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、１ｘ１０１６、１ｘ１０１７、１ｘ１０１８、１ｘ１０１９、または１ｘ１０２０形質導入単位（ＴＵ）／ｍＬの修飾ウイルス粒子を含有し得る。
薬学的に許容可能な担体及び補助成分及び薬剤
実施形態では、ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含有する薬学的製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含み得る。好適な薬学的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが含まれるがこれらに限定されず、これらは活性組成物と有害に反応しない。
薬学的製剤は、安定化され、所望の場合、滑沢剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色、香味及び／または芳香物質などの補助剤と混合され得、これらは活性組成物と有害に反応しない。
ある量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせの１つ以上に加えて、薬学的製剤はまた、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、ホルモン、免疫調節剤、解熱剤、抗不安剤、抗精神病剤、鎮痛剤、鎮痙剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗感染症剤、化学療法剤、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない有効量の補助活性剤を含み得る。
好適なホルモンには、アミノ酸由来ホルモン（例えば、メラトニン及びチロキシン）、小型ペプチドホルモン及びタンパク質ホルモン（例えば、チロトロピン放出ホルモン、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン）、エイコサノイド（例えば、アラキドン酸、リポキシン、及びプロスタグランジン）、及びステロイドホルモン（例えば、エストラジオール、テストステロン、テトラヒドロテストステロンコルチゾール）が含まれるがこれらに限定されない。好適な免疫調節剤には、プレドニゾン、アザチオプリン、６－ＭＰ、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１２）、サイトカイン（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－Ｋ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子、及びイミキモド）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６及びＣＸＣＬ７）、シトシンホスフェート－グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、抗体、及びアプタマー）が含まれるがこれらに限定されない。
好適な解熱剤には、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、アスピリン及び関連するサリチル酸塩（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）、パラセタモール／アセトアミノフェン、メタミゾール、ナブメトン、フェナゾン、及びキニーネが含まれるがこれらに限定されない。
好適な抗不安剤には、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、及びトフィソパム）、セロトニン作動性抗鬱剤（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、三環式抗鬱剤、及びモノアミンオキシダーゼ阻害剤）、メビカール、アホバゾール、セランク、ブロマンタン、エモキシピン、アザピロン、バルビツール酸、ヒドロキシジン、プレガバリン、バリドール、及びベータ遮断薬が含まれるがこれらに限定されない。
好適な抗精神病剤には、ベンペリドール、ブロムペリドール、ドロペリドール、ハロペリドール、モペロン、ピパペロン、チミペロン、フルスピリレン、ペンフリドール、ピモジド、アセプロマジン、クロルプロマジン、シアメマジン、ジジラジン、フルフェナジン、レボメプロマジン、メソリダジン、ペラジン、ペリシアジン、ペルフェナジン、ピポチアジン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロチオペンジル、チオプロペラジン、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、クロルプロチキセン、クロペンチキソール、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロチアピン、ロキサピン、プロチペンジル、カルピプラミン、クロカプラミン、モリンドン、モサプラミン、スルピリド、ベラリプリド、アミスルプリド、アモキサピン、アリピプラゾール、アセナピン、クロザピン、ブロナンセリン、イロペリドン、ルラシドン、メルペロン、ネモナプリド、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、トリミプラミン、ジプラシドン、ゾテピン、アルストニー、ベフェプルノクス、ビトペルチン、ブレクスピプラゾール、カンナビジオール、カリプラジン、ピマバンセリン、ポマグルメタッドメチオニル、バビカセリン、キサノメリン、及びジクロナピンが含まれるがこれらに限定されない。
好適な鎮痛剤には、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、オピオイド（例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルヒネ、ペチジン、ブプレノルフィン）、トラマドール、ノルエピネフリン、フルピレチン、ネホパム、オルフェナドリン、プレガバリン、ガバペンチン、シクロベンザプリン、スコポラミン、メサドン、ケトベミドン、ピリトラミド、ならびにアスピリン及び関連サリチル酸塩（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）が含まれるがこれらに限定されない。
好適な鎮痙剤には、メベベリン、パパベリン、シクロベンザプリン、カリソプロドール、オルフェナドリン、チザニジン、メタキサロン、メトカルバモール、クロルゾキサゾン、バクロフェン、ダントロレン、バクロフェン、チザニジン、及びダントロレンが含まれるがこれらに限定されない。好適な抗炎症剤には、プレドニゾン、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、及び免疫選択的抗炎症誘導体（例えば、顎下腺ペプチド－Ｔ及びその誘導体）が含まれるがこれらに限定されない。
好適な抗ヒスタミン剤には、Ｈ１－受容体アンタゴニスト（例えば、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブロモジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルプロマジン、シクリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニラミン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、エバスチン、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボセチリジン、ロラタジン、メクロジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、ピリラミン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、及びトリプロリジン）、Ｈ２－受容体アンタゴニスト（例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン、及びロキサチジン）、トリトカリン、カテチン、クロモグリケート、ネドクロミル、及びｐ２－アドレナリン作動性アゴニストが含まれるがこれらに限定されない。
好適な抗感染症剤には、抗アメーバ剤（例えば、ニタゾキサニド、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、クロロキン、ミルテフォシン、アンフォテリシンｂ、及びヨードキノール）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、及びネオマイシン）、駆虫剤（例えば、ピランテル、メベンダゾール、イベルメクチン、プラジカンテル、アルベンダゾール、チアベンダゾール、オキサムニキン）、抗真菌剤（例えば、アゾール抗真菌剤（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、パルコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、及びボリコナゾール）、エキノキャンディン（例えば、カスポファンギン、アニデュラファンギン、及びミカファンギン）、グリセオフルビン、テルビナフィン、フルシトシン、及びポリエン（例えば、ナイスタチン、及びアンフォテリシンｂ）、抗マラリア剤（例えば、ピリメタミン／スルファドキシン、アルテメーテル／ルメファントリン、アトバコン／プロカニル、キニーネ、ヒドロキシクロロキン、メフロキン、クロロキン、ドキシサイクリン、ピリメタミン、及びハロファントリン）、抗結核剤（例えば、アミノサリチレート（例えば、アミノサリチル酸）、イソニアジド／リファンピン、イソニアジド／ピラジンアミド／リファンピン、ベダキリン、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、及びサイクロセリン）、抗ウイルス剤（例えば、アマンタジン、リマンタジン、アバカビル／ラミブジン、エムトリシタビン／テノホビル、コビシスタット／エルビテグラビル／エムトリシタビン／テノホビル、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノホビル、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン、ラミブジン／ジドブジン、エムトリシタビン／テノホビル、エムトリシタビン／ロピナビル／リトナビル／テノホビル、インターフェロンアルファ－２ｖ／リバビリン、ペギンテルフェロンアルファ－２ｂ、マラビロク、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エンフビルチド、ホスカルネット、ホミビルセン、オセルタミビル、ザナミビル、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン、リルピビリン、デラビルジン、ネビラピン、エンテカルビル、ラミブジン、アデホビル、ソホスブビル、ジダノシン、テノホビル、アバカビル、ジドブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン、テルビブジン、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、ロピナビル／リトナビル、ボセプレビル、ダルナビル、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インジナビル、サウイナビル（ｓａｗｕｉｎａｖｉｒ）、リバビリン、バラシクロビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びバルガンシクロビル）、カルバペネム（例えば、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、及びシラスタチン／イミペネム）、セファロスポリン（例えば、セファドロキシル、セファラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セファゾリン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシム、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフチゾキシム、及びセフタジジム）、糖ペプチド抗生剤（例えば、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、及びテラバンシン）、グリシルサイクリン（例えば、チゲサイクリン）、抗らい菌剤（例えば、クロファジミン及びサリドマイド）、リンコマイシン及びその誘導体（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド及びその誘導体（例えば、テリスロマイシン、フィダキソマイシン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、及びトロレアンドマイシン）、リネゾリド、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、リファキシミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、アズトレオナム、バシトラシン、ペニシリン（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラネート、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、クラブラネート／チカルシリン、ペニシリン、プロカインペニシリン、オキサシリン、ジクロキサシリン、及びナフシリン）、キノロン（例えば、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、カチフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、トロバフロキサシン、及びスパルフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、スルファサラジン、及びスルファソキサゾール）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン／サリチル酸、ドキシサイクリン／オメガ－３ポリ不飽和脂肪酸、及びテトラサイクリン）、及び尿路抗感染症剤（例えば、ニトロフラントイン、メテナミン、ホスホマイシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びメチレンブルー）が含まれるがこれらに限定されない。
好適な化学療法剤には、パクリタキセル、ブレンツキシマブベドチン、ドキソルビシン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、エベロリムス、ペメトレキセド、メルファラン、パミドロネート、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリノスタット、トシツモマブ、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、ブスルファン、アレムツズマブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、ダウノルビシン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、ラムシルマブ、シタラビン、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ヒドロキシウレア、ダカルバジン、リュープロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンチミー、アミフォスチン、エトポシド、フルタミド、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、プララトレキセート、メトトレキサート、フロクスウリジン、オビヌツズマブ、ゲムシタビン、アファチニブ、メシル酸イマチニブ、カルムスチン、エリブリン、トラスツズマブ、アルトレタミン、トポテカン、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、インターフェロンアルファ－２ａ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イキサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、カルフィルゾミブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、ミトタン、ビンクリスチン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、ストロンチウム－８９塩化物、メクロレタミン、マイトマイシン、ブスルファン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ビノレルビン、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、タモキシフェン、ミトキサントロン、ペグアスパラガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、カルボプラチン、ペルツズマブ、シスプラチン、ポマリドミド、プレドニゾン、アルデスロイキン、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドミド、リツキシマブ、オクトレチド、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、シルツキシマブ、オマセタキシン、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（チオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、ＢＣＧ、テムシロリムス、ベンダムスチン塩酸塩、トリプトレリン、三酸化ヒ素、ラパチニブ、バルルビシン、パニツムマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、トレチノイン、アザシチジネア（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅａ）、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、イピリムマブ、ゴセレリン、ボリノスタット、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、エポチロン、タフルポシド、アザチオプリン、ドキシフルリジン、ビンデシン、及び全トランスレチノイン酸が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、ナノ粒子、他の送達粒子、及びそれらの組み合わせの１つ以上に加えて薬学的製剤に含有される補助活性剤が存在する実施形態では、補助活性剤の有効量などの量は、補助活性剤に応じて異なる。いくつかの実施形態では、補助活性剤の量は、０．００１マイクログラム～約１ミリグラムの範囲である。他の実施形態では、補助活性剤の量は、約０．０１ＩＵ～約１０００ＩＵの範囲である。さらなる実施形態では、補助活性剤の量は、０．００１ｍＬ～約１ｍＬの範囲である。さらに他の実施形態では、補助活性剤の量は、薬学的製剤全体の約１％ｗ／ｗ～約５０％ｗ／ｗの範囲である。追加の実施形態では、補助活性剤の量は、薬学的製剤全体の約１％ｖ／ｖ～約５０％ｖ／ｖの範囲である。さらに他の実施形態では、補助活性剤の量は、薬学的製剤全体の約１％ｗ／ｖ～約５０％ｗ／ｖの範囲である。
投薬形態
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の薬学的製剤は、投薬形態ものであり得る。投薬形態は、任意の適切な経路による投与のために適応され得る。適切な経路には、経口（口腔内または舌下を含む）、直腸、硬膜外、頭蓋内、眼内、吸入、鼻腔内、局所（口腔内、舌下、または経皮を含む）、膣、尿道内、非経口、頭蓋内、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮内、骨内、心臓内、関節内、海綿体内、髄腔内、硝子体内、脳内、歯肉、歯肉縁下、脳室内、及び皮内が含まれるがこれらに限定されない。そのような製剤は、当該技術分野で知られている任意の方法によって調製され得る。
経口投与のために適応された投薬形態は、個別の投薬量単位、例えば、カプセル、ペレットもしくは錠剤、粉末もしくは顆粒、溶液、または水性もしくは非水性液体中の懸濁液；食用フォームもしくはホイップ、または水中油液体エマルションまたは油中水液体エマルションであり得る。いくつかの実施形態では、経口投与のために適応された薬学的製剤はまた、薬学的製剤を風味付け、保存し、着色し、またはその分散を補助する１つ以上の薬剤を含む。経口投与のために調製された投薬形態はまた、フォーム、スプレー、または液体溶液として送達され得る液体溶液の形態であり得る。いくつかの実施形態では、経口投薬形態は、標的化エフェクター融合タンパク質及び／またはその複合体または本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含有する組成物の治療的有効量またはその適切な部分を含有する約１ｎｇ～１０００ｇの薬学的製剤を含有し得る。経口投薬形態は、それを必要とする対象に投与され得る。
適切な場合、本明細書に記載の投薬形態は、マイクロカプセル化され得る。
投薬形態はまた、任意の成分の放出を延長または持続させるように調製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、放出が遅延される成分であり得る。他の実施形態では、任意に含まれる補助成分の放出は、遅延される。成分の放出を遅延させるための好適な方法には、ポリマー、ワックス、ゲルなどの中の物質に成分をコーティングまたは埋め込むことが含まれるがこれらに限定されない。遅延放出投薬製剤は、標準的な参考文献、例えば、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ｔａｂｌｅｔｓ，” ｅｄｓ．Ｌｉｂｅｒｍａｎ ｅｔ．ａｌ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ － Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ”，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００、及び“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ”，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）に記載されているように調製され得る。これらの参考文献は、錠剤及びカプセルならびに遅延放出投薬形態の錠剤及びペレット、カプセル、及び顆粒を調製するための賦形剤、材料、装置、及びプロセスに関する情報を提供する。遅延放出は、約１時間～約３ヶ月またはそれ以上の範囲であり得る。
好適なコーティング物質の例には、セルロースポリマー、例えば、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート；ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、及び商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｔｈ Ｐｈａｒｍａ，Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、シェラック、ならびに多糖が含まれるがこれらに限定されない。
コーティングは、所望の放出プロファイルをもたらすために、異なる比の水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、及び／またはｐＨ依存性ポリマーを用いて、水不溶性／水溶性非ポリマー性賦形剤を用いてまたは用いずに形成され得る。コーティングは、錠剤（コーティングビーズを用いてまたは用いずに圧縮される）、カプセル（コーティングビーズを用いるまたは用いない）、ビーズ、粒子組成物を含むがこれらに限定されない投薬形態（マトリックスまたは単体）、限定されないが懸濁液形態としてまたはスプリンクル投薬形態として製剤化される「そのままの成分」のいずれかに対して実施される。
局所投与のために適応された投薬形態は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油として製剤化され得る。眼または他の外部組織、例えば、口または皮膚の処置のためのいくつかの実施形態では、薬学的製剤は、局所軟膏またはクリームとして適用される。軟膏中で製剤化される場合、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、パラフィン性または水混和性軟膏基材を用いて製剤化され得る。いくつかの実施形態では、活性成分は、水中油クリーム基材または油中水基材を用いてクリーム中で製剤化され得る。口における局所投与のために適応された投薬形態には、ロゼンジ、トローチ、及び口洗浄剤が含まれる。
鼻または吸入投与のために適応された投薬形態には、エアロゾル、溶液、懸濁液滴、ゲル、または乾燥粉末が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、微細化によって得られたまたは得られ得る粒子サイズが縮小した形態である吸入のために適応された投薬形態に含有される。いくつかの実施形態では、サイズが減少した（例えば、微細化された）化合物またはその塩もしくは溶媒和物の粒子サイズは、当該技術分野で知られている適切な方法によって測定して約０．５～約１０ミクロンのＤ５０値によって定義される。吸入による投与のために適応された投薬形態にはまた、粒子ダストまたはミストが含まれる。担体または賦形剤が鼻スプレーまたは液滴として投与するための液体である好適な投薬形態には、活性成分（例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上及び／または補助活性剤）の水性または油性の溶液／懸濁液が含まれ、これらは様々なタイプの計量用量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器によって生成され得る。
いくつかの実施形態では、投薬形態は、吸入による投与に好適なエアロゾル製剤であり得る。これらの実施形態の一部では、エアロゾル製剤は、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上及び薬学的に許容可能な水性または非水性溶媒の溶液または微懸濁液を含有し得る。エアロゾル製剤は、密閉容器において滅菌形態で単回または複数の用量で提供され得る。これらの実施形態の一部のため、密閉容器は、計量弁が装着された単回用量または複数の用量の鼻またはエアロゾルディスペンサー（例えば、計量用量吸入具）であり、これは、容器の内容物が消費されたときに廃棄されることが意図されている。
エアロゾル投薬形態がエアロゾルディスペンサーに含まれる場合、ディスペンサーは、加圧下で好適な推進剤、例えば、圧縮空気、二酸化炭素、またはヒドロフルオロカーボンを含むがこれらに限定されない有機推進剤を含有する。他の実施形態におけるエアロゾル製剤投薬形態は、ポンプ噴霧器に含まれる。加圧エアロゾル製剤はまた、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上の溶液または懸濁液を含有し得る。さらなる実施形態では、エアロゾル製剤はまた、例えば、製剤の安定性及び／または味及び／または微粒子質量特性（量及び／またはプロファイル）を改善するために組み込まれる共溶媒及び／または改変剤を含有し得る。エアロゾル製剤の投与は、１日１回または１日数回、例えば、１日２、３、４、または８回行われ得、その場合、１、２、または３用量が各時点で送達される。
吸入投与のために好適な及び／または適応されたいくつかの投薬形態の場合、薬学的製剤は、乾燥粉末吸入可能製剤である。本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上、補助活性成分、及び／またはその薬学的に許容可能な塩に加えて、そのような投薬形態は、ラクトース、グルコース、トレハロース、マンニトール、及び／またはデンプンなどの粉末基材を含有し得る。これらの実施形態の一部では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、粒子サイズ減少形態である。さらなる実施形態では、性能改変剤、例えば、Ｌ－ロイシンまたは別のアミノ酸、セロビオースオクタアセテート、及び／またはステアリン酸の金属塩、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム。
いくつかの実施形態では、エアロゾル投薬形態は、各々の計量用量のエアロゾルが、既定量の活性成分、例えば、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上の１つ以上を含有するように構成され得る。
膣投与のために適応された投薬形態は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供され得る。直腸投与のために適応された投薬形態には、座剤または浣腸が含まれる。
非経口投与のために適応された及び／または任意のタイプの注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、骨内、硬膜外、心臓内、関節内、海綿体内、歯肉、歯肉縁下、髄腔内、硝子体内、脳内、及び脳室内）のために適応された投薬形態は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、組成物を対象の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び／または非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含み得る。非経口投与のために適応された投薬形態は、密閉アンプルまたはバイアルを含むがこれらに限定されない単回単位用量または複数単位用量容器で提供され得る。用量は、凍結乾燥され、滅菌担体に再懸濁されて、投与前に用量が再構成され得る。即席注射溶液及び懸濁液は、いくつかの実施形態では、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
眼投与のために適応された投薬形態には、任意に注射のために適応され得る水性及び／または非水性滅菌溶液であって、任意に抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、組成物を眼またはそれに含まれるまたは対象の眼の周りの液体と等張にする溶質を含有し得るもの、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含有し得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれ得る。
いくつかの実施形態のため、投薬形態は、単位用量当たり既定量の本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上を含有する。そのため、いくつかの実施形態では、そのような単位用量の既定量は、１日１回または複数回投与され得る。そのような薬学的製剤は、当該技術分野でよく知られている方法のいずれかによって調製され得る。
キット
本明細書には、本明細書に記載の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、ウイルス粒子、他の送達ビヒクル、または他の成分及びそれらの組み合わせの１つ以上ならびに本明細書に記載の薬学的製剤の１つ以上を含有するキットも記載されている。実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上は、組み合わせキットとして提供され得る。本明細書で使用される場合、用語「組み合わせキット」または「部品のキット」は、要素の組み合わせまたはそれに含まれる活性成分などの単一の要素を包装、スクリーニング、試験、販売、上市、送達、及び／または投与するために使用される化合物、または製剤及び追加の成分を指す。そのような追加の成分には、包装、シリンジ、ブリスターパッケージ、ボトルなどが含まれるがこれらに限定されない。組み合わせキットは、成分の１つ以上（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、及びそれらの組み合わせの１つ以上の１つ以上）を含有し得、またはそれらの製剤は、単一製剤（例えば、液体、凍結乾燥粉末など）、または別々の製剤で提供され得る。別々の成分または製剤は、単一のパッケージまたはキット内の別々のパッケージに含まれ得る。キットにはまた、それに含まれる成分及び／または製剤の含有量に関する情報及び／または指示、それに含まれる成分（複数可）及び／または製剤（複数可）の含有量に関する安全性情報、それに含まれる成分（複数可）及び／または製剤についての量、投薬量、使用のための適応症、スクリーニング方法、成分設計推奨及び／または情報、推奨処置レジメン（複数可）に関する情報を含み得る有形表示媒体の指示書が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「有形表示媒体」は、物理的に有形であり、またはアクセス可能であり、単なる抽象的思考または記録されていない話し言葉ではない媒体を指す。「有形表示媒体」には、セルロースまたはプラスチック材料上の文字、または好適なコンピュータ可読メモリ形態で記憶されたデータが含まれるがこれらに限定されない。データは、例えば、フラッシュメモリドライブもしくはＣＤ－ＲＯＭなどの単位デバイスにまたは、例えば、ウェブインターフェースを介してユーザによってアクセスされ得るサーバに記憶され得る。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の成分の１つ以上を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、ベクターシステム及びキットを使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、ベクターシステムは、本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位及び／またはその組成物を含有するものなどの１つ以上の修飾ポリヌクレオチドに機能可能に連結された制御要素及び、任意に、制御要素に任意に機能可能に連結され得るカーゴ分子を含む。１つ以上の修飾送達システムポリヌクレオチドは、キット内のカーゴ分子を含有する実施形態においてカーゴ分子と同じまたは異なるベクターに含まれ得る。
いくつかの実施形態では、キットは、ベクターシステム及びキットを使用するための指示書を含む。いくつかの実施形態では、ベクターシステムは、（ａ）直接リピート配列及び直接リピート配列の上流または下流（適用可能な方）に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位に機能可能に連結された第１の制御要素であって、発現した場合、ガイド配列は、真核細胞における標的配列に対するＣａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体化したＣａｓ９酵素を含む、第１の制御要素；及び／または（ｂ）核局在化配列を含む前記Ｃａｓ９酵素をコードする酵素コーディング配列に機能可能に連結された第２の制御要素を含む。適用可能な場合、ｔｒａｃｒ配列も提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、システムの同じまたは異なるベクターに位置する成分（ａ）及び（ｂ）を含む。いくつかの実施形態では、成分（ａ）は、第１の制御要素に機能可能に連結された２つ以上のガイド配列をさらに含み、発現した場合、２つ以上のガイド配列の各々は、真核細胞における異なる標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、真核細胞の核における検出可能な量の前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の積蓄を誘導するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＶまたはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム酵素である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９酵素は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ１、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ Ｃａｓ９（例えば、少なくとも１つのＤＤを有するようにまたはそれに関連付けられるように改変される）に由来し、Ｃａｓ９のさらなる変化または変異を含み得、キメラＣａｓ９であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、真核細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態では、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置で１つまたは２つの鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、ＤＤ－ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ鎖切断活性を欠き、または実質的に欠く（例えば、野生型酵素またはヌクレアーゼ活性を低下させる変異または変化を有さない酵素と比較して５％以下のヌクレアーゼ活性）。いくつかの実施形態では、第１の制御要素は、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、第２の制御要素は、ポリメラーゼＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、長さが少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５ヌクレオチド、または１６～３０、または１６～２５、または１６～２０の間のヌクレオチドである。
使用方法
一般的論述
本発明の筋肉特異的標的化部位、修飾筋肉特異的送達システム、修飾ウイルスカプシド及び粒子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター（複数可）、修飾細胞の１つ以上を含む組成物は通常、１つ以上のカーゴをパッケージングし、及び／またはそれをレシピエント細胞に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、送達は、標的化部位の特異性に基づいて細胞特異的様式で、例えば、筋肉特異的様式で行われる。いくつかの実施形態では、これは、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上のＲＧＤ及びまたはｎ－ｍｅｒモチーフの包含によって少なくとも部分的に影響を受け得る、修飾ウイルスカプシドの指向性によって付与される。いくつかの実施形態では、指向性は、筋肉特異的である。いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位、修飾ウイルスカプシド及びウイルス粒子の１つ以上を含む組成物は、対象または細胞、組織、及び／または器官に投与され、レシピエント細胞へのカーゴの移行及び／または組み込みを容易化し得る。他の実施形態では、筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する、ポリペプチド及び他の粒子（例えば、修飾ＡＡＶカプシド及びウイルス粒子）などの組成物を生成することが可能な修飾細胞は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、及びベクターシステムなどから生成され得る。これには、限定されないが、修飾ＡＡＶカプシドシステム分子（例えば、ポリヌクレオチド、ベクター、及びベクターシステムなど）が含まれる。いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する、ポリペプチド及び他の粒子（例えば、修飾ＡＡＶカプシド及びウイルス粒子）などの組成物を生成することが可能な本明細書に記載のポリヌクレオチド、ベクター、及びベクターシステムなどは、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または組織に送達され得る。いくつかの実施形態では、対象に送達される場合、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで対象の細胞を形質転換して、本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する本明細書に記載の組成物を生成することが可能であり得る修飾細胞を生成し得、その組成物には、修飾細胞から放出され、ｉｎ ｖｉｖｏでカーゴ分子（複数可）をレシピエント細胞に送達し、またはレシピエント細胞が得られた対象への再導入のための個別化された修飾組成物（例えば、ＡＡＶカプシド粒子）を生成し得る修飾ＡＡＶカプシド粒子が含まれるがこれに限定されない。
いくつかの実施形態では、修飾細胞は、対象に送達され得、そこで本発明の生成された組成物（修飾ＡＡＶカプシド粒子を含むがこれに限定されない）を放出し得、これによりそれらは次いで、カーゴ（例えば、カーゴポリヌクレオチド（複数可））をレシピエント細胞に送達し得る。これらの一般的プロセスは、対象における疾患またはその症状を処置及び／または予防し、モデル細胞を生成し、改変生物を生成し、細胞選択及びスクリーニングアッセイを提供するための多様な方法において、バイオプロダクションにおいて、及び他の様々な用途において使用され得る。
いくつかの実施形態では、筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する組成物、例えば、ポリペプチド及び他の粒子（例えば、修飾ＡＡＶカプシド及びウイルス粒子）は、対象または細胞、組織、及び／または器官に送達され得る。このように、それらは、それらが筋肉細胞を含有し、またはそれに関連付けられ得る任意のカーゴを送達するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチド、ベクター、及びそのシステムは、所望の細胞特異性を有するバリアントが見つけられ得る修飾ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成するために使用され得る。様々な実施例によって裏付けられる本明細書で提供される説明は、所望の細胞特異性を念頭に置いている者が、本明細書に記載される本発明を利用して、所望の細胞特異性を有するカプシドを得ることができるであろうことを実証し得る。
対象発明は、結果またはデータの送信がある研究プログラムの一部として使用され得る。コンピュータシステム（またはデジタルデバイス）は、結果を受信し、送信し、表示し、及び／または記憶するために、データ及び／または結果を分析するために、及び／または結果及び／またはデータ及び／または分析の報告書を生成するために使用され得る。コンピュータシステムは、固定媒体を有するサーバに任意に接続され得る媒体（例えば、ソフトウェア）及び／またはネットワークポート（例えば、インターネットから）からの命令を読み取り得る論理装置として理解され得る。コンピュータシステムは、ＣＰＵ、ディスクドライブ、入力デバイス、例えば、キーボード及び／またはマウス、及びディスプレイ（例えば、モニター）の１つ以上を含み得る。指示書または報告書の送信などのデータ通信は、ローカルまたは遠隔地におけるサーバへ通信媒体を介して達成され得る。通信媒体は、データを送信及び／または受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続、またはインターネット接続であり得る。そのような接続は、ワールドワイドウェブでの通信を提供し得る。本発明に関するデータは、受理及び／またはレシーバによるレビューのためにそのようなネットワークまたは接続（またはプリントアウトなどの物理的報告書の郵送を含むがこれらに限定されない、情報を送信するための任意の他の好適な手段）で送信され得ることが想定される。レシーバは、個人、または電子システム（例えば、１つ以上のコンピュータ、及び／または１つ以上のサーバ）であり得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンピュータシステムは、１つ以上のプロセッサを含む。プロセッサは、コンピュータシステムの１つ以上の制御部、計算単位、及び／または他の単位に関連付けられ、または所望によりファームウェアに埋め込まれ得る。ソフトウェアで実行される場合、ルーチンは、任意のコンピュータ可読メモリ、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク、または他の好適な記憶媒体に記憶され得る。同様に、このソフトウェアは、任意の既知の送達方法（例えば、通信チャネル、例えば、電話回線、インターネット、ワイヤレス接続などによるもの、または可搬型媒体、例えば、コンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなどを介するものを含む）を介して計算装置に送達され得る。様々な工程は、様々なブロック、オペレーション、ツール、モジュール及び技術として実行され得、これらはひいては、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアの任意の組み合わせで実行され得る。ハードウェアで実行される場合、ブロック、オペレーション、技術などの一部またはすべては、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブル論理アレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）などで実行され得る。クライアント・サーバ、リレーショナルデータベース構築は、本発明の実施形態において使用され得る。クライアント・サーバ構築は、ネットワーク上の各コンピュータまたはプロセスがクライアントまたはサーバのいずれかであるネットワーク構築である。サーバコンピュータは典型的には、ディスクドライブ（ファイルサーバ）、プリンタ（プリントサーバ）、またはネットワークトラフィック（ネットワークサーバ）を管理するように特化された高性能コンピュータである。クライアントコンピュータには、ユーザがアプリケーションを実行するＰＣ（パーソナルコンピュータ）またはワークステーション、及び本明細書に開示される例示的な出力デバイスが含まれる。クライアントコンピュータは、ファイル、デバイス、及びさらに処理能力などのリソースについてサーバコンピュータに依存する。本発明のいくつかの実施形態では、サーバコンピュータは、データベース機能性のすべてに対処する。クライアントコンピュータは、すべてのフロントエンドデータ管理に対処するソフトウェアを有し得、また、ユーザからのデータ入力を受信し得る。コンピュータ実行可能コードを含む機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的送信媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体には、例えば、光学または磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ（複数可）などにおける記憶デバイスのいずれか（例えば、図面に示されるデータベースなどを実行するために使用され得る）が含まれる。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形送信媒体には、同軸ケーブル；銅ワイヤ及び光ファイバー（コンピュータシステム内にバスを含むワイヤを含む）が含まれる。搬送波送信媒体は、電気もしくは電磁信号、または音波もしくは光波、例えば、無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものの形態を取り得る。そのため、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤもしくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学的媒体、パンチカードペーパーテープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を送る搬送波、そのような搬送波を送るケーブルもしくは回線、またはコンピュータがプログラミングコード及び／またはデータを読み込み得る任意の他の媒体が含まれる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行用プロセッサに運ぶのに関与し得る。したがって、本発明は、本明細書で論述される任意の方法を実施すること、及びそれに由来するデータ及び／または結果及び／またはその分析を記憶及び／または送信すること、ならびに中間体を含む、本明細書で論述される任意の方法を実施することに由来する生成物を包含する。
治療剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシド、修飾ウイルス粒子、修飾細胞、及び／またはそれらの製剤を含むがこれらに限定されない本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する組成物は、１つ以上の疾患のための療法としてそれを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、処置される疾患は、遺伝子またはエピジェネティックベースの疾患である。いくつかの実施形態では、処置される疾患は、遺伝子またはエピジェネティックベースの疾患ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ウイルスカプシド、ウイルス粒子、修飾細胞、及び／またはそれらの製剤を含むがこれらに限定されない本明細書に記載の筋肉特異的標的化部位の１つ以上を含有する組成物は、疾患の処置または予防（または処置または予防の一部）としてそれを必要とする対象に送達され得る。本発明の組成物、製剤、細胞などの送達によって処置及び／または予防される特定の疾患は、本発明の組成物、製剤、細胞などに連結された、それに結合した、それに含まれる、またはそうでなければそれに関連付けられたカーゴに依存し得ることが理解される。
処置され得る遺伝子疾患は、本明細書の他の個所でより詳細に論述されている（例えば、以下の遺伝子改変ベースの療法に関する論述を参照されたい）。他の疾患には、以下のいずれかが含まれるがこれらに限定されない：がん、アクベチバクター（Ａｃｕｂｅｔｉｖａｃｔｅｒ）感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ、アメーバ症、アナプラズマ病、住血線虫症、アニサキス症、炭疽病、Ａｃｒａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ感染症、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、バベシア症、細菌性髄膜炎、細菌性肺炎、細菌性膣症、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、バルトネラ症、ベイリサスカリス（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ）感染症、ＢＫウイルス感染症、黒色砂毛、芽細胞増加症（Ｂｌａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、ブラストミセス症、ボリビア出血熱、ボツリヌス中毒症、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺ペスト、バークホルデリア感染症、ブルーリ潰瘍、カリシウイルス感染症、カンピロバクター感染症、カンジダ症、毛頭虫症、カリオン病、猫ひっかき疾患、蜂巣炎、シャーガス病、軟性下疳、水痘、チクングンヤ熱、クラミジア感染症、クラミジア肺炎、コレラ、クロモブラストミコーシス、ツボカビ症、肝吸虫症、クロストリジウムディフィシル大腸炎、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱、ライノウイルス／コロナウイルス感染症（一般的な風邪）、クロイツフェルト・ヤコブ病、クリミア・コンゴ出血熱、クリプトコッカス症、クリプトスポリジウム症、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）、サイクロスポーラ症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、デスモデスムス感染症、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジナ虫症、エボラ、エキノコックス症、エーリキア症、蟯虫症、エンテロコッカス感染症、エンテロウイルス感染症、流行性発疹チフス、伝染性紅斑、突発性発疹、肝蛭症、肥大吸虫症、致死性家族性不眠症、フィラリア症、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｉｎｇｅｎｓ感染症、フソバクテリウム感染症、ガス壊疽（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｍｙｏｎｅｃｒｏｓｉｓ）、ジオトリクム症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ランブル鞭毛虫症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径部肉芽腫、Ａ群レンサ球菌感染症、Ｂ群レンサ球菌感染症、インフルエンザ菌感染症、手足口病、ハンタウイルス肺症候群、ハートランドウイルス疾患、ヘリコバクターピロリ感染症、腎臓症候群を伴う出血熱、ヘンドラウイルス感染症、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅすべての群）、単純ヘルペス、ヒストプラスマ症、鉤虫感染症、ヒトボカウイルス感染症、ヒトエウィンギ（ｅｗｉｎｇｉｉ）エールリヒア症、ヒト顆粒球アナプラズマ病、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒト単球性エールリヒア症、ヒトパピローマウイルス、膜様条虫症、エプスタイン・バー感染症、単核球症、インフルエンザ、イソポリシス（ｉｓｏｐｏｒｉｓｉｓ）、川崎病、Ｋｉｎｇｅｌｌ ｋｉｎｇａｅ感染症、クールー、ラッサ熱、レジオネラ症（リージョネア病及びポトマック熱）、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、リンパ管フィラリア症、リンパ球性脈絡髄膜炎、マラリア、マールブルグ出血熱、麻疹、中東呼吸器症候群、類鼻疽、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、メタゴニムス症、微胞子虫症、伝染性軟属腫、サル痘、おたふく風邪、発疹熱、マイコプラズマ肺炎、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ感染症、菌腫、ハエうじ症、結膜炎、ニパウイルス感染症、ノロウイルス、バリアントクロイツフェルト・ヤコブ病、ノカルジア症、オンコセルカ症、オピストルキス症、パラコクシジオイデス症、肺吸虫症、パスツレラ病、頭虱、コロモジラミ寄生症、ケジラミ寄生症、骨盤内炎症性疾患、百日咳、ペスト、肺炎球菌感染症、ニューモシスチス肺炎、肺炎、急性灰白髄炎、プレボテラ感染症、原発性アメーバ髄膜脳炎、進行性多巣性白質脳症、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、回帰熱、呼吸器合胞体ウイルス感染症、ライノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア痘瘡、リフトバレー熱、ロッキー山紅斑熱、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、ＳＡＲＳ、疥癬、猩紅熱、住血吸虫症、敗血症、細菌性赤痢、帯状疱疹、天然痘、スポロトリクム症、ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡを含む）、糞線虫症、亜急性硬化性汎脳炎、梅毒、条虫症、破傷風、白癬菌属種感染症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、トラコーマ、旋毛虫病、鞭虫症、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ感染症、渓谷熱、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、ビブリオ属種感染症、ウイルス性肺炎、ウエストナイル発熱、白色砂毛、エルシニアシュードツベルクローシス、エルシニア症、黄熱病、ゼアスポラ（Ｚｅａｓｐｏｒａ）、ジカ熱、接合菌症及びそれらの組み合わせ。
本発明の実施形態を使用して処置され得る他の疾患及び障害には、内分泌疾患（例えば、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、低血糖、グルカゴノーマ、甲状腺腫、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、甲状腺炎、甲状腺癌、甲状腺ホルモン抵抗性、副甲状腺障害、骨粗鬆症、変形性骨炎、くる病、骨軟化症、下垂体機能低下症、下垂体腫瘍など）、感染症及び非感染性起源の皮膚病態、感染性または非感染性起源の眼疾患、感染性または非感染性起源の胃腸障害、感染性または非感染性起源の心臓血管疾患、感染性または非感染性起源の脳及びニューロン疾患、感染性または非感染性起源の神経系疾患、感染性または非感染性起源の筋肉疾患、感染性または非感染性起源の骨疾患、感染性または非感染性起源の生殖器系疾患、感染性または非感染性起源の腎臓系疾患、感染性または非感染性起源の血液疾患、感染性または非感染性起源のリンパ系疾患、感染性または非感染性起源の免疫系疾患、感染性または非感染性起源の精神疾病などが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、処置される疾患は、筋肉または筋肉関連疾患または障害、例えば、遺伝性筋肉疾患または障害である。
他の疾患及び障害は、当業者によって理解される。
養子細胞療法
一般的に言えば、養子細胞移植は、細胞（自己、同種、及び／または異種）の対象への移植を含む。細胞は、対象への送達の前に改変及び／またはそうでなければ操作される場合があり、またはされない場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾細胞は、養子細胞移植療法に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾細胞は、それを必要とする対象に送達され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から単離され、本明細書に記載の本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する本発明の組成物（修飾ウイルス粒子を含むがこれに限定されない）を含有するように、及び／またはそれを生成することが可能となるようにｉｎ ｖｉｔｒｏで操作されて修飾細胞が生成され、自己様式で対象にまたは同種もしくは異種様式で異なる対象に戻るように送達され得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、真核細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、幹細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、分化した細胞であり得る。単離、操作、及び／または送達される細胞は、免疫細胞、血液細胞、内分泌細胞、腎臓細胞、外分泌腺細胞、神経系細胞、血管細胞、筋肉細胞、泌尿器系細胞、骨細胞、軟部組織細胞、心臓細胞、ニューロン、または外皮系細胞であり得る。他の特定の細胞タイプは、当業者によってすぐに理解される。
いくつかの実施形態では、単離された細胞は、本明細書の他の個所に記載されている修飾細胞となる（例えば、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾送達システム分子またはベクターを含有する及び／または発現する）ように操作され得る。そのような修飾細胞を作製する方法は、本明細書の他の個所でより詳細に記載されている。
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、埋込または移植によるものを含む、任意の好都合な様式で行われ得る。細胞または細胞集団は、患者に皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に投与され得る。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
細胞または細胞集団の投与は、体重１ｋｇ当たり１０４～１０９細胞の投与であり、またはそれを含み得、それらの範囲内の細胞数のすべての整数値を含む。いくつかの実施形態では、１０５～１０６細胞／ｋｇが送達される。養子細胞療法における投薬は、例えば、シクロホスファミドでのリンパ球枯渇の過程を伴ってまたは伴わずに、例えば、１０６～１０９細胞／ｋｇの投与を伴い得る。細胞または細胞集団は、１つ以上の用量で投与され得る。別の実施形態では、細胞の有効量は、単回用量として投与される。別の実施形態では、細胞の有効量は、ある期間にわたって複数の用量として投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断の範囲内であり、患者の臨床的状態に依存する。細胞または細胞集団は、任意の供給源、例えば、血液バンクまたはドナーから得られ得る。個々の必要性は異なるが、特定の疾患または病態のための所与の細胞タイプの有効量の最適な範囲の決定は、当業者の技術の範囲内である。有効量は、治療的または予防的利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態及び体重、存在する場合は同時処置の種類、処置の頻度及び所望の効果の特質に依存する。
別の実施形態では、それらの細胞を含む細胞または組成物の有効量は、非経口で投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、組織内の注射によって直接的に行われ得る。いくつかの実施形態では、組織は、腫瘍であり得る。
可能性のある有害な反応に対して防御するために、修飾細胞は、細胞が特定のシグナルへの曝露に対して脆弱となる導入遺伝子の形態で、導入遺伝子安全スイッチを備え得る。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子は、例えば、Ｇｒｅｃｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＴＫ－ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５；６：９５で論述されているものと類似するように修飾細胞への導入によってこのように使用され得る。そのような細胞では、ガンシクロビルまたはアシクロビルなどのヌクレオシドプロドラッグの投与は、細胞死を引き起こす。代替的な安全スイッチコンストラクトには、例えば、２つの非機能性ｉｃａｓｐ９分子を一緒にして活性酵素を形成する小分子二量体化剤の投与によって引き起こされる誘導性カスパーゼ９が含まれる。細胞増殖制御を実行する多様な代替的アプローチが記載されている（米国特許公開番号２０１３００７１４１４；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１１４６８６２；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１４０１１９８７；ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１３０４０３７１；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，２０１４，１２３／２５：３８９５－３９０５；Ｄｉ Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１６７３－１６８３；Ｓａｄｅｌａｉｎ Ｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１１；３６５：１７３５－１７３；Ｒａｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８（６）：１１０７－１５（２０１０）を参照されたい）。
単離された細胞を改変して所望の特性を有する修飾細胞を得るための方法は、本明細書の他の個所に記載されている。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を改変するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用するゲノム編集を含むがこれに限定されないゲノム改変を含み得る。これは、例えば、本明細書の他の個所に記載されている修飾ＡＡＶカプシドシステム分子の導入に加わるものであり得る。
同種細胞は、宿主免疫系によって急速に拒絶される。未照射血液製剤に存在する同種白血球は、５～６日しか存続しないことが実証された（Ｂｏｎｉ，Ｍｕｒａｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｂｌｏｏｄ １；１１２（１２）：４７４６－５４）。よって、同種細胞の拒絶を防止するために、宿主の免疫系は通常、ある程度抑制されなければならない。しかしながら、養子細胞移植の場合、免疫抑制薬の使用はまた、本明細書に記載の修飾細胞などの導入された治療細胞に対する有害効果を有する。そのため、これらの条件において養子免疫療法アプローチを効果的に使用するために、導入された細胞は、免疫抑制処置に対して抵抗性であることを必要とするであろう。よって、特定の実施形態では、本発明は、好ましくは免疫抑制剤の標的をコードする少なくとも１つの遺伝子を不活化することによって、修飾細胞を改変して免疫抑制剤に対して抵抗性とする工程をさらに含む。免疫抑制剤は、いくつかの作用メカニズムの１つによって免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン－２受容体α－鎖ブロッカー、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫抑制性代謝拮抗剤であり得るがこれらに限定されない。本発明は、修飾細胞における免疫抑制剤の標的を不活化することによって養子細胞療法のための修飾細胞に免疫抑制抵抗性を付与することが可能である。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー及びシクロフィリンファミリー遺伝子メンバーであり得る。
免疫チェックポイントは、免疫反応を遅延または停止させ、免疫細胞の制御不能な活動から過剰な組織損傷を防止する阻害経路である。特定の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、プログラム死－１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）遺伝子（ＰＤＣＤ１）である。他の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４）である。追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、ＰＤＬ１またはＫＩＲなどのＣＤ２８及びＣＴＬＡ４ Ｉｇスーパーファミリーの別のメンバーである。さらに追加の実施形態では、標的とされる免疫チェックポイントは、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７またはＴＩＭ－３などのＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである。
さらなる免疫チェックポイントには、Ｓｒｃ相同性２ドメインを含有するタンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ－１）が含まれる（Ｗａｔｓｏｎ ＨＡ，ｅｔ ａｌ．，ＳＨＰ－１：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．２０１６ Ａｐｒ １５；４４（２）：３５６－６２）。ＳＨＰ－１は、広く発現する阻害性タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）である。Ｔ細胞において、それは、抗原依存性活性化及び増殖の負の制御因子である。それは細胞質タンパク質であるため、抗体媒介療法に適さないが、活性化及び増殖におけるその役割により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞などの養子移植ストラテジーにおける遺伝子操作の魅力的な標的となる。免疫チェックポイントにはまた、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ／Ｖｓｔｍ３／ＷＵＣＡＭ／ＶＳＩＧ９）及びＶＩＳＴＡ（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｅｙｏｎｄ ＣＴＬＡ－４ ａｎｄ ＰＤ－１，ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｚ ｏｆ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４１８）が含まれ得る。
国際特許公開番号ＷＯ２０１４１７２６０６は、疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び／または活性を増加させるため及びＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を減少させる（例えば、機能的に疲弊したまたは未反応性のＣＤ８＋免疫細胞を減少させる）ためのＭＴ１及び／またはＭＴ１阻害剤の使用に関する。特定の実施形態では、メタロチオネインは、養子移植Ｔ細胞において遺伝子編集によって標的化される。
特定の実施形態では、遺伝子編集の標的は、免疫チェックポイントタンパク質の発現に関与する少なくとも１つの標的とされた遺伝子座であり得る。そのような標的には、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＰＤＬ１、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＶＩＳＴＡ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＭＴ１、ＭＴ２、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＳＨＰ－１またはＴＩＭ－３が含まれ得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４遺伝子の発現に関与する遺伝子座が標的とされる。いくつかの実施形態では、遺伝子の組み合わせ、例えば、限定されないが、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴが標的とされる。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの遺伝子が編集される。遺伝子の対には、ＰＤ１及びＴＣＲα、ＰＤ１及びＴＣＲβ、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲα、ＣＴＬＡ－４及びＴＣＲβ、ＬＡＧ３及びＴＣＲα、ＬＡＧ３及びＴＣＲβ、Ｔｉｍ３及びＴＣＲα、Ｔｉｍ３及びＴＣＲβ、ＢＴＬＡ及びＴＣＲα、ＢＴＬＡ及びＴＣＲβ、ＢＹ５５及びＴＣＲα、ＢＹ５５及びＴＣＲβ、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲα、ＴＩＧＩＴ及びＴＣＲβ、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲα、Ｂ７Ｈ５及びＴＣＲβ、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲα、ＬＡＩＲ１及びＴＣＲβ、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲα、ＳＩＧＬＥＣ１０及びＴＣＲβ、２Ｂ４及びＴＣＲα、２Ｂ４及びＴＣＲβが含まれ得るがこれらに限定されない。
修飾細胞（修飾Ｔ細胞など（例えば、単離された細胞はＴ細胞である）の遺伝子的または他の改変の前または後にかかわらず、修飾細胞は、通常、例えば、米国特許６，３５２，６９４；６，５３４，０５５；６，９０５，６８０；５，８５８，３５８；６，８８７，４６６；６，９０５，６８１；７，１４４，５７５；７，２３２，５６６；７，１７５，８４３；５，８８３，２２３；６，９０５，８７４；６，７９７，５１４；６，８６７，０４１；及び７，５７２，６３１に記載されている方法を使用して活性化され、増殖させられ得る。修飾細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させられ得る。
いくつかの実施形態では、方法は、潜在的アロ反応性ＴＣＲまたは他の受容体を排除して同種養子移植を可能とするために、本明細書の他の個所に記載されている好適な遺伝子改変方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介する遺伝子編集）によってｅｘ ｖｉｖｏで修飾細胞を編集することを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは他の好適なゲノム改変技術によってｅｘ ｖｉｖｏで編集されて、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を回避するためにＴＣＲ（例えば、αβＴＣＲ）または他の関連受容体をコードする内因性遺伝子がノックアウトまたはノックダウンされる。いくつかの実施形態では、修飾細胞がＴ細胞である場合、修飾細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子座を変異させるためにＣＲＩＳＰＲまたは他の適切な遺伝子改変方法によってｅｘ ｖｉｖｏで編集される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＲＡＣの第１エクソンを標的とする１つ以上のガイド配列を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介してｅｘ ｖｉｖｏで編集される。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５４－１５７（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの第１エクソンは、別の適切な遺伝子改変方法を使用して改変される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外因性遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子座にノックインする一方で、内因性ＴＣＲ（例えば、ＣＡＲ ｃＤＮＡの後に自己切断型Ｐ２Ａペプチドをコードするドナー配列を有する）を同時にノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲまたは他の適切な方法の使用を含む。Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）を参照されたい。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子は、内因性ＴＣＲプロモーターの下流に機能可能に挿入されるプロモーターを欠くＣＡＲをコードするまたはＴＣＲをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、修飾細胞、例えば、修飾Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介して編集して、ＨＬＡ－Ｉタンパク質をコードする内因性遺伝子をノックアウトまたはノックダウンして、編集された細胞、例えば、修飾Ｔ細胞の免疫原性を最小化することを含む。いくつかの実施形態では、修飾Ｔ細胞は、ベータ－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座を変異させるためにｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介して編集され得る。いくつかの実施形態では、修飾細胞、例えば、修飾Ｔ細胞は、Ｂ２Ｍの第１エクソンを標的とする１つ以上のガイド配列を使用してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介してｅｘ ｖｉｖｏで編集される。Ｂ２Ｍの第１エクソンはまた、別の適切な改変方法を使用して改変され得る。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：１５４－１５７（２０１７）を参照されたい。Ｂ２Ｍの第１エクソンはまた、当業者によって理解される別の適切な改変方法を使用して改変され得る。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用して、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする外因性遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子座にノックインする一方で、同時に内因性Ｂ２Ｍ（例えば、ＣＡＲ ｃＤＮＡの後に自己切断型Ｐ２Ａペプチドをコードするドナー配列を有する）をノックアウトする。Ｅｙｑｕｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５４３：１１３－１１７（２０１７）を参照されたい。これはまた、当業者によって理解される別の適切な改変方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、外因性遺伝子は、内因性Ｂ２Ｍプロモーターの下流に機能可能に挿入されるプロモーターを欠くＣＡＲをコードするまたはＴＣＲをコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、修飾細胞、例えば、修飾Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介して編集して、外因性ＣＡＲまたはＴＣＲによって標的とされる抗原をコードする内因性遺伝子をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。これはまた、当業者によって理解される別の適切な改変方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、修飾細胞、例えば、修飾Ｔ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介して編集されて、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、スルビビン、マウスダブルミニッツ２ホモログ（ＭＤＭ２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ １（ＣＹＰ１Ｂ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）、リビン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、ＭＵＣ１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ｐ５３またはサイクリン（ＤＩ）（ＷＯ２０１６／０１１２１０を参照されたい）から選択される腫瘍抗原の発現がノックアウトまたはノックダウンされる。これはまた、当業者によって理解される別の適切な改変方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、修飾細胞、例えば、修飾Ｔ細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを介して編集されて、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用因子（ＴＡＣＩ）、またはＢ細胞活性化因子受容体（ＢＡＦＦ－Ｒ）、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＣＳ－１、ＣＤ３３、ＣＤ２６、ＣＤ３０、ＣＤ５３、ＣＤ９２、ＣＤ１００、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２００、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、またはＣＤ３６２（ＷＯ２０１７／０１１８０４を参照されたい）から選択される抗原の発現がノックアウトまたはノックダウンされる。これはまた、当業者によって理解される別の適切な改変方法を使用して達成され得る。
遺伝子ドライブ
本発明はまた、１つ以上のカーゴポリヌクレオチドの送達を介して遺伝子ドライブを発生させるための本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物、その製剤、その細胞、ベクターシステムなどの使用または遺伝子ドライブを発生させることが可能な１つ以上のカーゴポリヌクレオチドを有する本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物（修飾ＡＡＶカプシド粒子を含むがこれに限定されない）の生成を企図する。いくつかの実施形態では、遺伝子ドライブは、Ｃａｓ媒介ＲＮＡガイド遺伝子ドライブ、例えば、Ｃａｓ提供ＲＮＡガイド遺伝子ドライブ、例えば、国際特許公開ＷＯ２０１５／１０５９２８に記載の遺伝子ドライブに類似するシステムにおけるものであり得る。この種のシステムは、例えば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸配列を生殖系列細胞に導入することによって真核生殖系列細胞を変化させるための方法を提供し得る。ガイドＲＮＡは、生殖系列細胞のゲノムＤＮＡ上の１つ以上の標的位置と相補的となるように設計され得る。ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼをコードする核酸配列及びガイドＲＮＡをコードする核酸配列は、生殖系列細胞がＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを発現し得るように配置されたプロモーターと共に、コンストラクト上でフランキング配列の間に提供され得、またフランキング配列の間に位置し任意の所望のカーゴをコードする配列を伴う。フランキング配列は典型的には、生殖系列細胞を外来核酸配列についてホモ接合性とするために相同組換えなどのメカニズムによって標的切断部位でゲノムＤＮＡへの外来核酸コンストラクト配列の挿入を容易化するためにコンストラクトによってコードされる成分と共にフランキング配列が作用するように、選択された標的染色体上の対応する配列と同一の配列を含む。このように、遺伝子ドライブシステムは、繁殖集団を通して所望のカーゴ遺伝子を遺伝子移入することが可能である（Ｇａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｆｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｖｅｃｔｏｒ ｍｏｓｑｕｉｔｏ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ，ＰＮＡＳ ２０１５，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２３，２０１５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１５２１０７７１１２；Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｅＬｉｆｅ ２０１４；３：ｅ０３４０１）。選抜実施形態では、ゲノムにおける潜在的オフターゲット部位がほとんどない標的配列が選択され得る。複数のガイドＲＮＡを使用して標的遺伝子座内の複数の部位を標的とすることは、切断頻度を増加させ、ドライブ耐性アレルの進化を妨げ得る。切断型ガイドＲＮＡは、オフターゲット切断を減少させ得る。対合したニッカーゼは、特異性をさらに増加させるために単一のヌクレアーゼの代わりに使用され得る。遺伝子ドライブコンストラクト（遺伝子ドライブ修飾送達システムコンストラクトなど）は、例えば、相同組換え遺伝子を活性化するために及び／または非相同末端結合を抑制するために、転写制御因子をコードするカーゴ配列を含み得る。標的部位は、必須の遺伝子内から選択され得、これにより非相同末端結合事象は、ドライブ耐性アレルを生成するのではなく、致死性を引き起こし得る。遺伝子ドライブコンストラクトは、様々な温度で様々な宿主において機能するように修飾され得る（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（８）：ｅ７２３９３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７２３９３）。
移植及び異種移植
本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物、その製剤、その細胞、ベクターシステムなどは、カーゴポリヌクレオチドを送達するために使用され得、及び／またはそうでなければ異なる２人の間（移植）または種間（異種移植）の移植のための組織の改変に関与し得る。トランスジェニック動物の生成のためのそのような技術は、本明細書の他の個所に記載されている。種間移植技術は通常、当該技術分野で知られている。例えば、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、本明細書に記載の本発明の修飾ウイルス粒子または他の送達ビヒクル、ポリヌクレオチド、ベクター、及び／または修飾細胞を介して使用して送達され得、例えば、ヒト免疫系によって認識されるエピトープをコードする遺伝子、すなわち、異種抗原遺伝子の発現を破壊することによって、移植（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ（例えば、収集後であるが移植前）またはｉｎ ｖｉｖｏ（ドナーまたはレシピエントにおけるもの））のための器官、トランスジェニックブタ（ヒトヘムオキシゲナーゼ－１トランスジェニックブタ系統など）などの動物における選択された遺伝子をノックアウト、ノックダウンまたは破壊するために使用され得る。破壊のためのブタ遺伝子候補には、例えば、α（ｌ，３）－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びシチジンモノホスフェート－Ｎ－アセチルノイラミン酸ヒドロキシラーゼ遺伝子（国際特許公開ＷＯ２０１４／０６６５０５を参照されたい）が含まれ得る。また、内因性レトロウイルスをコードする遺伝子、例えば、すべてのブタ内因性レトロウイルスをコードする遺伝子が破壊され得る（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＰＥＲＶｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１５：Ｖｏｌ．３５０ ｎｏ．６２６４ ｐｐ．１１０１－１１０４を参照されたい）。また、ＲＮＡでガイドされるＤＮＡヌクレアーゼは、超急性拒絶反応に対する保護を改善するためにヒトＣＤ５５遺伝子などの異種移植ドナー動物におけるさらなる遺伝子の組み込みのための部位を標的とするために使用され得る。
種間移植（ヒトからヒトなど）である場合、本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物、または筋肉特異的標的化部位を含有する組成物（例えば、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾送達粒子）は、カーゴポリヌクレオチドを送達するために使用され、及び／またはそうでなければ移植される組織を改変するために含まれ得る。いくつかの実施形態では、改変は、免疫原性プロファイルが、レシピエントによる拒絶反応の発生を減少させるようにドナーのものよりもレシピエントの免疫原性プロファイルと類似するまたは同一となるように、１つ以上のＨＬＡ抗原または他の組織タイプ決定基を改変することを含み得る。関連する組織タイプ決定基は、当該技術分野で知られており（器官適合性を決定するために使用されるものなど）、免疫原性プロファイル（組織タイプ決定基の発現シグネチャから構成される）を決定するための技術は通常、当該技術分野で知られている。
いくつかの実施形態では、ドナー（収集前など）またはレシピエント（移植後）は、移植細胞、組織、及び／または器官の免疫原性プロファイルを改変することが可能な本明細書に記載の本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物、その製剤、その細胞、ベクターシステム、修飾筋肉特異的送達システム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾送達粒子の１つ以上を受け取り得る。いくつかの実施形態では、移植される細胞、組織、及び／または器官は、ドナーから収集され得、例えば、免疫原性が低下するようにまたはレシピエントに移植された場合にいくらかの特定の特性を有するように改変されるように収集された細胞、組織、及び／または器官を改変することが可能な本明細書に記載の本明細書の他の個所に記載されている筋肉特異的標的化部位を含有する組成物、その製剤、その細胞、ベクターシステム、修飾筋肉特異的送達システム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾送達粒子が、収集された細胞、組織、及び／または器官にｅｘ ｖｉｖｏで送達され得る。送達後、細胞、組織、及び／または器官は、ドナーに移植され得る。
遺伝子的またはエピジェネティック的態様での疾患の遺伝子改変及び処置
筋肉特異的標的化部位を含有する本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾送達粒子は、遺伝子的及び／またはエピジェネティック的態様を用いて遺伝子または他のポリヌクレオチドを改変するために及び／または疾患を処置するために使用され得る。本明細書の他の個所に記載されているように、カーゴ分子は、細胞に送達され得る、いくつかの実施形態では、細胞のゲノムに組み込まれ得るポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、カーゴ分子（複数可）は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム成分であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ成分は、本発明の組成物またはその製剤、例えば、本明細書に記載の修飾筋肉特異的ウイルス粒子または他の修飾送達ビヒクルによって送達される場合、任意にレシピエント細胞で発現させられ、配列特異的様式でレシピエント細胞のゲノムを改変するように作用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ウイルス粒子または他の修飾送達ビヒクル及び／または組成物にパッケージングされ、それによって送達され得るカーゴ分子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓに依存しない方法を介してゲノム改変を容易化／媒介し得る。そのような非ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム改変システムは、当業者によって即座に理解され、また、本明細書の他の個所に少なくとも部分的に記載されている。いくつかの実施形態では、改変は、特定の標的配列におけるものである。他の実施形態では、改変は、ゲノム全体を通してランダムに見える位置におけるものである。
疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例ならびに疾患に特異的な情報は、ワールドワイドウェブで利用可能なＭｃＫｕｓｉｃｋ－Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から利用可能である。これらのいずれかは、本明細書に記載の方法の１つ以上によって処置されることが適切であり得る。いくつかの実施形態では、疾患は、筋肉疾患または障害、神経筋疾患または障害、または心筋症である。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、以下のうちの任意の１つ以上から選択される：
（ａ）自己免疫疾患；
（ｂ）がん；
（ｃ）筋ジストロフィー；
（ｄ）神経筋疾患；
（ｅ）糖またはグリコーゲン蓄積症；
（ｆ）伸長リピート病；
（ｇ）ドミナントネガティブ疾患；
（ｈ）心筋症；
（ｉ）ウイルス性疾患；
（ｊ）早老性疾患；または
（ｋ）それらの任意の組み合わせ。
いくつかの実施形態では、伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。いくつかの実施形態では、筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである。いくつかの実施形態では、筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である。いくつかの実施形態では、ＬＧＭＤは、サブタイプ２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、または２Ｌである。いくつかの実施形態では、心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である。いくつかの実施形態では、糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である。いくつかの実施形態では、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である。いくつかの実施形態では、神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である。
より具体的には、これらの遺伝子及び経路における変異は、不適切なタンパク質または機能に影響を及ぼす不適切な量のタンパク質の生成をもたらし得る。遺伝子、疾患及びタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮出願６１／７３６，５２７から参照により本明細書に組み込まれる。そのような遺伝子、タンパク質及び経路は、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドであり得る。疾患関連及び／または細胞機能関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例が表Ａ及びＢに列挙されている。
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よって、本明細書には、（ｉｎ ｖｉｔｒｏで、すなわち、単離された真核細胞において）本明細書で論述される真核または原核細胞において１つ以上の変異を誘導する方法であって、本明細書に記載されるベクターを細胞に送達することを含む、方法も記載されている。変異（複数可）は、細胞（複数可）の標的配列での１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での１～７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。変異は、各標的配列での１、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む。変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または７５ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。変異は、前記細胞（複数可）の各標的配列での５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、または９９００～１００００ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって媒介されるものなどの、核酸成分（例えば、ガイド（複数可）ＲＮＡ（複数可）またはｓｇＲＮＡ（複数可））を介して前記細胞（複数可）の各標的配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。
いくつかの実施形態では、改変は、非ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムまたは技術を介して前記細胞（複数可）の標的またはランダム配列におけるヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。そのような技術は、修飾細胞ならびに修飾細胞及び生物を生成する方法が論述されている場所などの本明細書の他の個所で論述されている。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用する場合の毒性及びオフターゲット効果を最小化するために、送達されるＣａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であり得る。Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞または非ヒト真核生物動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、ディープシーケンシングを使用して潜在的オフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度を分析することによって決定され得る。代替的には、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小化するために、ＣａｓニッカーゼｍＲＮＡ（例えばＤ１０Ａ変異を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９様）が、対象となる部位を標的とする１対のガイドＲＮＡと共に送達され得る。毒性及びオフターゲット効果を最小化するためのガイド配列及びストラテジーは、ＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）におけるもの；または、本明細書のように変異を介するものであり得る。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む）の形成は、標的配列においてまたはその近く（例えば、それから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはそれ以上の塩基対内）で一方または両方の鎖の切断をもたらす。理論に縛られることを望むものではなく、野生型ｔｒａｃｒ配列のすべてまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５もしくはそれより多く、またはそれ以上のヌクレオチド）を含み、またはそれからなり得るｔｒａｃｒ配列はまた、ガイド配列に機能可能に連結されたｔｒａｃｒメイト配列のすべてまたは一部への、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションなどによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。
一実施形態では、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ分子をカーゴ分子として有する本明細書に記載の修飾細胞及び／または本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシド粒子を対象及び／または細胞に送達することを含む。送達されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子（複数可）は、複合体化して標的ポリヌクレオチドに結合し、例えば、前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変し得、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体化されるＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒメイト配列に連結され得、これはひいてはｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置で一本鎖または二本鎖を切断することを含む。いくつかの実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって前記切断された標的ポリヌクレオチドを修復することをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。いくつかの実施形態では、前記変異は、標的配列を含む遺伝子から発現したタンパク質における１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、１つ以上のベクターは、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、そのようなＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象における真核細胞に送達される。いくつかの実施形態では、前記改変は、細胞培養物中の前記真核細胞において行われる。いくつかの実施形態では、方法は、前記改変の前に対象から前記真核細胞を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、前記真核細胞及び／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、１つ以上の修飾ウイルス粒子または他の修飾送達ビヒクルが単離された細胞に送達された後に対象に戻され得る。いくつかの実施形態では、単離された細胞は、本明細書に記載の修飾送達システムの１つ以上の分子を単離された細胞に送達した後に対象に戻され、これにより、単離された細胞を前述した修飾細胞にし得る。
スクリーニング及び細胞選択
本明細書に記載の修飾筋肉特異的送達システムベクター、修飾細胞、修飾ウイルス粒子、及び／または修飾筋肉特異的送達システムは、スクリーニングアッセイ及び／または細胞選択アッセイにおいて使用され得る。本発明の修飾送達システムベクター、修飾細胞、及び／または修飾ウイルス粒子、及び／または他の修飾送達システムは、対象及び／または細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏであり得る。本明細書に記載の修飾送達システム分子、送達ビヒクル、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾ウイルス粒子は、外因性分子または化合物を、それらが送達される対象または細胞に導入し得る。外因性分子または化合物の存在が検出され得、細胞及び／またはその属性の同定を可能にし得る。いくつかの実施形態では、送達される分子または粒子は、遺伝子または他のヌクレオチド改変（例えば、変異、遺伝子またはポリヌクレオチド挿入及び／または欠失など）を付与し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド改変は、シーケンシングによって細胞において検出され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド改変は、細胞の検出、同定、及び／または選択を可能とする、細胞における検出可能な表現型変化をもたらす細胞に対する生理的及び／または生物学的改変をもたし得る。標的ポリヌクレオチドに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の結合が細胞死をもたらす実施形態などのいくつかの実施形態では、表現型変化は、細胞死であり得る。本発明の実施形態は、選択マーカーまたは対抗選択システムを含み得る２工程プロセスを必要とせずに特定の細胞の選択を可能とする。細胞（複数可）は、原核細胞または真核細胞であり得る。
一実施形態では、本発明は、１つ以上の細胞（複数可）における遺伝子において１つ以上の変異を導入することによって１つ以上の細胞（複数可）を選択する方法であって、方法は、本明細書の他の個所に記載されている１つ以上の修飾送達システム分子またはベクターを含み得る１つ以上のベクターを細胞（複数可）に導入することであって、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及び／またはｔｒａｃｒメイト配列に連結されたガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、及び編集鋳型；または細胞及び／またはそのゲノムに挿入される他のポリヌクレオチドの１つ以上の発現を誘導し得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素及び／または編集鋳型によって内部で発現され、ｉｎ ｖｉｖｏで発現されるものは、含まれる場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素切断を無効にする１つ以上の変異を含む）、導入すること；編集鋳型と細胞（複数可）における標的ポリヌクレオチドとの相同組換えが選択されるようにすること；ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて、前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断を達成することを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズされるガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズされるｔｒａｃｒメイト配列と複合体化されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、標的ポリヌクレオチドに対するＣＲＩＳＰＲ複合体の結合は、細胞死を誘導し、それにより１つ以上の変異が導入された１つ以上の細胞（複数可）が選択されるようにする、方法を提供する。好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓタンパク質である。本発明の別の実施形態では、選択される細胞は、真核細胞であり得る。
修飾ＡＡＶカプシドシステム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾ＡＡＶカプシド粒子（１つ以上のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を細胞に送達するものを含むがこれに限定されない）を含むスクリーニング方法は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの検出方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質を含む修飾ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの１つ以上の成分は、本明細書の他の個所に記載されている修飾筋肉特異的標的化部位を含む修飾送達システム分子（修飾ウイルス粒子または他の修飾送達ビヒクルなど）、修飾細胞、または他の組成物によって細胞に送達され、ＦＩＳＨ法において使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＤＮＡ二本鎖破断をもたらす能力を欠く不活化Ｃａｓタンパク質（ｄＣａｓ）（例えば、ｄＣａｓ９）を含み得、マーカー、例えば、蛍光タンパク質、例えば、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＥＧＦＰ）と融合され、挟動原体、セントロメア及びテロメアリピートをｉｎ ｖｉｖｏで標的とするために低分子ガイドＲＮＡと共発現され得る。ｄＣａｓシステムは、ヒトゲノムにおける反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化するために使用され得る。標識されたｄＣａｓ、ｄＣａｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、修飾ＡＡＶ送達システム分子、修飾細胞、及び／または修飾送達粒子（ウイルス性または非ウイルス性）のそのような新たな適用は、特に小核体積または複合３Ｄ構造に関する場合、細胞の画像化及び機能性核構造の研究において使用され得る。（Ｃｈｅｎ Ｂ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＬＡ，Ｃｉｍｉｎｉ ＢＡ，Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，Ｌｉ ＧＷ，Ｐａｒｋ Ｊ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＥＨ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＪＳ，Ｑｉ ＬＳ，Ｈｕａｎｇ Ｂ．２０１３．Ｄｙｎａｍｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｏｃｉ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ １５５（７）：１４７９－９１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．１２．００１．（その教示は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムに適用及び／または適応され得る）。マーカー（例えば、蛍光マーカー）に融合されたポリヌクレオチドを含む同様のアプローチは、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドシステム分子、ベクター、修飾細胞、及び／または修飾ＡＡＶカプシド粒子を介して細胞に送達され、細胞のゲノムに組み込まれ、及び／またはそうでなければＦＩＳＨ分析のために細胞のゲノムの領域と相互作用し得る。
他の細胞小器官及び他の細胞構造を研究するための同様のアプローチは、細胞に（例えば、本明細書に記載の修飾送達ＡＡＶカプシド分子、修飾細胞、及び／または修飾ＡＡＶカプシド粒子を介して）マーカー（蛍光マーカーなど）に融合された１つ以上の分子を送達することによって達成され得、マーカーに融合された分子は、１つ以上の細胞構造を標的とすることが可能である。マーカーの存在を分析することによって、特定の細胞構造を同定及び／または画像化し得る。
いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的送達システム分子は、細胞の中または外でのスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。いくつかの実施形態では、スクリーニングアッセイは、本発明の修飾筋肉特異的送達粒子を介してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓカーゴ分子（複数可）を送達することを含み得る。
スクリーニングにおける本システムの使用はまた、本発明、例えば、機能獲得スクリーニングによって提供される。遺伝子を人工的に過剰発現させた細胞は、例えば、ネガティブフィードバックループによって、遺伝子を経時的に下方制御することができる（平衡の復元）。スクリーニングが開始する時までに、制御されていない遺伝子は再度低減され得る。他のスクリーニングアッセイは、本明細書の他の個所で論述されている。
実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ送達方法からのまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ送達方法の細胞であって、方法は、送達システムを細胞、任意に真核細胞と接触させることであって、これにより送達システムの構成要素の細胞への送達が生じる、接触させること、及び任意に接触からのデータまたは結果を得ること、ならびにデータまたは結果を送信することを含む、細胞を提供する。
実施形態では、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ送達方法からのまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ送達方法の細胞であって、方法は、送達システムを細胞、任意に真核細胞と接触させることであって、これにより送達システムの構成要素の細胞への送達が生じる、接触させること、及び任意に接触からのデータまたは結果を得ること、ならびにデータまたは結果を送信することを含み、細胞生成物は、送達システムと接触していない細胞と比較して変化し、例えば、接触がなければ細胞の野生型であったであろうものから変化する、細胞を提供する。実施形態では、細胞生成物は、非ヒトまたは動物である。いくつかの実施形態では、細胞生成物は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターで一過性にまたは非一過性にトランスフェクションされる。いくつかの実施形態では、細胞は、任意に再導入される対象において自然に生じるようにトランスフェクションされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションされる細胞は、対象から取得される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から採取された細胞から得られ、またはそれに由来にするものであり、例えば、細胞株である。修飾筋肉特異的送達システム及びその粒子の送達メカニズム及び技術は、本明細書の他の個所に記載されている。
いくつかの実施形態では、修飾筋肉特異的送達システム分子（複数可）を宿主細胞に直接的に導入することが想定される。例えば、修飾筋肉特異的送達システム分子（複数可）は、修飾筋肉特異的ウイルス粒子にパッケージングされた、または非ウイルス性修飾筋肉特異的送達粒子に含有されたまたは連結された１つ以上のカーゴ分子と共に送達され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、修飾ウイルス粒子（修飾筋肉特異的ＡＡＶ粒子など）にパッケージングされる修飾送達分子及びカーゴ分子を細胞において発現させる方法であって、本明細書に開示されるベクター送達システムのいずれかによるベクターを導入する工程を含み得る、方法を提供する。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定するものではない。
実施例１－ｍＲＮＡベースの検出方法は、ＡＡＶバリアントの選択にとってより厳格である。
図１は、ｍＲＮＡの生成をもたらすアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入メカニズムを示している。図１に示されているように、ＡＡＶ粒子による細胞の機能性形質導入は、ｍＲＮＡ鎖の生成をもたらし得る。非機能的な形質導入は、ウイルスゲノムがＤＮＡベースのアッセイを使用して検出可能であるにもかかわらず、そのような生成物を生成しないであろう。よって、例えば、ＡＡＶによる形質導入を検出するためのｍＲＮＡベースの検出アッセイは、より厳格であり、細胞を機能的に形質導入することができるウイルス粒子の機能性に関するフィードバックを提供し得る。図２は、ＡＡＶバリアントのｍＲＮＡベースの選択がＤＮＡベースの選択よりも厳格であり得ることを実証し得るグラフを示している。ウイルスライブラリは、ＣＭＶプロモーターの制御下で発現させた。
実施例２－ｍＲＮＡベースの検出方法は、カプシドバリアントライブラリからＡＡＶカプシドバリアントを検出するために使用され得る
図３Ａ～３Ｂは、肝臓におけるウイルスライブラリとベクターゲノムＤＮＡ（図３Ａ）及びｍＲＮＡ（図３Ｂ）との相関関係を実証し得るグラフを示している。図４Ａ～４Ｆは、異なる組織で同定されたｍＲＮＡレベルで発現したカプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。
実施例３－カプシドｍＲＮＡ発現は、組織特異的プロモーターによって誘導され得る
図５Ａ～５Ｃは、細胞タイプ特異的プロモーター（ｘ軸に示されている）の制御下での異なる組織におけるカプシドｍＲＮＡ発現を実証し得るグラフを示している。ＣＭＶは、例示的な構成的プロモーターとして含めた。ＣＫ８は、筋肉特異的プロモーターである。ＭＨＣＫ７は、筋肉特異的プロモーターである。ｈＳｙｎは、ニューロン特異的プロモーターである。
実施例４－カプシドバリアントライブラリ生成、バリアントスクリーニング、及びバリアント同定
通常、ＡＡＶカプシドライブラリは、適切なＡＡＶプロデューサー細胞株において前述の修飾ＡＡＶカプシドポリヌクレオチドをそれぞれ含有する修飾カプシドベクターを発現させることによって生成され得る。例えば、図８を参照されたい。これは、１つ以上の所望の細胞特異的修飾ＡＡＶカプシドバリアントを含有し得るＡＡＶカプシドライブラリを生成し得る。図７は、ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成する実施形態、特にランダムｎ－ｍｅｒ（ｎ＝３～１５アミノ酸）の野生型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９への挿入を示す概略図を示している。この例では、ランダム７－ｍｅｒをＡＡＶ９ウイルスタンパク質の可変領域ＶＩＩＩのａａ５８８～５８９の間に挿入し、１つのベクター当たり１つのバリアントを有するウイルスゲノム含有ベクターを形成するために使用した。図８に示されているように、カプシドバリアントベクターライブラリを使用して、各カプシドバリアントがそのコーディング配列をベクターゲノムとして封入したＡＡＶ粒子を生成した。図９は、ＡＡＶカプシドバリアントライブラリを生成するためにＡＡＶベクターシステムにおいて使用され得る代表的なＡＡＶカプシドプラスミドライブラリベクターのベクターマップを示している（例えば、図８を参照されたい）。ライブラリは、組織特異的プロモーターまたは構成的プロモーターの制御下でカプシドバリアントポリヌクレオチドを用いて生成され得る。ライブラリはまた、ポリアデニル化シグナルを含んでいたカプシドバリアントポリヌクレオチドを用いて生成された。
図６に示されているように、ＡＡＶカプシドライブラリは、第１ラウンドのｍＲＮＡベースの選択のために様々な非ヒト動物に投与され得る。図１に示されているように、ＡＡＶ及び関連ベクターによる形質導入プロセスは、細胞を形質導入したウイルスのゲノムを反映するｍＲＮＡ分子の生成をもたし得る。少なくとも本明細書の実施例において実証されるように、ｍＲＮＡベースの選択は、細胞を機能的に形質導入することが可能なウイルス粒子を決定するのにより特異的かつ有効であり得るが、その理由は、それが、ウイルスＤＮＡの存在を測定することによって細胞におけるウイルス粒子の存在を検出することだけとは対照的に、生成された機能性生成物に基づいているからである。
第１ラウンドの投与後、所望のカプシドバリアントを有する１つ以上の修飾ＡＡＶウイルス粒子は次いで、フィルタリングされたＡＡＶカプシドライブラリを形成するために使用され得る。所望のＡＡＶウイルス粒子は、カプシドバリアントのｍＲＮＡ発現を測定し、どのバリアントが所望ではない細胞タイプ（複数可）と比較して所望の細胞タイプ（複数可）において高度に発現するかを決定することによって同定され得る。所望の細胞、組織、及び／または器官タイプで高度に発現するものは、所望のＡＡＶカプシドバリアント粒子である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、所望の細胞、組織、または器官において選択的活性を有する組織特異的プロモーターの制御下にある。
第１ラウンドから同定された修飾ＡＡＶカプシドバリアント粒子は次いで、様々な非ヒト動物に投与され得る。いくつかの実施形態では、選択及び同定の第２ラウンドにおいて使用される動物は、第１ラウンドの選択及び同定のために使用されたそれらの動物と同じではない。ラウンド１と同様に、投与後、所望の細胞、組織、及び／または器官タイプ（複数可）における上位発現バリアントが、細胞におけるウイルスｍＲＮＡ発現を測定することによって同定され得る。ラウンド２後に同定された上位バリアントは次いで、任意にバーコーディングされ、任意にプールされ得る。いくつかの実施形態では、第２ラウンドからの上位バリアントは次いで、特に上位バリアントの最終使用がヒトにおけるものである場合、上位細胞特異的バリアント（複数可）を同定するために非ヒト霊長類に投与され得る。各ラウンドでの投与は、全身性であり得る。
図１０は、異なるプロモーターを使用して生成されたライブラリによって生成されたウイルス力価（ＡＡＶ９ベクターゲノム／１５ｃｍディッシュとして計算される）を実証し得るグラフを示している。図１０に示されるように、ウイルス力価は、異なるプロモーターの使用によって有意に影響を受けなった。
図１１Ａ～１１Ｆは、ＭＨＣＫ７筋肉特異的プロモーターの制御下で発現したカプシドライブラリを使用したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける第１ラウンドの選択の後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。
図１２Ａ～１２Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける選択の第２ラウンドの後に得られた結果を実証し得るグラフを示している。
図１３Ａ～１３Ｂは、同義コドンによってコードされるバリアントの存在量間の相関関係を実証し得るグラフを示している。このグラフは、ウイルスライブラリ及び機能性ウイルス粒子の両方においてコドンの偏りがほどんどないか全くないことを実証し得る。
図１４は、２つの異なる筋肉特異的プロモーター（ＭＨＣＫ７及びＣＫ８）の制御下で発現した同じバリアントの存在量間の相関関係を実証し得るグラフを示している。このグラフは、少なくとも筋肉細胞について、組織特異的プロモーターがカプシドバリアントライブラリを生成するために使用される効果がほとんどないことを実証し得る。
実施例５－筋肉指向性ｒＡＡＶカプシド
図１５は、野生型ＡＡＶ９カプシドと同様の力価を有するｒＡＡＶを生成する筋肉指向性カプシドバリアントを実証し得るグラフを示している。
図１６は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像を示している。
図１７は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像のパネルを示している。
図１８は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る画像のパネルを示している。
図１９は、種にわたる筋肉指向性遺伝子送達のための有力なカプシドバリアントの選択の概略図を示している。
図２０Ａ～２０Ｃは、異なる系統のマウスにおける選択を実証し得る表が、上位の筋肉指向性ヒットと同じバリアントを同定することを示している。
実施例６－ＭｙｏＡＡＶ及びＡＡＶ９及びＡＡＶ８の比較
先に論述されているように、図１７は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得る。
図２１は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス筋肉形質導入の比較を実証し得る画像を示している。
図２２は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のマウス組織形質導入の比較を実証し得るグラフを示している。
図２３は、ｒＡＡＶ９－ＧＦＰとｒＭｙｏＡＡＶ－ＧＦＰとの間のベクターゲノム生体内分布の比較を実証し得るグラフを示している。
図２４Ａ～２４Ｂは、ＡＡＶ９及びＡＡＶ８と比較して、ＭｙｏＡＡＶによる筋肉におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子発現のより速い動態を実証し得る画像を示している。
図２５は、ＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲまたはＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲによるモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正のメカニズムを実証し得る。
図２６Ａ～２６Ｃは、ＡＡＶ９－ＣＲＩＳＰＲと比較したＭｙｏＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲを用いたモデルｍｄｘマウスにおけるＤＭＤ変異の修正を実証し得る。
図２７は、ＭｙｏＡＡＶが受容体としてのインテグリンヘテロ二量体を使用して細胞に入ることを実証し得る。
図２８は、ｍｙｏＡＡＶが、ＡＡＶ９よりも効率的にマウス及びヒトの両方の一次筋管を形質導入し得ることを実証し得るグラフを示している。
図２９Ａ～２９Ｂは、インテグリンアルファＶ小分子阻害剤がＭｙｏＡＡＶによるヒト及びマウス一次筋管の形質導入を抑制することを実証し得る。
実施例７－非ヒト霊長類における上位ｎ－ｍｅｒモチーフ。
筋肉特異的ＡＡＶカプシドを筋肉特異的プロモーターを使用して生成し、得られたカプシドライブラリを、本明細書の他の個所及び／または米国仮出願整理番号６２／８９９，４５３、６２／９１６，２０７、６３／０１８，４５４、６３／０５５，２５２、及び６２／９１６，２２１ならびに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／５０５３４に記載されているように非ヒト霊長類においてスクリーニングした。表８及び９は、筋肉特異的ｎ－ｍｅｒモチーフの上位ヒット及びそれらのコーディング配列を各表におけるランク順で示している。
Figure 2022551986000146
Figure 2022551986000147
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Figure 2022551986000155
Figure 2022551986000156
筋肉特異的ＡＡＶカプシドを２つの異なる筋肉特異的プロモーターからの発現を使用して生成し、各プロモーターについて得られたカプシドライブラリを、本明細書の他の個所及び／または米国仮出願整理番号６２／８９９，４５３、６２／９１６，２０７、６３／０１８，４５４、６３／０５５，２５２、及び６２／９１６，２２１ならびに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／５０５３４に記載されているように非ヒト霊長類においてスクリーニングした。
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本発明の記載される方法、薬学的組成物、及びキットの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明らかになる。本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、さらなる改変が可能であること及び特許請求された本発明が、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解される。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための記載された態様の様々な改変は、本発明の範囲内であることが意図されている。本出願は、一般に、本発明の原理に原則に従う本発明の任意の変形、使用、または適応であって、本発明に関する分野において既知の慣行実務の範囲内に入り、かつ前述の本質的特徴に適用され得る本開示からの逸脱を含むものを包含することが意図される。

Claims (87)

  1. 筋肉細胞を標的とするのに有効な標的化部位であって、前記標的化部位は、ｎ－ｍｅｒモチーフを含む、前記標的化部位；及び
    カーゴであって、前記カーゴは、前記標的化部位に連結されており、またはそうなければ関連付けられている、前記カーゴ
    を含む組成物。
  2. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＲＧＤモチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎの式（式中、ｍは０～４アミノ酸であり、ｎは０～１５アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ＲＧＤモチーフは、式ＲＧＤＸｎ（式中、ｎは４または５であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、配列番号１３～５０、１２７７～２４９３、３７３７～４９７９、６６４７～８３１３、８３１４～８５０２、または８６９２～８８８９のうちのいずれか１つである、請求項２に記載の組成物。
  6. 前記標的化部位は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、ポリマー、糖、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記標的化部位は、ウイルスタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ウイルスタンパク質は、カプシドタンパク質である、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ウイルスタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）タンパク質である、請求項７に記載の組成物。
  10. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、前記ｎ－ｍｅｒモチーフが、ウイルスカプシドタンパク質が一部であるウイルスカプシドの外部となるように、前記ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸間に配置される、請求項７に記載の組成物。
  11. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４の間、もしくはそれらの任意の組み合わせまたはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続アミノ酸の間に挿入されている、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸５８８と５８９との間またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置に挿入されている、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記組成物は、修飾ウイルス粒子である、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記修飾ウイルス粒子は、修飾ＡＡＶウイルス粒子である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記修飾ＡＡＶウイルス粒子は、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記カーゴは、筋肉疾患または障害を処置または予防することが可能である、請求項１に記載の組成物。
  17. 前記筋肉疾患または障害は、
    ａ．自己免疫疾患；
    ｂ．がん；
    ｃ．筋ジストロフィー；
    ｄ．神経筋疾患；
    ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
    ｆ．伸長リピート病；
    ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
    ｈ．心筋症；
    ｉ．ウイルス性疾患；
    ｊ．早老性疾患；または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記カーゴは、
    ａ．モルホリノ；
    ｂ．ペプチド連結モルホリノ；
    ｃ．アンチセンスオリゴヌクレオチド；
    ｄ．ＰＭＯ、治療用導入遺伝子；
    ｅ．治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｆ．ＰＰＭＯ；
    ｇ．１つ以上のペプチドまたはポリペプチド；
    ｈ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
    ｉ．リボヌクレオタンパク質であって、前記リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を含む、前記リボヌクレオタンパク質；
    ｊ．治療用導入遺伝子ＲＮＡ、または他の遺伝子改変もしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質；または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項１に記載の組成物。
  19. 前記カーゴは、遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項１に記載の組成物。
  20. 前記カーゴは、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項１に記載の組成物。
  21. 前記カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である、請求項１に記載の組成物。
  22. 前記ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、１’、２、３、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれらの任意の組み合わせ、及び任意にｎＮＯＳドメイン、アクチン結合ドメイン、１つ以上のヒンジ領域、ジストログリカン結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記カーゴは、筋肉特異的プロモーターに機能可能に連結されている、請求項１に記載の組成物。
  24. 前記伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項１７に記載の組成物。
  25. 前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項１７に記載の組成物。
  26. 前記筋強直性ジストロフィーは、１型または２型筋強直性ジストロフィーである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー関連心筋症、またはダノン病である、請求項１７に記載の組成物。
  28. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項１７に記載の組成物。
  29. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項１７に記載の組成物。
  31. 前記組成物は、増加した筋肉細胞効力、筋肉細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項１に記載の組成物。
  32. 筋肉細胞を標的とするのに有効な１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドであって、各標的化部位は、１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフを含み、各ｎ－ｍｅｒモチーフは、ＲＧＤモチーフまたは非ＲＧＤ ｎ－ｍｅｒモチーフであり、各ポリヌクレオチドは、前記１つ以上のｎ－ｍｅｒモチーフの１つ以上を少なくともコードする、前記１つ以上のポリヌクレオチド；及び
    任意に、前記１つ以上のポリヌクレオチドの１つ以上に機能的に連結された制御要素
    を含むベクター
    を含むベクターシステム。
  33. 前記ＲＧＤモチーフは、ＸｍＲＧＤＸｎの式（式中、ｍは０～４アミノ酸であり、ｎは０～１５アミノ酸であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する、請求項３２に記載のベクターシステム。
  34. 前記ＲＧＤモチーフは、式ＲＧＤＸｎ（式中、ｎは４または５であり、Ｘは任意のアミノ酸であり、存在する各Ｘアミノ酸は、独立して、任意のアミノ酸からなる群からの他のものから選択される）を有する、請求項３３に記載のベクターシステム。
  35. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフは、配列番号１３～５０、１２７７～２４９３、３７３７～４９７９、６６４７～８３１３、８３１４～８５０２、または８６９２～８８８９のうちのいずれか１つである、請求項３３に記載のベクターシステム。
  36. カーゴをさらに含む、請求項３２に記載のベクターシステム。
  37. 前記カーゴは、カーゴポリヌクレオチドであり、前記標的化部位をコードする前記１つ以上のポリヌクレオチド、前記制御要素、またはその両方の１つ以上に任意に連結されている、請求項３６に記載のベクターシステム。
  38. 前記カーゴポリヌクレオチドは、前記標的化部位をコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターに存在する、請求項３６に記載のベクターシステム。
  39. 前記ベクターシステムは、前記カーゴを含有するウイルス粒子を生成することが可能である、請求項３６に記載のベクターシステム。
  40. 前記ベクターシステムは、前記標的化部位の１つ以上を含むウイルスカプシドポリペプチドを生成することが可能である、請求項３２に記載のベクターシステム。
  41. 前記ベクターシステムは、ＡＡＶウイルス粒子を生成することが可能である、請求項３２に記載のベクターシステム。
  42. 前記ＡＡＶウイルス粒子は、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、またはＡＡＶ ｒｈ．１０ウイルス粒子である、請求項４１のいずれかに記載のベクターシステム。
  43. 前記カプシドポリペプチドは、修飾ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ ｒｈ．７４、ＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドである、請求項４０に記載のベクターシステム。
  44. 前記ｎ－ｍｅｒモチーフ（複数可）をコードする前記１つ以上のポリヌクレオチドの少なくとも１つは、前記ｎ－ｍｅｒモチーフの少なくとも１つが前記ウイルスカプシドの外部となるように前記ウイルスタンパク質の２つのアミノ酸に対応する２つのコドン間に挿入されている、請求項３９に記載のベクターシステム。
  45. 前記２つのコドンは、ＡＡＶ９カプシドポリペプチドにおけるアミノ酸２６２～２６９、３２７～３３２、３８２～３８６、４５２～４６０、４８８～５０５、５２７～５３９、５４５～５５８、５８１～５９３、７０４～７１４の間、もしくはそれらの任意の組み合わせまたはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置における任意の２つの連続アミノ酸に対応する、請求項４４に記載のベクターシステム。
  46. 前記２つのコドンは、前記ＡＡＶ９カプシドポリヌクレオチドにおけるアミノ酸５８８及び５８９またはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ ｒｈ．７４、もしくはＡＡＶ ｒｈ．１０カプシドポリペプチドにおける類似する位置に対応する、請求項４５に記載のベクターシステム。
  47. 前記１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む前記ベクターは、スプライス制御要素を含まない、請求項３２のいずれかに記載のベクターシステム。
  48. ウイルス性ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３２に記載のベクターシステム。
  49. 前記ウイルス性ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶのｒｅｐタンパク質である、請求項４８に記載のベクターシステム。
  50. 前記ウイルス性ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、前記１つ以上の標的化部位のすべてまたは一部をそれぞれコードする１つ以上のポリヌクレオチドと同じベクターまたは異なるベクターにある、請求項４８に記載のベクターシステム。
  51. 前記ウイルス性ｒｅｐタンパク質は、制御要素に機能的に連結されている、請求項４８に記載のベクターシステム。
  52. 請求項３２～５１のいずれか１項に記載のベクターシステムを発現させることによって生成されるポリペプチド。
  53. 前記ポリペプチドは、ウイルス性ポリペプチドである、請求項５２に記載のポリペプチド。
  54. 前記ウイルス性ポリペプチドは、ＡＡＶポリペプチドである、請求項５３に記載のポリペプチド。
  55. 請求項３２～５１のいずれか１項に記載のベクターシステムを発現させることによって生成される粒子。
  56. 前記粒子は、ウイルス粒子である、請求項５５に記載の粒子。
  57. 前記ウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である、請求項５６に記載の粒子。
  58. 前記ウイルス粒子は、筋肉特異的指向性を有する、請求項５６に記載の粒子。
  59. 前記カーゴは、筋肉疾患または障害を処置または予防することが可能である、請求項３６～５１のいずれか１項に記載のベクターシステム、請求項５２～５４のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項５５～５８に記載のいずれか１項に記載の粒子。
  60. 前記筋肉疾患または障害は、
    ａ．自己免疫疾患；
    ｂ．がん；
    ｃ．筋ジストロフィー；
    ｄ．神経筋疾患；
    ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
    ｆ．伸長リピート病；
    ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
    ｈ．心筋症；
    ｉ．ウイルス性疾患；
    ｊ．早老性疾患；または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項５９に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  61. 前記カーゴは、モルホリノ；
    ａ．ペプチド連結モルホリノ；
    ｂ．アンチセンスオリゴヌクレオチド；
    ｃ．ＰＭＯ、治療用導入遺伝子；
    ｄ．治療用ポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｅ．ＰＰＭＯ；
    ｆ．１つ以上のペプチドまたはポリペプチド；
    ｇ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、ガイドＲＮＡ、またはその両方をコードする１つ以上のポリヌクレオチド；
    ｈ．リボヌクレオタンパク質であって、前記リボヌクレオタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム分子を含む、前記リボヌクレオタンパク質；
    ｉ．治療用導入遺伝子ＲＮＡ、または他の遺伝子改変もしくは治療用ＲＮＡ及び／またはタンパク質；または
    ｊ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  62. 前記カーゴは、遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項５９に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  63. 前記カーゴは、ジストロフィン遺伝子におけるエクソンスキッピングを誘導することが可能である、請求項５９に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  64. 前記カーゴは、ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子である、請求項５９に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  65. 前記ミニまたはマイクロジストロフィン遺伝子は、スペクトリン様リピート１、１’、２、３、１６、１７、２０、２１、２２、２３、２４、またはそれらの任意の組み合わせ、及び任意にｎＮＯＳドメイン、アクチン結合ドメイン、１つ以上のヒンジ領域、ジストログリカン結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６４に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  66. 前記伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  67. 前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  68. 前記筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である、請求項６７に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  69. 前記心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  70. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  71. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である、請求項７０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  72. 前記神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項６０に記載のベクターシステム、ポリペプチド、または粒子。
  73. 前記ポリペプチド、前記粒子、またはその両方は、増加した筋肉細胞効力、筋肉細胞特異性、減少した免疫原性、またはそれらの任意の組み合わせを有する、請求項５２～５８のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは粒子。
  74. ａ．請求項１～３１のいずれかに記載の組成物；
    ｂ．請求項３２～５１または５９～７２のいずれか１項に記載のベクターシステム；
    ｃ．請求項５２～５４または５９～７３のいずれか１項に記載のポリペプチド；
    ｄ．請求項５５～７３のいずれか１項に記載の粒子；または
    ｅ．それらの組み合わせ
    を含む細胞。
  75. 前記細胞は、原核である、請求項７４に記載の細胞。
  76. 前記細胞は、真核である、請求項７４に記載の細胞。
  77. ａ．請求項１～３１のいずれかに記載の組成物；
    ｂ．請求項３２～５１または５９～７２のいずれか１項に記載のベクターシステム；
    ｃ．請求項５２～５４または５９～７３のいずれか１項に記載のポリペプチド；
    ｄ．請求項５５～７３のいずれか１項に記載の粒子；
    ｅ．請求項７４～７６のいずれか１項に記載の細胞；または
    ｆ．それらの組み合わせ；及び
    薬学的に許容可能な担体
    を含む薬学的製剤。
  78. ａ．請求項１～３１のいずれかに記載の組成物；
    ｂ．請求項３２～５１または５９～７２のいずれか１項に記載のベクターシステム；
    ｃ．請求項５２～５４または５９～７３のいずれか１項に記載のポリペプチド；
    ｄ．請求項５５～７３のいずれか１項に記載の粒子；
    ｅ．請求項７４～７６のいずれか１項に記載の細胞；
    ｆ．請求項７７に記載の薬学的製剤；または
    ｇ．それらの組み合わせ
    を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
  79. 前記それを必要とする対象は、筋肉疾患または障害を有する、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記筋肉疾患または障害は、
    ａ．自己免疫疾患；
    ｂ．がん；
    ｃ．筋ジストロフィー；
    ｄ．神経筋疾患；
    ｅ．糖またはグリコーゲン蓄積症；
    ｆ．伸長リピート病；
    ｇ．ドミナントネガティブ疾患；
    ｈ．心筋症；
    ｉ．ウイルス性疾患；
    ｊ．早老性疾患；または
    ｋ．それらの任意の組み合わせ
    である、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記伸長リピート病は、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー、または顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、エメリードレイフス型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、またはＦＳＨＤである、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記筋強直性ジストロフィーは、１型または２型である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記心筋症は、拡張型心筋症、肥大型心筋症、ＤＭＤ関連心筋症、またはダノン病である、請求項８０に記載の方法。
  85. 前記糖またはグリコーゲン蓄積症は、ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患またはポンペ病である、請求項８０に記載の方法。
  86. 前記ＭＰＳ ＩＩＩ型疾患は、ＭＰＳ ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、またはＩＩＩＤ型である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記神経筋疾患は、シャルコー・マリー・トゥース病またはフリードライヒ運動失調症である、請求項８０に記載の方法。
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