JP2022501044A - ヒトアンジェルマン症候群において父方ｕｂｅ３ａ遺伝子発現を復活させるための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトアンジェルマン症候群のニューロンにおける父方遺伝のＵＢＥ３Ａアレルの発現を、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイムおよび／またはマイクロＲＮＡのウイルスベクター送達を用いて活性化するための組成物および方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１８年９月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７３４４３５号に対する優先権を主張し、その全内容は引用により完全に本書の一部とする。

本開示は、ヒトアンジェルマン症候群のニューロンにおける父方遺伝のＵＢＥ３Ａアレルの発現を、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイムおよび／またはマイクロＲＮＡを用いて活性化するための組成物および方法に関する。

アンジェルマン症候群（ＡＳ）は、１５０００個体当たり約１個体が罹患する神経発達障害である。ＡＳを有する個体は、発達の遅れ、重度の認知障害、失調歩行、頻繁な発作、短い注意持続時間、発話の無いこと、および特徴的な幸福な様子を示す。ＡＳ患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導されるニューロンは、脱分極した静止膜電位、活動電位発生の遅延、および自発性シナプス活動の低下を示す。ＡＳの患者集団は比較的大きく、患者数が３０００を超える連絡先登録簿が作られており、毎年約２５０のＡＳ診断が新たになされる。ＡＳを有する個体は、生涯にわたりケアを必要とする。

ＡＳは、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるＵＢＥ３Ａの母方コピーの機能低下によって引き起こされる。この機能低下変異は、母方アレルにおける、どの種類の遺伝子変異によっても引き起こされうる。ＵＢＥ３Ａ遺伝子は、ニューロンにおいて専ら母方アレルから発現される。ＡＳを有するすべての個体が、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）と呼ばれる長鎖ノンコーディングＲＮＡによってエピジェネティックなサイレンシングを受ける正常な父方ＵＢＥ３Ａアレルを有する。父方アレルの再活性化が、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現を復活させ行動障害を軽減することが、ＡＳマウスモデルにおいて示されている。ヒトにおけるＵＢＥ３Ａ発現の復活は、特に幼児において復活する場合、該障害を改善することが期待される。

アンジェルマン症候群の治療法は無いが、この障害の治療のために２つのアプローチが製薬会社および研究機関によって研究されている。１つ目は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子を切断し父方ＵＢＥ３Ａを活性化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用である。２つ目のアプローチは、ＵＢＥ３Ａ遺伝子を患者に導入し直すＡＡＶ仲介遺伝子療法である。上記ＡＳＯは、血液脳関門を通過せず、脊髄内への注入を生涯にわたり繰り返す必要がある。ＵＢＥ３Ａ遺伝子をニューロンに導入し直す遺伝子療法は、ＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを調節する能力を欠き、１つのタンパク質アイソフォームを全部で３つの中から選択する必要があるが、個々のアイソフォームの機能は未だよくわかっていない。これにより、別の関連障害であるＤｕｐ１５ｑ症候群の原因になりうるＵＢＥ３Ａの過剰発現、および重要なタンパク質アイソフォームの欠如がもたらされうる。

本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制し、その天然の調節エレメントによる父方ＵＢＥ３Ａの発現を可能にすることによる遺伝子療法による新規なＡＳ処置アプローチを提供する。ニューロンにおけるＵＢＥ３Ａ発現増加は、上に挙げたニューロンに対するＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの作用を改善しうる。３つのタンパク質アイソフォームのすべてが、そのレベルを正常に調節する内在性調節エレメントを用いて発現しうる。したがって、過剰発現は、天然の調節エレメントの使用によって防止される。このアプローチは、ＡＳ症候群を単回の処置によって改善することができ、したがってＡＳＯに必要な反復脊髄注入を回避しうる。

本発明は、一側面において、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、またはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供し、ここで、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡは父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができる。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、およびプロモーター、を含む発現ベクターを提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むウイルス粒子を提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるｓｈＲＮＡ、リボザイムもしくはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、および薬学的に許容しうる担体、を含む医薬組成物を提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるｓｈＲＮＡ、リボザイムもしくはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、またはその医薬組成物を、処置有効量で、必要とする患者に投与することを含む、アンジェルマン症候群を処置する方法を提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるｓｈＲＮＡ、リボザイムもしくはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、またはその医薬組成物を、処置有効量で、必要とする患者に投与することを含む、父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子発現の発現を活性化または増加する方法を提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、またはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むウイルス粒子、またはその医薬組成物を、処置有効量で、必要とする患者に投与することを含む、配列番号１でコードされるＲＮＡアンチセンス転写物による父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のサイレンシングを抑制する方法を提供する。

他の一側面において、本発明は、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができる、本書に記載されるポリヌクレオチドでコードされるｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡを提供する。

図１は、アンジェルマン症候群における染色体の変異を示す。 図２は、父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子の図である。 図３Ａは、ハンマーヘッド型リボザイムがインビトロでＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを切断することを示す。ハンマーヘッド型リボザイムおよびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＤＮＡを、ＰＣＲによりインビトロで転写した。得られたリボザイムおよびＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡをインビトロでインキュベートし（細胞なし、ベクターなし）、切断をアガロースゲル上で可視化した。 図３Ｂは、ハンマーヘッド型リボザイムが、ヒトＡＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを切断することを示す。 図４は、ｓｈＲＮＡがＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳをノックダウンし、父方ＵＢＥ３Ａを活性化することを示す。ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを標的とするｓｈＲＮＡを発現するようにレンチウイルスを導入したＡＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてＲＴ−ｑＰＣＲを行った。３つのｓｈＲＮＡのうちの１つが、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳをノックダウンし、父方ＵＢＥ３Ａを活性化した。 図５は、５５１ ｓｈＲＮＡ２を持つＡＡＶ粒子が導入されたＡＳニューロンを示す。ＡＡＶベクターは、ニューロンへの導入後に緑色蛍光を発することができるように、ＥＧＦＰをも持つ。ニューロンへの導入は、細胞当たり１×１０^５ウイルスゲノムで行った。 図６は、ｓｈＲＮＡ２のクローニングに使用したＡＡＶベクター５５１であるｐＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰのプラスミドマップを示す。

ＵＢＥ３Ａ
ＵＢＥ３Ａは、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子である。ＵＢＥ３Ａのゲノム座標は、マイナス鎖においてhg19 chr15:25,582,381-25,684,175である。ＵＢＥ３Ａには３つの正常なアイソフォームがある：アイソフォーム１（受託番号Ｘ９８０３２）；アイソフォーム２（受託番号Ｘ９８０３１）；アイソフォーム３（受託番号Ｘ９８０３３）。ニューロンにおいて、ＵＢＥ３Ａ遺伝子は、専ら母方アレルから発現される。父方ＵＢＥ３Ａアレルは、配列番号１でコードされるＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）と呼ばれる長鎖ノンコーディングＲＮＡによってエピジェネティックなサイレンシングを受ける。ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのゲノム座標は、プラス鎖においてhg19 chr15:25,223,730-25,664,609である。以下のゲノム座標が特に関心が持たれる：プラス鎖におけるhg19 chr15:25,522,751-25,591,391。

本発明の組成物および方法は、ＵＢＥ３Ａアンチセンス転写物（ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）を、父方ＵＢＥ３Ａアレルをサイレンシングしないように標的化することに関する。ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはマイクロＲＮＡによる効果的なＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ阻害は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ発現レベルの低下を導き得、したがって父方ＵＢＥ３Ａアレルの発現レベルの増加をもたらし得る。

本発明のいくつかの側面において、本発明の組成物および方法は、ＡＳの治療または予防に関する。必要とする患者またはヒトの処置方法に関する前記態様のいくつかの側面において、必要とする患者またはヒトは、ＡＳを有するか、またはＡＳを発症するリスクを有する。本書において、用語「必要とする患者」は、治療または予防方法を必要とする任意の哺乳動物を包含し、特にヒトを包含する。対象は雄または雌でありうる。いくつかの側面において、本発明により提供される方法にしたがって処置される、ＡＳを有する、必要とする患者は、不安、学習、平衡、運動機能および／または発作において改善を示しうるか、または該方法は、ニューロン静止膜電位を約−７０ｍＶに回復し得、活動電位発生の遅れを改善し得、自発性シナプス活動を増加し得、基電流、活動電位特性（例えば波形）、膜電流、シナプス電位、イオンチャネルコンダクタンス等のニューロン表現型におけるさらなる変化を改善し得る。

ｓｈＲＮＡ、リボザイム、マイクロＲＮＡ、およびコーディング配列
本発明の一側面にしたがって、ポリヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列である配列番号１の発現低下をもたらすショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、またはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。例えば、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡの一部が、配列番号１によりコードされるＲＮＡ配列またはそれに含まれる配列に相補的でありうる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列によりコードされるＲＮＡポリヌクレオチドである。第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、培養およびその後のウイルス粒子作製のための適当なベクター（例えばプラスミド）中にクローニングするのに適当なＤＮＡポリヌクレオチドでありうる。ウイルス粒子は、感染に適当な形態の、ヌクレオチドコーディング配列を伴うＤＮＡポリヌクレオチドを含みうる。したがって、第１のヌクレオチド配列は、ウイルス粒子作製またはウイルス粒子への封入用のプラスミド中にクローニングされるＤＮＡ配列でありうる。レトロウイルスはヌクレオチドコーディング配列をＲＮＡポリヌクレオチドの形態の有するので、レトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス）は、第１のヌクレオチド配列を対応するＲＮＡ配列として含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む。

第１のヌクレオチド配列は、ｓｈＲＮＡをコードしうる。例えば、第１のヌクレオチド配列は配列番号２でありうる。第１のヌクレオチド配列はまた、配列番号２中の太字のヌクレオチドが配列番号９〜５０８のいずれかで置き換えられ、配列番号２中のイタリック体のヌクレオチドが配列番号９〜５０８のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドで置き換えられた、改変された配列番号２でありうる。

第１のヌクレオチド配列は、リボザイムをコードしうる。例えば、第１のヌクレオチド配列は配列番号３でありうる。第１のヌクレオチド配列は、配列番号４でありうる。

第１のヌクレオチド配列は、マイクロＲＮＡをコードしうる。例えば、第１のヌクレオチド配列は配列番号８でありうる。第１のヌクレオチド配列はまた、配列番号８中の太字のヌクレオチドが配列番号９〜５０８のいずれかで置き換えられ、配列番号８中のイタリック体のヌクレオチドが配列番号９〜５０８のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドで置き換えられた、改変された配列番号８でありうる。イタリック体のヌクレオチドと、配列番号９〜５０８のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドとは、相補性が１００％未満でありうる。

本書において、「標的」とは、水素結合によるヌクレオチド配列との、例えばＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのより長いゲノム配列内のヌクレオチド配列から転写されるヌクレオチド配列との、ハイブリダイゼーションを受けることができる作動可能なＲＮＡポリヌクレオチドを意味する。ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのより長いゲノム配列内のヌクレオチド配列から転写されるヌクレオチド配列との、作動可能ＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、作動可能ＲＮＡポリヌクレオチド不存在下のＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ発現レベルとの比較で、作動可能ＲＮＡポリヌクレオチド存在下のＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ発現レベルの低下をもたらしうる。好ましくは、作動可能ＲＮＡポリヌクレオチドは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのより長いゲノム配列内にコードされるＲＮＡ配列に相補的なｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列を含む。例えば、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、配列番号５および配列番号９〜５０８によりコードされるＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、リボザイムは、配列番号６または配列番号７によりコードされるＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。したがって、作動可能ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡが標的生物中に同化され機能的状態へとプロセシングされた後のｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡの作動可能部分をさす。

「発現を低下する」とは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの発現または活性の低下または阻止をいい、発現または活性を完全に無くすことを必ずしも意味しない。標的の発現低下のメカニズムは、より長いゲノムＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列（配列番号１）中の１つ以上の配列から転写される１つ以上の標的配列との作動可能ＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み、ここで、ハイブリダイゼーションのアウトカムまたは効果は、転写またはスプライシングに例えば関与する細胞内機構の妨害を伴う標的分解または標的占有である。

特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本発明のｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡは、父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを、（１）配列番号１によりコードされるＲＮＡ転写物を切断すること；（２）配列番号１によりコードされるＲＮＡ転写物の定常状態レベル（すなわちホメオスタシス時のベースラインレベル）を低下させること；および（３）配列番号１の転写を終結させること、によって抑制しうる。例えば、配列番号１によりコードされるＲＮＡ転写物の切断および定常状態レベル低下は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を伴うメカニズムによって起こりうる。ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡのいずれも、ＲＩＳＣを利用しうる。ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡのゲノム材料を持つベクターが宿主ゲノム中に一体化されると、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡゲノム材料は宿主中でｐｒｉ−マイクロＲＮＡに転写される。ｐｒｉ−マイクロＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａといったリボヌクレアーゼによって、ｐｒｅ−ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−マイクロＲＮＡへとそれぞれプロセシングされ、核から運び出される。ｐｒｅ−ｓｈＲＮＡまたはｐｒｅ−マイクロＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒといったエンドリボヌクレアーゼによるプロセシングを受けて短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡをそれぞれ形成する。ｓｉＲＮＡについては、ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣに取り込まれ、そこでセンス鎖が分解され、アンチセンス鎖がＲＩＳＣをｍＲＮＡ中の相補配列へと導くガイドとしてはたらく。マイクロＲＮＡについては、マイクロＲＮＡの一本の鎖がＲＩＳＣに取り込まれ、ＲＩＳＣをｍＲＮＡ中の相補配列へと導くガイドとしてはたらく。ＲＩＳＣはｍＲＮＡを、該配列が完全な相補性を有する場合に切断し、該配列が不完全な相補性を有する場合にｍＲＮＡの翻訳を抑制する。他の一例において、配列番号１によりコードされるＲＮＡ転写物の切断および定常状態レベル低下は、リボザイムを伴うメカニズムによって起こりうる。リボザイムのゲノム材料を持つベクターが宿主ゲノム中に一体化されると、それは宿主中でＲＮＡに転写される。ＲＮＡは、触媒ドメインおよび標的ｍＲＮＡに相補的な領域を有する二次構造を形成する。リボザイムが標的ｍＲＮＡに結合すると、触媒ドメインが標的ｍＲＮＡを切断する。配列番号１の転写は、５’−３’および３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ２）が、転写されている標的ｍＲＮＡの切断されたキャッピングされていない末端に結合する魚雷メカニズムによって終結させられうる。５’−３’エキソヌクレアーゼはポリメラーゼを捉えてポリメラーゼをＤＮＡから離れさせる。このようにして、第１の核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡの定常状態レベルを低下することによって父方ＵＢＥ３Ａの発現を増加させうる。

本書において使用する用語「核酸」は、ヌクレオチドモノマーから構成される分子をさす。核酸の例は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、短い干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を包含する。「ヌクレオチド」は、糖部分にリン酸基が共有結合したヌクレオシドを意味する。「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、それぞれが個別に修飾されているかまたは修飾されていないものでありうるヌクレオチドが結合したポリマーを意味する。

本書において使用する用語「ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」は、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を形成する、通常のステム−ループｓｈＲＮＡを包含する。「ｓｈＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡが組み込まれたｓｈＲＮＡ（ｍｉＲＮＡベースｓｈＲＮＡ）をも包含するが、これは、二本鎖ｍｉＲＮＡのガイド鎖およびパッセンジャー鎖が、既存の（または天然の）ｍｉＲＮＡ中に、または改変もしくは合成（設計）されたｍｉＲＮＡ中に組み込まれたものである。転写されるとき、通常のｓｈＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲ−４５１ ｓｈＲＮＡ ｍｉｍｉｃでない）は、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）または天然のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに非常に類似する構造を形成する。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡはその後、Ｄｒｏｓｈａおよびその補因子により、ｐｒｅ−ｓｈＲＮＡへとプロセシングされる。したがって、用語「ｓｈＲＮＡ」は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ｍｉｒ）分子およびｐｒｅ−ｓｈＲＮＡ分子を包含する。

「ステム−ループ構造」とは、主に一本鎖のヌクレオチドの領域（ループ部分）が一端に連結された二本鎖（ステム部分）を形成することが知られるかまたは予測されるヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸をいう。ループ部分は少なくとも４ヌクレオチドの長さ、好ましくは６ヌクレオチドの長さであることが知られている（例えば、配列番号２中の下線部の配列）。用語「ヘアピン」および「折り返し」構造も、ステム−ループ構造をさすために本書において使用される。そのような構造は、当分野においてよく知られており、該用語は当分野において知られるその意味で使用される。当分野で知られるように、二次構造は塩基が正確に対をなすことを必要としない。したがって、ステムは１つ以上の塩基ミスマッチまたはバルジを含むことができる。あるいは、塩基対形成は正確であること、すなわちミスマッチを含まないものであることができる。

いくつかの態様において、本書において有用なｓｈＲＮＡは、インビボでの安定性が高められたｓｈＲＮＡを包含する改変ｓｈＲＮＡを包含するが、それに限定されない。改変ｓｈＲＮＡは、核酸塩基、糖またはバックボーンに付加、欠失および／または置換を有する分子、および架橋されているかまたは他の化学的修飾がなされている分子を包含する、ヌクレオチドアナログを含む分子を包含する。改変されたヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ分子のいくつかの部分の中に、またはｓｈＲＮＡ分子の全体にわたって、存在しうる。例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、その５’末端、その３’末端もしくは両方の領域において、および／またはガイド鎖、パッセンジャー鎖もしくは両方の中において、および／または５’末端、３’末端もしくは両方にオーバーハングするヌクレオチドの中において、改変されうるかまたは改変された核酸を含みうる（Crooke, 米国特許第6,107,094号および第5,898,031号; Elmen et al., 米国特許出願公開第2008/0249039号および第2007/0191294号; Manoharan et al., 米国特許出願公開第2008/0213891号; MacLachlan et al., 米国特許出願公開第2007/0135372号; およびRana, 米国特許出願公開第2005/0020521号を参照されたい；これらすべてを引用により本書の一部とする）。

本発明において、ｓｈＲＮＡは、全ゲノムＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列（配列番号１）内から転写されるＲＮＡヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳによる父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制する。他のいくつかの態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号９〜５０８によりコードされるＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。さらなる特定の態様において、ｓｈＲＮＡは、配列番号５によりコードされるＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様において、ｓｈＲＮＡは配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされる。本発明のいくつかの態様において、ｓｈＲＮＡに含まれ、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子から転写されるＲＮＡヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列は、１７〜２１ヌクレオチドの長さである。相補的ヌクレオチドは、連続しうる、または非相補的ヌクレオチドで隔てられうる。いくつかの態様において、相補的ヌクレオチド配列は、配列番号２に太字で示されるように２１ヌクレオチドの長さである。ｓｈＲＮＡは、１７、１８、１９、２０または２１のヌクレオチドが配列番号９〜５０８中のヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含みうる。１７、１８、１９、２０または２１の相補的ヌクレオチドは、連続しうる、または非相補的ヌクレオチドで隔てられうる。ループを含むｓｈＲＮＡの全長は、４０〜５０ヌクレオチド、好ましくは４４〜４８ヌクレオチド、より好ましくは４８ヌクレオチドの長さである。

本書において使用する用語「リボザイム」は、酵素のように作用するＲＮＡ分子、または該ＲＮＡ分子を含むタンパク質からなる分子をさし、これはＲＮＡ酵素または酵素ＲＮＡとも称される。リボザイムは、明確な三次構造を有するＲＮＡ分子によって化学反応を触媒し、触媒または自己触媒作用を有することがわかっている。いくつかのリボザイムは、自身または他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害し、他のいくつかのリボザイムは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒する。そのようなリボザイムは、ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＳリボザイム、ヘアピン型リボザイム等を包含しうる。本発明において、リボザイムは、全ゲノムＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列（配列番号１）内から転写されるＲＮＡヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳによる父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制する。他のいくつかの態様において、リボザイムは、配列番号６および／または配列番号７によりコードされるＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。他のいくつかの態様において、リボザイムは、配列番号３または４のヌクレオチド配列によりコードされる。配列番号３および４中の太字の配列は配列番号６または７に相補的であり、下線を付した配列はリボザイムの触媒領域を示す。

本書において使用する用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」および「ｍｉＲ」は、同義で用いられ、内在性遺伝子から誘導される約１７〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのノンコーディングＲＮＡをいう。マイクロＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと称される、より長い（約７５ｎｔ）ヘアピン様前駆体からプロセシングされる。マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと称されるリボヌクレオタンパク質複合体を構成し、アンチセンス相補性によって標的を認識する。マイクロＲＮＡがその標的と１００％マッチする、すなわち相補性が完全である場合、標的ｍＲＮＡは切断され、ｍｉＲＮＡはｓｉＲＮＡのようにはたらく。マッチが不完全である、すなわち相補性が部分的である場合、標的ｍＲＮＡの翻訳が阻止される。本発明のいくつかの態様において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子から転写されるＲＮＡヌクレオチド配列に相補的な、マイクロＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列は、１７〜２１ヌクレオチドの長さである。相補的ヌクレオチドは、連続しうる、または非相補的ヌクレオチドで隔てられうる。いくつかの態様において、相補的ヌクレオチド配列は、配列番号８中に太字で示されるように２１ヌクレオチドの長さである。マイクロＲＮＡは、１７、１８、１９、２０または２１のヌクレオチドが配列番号５または９〜５０８中のヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含みうる。１７、１８、１９、２０または２１の相補的ヌクレオチドは、連続しうる、または非相補ヌクレオチドで隔てられうる。ループを含む前駆体マイクロＲＮＡの全長は、５０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは５９〜６７ヌクレオチド、より好ましくは６７ヌクレオチドの長さでありうる。

本発明において、マイクロＲＮＡは、全ゲノムＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列（配列番号１）内の１つ以上のヌクレオチド配列から転写される１つ以上のヌクレオチド配列を標的とし、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳによる父方ＵＢＥ３Ａサイレンシングを抑制するようにデザインされる。他のいくつかの態様において、マイクロＲＮＡは、配列番号９〜５０８から選択される１つ以上の配列から転写される１つ以上の配列を標的とするようにデザインされる。さらなる特定の一態様において、マイクロＲＮＡは、配列番号５から転写される配列を標的とする。他のいくつかの態様において、マイクロＲＮＡは、配列番号８のヌクレオチド配列によりコードされ、配列番号８中の太字の配列は、配列番号５または９〜５０８に相補的である。

ある配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能かを決定する方法は、当分野においてよく知られている。いくつかの態様において、本発明において提供されるｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡポリヌクレオチドは、配列番号１のＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳから転写されるＲＮＡに特異的にハイブリダイズ可能な核酸配列を含む。

ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ標的配列に相補的な１７〜２１の連結されたヌクレオチドの領域を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、ここで、該ＲＮＡポリヌクレオチド領域は、その長さ全体にわたって、等しい長さのＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡ核酸配列領域に対して少なくとも８５％相補的である。いくつかの態様において、該ＲＮＡポリヌクレオチド領域は、その長さ全体にわたって、等しい長さのＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡ核酸配列領域に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。

ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡ配列に対して、少なくとも８５％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡ配列に対して、少なくとも９０％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡ配列に対して、少なくとも９５％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡは、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡ配列に対して、１００％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。

リボザイムは、触媒領域によって隔てられた、ＲＮＡ標的配列に相補的な連結されたヌクレオチドの２つの領域を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、ここで、ＲＮＡポリヌクレオチドの非触媒領域の全体は、その全長にわたって、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡヌクレオチド配列の等しい長さの領域と少なくとも８５％相補的である。いくつかの態様において、ＲＮＡヌクレオチドの非触媒領域の全体は、その全長にわたって、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡヌクレオチド配列の等しい長さの領域と少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である。本発明のいくつかの態様において、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子から転写されるＲＮＡヌクレオチド配列に相補的な、リボザイムに含まれるヌクレオチド配列は、１７〜２１ヌクレオチドの長さである。相補的ヌクレオチドは、非相補的ヌクレオチドで隔てられうる。いくつかの態様において、相補的ヌクレオチド配列は、配列番号３〜４中に太字で示されるように、２１ヌクレオチドの長さである。リボザイムは、１７、１８、１９、２０または２１のヌクレオチドが配列番号６〜７のヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列を含みうる。１７、１８、１９、２０または２１の相補的ヌクレオチドは、非相補的ヌクレオチドで隔てられうる。触媒ループを含むｓｈＲＮＡの全長は、５０〜１５０ヌクレオチド、好ましくは５７〜６５ヌクレオチド、より好ましくは５９ヌクレオチドの長さである。

リボザイムは、配列番号６または７によりコードされるＲＮＡ配列に対し、少なくとも８５％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。リボザイムは、配列番号６または７によりコードされるＲＮＡ配列に対し、少なくとも９０％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。リボザイムは、配列番号６または７によりコードされるＲＮＡ配列に対し、少なくとも９５％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。リボザイムは、配列番号６または７によりコードされるＲＮＡ配列に対し、１００％相補的であり、それと等しい長さのヌクレオチド配列を含みうる。

いくつかの側面において、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの側面において、ＲＮＡポリヌクレオチドは改変されたＲＮＡポリヌクレオチドである。本書において相補性パーセントは、アデニンとチミン、アデニンとウラシル（ＲＮＡ）、およびグアニンとシトシンの間の塩基対形成をいう通常の意味で用いられる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡとＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列の間の非相補的核酸塩基は、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡがＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズ可能である限り許容されうる。さらに、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡはＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列の１つ以上のセグメントにわたって、介在するまたは隣接するセグメントが当該ハイブリダイゼーションに関与しないように、ハイブリダイズしうる（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）。

いくつかの態様において、本発明において提供されるｓｈＲＮＡ、リボザイムもしくはマイクロＲＮＡ、またはその特定の部分は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡヌクレオチド配列、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ領域、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳセグメント、またはその特定の部分に対し、相補性が次に記載する値であるかまたは少なくとも次に記載する値である：７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％。ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡとＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列との相補性パーセントは、ルーチンな方法によって決定することができる。

例えば、１８〜２０の核酸塩基がＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ領域に対し相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズし得、９０％の相補性を示し得るｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡ。この例において、残りの非相補的核酸塩基は、クラスターをなすかまたは相補的核酸塩基で隔てられてよく、互いにまたは相補的核酸塩基と連続している必要はない。したがって、標的ヌクレオチド配列と完全に相補的な２つの領域で挟まれた４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基の長さのｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列との７７．８％の全体的な相補性を有し得、本発明の範囲に含まれ得る。ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡとＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列の領域との相補性パーセントは、当分野で知られるＢＬＡＳＴプログラム（basic local alignment search tools）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いてルーチンに決定することができる（Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656）。相同性、配列同一性または相補性のパーセントは、例えば、スミス-ウォーターマン・アルゴリズム（Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489）を用いるデフォルトセッティングを用いるＧａｐプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.）によって決定することができる。

いくつかの態様において、本発明において提供されるｓｈＲＮＡ、リボザイムもしくはマイクロＲＮＡ、またはその特定の部分は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列、またはその配列番号１の転写産物の特定の部分に対して完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。例えば、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡは、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列またはその領域、セグメントもしくは配列に対し完全に相補的である。本書において「完全に相補的」とは、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの各核酸塩基が、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳヌクレオチド配列から転写された対応するＲＮＡ核酸塩基との正確な塩基対形成が可能であることを意味する。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの有効な濃度または用量は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳによる父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％抑制しうる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの有効な濃度または用量は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの転写を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％終結させうる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの有効な濃度または用量は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子の定常状態レベルを、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％低下しうる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの有効な濃度または用量は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを切断し、それを、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％減少させうる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡの有効な濃度または用量は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの発現を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％低下させ、父方ＵＢＥ３Ａの発現を、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％誘導しうる。

本書において、用語「ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ」および「Ｕｂｅ３Ａ−ＡＴＳ」は、その綴りを大文字にすることなく任意の特定の種またはオーソログをさして互換的に使用されうる。「ＵＢＥ３Ａ」および「Ｕｂｅ３Ａ」は、その綴りを大文字にすることなく任意の特定の種またはオーソログをさして互換的に使用されうる。さらに、「ＵＢＥ３Ａ」、イタリック体の「ＵＢＥ３Ａ」、「Ｕｂｅ３Ａ」、およびイタリック体の「Ｕｂｅ３Ａ」は、特に別の意味を有することが示されない限り、イタリック体で記載することなく核酸またはタンパク質をさして互換的に使用されうる。

ウイルスベクター
「ベクター」は、その中に別のＤＮＡセグメントが、該セグメントの複製がもたらされるように挿入されうる、プラスミド、ファージまたはコスミドといったレプリコンである。一般に、ベクターは、適切な調節要素を伴うとき、複製が可能である。適当なベクターバックボーンは、例えば、プラスミド、ウイルスゲノムを含むプラスミド、ウイルス、または人工染色体といった、当分野でルーチンに使用されるものを包含する。用語「ベクター」は、クローニングおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターを包含する。

当業者に知られるように、用語「ウイルスベクター」は、細胞へ、または核酸配列の導入および／または核酸配列の細胞ゲノムへの組み込みを仲介するウイルス粒子への核酸分子の導入を典型的には促進する、ウイルス核酸要素を含む核酸分子（例えばトランスファープラスミド）をさして広く用いられている。

ウイルスベクターは、主にウイルスに由来する、構造的および／または機能的な遺伝子要素を含む。ウイルスベクターは、好ましくは、非毒性であり、非免疫原性であり、作製が容易であり、ＤＮＡまたはＲＮＡの保護および標的細胞への送達に有効である。本発明の組成物および方法にしたがい、ウイルスベクターは、本発明のｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡを含みうる。いくつかの特定の態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。

本書において用いられる用語「レンチウイルス」とは、複雑レトロウイルスの一群（または属）をさす。レンチウイルスの例は、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；１型ＨＩＶおよび２型ＨＩＶを包含する）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルスウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を包含するが、それに限定されない。レンチウイルスは、分裂細胞および分裂終了細胞に形質導入しうる。

用語「レンチウイルスベクター」とは、主にレンチウイルスに由来する長い末端反復（ＬＴＲ）を包含する構造的および機能的遺伝子要素またはその一部を含むウイルスベクター（例えばウイルスプラスミド）をいう。レンチウイルスベクターは、逆転写、複製、組み込みおよび／または核酸配列（例えばコーディング配列）パッケージングのためのレトロウイルス（例えばレンチウイルス）配列を含むハイブリッドベクター（例えばトランスファープラスミドの形態のもの）である。用語「レトロウイルスベクター」とは、主にレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子要素またはその一部を含むウイルスベクター（例えばトランスファープラスミド）をいう。

アデノウイルスベクターは、生物対象に直接投与されるようデザインされている。レトロウイルスベクターとは異なり、ほとんどのアデノウイルスベクターゲノムは宿主細胞の染色体に組み込まれない。その代わりに、アデノウイルスベクターを用いて細胞に導入された遺伝子は、長期間持続する染色体外要素（エピソーム）として核内に維持される。アデノウイルスベクターは、インビボで気道上皮細胞、内皮細胞、肝細胞およびさまざまな腫瘍を包含する多くの異なる組織の分裂および非分裂細胞に形質導入しうる（Trapnell, 1993; Chuah et al., 2003）。

用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」とは、ヒトおよび他のいくつかの霊長類種に感染するが、疾患を引き起こすことは知られておらず、非常に軽度の免疫反応を引き起こすに過ぎない、短鎖ｓｓＤＮＡウイルスをいう。ＡＡＶは、分裂細胞にも非分裂細胞にも感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込ませうる。このような特徴のゆえにＡＡＶは、該ベクターのクローニング能力は比較的限定されているものの、遺伝子療法のためのウイルスベクターの作製のために非常に興味深い候補である。本発明の好ましい一態様において、使用するベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する（すなわちＡＡＶベクター）。３０を超える天然のＡＡＶ血清型が利用可能である。ＡＡＶカプシドには多くの天然のバリアントが存在し、特定の種類の標的細胞に対して特に適当な性質を有するＡＡＶを特定し使用することができる。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的技術によって改変しうるので、該粒子を、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡ配列のＤＮＡ配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限にするため、安定性および粒子寿命を調節するため、効果的な分解のため、核への正確な送達のため等に最適化することが可能である。

「発現ベクター」とは、調節領域を含むベクターである。多くのベクターおよび発現系が、Novagen (Madison, Wis.)、Clontech (Palo Alto, Calif.)、Stratagene (La Jolla, Calif.)、およびInvitrogen/Life Technologies (Carlsbad, Calif.)といった会社から市販されている。発現ベクターは、特定のウイルスに由来するウイルス発現ベクターでありうる。

本書において提供されるベクターはまた、例えば複製起点、足場付着領域（ＳＡＲ）、および／またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、宿主細胞に選択可能な表現型を付与することができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、またはヒグロマイシン）に対する耐性といった殺生物剤耐性を付与することができる。発現ベクターは、発現されるポリペプチドの操作または検出（例えば精製または局在化）を促進するようにデザインされたタグ配列を含むことができる。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、またはＦｌａｇ（商標）タグ（Kodak, New Haven, Conn.）配列といったタグ配列は典型的には、コードされるポリペプチドとの融合体として発現される。そのようなタグは、カルボキシルまたはアミノ末端を包含する、ポリペプチド中のどこかの位置に挿入されうる。

さらなる発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントをも含みうる。適当なベクターは、ｐＬＫ０．１ ｐｕｒｏ、ＳＶ４０、およびＲＰ４といったプラスミドに由来するもの；ファージＤＮＡ、例えば、多くのファージ１由来物、例えばＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ファージＤＮＡ、真核生物細胞において有用なベクター、例えば昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を利用するように改変されたプラスミドを包含する。

ベクターは、調節領域をも含みうる。用語「調節領域」とは、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を及ぼすヌクレオチド配列をいう。調節領域は、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答配列、タンパク質認識部位、誘導要素、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、核局在化シグナル、ならびにイントロンを包含するが、それに限定されない。

本書において用いられる用語「作動可能に連結される」とは、核酸中で調節領域および転写される配列が、そのような配列の転写または翻訳に影響を及ぼすように位置することをいう。例えば、コーディング配列をプロモーターの制御下に置くために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は典型的には、プロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置される。しかしながら、プロモーターは、翻訳開始部位の約５０００ヌクレオチド上流、または転写開始部位の約２０００ヌクレオチド上流にまで配置することができる。プロモーターは典型的には、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。プロモーターはまた、エンハンサー配列、上流要素または上流活性化領域（ＵＡＲ）といった、少なくとも１つの調節要素を含みうる。含めるプロモーターの種類は、効率、選択可能性、誘導可能性、所望の発現レベル、および細胞または組織優先的発現を包含するがそれに限定されない、いくつかの因子によって決められる。コーディング配列に対してプロモーターおよび他の調節領域を適当に選択および配置することによってコーディング配列の発現を調節することは、当業者がルーチンに行いうることである。

ベクターは、遺伝子送達および／または遺伝子発現をさらに調節する、または、標的化された細胞に他の有益な特性を提供する、他の成分または機能性をも含みうる。下記に、より詳細に記載され説明されるように、そのような他の成分は、例えば、細胞に対する結合または標的化に影響を及ぼす成分（細胞種または組織特異的結合を仲介する成分を包含する）；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（例えば核局在化を仲介する物質）；およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を包含する。そのような成分は、マーカー、例えばベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出または選択するために使用することができる検出可能および／または選択可能なマーカーをも包含しうる。そのような成分はベクターの天然の特徴として提供されうるか（例えば結合および取り込みを仲介する成分または機能性を有するある種のウイルスベクターを使用する場合）、またはベクターはそのような機能性を提供するように改変されうる。他のベクターは、Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)に記載されるものを包含する。そのような多様なベクターが当分野において知られ、一般に利用可能である。

「組換えウイルスベクター」とは、１つ以上の異種遺伝子産物または配列を含むウイルスベクターをいう。多くのウイルスベクターにはパッケージングに関してサイズ制限があるので、異種遺伝子産物または配列は典型的には、ウイルスゲノムの１つ以上の部分と置き換えて導入される。そのようなウイルスは複製欠損となり得、欠損機能がウイルスの複製およびカプシド形成中にトランスに提供されることを必要としうる（これは例えば、複製および／またはカプシド形成に必要な遺伝子産物を持つヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株の使用による）。

いくつかの態様において、本発明において使用されるウイルスベクターは、細胞当たり少なくとも１０^５ウイルスゲノムの濃度で使用されうる。

適当なプロモーターの選択は、容易に行うことができる。適当なプロモーターの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーター、例えばＵ６プロモーターである。遺伝子発現のために使用しうる他の適当なプロモーターは以下のものを包含するが、それに限定されない：７６３塩基対サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Davis, et al., Hum Gene Ther 4:151 (1993)）、ＳＶ４０初期プロモーター領域、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン（ＭＭＴ）遺伝子の調節配列、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーター、ならびに組織特異性を示しトランスジェニック動物において用いられている動物転写調節領域：脳内の希突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域、および視床下部において活性であるゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域。ある種のタンパク質は、その天然のプロモーターを用いて発現させることができる。発現を向上することのできる他の要素、例えばエンハンサー、または高レベルの発現をもたらすｔａｔ遺伝子およびｔａｒエレメントのような系をも含ませることができる。そして該カセットを、ベクター、例えばプラスミドベクター、例えばｐＬＫ０．１、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、または知られている他のプラスミドベクターに挿入することができる。Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, (1989)を参照されたい。プラスミドベクターは、マーカーポリペプチドが処置される生体の代謝に悪影響を及ぼすものではない限り、アンピシリン耐性のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子といった選択可能なマーカーをも含みうる。該カセットは、合成送達系、例えばＷＯ９５／２２６１８に開示される系において、核酸結合成分に結合させることもできる。

ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡのコーディング配列は、当分野においてよく知られる任意の適当な遺伝子工学的手法を用いて、ウイルスベクター中にクローニングすることができ、そのような方法は以下のものを包含するが、それに限定されない：標準的なＰＣＲ技術、ポリヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、トランスフォーメーション、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングで、Sambrookらの文献（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)）、Coffinらの文献（Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)）、および“RNA Viruses: A Practical Approach”（Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)）に記載されるようなもの。好ましい態様において、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡのＤＮＡ配列は、５’および３’末端に、制限エンドヌクレアーゼにより切断されるプラスミドおよび／またはベクター上の配列と相補的なフランキング配列を含む。当分野においてよく知られるように、フランキング配列は、プラスミドおよび／またはベクターの制限消化において用いられる制限エンドヌクレアーゼに応じるものである。したがって、当業者はそのように、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡのＤＮＡ配列の５’および３’末端のフランキング配列を選択することができる。他の好ましい一態様において、標的部位を、当分野において現在知られている、Gateway、PCR in fusion、Cre-lox P、およびCreatorを包含する、核酸融合および交換技術によって、ベクター中にクローニングすることができる。

いくつかの態様において、発現ベクターは、プロモーター、および本発明のショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、またはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、を含む。好ましくは、プロモーター、および第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、作動可能に連結される。好ましくは、プロモーターはＵ６プロモーターである。発現ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列は、配列番号２でありうる。発現ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列は、配列番号３でありうる。発現ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列は、配列番号４でありうる。発現ベクターに含まれる第１のヌクレオチド配列は、配列番号８でありうる。発現ベクター中の第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡポリヌクレオチドである。発現ベクターの第１のヌクレオチド配列は、好ましくはＤＮＡヌクレオチド配列である。発現ベクターの第１のヌクレオチド配列によりコードされるｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡは、本書に開示される任意の変化形について記載されるものでありうる。

後述のように、組換えウイルスベクターは、パッケージング細胞または細胞株に、組換えウイルス粒子のパッケージングに必要な要素と共に導入される。トランスフェクトされた細胞の上清から採取された組換えウイルス粒子が、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡの発現用の標的細胞または生物の感染のために用いられる。導入される細胞または生物は、一過性発現のために用いられるか、または安定な発現のために選択される。

ウイルス粒子
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡのコーディングヌクレオチド配列を送達するために、ウイルス粒子が用いられる。ウイルス粒子は典型的には、核酸に加えて、さまざまなウイルス成分および、ときには、宿主細胞成分を含みうる。核酸配列は、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡ核酸配列を必要とする患者またはヒトの標的細胞に送達することのできるウイルス粒子にパッケージングされうる。

ウイルス粒子は、（ａ）ウイルス発現ベクターを適当な細胞株に導入すること；（ｂ）該細胞株を、ウイルス粒子の生産を可能にするように適当な条件下に培養すること；（ｃ）生産されたウイルス粒子を回収すること；および（ｄ）場合により、回収された感染性ウイルス粒子を精製すること、によって作製されうる。

本発明のｓｈＲＮＡ、リボザイム、またはマイクロＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、増幅または発現のために、当業者が容易に使用できるよく知られた方法を用いて適当な細胞株に導入されうる。そのような方法は、以下のものを包含するが、それに限定されない：少量のＤＮＡの、細胞の核内へのマイクロインジェクション（Capechi et al., 1980, Cell 22, 479-488）、ＣａＰＯ_４仲介トランスフェクション（Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 2745-2752）、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション（Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311-1326）、リポフェクチン／リポソーム融合（Feigner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417）、パーティクルガン（Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572）、遺伝子銃、トランスダクション、感染（例えば感染性ウイルス粒子による）、および他の方法、例えばSambrookらの文献（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001）に記載される方法。

本発明のベクターに欠失がある場合、感染性粒子は通常、非機能性のウイルス遺伝子をトランスに補う補完細胞株においてまたはヘルパーウイルスを使用して、作製される。例えば、アデノウイルスベクターを補う適当な細胞株は、Ｅ１機能を補うために通常用いられる２９３細胞（Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36, 59-72）およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917）を包含する。他のいくつかの細胞株が、二重に欠失のあるアデノウイルスベクターを補うように組換えられている（Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559-565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6, 1575-1586; Wang et al., 1995, Gene Ther. 2, 775-783; Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2033; WO94/28152およびWO97/04119）。感染性ウイルス粒子は、培養上清から、また、溶解後の細胞から回収され得、場合により標準的な方法（例えばWO 96/27677, WO 98/00524, WO 98/22588, WO 98/26048, WO 00/40702, EP 1016700およびWO 00/50573に記載される、クロマトグラフィー、塩化セシウム勾配を用いる超遠心分離）によってさらに精製される。

本発明は、本書に記載される本発明の核酸分子、ベクター、または感染性ウイルス粒子を含む宿主細胞にも関する。本発明の目的のために、用語「宿主細胞」は、組織、器官、または単離細胞における特定の構造に関する限定なしに広義に理解すべきである。そのような細胞は、特殊な種類の細胞、または異なる種類の細胞の群のものであってよく、培養された細胞株、初代細胞、および増殖性細胞を包含する。

したがって、宿主細胞は、原核生物細胞、下等真核生物細胞、例えば酵母、および他の真核生物細胞、例えば昆虫細胞、植物および高等真核生物細胞、例えば脊椎動物細胞、特に好ましくは哺乳動物（例えばヒトまたは非ヒト）細胞を包含する。適当な哺乳動物細胞は、以下のものを包含するが、それに限定されない：造血細胞（全能性、幹細胞、白血球、リンパ球、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、樹状細胞、非ヒト細胞等）、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞（例えば骨格筋、心筋または平滑筋）、または線維芽細胞。好ましくい宿主細胞は、大腸菌、バチルス属、リステリア属、サッカロミセス属、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）、ＭＤＣＫ細胞（Madin-Darbyイヌ腎細胞株）、ＣＲＦＫ細胞（Crandellネコ腎細胞株）、ＣＶ−１細胞（アフリカサル腎細胞株）、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ−７）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒーラ細胞、およびベロ細胞を包含する。宿主細胞は、上に挙げたような本発明の複製欠損ベクター（例えばアデノウイルスベクター）の少なくとも１つの欠損機能を補うことのできる補完細胞をも包含する。

本発明の宿主細胞は、さらに封入しうる。細胞封入技術は文献に記載されている（Tresco et al., 1992, ASAJO J. 38, 17-23; Aebischer et al., 1996, Human Gene Ther. 7, 851-860）。前記特定の態様にしたがって、トランスフェクトまたは感染された真核生物宿主細胞は、微孔膜を形成する化合物で封入され、その封入された細胞はさらにインビボ移植されうる。関心の細胞を含むカプセルは、カプセルの内側と外側の間のタンパク質および栄養物の自由な通過を可能にするが移植された細胞と宿主の細胞との接触は防ぐ適当な分子量カットオフを有する中空多孔膜を用いて作製されうる（例えばAkzo Nobel Faser AG, Wuppertal, Germany; Deglon et al. 1996, Human Gene Ther. 7, 2135-2146）。

本発明において使用するのに適当なウイルス粒子は、ＡＡＶ粒子およびレンチウイルス粒子を包含する。ＡＡＶ粒子は、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡのコーディング配列をゲノムＤＮＡの形態で有する。一方、レンチウイルス粒子はレトロウイルスのクラスに属し、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、およびマイクロＲＮＡのコーディング配列をＲＮＡの形態で有する。

ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ ＲＮＡを標的とするｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ（またはレンチウイルス粒子の場合、ＲＮＡ）を含むＡＡＶ粒子、人工ＡＡＶ粒子、自己相補的ＡＡＶ粒子、およびレンチウイルス粒子といった組換えウイルス粒子は、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳによるＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制するように標的細胞に送達されうる。ＡＡＶの使用は、これが比較的無毒性であり、効果的な遺伝子送達を提供し、特定の目的のために容易に最適化できることから、ＤＮＡ送達の一般的様式である。本発明の一態様において、選択されたＡＡＶ血清型は天然の向神経性を有する。本発明のさらなるいくつかの態様において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９またはＡＡＶ１０である。

適当な組換えＡＡＶは、本書において定義される、本書において定義されるＡＡＶ血清型カプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；少なくともＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）およびコーディングヌクレオチド配列からなるミニジーン；ならびにＡＡＶカプシドタンパク質中へのミニジーンのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することによって作製される。ＡＡＶカプシド中にＡＡＶミニジーンをパッケージングするために宿主細胞において培養される必要のある成分は、宿主細胞にトランスに提供されうる。あるいは、任意の１つ以上の必要な成分（例えばミニジーン、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）は、当業者に知られる方法を用いて１つ以上の必要な成分を含むように操作されている安定な宿主細胞によって提供されうる。

別に指定しない限り、ＡＡＶ ＩＴＲ、および本書に記載される他の選択されたＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０または他の既知および未知のＡＡＶ血清型を包含するがそれに限定されない任意のＡＡＶ血清型の中から容易に選択されうる。ＩＴＲまたは他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な方法を用いて、あるＡＡＶ血清型から容易に単離されうる。そのようなＡＡＶは、学究的、商業的または公的な供給元（例えばThe American Type Culture Collection, Manassas, Va.）から単離または入手されうる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献またはデータベース、例えばGenBank、PubMed等において利用可能であるような公開された配列を参照して、合成的または他の適当な手段によって入手しうる。

本発明のｒＡＡＶを作製するのに必要なミニジーン、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびヘルパー機能は、搭載する配列を導入する任意の遺伝子要素の形態で、パッケージング宿主細胞に提供されうる。選択された遺伝子要素は、任意の適当な方法で提供されうる。本発明の任意の実施形態を構成するために用いられる方法は、核酸操作の技術を有する者に知られており、遺伝子操作、組換え操作、および合成技術を包含する。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを作製する方法がよく知られており、適当な方法の選択に関し本発明において制限はない。例えば、K. Fisher et al, 1993 J. Viral., 70:520-532および米国特許第5,478,745号等を参照されたい。これら文献は引用によって本書に組み込まれる。

前記の、および他の一般的なベクター、ならびに調節要素の選択は、従来のように行われ、多くの配列が利用可能である。例えば、Sambrookらの文献、およびその、例えば第３．１８〜３．２６頁および第１６．１７〜１６．２７頁に引用された文献、ならびにAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989を参照されたい。当然ながら、すべてのベクターおよび発現調節配列が、すべての本発明のトランス遺伝子の発現のために等しく十分に機能しうるわけではない。しかしながら、当業者は、前記の、および他の発現調節配列の中からの選択を、本発明の範囲を外れることなく行いうる。

医薬組成物および治療的処置
ｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡの所望のコーディング配列を含むウイルス粒子は、任意の適当な投与手段により必要とする患者またはヒトに投与するために製剤化することができる。そのような製剤化は、薬学的および／または生理学的に許容しうる賦形剤または担体、特に脳への投与、例えば頭蓋下または脊髄注入による脳への投与に適当なものの使用を伴う。さらに、併用処置において１つ以上のｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡ、またはその任意の組み合わせを投与しうる。併用処置において、異なるｓｈＲＮＡ、リボザイム、および／またはマイクロＲＮＡを、同時に、別々に、前後して、任意の順序で、投与しうる。

好ましくは、本発明の医薬組成物は、ヒトまたは動物体への注入による送達のために適当な担体および／または希釈剤を含む。そのような担体および／または希釈剤は、使用する用量および濃度で無毒性である。それは、単位用量もしくは多回用量形態の非経口投与用、または連続的もしくは定期的注入による直接注入用の組成物の調製のために通常用いられるものから選択される。それは好ましくは、等張、低張またはやや高張であり、比較的低いイオン強度を有し、これは例えば、糖、ポリアルコールおよび等張塩類液によりもたらされる。例としては、無菌水、生理食塩液（例えば塩化ナトリウム）、制菌水、リンガー液、グルコースもしくはサッカロース液、ハンクス液、および他の生理学的に平衡化された水性塩類液が挙げられる（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkinsの最新版を参照されたい）。本発明の組成物のｐＨは、ヒトまたは動物における使用に適するように、適当に、好ましくは生理的もしくはやや塩基性ｐＨ（約ｐＨ８〜約ｐＨ９、特に好ましくはｐＨ８．５）に調節され緩衝される。適当な緩衝剤は、リン酸緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）、炭酸水素緩衝剤および／またはTris緩衝剤を包含する。特に好ましい一組成物は、１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５４ｍｇ／ｌ Tween 80、１０ｍＭ Tris ｐＨ８．５中に調製される。他の好ましい一組成物は、１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ、２０ｍＭ Tris、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に調製される。組成物は−７０℃で少なくとも６箇月間安定である。

本発明の組成物は、さまざまな形態、例えば固体（例えば粉末、凍結乾燥形態）または液体（例えば水性）でありうる。固体の組成物の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から活性物質とさらなる所望の成分の粉末を生じる減圧乾燥および凍結乾燥である。そのような溶液は、所望により、注射用に無菌水の添加により再構成するための無菌アンプル中に貯蔵することができる。

ネブライザーによる投与用のまたはエアロゾル化された形態の製剤も本発明に含まれる。経鼻投与方法は当分野においてよく知られており、液滴、スプレー、または乾燥粉末形態の組成物を、適当なプロペラント（例えば、二酸化炭素といったガス）を含む圧力容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから、処置する個体の鼻咽頭に投与することを包含する（例えば、ＷＯ９５／１１６６４参照）。経口投与用の胃酸耐性カプセルおよび顆粒といた腸溶性製剤、直腸または膣投与用坐剤も、本発明に含まれる。非非経口投与用には、組成物は、粘膜の孔サイズを大きくする吸収促進剤をも含みうる。そのような吸収促進剤は、デオキシコール酸ナトリウム、グリコール酸ナトリウム、ジメチル−β−シクロデキストリン、ラウロイル−１−リゾホスファチジルコリン、および粘膜のリン脂質領域に類似する構造を有する他の物質を包含する。

組成物は、所望の薬学的または薬力学的性質をもたらすため、例えば製剤のｐＨ、浸透圧、粘性、透明度、色、無菌性、安定性、溶解速度を改変もしくは維持する、またはヒトもしくは動物体における放出もしくは吸収を改変もしくは維持するための、他の薬学的に許容しうる賦形剤をも含みうる。例えば、ポリエチレングリコールといったポリマーが、溶解性、安定性、半減期および他の薬学的に有利な性質の所望の性質を得るために使用されうる（Davis et al., 1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham et al., 1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51, 210-218）。安定化成分の例は、ポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびその組み合わせを包含する。プラスミドベースの組成物に特に適当な他の安定化成分は、次のものを包含する：ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３に記載されるように、宿主細胞の細胞外マトリックスを脱安定化すると考えられる）、クロロキン、プロトン性化合物、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチルＬ−２−ピロリドン、またはその誘導体、非プロトン性化合物、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル（ＥＰ８９０３６２参照）、ヌクレアーゼ阻害剤、例えばアクチンＧ（ＷＯ９９／５６７８４）、および陽イオン塩、例えばマグネシウム（Ｍｇ^２＋）（ＥＰ９９８９４５）およびリチウム（Ｌｉ^＋）（ＷＯ０１／４７５６３）、ならびにその誘導体。本発明の組成物中の陽イオン塩の量は、好ましくは約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、より好ましくは約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。増粘剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランを包含する。組成物は、血液関門または特定の器官の膜を横切る浸透または輸送を促進することが当分野で知られる物質（例えば、トランスフェリン受容体に対する抗体；Friden et al., 1993, Science 259, 373-377）をも含みうる。動脈細胞における投与を促進するために、ポリリジンおよびラクトースのゲル複合体（Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871-878）またはポロキサマー４０７（Pastore, 1994, Circulation 90, 1-517）を使用しうる。

ウイルス粒子および医薬組成物は、患者に処置有効量で投与しうる。本書において使用される用語「処置有効量」とは、所望の生物学的効果を実現するのに十分な量をいう。例えば、アンジェルマン症候群を処置するための処置有効量は、本書に記載するようなアンジェルマン症候群の１つ以上の症状（例えば、発達の遅れ、重度の認知障害、失調歩行、頻繁な発作、短い注意持続時間、発話の無いこと、および特徴的な幸福な様子）を改善するのに十分な量である。さらに、ＡＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンは、脱分極した静止膜電位、活動電位発生の遅れ、および自発性シナプス活動の低下を示す。したがって、ＡＳ処置のための処置有効量は、ニューロン静止膜電位を約−７０ｍＶに回復させ、活動電位発生の遅れを改善し、自発性シナプス活動を高め、または、基電流、活動電位特性（例えば波形）、膜電流、シナプス電位、イオンチャネルコンダクタンス等に関連するニューロン表現型におけるさらなる変化を改善しうる。

適当な投与量は、特定の活性物質の薬力学的性質、宿主生物の年齢、健康状態および体重；処置する状態、症状の種類と程度、併用処置の種類、処置の頻度、予防または治療の必要、および／または所望の効果といった、知られている因子によって異なりうる。投与量はまた、選択された特定の投与経路に応じて計算しうる。処置に適当な投与量を決定するために必要な計算のさらなる微調節は、関連する状況に照らして、医師によってルーチンになされる。一般的な基準として、ウイルス粒子ベースの組成物は、細胞当たり少なくとも１０^５ウイルスゲノムの用量の形態に調製しうる。力価は通常の方法で決定しうる。ベクタープラスミドベースの組成物は、１μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１００μｇ〜１ｍｇの範囲の用量の形態に調製しうる。投与は、単回投与、または一定の間隔を置いて１回以上反復される投与において、行いうる。

本発明の組成物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多回用量バイアルに封入されうる。いずれの場合も、組成物は、無菌でなければならず、容易な注射針通過が可能な程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件において安定でなければならず、細菌および真菌といった微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。無菌注射用液は、必要量の活性成分（例えば感染性粒子）を、上に挙げた成分の１つまたは組み合わせと合わせ、その後、滅菌濾過することによって調製しうる。

本発明のウイルス粒子および医薬組成物は、好ましくは、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入、くも膜下腔内または頭蓋内、例えば脳内もしくは脳室内投与を包含する非経口経路で投与する。一態様において、ウイルス粒子または医薬組成物は、脳内または脳室内投与する。他の一態様において、ウイルス粒子または医薬組成物は、くも膜下腔内投与する。

本発明の方法のいくつかの態様において、上述のウイルス粒子および医薬組成物は、必要とする患者またはヒトの脳内または脊髄内への頭蓋下注入によって、対象に投与する。本発明の特定の一態様において、脳内への頭蓋下投与は、本発明のコーディングヌクレオチド配列の、グリアおよびニューロンを包含する脳細胞への直接の投与をもたらす。本発明において使用する用語「ニューロン」は、脳の、または脳機能に関与する任意の細胞をいう。該用語は、単極性、双極性、多極性および偽単極性を包含するニューロンの種類の任意の１つをさしうる。

実施例
一般的方法
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の培養および神経分化
ｈＥＳＣを、照射マウス胚性線維芽細胞上で培養し、ｈＥＳＣ培地（knockout血清代替物、Ｌ−グルタミン＋β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、および塩基性線維芽細胞成長因子を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２）を毎日供給した。ｈＥＳＣを５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。細胞を５〜７日毎に手作業で継代した。

改良版の単相プロトコルを用いて、ｈＥＳＣをニューロンに分化させた。継代の２日後に、Ｎ２Ｂ２７培地（Neurobasal培地、１％Ｎ２、２％Ｂ２７、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％インスリン−トランスフェリン−セレン）中での細胞の培養により神経誘導を開始した。分化の最初の１０日間にわたり、Ｎ２Ｂ２７培地に新鮮なノギン（５００ｎｇ／ｍＬ）を補充した。神経誘導開始から約１４日後に、Stem Pro EZ継代ツールを用いて、神経ロゼットを、ポリ−Ｄ−リジンおよびラミニンコーティングしたプレートに手作業で継代した。約３週間の分化で神経前駆細胞を高密度で再度プレーティングし、約４週間の分化で神経分化誘導培地（ＮＤＭ）に切り替え、約５週で最終分化のために低密度でプレーティングした。ＮＤＭは、neurobasal培地、１％Ｂ２７、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．５％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、非必須アミノ酸、１μＭアスコルビン酸、２００μＭサイクリックＡＭＰ、１０ｎｇ／ｍＬ脳由来神経栄養因子、および１０ｎｇ／ｍＬグリア細胞由来神経栄養因子からなった。ニューロンを分化の１０〜１７週まで培養において維持した。ｈＥＳＣ維持およびニューロン分化のプロトコルは文献に記載されている。

ｓｈＲＮＡおよびリボザイムベクターの作製
ｓｈＲＮＡおよびリボザイムを、２つの相補的ポリヌクレオチドを所望の配列と共にアニーリングすることによって作製した。具体的には、ｓｈＲＮＡを作製するためのポリヌクレオチドは、標的化される特定の２１ヌクレオチドの配列およびその逆相補配列が、ＣＴＣＧＡＧのループ配列によって隔てられたもの、ならびにプラスミドベクターへのクローニングのために付加されたＣＣＧＧの５’フランク配列およびＴＴＴＴＴＧの３’フランク配列からなった。リボザイムを作製するためのポリヌクレオチドは、特定の４１のヌクレオチドの配列と、プラスミドクローニングのために付加された同じ５’および３’フランキング配列からなった。アニーリングされたポリヌクレオチドを、pLK0.1 puroベクター（Stewart et al RNA 2003 Apr;9(4):493-501）中にライゲーションした。ｓｈＲＮＡおよびリボザイム配列は、Ｕ６プロモーターの制御下にある。得られたプラスミドを、ｓｈＲＮＡ配列の正しい挿入を確認するためにSangerシーケンシングに付した。

レンチウイルスの作製およびニューロンのトランスダクション
リポフェクタミン３０００を用いて２９３ＦＴ細胞を第二世代パッケージングシステムでトランスフェクトすることによってレンチウイルス粒子を作製した。Lenti-X Concentrator Kit（Clontech）を用いてウイルスを濃縮し、qPCR Lentivirus Titration Kit（abm）を用いてウイルス力価を計算した。１０週となったニューロンを、ラミニンコーティングしたプラスチック皿に１．３細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングし、細胞当たり１０個のウイルス粒子を導入した。レンチウイルス導入の７日後にニューロンをＲＮＡのために採取した。

定量ＲＴ−ＰＣＲ
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientific）を製造者の指示に従って使用してｃＤＮＡを合成した。Step One Plus（Thermo Fisher Scientific）において、意図される各標的用のTaqman Gene Expression AssaysおよびMastermix（Thermo Fisher Scientific）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。反応は、GAPDH Endogenous Control Taqman Assayを正規化用のハウスキーピング遺伝子として用いて、テクニカルな二連で行った。遺伝子発現をΔΔＣ_ｔ法によって定量した。

ＡＡＶの作製およびニューロンのトランスダクション
５５１ ｓｈＲＮＡ ２およびスクランブルｓｈＲＮＡ対照が、業者によってｐＡＶ−Ｕ６−ＧＦＰベクター中にクローニングされウイルス粒子にパッケージングされた。ニューロンに５５１ ｓｈＲＮＡ ２ ＡＡＶ９粒子を、細胞当たり少なくとも１×１０^５ウイルスゲノムで導入した。４８時間後に、導入されたニューロンを可視化するよう、ニューロンを画像化した。

実施例１
インビトロでリボザイムの切断能力を試験するために、制御した条件下にリボザイムおよび標的ＲＮＡ配列をインビトロで転写し試験した。具体的には、Ｔ７配列を含むプライマーを使用して、意図する標的のゲノム配列を増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｔ７ポリメラーゼを用いるインビトロ転写アッセイに使用する前に、精製し濃縮した。ＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いるインビトロ転写反応に使用した。ＲＮＡを、MEGAclearキット（Ambion）を用いてカラム精製した。リボザイムＲＮＡを、２つの相補的なリボザイムポリヌクレオチドのアニーリングによって作製した。次いでそれをＴ４ポリメラーゼを用いて末端平滑化し、精製し濃縮した。リボザイムをワーキングストックとしてｄｄＨ２Ｏ中に適当な濃度（５ｐｍｏｌ／μＬ）に希釈した。リボザイムおよび標的ＲＮＡを、インビトロ切断アッセイにおいて３７℃で３０分間合し、２％アガロースゲル上で臭化エチジウムで可視化した。

ＲＮＡ中のホスホジエステル結合の加水分解を引き起こす触媒ＲＮＡ分子であるハンマーヘッド型リボザイムを最初に試験した。該リボザイムは、速やかに、かつ、他の細胞機構から独立して切断するもので、ＨＩＶおよびある種の腫瘍のために臨床試験において試験されている。４つのハンマーヘッド型リボザイムを、機能的ＡＳＯにより標的化される配列の近くで切断するようデザインした。インビトロ切断アッセイは、リボザイムが活性でありＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ配列を切断できることを示した（図３Ａ）。最も活性の高い２つのリボザイムである５５１Ｒｉｂｏ１（配列番号３）および５５１Ｒｉｂｏ２（配列番号４）は、レンチウイルスベクターによってコードされ、これはレンチウイルス粒子中にパッケージングされ、成熟ＡＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンへの導入に用いられた。ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子レベルは約４０％低下した（図３Ｂ）。

実施例２
ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ遺伝子中の同様の配列を標的とするｓｈＲＮＡを開発した。ｓｈＲＮＡはＲＮＡ干渉経路によってＲＮＡをノックダウンする。４つのｓｈＲＮＡを、レンチウイルスベクター中にクローニングすることによってデザインし、これはレンチウイルス粒子中にパッケージングされ、成熟ＡＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンへの導入に用いられた。５５１ｓｈＲＮＡ２（配列番号２）はＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの４０％のノックダウンおよび父性ＵＢＥ３Ａの２．２倍の活性化を達成した（図４）。これらの試験は、同じｓｈＲＮＡをアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中にクローニングし、ＡＡＶ９粒子にパッケージングすることによって繰り返されている（図５および６）。

上記の詳細な説明および実施例は、単に説明のためのものであって本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではないと理解される。本発明の範囲は特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定される。

開示される態様に対するさまざまな変更および改変が当業者には明らかでありうる。本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤または使用方法に関する変更および改変を包含するがそれに限定されない、そのような変更および改変は、その精神および範囲から外れることなくなされうる。

配列

Claims (35)

1. ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイムまたはマイクロＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングを抑制することができる、ポリヌクレオチド。
2. 第１のヌクレオチド配列がｓｈＲＮＡをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. ｓｈＲＮＡが、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的な第２のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 第１のヌクレオチド配列が配列番号２である、請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
5. 第１のヌクレオチド配列がリボザイムをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
6. リボザイムが、配列番号６または７のいずれかによりコードされるＲＮＡに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的な第２のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 第１のヌクレオチド配列が配列番号３または配列番号４である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
8. 第１のヌクレオチド配列がマイクロＲＮＡをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
9. マイクロＲＮＡが、配列番号５または配列番号９〜５０８のいずれかによりコードされるＲＮＡに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％相補的な第２のヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
10. 第１のヌクレオチド配列が配列番号８である、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
11. ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが父方ＵＢＥ３Ａの発現を増加させる、請求項１〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
12. 父方ＵＢＥ３Ａが配列番号５０９のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
13. 父方ＵＢＥ３Ａのサイレンシングが、配列番号１によりコードされるＲＮＡ転写物によるものである、請求項１〜１２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載されるポリヌクレオチド、およびプロモーターを含む、発現ベクター。
15. プロモーターがＵ６プロモーターである、請求項１４に記載の発現ベクター。
16. ポリヌクレオチドがＤＮＡポリヌクレオチドである、請求項１４または１５に記載の発現ベクター。
17. 発現ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項１４〜１６のいずれかに記載の発現ベクター。
18. 請求項１〜１３のいずれかに記載されるポリヌクレオチドを含む、ウイルス粒子。
19. 粒子がＡＡＶ粒子またはレンチウイルス粒子である、請求項１８に記載のウイルス粒子。
20. 粒子が特異的な向神経性を有するＡＡＶ粒子である、請求項１９に記載のウイルス粒子。
21. 粒子がＡＡＶ９またはＡＡＶ１０粒子である、請求項１９に記載のウイルス粒子。
22. 請求項１〜１３のいずれかに記載されるポリヌクレオチドまたは請求項１８〜２１のいずれかに記載されるウイルス粒子、および薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
23. 請求項１８〜２１のいずれかに記載されるウイルス粒子または請求項２２に記載される医薬組成物を処置有効量で必要とする患者に投与することを含む、アンジェルマン症候群を処置する方法。
24. 請求項１８〜２１のいずれかに記載されるウイルス粒子または請求項２２に記載される医薬組成物を処置有効量で必要とする患者に投与することを含む、父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子発現を活性化または発現増加させる方法。
25. 請求項１８〜２１のいずれかに記載されるウイルス粒子または請求項２２に記載される医薬組成物を、配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物を切断するのに有効な量で、必要とする患者に投与することを含む、配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物による父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のサイレンシングを抑制する方法。
26. ウイルス粒子または医薬組成物が患者の脳に投与される、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
27. ウイルス粒子または医薬組成物が患者のニューロンに投与される、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
28. 患者がヒトである、請求項２３〜２７のいずれかに記載の方法。
29. ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが、配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物による父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のサイレンシングを抑制する、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
30. ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが、配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドの転写を終結させる、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
31. ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが、配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物のレベルを低下させる、請求項２３〜３０のいずれかに記載の方法。
32. ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡが、配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物を切断する、請求項２３〜３１のいずれかに記載の方法。
33. アンジェルマン症候群の処置における使用するため、父方ＵＢＥ３Ａの活性化における使用のため、または配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物による父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のサイレンシングの抑制における使用のための、請求項１〜１３のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１８〜２１のいずれかに記載のウイルス粒子または請求項２２に記載の医薬組成物。
34. アンジェルマン症候群の処置用、父方ＵＢＥ３Ａの活性化用、または配列番号１によりコードされるＲＮＡアンチセンス転写物による父方ＵＢＥ３Ａ遺伝子のサイレンシングの抑制用の医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれかに記載されるポリヌクレオチド、請求項１８〜２１のいずれかに記載されるウイルス粒子または請求項２２に記載される医薬組成物の使用。
35. 請求項１〜１３のいずれかに記載されるポリヌクレオチドによりコードされる、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたはマイクロＲＮＡ。

Images