KR20170071541A - 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법 - Google Patents

근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170071541A
KR20170071541A KR1020177012963A KR20177012963A KR20170071541A KR 20170071541 A KR20170071541 A KR 20170071541A KR 1020177012963 A KR1020177012963 A KR 1020177012963A KR 20177012963 A KR20177012963 A KR 20177012963A KR 20170071541 A KR20170071541 A KR 20170071541A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sod1
sirna
vector
synthetic
artificial sequence
Prior art date
Application number
KR1020177012963A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102599909B1 (ko
Inventor
디나 웬-이 사
진자오 호우
마티유 이. 논넨마커
펑청 주
마르쿠스 호스바흐
요헨 데커트
Original Assignee
보이저 테라퓨틱스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 보이저 테라퓨틱스, 인크. filed Critical 보이저 테라퓨틱스, 인크.
Priority to KR1020237037989A priority Critical patent/KR20230169197A/ko
Publication of KR20170071541A publication Critical patent/KR20170071541A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102599909B1 publication Critical patent/KR102599909B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 SOD1 유전자에 대한 작은 간섭 RNA(siRNA), siRNA 분자를 암호화하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 및 이러한 siRNA 분자 및 AAV 벡터를 사용하여 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)}
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 11월 14일자로 출원된 SOD-1을 표적화하는 siRNA를 이용한 근위축성 측삭 경화증(ALS)의 치료라는 제목의 미국 가출원 제62/079,588호, 2015년 8월 31일자로 출원된 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 조성물 및 방법이라는 제목의 미국 가출원 제62/211,992호, 2015년 9월 29일자로 출원된 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하는 조성물 및 방법이라는 제목의 미국 가출원 제62/234,466호의 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 전자적으로 포맷된 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2015년 11월 12일자로 생성된 1011PCTSL.txt라는 명칭의 파일로 제공되고, 그 크기는 126,873바이트이다. 서열 목록의 전자 포맷으로 된 정보는 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 조절성(modulatory) 폴리펩티드, 예컨대 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1) 유전자를 표적화하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 분자의 설계, 제제, 제조, 사용 및/또는 제형을 위한 조성물, 방법 및 공정에 관한 것이다. 본원에 사용된 "조절성 폴리뉴클레오티드"는 표적 유전자, 예컨대, mRNA의 수준 또는 양, 또는 단백질 수준을 조절(증가 또는 감소)하는 기능을 하는 임의의 핵산 서열이다. SOD1 유전의 표적화는 SOD1 유전자의 발현 및 SOD1 효소 생산을 방해할 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터에 삽입된다. 신경퇴행성 질환(예컨대, 근위축성 측삭 경화증(ALS))을 가진 대상에서 SDO1 유전자 발현을 저해하기 위해 siRNA 분자를 사용하는 방법이 또한 개시된다.
발명의 배경
루게릭병으로도 알려진 근위축성 측삭 경화증(ALS)은 일차 운동 피질, 뇌간 및 척수에서 운동 뉴런(MN)의 두드러진 손실을 특징으로 하는 가장 치명적인 진행성 신경퇴행성 질환이다. 운동 뉴런의 손실은 호흡과 같은 기본적이고 근본적인 움직임을 파괴하고, 일반적으로 진단 후 2~5년 이내에 환자의 사망을 초래한다. 환자의 운동 기능의 점진적인 악화는 환자의 호흡 능력을 심각하게 저해하여 환자의 생존을 위한 어떤 형태의 호흡 보조기구를 필요로 한다. 다른 증상으로는 손, 팔, 다리 또는 연하 근육의 근육 약화를 또한 포함한다. 일부 환자(예컨대, 전두측두엽 치매(FTD)-ALS)는 전두측두엽 치매를 발달시킬 수도 있다.
ALS 협회에 따르면, 미국에서 약 5,600명이 매년 ALS로 진단된다. ALS의 발병률은 100,000명 당 2명이며, 임의의 주어진 시간에 30,000명의 미국인이 이 질환을 갖는 것으로 추정된다.
2가지 형태의 ALS가 기술되어 있다: 하나는 산발성 ALS(sALS)로, 이는 미국에서 가장 흔한 형태의 ALS이고 진단된 모든 사례의 90 내지 95%를 차지한다; 또 다른 하나는 가족성 ALS(fALS)로, 주로 우성 유전을 가진 가족 계통에서 발생하며 미국에서 모든 사례의 약 5 내지 10%만을 차지한다. sALS와 fALS는 임상적으로 구별할 수 없다.
병리학적 연구로 확인된 바에 따르면, 소포체 스트레스(ER stress) 증가, 자유 라디칼(즉, 반응성 산소종(ROS)) 생성, 미토콘드리아 기능부전, 단백질 응집, 세포자멸, 염증 및 글루타메이트 흥분세포독성(excitotoxicity)을 포함하여, 질병 발병 후 일부 세포 과정의 교란이 특히 운동뉴런(MN)에서 일어난다.
ALS의 원인은 복잡하고 이질적이다. 일반적으로, ALS는 환경 노출과 함께 다수의 유전자가 합쳐져 사람을 취약하게 만드는 복잡한 유전적 장애로 간주된다. SOD-1(Cu2+/Zn2+ 슈퍼옥사이드 디스뮤타제), TDP-43(TARDBP, TAR DNA 결합 단백질-43), FUS(육종 융합/육종 전좌), ANG(안지오제닌), ATXN2(아탁신-2), 발로신(valosin) 함유 단백질(VCP), OPTN(옵티뉴린) 및 9번 염색체의 개방형 해독 틀 72(C9ORF72)에서 비암호화 GGGGCC 헥사뉴클레오티드 반복 확장을 포함하여 ALS와 관련된 12개가 넘는 유전자가 발견되었다. 그러나, 운동 뉴런 퇴행의 정확한 메커니즘은 아직 파악하기 어렵다.
현재, ALS의 치료법은 없다. 유일하게 FDA에서 승인된 약물은 릴루졸(Riluzole)로, 글루타메이트 반응에 길항하여 ALS의 병리학적 발달을 감소시킨다. 그러나 초기 단계의 ALS 환자에 대해 단지 약 3개월의 수명 연장이 보고 되었고, 후기 단계의 ALS 환자에 대한 치료 효과는 관찰되지 않았으며, 이는 환자를 위한 치료 선택의 부족을 나타낸다 (Bensimon G 등, J Neurol. 2002, 249, 609-615). 따라서, 질병 진행을 효과적으로 예방할 수 있는 새로운 치료 전략이 여전히 요구된다.
산발성과 가족성 ALS 모두의 잠재적인 치료법에 대하여 많은 상이한 전략이 연구 중에 있다. 하나의 전략은, 뉴런의 생존을 촉진할 수 있는 신경영양 인자, 예컨대 인슐린-유사 성장 인자 I(IGF-I), 신경교세포주 유도 신경영양인자(GDNF), 혈관내피성장인자(VEGF), 콜리벨린(Colivelin) 및 활성 의존성 신경영양 인자(ADNF)로 유도된 펩티드의 신경보호 및/또는 재생 효과에 기초한다. 몇몇 연구들은 신경영양 인자가 운동 뉴런 기능을 보존하므로 SOD1 형질전환 마우스에서 운동 능력을 향상시킬 수 있음을 보여주었다. 그러나, 이러한 치료법은 종종 SOD1 마우스의 생존 연장에 실패하여, 신경영양 인자가 뉴런의 생존을 연장하기에는 충분하지 않음을 시사한다(Yacila 및 Sari, Curr Med Chem., 2014, 21(31), 3583-3593 리뷰 참조).
ALS 치료를 위한 또 다른 전략은 줄기 세포에 기초한 치료법에 초점을 맞추어 왔다. 줄기 세포는 운동 뉴런을 생성하여 ALS의 영향을 받은 CNS, 예컨대 일차 운동 피질, 뇌간 및 척수에서 퇴행성 운동 뉴런을 대체할 잠재력이 있다. 유도만능줄기세포(iPSC), 중간엽 줄기 세포(MSC)(예컨대 골수 중간엽 줄기 세포(BMSC) 및 지방 줄기 세포(ASC)) 및 신경 조직 기원 신경 줄기 세포(예컨대 태아 척수 신경 줄기 세포(NSC), 다능성 신경 전구 세포(NPC))를 포함하여, 여러 소스로부터 유도된 줄기 세포가 조사되었다(예컨대, Kim C 등, Exp . Neurobiol., 2014, 23(3), 207-214 참조).
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유형 I(SOD1; Cu2 +/Zn2 + 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 유형 I) 유전자에서의 돌연변이는 가장 흔한 fALS의 원인이며, 전체 fALS의 사례 중 약 20 내지 30%를 차지한다. 최근 보고는 SOD1 돌연변이가 모든 sALS 사례의 약 4 %정도와 관련이 있을 수도 있음을 나타낸다(Robberecht 및 Philip, Nat. Rev. Neurosci., 2013, 14, 248-264). SOD1-관련 fALS는 정상 SOD1 활성의 상실에 의한 것이 아니라 독성 기능의 획득에 의한 것일 가능성이 크다. 돌연변이 SOD1-관련 fALS 독성에 대한 가설 중 하나는 비정상적인 SOD1 효소가 과산화질산염 또는 과산화수소와 같은 작은 분자를 생성하여 유해한 자유 라디칼을 생성한다고 제시한다. 돌연변이 SOD1 신경 독성에 대한 다른 가설은 프로테아좀 활성의 저해, 미토콘드리아 손상, RNA 처리과정의 파괴 및 세포 내 응집체 형성을 포함한다. ALS에서 돌연변이 SOD1 변이체 및/또는 야생형 SOD1의 비정상적인 축적은 병리학적인 봉입체(inclusion)로 확인된 불용성 섬유성 응집체를 형성한다. 응집된 SOD1 단백질은 미토콘드리아 스트레스(Vehvilainen P 등, Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126) 및 세포, 특히 운동 뉴런에 대해 다른 독성을 유도할 수 있다.
이러한 발견은 SOD1이 가족성과 산발성 ALS 모두에 대한 잠재적인 치료 표적이 될 수 있음을 나타낸다 ALS 환자의 중추신경계에서 생산된 SOD1 단백질을 감소시킬 수 있는 치료법은, 환자에서 운동 뉴런 퇴행 및 근육 약화 및 위축과 같은 ALS 증상을 개선할 수 있다. 야생형 및/또는 돌연변이 SOD1 단백질 응집체의 형성을 방지하는 것을 목표로 하는 제제 및 방법은 질병 진행을 예방할 수 있고 ALS 증상을 개선할 수 있다. RNA 간섭(RNAi)이 매개된 유전자 침묵은 최근에 연구자들의 관심을 불러 일으켰다. SOD1 유전자를 표적화하는 작은 이중 가닥 RNA(작은 간섭 RNA) 분자는 ALS 치료에서 이의 잠재력에 대해 당업계에서 교시되었다(미국특허 제7,632,938호 및 미국공개특허 제20060229268의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함).
본 발명은 질병의 치료를 위해 ALS 환자에서 SOD1의 발현을 억제 또는 예방하기 위한 RNA 간섭에 기초한 접근법을 개발한다.
본 발명은 새로운 종류의 이중 가닥 RNA(dsRNA) 구조와 siRNA 구조 및 그 설계 방법을 제공한다. 또한, 이러한 신규한 siRNA 작제물은 합성 분자이거나 세포로 전달하기 위해 발현 벡터(하나 또는 두 가닥 모두)에 암호화 될 수 있다. 이러한 벡터는 비제한적으로 임의의 AAV 혈청형의 벡터 게놈 또는 렌티 바이러스와 같은 기타 바이러스 전달 비히클과 같은 아데노-관련된 바이러스 벡터를 포함한다.
발명의 내용
본 발명은 유전자 발현 및 단백질 생산을 특이적으로 간섭하는 RNA 분자 매개된 유전자에 관한 것이다. 운동 뉴런 퇴행성 질환, 예컨대 근위축성 측삭 경화증 치료 방법 또한 본 발명에 포함된다. 본원에 특징화된 조성물에 포함된 siRNA는 SOD1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인, 30 뉴클레오티드 이하, 일반적으로 19 내지 24 뉴클레오티드 길이의 영역을 갖는 안티센스 가닥(안티센스 가닥)을 갖는 dsRNA를 포함한다.
본 발명은, SOD1 유전자 발현 및/또는 SOD1 단백질 생산을 저해하기 위해 SOD1 mRNA를 표적화하는 작은 간섭 RNA(siRNA) 이중가닥과 같은 짧은 이중 가닥 RNA 분자를 제공한다. 본 발명의 siRNA 이중가닥은 SOD1 유전자에서 임의의 특정 돌연변이와는 무관하게 SOD1 유전자의 두 대립유전자를 저해할 수 있고, 특히 ALS 질환에서 발견되는 두 대립유전자와 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 siRNA 분자 또는 siRNA 분자의 단일 가닥은 아데노-관련 바이러스 벡터에 삽입되어 세포, 특히 운동 뉴런 및/또는 중추신경계의 다른 주변 세포 내에 도입된다.
본 발명의 siRNA 이중가닥은 함께 혼성화되어 이중가닥 구조를 형성하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 포함하며, 이때, 안티센스 가닥은 표적화된 SOD1 유전자의 핵산 서열에 대해 상보적이고, 센스 가닥은 표적화된 SOD1 유전자의 핵산 서열에 대해 상동성이다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단은 5' 인산염 기를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단은 3' 히드록시 기를 함유한다. 다른 양태에서, 각 가닥의 3' 말단에는 하나 또는 2개의 뉴클레오티드 오버행(overhang)이 있거나 존재하지 않는다.
본 발명에 따르면, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥의 각 가닥은 길이가 약 19 내지 25 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 약 19 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 21 뉴클레오티드, 22 뉴클레오티드, 23 뉴클레오티드, 24 뉴클레오티드 또는 25 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, siRNA는 변형되지 않은 RNA 분자일 수 있다.
다른 양태에서, siRNA는 염기, 당 또는 골격 변형과 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
하나의 구현예에서, siRNA 또는 dsRNA는 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함한다. dsRNA는 제1서열을 갖는 센스 가닥 및 제2서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 SOD1을 암호화하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 길이가 30 뉴클레오티드 이하, 15 뉴클레오티드 이상이다. 일반적으로, dsRNA는 길이가 19 내지 24, 예컨대, 19 내지 21 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, dsRNA는 길이가 약 15 내지 약 25 뉴클레오티드 이고, 다른 구현예에서, dsRNA는 길이가 약 25 내지 약 30 뉴클레오티드이다.
dsRNA는, SOD1을 발현하는 세포와 접촉하거나, SOD1을 발현하는 세포내에서 전사되면, 본원에 기술된 방법으로 분석했을 때, SOD1 유전자의 발현을 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상 또는 40% 이상 저해 또는 억제한다.
본 발명에 따르면, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥, siRNA 이중가닥 중 하나의 가닥 또는 dsRNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터가 생산되며, AAV 벡터 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 및/또는 AAV-DJ 및 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에 따르면, ALS에서 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 또는 dsRNA는 표 3, 표 11 또는 표 13에 나열되어 있는 siRNA 이중가닥으로부터 선택된다. 바람직하게는, ALS에서 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 siRNA 이중가닥: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 및 D-2858로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 SOD1 유전자를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, siRNA 이중가닥을 암호화하는 핵산 서열이 AAV 벡터에 삽입된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포에서 SOD1 유전자 발현을 저해/침묵시키는 방법을 제공한다. 따라서, siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 세포, 특히 운동 뉴런에서 SOD1 유전자 발현을 실질적으로 저해하기 위해 사용될 수 있다. 일부 양태에서, SOD1 유전자 발현 저해는 약 20% 이상, 바람직하게는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지의 저해를 지칭한다. 따라서, 표적화된 유전자의 단백질 산물은 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지 저해될 수 있다. SOD1 유전자는 야생형 유전자이거나 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 SOD1 유전자일 수 있다. 따라서, SOD1 단백질은 야생형 단백질 또는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에서 비정상적인 SOD1 유전자 및/또는 SOD1 단백질과 관련된 근위축성 측삭 경화증을 치료 또는 개선하는 방법을 제공하며, 이 방법은 SOD1 유전자를 표적화하는 약제학적으로 유효한 양의 하나 이상의 siRNA 이중가닥을 대상에 투여하는 것, 상기 siRNA 이중가닥을 표적화된 세포에 전달하는 것, SOD1 유전자 발현 및 단백질 생산을 저해하는 것, 및 대상에서 ALS 증상을 개선하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, SOD1 유전자를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터가 ALS의 치료 및/또는 개선을 필요로 하는 대상에 투여된다. AAV 벡터 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10 및 AAV-DJ 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, ALS는 SOD1 돌연변이와 관련된 가족성 ALS이다. 다른 양태에서, ALS는 SOD1 단백질의 비정상적인 응집 또는 SOD1 단백질 기능 또는 위치화 (localization)의 중단을 특징으로 하는 산발성 ALS이지만, 유전적 돌연변이의 결과일 필요는 없다. 본 방법에 의해 개선되는 ALS 증상은 운동 뉴런 퇴행, 근육 약화, 근육 경직, 불분명한 발음 및/또는 호흡 곤란을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 또는 dsRNA 또는 이러한 siRNA를 암호화하는 분자를 포함하는 AAV 벡터가, 예컨대 두개내 주사에 의해 대상의 중추신경계 내로 직접 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단독 요법으로서 사용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 병용 요법으로서 사용된다. 병용 요법은 운동 뉴런 퇴행에 신경보호 효과가 시험된 하나 이상의 신경보호제, 예컨대 작은 분자 화합물, 성장인자 및 호르몬과 병용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상에 본원에 기술된 약제학적으로 유효한 양의 플라스미드 또는 AAV 벡터를 투여하여 근위축성 측삭 경화증을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. ALS는 가족성 ALS 또는 산발성 ALS일 수 있다.
도면의 간단한 설명
전술한 목적 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에서 도시된 바와 같이 특정 구현예에 대한 다음의 설명으로부터 명백해질 것이며, 동일한 참조 부호는 상이한 도면 전반에 걸쳐 동일한 부분을 지칭한다. 도면은 축척일 필요는 없으며, 대신에 본 발명의 다양한 구현예의 원리를 설명할 때 강조된다.
도 1은 AAV 벡터에 암호화된 작제물의 활성을 보여주는 그래프다.
도 2는 HEK293T 세포에서 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 가이드 가닥의 활성을 보여주는 그래프다.
도 3은 HEK293T 세포에서 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 패신저(passenger) 가닥의 활성을 보여주는 그래프다.
도 4는 HeLa 세포에서 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 가이드 가닥의 활성을 보여주는 그래프다.
도 5는 HeLa 세포에서 AAV 벡터에 암호화된 조절성 폴리뉴클레오티드의 패신저 가닥의 활성을 보여주는 그래프다.
도 6은 세포내 AAV DNA에 대한 그래프다.
도 7은 인간 운동 뉴런에서 AAV 벡터에 암호화된 작제물의 활성을 보여주는 그래프다.
도 8은 U251MG 세포에서 SOD1의 용량-의존적인 침묵을 보여주는 도표이다.
도 9는 인간 성상세포에서 SOD1의 용량-의존적인 침묵을 보여주는 도표이다.
도 10은 U251MG 세포에서 SOD1의 시간 경과에 따른 침묵을 보여주는 도표이다.
도 11은 작제물의 용량-의존적인 효과를 보여주는 도표 11A, 11B 및 11C를 포함한다. 도표 11A는 상대적인 SOD1 발현을 보여준다. 도표 11B는 가이드 가닥의 퍼센트를 보여준다. 도표 11C는 패신저 가닥의 퍼센트를 보여준다.
도 12는 ITR, 인트론(I) 및 폴리A(P)와 관련하여 조절성 폴리뉴클레오티드(MP)의 위치를 나타내는 도표이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 치료제로서 조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 RNA 또는 DNA 분자에 관한 것이다. RNA 간섭 매개된 유전자 침묵은 특히 표적화된 유전자 발현을 저해할 수 있다. 이어서, 본 발명은 SOD1 유전자를 표적화하는 작은 이중가닥 RNA(dsRNA) 분자(작은 간섭 RNA, siRNA), 이러한 siRNA를 포함하는 약제학적 조성물 및 그 설계 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 신경퇴행성 질환, 특히 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하기 위한, SOD1 유전자 발현 및 단백질 생산을 저해하기 위한 이의 용법을 제공한다.
본 발명은 SOD1 mRNA를 표적화하여 SOD1 유전자 발현 및/또는 SOD1 단백질 생산을 저해하는, 작은 간섭 RNA(siRNA) 이중가닥(및 이를 암호화하는 조절성 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 본 발명의 siRNA 이중가닥은 SOD1 유전자에서 임의의 특정 돌연변이와는 무관하게 SOD1 유전자의 두 대립유전자를 저해할 수 있고, 특히 ALS 질환에서 발견되는 두 대립유전자와 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 siRNA 분자 또는 siRNA 분자의 단일 가닥을 암호화하는 핵산 서열은 아데노-관련 바이러스 벡터에 삽입되어 세포, 특히 운동 뉴런 및/또는 중추신경계의 다른 주변 세포 내에 도입된다.
본 발명의 암호화된 siRNA 이중가닥은 함께 혼성화되어 이중가닥 구조를 형성하는 안티센스 가닥 및 센스 가닥을 함유하며, 이때, 안티센스 가닥은 표적화된 SOD1 유전자의 핵산 서열에 대해 상보적이고, 센스 가닥은 표적화된 SOD1 유전자의 핵산 서열에 대해 상동성이다. 일부 양태에서, 안티센스 가닥의 5' 말단은 5' 인산염 기를 갖고, 센스 가닥의 3' 말단은 3' 히드록시 기를 함유한다. 다른 양태에서, 각 가닥의 3' 말단에는 하나 또는 2개의 뉴클레오티드 오버행이 있거나 이것이 존재하지 않는다.
본 발명에 따르면, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥의 각 가닥은 길이가 약 19 내지 25, 19 내지 24 또는 19 내지 21 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 약 19 뉴클레오티드, 20 뉴클레오티드, 21 뉴클레오티드, 22 뉴클레오티드, 23 뉴클레오티드, 24 뉴클레오티드 또는 25 뉴클레오티드 이다. 일부 양태에서, siRNA는 변형되지 않은 RNA 분자일 수 있다.
다른 양태에서, siRNA는 염기, 당 또는 골격 변형과 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
하나의 구현예에서, siRNA 또는 dsRNA는 서로 상보적인 2개 이상의 서열을 포함한다. dsRNA는 제1서열을 갖는 센스 가닥 및 제2서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 SOD1을 암호화하는 mRNA의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상보성 영역은 길이가 30 뉴클레오티드 이하, 15 뉴클레오티드 이상이다. 일반적으로 dsRNA는 길이가 19 내지 25, 19 내지 24 또는 19 내지 21 뉴클레오티드 이다. 일부 구현예에서, dsRNA는 길이가 약 15 내지 약 25 뉴클레오티드 이고, 다른 구현예에서, dsRNA는 길이가 약 25 내지 약 30 뉴클레오티드이다.
dsRNA는, SOD1을 발현하는 세포와 접촉시 발현 벡터에서 직접 투여되거나 이에 암호화되든 간에, 본원에 기술된 방법으로 분석했을 때, SOD1 발현을 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상 또는 40% 이상까지 저해한다.
본원에 기술된 조성물에 포함된 siRNA 분자는 길이가 30 뉴클레오티드 이하, 일반적으로 19 내지 25, 19 내지 24 또는 19 내지 21 뉴클레오티드인 영역을 갖는 안티센스 가닥(안티센스 가닥)을 갖는 dsRNA를 포함하며, 이는 SOD1 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부분에 대해 실질적으로 상보적이다.
본 발명에 따르면, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥, siRNA 이중가닥 중 하나의 가닥 또는 dsRNA의 핵산을 포함하는 AAV 벡터가 생산되며, AAV 벡터 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 및 AAV-DJ 및 이의 변이체일 수 있다.
본 발명에 따르면, ALS에서 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 표 3에 나열된 siRNA 이중가닥으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, ALS에서 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 siRNA 이중가닥: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 및 D-2858로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 SOD1 유전자를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, siRNA 이중가닥은 AAV 벡터에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 세포에서 SOD1 유전자 발현을 저해/침묵시키는 방법을 제공한다. 따라서, siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 세포, 특히 운동 뉴런에서 SOD1 유전자 발현을 실질적으로 저해하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, SOD1 유전자 발현 저해는 적어도 약 20%까지, 예컨대 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 저해하는 것을 지칭한다. 따라서, 표적화된 유전자의 단백질 생산은 적어도 약 20 까지, 바람직하게는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 저해될 수 있다. SOD1 유전자는 야생형 유전자이거나 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 SOD1 유전자일 수 있다. 따라서, SOD1 단백질은 야생형 단백질 또는 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 폴리펩티드이다.
하나의 구현예에서, siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 SOD1 단백질 발현을 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 감소시키는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, SOD1 단백질 발현의 발현은 50 내지 90% 감소될 수 있다.
하나의 구현예에서, siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 SOD1 mRNA 발현을 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 감소시키는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, SOD1 mRNA 발현의 발현은 50 내지 90% 감소될 수 있다.
하나의 구현예에서, siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 하나 이상의 CNS 영역, 예컨대 비제한적으로 척수, 전뇌, 중뇌 및 후뇌에서 SOD1 단백질 및/또는 mRNA의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. SOD1 단백질 및/또는 mRNA의 발현은 하나 이상의 CNS 영역에서 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 감소시킨다. 비제한적인 예로서, 척수에서 SOD1 단백질 및 mRNA 발현의 발현은 50 내지 90%까지 감소된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상에서 비정상적인 SOD1 유전자 및/또는 SOD1 단백질과 관련된 근위축성 측삭 경화증을 치료 또는 개선하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 SOD1 유전자를 표적화하는 약제학적으로 유효량의 하나 이상의 siRNA 이중가닥 또는 siRNA 이중가닥을 암호화하는 핵산을 대상에 투여하는 것, 상기 siRNA 이중가닥(또는 암호화된 이중가닥)을 표적화된 세포에 전달하는 것, SOD1 유전자 발현 및 단백질 생산을 저해하는 것, 및 대상에서 ALS 증상을 개선하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, SOD1 유전자를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터가 ALS의 치료 및/또는 개선을 필요로 하는 대상에 투여된다. AAV 벡터 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8(AAVDJ8) 및 AAV-DJ(AAVDJ) 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, AAV 벡터 혈청형은 AAV2이다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터 혈청형은 AAVDJ이다. 또 다른 구현예에서, AAV 벡터 혈청형은 AAVDJ8이다.
하나의 구현예에서, 본 발명에서 유용한 혈청형은 AAV-DJ8일 수 있다. AAV-DJ8의 아미노산 서열은 헤파린 결합 도메인(HBD)을 제거하기 위한 2개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 미국특허 제7,588,772호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에서 서열번호 1로 기재된 AAV-DJ 서열은, 2개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) 587번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 글루타민(Q; gln)으로 바뀐 R587Q, 및 (2) 590번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 트레오닌(T; thr)으로 바뀐 R590T. 또 다른 비제한적인 예로서 3개의 돌연변이를 포함할 수 있다: (1) 406번 아미노산에서 리신(K; lys)이 아르기닌(R; arg)으로 바뀐 K406R, (2) 587번 아미노산에서 아르기닌(R; arg)이 글루타민(Q; gln)으로 바뀐 R587Q, 및 (3) 590번 아미노산 590에서 아르기닌(R; arg)이 트레오닌(T; thr)으로 바뀐 R590T.
일부 양태에서, ALS는 SOD1 돌연변이와 관련된 가족성 ALS이다. 다른 양태에서, ALS는 SOD1 단백질의 비정상적인 응집 또는 SOD1 단백질 기능 또는 위치화(localization)의 일탈을 특징으로 하는 산발성 ALS이다. 본 방법에 의해 개선되는 ALS 증상은, 비제한적으로 운동 뉴런 퇴행, 근육 약화, 근육 경직, 불분명한 발음 및/또는 호흡 곤란을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 또는 암호화된 dsRNA 또는 이러한 siRNA 분자를 포함하는 AAV 벡터가, 예컨대 두개내 주사에 의해 대상의 중추신경계 내로 직접 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단독 요법으로서 사용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 병용 요법으로서 사용된다. 병용 요법은 운동 뉴런 퇴행에 신경보호 효과가 시험된 하나 이상의 신경보호제, 예컨대 작은 분자 화합물, 성장인자 및 호르몬과 병용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 필요로 하는 대상에 본원에 기술된 약제학적으로 유효한 양의 플라스미드 또는 AAV 벡터를 투여하여 근위축성 측삭 경화증을 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. ALS는 가족성 ALS 또는 산발성 ALS일 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부 사항은 이하의 첨부된 설명에서 설명된다. 본원에 기술된 것과 유사 또는 동일한 임의의 물질 및 방법이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 이하 설명한다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점이 이 설명으로부터 명백해질 것이다. 본 설명에서, 단수 형태는 문맥에서 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수를 포함한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충이 있는 경우, 본 설명에 따른다.
근위축성 측삭 경화증( ALS )
성인-발병 신경퇴행성 장애인 근위축성 측삭 경화증(ALS)는 운동 피질, 뇌간 및 척수에서 선택적인 사멸을 특징으로 하는 진행성이고 치명적인 질환이다. ALS의 발병률은 100,000명당 약 1.9명이다. ALS로 진단된 환자는 경련, 과다반사 또는 반사저하, 갑작스런 경련(fasciculation), 근육 위축 및 마비를 특징으로 하는 진행성 근육 표현형을 발달시킨다. 이러한 운동 장애는 운동 뉴런의 손실로 인한 근육의 탈신경화(denervation)에 기인한다. ALS의 주요 병리학적 특징은 피질척수로(corticospinal tract)의 퇴행 및 하위 운동 뉴런(LMN) 또는 전각 세포(anterior horn cell)의 광범위한 손실(Ghatak 등, J Neuropathol Exp Neurol., 1986, 45, 385-395), 일차 운동 피질에서의 베츠(Betzl) 세포 및 추상세포의 퇴행(Udaka 등, Acta Neuropathol, 1986, 70, 289-295; Maekawa 등, Brain, 2004, 127, 1237-1251) 및 운동 피질 척수에서의 반응성 신경교증(reactive gliosis)(Kawamata 등, Am J Pathol., 1992, 140,691-707; 및 Schiffer 등, J Neurol Sci., 1996, 139, 27-33)을 포함한다. ALS는 호흡 결함 및/또는 염증에 의해 보통 진단 후 3 내지 5년 이내에 치명적이다(Rowland LP 및 Shneibder NA, N Engl . J. Med., 2001, 344, 1688-1700).
ALS의 세포 특징은 퇴행성 운동 뉴런 및 주변 세포(예컨대, 성상세포)에서 단백질성 유비퀴틴화된 세포 봉입체의 존재이다. 유비퀴틴화된 봉입체(즉, 루이소체 유사 봉입체 또는 스케인 유사 봉입체)는 ALS에서 가장 흔하고 특이적인 유형의 봉입체며, 척수 및 뇌간의 LMN, 및 피질척수 상위 운동 뉴런 (UMN)에서 발견된다(Matsumoto et al., J Neurol Sci., 1993, 115, 208-213; and Sasak and Maruyama, Acta Neuropathol., 1994, 87, 578-585). 일부 단백질은 유비퀴틴, Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1), 페리페린 및 도르핀(Dorfin)을 비롯하여, 봉입체의 구성요소로 확인되었다. 신경미세섬유성 봉입체는 종종 ALS의 척수 운동 뉴런에서 유리질 거대 봉입체(HCI) 및 축삭 "스페로이드(spheroids)"에서 발견된다. 다른 유형 및 덜 특이적인 봉입체는 피질 위층에서의 부니아 바디(Bunina bodies)(시스타틴 C-함유 봉입체)와 크레센트(Crescen) 모양의 봉입체(SCI)를 포함한다. ALS에서 나타나는 다른 신경병리학적 특징은 골지체의 분절화, 미토콘드리아의 액포화 및 시냅스 말단의 초미세구조의 비정상을 포함한다(Fujita et al., Acta Neuropathol. 2002, 103, 243-247).
추가로, 전두측두엽 치매 ALS(FTD-ALS)에서의 피질 위축(전두엽 및 측두엽 포함)이 또한 관찰되며, 이는 FTD-ALS 환자에서 인지 장애를 야기할 수 있다.
ALS는 복잡하고 다요인성 질환이고, ALS 발병기전을 담당하는 것으로 가설되는 다수의 메커니즘은 비제한적으로, 단백질 분해의 기능장애, 글루타메이트 흥분세포독성, 미토콘드리아 기능장애, 세포자멸, 산화 스트레스, 염증, 단백질 잘못 접힘 및 응집, 비정상적인 RNA 대사, 및 변경된 유전자 발현을 포함한다.
ALS 사례의 약 10% 내지 15%는 질환의 가족력이 있으며, 이러한 환자는 가족성 ALS(fALS) 또는 유전된 환자라고 지칭되며, 일반적으로 유전 및 높은 침투도의 멘델식 우성 방식으로 유전된다. 나머지(약 85% 내지 95%)는 이들은 기록된 가족력과는 관련이 없기 때문에 산발성 ALS(sALS)으로 분류되지만, 대신에 비제한적으로 환경적인 요인, 유전적 다형성, 체세포 돌연변이 및 가능한 유전-환경적 상호작용을 포함하는 다른 위험 요소에 기인하는 것으로 생각된다. 대부분의 경우에서, 가족성(또는 유전성) ALS는 상염색체 우성 질환으로 유전되지만, 상염색체 열성 및 X-연관된 유전을 불완전한 침투가 있는 내력이 존재한다. 산발성 및 가족성 형태는 임상적으로 구분할 수 없으므로 일반적인 병인을 시사한다. ALS에서 운동 뉴런의 선택적인 사멸의 정확한 원인은 여전히 불분명하다. fALS에서 유전적인 요인을 이해하는 과정은 두 형태의 질환이 밝혀질 수 있다.
최근에, ALS의 유전적 원인으로의 폭발적인 증가는 fALS의 원인으로 공지된 10개 이상의 상이한 유전자에서 돌연변이를 발견하였다. 가장 흔한 한 가지는 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1(SOD1; 약 20%)을 암호화하는 유전자(Rosen DR 등, Nature, 1993, 362, 59-62), 육종 융합/지방육종 전좌(FUS/TLS; 1 내지 5%) 및 TDP-43(TARDBP; 1 내지 5%)에서 발견된다 최근에, C9 또는 F72 유전자에서의 헥사뉴클레오티드 반복 확장 (GGGGCC)n은 서양인에서 fALS의 가장 빈번한(약 40%) 원인으로 확인되었다 (Renton 등, Nat. Neurosci., 2014, 17, 17-23 참조). ALS에서 돌연변이된 다른 유전자는 알신(ALS2), 세나탁신(SETX), 소포-관련된 막 단백질(VAPB), 및 안지오제닌(ANG)을 포함한다. fALS 유전자는 상이한 세포 메커니즘을 조절하며, 이는 ALS의 병인이 복잡하고 결국 운동 뉴런 퇴행을 야기하는 일부 상이한 처리과정과 관련되어 있을 수 있음을 시사한다.
SOD1은 포유류에서 확인되고 특징지워지는 3종의 인간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제: 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Cu/ZnSOD 또는 SOD1), 망간 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(MnSOD 또는 SOD2), 및 세포외 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(ECSOD 또는 SOD3) 중 하나이다. SOD1은 서브유닛 당 하나의 구리- 및 하나의 아연-결합 부위를 갖는 153-잔기 폴리펩티드의 32 kDa의 동형이합체이며, 이는 인간 21번 염색체상의 SOD1 유전자(유전자은행 접근 번호 NM_000454.4)에 의해 암호화된다(표 2 참조). SOD1은 결합된 구리 이온에서 슈퍼옥사이드 음이온(O2 -)의 분자 산소(O2) 및 과산화수소(H2O2)로의 반응을 촉매한다. SOD1의 세포내 농도는 높으며(10 내지 100 μM), 이는 중추신경계(CNS)에서의 총 단백질 농도의 1%를 차지한다. 단백질은 진핵 세포의 세포질뿐만 아니라, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀 및 미토콘드리아 막간 공간(intermembrane space)에 위치해있다(Lindenau J 등, Glia, 2000, 29, 25-34).
SOD1 유전자의 돌연변이는 fALS 환자에서 15 내지 20% 및 모든 ALS 경우에서 1 내지 2% 까지 나타난다. 현재, 153-아미노산 SOD1 폴리펩티드를 통해 분포된 170종 이상의 상이한 돌연변이가 ALS를 유발하는 것으로 밝혀졌고, 업데이트된 목록을 ALS 온라인 유전자 데이터베이스(ALSOD)(Wroe R 등, Amyotroph Lateral Scler., 2008, 9, 249-250)에서 확인할 수 있다. 표 1은 ALS에서 SOD1의 돌연변이의 일부 예를 나열한다. 이러한 돌연변이는 결실, 삽입 및 C-말단 절단이 또한 발생하지만, 우세하게는 단일 아미노산 치환(즉, 미스센스 돌연변이)이다. 상이한 SOD1 돌연변이는 상이한 지리적 분포 패턴을 나타낸다. 예컨대, SOD1 유전자 돌연변이에 의해 야기된 ALS를 가진 모든 미국인의 40 내지 50%는 Ala4Val(또는 A4V)의 특정 돌연변이를 갖는다. A4V 돌연변이는 전형적으로 심각한 징후 및 증상과 관련되어 있으며 생존 기간은 전형적으로 2 내지 3년이다. I113T 돌연변이는 영국에서 가장 흔한 돌연변이이다. 유럽에서 가장 흔한 돌연변이는 D90A 치환이며 생존 기간은 보통 10년 초과이다.
[표 1]
Figure pct00001
SOD1 유전자 결함과 관련된 신경세포 사멸의 메커니즘을 조사하기 위해서, SOD1-관련 ALS의 몇몇 설치류 모델이 당업계에서 개발되었는데, 이는 미스센스 돌연변이, 작은 결실 또는 삽입을 비롯하여 상이한 돌연변이를 갖는 인간 SOD1 유전자를 발현한다. 비제한적인 ALS 마우스 모델의 예는 SOD1G93A, SOD1A4V, SOD1G37R, SOD1G85R, SOD1D90A, SOD1L84V, SOD1I113T, SOD1H36R / H48Q, SOD1G127X, SOD1L126X 및 SOD1L126delTT를 포함한다. 2종의 상이한 인간 SOD1 돌연변이를 갖는 이러한 2종의 형질전환 랫트 모델은: SOD1H46R 및 SOD1G93R이다. 이러한 설치류 ALS 모델은, 인간 ALS 환자와 유사한 근육 약화, 및 인간 질환의 몇몇 특징, 특히 척추 운동 뉴런의 선택적인 사멸, 운동 뉴런에서 단백질 봉입체의 응집 및 미세교세포 활성화를 반영하는 기타 병인적 특징을 발달시킬 수 있다. 형질전환 설치류는 인간 SOD1-관련 ALS 질환의 우수한 모델이이며, 질환 발병 및 질환 치료법을 개발하기 위한 모델을 제공한다는 것이 당업계에 잘 공지되어 있다.
동물 및 세포 모델에서의 연구는 SOD1 병원성 변이체가 기능 획득에 의해 ALS를 유발한다는 것을 보여준다. 즉, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 효소는 SOD1 돌연변이에 의해 변경될 때 신규하지만 해로운 특성을 얻는다. 예컨대, ALS에서 일부 SOD1 돌연변이된 변이체는 산화환원 주기의 방해에 의해 산화 스트레스가 증가한다(예컨대, 독성의 슈퍼옥사이드 라디칼의 축적 증가). 다른 연구는 또한 ALS에서의 일부 SOD1 돌연변이된 변이체가 이의 정상적인 생리학적 기능과 독립적인 독성의 특성을 획득할 수 있음을 나타낸다(예컨대, 잘못 접힌 SOD1 변이체의 비정상적인 응집). 비정상적인 산화환원 화학적 모델에서, 돌연변이 SOD1은 불안정하며, 비정상적인 화학을 통해 비통상적인 기질과 반응하여 반응성 산소종(ROS)의 과생산을 야기한다. 단백질 독성 모델에서, 불안정하고 잘못 접힌 SOD1은 세포질 봉입체로 응집되어 세포 처리과정에 중요한 단백질을 격리시킨다. 이러한 두 가지 가설은 상호 배타적이지 않다. 활성 부위에서 금속에 결합하는 선택된 히스티딘 잔기의 산화는 SOD1 응집을 매개한다는 것이 밝혀졌다.
응집된 돌연변이 SOD1 단백질은 또한 미토콘드리아 기능부전 (Vehvilainen P 등, Front Cell Neurosci., 2014, 8, 126), 축삭 수송 장애, 비정상적인 RNA 대사, 신경교세포 병리학 및 글루타메이트 흥분세포독성을 유발할 수 있다. 일부 산발성 ALS 경우에서, 잘못 접힌 야생형 SOD1 단백질은 가족성 ALS-관련 SOD1 변이체에서 나타나는 것과 유사한 "독성 형태"를 형성하는 질환에 걸린 운동 뉴런에서 발견된다 (Rotunno MS 및 Bosco DA, Front Cell Neurosci., 2013, 16, 7, 253). 이러한 증거는, ALS가 다른 신경퇴행성 질환, 예컨대 알츠하이머병 및 파킨슨병과 유사한 단백질 접힘 질환임을 시사한다.
현재, ALS를 겪는 환자가 이용가능한 치료법이 없다. 유일하게 FDA에서 승인된 약물은 글루타메이트 방출을 저해하는 릴루졸로, ALS에 대해 중간 정도의 효과를 가지며, 18개월 동안 복용하는 경우 단지 2 내지 3개월 까지만 생존을 연장시킨다. 불행하게도, 릴루졸을 복용하는 환자는 질환 진행의 늦춤 또는 근육 기능의 개선을 경험하지 못한다. 따라서, 릴루졸은 치료법 또는 효과적인 치료법을 제시하지 않는다. 연구자들은 보다 우수한 치료제를 계속해서 찾고 있다.
SOD1 응집을 예방 또는 개선할 수 있는 치료적 접근법이 이미 시험되어 왔다. 예컨대, 히드록실아민 유도체인 애리모클로몰(arimoclomol)은 열 충격 단백질을 표적화하는 약물이며, 이는 이러한 응집체에 대한 세포 방어 메커니즘이다. 연구는 애리모클로몰을 이용한 치료가 SOD1 마우스 모델에서 근육 기능을 개선함을 보여주었다. ALS에서 하나 이상의 세포 결함을 표적화하는 다른 약물은 AMPA 길항제, 예컨대 운동 뉴런에 대한 글루타메이트-유도된 흥분세포독성을 감소시킬 수 있는 베타-락탐 항체인 탈람파넬(talampanel); 산화 유도된 운동 뉴런 사멸을 저해할 수 있는 브로모크립틴(Bromocriptine)(예컨대, 미국공개특허 제20110105517호; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨); SOD1 유전자 발현을 감소시킬 수 있는 1,3-다이페닐우레아 유도체 또는 다중효소 저해제(예컨대, 미국공개특허 제20130225642호; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨); 미토콘드리아에서 산화 반응을 개선할 수 있는 도파민 작용제인 프라미펙솔(pramipexole) 및 이의 거울상이성질체인 덱스프라미펙솔(dexpramipexole); 사이클로옥시게나제 효소를 저해하는 니메술리드(nimesulide)(미국공개특허 제20060041022호 전체를 참고로써 본문에 포함함); 자유 라디칼 스캐빈저로 작용하는 약물(미국특허 제6,933,310호 및 PCT 공개특허 제WO2006075434호의 각 내용 전체를 참고문헌으로서 본문에 포함)을 포함할 수 있다.
비정상적인 SOD1 단백질 응집을 저해하기 위한 또 다른 접근법은 ALS에서 SOD1 유전자 발현을 침묵/저해하는 것이다. 돌연변이된 대립유저자의 특정 유전자 침묵을 위한 작은 간섭 RNA가 fALS의 치료에 대해 치료적으로 유익하다는 것이 보고되었다(예컨대, Ralgh GS 등, Nat. Medicine, 2005, 11(4), 429-433; 및 Raoul C 등, Nat. Medicine, 2005, 11(4), 423-428; 및 Maxwell MM 등, PNAS, 2004, 101(9), 3178-3183; 및 Ding H 등, Chinese Medical J., 2011, 124(1), 106-110; 및 Scharz DS 등, Plos Genet., 2006, 2(9), e140; 이의 각 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
ALS에서 SOD1 유전자를 표적화하고 SOD1 발현을 조절하는 다수의 다른 RNA 치료제가 당업계에 교시되어 있다. 이러한 RNA에 기초한 제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이중 가닥의 작은 간섭 RNA를 포함한다. 예컨대, Wang H 등, J Biol. Chem., 2008, 283(23), 15845-15852); 미국특허 제7,498,316호; 제7,632,938호; 제7,678,895호; 제7,951,784호; 제7,977,314호; 제8,183,219호; 제8,309,533호 및 제8, 586, 554호; 및 미국공개특허 제2006/0229268 및 2011/0263680호(각 내용 전체가 본원에 참조로써 포함됨) 참조.
본 발명은 조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 분자 및 이의 설계 및 제조 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터를 이용한다. 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 운동 뉴런으로의 활성제의 전달을 증가시킬 수 있다. SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화하는 dsRNA는 세포내에서 SOD1 유전자 발현(예컨대, mRNA 수준)을 현저하게 저해할 수 있고; 따라서, 단백질 응집 및 봉합체 형성, 증가된 자유 라디칼, 미토콘드리아 기능부전 및 RNA 대사와 같은 세포 내에서 SOD1 발현 유도된 스트레스를 개선할 수 있다.
이러한 siRNA 매개된 SOD1 발현 저해가 ALS 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 환자에서 ALS의 치료 및/또는 개선 방법은, 환자에게 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터의 유효량을 세포 내로 투여하는 것을 포함한다. 이러한 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터의 투여는 SOD1 유전자 발현의 억제/침묵을 야기하는 siRNA 분자를 암호화할 것이다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 AAV는 대상에서 돌연변이 SOD1의 발현을 감소시킨다. 돌연변이 SOD1의 감소는 또한 독성 메커니즘, 예컨대 비제한적으로 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능부전, 손상된 축삭 수송, 비정상적인 RNA 대사, 신경교세포 병리학 및/또는 글루타메이트 흥분세포독성을 야기할 수 있는 독성 응집체의 형성을 감소시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 치료를 필요로 하는 대상에서 SOD1의 양을 감소시키며 따라서 본원에 기술된 치료적 이익을 제공한다.
본 발명의 조성물
siRNA 분자
본 발명은 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 유전자 발현의 RNA 간섭(RNAi) 유도된 저해에 관한 것이다. SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA(본원에서 집합적으로 "siRNA 분자"로 지칭됨)가 본원에서 제공된다. 이러한 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 세포, 예컨대 운동 뉴런에서 SOD1 유전자 발현을 감소시키거나 침묵시킬 수 있으며, 이에 따라 비제한적으로 운동 뉴런 사멸 및 근육 위축과 같은 ALS 증상을 개선할 수 있다.
RNAi(전사 후 유전자 침묵(PTGS), 진압(quelling), 또는 공동 억제로도 공지됨)는 RNA 분자가 서열 특이적인 방식으로 전형적으로 특이적인 mRNA 분자를 파괴시킴으로써 유전자 발현을 저해하는 전사 후 유전자 침묵 처리과정이다. RNAi의 활성 구성요소는 작은 간섭 RNA(siRNA)라 불리는 짧은/작은 이중 가닥의 RNA(dsRNA)이며, 이는 전형적으로 15 내지 30 뉴클레오티드(예컨대, 19 내지 25, 19 내지 24 또는 19 내지 21 뉴클레오티드) 및 2 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하며, 표적 유전자의 핵산 서열과 일치한다. 이러한 짧은 RNA 종은 보다 큰 dsRNA의 다이서(Dicer)-매개된 절단에 의해 생체내에서 자연적으로 생성되며, 이들은 포유류 세포에서 기능적이다.
마이크로RNA(miRNA)로 명명된 자연적으로 발현된 작은 RNA 분자는 mRNA의 발현을 조절함으로써 유전자 침묵을 유도한다. RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)를 함유하는 miRNA는 시드(seed) 영역이라고 불리는 miRNA의 5' 영역에서 2 내지 7개의 뉴클레오티드, 및 이의 3' 영역에서 다른 염기쌍과 완벽한 서열 상보성을 제시하는 mRNA를 표적화한다. 유전자 발현의 miRNA 매개된 유전자 발현의 하향 조절은 표적 mRNA의 절단, 표적 mRNA의 번역 억제 또는 mRNA 분해에 의해 야기될 수 있다. miRNA 표적 서열은 보통 표적 mRNA의 3'-UTR에 위치한다. 단일 miRNA는 다양한 유전자로부터 100개 초과의 전사물을 표적화할 수 있고, 하나의 mRNA는 상이한 miRNA에 의해 표적화될 수 있다.
특정 miRNA를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 시험관내에서 설계되고 합성되어 RNAi 처리과정을 활성화시키기 위해 세포 내에 도입될 수 있다. Elbashir 등은, 21-뉴클레오티드의 siRNA 이중가닥(작은 간섭 RNA라고 칭해짐)이 포유류 세포에서 면역 반응의 유도 없이 강력하고 특이적인 유전자 넉다운에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다(Elbashir SM 등, Nature, 2001, 411, 494-498). 이러한 초기 보고 이래로, siRNA에 의한 번역 후 유전자 침묵은 포유류 세포에서 유전자 분석을 위한 강력한 도구로써 등장하였으며, 신규한 치료제를 생산할 잠재력이 있다.
시험관내에서 합성된 siRNA 분자는 RNAi를 활성화시키기 위해 세포 내로 도입될 수 있다. 내인성 dsRNA와 유사한 외인성 siRNA는, 이것이 세포 내로 도입될 때 조립되어, siRNA 이중가닥의 2개의 가닥 중 하나에 상보적인 RNA 서열(즉, 안티센스 가닥)에 대해 게놈 검색을 용이하게 하는 다중유닛 복합체인 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)를 형성할 수 있다. 이러한 처리과정 중에, siRNA의 센스 가닥(또는 패신저 가닥)이 복합체로부터 손실되는 반면, siRNA의 안티센스 가닥(또는 가이드 가닥)은 이의 상보적인 RNA와 매칭된다. 특히, siRNA 함유 RISC 복합체의 표적은 완벽한 서열 상보성을 제시하는 mRNA이다. 그 다음, siRNA 매개된 유전자 침묵이 발생하여, 표적을 절단, 방출 및 분해한다.
표적 mRNA와 상동성인 센스 가닥 및 표적 mRNA와 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 siRNA 이중가닥은, 표적 RNA 파괴 효율의 관점에서 단일 가닥(ss)-siRNA(예컨대, 안티센스 가닥 RNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 사용에 비해 보다 더 많은 이점을 제공한다. 다수의 경우에서, 상응하는 이중가닥의 효과적인 유전자 침묵 효능을 달성하기 위해서는 보다 높은 농도의 ss-siRNA가 요구된다.
임의의 전술된 분자는 AAV 벡터 또는 벡터 게놈에 의해 암호화될 수 있다.
SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥의 설계 및 서열
siRNA의 설계에 대한 일부 지침이 당업계에 제안되어 있다. 이러한 지침은 일반적으로 침묵되는 유전자 영역을 표적하는 19-뉴클레오티드의 이중가닥 영역, 대칭의 2 내지 3 뉴클레오티드의 3' 오버행, 5-인산염 및 3-히드록시 기를 생성할 것을 권장한다. siRNA 서열 선호를 지배할 수 있는 다른 규칙은, 비제한적으로 (i) 안티센스 가닥의 5' 말단에서의 A/U; (ii) 센스 가닥의 5' 말단에서의 G/C; (iii) 안티센스 가닥의 5' 말단 1/3에서의 5개 이상의 A/U 잔기; 및 (iv) 9 뉴클레오티드 초과의 길이의 임의의 GC 스트레치의 부재를 포함한다. 이러한 고려에 따라, 표적 유전자의 특정 서열과 함께, 포유류의 표적 유전자 발현을 억제하기 위해 필수적인 고도로 효과적인 siRNA 분자가 용이하게 설계될 수 있다.
본 발명에 따르면, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 분자(예컨대, siRNA 복합체 또는 암호화된 dsRNA)가 설계된다. 이러한 siRNA 분자는 SOD1 유전자 발현 및 단백질 생산을 특이적으로 억제할 수 있다. 일부 양태에서, siRNA 분자는 세포에서 SOD1 유전자 변이체, 즉, ALS 질환을 갖는 환자에서 식별되는 돌연변이된 SOD1 전사물(예컨대, 표 1의 돌연변이)을 선택적으로 "넉아웃" 시키기 위해 설계되고 사용된다. 일부 양태에서, siRNA 분자는 세포에서 SOD1 유전자 변이체를 선택적으로 "넉다운"시키기 위해 설계되고 사용된다. 다른 양태에서, siRNA 분자는 SOD1 유전자에서 임의의 특정 돌연변이와는 무관하게 야생형 및 SOD1 유전자의 돌연변이된 대립유전자 둘 다를 저해 또는 억제할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 두 가닥 모두 함께 혼성화되어 이중가닥 구조를 형성하는, 센스 가닥 및 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다. 안티센스 가닥은 SOD1 mRNA 서열을 표적-특이적인 RNAi를 지시하기에 충분한 상보성을 가지고 있으며, 즉, siRNA 분자는 RNAi 기구(machinery) 또는 처리과정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 유발시키기에 충분한 서열을 가지고 있다.
일부 구현예에서, 안티센스 가닥 및 표적 mRNA 서열은 100% 상보적이다. 안티센스 가닥은 표적 mRNA 서열의 임의의 부분에 대해 상보적일 수 있다.
다른 구현예에서, 안티센스 가닥 및 표적 mRNA 서열은 하나 이상의 미스매치를 포함한다. 비제한적인 예로서, 안티센스 및 표적 mRNA 서열은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 99%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 99%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 99%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 99%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 99%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 99%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 99%, 90 내지 95%, 90 내지 99% 또는 95 내지 99% 상보적이다.
본 발명에 따르면, siRNA 분자는 약 10 내지 50 이상의 뉴클레오티드 길이, 즉, 10 내지 50 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함하는 각각의 가닥의 길이를 갖는다. 바람직하게는, siRNA는 각 가닥에서 약 15 내지 30, 예컨대 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 가닥 중 하나는 표적 영역에 대해 충분히 상보적이다. 하나의 구현예에서, siRNA 분자는 약 19 내지 25, 19 내지 24 또는 19 내지 21 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 약 19 뉴클레오티드 내지 약 25 뉴클레오티드, 및 3' 말단에 2개의 오버행 뉴클레오티드를 포함하는 합성 RNA 이중가닥일 수 있다. 일부 양태에서, siRNA 분자는 변형되지 않은 RNA 분자일 수 있다. 다른 양태에서, siRNA 분자는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 염기, 당 또는 골격 변형을 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예컨대, AAV 벡터), 게놈, 또는 세포로의 전달을 위한 핵산 발현 벡터에 암호화될 수 있다.
DNA 발현 플라스미드는 세포에서 본 발명의 siRNA 이중가닥 또는 dsRNA를 안정적으로 발현시키고 표적 유전자의 장기 저해를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, siRNA 이중가닥의 센스 및 안티센스 가닥은, 전형적으로 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)라고 불리는 줄기-고리 구조의 발현을 야기하는 짧은 스페이서 서열에 의해 연결된다. 헤어핀은 다이서에 의해 인식되고 절단되어 성숙한 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명에 따르면, SOD1 mRNA를 표적화하는 siRNA 분자를 암호화하는 핵산을 포함하는 AAV 벡터가 제조되며, 이러한 AAV 벡터의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 및 AAV-DJ 및 이의 변이체일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 표적 mRNA(즉, SOD1)를 억제(또는 분해)한다. 따라서, siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 세포, 예컨대 운동 뉴런에서 SOD1 유전자 발현을 실질적으로 저해하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, SOD1 유전자 발현의 저해는 약 20% 이상까지, 바람직하게는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 저해를 지칭한다. 따라서, 표적화된 유전자의 단백질 생산은 적어도 약 20 까지, 바람직하게는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%까지, 또는 적어도 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 저해될 수 있다. SOD1 유전자는 야생형 유전자이거나 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 SOD1 유전자일 수 있다. 따라서, 단백질은 야생형 단백질 또는 하나 이상의 돌연변이가 있는 돌연변이된 폴리펩티드이다.
본 발명에 따라, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 배양된 세포에서 SOD1 mRNA 수준을 감소시키는 이들의 능력을 위해 설계 및 시험되었다. 이러한 siRNA 이중가닥은 표 3에 나열된 것들을 포함한다. 비제한적인 예로서, siRNA 이중가닥은 siRNA 이중가닥 ID: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 및 D-2858일 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA의 3' 줄기 갈래는, 5' 줄기 갈래에서 패신저 가닥의 5' 말단의 13 뉴클레오티드 상류 중 11개에 대해 상보적인, 가이드 가닥의 3' 말단의 11 뉴클레오티드 하류를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 조절성 폴리뉴클레오티드의 3' 줄기 갈래의 3' 말단의 6 뉴클레오티드 하류에 있는 시스테인을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 가이드 가닥에 대한 miRNA 시드 매치를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 패신저 가닥에 대한 miRNA 시드 매치를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 가이드 또는 패신저 가닥에 대한 시드 매치를 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 가이드 가닥에 대해 상당한 전장 비표적(off target)이 거의 없을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 패신저 가닥에 대해 상당한 전장 비표적이 거의 없을 수 있다. 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 패신저 가닥에 대해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 내지 5%, 2 내지 6%, 3 내지 7%, 4 내지 8%, 5 내지 9%, 5 내지 10% 6 내지 10% 미만의 전장 비표적을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 가이드 가닥 또는 패신저 가닥에 대해 상당한 전장 비표적이 거의 없을 수 있다. 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 가이드 또는 패신저 가닥에 대해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 1 내지 5%, 2 내지 6%, 3 내지 7%, 4 내지 8%, 5 내지 9%, 5 내지 10% 6 내지 10% 미만의 전장 비표적을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 시험관내에서 높은 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 시험관내에서 낮은 활성을 가질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 갖는다. 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운 (KD)은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 99.5% 또는 100%일 수 있다. 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운은 60 내지 65%, 60 내지 70%, 60 내지 75%, 60 내지 80%, 60 내지 85%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 99%, 60 내지 99.5%, 60 내지 100%, 65 내지 70%, 65 내지 75%, 65 내지 80%, 65 내지 85%, 65 내지 90%, 65 내지 95%, 65 내지 99%, 65 내지 99.5%, 65 내지 100%, 70 내지 75%, 70 내지 80%, 70 내지 85%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 99%, 70 내지 99.5%, 70 내지 100%, 75 내지 80%, 75 내지 85%, 75 내지 90%, 75 내지 95%, 75 내지 99%, 75 내지 99.5%, 75 내지 100%, 80 내지 85%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 99%, 80 내지 99.5%, 80 내지 100%, 85 내지 90%, 85 내지 95%, 85 내지 99%, 85 내지 99.5%, 85 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 99%, 90 내지 99.5%, 90 내지 100%, 95 내지 99%, 95 내지 99.5%, 95 내지 100%, 99 내지 99.5%, 99 내지 100% 또는 99.5 내지 100%일 수 있다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥에 의한 표적 넉-다운 (KD)은 70% 초과이다.
하나의 구현예에서, 가장 근접한 비표적에 대한 패신저 가닥의 IC50은 표적에 대한 가이드 가닥의 IC50에 100을 곱한 것을 초과한다. 비제한적인 예시로서, 가장 근접한 비표적에 대한 패신저 가닥의 IC50이 표적에 대한 가이드 가닥의 IC50에 100을 곱한 것을 초과하는 경우, 인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA는 시험관내에서 높은 가이드 가닥 활성 및 낮은 패신저 가닥 활성을 갖는다고 일컬어 진다.
하나의 구현예에서, 시험관내 또는 생체내에서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 5' 말단에서 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 시간의 정확한 시작 (n)을 갖는다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 정확하며, 시험관내에서 5' 말단에서 99% 이상의 시간의 정확한 시작(n)을 갖는다. 비제한적인 예로서, 가이드 가닥의 5' 처리과정은 정확하며, 생체내에서 5' 말단에서 99% 이상의 시간의 정확한 시작(n)을 갖는다.
하나의 구현예에서, 시험관내 또는 생체내에서 발현된 가이드-대-패신저(G:P) 가닥의 비는 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55, 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5, 또는 99:1이다. 비제한적인 예로서, 시험관내에서 가이드-대-패신저 가닥의 비는 80:20이다. 비제한적인 예로서, 생체내에서 가이드-대-패신저 가닥의 비는 80:20이다.
하나의 구현예에서, dsRNA를 암호화하는 벡터 게놈의 완전성은 작제물 전체 길이의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 99% 초과이다.
siRNA 변형
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는, 전구체 또는 DNA로서 전달되지 않을 때, 화학적으로 변형되어 예컨대 비제한적으로 생체내에서 siRNA의 안정성을 증가시키는 것과 같이 RNA 분자의 일부 특징을 조절할 수 있다. 화학적으로 변형된 siRNA 분자는 인간의 치료 적용에 사용될 수 있으며, siRNA 분자의 RNAi 활성을 손상시키지 않으면서 개선될 수 있다. 비제한적인 예로서, siRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 둘 다의 3' 및 5' 말단 둘 다에서 변형된다.
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA 이중가닥은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 비제한적으로 당 변형된 뉴클레오티드, 핵염기 변형 및/또는 골격 변형을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, siRNA 분자는 조합된 변형, 예컨대 조합된 핵염기 및 골격 변형을 함유할 수 있다.
하나의 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 당-변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 당 변형된 뉴클레오티드는, 비제한적으로 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2'-티오 변형된 리보뉴클레오티드, 예컨대 2'-플루오로 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티 뿐만 아니라, 리보실이 아닌 당 또는 이의 유사체를 갖는 뉴클레오티드상에서 변형될 수 있다. 예컨대, 당 모이어티는 만노스, 아라비노스, 글루코피라노스, 갈락토피라노스, 4'-티오리보스 및 다른 당, 헤테로사이클, 또는 카보사이클일 수 있거나 이에 기초할 수 있다.
하나의 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 핵염기-변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 골격-변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 이중가닥은 골격에 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 정상적인 "골격"은 DNA 또는 RNA 분자에서 반복적으로 교대하는 당-인산염 서열을 지칭한다. 디옥시리보스/리보스 당은 3'-히드록시 및 5'-히드록시 기 둘 다에서 "포스포다이에스터" 결합/연결(PO 연결)로도 공지된 에스터 연결에서 인산염 기에 결합된다. PO 골격은 포스포로티오에이트 골격(PS 연결)으로 변형될 수 있다. 일부 경우에서, 천연 포스포다이에스터 결합은 아미드 결합으로 치환될 수 있지만, 2개의 당 단위 사이의 4개의 원자는 유지된다. 이러한 아미드 변형은 뉴클레오티드의 고상 합성을 촉진시킬 수 있고, siRNA 보체로 형성된 이중가닥의 열역학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 예컨대, Mesmaeker 등, Pure & Appl . Chem., 1997, 3, 437-440(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)을 참조.
변형된 염기는 하나 이상의 원자 또는 기의 치환 또는 부가에 의해 변형된 뉴클레오티드 염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 잔틴, 이노신 및 케오신을 지칭한다. 핵염기 잔기에서의 변형의 일부 예는, 비제한적으로 알킬화, 할로겐화, 티올화, 아미노화, 아미드화 또는 아세틸화된 염기를 개별적으로 또는 조합하여 포함한다. 보다 특정한 예는, 예컨대 5-프로피닐우리딘, 5-프로피닐시티딘, 6-메틸시티딘, 6-메틸구아닌, N,N,-다이메틸시티딘, 2-프로필시티딘, 2-프로필구아닌, 2-아미노시티딘, 1-메틸이노신, 3-메틸우리딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘 및 5' 위치에 변형을 갖는 다른 뉴클레오티드, 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-할로시티딘, 5-할로우리딘, 4-아세틸시티딘, 1-메틸아데노신, 2-메틸아데노신, 3-메틸시티딘, 6-메틸우리딘, 2-메틸구아노신, 7-메틸구아노신, 2,2-다이메틸구아노신, 5-메틸아미노에틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 데아자뉴클레오티드 예컨대 7-데아자-아데노신, 6-아조우리딘, 6-아조시티딘, 6-아조티미딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 다른 티오 염기 예컨대 2-티오우리딘 및 4-티오우리딘 및 2-티오시티딘, 다이히드로우리딘, 슈도우리딘, 케오신, 아케오신, 나프틸 및 치환된 나프틸 기, 임의의 O- 및 N-알킬화된 퓨린 및 피리미딘 예컨대 N6-메틸아데노신, 5-메틸카보닐메틸우리딘, 우리딘 5-옥시아세트산, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐 및 변형된 페닐 기 예컨대 아미노페놀 또는 2,4,6-트리메톡시 벤젠, G-클램프 뉴클레오티드로 작용하는 변형된 시토신, 8-치환된 시티딘 및 구아닌, 5-치환된 우라실 및 티민, 아자피리미딘, 카복시히드록시알킬 뉴클레오티드, 카복시알킬아미노알킬 뉴클레오티드 및 알킬카보닐알킬화된 뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 단지 센스 가닥 상에 있을 수 있다.
또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 단지 안티센스 가닥 상에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오티드는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 SOD1 mRNA 서열과 같은 표적 mRNA 서열과 쌍을 이루는 안티센스 가닥의 능력에 영향을 미치지 않는다.
벡터
일부 구현예에서, 본원에 기술된 siRNA 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 하나의 구현예에서, siRNA 분자는 바이러스 벡터에 의해 암호화된다. 바이러스 벡터는, 비제한적으로 헤르페스바이러스(HSV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등일 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
레트로바이러스 벡터
일부 구현예에서, SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥은 레트로바이러스 벡터에 의해 암호화된다(예컨대, 미국특허 제5,399,346호; 제5,124,263호; 제4,650,764호 및 제4,980,289호 참조; 이의 각 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
아데노바이러스벡터
아데노바이러스는, 생체내에서 핵산을 다양한 세포 유형으로 효율적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵세포 DNA 바이러스이며, 유전자를 신경 세포에 표적화하는 것을 포함하여, 유전자 치료 프로토콜에서 광범위하게 사용되고 있다. 다양한 복제 결함 아데노바이러스 및 최소 아데노바이러스 벡터가 핵산 치료제로 기술되어 왔다(예컨대, PCT 공개특허 제WO199426914호, 제WO 199502697호, 제WO199428152호, 제WO199412649호, 제WO199502697호 및 제WO199622378호 참조; 각 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 이러한 아데노바이러스 벡터는 또한 본 발명의 siRNA 분자를 세포로 전달하는데에 사용될 수 있다.
아데노 -관련 바이러스( AAV ) 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 의존적인 파보바이러스(다른 파보바이러스와 마찬가지로)이고, 길이가 약 5000 뉴클레오티드인 게놈을 갖는 단일 가닥의 비-외막 DNA 바이러스이고, 복제(Rep) 담당 단백질 및 캡시드(Cap) 구조적 단백질을 암호화하는 2개의 개방형 해독 틀을 함유한다. 개방형 해독 틀은 바이러스 게놈의 복제 기점으로 작용하는 2개의 역위 말단 반복(ITR) 서열에 의해 측부에 위치한다. 추가로, AAV 게놈은 포장(packaging) 서열을 함유하여 바이러스 게놈을 AAV 캡시드 내로 포장할 수 있다. AAV 벡터는 감염된 세포에서 생산적인 감염을 겪기 위해 보조-헬퍼(예컨대, 아데노바이러스)를 필요로 한다. 이와 같은 헬퍼 기능의 부재에서, AAV 비리온은 본질적으로 숙주 세포에 들어가서 세포의 게놈에 통합된다.
AAV 벡터는 일부 독특한 특징에 기인하여 siRNA 전달에 대해 조사되어 왔다. 비제한적인 특징의 예는, (i) 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 감염시키는 능력; (ii) 인간 세포를 비롯하여 감염성 대한 광범위한 숙주 범위; (iii) 야생형 AAV는 임의의 질환과 관련 없고, 감염된 세포에서 복제되지 않는 것으로 나타남; (iv) 벡터에 대해 세포-매개된 면역 반응 결여; 및 (v) 숙주 염색체에서의 비-통합적인 성질로 인해 장기 발현에 대한 가능성 감소를 포함한다. 또한, AAV 벡터에 의한 감염은 세포 유전자 발현 양상의 변화에 최소한의 영향을 미친다 (Stilwell 및 Samulski 등, Biotechniques, 2003, 34, 148).
전형적으로, siRNA 전달을 위한 AAV 벡터는 바이러스 게놈내에서 기능적인 Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 서열이 결여된 복제 결함인 재조합 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 경우에서, 결함있는 AAV 벡터는 대부분 또는 모든 암호화 서열이 결여되어 있을 수 있으며, 본질적으로 단지 하나 또는 2개의 AAV ITR 서열 및 포장 서열만을 함유한다.
AAV 벡터는 또한 자기-상보적인 AAV 벡터 (scAAV)를 포함할 수 있다. scAAV 벡터는 함께 어닐링(annealing)되어 이중 가닥의 DNA를 형성하는 두 DNA 가닥을 함유한다. 제2가닥 합성을 생략함으로써, scAAV는 세포에서 신속한 발현을 가능케 한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 AAV 벡터는 scAAV이다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 사용된 AAV 벡터는 ssAAV이다.
AAV 벡터의 생산 및/또는 변형 방법이 위형(pseudotype) AAV 벡터와 같이 당업계에 공개되어 있다(PCT 공개특허 제WO200028004호; 제WO200123001호; 제WO2004112727호; 제WO 2005005610호 및 제WO 2005072364호; 이의 각 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터가, 비제한적으로 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 및 AAV-DJ를 비롯하여 다양한 혈청형으로부터 제조 또는 유래될 수 있다. 일부 경우에서, AAV의 상이한 혈청형은 함께 또는 다른 유형의 바이러스와 혼합되어 키메라 AAV 벡터를 생산할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 포유류 세포 내로 도입될 수 있다.
AAV 벡터는 전달 효율을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 이와 같이 변형된 AAV 벡터는 효율적으로 포장될 수 있고, 고주파에서 최소의 독성으로 표적 세포를 성공적으로 감염시키는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 인간 혈청형 AAV 벡터일 수 있다. 이러한 인간 AAV 벡터는 임의의 공지된 혈청형, 예컨대 AAV1 내지 AAV11 중 임의의 하나의 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 비제한적인 예로서, AAV 벡터는 AAV1-유래 캡시드에 AAV1-유래의 게놈을 포함하는 벡터; AAV-2 유래 게놈에 AAV2-유래 게놈을 포함하는 벡터; AAV4 유래 캡시드에 AAV4-유래 게놈을 포함하는 벡터; AAV6 유래 캡시드에 AAV6-유래 게놈을 포함하는 벡터 또는 AAV9 유래 캡시드에 AAV9-유래 게놈을 포함하는 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는, 2종 이상의 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래한 서열 및/또는 구성요소를 함유하는 위형 혼성 또는 키메라 AAV 벡터일 수 있다. 위형 AAV 벡터는 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래된 AAV 게놈 및 적어도 부분적으로 상이한 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함하는 벡터일 수 있다. 비제한적인 예시로서, 이러한 위형 AAV 벡터는, AAV1-유래 캡시드에 AAV2-유래 게놈을 포함하는 벡터; 또는 AAV6-유래 캡시드에 AAV2-유래 게놈을 포함하는 벡터; 또는 AAV4-유래 캡시드에 AAV2-유래 게놈을 포함하는 벡터; 또는 AAV9-유래 캡시드에 AAV2-유래 게놈을 포함하는 벡터일 수 있다. 이와 같은 방식으로, 본 발명은 임의의 혼성형 또는 키메라 AAV 벡터를 고려한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 siRNA 분자를 중추신경계에 전달하기 위해 사용될 수 있다(미국특허 제6,180,613호의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함).
일부 양태에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 비-바이러스 기원의 펩티드를 포함하여 변형된 캡시드를 추가로 포함할 수 있다. 다른 양태에서, AAV 벡터는 CNS 특이적인 키메라 캡시드를 함유하여 암호화된 dsRNA 이중가닥의 뇌 및 척수로의 전달을 용이하게 할 수 있다. 예컨대, 가변 영역(VR) 서열 및 구조를 확인하기 위해, CNS 굴성을 나타내는 AAV 변이체로부터 캡 뉴클레오티드 서열을 정렬할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 다시스트론성 분자인 siRNA 분자를 암호화할 수 있다. siRNA 분자는 siRNA 분자 영역 사이에 하나 이상의 연결자(linker)를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는, 비제한적으로 SV40 인트론을 갖는 CMV, U6, CBA 또는 CBA 프로모터와 같이 발현 벡터에서 프로모터의 하류에 위치할 수 있다. 추가로, 암호화된 siRNA 분자는 또한 발현 벡터에서 아데닐화중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25% 이내에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 아데닐산중합반응 서열의 상류에 위치할 수 있다. 추가로, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터, 예컨대 비제한적으로 SV40 인트론을 갖는 CMV, U6, CBA 또는 CBA 프로모터와 같은 프로모터의 하류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 뉴클레오티드 이내에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 프로모터의 하류 및/또는 아데닐산중합반응 서열의 상류로부터 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25% 이내에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 scAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 ssAAV에 위치할 수 있다.
하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플립(filp) ITR의 5' 말단 인근에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플립 ITR의 3' 말단 인근에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플랍(flop) ITR의 5' 말단 인근에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플랍 ITR의 3' 말단 인근에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이에 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 플립 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이(예컨대, 플립 ITR의 5' 말단과 플랍 ITR의 3' 말단 사이, 또는 플랍 ITR의 3' 말단과 플립 ITR의 5' 말단 사이)에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내의 하류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 30 초과의 뉴클레오티드 이내의 상류에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 뉴클레오티드 이내의 하류에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 30, 10 내지 15, 10 내지 20, 10 내지 25, 10 내지 30, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 20 내지 25, 20 내지 30 또는 25 내지 30 이내의 상류에 위치할 수 있다. 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 처음 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25% 또는 25% 초과의 상류에 위치할 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 암호화된 siRNA 분자는 발현 벡터에서 ITR(예컨대, 플립 또는 플랍 ITR)의 5' 또는 3' 말단으로부터 처음 1 내지 5%, 1 내지 10%, 1 내지 15%, 1 내지 20%, 1 내지 25%, 5 내지 10%, 5 내지 15%, 5 내지 20%, 5 내지 25%, 10 내지 15%, 10 내지 20%, 10 내지 25%, 15 내지 20%, 15 내지 25%, 또는 20 내지 25%의 하류에 위치할 수 있다.
발현 벡터
하나의 구현예에서, 발현 벡터(예컨대, AAV 벡터)는 본원에 기술된 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 하나 이상의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있따.
하나의 구현예에서, 발현 벡터는, 5'에서 3'으로 지칭되는 ITR에서 ITR까지, ITR, 프로모터, 인트론, 조절성 폴리뉴클레오티드, 폴리A 서열 및 ITR을 포함할 수 있다.
게놈 크기
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 단일 가닥 또는 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 벡터 게놈의 크기는 작거나 중간이거나 크거나 최대 크기일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 작은 단일 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 작은 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.7 내지 3.5 kb, 예컨대 크기가 약 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4 및 3.5 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 작은 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 3.2 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은 작은 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 작은 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.3 내지 1.7 kb, 예컨대 크기가 약 1.3, 1.4, 1.5, 1.6 및 1.7 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 작은 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.6 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 siRNA 또는 dsRNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 중간 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 중간 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 3.6 내지 4.3 kb, 예컨대 크기가 약 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2 및 4.3 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 중간 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 1.8 내지 2.1 kb, 예컨대 크기가 약 1.8, 1.9, 2.0, 및 2.1 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 중간 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 큰 크기의 단일 가닥의 벡터는 크기가 4.4 내지 6.0 kb, 예컨대 크기가 약 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 및 6.0 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.7 kb일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 4.8 kb일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 큰 크기의 단일 가닥의 벡터 게놈은 크기가 6.0 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈은, 큰 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈일 수 있다. 큰 크기의 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 2.2 내지 3.0 kb, 예컨대 크기가 약 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 및 3.0 kb일 수 있다. 비제한적인 예로서, 크기가 큰 이중 가닥의 벡터 게놈은 크기가 약 2.4 kb일 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 프로모터 및 폴리A 테일을 포함할 수 있다.
프로모터
당업자는, 표적 세포가 비제한적으로 종 특이적, 유도성, 조직-특이적 또는 세포 주기-특이적인 프로모터를 포함하는 특이적 프로모터를 필요로 할 수 있음을 알 수 있다 (Parr 등., Nat. Med.3:1145-9 (1997); 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
하나의 구현예에서, 프로모터는 조절성 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하는데 충분하다고 여겨지는 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 표적화되는 세포에 대해 향성(tropism)을 갖는 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 표적화된 세포, 예컨대 비제한적으로 신경계 조직에서 일정 기간 동안 탑재물, 예컨대 조절성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 siRNA 또는 dsRNA의 발현을 제공하는 약한 프로모터이다. 발현은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 3주, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 또는 10년 초과의 기간일 수 있다. 발현은 1 내지 5 시간, 1 내지 12 시간, 1 내지 2 일, 1 내지 5 일, 1 내지 2 주, 1 내지 3 주, 1 내지 4 주, 1 내지 2 개월, 1 내지 4 개월, 1 내지 6 개월, 2 내지 6 개월, 3 내지 6 개월, 3 내지 9 개월, 4 내지 8 개월, 6 내지 12 개월, 1 내지 2 년, 1 내지 5 년, 2 내지 5 년, 3 내지 6 년, 3 내지 8 년, 4 내지 8 년 또는 5 내지 10 년 동안일 수 있다. 비제한적인 예로서, 프로모터는, 신경계 조직에서 탑재물의 지속적인 발현을 위한 약한 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 1 kb 미만의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 200 내지 600, 200 내지 700, 200 내지 800, 300 내지 400, 300 내지 500, 300 내지 600, 300 내지 700, 300 내지 800, 400 내지 500, 400 내지 600, 400 내지 700, 400 내지 800, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 600 내지 700, 600 내지 800 또는 700 내지 800의 길이를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 프로모터는 2개 이상의 구성요소, 예컨대 비제한적으로 CMV 및 CBA의 조합일 수 있다. 각 구성요소는 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800 또는 800 초과의 길이를 가질 수 있다. 각 구성요소는 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 200 내지 600, 200 내지 700, 200 내지 800, 300 내지 400, 300 내지 500, 300 내지 600, 300 내지 700, 300 내지 800, 400 내지 500, 400 내지 600, 400 내지 700, 400 내지 800, 500 내지 600, 500 내지 700, 500 내지 800, 600 내지 700, 600 내지 800 또는 700 내지 800의 길이를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, 프로모터는 382 뉴클레오티드의 CMV-인핸서 서열 및 260 뉴클레오티드의 CBA-프로모터 서열의 조합이다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소를 포함한다(예컨대, Powell 등, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015 참조; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨) 전이유전자의 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 요소의 비제한적인 예는, 프로모터, 내인성 miRNA, 전사 후 조절성 요소(RPE), 아데닐산중합반응(폴리 A) 신호 서열 및 상류 인핸서(USE), CMV 인핸서 및 인트론을 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소를 포함한다(예컨대, Powell 등, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨) 예컨대, 프로모터.
대부분의 조직에서 발현을 촉진하기 위한 프로모터는, 비제한적으로 인간 신장 인자 1α-서브유닛(EF1α), 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV), 닭 β-액틴(CBA) 및 이의 유도체 CAG, β 글루쿠로니다제(GUSB), 또는 유비퀴틴 C(UBC)를 포함한다. 조직-특이적인 발현 요소는, 비제한적으로, 발현을 뉴런, 성상세포 또는 희돌기교세포로 제한하기 위해 사용될 수 있는 신경계 프로모터와 같이 발현을 특정 세포 유형으로 제한하기 위해 사용될 수 있다. 뉴런에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 혈소판-유래 성장 인자 B-쇄(PDGF-β), 시냅신(Syn), 메틸-CpG 결합 단백질 2(MeCP2), CaMKII, mGluR2, NFL, NFH, nβ2, PPE, Enk 및 EAAT2 프로모터를 포함한다. 성상세포에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 신경교섬유질산성단백질(GFAP) 및 EAAT2 프로모터를 포함한다. 희돌기교세포에 대한 조직-특이적인 발현 요소의 비제한적인 예는, 수초염기성 단백질 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 유비퀴틴성 프로모터를 포함한다. 유비퀴틴성 프로모터의 비제한적인 예는, CMV, CBA(유도체 CAG, CBh 등 포함), EF-1α, PGK, UBC, GUSB(hGBp), 및 UCOE(HNRPA2B1-CBX3 프로모터)를 포함한다. Yu et al. (본문에 포함된Molecular Pain 2011, 7:63의 전체 내용을 레퍼런스로써 참고)은, 랫트 DRG 세포 및 일차 DRG 세포에서 렌티바이러스 벡터를 사용하여 CAG, EFIα, PGK 및 UBC 프로모터 하에 eGFP의 발현을 평가하였고, UBC가 다른 3개의 프로모터에 비해 보다 약한 발현을 보임을 발견하였고, 모든 프로모터에서 단지 10 내지 12%의 신경교세포가 발현함을 발견하였다. Soderblom 등 (E. Neuro 2015의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함)은, CMV 및 UBC 프로모터를 가진 AAV8 및 운동 피질에서 주사 후 CMV 프로모터를 가진 AAV2에서의 eGFP의 발현을 평가하였다. UBC 또는 EFIα프로모터를 함유하는 플라스미드의 비강내 투여는, CMV 프로모터에 의한 발현에 비해 보다 큰 지속적인 기도 발현을 나타냈다(Gill et al., Gene Therapy 2001, Vol. 8, 1539-1546의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함). Husain 등 (본문에 포함된Gene Therapy 200의 전체 내용을 레퍼런스로써 참고)은, hGUSB 프로모터, HSV-1LAT 프로모터 및 NSE 프로모터를 가진 HβH 작제물을 평가하였고, 마우스 뇌에서 HβH 작제물이 NSE에 비해 보다 약한 발현을 보임을 발견하였다. Passini와 Wolfe(J. Virol. 2001, 12382-12392의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함)은, 신생 마우스에 뇌실내 주사 후 HβH 벡터의 장기 효과를 평가하였고, 1년 이상 동안 지속적으로 발현함을 발견하였다. CMV-lacZ, CMV-luc, EF, GFAP, hENK, nAChR, PPE, PPE + wpre, NSE(0.3 kb), NSE(1.8 kb) 및 NSE(1.8 kb + wpre)와 비교하여 NF-L 및 NF-H 프로모터가 사용되었을 때, 모든 뇌 영역에서의 낮은 발현이 Xu 등(Gene Therapy 2001, 8, 1323-1332의 전체 내용을 참고문헌으로서 본문에 포함)에 의해 발견되었다. Xu 등은 프로모터 활성이 내림차순으로 NSE(1.8 kb), EF, NSE(0.3 kb), GFAP, CMV, hENK, PPE, NFL 및 NFH임을 발견하였다. NFL은 650 뉴클레오티드 프로모터이고, NFH는 920 뉴클레오티드 프로모터이고, 둘 모두는 간에는 없지만 NFH는 감각 자기수용(proprioceptive) 뉴런, 뇌 및 척수에 풍부하고, NFH는 심장에 존재한다. Scn8a는 470 뉴클레오티드 프로모터이고 이는 DRG, 척수 및 뇌를 통해 발현되고, 해마 뉴런 및 소뇌 푸르키네 세포, 피질, 시상 및 시상하부에서 특히 높은 발현을 보인다(Drews et al. 2007 and Raymond et al. 2004의 각 내용 전체를 참고문헌으로서 본문에 포함).
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 UBC 프로모터를 포함한다. UBC 프로모터는 300 내지 350 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, UBC 프로모터는 332 뉴클레오티드이다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 GUSB 프로모터를 포함한다. GUSB 프로모터는 350 내지 400 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, GUSB 프로모터는 378 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보적일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 NFL 프로모터를 포함한다. NFL 프로모터는 600 내지 700 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, NFL 프로모터는 650 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보적일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 NFH 프로모터를 포함한다. NFH 프로모터는 900 내지 950 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, NFH 프로모터는 920 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보적일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 scn8a 프로모터를 포함한다. scn8a 프로모터는 450 내지 500 뉴클레오티드 크기를 가질 수 있다. 비제한적인 예로서, scn8a 프로모터는 470 뉴클레오티드이다. 비제한적인 예로서, 작제물은 AAV-프로모터-CMV/글로빈 인트론-hFXN-RBG일 수 있으며, 이때, AAV는 자기-상보적일 수 있고, AAV는 DJ 혈청형일 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 FXN 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 PGK 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 CBA 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 CMV 프로모터를 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 간 또는 골격근 프로모터를 포함한다. 간 프로모터의 비제한적인 예는 hAAT 및 TBG를 포함한다. 골격근 프로모터의 비제한적인 예는 데스민(Desmin), MCK 및 C5-12를 포함한다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터는 인핸서 요소, 프로모터 및/또는 5' UTR 인트론을 포함한다. 인핸서는 비제한적으로 CMV 인핸서일 수 있고, 프로모터는 비제한적으로 CMV, CBA, UBC, GUSB, NSE, 수냅신(Sunapsin), MeCP2, 및 GFAP 프로모터일 수 있고, 5' UTR/인트론은 비제한적으로 SV40, 및 CBA-MVM일 수 있다. 비제한적인 예로서, 조합되어 사용되는 인핸서, 프로모터 및/또는 인트론은: (1) CMV 인핸서, CMV 프로모터, SV40 5'UTR 인트론; (2) CMV 인핸서, CBA 프로모터, SV 40 5'UTR 인트론; (3) CMV 인핸서, CBA 프로모터, CBA-MVM 5'UTR 인트론; (4) UBC 프로모터; (5) GUSB 프로모터; (6) NSE 프로모터; (7) 시냅신 프로모터; (8) MeCP2 프로모터 및 (9) GFAP 프로모터일 수 있다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터는 조작된 프로모터를 갖는다.
인트론
하나의 구현예에서, 벡터 게놈은 전이유전자 표적 특이성 및 발현을 향상시키기 위한 하나 이상의 요소(예로, 본문에 포함된 Powell 등, Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015 의 전체 내용을 레퍼런스로서 참고)로, 인트론 등을 포함한다. 인트론의 비제한적인 예는, MVM(67 내지 97 bp), F.IX 절단된(truncated) 인트론 1(300 bp), β-글로빈 SD/면역글로빈 중쇄 스플라이스 수용자(250 bp), 아데노바이러스 스플라이스 공여자/면역글로빈 스플라이스 수용자(500 bp), SV40 후기 스플라이스 공여자/스플라이스 수용자(19S/16S)(180 bps) 및 혼성 아데노바이러스 스플라이스 공여자/IgG 스플라이스 수용자(230 bp)를 포함한다.
하나의 구현예에서, 인트론은 길이가 100 내지 500 뉴클레오티드일 수 있다. 인트론은 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490 또는 500 길이를 가질 수 있다. 프로모터는 80 내지 100, 80 내지 120, 80 내지 140, 80 내지 160, 80 내지 180, 80 내지 200, 80 내지 250, 80 내지 300, 80 내지 350, 80 내지 400, 80 내지 450, 80 내지 500, 200 내지 300, 200 내지 400, 200 내지 500, 300 내지 400, 300 내지 500, 또는 400 내지 500의 길이를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터 게놈은 프로모터, 예컨대 비제한적으로 CMV 또는 U6을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 AAV에 대한 프로모터는 CMV 프로모터이다. 또 다른 비제한적인 예로서, 본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 AAV에 대한 프로모터는 U6 프로모터이다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터는 CMV 및 U6 프로모터를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, AAV 벡터는 CBA 프로모터를 포함할 수 있다.
세포에 도입- 합성 dsRNA
siRNA 분자(예컨대, siRNA 이중가닥 및 dsRNA)의 화학적 및 생물학적 안정성을 확보하기 위해, siRNA 분자를 표적 세포 내에 전달하는 것이 중요하다. 일부 구현예에서, 세포는, 비제한적으로 포유류 기원, 인간 기원 세포, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포, 신경줄기세포 및 신경전구세포를 포함할 수 있다.
siRNA를 비롯한 핵산은 정상적인 생리학적 조건하에 당-인산염 골격에서 순 음전하를 띄고 있다. 세포에 들어가기 위해, siRNA 분자는 세포 막의 지질 이중층과 반드시 접촉해야 하며, 이의 머리 기(head group)도 또한 음전하를 띄고 있다.
siRNA 이중가닥은 이를 세포막을 가로지를 수 있도록 하는 담체, 예컨대 siRNA의 세포 흡수를 촉진시키는 포장 입자와 복합화될 수 있다. 포장 입자는, 비제하적으로 리포좀, 나노입자, 양이온 지질, 폴리에틸렌이민 유도체, 덴드리머(dendrimer), 탄소 나노튜브 및 탄소로 만들어진 나노입자와 덴드리머의 조합을 포함할 수 있다. 지질은 양이온 지질 및/또는 중성 지질일 수 있다. siRNA 분자와 양이온 담체사이에 잘 확립된 친유성 복합체 외에, siRNA 분자는 소수성 모이어티, 예컨대 콜레스테롤과 접합될 수 있다(예컨대, 미국공개특허 제20110110937호; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 이러한 전달 방법은 siRNA 분자의 시험관내 세포 흡수 및 생체내 약학적 특성을 향상시킬 잠재력을 가지고 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 또한 특정 양이온 세포-투과 펩티드(CPP), 예컨대 MPG, 트랜스포탄(transportan) 또는 페너트라틴(penetratin)과 공유결합 또는 비공유결합으로 접합될 수 있다(예컨대 미국공개특허 제20110086425호; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
세포에 도입- AAV 벡터
본 발명의 siRNA 분자(예컨대, siRNA 이중가닥)은 임의의 다양한 접근법, 예컨대 비제한적으로 바이러스 벡터(예컨대, AAV 벡터)를 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 바이러스 벡터는 형질감염에 대해 용이하게 조작되지 않는 세포 내로 siRNA 분자의 도입을 촉진하도록 조작되고 최적화되었다. 또한, 일부 합성 바이러스 벡터는 shRNA를 세포 게놈에 통합시킬 수 있는 능력을 가지고 있으며, 이에 따라 안정한 siRNA 발현 및 표적 유전자의 장기 넉다운을 유도한다. 이러한 방식으로, 바이러스 벡터는 야생형 바이러스에서 발견되는 해로운 복제 및/또는 통합 특징이 결여된 채 특이적 전달을 위한 비히클로서 조작된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자는, 세포를 친유성 담체 및 벡터, 예컨대 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 도입된다. 다른 구현예에서, siRNA 분자는, 세포를 벡터, 예컨대 세포에서 전사될 때 siRNA 분자를 생산할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터로 형질감염 또는 감염시킴으로써 세포 내에 도입된다. 일부 구현예에서, siRNA 분자는, 세포를 벡터, 예컨대 세포에서 전사될 때 siRNA 분자를 생산할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터에 주입함으로써 세포에 도입될 수 있다.
일부 구현예에서, 형질감염 전에, 벡터, 예컨대 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터는 세포 내로 형질감염시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 전기천공법에 의해 세포 내로 전달될 수 있다(예컨대, 미국공개특허 제20050014264호; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
본원에 기술된 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는, 미국공개특허 제20120264807호(이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같은 광화학 내재화(photochemical internalization)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 제형은 본원에 기술된 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 함유할 수 있다. 하나의 구현예에서, siRNA 분자는 하나 이상의 표적 부위에서 SOD1 유전자를 표적화할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제형은 다수의 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하며, 각 벡터는 상이한 표적 부위에서 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. SOD1은 2, 3, 4, 5 또는 5 초과 부위에서 표적화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 임의의 관련 종, 예컨대 비제한적으로 인간, 개, 마우스, 랫트 또는 원숭이로부터의 벡터, 예컨대 AAV 벡터가 세포 내로 도입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 치료될 질환과 관련된 세포 내로 도입될 수 있다. 비제한적인 예로서, 질환은 ALS이고, 표적 세포는 운동 뉴런 및 성상세포이다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 표적 서열의 높은 수준의 내인성 발현을 갖는 세포 내로 도입될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 표적 서열의 낮은 수준의 내인성 발현을 갖는 세포 내로 도입될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포는 높은 효율의 AAV 형질도입을 갖는 세포일 수 있다.
약제학적 조성물 및 제형
약제학적 조성물(siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터) 외에, 인간에 투여하기에 적절한 약제학적 조성물이 본원에서 제공되며, 이러한 조성물은 일반적으로 임의의 다른 동물, 예컨대, 비-인간 동물, 예컨대 비-인간 포유류에 투여하기에 적절하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 조성물을 다양한 동물에 투여하기에 적절하도록 하기 위해 인간에게 투여하기에 적절한 약제학적 조성물의 변형이 잘 알려져 있으며, 통상의 숙련된 수의학 약리학자는 단지 통상적인, 임의의 실험으로 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다. 약제학적 조성물의 투여가 고려되는 대상은, 비제한적으로 인간 및/또는 다른 영장류; 상업적으로 관련있는 포유류, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 고양이, 개, 마우스, 및/또는 랫트를 포함하는 포유류; 및/또는 상업적으로 관련있는 조류, 예컨대 가금, 닭, 오리, 거위 및/또는 칠면조를 포함하는 조류를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 인간, 인간 환자 또는 대상에 투여된다. 본 발명의 목적을 위해, 어구 "활성 성분"은 일반적으로 합성 siRNA 이중가닥, siRNA 이중가닥을 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터 또는 본원에 기술된 바와 같이 벡터에 의해 전달되는 siRNA 분자를 지칭한다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 임의의 공지된 또는 후술의 약학분야에서 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은, 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계, 및 이어서 필요한 및/또는 바람직한 경우, 제품을 목적하는 단일- 또는 다중-투여 단위로 분할, 성형 및/또는 포장하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물중의 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 치료되는 대상의 개체, 크기 및/또는 상태, 및 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는, (1) 안전성 증가; (2) 세포 형질감염 또는 형질도입; (3) 지속적 또는 지연된 방출 허용; (4) 생체분포 변경(예컨대, 바이러스 벡터를 특정 조직 또는 세포 유형, 예컨대 뇌 및 운동 뉴런으로 표적화)을 위해 하나 이상의 부형제를 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명의 제형은 제한 없이 식염수, 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 중합체, 리포플렉스, 코어-셀 나노입자, 펩티드, 단백질, 바이러스 벡터로 형질감염된 세포(예컨대, 대상으로의 이식하기 위한), 나노입자 모방체 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 바이러스 입자는 자기-조립된 핵산 나노입자를 사용하여 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 임의의 공지된 또는 후술의 약학분야에서 개발된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 단일 단위 투여량 및/또는 다수의 단일 단위 투여량으로써 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 본원에 사용된 "단위 투여량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 개별적인 양을 지칭한다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상에 투여될 활성 성분의 투여량과 동일하고, 이러한 투여량의 편리한 분획, 예컨대 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3이다.
본발명에 따른 약제학적 조성물중의 활성 성분, 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은, 치료되는 대상의 개체, 크기 및/또는 상태, 및 추가로 조성물이 투여되는 경로에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 조성물은 0.1% 내지 99% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다. 예컨대, 조성물은 0.1% 내지 100%, 예컨대 .5 내지 50%, 1 내지30%, 5 내지 80%, 적어도 80% (w/w)의 활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 순수할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 인간 용도 및 수의학적 용도로 승인될 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 식품 의약국에 의해 승인될 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 약제학적 등급인 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제는 미국 약전(USP), 유럽 약전(EP), 영국 약전, 및/또는 국제 약전의 표준을 만족할 수 있다.
본원에 사용된 부형제는, 목적하는 특정 투여 형태에 적절한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 희석제 또는 다른 액상 비히클, 분산제 또는 현탁 보조제, 계면활성제, 등장제, 농후제 또는 유화제, 보존제 등을 비제한적으로 포함한다. 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 다양한 부형제 및 조성물의 제조 기법이 당업계에 공지되어 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006; 이의 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 예컨대, 임의의 목적하지 않는 생물학적 효과를 생성시키거나 다른 방식으로 약제학적 조성물의 임의의 다른 구성요소와 유해한 방식으로 상호작용함으로써, 임의의 통상적인 부형제 매질이 물질 또는 이의 유도체와 배합될 수 없는 한을 제외하고, 통상적인 부형 매질의 사용이 본 발명의 범위 내에서 고려될 수 있다.
예시적인 희석제는, 비제한적으로 칼슘 카보네이트, 소듐 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 다이칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트, 칼슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트, 락토스, 당, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 솔비톨, 이노시톨, 소듐 클로라이드, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 당 등 및/또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 제형은 하나 이상의 불활성 성분을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "불활성 성분"은 제형에 포함된 하나 이상의 불활성제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본발명의 제형에 사용될 수 있는 불활성 성분 전부, 또는 일부는 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인될 수 있다.
본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터 제형은 양이온 또는 음이온을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 제형은 금속 양이온, 예컨대 비제한적으로 Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ 및 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는 염"은 개시된 화합물의 유도체를 지칭하며, 이때, 모(parent) 화합물은 존재하는 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예컨대, 유리 염기 기를 적절한 유기 산과 반응시킴으로써) 변형된다. 약제학적으로 허용되는 염의 예는, 비제한적으로, 아민과 같은 염기 잔기의 무기 또는 유기산 염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기 염 등을 포함한다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 비스설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄에프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로요다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레르에이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은, 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등 및 비독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온, 비제한적으로 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 에틸 아민 등을 포함하여 아민 양이온을 포함한다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 염은, 예컨대 비독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 염은, 통상적인 화학적 방법에 의해 염기 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이러한 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 중 또는 이 둘의 혼합물중의 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로 비수성 매질, 예컨대 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴이 바람직하다. 적절한 염의 목록이 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge 등, Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977) (각 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨) 에서 확인된다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 용매화물"은 적절한 용매의 분자가 결정형 격자에 혼입되어 있는 본 발명의 화합물을 의미한다. 적절한 용매는 투여된 투여량에서 생리학적으로 허용된다. 예컨대, 용매화물은, 유기 용매, 물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 용액으로부터 결정화, 재결정화 또는 침전에 의해 제조될 수 있다. 적절한 용매의 예는 에탄올, 물 (예컨대, 일-, 이- 및 삼-수화물), N-메틸피롤리돈(NMP), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), N,N'-다이메틸포름아마이드(DMF), N,N'-다이메틸아세트아마이드(DMAC), 1,3-다이메틸-2-이미다졸리디논(DMEU), 1,3-다이메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2-(1H)-피리미디논(DMPU), 아세토니트릴(ACN), 프로필렌 글리콜, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 2-피롤리돈, 벤질 벤조에이트 등이다. 물이 용매인 경우, 용매화물은 "수화물"이라고 지칭된다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 CNS 전달을 위해 제형화될 수 있다. 뇌 혈액 장벽을 가로지르는 제제가 사용될 수 있다. 예컨대, siRNA 분자를 뇌 혈액 장벽 내피로 표적화할 수 있는 일부 세포 침투 펩티드가 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥을 제형화하기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, Mathupala, Expert Opin Ther Pat., 2009, 19, 137-140; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
투여
본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터가 치료 효과의 결과를 가져오는 임의의 경로로 투여될 수 있다. 이는 비제한적으로, 장내(장관내), 위장내, 경막외(경질막내에), 경구(입을 통해), 경피, 경막주위, 뇌내(대뇌내), 뇌실내(대뇌강내로), 피내단자(피부에 도포), 진피내(피부 자체내) 피하(피부아래), 비강 투여 (코를 통해), 정맥내(정맥내로), 정맥내 대량주입, 정맥내 점적주입, 동맥내(동맥내에), 근육내(근육안에), 심장내(심장안에), 골내(골수내로), 척수강내(척추관내로), 복강내(복막내 주입 또는 주사), 방광내 주입, 유리체내(안구를 통해), 해면정맥동내 주사(병적강내에), 강내(음경 기저부내), 질내투여, 자궁내, 양막외 투여, 경피내(전신 분포를 위한 손상되지 않은 피부를 통한 확산), 점막관통(점막을 통한 확산), 질경유, 흡입제(코 흡입), 혀 밑, 입술밑, 관장, 눈점안액(결막위), 귀점적, 귓바퀴(이도 안에 또는 이를 경유하여), 협측(볼쪽을 향하여), 결막, 피부, 이(치아 또는 이빨로), 전기삼투, 자궁경경내막, 맥내, 기관내, 체외, 혈액투석, 침습, 사이질, 복강내, 양막내, 관절내, 난관내, 기관지내, 활액낭내, 연골내(관절안에), 마미내(마미내에), 수조내(소뇌숨뇌수조 큰수조 내에), 각막내(각막내로), 치아관상, 심장 동맥내(관상동맥내로), 해면채내(음경내 해면체의 확장가능한 공간내), 층판내(디스크내에), 선관내(샘관내), 십이지장내(십이지장안에), 경막내(경막내 또는 경막밑), 표피내(표피에), 식도내(식도에), 위내(위안에), 잇몸내(치은안에), 회장내(소장의 말초부분내), 병변내(국부적인 병변내 또는 직접 도입), 내강내(관의 내강 안에), 림프액내(림프내로), 골수내 (골수강내로), 수막내 (수막내에), 안구내 (안구내로), 난소내 (난소내로), 심낭막내(심낭막내로), 흉막내(흉막내에), 전립선내(전립선내로), 폐내(폐 또는 기관지내), 내흉(비강 또는 안와 부비동내로), 척수내(척추내에), 활액내(관절강 활액내로), 힘줄내(힘줄내로), 고환내(고환안에), 수막공간내(임의의 수준의 뇌척수축에서의 뇌척수액내), 흉곽내(가슴우리 내에), 관내(기관의 세관내로), 종양내(종양내로), 고막내(청각매질내로), 혈관내(혈관 또는 혈관들내로), 심실내(심실내로), 이온삼투압(가용성 염 이온이 신체의 조직으로 이동하는 전류에 의해), 세척(개방상처 또는 체강을 세척하거나 씻어내서), 후두(후두에 직접), 비위관(코를 통해 위장으로), 교합적 드레싱 기술(국소 경로 관리는 그영역을 덮는 드레싱에 의해 덮힘), 안구(눈 외부에), 구강인두(입과 인두에 직접), 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 회음부, 치주, 직장, 호흡기(국소 또는 전신효과를 위해 구강내 또는 비강흡입용 호흡기 안에), 연수후부(교뇌 뒤 또는 안구 뒤), 연조직, 지주막하, 결막하, 점막하, 국소, 경태반(태반을 통과 또는 통해), 기관지경(기관벽을 통해), 고실경유(고실을 통과 또는 통해), 요관(요관으로), 요도(요도로), 질, 미추차단, 신경차단, 담즙관류, 심장관류, 광분반술 또는 척추를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 벡터 또는 siRNA 분자가 중추신경계에 들어가서 운동 뉴런 내에 침투하는 것을 촉진시키는 방식으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 근육 주사에 의해 투여될 수 있다. Rizvanov 등은, 돌연변이 인간 SOD1 mRNA를 표적화하는 siRNA 분자가 궁둥 신경(sciatic nerve)에 의해 흡수되고, 운동 뉴런의 세포체에 역으로 수송되어, SOD1G93A 형질전환 ALS 마우스에서 돌연변이 SOD1 mRNA를 저해한다는 것을 처음으로 밝혔다(Rizvanov AA 등, Exp . Brain Res., 2009, 195(1), 1-4; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨). 또 다른 연구는 또한, 돌연변이 SOD1 유전자에 대한 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하는 AAV의 근육 전달은, 근육에서 유의한 돌연변이 SOD1 넉다운 및 운동 뉴런의 신경자극전달(innervating)을 유도함을 보여주었다(Towne C 등, Mol Ther., 2011; 19(2): 274-283; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 이중가닥을 발현하는 AAV 벡터는 말초 주사 및/또는 비강내 전달에 의해 투여될 수 있다. siRNA 이중가닥에 대한 AAV 벡터의 말초 투여가 중추신경계, 예컨대 운동 뉴런으로 수송될 수 있음이 당업계에 개시되어 있다(예컨대, 미국공개특허 제20100240739호; 및 제20100130594호; 각 내용의 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 조성물은 두개내 전달에 의해 대상에 투여될 수 있다(예로, 본문에 포함된 미국특허 제8,119,611호의 전체 내용을 레퍼런스로서 참고)).
본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 조성물은, 액상 용액 또는 현택액으로서, 액상 용액 또는 액상 용액중의 현탁액에 적절한 고체로서, 임의의 적절한 형태로 투여될 수 있다. siRNA 이중가닥은 임의의 적절하고 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 "치료 유효"량, 즉, 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 완화 및/또는 예방하거나, 대상의 상태의 개선을 제공하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS를 갖는 대상의 기능 및/또는 생존을 개선시키기 위해 치료 유효량으로 CNS에 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터는 척수강내로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 척수 및/또는 뇌간에서 운동 뉴런 및 성상세포를 표적하기 위해 siRNA 이중가닥 또는 dsRNA에 대한 치료 유효량으로 대상에 투여될 수 있다(예컨대 척추강내 투여를 통해 대상의 CNS로). 비제한적인 예로서, siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 SOD1 단백질 또는 mRNA의 발현을 감소시킬 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, siRNA 이중가닥 또는 dsRNA는 SOD1를 억제할 수 있고 SOD1 매개 독성을 감소시킬 수 있다. SOD1 단백질 및/또는 mRNA의 감소뿐만 아니라 SOD1 매개 독성의 감소는 염증의 증가가 거의 없이 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 대상의 기능 저하를 늦추거나/늦추고(예컨대, 기능평가척도(ALSFRS)와 같이 공지된 평가 방법을 사용하여 결정됨), 대상(예컨대, 감소된 사망률 또는 인공호흡기 보조 필요)의 인공 호흡기 독립적 생존을 연장시키기 위해 치료 유효량으로 대상에 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터는 척수강내로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 척수 운동 뉴런 및/또는 성상세포에 형질도입하기 위한 치료 유효량으로 큰수조에 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터는 척수강내로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 척수 운동 뉴런 및/또는 성상세포에 형질도입하기 위한 치료 유효량으로 척수강내 주입을 사용하여 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터는 척수강내로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로서, 제형의 염기성도 및/또는 삼투압은 중추신경계 또는 중추신경계의 영역 또는 구성요소에서 최적의 약물 분포를 보장하도록 최적화될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 단일 경로 투여를 통해 대상에 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 투여의 다중-부위 경로를 통해 대상에 전달될 수 있다. 대상은 2, 3, 4, 5 또는 5 초과의 부위에 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터가 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 볼루스 주입을 사용하여 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터가 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 수 분, 수 시간 또는 수 일의 주기에 걸친 지속 전달을 사용하여 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터가 투여될 수 있다. 주입 속도는 대상, 분포, 제형 또는 또 다른 전달 척도에 따라 변할 수 있다.
하나의 구현예에서, 카테터는 다중-부위 전달을 위해 척추의 하나 이상의 부위에 위치할 수 있다. 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 연속적인 및/또는 볼루스 주입으로 전달될 수 있다. 각 전달 부위는 투여 요법에 따라 상이할 수 있으며, 동일한 투여 요법이 각 전달 부위에 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 전달 부위는 경부 및 요추 영역내일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 전달 부위는 경부 영역내일 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 전달 부위는 요추 영역내일 수 있다.
하나의 구현예에서, 대상은 본원에 기술된 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 전달 전에 척추 해부학 및 병리학에 대해 분석될 수 있다. 비제한적인 예로서, 척추측만증을 갖는 대상은 척추측만증이 없는 환자와 비교하여 상이한 투여 요법 및/또는 카테터 위치를 가질 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 전달 동안 대상의 척주 방향은 지면에 수직일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 전달 동안 대상의 척주 방향은 지면에 수평일 수 있다.
하나의 구현예에서, 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 전달 동안 대상의 척주 방향은 지면과 비교한 각도일 수 있다. 지면과 비교한 대상의 척추 각도는 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 또는 180 도일 수 있다.
하나의 구현예에서, 전달 방법 및 지속기간은 척수에서 광범위한 형질도입을 제공하도록 선택된다. 비제한적인 예로서, 척수강내 전달은 척수의 부 리(rostral)-꼬리(caudal) 길이를 따라 광범위한 형질도입을 제공하는데 사용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 다중-부위 주입은 척수의 부리-꼬리 길이를 따라 보다 균일한 형질도입을 제공한다. 또 다른 비제한적인 예로서, 연장된 주입은 척수의 부리-꼬리 길이를 따라 보다 균일한 형질도입을 제공한다.
투여
본 발명의 약제학적 조성물은 SOD1 관련 장애(예컨대, ALS)를 감소, 예방 및/또는 치료하기 위해 임의의 유효량을 사용하여 대상에 투여될 수 있다. 필요한 정확한 투여량은 종, 연령 및 대상의 일반적인 상태, 질환의 중증도, 특정 조성물, 이의 투여 형태, 이의 활성 형태 등에 따라 대상마다 다를 것이다.
본 발명의 조성물은 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 전형적으로 단위 투여량 형태로 제형화된다. 그러나, 본 발명의 조성물의 총 일일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있음이 이해될 것이다. 임의의 특정 환자에 대한 특정 치료 효과는 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 화합물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 siRNA 이중가닥의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료 지속기간; 사용되는 특정 화합물과 조합되어 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의료업계에 공지된 인자를 비롯하여 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
하나의 구현예에서, 대상의 연령 및 성별은 본 발명의 조성물의 투여량을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 비제한적인 예시로서, 나이가 많은 대상은 나이가 어린 대상에 비해 더 많은 투여량의 조성물(예컨대, 5 내지 10%, 10 내지 20%, 15 내지 30% ,20 내지 50%, 25 내지 50% 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 90% 초과)을 받을 수 있다. 비제한적인 예시로서, 나이가 어린 대상은 나이가 많은 대상에 비해 더 많은 투여량의 조성물(예컨대, 5 내지 10%, 10 내지 20%, 15 내지 30% ,20 내지 50%, 25 내지 50% 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 90% 초과)을 받을 수 있다. 비제한적인 예시로서, 여자인 대상은 남자인 대상에 비해 더 많은 투여량의 조성물(예컨대, 5 내지 10%, 10 내지 20%, 15 내지 30% ,20 내지 50%, 25 내지 50% 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 90% 초과)을 받을 수 있다. 비제한적인 예시로서, 남자인 대상은 여자인 대상에 비해 더 많은 투여량의 조성물(예컨대, 5 내지 10%, 10 내지 20%, 15 내지 30% ,20 내지 50%, 25 내지 50% 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상 또는 90% 초과)을 받을 수 있다.
일부 특정 구현예에서, 본 발명의 siRNA 이중가닥을 전달하기 위한 AAV 벡터의 투여량은 질환의 상태, 대상 및 치료 전략에 따라 맞춰질 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포의 전달은 [VG/시간 = mL/시간 * VG/mL](여기서, VG는 바이러스 게놈이고, VG/mL은 조성물 농도이고, mL/시간은 연장된 전달의 속도이다)]로 정의된 전달 속도를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG 내지 약 1x1016 VG의 대상 당 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7.1x1011, 7.2x1011, 7.3x1011, 7.4x1011, 7.5x1011, 7.6x1011, 7.7x1011, 7.8x1011, 7.9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1 x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012,4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8.1x1012, 8.2x1012, 8.3x1012, 8.4x1012, 8.5x1012, 8.6x1012, 8.7x1012, 8.8 x1012, 8.9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/대상의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG/kg 내지 약 1x1016 VG/kg의 대상 당 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 2.1x1011, 2.2x1011, 2.3x1011, 2.4x1011, 2.5x1011, 2.6x1011, 2.7x1011, 2.8x1011, 2.9x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 7.1x1011, 7.2x1011, 7.3x1011, 7.4x1011, 7.5x1011, 7.6x1011, 7.7x1011, 7.8x1011, 7.9x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1 x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012,4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 8.1x1012, 8.2x1012, 8.3x1012, 8.4x1012, 8.5x1012, 8.6x1012, 8.7x1012, 8.8 x1012, 8.9x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/kg의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
하나의 구현예에서, 약 105 내지 106의 바이러스 게놈(단위)이 투여량 당 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물의 세포로의 전달은 약 1x106 VG/mL 내지 약 1x1016 VG/mL의 총 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전달은 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 9x108, 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 9x109, 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 9x1010, 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 9x1011, 1x1012, 1.1x1012, 1.2x1012, 1.3x1012, 1.4x1012, 1.5x1012, 1.6x1012, 1.7x1012, 1.8x1012, 1.9x1012, 2x1012, 2.1x1012, 2.2x1012, 2.3x1012, 2.4x1012, 2.5x1012, 2.6x1012, 2.7x1012, 2.8x1012, 2.9x1012, 3x1012, 3.1x1012, 3.2x1012, 3.3x1012, 3.4x1012, 3.5x1012, 3.6x1012, 3.7x1012, 3.8x1012, 3.9x1012, 4x1012, 4.1x1012, 4.2x1012, 4.3x1012, 4.4x1012, 4.5x1012, 4.6x1012, 4.7x1012, 4.8x1012, 4.9x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 9x1012, 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 6.7x1013, 7x1013, 8x1013, 9x1013, 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 9x1014, 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 9x1015, 또는 1x1016 VG/mL의 조성물 농도를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 바람직한 siRNA 이중가닥 투여량은 다중 투여량을 사용하여 전달될 수 있다 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14회 이상의 투여). 다중 투여가 사용되는 경우, 본원에 기술된 바와 같은 분할 투여 요법이 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "분할 투여량"은 단일 단위 투여량 또는 일일 투여량을 2회 이상의 투여량, 예컨대 단일 단위 투여량의 2회 이상의 투여로 나눈 것이다. 본원에 사용된 "단일 단위 투여량"은 1회 투여량/1회/단일 경로/단일 접촉점으로, 즉 단일 투여건으로 투여된 조절성 폴리뉴클레오티드 치료제의 투여량이다. 본원에 사용된 "총 일일 투여량"은 24시간 주기 내에 주어진 또는 처방된 양이다. 이는 단일 단위 투여량으로서 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조절성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터는 분할 투여량으로 대상에 투여된다. 이들은 오직 완충액중에서 또는 본원에 기술된 제형중에서 제형화될 수 있다.
ALS 의 치료 방법
본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 세포 내에 도입하는 방법이 본 발명에서 제공되며, 이러한 방법은 임의의 벡터를 표적 SOD1 mRAN의 분해가 일어나기에 충분한 양으로 세포에 도입함에 따라 세포에서 표적-특이적인 RNAi가 활성시키는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 줄기 세포, 신경 세포 예컨대 운동 뉴런, 근육 세포 및 신경교세포 예컨대 성상세포일 수 있다.
본 발명은, 치료를 필요로하는 대상에서 비정상적인 SOD1 기능과 관련된 ALS를 치료하는 방법을 개시한다. 이러한 방법은 선택적으로 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 비제한적인 예시로서, siRNA 분자는 SOD1 유전자 발현을 침묵시킬 수 있고, SOD1 단백질 생산을 저해할 수 있고, ALS가 치료적으로 치료되도록 대상에서 ALS의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 조성물은 대상의 중추신경계에 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 포함하는 조성물은 대상의 근육에 투여된다.
특히, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는, 운동 뉴런, 희돌기교세포를 포함하는 신경교세포, 성상세포 및 미세아교세포; 및/또는 T 세포와 같은 신경 주변의 다른 세포를 포함하여, 특이적 유형의 표적화된 세포 내에 전달될 수 있다. 인간 ALS 환자 및 동물 SOD1 ALS 모델에서의 연구는 신경교세포가 운동 신경의 기능부전 및 사멸에서 초기 역할을 한다는 것을 보여준다. 돌연변이 SOD1이 운동 뉴런에 존재하더라도, 주변의 보호성 신경교세포에서의 정상적인 SOD1은 운동 뉴런이 사멸되는 것을 막을 수 있다(예컨대, Philips 및 Rothstein, Exp . Neurol., 2014, May 22. pii: S0014-4886(14)00157-5 참조; 이의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨).
일부 특정 구현예에서, 본 발명의 siRNA 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS에 대한 치료제로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 ALS의 치료를 위한 단독 치료제 또는 병용 치료제로서 투여된다.
SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA 이중가닥을 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 하나 이상의 다른 체료제와 조합되어 사용될 수 있다. "와 조합되어"라는 것은, 이러한 전달 방법이 본 발명의 범위 내에 있음에도 불구하고, 제제가 반드시 동시에 투여되고/되거나 함께 전달되도록 제형화되어야함을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 조성물은 하나 이상의 다른 목적하는 치료제 또는 의학적 처치와 동시에, 그전에 또는 후에 투여될 수 있다. 일반적으로 각 제제는 제제에 대해 결정된 투여량 및/또는 시간 스케쥴로 투여될 것이다.
본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터와 조합되어 사용될 수 있는 치료제는, 항산화제, 항-염증제, 항-세포자멸제, 칼슘 조절제, 항글루탐산제, 구조적 단백질 저해제 및 금속 이온 조절과 연관된 화합물인 작은 분자 화합물일 수 있다.
본원에 기술된 벡터와 조합하여 사용될 수 있는, ALS 치료를 위해 시험된 화합물은 비제한적으로 항글루탐산제: 릴루졸, 토피라메이트, 탈람판넬, 라모트리진, 덱스트로메트로판, 가바펜틴 및 AMPA 길항제; 항-세포자멸제: 미노사이클린, 소듐 페닐부틸레이트 및 아리모클로몰; 항-염증제: 강글리오시드, 셀레콕시브, 사이클로스포린, 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 플라즈마포레시스, 글라티라머 아세테이트 및 탈리도마이드; 세프트리악손(Berry 등, Plos One, 2013, 8(4)); 피트-락탐 항생제; 프라미펙솔(도파민 길항제) (Wang 등, Amyotrophic Lateral Scler., 2008, 9(1), 50-58); 미국공개특허 제20060074991호의 니메슐리드; 미국공개특허 제20130143873호에 개시된 다이아족사이드); 미국특허 제20080161378호에 개시된 피라졸론 유도체; 산화 스트레스-유도 세포 사멸을 저해하는 자유 라디칼 스캐빈저, 예컨대 본문에 포함된 브로모크립틴 (미국 공개특허 제20110105517호); PCT 특허공개 제2013100571호에 논의된 페닐 카바메이트 화합물; 미국특허 제6,933,310호 및 제8,399,514호 및 미국공개특허 제20110237907호 및 제20140038927호에 개시된 신경보호 화합물; 및 미국공개특허 제20070185012호에 교시된 글리코펩티드를 포함한다. 위의 각 내용 전체를 레퍼런스로서 참고하라.
본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 암호화하는 벡터, 예컨대 AVV 벡터와의 병용 요법에 사용될 수 있는 치료제는 신경 손실을 보호할 수 있는 호르몬 또는 변이체, 예컨대 부신피질자극호르몬(ACTH) 또는 이의 단편(예컨대, 미국공개특허 제20130259875호); 에스트로겐(예컨대, 미국특허 제6,334,998호 및 제 6,592,845호)(이의 각각의 내용 전체가 참조로써 본원에 포함됨)일 수 있다.
신경영양 인자가 ALS를 치료하기 위하여 본 발명의 siRNA에 대한 핵산 서열을 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터와의 병용 요법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 신경영양 인자는 뉴런의 생존, 성장, 분화, 증식 및/또는 성숙을 촉진하거나, 뉴런의 증가된 활성을 자극하는 물질로서 정의된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가로 치료를 필요로하는 대상에 하나 이상의 영양 인자를 전달하는 것을 포함한다. 영양 인자는, 비제한적으로, IGF-I, GDNF, BDNF, CTNF, VEGF, 콜리벨린, 잘리프로덴, 타이로트로핀 -방출 호르몬 및 ADNF, 및 이들의 변이체를 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, SOD1 유전자를 표적화하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 신경영양 인자, 예컨대 AAV-IGF-I(Vincent 등, Neuromolecular medicine, 2004, 6, 79-85; 이의 전체 내용이 참조로써 본원에 포함됨) 및 AAV-GDNF(Wang 등, J Neurosci., 2002, 22, 6920-6928; 이의 전체 내용이 참조로써 본원에 포함됨)를 발현하는 AAV 벡터와 함께 병용투여될 수 있다.
일부 구현예에서, ALS 치료를 위한 본 발명의 조성물은 치료를 필요로 하는 대상에, siRNA 분자 또는 siRNA 분자를 포함하는 벡터가 혈액-뇌 장벽 및 혈액 척수 장벽 중 하나 또는 둘 모두를 통과할 수 있도록 , 정맥내로, 근육내로, 피하로, 복강내로, 척수강내로 및/또는 심실내로 투여된다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 대상의 중추신경계(CNS)에 본 발명의 siRNA 분자에 대한 핵산 서열을 포함하는 벡터, 예컨대 AAV를 벡터를 포함하는 조성물의 치료적 유효량을(예컨대, 주입 펌프 및/또는 전달 스캐폴드를 사용하여) 직접 투여(예컨대, 심실내 투여 및/또는 척수강내 투여)하는 것을 포함한다. 이러한 벡터는 SOD1 유전자 발현을 침묵 또는 억제시키기 위해 사용될 수 있고/있거나 ALS가 치료적으로 치료되도록 대상에서 ALS의 하나 이상의 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
특정 양태에서, ALS의 증상은 비제한적으로 운동 뉴런 퇴화, 근육 약화, 근육 위축, 근육의 뻣뻣함, 호흡의 어려움, 불분명한 발음, 갑작스런 경련의 발달, 전두측두엽 치매를 포함고/하거나 치료되는 대상에서 조기 사망이 개선된다. 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 뇌 및 척수 중 하나 또는 둘 다에 적용된다. 다른 양태에서, 근육 조정 및 근육 기능 중 하나 또는 둘 다가 개선된다. 다른 양태에서, 대상의 생존이 연장된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 siRNA를 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 대상으로의 투여는 대상의 CNS에서 돌연변이 SOD1을 낮출 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA를 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 대상으로의 투여는 대상의 CNS에서 야생형 SOD1을 낮출 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 siRNA를 암호화하는 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 대상으로의 투여는 대상의 CNS에서 돌연변이 SOD1 및 야생형 SOD1을 낮출 수 있다. 돌연변이 및 야생형 SOD1은 대상의 CNS, CNS 영역 또는 CNS의 특정 세포에서 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100%, 또는 20 내지 30%, 20 내지 40%, 20 내지 50%, 20 내지 60%, 20 내지 70%, 20 내지 80%, 20 내지 90%, 20 내지 95%, 20 내지 100%, 30 내지 40%, 30 내지 50%, 30 내지 60%, 30 내지 70%, 30 내지 80%, 30 내지 90%, 30 내지 95%, 30 내지 100%, 40 내지 50%, 40 내지 60%, 40 내지 70%, 40 내지 80%, 40 내지 90%, 40 내지 95%, 40 내지 100%, 50 내지 60%, 50 내지 70%, 50 내지 80%, 50 내지 90%, 50 내지 95%, 50 내지 100%, 60 내지 70%, 60 내지 80%, 60 내지 90%, 60 내지 95%, 60 내지 100%, 70 내지 80%, 70 내지 90%, 70 내지 95%, 70 내지 100%, 80 내지 90%, 80 내지 95%, 80 내지 100%, 90 내지 95%, 90 내지 100% 또는 95 내지 100%까지 낮아질 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 운동 뉴런(예컨대, 배쪽뿔(ventral horn) 운동 뉴런) 및/또는 성상세포에서 야생형 SOD1의 발현을 50% 이상까지 낮출 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 운동 뉴런(예컨대, 배쪽뿔 운동 뉴런) 및/또는 성상세포에서 돌연변이 SOD1의 발현을 50% 이상까지 낮출 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 운동 뉴런(예컨대, 배쪽뿔 운동 뉴런) 및/또는 성상세포에서 야생형 SOD1 및 돌연변이 SOD1의 발현을 50% 이상까지 낮출 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터의 대상으로의 투여는 척수에서 돌연변이 및/또는 야생형 SOD1의 발현을 감소시킬 것이고, 돌연변이 및/또는 야생형 SOD1의 발현 감소는 대상에서 ALS의 영향을 감소시킬 것이다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS의 초기 단계에 있는 대상에 투여될 수 있다. 초기 단계 증상은, 비제한적으로 근육이 연약하고 유연하거나 뻣뻣한 근육, 팽팽하고 경련된 근육, 근육의 쪼임 및 떨림(갑작스런 경련), 근육 질량의 손실(위축증), 피로, 불량한 균형, 불분명한 발음의 말, 약한 손힘(grip), 및/또는 보행시 헛디딤 등을 포함한다. 이러한 증상은 단일 신체 영역에 제한될 수 있고, 가벼운 증상은 하나 초가의 영역에 영향을 미칠 수 있다. 비제한적인 예로서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS 증상의 중증도 및/또는 발생을 감소시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS의 중기 단계에 있는 대상에 투여될 수 있다. ALS의 중기 단계는, 비제한적으로 초기 단계에 비해 더 광범위하게 퍼진 근육 증상, 다른 근육은 약해지거나 영향을 받지 않은 반면 일부 근육은 마비됨, 지속적인 근육 떨림 (갑작스런 경련), 사용하지 않는 근육이 수축의 원인이 되어 관절이 경직됨, 통증 및 종종 기형, 삼키는 근육 운동의 약화가 질식 및 섭취 및 침 삼킴의 보다 큰 어려움을 야기할 수 있음, 호흡 근육의 약화는 호흡의 특히 누워 있을 때 분명한 호흡의 불충분을 야기할 수 있음 및/또는 대상은 한차례의 비조절되고 부적절한 웃음 또는 울음(가성연수 효과)을 포함한다. 비제한적인 예로서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 ALS 증상의 중증도 및/또는 발생을 감소시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 후기 단계의 ALS인 대상에 투여될 수 있다. 후기 단계의 ALS는, 비제한적으로 대부분 마비된 수의근, 폐의 공기의 내뱉는 운동을 도움주는 근육이 심각하게 약화됨, 운동성이 극도로 제한됨, 불량한 호흡이 피로, 생각이 몽롱해짐, 두통 및 감염 또는 질환(예컨대, 폐렴)에 취약해짐을 야기함, 말하기가 어려워지고 입을 통한 섭취 또는 식음이 불가능해질 수 있음을 포함한다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 C9orf72돌연변이를 갖는 ALS를 갖는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 TDP-43 돌연변이를 갖는 ALS를 갖는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 벡터, 예컨대 AAV 벡터는 FUS 돌연변이를 갖는 ALS를 갖는 대상을 치료하는데 사용될 수 있다.
정의
달리 언급되지 않는한, 다음의 용어 및 어구는 후술되는 의미를 갖는다. 정의는 본질적으로 제한하는 것을 의미하는 것은 아니며, 본 발명의 특정 양상의 보다 명확한 이해를 제공하기 위해 제공된다.
본원에 사용된 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 폴리디옥시리보뉴클레오티드(2-디옥시-D-리보스 포함), 또는 폴리리보뉴클레오티드(D-리보스 포함), 또는 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N 글리코시드, 또는 변경된 퓨린 또는 피리미딘 염기인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드로 구성된 핵산 중합체를 지칭한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 사이의 길이에는 의도된 구별이 없으며, 이러한 용어는 상호교환적으로 사용될 것이다. 이러한 용어는 오직 분자의 1차 구조만을 지칭한다. 따라서, 이러한 용어는 이중- 및 단일-가닥의 DNA뿐만 아니라 이중- 및 단일-가닥의 RNA를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "RNA" 또는 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다; 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자" 또는 "디옥시리보핵산 분자"는 디옥시리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. DNA 및 RNA는, 예컨대 DNA 복제 및 DNA 전사에 의해 각각 자연적으로 합성될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. DNA 및 RNA는 단일-가닥(예컨대 각각 ssRNA 또는 ssDNA) 또는 다중-가닥(예컨대, 이중 가닥, 즉, 각각 dsRNA 및 ds DNA)일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "mRNA" 또는 "메신저 RNA"는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄의 아미노산 서열을 암호화하는 단일 가닥의 RNA를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "RNA 간섭" 또는 "RANi"는 상응하는 단백질-암호화 유전자 발현의 억제, 간섭 또는 "침묵"을 야기하는, RNA 분자에 의해 매개되는 서열 특이적인 조절 메커니즘을 지칭한다. RNAi는 식물, 동물 및 곰팡이를 비롯하여 많은 유형의 유기체에서 발견된다. RNAi는 외래 RNA(예컨대, 바이러스 RNA)를 제거하기 위해 세포에서 자연적으로 발생한다. 천연 RNAi는 분해 메커니즘을 다른 유사한 RNA 서열로 향하게 하는 유리 dsRNA로부터 절단된 단편을 통해 진행된다. RNAi는 RNA 유도된 침묵 복합체(RISC)에 의해 조절되며, 세포질에서 짧은/작은 dsRNA 분자에 의해 개시되고, 여기에서 이들은 촉매적 RISC 구성요소인 아르고네이트(argonaute)와 상호작용한다, dsRNA 분자는 세포에 외인성으로 도입될 수 있다. 외인성 dsRNA는 리보뉴클레아제 단백질인 다이서를 활성화시킴으로써 RNAi를 개시하고, 다이서는 dsRNA에 결합하여 절단하여 각 말단에 일부 짝지워지지 않은 오버행 염기를 갖는 21 내지 25 염기쌍의 이중 가닥의 단편을 생성한다. 이러한 짧은 이중 가닥의 단편은 작은 간섭 RNA(siRNA)라고 일컬어진다.
본원에 사용된 용어 "짧은 간섭 RNA", "작은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 RNAi를 지시하거나 매개할 수 있는, 약 5 내지 60 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함하는 RNA 분자(또는 RNA 유사체)를 지칭한다. 바람직하게는, siRNA 분자는 약 15 내지 30 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 약 16 내지 25 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 약 18 내지 23 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 약 19 내지 22 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)(예컨대, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체), 약 19 내지 25 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 및 약 19 내지 24 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체)를 포함한다. 용어 "짧은" siRNA는 5 내지 23 뉴클레오티드 바람직하게는 21 뉴클레오티드(또는 뉴클레오티드 유사체), 예컨대, 19, 20, 21 또는 22 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA를 지칭한다. 용어 "긴" siRNA는 24 내지 60 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 24 내지 25 뉴클레오티드, 예컨대, 23, 24, 25 또는 26 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA를 지칭한다. 짧은 siRNAs는 경우에 따라, 보다 짧은 siRNA가 RNAi를 매개하는 능력을 보유하는 경우, 19 뉴클레오티드 미만, 예컨대, 16, 17 또는 18 뉴클레오티드, 또는 5 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 긴 siRNAs는 경우에 따라, 보다 긴 siRNA가 짧은 siRNA에 대한 추가 처리, 예컨대 효소 처리가 없는 경우 RNAi 또는 번역 억제를 매개하는 능력을 보유하는 경우, 26 뉴클레오티드 초과, 예컨대, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 심지어는 60 뉴클레오티드 초과를 포함한다. siRNA는 단일 가닥의 RNA 분자(ss-siRNA) 또는 혼성화되어 siRNA 이중가닥으로 불리는 이중가닥 구조를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥의 RNA 분자(ds-siRNA)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 siRNA 분자의 "안티센스 가닥" 또는 "제1가닥" 또는 "가이드 가닥"은 침묵에 대해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10 내지 50 뉴클레오티드, 예컨대 약 15 내지 30, 16 내지 25, 18 내지 23 또는 19 내지 22 뉴클레오티드의 부분에 실질적으로 상보적인 가닥을 지칭한다. 안티센스 가닥 또는 제1가닥은 표적-특이적 침묵을 지시하기 위해 목적하는 표적 mRNA 서열에 대해 충분히 상보적인 서열을 가지며, 예컨대, 상보성은 RNAi 기구 또는 처리과정에 의해 표적 mRNA의 파괴를 유발시키기에 충분하다.
본원에 사용된 용어 siRNA 분자의 "센스 가닥" 또는 "제2가닥" 또는 "패신저 가닥"은 안티센스 가닥 또는 제1가닥에 상보적인 가닥을 지칭한다. siRNA 분자의 안티센스 및 센스가닥은 혼성화되어 이중가닥 구조를 형성한다. 본원에 사용된 "siRNA 이중가닥"은 침묵에 대해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10 내지 50 뉴클레오티드 부분에 대해 충분히 상보성을 갖는 siRNA 가닥 및 siRNA 가닥과 이중가닥을 형성하기에 충분히 상보성을 갖는 siRNA 가닥 포함한다.
본원에 사용된 용어 "상보적인"은 서로 염기쌍을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 능력을 지칭한다. 염기쌍은 전형적으로 역평행 폴리뉴클레오티드 가닥의 뉴클레오티드 단위 사이의 수소결합에 의해 형성된다. 상보적인 폴리뉴클레오티드 가닥은 왓슨-크릭 방식(예컨대, A와 T, A와 U, C와 G)으로, 또는 이중가닥 형성을 허용하는 임의의 다른 방식으로 염기쌍을 형성할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, DNA와 대조적으로 RNA를 사용하는 경우, 티민 대신 우라실이 아데노신에 상보적인 것으로 간주되는 염기이다. 그러나, 본 발명의 맥락에서 U가 언급되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, T를 치환하는 능력을 의미한다. 완전한 상보성 또는 100% 상보성은 하나의 폴리뉴클레오티드 가닥의 각 뉴클레오티드 단위가 제2폴리뉴클레오티드 가닥의 뉴클레오티드 단위와 수소 결합을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 완전한 상보성보다 적은 것은, 2 가닥의 전부는 아니지만 일부 뉴클레오티드 단위가 서로 수소결합을 형성할 수 있는 상황을 지칭한다. 예컨대, 2개의 20량체에 대하여, 각 가닥의 2개의 염기쌍만이 서로 수소결합을 형성할 수 있는 경우, 폴리뉴클레오티드 가닥은 10% 상보성을 나타낸다. 동일한 예에서, 각 가닥 상에 18개의 염기쌍이 서로 수소결합을 형성할 수 있는 경우, 폴리뉴클레오티드 가닥은 90%의 상보성을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 상보적인"은 목적하는 표적 mRNA에 결합 및 표적 mRNA의 RNA 침묵을 유발시키기에 충분한 서열(예컨대, 안티센스 가닥)을 갖는 siRNA를 의미한다.
본원에 사용된 "표적화"는 표적 핵산에 혼성화되어 목적하는 효과를 유도하는 핵산 서열의 설계 및 선별 과정을 의미한다.
용어 "유전자 발현"은 핵산이 성공적인 전사 및 대부분의 경우에서 번역되어 단백질 또는 펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 명확하게 하기 위하여, "유전자 발현"의 측정을 지칭하는 경우, 측정이 전사의 핵산 생성물, 예컨대 RNA 또는 mRNA 또는 번역의 아미노산 생성물, 예컨대 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. RNA, mRNA, 폴리펩티드 및 펩티드의 양 또는 수준의 측정 방법이 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "돌연변이"는 유전자의 구조를 임의로 변화시켜 후속 세대에 전달될 수 있는 변이체 형태("돌연변이체"로도 지칭됨)를 생성하는 것을 지칭한다. 유전자에서의 돌연변이는, DNA에서의 단일 염기의 교체 또는 유전자 또는 염색체의 보다 큰 부분의 결실, 삽입 또는 재배열에 의해 야기될 수 있다.
본원에 사용된 "벡터"는 이종 분자, 예컨대 본 발명의 siRNA 분자의 운반체로써 수송, 형질도입 또는 다른 방식으로 작용하는 임의의 분자 또는 모이어티이다 "바이러스 벡터"는 관심있는 분자, 예컨대 전이유전자, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩티드 또는 조절성 핵산 예컨대 작은 간섭 RNA(siRNA)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 암호화하거나 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 부위를 포함하는 벡터이다. 바이러스 벡터는 통상적으로 유전 물질을 세포 내로 전달하기 위해 사용된다. 바이러스 벡터는 종종 특정 적용을 위해 변형된다. 바이러스 벡터의 유형은 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-관련 바이러스 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "아데노-관련 바이러스" 또는 "AAV" 또는 "AAV 벡터"는 아데노-관련 벡터의 구성요소를 포함하거나 이로부터 유래하고 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포를 감염시키기에 적절한 임의의 벡터를 지칭한다. 용어 AAV 벡터는 전형적으로 siRNA 이중가닥을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 AAV 유형 바이러스 입자 또는 비리온을 나타낸다. AAV 벡터는 혈청형 조합(즉, "위형" AAV)을 비롯하여 다양한 혈청형 또는 다양한 게놈(예컨대, 단일 가닥의 또는 자기 상보적인)으로부터 유래될 수 있다. 추가로, AAV 벡터는 복제 결함 및/또는 표적화될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "유전자 발현 억제"는 유전자 발현 산물의 양의 감소를 야기하는 것을 의미한다. 발현 산물은 유전자로부터 전사된 RNA 분자(예컨대, mRNA) 또는 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 전형적으로, mRNA의 수준 감소는 이로부터 번역된 폴리펩티드의 수준 감소를 야기한다. 발현 수준은 mRNA 또는 단백질을 측정하기 위한 표준 기법을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "시험관내"는 사건이 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 미생물)내에서가 아니라, 인공적인 환경, 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양, 페트리 디쉬, 등에서 발생하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "생체내"는 사건이 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 미생물 또는 세포 또는 이의 조직)에서 발생하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "변형된"은 본 발명의 분자의 변화된 상태 또는 구조를 지칭한다. 분자는 화학적, 구조적 및 기능적을 포함하여 다양한 방법으로 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "합성의"는 사람의 손에 의해 생산, 준비 및/또는 제조되는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 본 발명의 다른 분자의 합성은 화학적 또는 효소적일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질감염"은 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 방법을 지칭한다. 형질도입 방법은 비제한적으로 화학적 방법, 물리적 처리 및 양이온 지질 또는 혼합물을 포함한다. 세포 내로 형질감염될 수 있는 제제의 목록은 크고, 비제한적으로 siRNA, 센스 및/또는 안티-센스 서열, 하나 이상의 유전자를 암호화하고 발현 플라스미드 내에 조직화된 DNA, 단백질, 단백질 단편 등을 포함한다.
본원에 사용된 "비표적"은 임의의 하나 이상의 표적, 유전자 및/또는 세포 전사물에 대한 임의의 의도하지 않은 효과를 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없고 합리적인 이득/위험 비율에 상응하는, 인간 또는 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 의미하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에 사용된 용어 제제의 "유효량"은 효과적인 이점의 또는 바람직한 결과, 예컨대 임상결과를 얻기에 충분한 양을 의미하고, 이러한 "유효량"은 이것이 적용되는 상황에 달려있다. 예컨대, ALS를 치료하기 위한 제제를 투여하는 상황에서, 제제의 유효량은, 예컨대 본원에 정의된 바와 같이, 제제의 투여 없이 수득된 반응에 비해 ALS의 치료를 달성하기에 충분한 양이다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량"은 감염, 질환, 장애 및/또는 상태에 취약하거나 이를 앓고 있는 대상에 투여되어, 감염, 질환, 장애 및/또는 상태의 발병의 치료, 증상의 개선, 진단, 예방 및/또는 지연에 충분한, 전달되는 제제(예컨대, 핵산, 약물, 치료제, 진단제, 예방제, 등)의 양을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "대상" 또는 "환자"는, 예컨대, 실험적, 진단적, 예방적 및/또는 치료적 목적으로 본 발명에 다른 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 대상은 동물(예컨대, 포유류 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간) 및/또는 식물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "예방하다" 또는 "예방"은 수 주, 수 개월 또는 수 년을 포함하는 일정 기간 동안 상태 또는 질환의 발병, 발달 또는 진행의 지연 또는 방지하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 질환의 치료 또는 개선을 위해 사용되는 하나 이상의 특정 절차의 적용을 지칭한다. 특정 구현예에서, 특정 절차는 하나 이상의 약제학적 제제의 투여이다. 본 발명의 맥락에서, 특정 절차는 SOD1 유전자를 치료하는 하나 이상의 siRNA 이중가닥 또는 암호화된 dsRNA의 투여이다.
본원에 사용된 용어 "개선" 또는 "개선하다"는 상태 또는 질환의 하나 이상의 징후의 중증도를 낮추는 것을 지칭한다. 예컨대, 신경퇴행성 장애의 맥락에서, 개선은 뉴런 손실의 감소를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "투여하다"는 대상에 약제학적 제제 또는 조성물을 제공하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "신경퇴행"은 신경 세포 사멸을 야기하는 병리학적 상태를 지칭한다. 다수의 신경 장애는 공통의 병리학적 상태로서 신경퇴행을 공유한다. 예컨대, 알츠하이머, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)은 모두 수 년에 걸쳐 느리고 진행적인 신경 세포 사멸을 특징으로 하는 만성 신경퇴행인 반면, 급성 신경퇴행은 허혈, 예컨대 뇌졸중, 외상, 컨대 외상성 뇌손상에 기인하거나, 예컨대 척수 손상 또는 경화증에 의해 야기되는 탈수초 또는 외상에 의한 축삭횡단에 의해 기인한 갑작스런 발병의 신경 세포 사멸을 특징으로 한다. 일부 신경 장애에서, 주로 하나의 유형의 신경 세포가 퇴행성이며, 예컨대 ALS에서의 운동 뉴런 퇴행이다.
균등물 및 범위
당업자는, 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 발명에 따른 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 사용하여 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.
청구범위에서, 단수형 명사는 문맥에 반하여 지시되지 않는 한, 하나 이상을 의미할 수 있다. 군의 하나 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구범위 또는 설명은, 문맥에 반하는 것으로 명시되어 있지 않는 한, 군 구성원의 하나 ,하나 이상 또는 모두가 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 다른 방식으로 관련이 있는 경우, 만족한 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 다른 방식으로 관련되어 있는 구현예를 포함한다. 본 발명은 하나 이상 또는 군의 전체 구성원이 주어진 생성물 또는 방법에 존재하거나, 사용되거나 다른 방식으로 관련되어 있는 구현예를 포함한다.
또한, 용어 "포함하는"은 개방되고 허용되는 것으로 의도되지만, 추가 요소 또는 단계의 포함을 요하지 않음을 유의해야 한다. 용어 "포함하는"이 사용된 경우, 용어 "로 이루어진"은 따라서 포함되고 개시된다.
범위가 주어진 경우, 끝점이 포함된다. 추가로, 당업자 중 한명의 맥락 및 이해로부터 달리 지시되거나 다른 방식으로 명백하지 않는 한, 범위로 표현된 값은 본 발명의 상이한 구현예에서 언급된 범위 이내의 임의의 특정 값 또는 하위범위를, 문맥이 다른 방식으로 명백하게 지시되지 않는 한, 범위의 하한 단위의 1/10으로 가정할 수 있음이 이해되어야 한다.
추가로, 선행기술에 속하는 본 발명의 임의의 특정 구현예가 임의의 하나 이상의 청구범위로부터 명백하게 배제될 수 있음이 이해되어야 한다. 이러한 구현예는 당업자에게 공지된 것으로 간주되므로, 본원에서 명백하게 배제가 명시되지 않아도 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물의 임읨의 특정 구현예(예컨대, 임의의 항생제, 체료제 또는 활성 성분; 임의의 생산 방법; 임의의 사용 방법 등)는 선행기술의 존재와 관계 없이, 어떤 이유로든 임의의 하나 이상의 주장으로부터 배제될 수 있다.
사용된 단어는 제한보다는 설명의 단어이고, 변경은 본 발명의 넓은 양태에서 본 발명의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 첨부된 청구범위 내에서 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명은 몇몇 설명된 구현예와 관련하여 일부 길이 및 일부 상세하게 설명되었지만, 임의의 이러한 특정 사항 또는 구현예 또는 임의의 특정한 구현예로 제한되어야 하는 것으로 의도된 것은 아니지만, 선행 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가장 광범위한 가능한 해석을 제공하고, 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1 SOD1 siRNA 설계 및 합성
SOD1 siRNA 설계
인간 SOD1 유전자를 표적화하는 siRNA를 확인하기 위해 siRNA를 설계하였다. 표 2에 기술되어 있듯, 인간에 대한 SOD1 전사물((유전자은행 접근 번호 NM_ 000454.4(서열번호 1)), 시노몰구스(NCBI 참조서열 모음(배포 63)(서열번호 2)로부터의 (유전자은행 접근 번호 XM_005548833.1)) 및 레수스(앙상블 프로젝트(배포 75)로부터의 SOD1 전사물 ENSMMUT00000002415(서열번호 3))를 사용하여 설계하였다.
[표 2]
Figure pct00002
인간 SOD1 전사물과 안티센스 가닥의 2 내지 18번 위치에서 100% 동일하고 비-인간 영장류 SOD1 전사물과 안티센스 가닥의 2 내지 18번 위치에서 부분적 또는 100% 동일하도록 siRNA 이중가닥을 설계하였다. 모든 siRNA 이중가닥에서, 안티센스 가닥의 1번 위치를 U로 조작하고, 센스 가닥의 19번 위치를 C로 조작하여 이러한 위치에 이중가닥을 짝짓지 않았다.
SOD1 siRNA 서열 선택
인간, 시노몰구스 및 레수스 SOD1 유전자의 안티센스 가닥의 예측되는 선택성, 및 miRBase20.0에서 인간 서열에 대한 안티센스 가닥의 2 내지 7번 위치에서 시드 서열의 매칭 결핍에 기초하여, 총 169개의 안티센스 및 169개의 센스의 인간 SOD1 유래 올리고뉴클레오티드를 합성하여 이중 가닥을 형성하였다(표 3). 이어서, siRNA 이중가닥을 시험관내에서 내인성 SOD1 유전자 발현(SOD1 mRNA 수준)에 대한 저해 활성에 대해 시험하였다.
[표 3]
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SOD1 siRNA 합성
포스포라미다이트 올리고머화 화학에 따라 올리고리보뉴클레오티드를 ABI 3900 합성기(Applied Biosystems)에서 조립하였다. 0.2 μmol의 합성 크기를 수득하기 위한 고상 지지체는 2'-디옥시-티미딘(Glen Research(미국 버지니아 스터링)로부터 구입)이 탑재된 폴리스티렌이었다. 보조 합성 시약인, DNA 및 RNA 포스포라미다이트를 SAFC Proligo(독일 함부르크)로부터 입수하였다. 특히, 우리딘(U)의 5'-O-(4,4'-다이메톡시트라이틸)-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이이소프로필) 포스포라미다이트 단량체, 티미딘(dT), 4-N-아세틸시티딘(CAc), 6-N-벤조일아데노신(Abz) 및 2'-O-t-부틸다이메틸실일을 가진 2-N-이소부티릴구아노신(GiBu)을 사용하여 올리고머 서열 을 만들었다. 모든 포스포라미다이트(아세토니트릴 중 70 mM)의 커플링 시간은 활성화제로서 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)(아세토니트릴 중 0.5 M)을 사용하여 3분이었다. 합성기에서 최종 다이메톡시트라이틸 기를 제거하여 서열을 합성하였다("DMT 제거(off)" 합성). 고상 합성이 완료되면, 올리고리보뉴클레오티드를 고상 지지체로부터 절단하고, 수성 메틸아민(40%) 및 에탄올중의 메틸아민(33%)의 1:1 (v/v) 혼합물을 사용하여 탈보호시켰다. 45°C에서 90분 후에, N,N-다이메틸 포름아마이드(DMF)로 용액을 희석하고 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드(TEA.HF)를 첨가하였다. 45°C에서 2시간 동안 배양시킨 후, 올리고리보뉴클레오티드를 1 M NaOAc, 및 아세톤 및 에탄올 4:1 (v/v)의 혼합물로 침전시켰다. 펠릿을 1 M 수성 NaCl 용액에 용해시키고, 크기 배제 크로마토그래피로 탈염시켰다. 이를 하이트랩(HiTrap) 5 mL 컬럼(GE 헬스케어)이 구비된 AKTA Purifier HPLC 시스템(GE 헬스케어, 독일 프라이부르크)을 사용하여 달성하였다. 올리고리보뉴클레오티드의 동일성을 MALDI 질량 분석법 또는 ESI 질량분석법으로 확인하였다. RNA 단일 가닥으로부터 siRNA를 생성하기 위해, 등몰량의 상보적인 센스 및 안티센스 가닥을 혼합하고, 20 mM NaCl, 4 mM 소듐 포스페이트 pH 6.8 완충액에서 혼합하고 어닐링시켰다. siRNA를 사용하기 전까지 냉동 보관하였다.
실시예 2 인간 SOD1 mRNA 억제에 대한 SOD1 siRNA 의 시험관내 스크리닝
SOD1 mRNA를 정량하기 위해 bDNA(분지형 DNA) 분석법을 사용하여 HeLa 세포에서 내인성 SOD1 발현의 억제에 대해 siRNA를 표적화하는 인간 SOD1(표 3에 기술되어 있음)을 분석하였다. IC50을 계산하기 위하여, 4가지 유형의 배양된 세포에서 용량 반응 실험에서, SOD1 dsRNA 이중가닥의 서브세트를 선별하기 위하여 2회 투여량 분석 결과를 사용하였다.
세포 배양 및 형질감염
HeLa 세포를 ATCC(LGC Standards와 합명회사인 ATCC, 독일 베젤)로부터 입수하고, 가습된 배양기에서 5% CO2를 가진 대기에서 37°C에서 10% 태아 소 혈청(GIBCO/Life Technologies의 초저 IgG) 및 1% Pen/Strep(Biochrom GmbH, 독일 베를린)을 함유하도록 보충된 HAM F-12 배지(Biochrom GmbH, 독일 베를린)에서 배양하였다.
siRNA로 형질감염시키기 위해, 96-웰 플레이트에 19,000 내지 20,000 세포/웰의 밀도로 HeLa 세포를 씨딩하였다. 제조사의 지시에 따라 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen/Life Technologies)을 사용하여 siRNA의 형질감염을 수행하였다. 2회-투여량 스크린에 대하여, 1 nM 또는 0.1 nM 농도의 SOD1 siRNA를 사용하였다. 10, 2.5, 0.6, 0.16, 0.039, 0.0098, 0.0024, 0.0006, 0.00015, 및 0.000038 nM의 SOD1 siRNA 농도로 용량 반응 실험을 수행하였다. 대조군 웰을 루시퍼라제 siRNA, Aha-1 siRNA, PLGF siRNA, 또는 관련없는 siRNA의 대조군 혼합물로 형질감염시켰다.
분지형 DNA 분석- 퀀티진( QuantiGene ) 2.0
siRNA와 함께 24시간 배양한 후, 배지를 제거하고 세포를 150μl의 용균 혼합물(1 부피의 용균 혼합물, 2 부피의 뉴클라아제가 없는 물)에서 용균시킨 다음 53°C에서 60분 동안 배양하였다. 이어서, 80μl의 작동 프로브 세트(Working Probe Set) SOD1(유전자 표적) 및 90μl의 작동 프로브 세트 GAPDH(내인성 대조군) 및 20μl 또는 10μl의 세포 용균물을 캡쳐 플레이트(Capture Plate)에 첨가하였다. 캡쳐 플레이트를 55°C(SOD1의 경우) 및 53°C(GAPDH의 경우)에서 배양하였다(약 16 내지 20시간). 다음날, 캡쳐 플레이트를 300μl 이상의 1X 세척 완충액(뉴클라아제가 없는 물, 완충액 구성요소 1 및 세척 완충액 구성요소 2)으로 3회 세척하였다(마지막 세척 후, 플레이트를 뒤집어 이를 깨끗한 종이 타월로 빨아들여 닦아냈다). 100μl의 예비-증폭기 작동 시약을 SOD1 캡쳐 플레이트에 첨가하고, 이를 알루미늄 포일로 밀봉하여 55°C에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 동안 배양한 후, 세척 단계를 반복한 다음 100μl의 증폭기 작동 시약을 SOD1 및 GAPDH 캡쳐 플레이트 둘 다에 첨가하였다. 55°C(SOD1) 또는 53°C(GAPDH)에서 1시간 동안 배양한 후, 세척 및 건조 단계를 반복하고, 100 μl의 표지 프로브를 첨가하였다. 캡쳐 플레이트를 50°C(SOD1) 또는 53°C(GAPDH)에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 1X 세척 완충액으로 세척하고, 건조시킨 다음 100 μl의 기질을 캡쳐 플레이트에 첨가하였다. 어두운 곳에서 30분 동안 배양한 후, 1420 발광 계수기(WALLAC VICTOR Light, Perkin Elmer, 독일 로트가우- 유게스하임)를 사용하여 발광을 읽었다.
bDNA 데이터 분석
각각의 SOD1 siRNA 또는 대조군 siRNA에 대해, 4개의 웰을 평행하게 형질감염시키고 평행하게, 개별적인 데이터포인트를 각 웰로부터 수집하였다. 각각의 웰에 대하여, SOD1 mRNA 수준을 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 주어진 SOD1 siRNA 활성을, 대조군 웰을 통해 평균화된 SOD1 mRNA 농도(GAPDH mRNA에 대해 정규화됨)에 대해 상대적인, 치료된 세포에서의 SOD1 mRNA 농도(GAPDH mRNA에 대해 정규화됨)의 퍼센트로 표현하였다.
표 4는, 표 3에 주어진 서열인 SOD1 siRNA를 1 nM 또는 0.1 nM에서 시험한 시험관내 HeLa 스크린의 결과를 제공한다. 각 SOD1 siRNA에 대하여, 대조군에 비해 치료된 세포에 남아있는 SOD1 mRNA의 평균 백분율(GAPDH mRNA에 대해 정규화됨), 및 표준 편차가 표 4에 제시되어 있다. 1 nM에서의 SOD1 siRNA의 수는 HeLa 세포에서 SOD1 mRNA 수준을 80% 초과까지 감소시키는데 효과적이었다. 또한, 0.1 nM에서의 SOD1 siRNA의 수는 HeLa 세포에서 SOD1 mRNA 수준을 80% 초과까지 감소시키는데 효과적이었다.
[표 4]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
HeLa 세포에서 0.1 nM에서 가장 활성인 SOD1 siRNA 12개를 용량-반응 실험으로 평가하였다. 표 5는 HeLa 세포에서 이들 12개의 선별된 SOD1 siRNA에 대해 대조군에 비해 50% SOD1 mRNA 억제를 야기하는 IC50 농도를 제공한다. 이들 12개의 SOD1 siRNA는 실험 패러다임에서 특히 강력했으며, 1 내지 8 pM에서 IC50 값을 나타냈다.
[표 5]
Figure pct00015
이들 12개의 SOD1 siRNA에 대한 IC50을 확인하기 위해 사용된 HeLa 세포로부터의 용량 반응 데이터를 아래 표 6에 상세히 나타냈다. 모든 12개의 siRNA는 pM IC50을 갖는 것으로 결정되었다. 표 5에서 SOD1 siRNA에 대한 IC50 데이터는 아래 표 6에 제시된 데이터의 요약이다.
[표 6]
Figure pct00016
실시예 3. SH - SY5Y 세포, U87 세포 및 1차 인간 성상세포에서 내인성 SOD1 mRNA 발현에 대해 선별된 SOD1 siRNA의 시험관내 스크린
SH-SY5Y 세포를 ATCC (LGC Standards와 합명회사인 ATCC, 독일 베젤)로부터 입수하고, 가습된 배양기에서 5% CO2를 가진 대기에서 37°C에서 15% FCS(GIBCO/Life Technologies의 초저 IgG), 1% L-글루타민(Biochrom GmbH, 독일 베를린) 및 1% Pen/Strep(Biochrom GmbH, 독일 베를린)을 함유하도록 보충된 Dulbecco MEM(Biochrom GmbH, 독일 베를린)에서 배양하였다.
U87MG 세포를 ATCC(LGC Standards와 합명회사인 ATCC, 독일 베젤)로부터 입수하고, 가습된 배양기에서 5% CO2를 가진 대기에서 37°C에서 10% FCS(GIBCO/Life Technologies의 초저 IgG) 및 1% Pen/Strep(Biochrom GmbH, 독일 베를린)을 함유하도록 보충된 ATCC-제형화된 이글(Eagle) 최소 필수 배지(LGC Standards와 합명회사인 ATCC, 독일 베젤)에서 배양하였다.
1차 인간 성상세포를 LONZA(Lonza Sales Ltd, 스위스 바젤)로부터 입수하고, 가습된 배양기에서 5% CO2를 가진 대기에서 37°C에서 AGM 싱글쿼트(SingleQuot) 키트(Lonza Sales Ltd, 스위스 바젤)로 보충된 ABM 기본 배지(Lonza Sales Ltd, 스위스 바젤)에서 배양하였다.
SH-SY5Y 세포에 대한 형질감염 시약이 리포펙타민2000(Invitrogen/Life Technologies)이고, U87 세포의 경우 RNAiMAX(Invitrogen/Life Technologies), 1차 인간 성상세포의 경우 리포펙타민2000(Invitrogen/Life Technologies)라는 것을 제외하고, HeLa세포에 대해 기술된 방식과 유사한 방식으로 SH-SY5Y 세포, U87MG 세포 및 1차 인간 성상세포를 12개의 선별된 siRNA(D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858)로 형질감염시키고, SOD1 및 GAPDH mRNA의 수준을 bDNA로 정량화하였다.
이들 12개의 SOD1 siRNA(D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823, D-2858)에 대한 IC50을 확인하기 위해 SH-SY5Y 세포, U87MG 세포 및 1차 인간 성상세포로부터의 용량 반응 데이터를 사용하였고, 아래의 표 7, 8 및 9에 각각 상세하게 나타내었다. 모든 12개의 siRNA가 U87 세포에서 pM IC50을 갖는 것으로 결정되었다.
IC50 값이 표 10에 제공된다. 일반적으로 1차 인간 성상세포에서, IC50은 SH-SY5Y 및 U87MG 세포에서보다 더 높았다.
[표 7]
Figure pct00017
[표 8]
Figure pct00018
[표 9]
Figure pct00019
표 10에서 SOD1 siRNA에 대한 IC50 데이터는 아래 표 7, 8 및 9에 제시된 데이터의 요약이다.
[표 10]
Figure pct00020
실시예 4. SOD1 을 표적화하는 siRNA
효과가 있는 것으로 밝혀진 SOD1 siRNA의 패신저-가이드 가닥 이중가닥을 발현 벡터로 조작하고 중추신경계 세포 또는 신경세포의 세포주에 형질감염시켰다. siRNA 넉다운 연구에서 사용된 오버행이 siRNA에 대한 표준 dTdT이지만, 작제물내의 오버행은 임의의 다이뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
사용된 세포는 1차 세포이거나 유도만능줄기세포(iPS 세포)로부터 유래될 수 있다.
이어서, SOD1 넉다운을 측정하고, 심도 시퀀싱을 수행하여 발현 벡터에 투여된 각 작제물에서 처리된 정확한 패신저 및 가이드 가닥을 결정하였다.
가이드 대 패신저 가닥의 비를 계산하여 예컨대, RNA 유도된 침묵 복합체(RISC) 처리의 넉다운 효율을 결정하였다.
N-말단을 시퀀싱하여 절단 부위를 결정하고 표적의 퍼센트 균일(homogeneous) 절단을 결정하였다. 절단은 90%보다 높을 것으로 예측된다.
SOD1의 시험관내 넉다운을 분석하기 위해 병행 시험에서 HeLa 세포를 동시-형질감염시켰다. 루시퍼라제 작제물을 대조군으로써 사용하여 비표적 효과를 결정하였다.
심도 시퀀싱을 다시 수행하였다.
실시예 5. SOD1 을 표적화하는 패신저 및 가이드 서열
본 발명에 따라, SOD1 siRNA를 설계하였다. 이들이 표 11A 및 11B에 주어져 있다. 패신저 및 가이드 가닥을 이러한 표에 기술하였다. 표 11A 및 11B에서, 서열 명칭의 "miR" 구성요소는 miRNA 유전자의 서열 번호와 반드시 일치하지 않는다(예컨대, VOYmiR-101은 서열 명칭이며, 반드시 miR-101이 서열의 일부임을 의미하는 것은 아니다).
[표 11A]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
[표 11B]
Figure pct00027
실시예 6 AAV - miRNA 벡터에서 SOD1 siRNA 작제물
표 11에 나열된 SOD1 siRNA의 패신저-가이드 가닥 이중가닥을 AAV-miRNA 발현 벡터 내로 조작하였다. 5'에서 3'로 기술된 ITR에서 ITR까지로의 작제물은 돌연변이 ITR, 프로모터(CMV, U6 또는 CB6 프로모터(CMVie 인핸서, CBA 프로모터 및 SV40 인트론을 포함함), 표 11의 패신저 및 가이드 가닥(패신저와 가이드 가닥 사이에 루프, 패신저 가닥 앞에 5' 측부 영역 및 가이드 가닥 뒤에 3' 측부 영역을 가짐), 토끼 글로빈 폴리A 및 야생형 ITR을 포함한다. AAV - miRNA 발현 벡터의 효율을 시험하기 위해 시험관내 및 생체내 연구를 수행하였다.
실시예 7. HeLa 세포에서의 작제물의 활성
실시예 6에 기술된 7개의 SOD1 siRNA 작제물(VOYmiR-103, VOYmiR-105, VOYmiR-108, VOYmiR-114, VOYmiR-119, VOYmiR-120, 및 VOYmiR-127) 및 이중 가닥의 mCherry 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켜 작제물의 활성을 시험하였다.
A. 패신저 및 가이드 가닥의 활성
7개의 SOD1 siRNA 작제물 및 이중 가닥의 mCherry 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 모든 7개의 SOD1 siRNA 작제물이 가이드 가닥의 75 내지 80% 넉다운의 높은 활성, 및 패신저 가닥의 낮은 활성 또는 활성이 없음을 나타냈다. SOD1 siRNA 후보 벡터의 가이드 가닥은 SOD1의 75 내지 80% 수율의 높은 활성을 보인 반면, 패신저 가닥은 낮거나 거의 없는 활성을 보였다.
SOD1에서 작제물의 활성
7개의 SOD1 siRNA 작제물 및 이중 가닥의 mCherry(dsCherry) 대조군을 1e4 vg/세포, 1e3 vg/세포, 또는 1e2 vg/세포의 MOI로 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 72시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 모든 7개의 SOD1 siRNA 작제물이 1e3 vg/세포로 효율적인 넉다운을 보였다. 대부분의 SOD1 siRNA 작제물이 도 1에 나타난 바와 같이 높은 활성(75 내지 80% 넉다운)을 보였다.
실시예 8. HEK 세포에서의 작제물의 활성
실시예 6에 기술된 30개의 SOD1 siRNA 작제물(VOYmiR-102.860, VOYmiR-102.861, VOYmiR-102.866, VOYmiR-102.870, VOYmiR-102.823, VOYmiR-104.860, VOYmiR-104.861, VOYmiR-104.866, VOYmiR-104.870, VOYmiR-104.823, VOYmiR-109.860, VOYmiR-109.861, VOYmiR-109.866, VOYmiR-109.870, VOYmiR-109.823, VOYmiR-114.860, VOYmiR-114.861, VOYmiR-114.866, VOYmiR-114.870, VOYmiR-114.823, VOYmiR-116.860, VOYmiR-116.861, VOYmiR-116.866, VOYmiR-116.870, VOYmiR-116.823, VOYmiR-127.860, VOYmiR-127.861, VOYmiR-127.866, VOYmiR-127.870, VOYmiR-127.823) 및 VOYmiR-114 및 이중 가닥의 mCherry 대조군을 세포에 형질감염시켜 작제물의 활성을 시험하였다.
A. HEK293에서의 패신저 및 가이드 가닥의 활성
30개의 작제물 및 2개의 대조군을 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 24시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 대부분의 작제물이 가이드 가닥의 높은 활성(도 2) 및 패신저 가닥의 낮거나 없는 활성(도 3)을 보였다.
B. HeLa에서의 패신저 및 가이드 가닥의 활성
30개의 작제물 및 2개의 대조군을 HeLa 세포에 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 대부분의 작제물이 가이드 가닥의 높은 활성(도4) 및 패신저 가닥의 낮거나 없는 활성(도 5)을 보였다.
C. HeLa 및 HEK293 의 연관성
30개의 작제물의 넉다운은 HeLa 및 HEK293 세포에서 유사하였다. 30개의 작제물은 작제물의 가이드 가닥에 대한 넉다운을 나타냈다(도 2 및 도 4 참조). 작제물의 대부분의 가이드 가닥은 70 내지 90%의 넉다운을 나타냈다.
D. 캡시드 선별
HeLa 및 HEK293의 최상의 작제물은 AAV 내에 포장되어 HeLa 감염을 일으킬 것이다. 작제물을 포장하기 위한 최상의 AAV를 결정하기 위해, AAV2 또는 AAV-DJ8에 포장된 mCherry를 HeLa 세포에 10 vg/세포, 1e2 vg/세포, 1e3 vg/세포, 1e4 vg/세포 또는 1e5 vg/세포의 MOI로 감염시키고, 40시간에 발현을 평가하였다. AAV2를 최상의 작제물을 포장하기 위한 캡시드로서 선별하였다.
E. AAV2 생산
HeLa 및 HEK293의 최상의 작제물을 AAV2(1.6 kb)에 포장하고 이중 가닥의 mCherry(dsmCherry) 대조군을 또한 포장하였다. 분석에 앞서, 포장된 작제물을 이오딕사놀(Idoixanol) 정제를 수행하였다. AAV 역가가 표 12에 나타나있다.
[표 12]
Figure pct00028
HeLa 세포에서의 SOD1 넉다운에 대한 형질도입 효과가 도 6에 제시되어 있다. 또한, HeLa 세포에서, 보다 큰 MOI(1.0E+05에 비해 1.0E+04)는 모든 구조물에 대해 증가된 넉다운을 나타내지 않았다.
F. 인간 운동 뉴런 전구체( HMNP )에서의 작제물의 활성
실시예 8E에 기술된 바와 같은 상위 18개의 pri-miRNA 작제물 및 mCherry 대조군을 인간 운동 뉴런 전구체(HMNP) 세포에 10E5의 MOI로 감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하였다. 약 절반의 작제물이 HMNP에서 50% 초과의 SOD1 침묵을 제공하였고, 이들 중 4개는 70% 초과의 침묵을 제공하였다(도 7).
G. 생체내 연구를 위한 작제물 선별
표적 서열에 큰 효과를 미치고 카세트에 미미한 영향을 미치는 상위 12개의 작제물을 선별하였다. AAV-rh10 캡시드에 포장된 이러한 작제물을 주입을 위해 제형화하고 포유류에 투여하여 작제물의 생체내 효과를 연구하였다.
실시예 9. 작제물의 시험관내 연구
AAV2에 포장된 실시예 8D에 기술된 바와 같은 18개의 작제물 및 mCherry 대조군을 본 연구에 사용하였다. 본 연구를 위해, 배양 배지(500 ml의 DMEM/F-12 GLUTAMAXTM 보충물(Life Technologies, Cat#.10565-018), 50 ml FBS (Life Technologies, Cat#.16000-044, lot:1347556), 5 ml MEM 비필수 아미노산 용액 (100x) (Cat.# 11140-050) 및 5 ml HEPES (1M)(Life Technologies, Cat#.15630-080))중의 HEK293T 세포(Fisher Scientific, Cat.# HCL4517), 배양 배지(500 ml의 DMEM/F-12 GLUTAMAXTM 보충물(Life Technologies, Cat#.15630-080))중의 U251MG 세포 (P18)(Sigma, Cat#.09063001-1VL) 또는 배양 배지(AGM 싱글쿼트 키트 보충 & 성장 인자(Lonza, Cat#. CC-4123)로 보충된 ABM 기초 배지 500 ml(Lonza, Cat#. CC-3186))중의 정상 인간 성상세포(HA) (Lonza, Cat#CC-2565)를 사용하여 작제물을 시험하였다. HEK293T 세포(96 웰 플레이트 중 5x10E4 세포/웰), U251MG 세포(96 웰 플레이트 중 2x10E4 세포/웰) 및 HA 세포(96 웰 플레이트 중 2x10E4 세포/웰)를 씨딩하고 1.0E+05의 MOI를 사용하여 세포를 감염시켰다. 48시간 후에, 세포를 분석하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.
[표 13]
Figure pct00029
대부분의 작제물에 대해 HEK293T 세포에서 80% 초과의 넉다운이 관찰되었다. 절반 초과의 작제물이 U251MG 세포 및 HA 세포에서 80% 초과의 넉다운을 보였다.
실시예 10. 용량 의존적인 SOD1 강하(lowering)
실시예 8E에 기술된 바와 같은 상위 18개의 pri-miRNA 작제물 중 4개 및 mCherry 대조군을 인간 성상 세포주(U251MG) 또는 1차 인간 성상세포(HA)에 1.0E+02, 1.0E+03, 1.0E+04, 1.0E+05 또는 1.0E+06의 MOI로 형질감염시켰다. 48시간 후에 내인성 mRNA 발현을 평가하고 용량-의존적인 사일런싱을 도 8(U251MG) 및 도 9(HA)에 나타냈다. 모든 작제물에서, 투여량의 증가는 또한 넉다운된 SOD1 mRNA의 양의 증가와 관련이 있었다.
실시예 11. SOD1 넉다운의 시간 경과
2개의 pri-miRNA 작제물(VOYmiR-120 및 VOYmiR-122), SOD1 siRNA의 음성 대조군 및 양성 대조군을 인간 성상세포주(U251MG)에 형질감염시켰다. 도 10에 나타난 바와 같이, 상대적인 SOD1 mRNA를 60시간 동안 도출하였다. hSOD1의 70 내지 75% 넉다운이 뉴클레오펙터(Nucleofector) 형질감염 후에 2개의 pri-miRNA 작제물에서 나타났으며, 12 내지 24시간 창에서 가장 큰 넉다운이 관찰되었다.
실시예 12. SOD1 넉다운 및 표준 퍼센트
VOYmiR-104를 50pM, 100 pM 및 150 pM의 농도로 HeLa 세포에 형질감염시키고, 비치료된(UT) 세포와 비교하였다. 도 11A 내지 도 11C에 나타난 바와 같이, 상대적인 SOD1 mRNA, 가이드 가닥의 퍼센트 및 패신저 가닥의 퍼센트를 36, 72, 108 및 144 시간에 도출하였다. 가장 높은 농도(150pM)는 가장 큰 발현의 감소를 나타냈지만, 모든 3개의 투여량은 SOD1 발현에서 유의한 감소를 나타냈다.
실시예 13. SOD1 을 표적화하는 작제물
개 SOD1에 대해 작제물을 설계하였고 이러한 작제물을 표 14에 나타냈다. 개 SOD1은 본 발명에서 표적화된 영역에서 인간과 100% 보존되어 있다. 패신저 및 가이드 서열이 표에 기술되어 있다. 표 14에서, 서열 명칭의 "miR" 구성요소는 miRNA 유전자의 서열 번호와 반드시 일치하지 않는다(예컨대, dVOYmiR-102는 서열 명칭이며, 반드시 miR-102이 서열의 일부임을 의미하는 것은 아니다)
[표 14]
Figure pct00030
실시예 14. 조절성 폴리뉴클레오티드의 위치 효과
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114 또는 VOYmiR-126)를 발현벡터(게놈 크기 2400 뉴클레오티드; scAAV)의 6개의 상이한 위치에 삽입하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 역가를 타크만(TaqMan) PCR을 사용하여 6번 위치 및 대조군(조절성 폴리뉴클레오티드가 없는 작제물; scAAV)에 대해 평가하였고 이의 결과를 표 15에 나타냈다.
[표 15]
Figure pct00031
B. 게놈 완전성 (integrity)에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 2400 뉴클레오티드; scAAV)의 6개의 상이한 위치에 삽입하였고, 조절성 폴리뉴클레오티드(scAAV)가 없는 대조군이다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 게놈을 정제된 AAV 제제물로부터 추출하고 중성의 아가로스 겔에서 수행(running)시켰다 절단된(truncated) 게놈이 모든 작제물에서 관찰되었고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)가 표 16에 나타나 있다.
[표 16]
Figure pct00032
6번 위치에 절단된 게놈의 수가 가장 많았고, 4번 및 5번 위치에서 절단된 게놈의 양이 가장 적었다.
C. 넉다운 효율에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(AAV2)(게놈 크기 2400 뉴클레오티드; scAAV)의 6개의 상이한 위치에 삽입하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. HeLa 세포의 형질도입을 1 x 104 vg/세포l, 1 x 103 vg/세포 및 1 x 102 vg/세포로 수행하였다. SOD1 mRNA 발현(대조군(eGFP)의 % 로서)을 감염 72 시간 후에 결정하였고 그 결과를 표 17에 나타내었다.
[표 17]
Figure pct00033
3번 위치에서 가장 큰 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 가졌고 4번 위치에서 가장 낮은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 가졌다.
실시예 15 게놈 크기의 영향
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 2 kb; scAAV)의 1번, 2번, 5번 및 6번 위치에 삽입하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. siRNA 분자가 없는 이중 가닥의 대조군(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군) 및 이중 가닥의 발현 벡터(scAAV miR114; ITR(105 뉴클레오티드) - 프로모터(약 900 뉴클레오티드)- siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드(158 뉴클레오티드)- 폴리A 서열(127 뉴클레오티드) 및 ITR) 뿐만 아니라 siRNA 분자가 없는 대조군을(eGFP; scAAV)을 비교하였다. 바이러스 역가를 타크만 PCR을 사용하여 평가하였고 이의 결과를 표 18에 나타냈다.
[표 18]
Figure pct00034
작제물의 5번 위치에서 가장 낮은 역가가 관찰되었고, 작제물의 2번 위치에서 가장 큰 역가가 관찰되었다.
B. 게놈 완전성 (integrity)에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 2 kb; scAAV)의 1번, 2번, 5번 및 6번 위치에 삽입하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. siRNA 분자가 없는 이중 가닥의 대조군(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군) 및 이중 가닥의 발현 벡터(scAAV miR114; ITR (105 뉴클레오티드) - 프로모터(약 900 뉴클레오티드)- siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드(158 뉴클레오티드)- 폴리A 서열(127 뉴클레오티드) 및 ITR) 뿐만 아니라 siRNA 분자가 없는 대조군(eGFP; scAAV)을 비교하였다. 절단된 게놈이 모든 작제물에서 관찰되었고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)가 표 19에 나타나 있다.
[표 19]
Figure pct00035
모든 작제물은 몇몇 절단된 게놈을 갖는 것으로 확인되었다.
상이한 siRNA 분자의 효과를 결정하기 위해 추가 연구를 수행하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, VOYmiR-114 및 VOYmiR-126 를 분리된 발현 벡터(게놈 크기 1.6 kb; scAAV)의 3번 위치에 삽입하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. VOYmiR-114 작제물의 경우, 벡터 게놈의 5' 말단(1526 뉴클레오티드)과 조절성 폴리뉴클레오티드의 중심(신축성 루프 (flexible loop)의 중심) 사이의 거리는 1115 뉴클레오티드이다. VOYmiR-126 작제물의 경우, 벡터 게놈의 5' 말단(1626 뉴클레오티드)과 조절성 폴리뉴클레오티드의 중심(신축성 루프의 중심) 사이의 거리는 1164 뉴클레오티드이다.
VOYmiR-114 작제물의 경우, 바이러스 역가(15-cm 디쉬 당 VG)는 약 1.1E+11 이었다. VOYmiR-126 작제물의 경우, 인트론 프로브 바이러스 역가(15-cm 디쉬 당 VG)는 약 1.2E+12 이었다. 대조군은 약 2.1E+11(15-cm 디쉬 당 VG) 이었다. VOYmir-114는 약 20%의 절단된 게놈을 갖고, VOYmiR-126는 약 15%의 절단된 게놈을 갖고,대조군은 약 5%의 절단된 게놈을 갖는다.
실시예 16. 단일 가닥의 작제물의 영향
A. 바이러스 역가에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 폴리뉴클레오티드(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 4.7 kb; scAAV)의 1번, 3번 및 5번 위치에 삽입하고, 대조군 또한 siRNA 폴리뉴클레오티드(게놈 크기 2 kb; scAAV) 없이 시험하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 역가를 타크만 PCR을 사용하여 평가하였고 이의 결과를 표 20에 나타냈다.
[표 20]
Figure pct00036
3번 위치에서 가장 큰 바이러스 역가가 관찰되었고, 1번 위치 및 이어서 5번 위치가 뒤를 이었다.
B. 게놈 완전성 (integrity)에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 4.7 kb; scAAV)의 1번, 3번 및 5번 위치에 삽입하고, 대조군 또한 조절성 폴리뉴클레오티드(게놈 크기 2 kb; scAAV) 없이 시험하였다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. 바이러스 게놈을 정제된 AAV 제제물로부터 추출하고 중성의 아가로스 겔에서 수행(running)시켰다 절단된 게놈이 모든 작제물에서 관찰되었고, 절단된 게놈의 대략적인 퍼센트(전체 중 퍼센트)가 표 21에 나타나 있다.
[표 21]
Figure pct00037
5번 위치에서 가장 큰 수의 절단된 게놈을 가졌고, 3번 위치에서 가장 적은 양의 절단된 게놈을 가졌다.
C. 넉다운 효율에 대한 효과
도 12에 나타난 바와 같이, siRNA 분자(VOYmiR-114)를 발현벡터(게놈 크기 4.7 kb; scAAV)의 1번, 3번 및 5번 위치에 삽입하고, 대조군 또한 조절성 폴리뉴클레오티드(게놈 크기 2 kb; scAAV) 없이 시험하였다. siRNA 분자(게놈 크기 2 kb; ssAAV 대조군)가 없는 단일 가닥의 대조군, siRNA 분자(게놈 크기 1.6 kb; scAAV 대조군)가 없는 이중 가닥의 대조군 및 siRNA 분자를 가진 이중 가닥의 발현 벡터(게놈 크기 2.4 kb; scAAV miR114)가 있다. 도 12에서, "ITR"은 역위 말단 반복이고, "I"는 인트론을 나타내고, "P"는 폴리A이고 "MP"는 siRNA 분자를 포함하는 조절성 폴리뉴클레오티드이다. HeLa 세포의 형질도입을 1 x 104 vg/세포l, 1 x 103 vg/세포 및 1 x 102 vg/세포로 수행하였다. SOD1 mRNA 발현(대조군(eGFP)의 % 로서)을 감염 72 시간 후에 결정하였고 그 결과를 표 22에 나타내었다.
[표 22]
Figure pct00038
3번 위치에서 가장 높은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 % 로서)을 보였고, 이어서 1번 위치였고, 가장 낮은 SOD1 mRNA 발현(대조군의 %로서)을 갖는 단일 가닥의 작제물은 5번 위치였다. 단일 가닥의 작제물 중 그 어떤 것도 siRNA 폴리뉴클레오티드를 가진 이중 가닥의 대조군 만큼의 낮은 넉다운 효율을 갖지 않았다.
실시예 17. 생체내 SOD1 넉다운
생체내에서 pri-miRNA의 생물학적 활성을 평가하기 위해서, 자기-상보적인 pri-miRNA(VOYmiR-114.806, VOYmiR127.806, VOYmiR102.860, VOYmiR109.860, VOYmiR114.860, VOYmiR116.860, VOYmiR127.860, VOYmiR102.861, VOYmiR104.861, VOYmiR109.861, VOYmiR114.861, VOYmiR109.866, VOYmiR116.866, 또는 VOYmiR127.866)를 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장하였다.
마우스에, 이와 같이 포장된 pri-miRNA 또는 대조군 비히클만(5% 솔비톨 및 0.001% F-68이 있는 인산염-완충된 식염수)을 10분의 선조체내 주입으로 투여하였다. 인간 SOD1를 발현하는 약 20 내지 30 g의 체중의 암컷 또는 수컷의 Tg(SOD1)3Cje/J 마우스(Jackson Laboratory,메인 바하버)에 선조체를 표적화하는 시험 물질 5 uL를 단방향으로 주사하였다(정수리점(bregma)에 대해 전후측 +0.5 mm, 중외측 + 2 mm; 두개골 표면에 대해 배복방향 3.8 mm). 33 게이지 바늘이 구비된 사전-충진 펌프-조 해밀턴 미세-주사기(1701 모델, 10 μl)을 사용하여 시험 물질을 0.5 uL/분으로 주사하였다(시험 물질 당 5 마리). 주사 후 1, 2, 3, 4 또는 6주에, 동물을 희생시키고 뇌를 제거하여 1 mm 두정 판(coronal slab) 및 인접한 1 mm 선조체의 주입 부위를 포함하는 동측 선조를 해부하여 이를 냉동시켰다. 마우스 조직 샘플을 용균시키고, 인간 SOD1 단백질 수준, SOD1 및 마우스 GAPDH(mGAPDH) mRNA 수준을 정량하였다. SOD1 단백질 수준을 ELISA(eBioscience Affymetrix, 캐나다 샌디에고)로 정량하고, 총 단백질 수준을 BCA 분석법(ThermoFisher Scientific, 마이애미 월섬)으로 정량하였다. 각 조직 샘플에 대하여, 총 단백질에 대해 정규화된 SOD1 단백질의 수준을 평균 2회 측정으로 계산하였다. 이와 같이 정규화된 SOD1 단백질 수준을 추가로 비히클 군에 대해 정규화하고, 평균화하여 군(치료) 평균을 수득하였다. SOD1 및 mGAPDH mRNA 수준을 qRT-PCR로 정량하였다. 각 조직 샘플에 대하여 SOD1/mGAPDH(정규화된 SOD1 mRNA 수준) 비를 평균 3회 측정으로 계산하였다. 이와 같은 비를 평균화하여 군(치료) 평균을 수득하였다. 이들 군 평균을 추가로 비히클 군에 대해 정규화하였다.
시험 물질(1 x 1013 - 3 x 1013vg의 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ에 포장된 pri-miRNA) 또는 비히클을 척수강내 요추 볼루수로 비인간 영장류에 투여하였다. 약 2.5 내지 8.5 kg 체중의 암컷 시노몰구스 원숭이(필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), CR Research Model Houston, 텍사스 휴스턴)에 요추에 위치한 카테터 팁이 구비된 단일 척수강내 카테터를 이식시켰다. 약 60분 간격으로 3회의 1 mL 볼루스 주사(1 mL/분)를 포함하는 시험 물질을 투여하였다(시험 물질 당 4 마리). 투여 후 4 내지 6주에 동물을 희생시키고, 생체분석 및 조직학적 평가를 위해 선별된 조직을 회수하였다. 비히클 군에 대해 상대적인 SOD1 단백질 및 mRNA 수준을 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장된 pri-miRNA로 치료한 후 억제에 대해 평가하였다.
실시예 18. VOYmiR -114.806을 사용한 생체내 SOD1 넉다운
Tg(SOD1)3Cje/J 마우스에서, VOYmiR-114.806을 실시예 17에 기술된 바와 같은 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장하였다. 3.7 x 109 vg의 투여량을 단방향 선조체내 투여를 통해 마우스에 투여하였다. 1주 또는 2주 후에, 정규화된 SOD1 단백질 수준에서 유의한 감소는 없었다; 정규화된 SOD1 단백질 수준은 1주 및 2주 후에 각각 비히클 대조군의 98±11%(표준편차) 및 98±10%였다. 3주까지, VOYmiR-114.806은 정규화된 SOD1 단백질 수준을 비히클 대조군의 84±9.0%로 감소시켰고, 이는 통계적으로 유의한 것이었다(p<0.05, 듀멧(Dunnett)의 사후 분석을 이용한 일원 분산분석). 4주 및 6주까지, VOYmiR-114.806은 정규화된 SOD1 단백질 수준을 비히클 대조군의 각각 73±7.9%(p < 0.0001) 및 75±7.4%(p<0.0001)로 감소시켰다. 이러한 결과는 CBA 프로모터가 있는 AAV-DJ 내에 포장된 VOYmiR-114.806이 생체내에서 SOD1 단백질 수준을 하향조절 하는데 효과적임을 보여준다. 추가로, 이러한 결과는, CBA 프로모터가 있는 AAVDJ 내에 포장된 VOYmiR-114.806의 3.7 x 109 vg 만큼 낮은 총 선조체내 투여량이 SOD1 단백질 수준을 유의하게 하향 조절함을 보여준다.
본 발명은 몇몇 설명된 구현예와 관련하여 일부 길이 및 일부 상세하게 설명되었지만, 임의의 이러한 특정 사항 또는 구현예 또는 임의의 특정한 구현예로 제한되어야 하는 것으로 의도된 것은 아니지만, 선행 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가장 광범위한 가능한 해석을 제공하고, 따라서 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서에 따른다. 추가로, 섹션 말머리, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> VOYAGER THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS) <130> 2057.1011PCT <150> US 62/079,588 <151> 2014-11-14 <150> US 62/211,992 <151> 2015-08-31 <150> US 62/234,466 <151> 2015-09-29 <160> 396 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gtttggggcc agagtgggcg aggcgcggag gtctggccta taaagtagtc gcggagacgg 60 ggtgctggtt tgcgtcgtag tctcctgcag cgtctggggt ttccgttgca gtcctcggaa 120 ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg tgctgaaggg 180 cgacggccca gtgcagggca tcatcaattt cgagcagaag gaaagtaatg gaccagtgaa 240 ggtgtgggga agcattaaag gactgactga aggcctgcat ggattccatg ttcatgagtt 300 tggagataat acagcaggct gtaccagtgc aggtcctcac tttaatcctc tatccagaaa 360 acacggtggg ccaaaggatg aagagaggca tgttggagac ttgggcaatg tgactgctga 420 caaagatggt gtggccgatg tgtctattga agattctgtg atctcactct caggagacca 480 ttgcatcatt ggccgcacac tggtggtcca tgaaaaagca gatgacttgg gcaaaggtgg 540 aaatgaagaa agtacaaaga caggaaacgc tggaagtcgt ttggcttgtg gtgtaattgg 600 gatcgcccaa taaacattcc cttggatgta gtctgaggcc ccttaactca tctgttatcc 660 tgctagctgt agaaatgtat cctgataaac attaaacact gtaatcttaa aagtgtaatt 720 gtgtgacttt ttcagagttg ctttaaagta cctgtagtga gaaactgatt tatgatcact 780 tggaagattt gtatagtttt ataaaactca gttaaaatgt ctgtttcaat gacctgtatt 840 ttgccagact taaatcacag atgggtatta aacttgtcag aatttctttg tcattcaagc 900 ctgtgaataa aaaccctgta tggcacttat tatgaggcta ttaaaagaat ccaaattcaa 960 actaaaaaaa aaaaaaaaaa a 981 <210> 2 <211> 465 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 2 atggcgatga aggccgtgtg cgtgttgaag ggcgacagcc cagtgcaggg caccatcaat 60 ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattac aggattgact 120 gaaggcctgc atggattcca tgttcatcag tttggagata atacacaagg ctgtaccagt 180 gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga caacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240 catgttggag acctgggcaa tgtgactgct ggcaaagatg gtgtggccaa ggtgtctttc 300 gaagattctg tgatctcgct ctcaggagac cattccatca ttggccgcac attggtggtc 360 catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtaaaaa gacaggaaac 420 gctggaggtc gtctggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aataa 465 <210> 3 <211> 464 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 3 atggcgatga aggccgtgtg cgtgttgaag ggcgacagcc cagtgcaggg caccatcaat 60 ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattac aggattgact 120 gaaggcctgc atggattcca tgttcatcag tttggagata atacacaagg ctgtaccagt 180 gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga caacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240 catgttggag acctgggcaa tgtgactgct ggcaaagatg gtgtggccaa ggtgtctttc 300 gaagattctg tgatctcgct ctcaggagac cattccatca ttggccgcac attggtggtc 360 catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtaaaaa gacaggaaac 420 gctggaggtc gtctggcttg tggtgtaatt gggatcgcca ataa 464 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 4 cggaggucug gccuauaact t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 5 ggaggucugg ccuauaaact t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 6 gaggucuggc cuauaaagct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 7 aggucuggcc uauaaaguct t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 8 ggucuggccu auaaaguact t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 9 ucuggccuau aaaguaguct t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 10 cuggccuaua aaguagucct t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 11 uggccuauaa aguagucgct t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 12 ggccuauaaa guagucgcct t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 13 gccuauaaag uagucgcgct t 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 14 ccuauaaagu agucgcggct t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 15 gucguagucu ccugcagcct t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 16 cguagucucc ugcagcguct t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 17 guagucuccu gcagcgucct t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 18 uagucuccug cagcgucuct t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 19 auggcgacga aggccgugct t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 20 cgacgaaggc cgugugcgct t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 21 gaaggccgug ugcgugcuct t 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 22 ggccgugugc gugcugaact t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 23 agggcgacgg cccagugcct t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 24 ugcagggcau caucaauuct t 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 25 gcagggcauc aucaauuuct t 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 26 agggcaucau caauuucgct t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gggcaucauc aauuucgact t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 28 ggcaucauca auuucgagct t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 29 gcaucaucaa uuucgagcct t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 30 caucaucaau uucgagcact t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 31 aauuucgagc agaaggaact t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 32 uucgagcaga aggaaaguct t 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 33 ucgagcagaa ggaaaguact t 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 34 aagguguggg gaagcauuct t 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 35 ggugugggga agcauuaact t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 36 gacugacuga aggccugcct t 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 37 cugacugaag gccugcauct t 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ugacugaagg ccugcaugct t 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ugaaggccug cauggauuct t 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 40 gaaggccugc auggauucct t 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ugcauggauu ccauguucct t 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 42 cauggauucc auguucauct t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ggauuccaug uucaugagct t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 44 uuccauguuc augaguuuct t 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 45 guucaugagu uuggagauct t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 46 uucaugaguu uggagauact t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 47 ugaguuugga gauaauacct t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 48 gaguuuggag auaauacact t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 49 aggcuguacc agugcaggct t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 50 ggcuguacca gugcagguct t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 51 gcagguccuc acuuuaauct t 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 52 cagguccuca cuuuaaucct t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 53 ucacuuuaau ccucuaucct t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 54 cuauccagaa aacacgguct t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 55 uauccagaaa acacggugct t 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 56 auccagaaaa cacgguggct t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 57 ccagaaaaca cggugggcct t 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 58 gaaaacacgg ugggccaact t 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 59 aaaacacggu gggccaaact t 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 60 cggugggcca aaggaugact t 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 61 aggaugaaga gaggcaugct t 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 62 augaagagag gcauguugct t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 63 gagaggcaug uuggagacct t 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 64 agaggcaugu uggagacuct t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 65 auguuggaga cuugggcact t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 66 guuggagacu ugggcaauct t 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 67 ggagacuugg gcaaugugct t 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 68 ggcaauguga cugcugacct t 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 69 caaugugacu gcugacaact t 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 70 cugacaaaga ugguguggct t 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 71 ugacaaagau gguguggcct t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 72 cucaggagac cauugcauct t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 73 ucaggagacc auugcaucct t 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 74 agaccauugc aucauuggct t 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 75 gaccauugca ucauuggcct t 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 76 auugcaucau uggccgcact t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 77 cauuggccgc acacugguct t 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 78 cgcacacugg ugguccauct t 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 79 cacacuggug guccaugact t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 80 acacuggugg uccaugaact t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 81 ugguggucca ugaaaaagct t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 82 ugguccauga aaaagcagct t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 83 aaagcagaug acuugggcct t 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 84 gcagaugacu ugggcaaact t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 85 augacuuggg caaaggugct t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 86 ugacuugggc aaagguggct t 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 87 gacuugggca aagguggact t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 88 guacaaagac aggaaacgct t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 89 acaaagacag gaaacgcuct t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 90 caaagacagg aaacgcugct t 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 91 aggaaacgcu ggaagucgct t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 92 gucguuuggc uuguggugct t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 93 ucguuuggcu ugugguguct t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 94 cguuuggcuu gugguguact t 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 95 guuuggcuug ugguguaact t 21 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 96 uuggcuugug guguaauuct t 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 97 ggcuuguggu guaauuggct t 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gcuuguggug uaauugggct t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 99 cuuguggugu aauugggact t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 100 ugugguguaa uugggaucct t 21 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gugguguaau ugggaucgct t 21 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 102 ugguguaauu gggaucgcct t 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 103 guaauuggga ucgcccaact t 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 104 uaauugggau cgcccaauct t 21 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 105 aauugggauc gcccaauact t 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 106 auugggaucg cccaauaact t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 107 uugggaucgc ccaauaaact t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 108 ugggaucgcc caauaaacct t 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gggaucgccc aauaaacact t 21 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 110 aucgcccaau aaacauucct t 21 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 111 ccaauaaaca uucccuugct t 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 112 caauaaacau ucccuuggct t 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 113 aauaaacauu cccuuggact t 21 <210> 114 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 114 auaaacauuc ccuuggauct t 21 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 115 uaaacauucc cuuggaugct t 21 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 116 aaacauuccc uuggauguct t 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 117 aacauucccu uggauguact t 21 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 118 auucccuugg auguagucct t 21 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 119 cuuggaugua gucugaggct t 21 <210> 120 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 120 cugaggcccc uuaacucact t 21 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 121 gaggccccuu aacucaucct t 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 122 aggccccuua acucaucuct t 21 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 123 ccccuuaacu caucuguuct t 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 124 cccuuaacuc aucuguuact t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 125 ccuuaacuca ucuguuauct t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 126 cuuaacucau cuguuaucct t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 127 uuaacucauc uguuauccct t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 128 uaacucaucu guuauccuct t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 129 aacucaucug uuauccugct t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 130 guuauccugc uagcuguact t 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 131 cugcuagcug uagaaaugct t 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 132 ugcuagcugu agaaauguct t 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 133 gcuguagaaa uguauccuct t 21 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 134 cuguagaaau guauccugct t 21 <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 135 uguagaaaug uauccugact t 21 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 136 guagaaaugu auccugauct t 21 <210> 137 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 137 aaauguaucc ugauaaacct t 21 <210> 138 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 138 guauccugau aaacauuact t 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 139 uuaaacacug uaaucuuact t 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 140 acuguaaucu uaaaagugct t 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 141 cuguaaucuu aaaaguguct t 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 142 uguaaucuua aaaguguact t 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 143 guaaucuuaa aaguguaact t 21 <210> 144 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 144 cuuaaaagug uaauugugct t 21 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 145 uaccuguagu gagaaacuct t 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 146 uuaugaucac uuggaagact t 21 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 147 augaucacuu ggaagauuct t 21 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 148 aucacuugga agauuuguct t 21 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 149 uggaagauuu guauaguuct t 21 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 150 uauaaaacuc aguuaaaact t 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 151 aaacucaguu aaaaugucct t 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gucuguuuca augaccugct t 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 153 augaccugua uuuugccact t 21 <210> 154 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 154 accuguauuu ugccagacct t 21 <210> 155 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ccuguauuuu gccagacuct t 21 <210> 156 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 156 uaaaucacag auggguauct t 21 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 157 aucacagaug gguauuaact t 21 <210> 158 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 158 ucacagaugg guauuaaact t 21 <210> 159 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 159 acagaugggu auuaaacuct t 21 <210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 160 cagaugggua uuaaacuuct t 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 161 agauggguau uaaacuugct t 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 162 auggguauua aacuugucct t 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 163 uaaacuuguc agaauuucct t 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 164 ucauucaagc cugugaauct t 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 165 cauucaagcc ugugaauact t 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 166 aauaaaaacc cuguauggct t 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 167 auaaaaaccc uguauggcct t 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 168 aacccuguau ggcacuuact t 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 169 acccuguaug gcacuuauct t 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gaggcuauua aaagaaucct t 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 171 aaagaaucca aauucaaact t 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 172 gaauccaaau ucaaacuact t 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 173 uuuauaggcc agaccuccgt t 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 174 uuuuauaggc cagaccucct t 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 175 ucuuuauagg ccagaccuct t 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 176 uacuuuauag gccagaccut t 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 177 uuacuuuaua ggccagacct t 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 178 uacuacuuua uaggccagat t 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 179 ugacuacuuu auaggccagt t 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 180 ucgacuacuu uauaggccat t 21 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 181 ugcgacuacu uuauaggcct t 21 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 182 ucgcgacuac uuuauaggct t 21 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 183 uccgcgacua cuuuauaggt t 21 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 184 ugcugcagga gacuacgact t 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 185 uacgcugcag gagacuacgt t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 186 ugacgcugca ggagacuact t 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 187 uagacgcugc aggagacuat t 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 188 ucacggccuu cgucgccaut t 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 189 ucgcacacgg ccuucgucgt t 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 190 uagcacgcac acggccuuct t 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 191 uuucagcacg cacacggcct t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 192 ugcacugggc cgucgcccut t 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 193 uaauugauga ugcccugcat t 21 <210> 194 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 194 uaaauugaug augcccugct t 21 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 195 ucgaaauuga ugaugcccut t 21 <210> 196 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 196 uucgaaauug augaugccct t 21 <210> 197 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 197 ucucgaaauu gaugaugcct t 21 <210> 198 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 198 ugcucgaaau ugaugaugct t 21 <210> 199 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 199 uugcucgaaa uugaugaugt t 21 <210> 200 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 200 uuuccuucug cucgaaauut t 21 <210> 201 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 201 uacuuuccuu cugcucgaat t 21 <210> 202 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 202 uuacuuuccu ucugcucgat t 21 <210> 203 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 203 uaaugcuucc ccacaccuut t 21 <210> 204 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 204 uuuaaugcuu ccccacacct t 21 <210> 205 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 205 ugcaggccuu cagucaguct t 21 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 206 uaugcaggcc uucagucagt t 21 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 207 ucaugcaggc cuucagucat t 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 208 uaauccaugc aggccuucat t 21 <210> 209 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 209 ugaauccaug caggccuuct t 21 <210> 210 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 210 ugaacaugga auccaugcat t 21 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 211 uaugaacaug gaauccaugt t 21 <210> 212 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 212 ucucaugaac auggaaucct t 21 <210> 213 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 213 uaaacucaug aacauggaat t 21 <210> 214 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 214 uaucuccaaa cucaugaact t 21 <210> 215 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 215 uuaucuccaa acucaugaat t 21 <210> 216 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 216 uguauuaucu ccaaacucat t 21 <210> 217 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 217 uuguauuauc uccaaacuct t 21 <210> 218 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 218 uccugcacug guacagccut t 21 <210> 219 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 219 uaccugcacu gguacagcct t 21 <210> 220 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 220 uauuaaagug aggaccugct t 21 <210> 221 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 221 ugauuaaagu gaggaccugt t 21 <210> 222 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 222 ugauagagga uuaaagugat t 21 <210> 223 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 223 uaccguguuu ucuggauagt t 21 <210> 224 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 224 ucaccguguu uucuggauat t 21 <210> 225 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 225 uccaccgugu uuucuggaut t 21 <210> 226 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 226 ugcccaccgu guuuucuggt t 21 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 227 uuuggcccac cguguuuuct t 21 <210> 228 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 228 uuuuggccca ccguguuuut t 21 <210> 229 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 229 uucauccuuu ggcccaccgt t 21 <210> 230 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 230 ucaugccucu cuucauccut t 21 <210> 231 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ucaacaugcc ucucuucaut t 21 <210> 232 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 232 ugucuccaac augccucuct t 21 <210> 233 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 233 uagucuccaa caugccucut t 21 <210> 234 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 234 uugcccaagu cuccaacaut t 21 <210> 235 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 235 uauugcccaa gucuccaact t 21 <210> 236 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 236 ucacauugcc caagucucct t 21 <210> 237 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 237 ugucagcagu cacauugcct t 21 <210> 238 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 238 uuugucagca gucacauugt t 21 <210> 239 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 239 uccacaccau cuuugucagt t 21 <210> 240 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 240 ugccacacca ucuuugucat t 21 <210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 241 uaugcaaugg ucuccugagt t 21 <210> 242 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 242 ugaugcaaug gucuccugat t 21 <210> 243 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 243 uccaaugaug caauggucut t 21 <210> 244 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 244 ugccaaugau gcaaugguct t 21 <210> 245 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 245 uugcggccaa ugaugcaaut t 21 <210> 246 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 246 uaccagugug cggccaaugt t 21 <210> 247 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 247 uauggaccac cagugugcgt t 21 <210> 248 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 248 uucauggacc accagugugt t 21 <210> 249 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 249 uuucauggac caccagugut t 21 <210> 250 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 250 ucuuuuucau ggaccaccat t 21 <210> 251 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 251 ucugcuuuuu cauggaccat t 21 <210> 252 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 252 ugcccaaguc aucugcuuut t 21 <210> 253 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 253 uuuugcccaa gucaucugct t 21 <210> 254 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 254 ucaccuuugc ccaagucaut t 21 <210> 255 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 255 uccaccuuug cccaagucat t 21 <210> 256 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 256 uuccaccuuu gcccaaguct t 21 <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 257 ucguuuccug ucuuuguact t 21 <210> 258 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 258 uagcguuucc ugucuuugut t 21 <210> 259 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 259 ucagcguuuc cugucuuugt t 21 <210> 260 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 260 ucgacuucca gcguuuccut t 21 <210> 261 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 261 ucaccacaag ccaaacgact t 21 <210> 262 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 262 uacaccacaa gccaaacgat t 21 <210> 263 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 263 uuacaccaca agccaaacgt t 21 <210> 264 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 264 uuuacaccac aagccaaact t 21 <210> 265 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 265 uaauuacacc acaagccaat t 21 <210> 266 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 266 uccaauuaca ccacaagcct t 21 <210> 267 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 267 ucccaauuac accacaagct t 21 <210> 268 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 268 uucccaauua caccacaagt t 21 <210> 269 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 269 ugaucccaau uacaccacat t 21 <210> 270 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 270 ucgaucccaa uuacaccact t 21 <210> 271 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 271 ugcgauccca auuacaccat t 21 <210> 272 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 272 uuugggcgau cccaauuact t 21 <210> 273 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 273 uauugggcga ucccaauuat t 21 <210> 274 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 274 uuauugggcg aucccaauut t 21 <210> 275 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 275 uuuauugggc gaucccaaut t 21 <210> 276 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 276 uuuuauuggg cgaucccaat t 21 <210> 277 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 277 uguuuauugg gcgaucccat t 21 <210> 278 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 278 uuguuuauug ggcgauccct t 21 <210> 279 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 279 ugaauguuua uugggcgaut t 21 <210> 280 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ucaagggaau guuuauuggt t 21 <210> 281 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 281 uccaagggaa uguuuauugt t 21 <210> 282 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 282 uuccaaggga auguuuauut t 21 <210> 283 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 283 uauccaaggg aauguuuaut t 21 <210> 284 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 284 ucauccaagg gaauguuuat t 21 <210> 285 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 285 uacauccaag ggaauguuut t 21 <210> 286 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 286 uuacauccaa gggaauguut t 21 <210> 287 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 287 ugacuacauc caagggaaut t 21 <210> 288 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 288 uccucagacu acauccaagt t 21 <210> 289 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 289 uugaguuaag gggccucagt t 21 <210> 290 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 290 ugaugaguua aggggccuct t 21 <210> 291 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 291 uagaugaguu aaggggccut t 21 <210> 292 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 292 uaacagauga guuaaggggt t 21 <210> 293 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 293 uuaacagaug aguuaagggt t 21 <210> 294 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 294 uauaacagau gaguuaaggt t 21 <210> 295 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 295 ugauaacaga ugaguuaagt t 21 <210> 296 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 296 uggauaacag augaguuaat t 21 <210> 297 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 297 uaggauaaca gaugaguuat t 21 <210> 298 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 298 ucaggauaac agaugaguut t 21 <210> 299 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 299 uuacagcuag caggauaact t 21 <210> 300 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 300 ucauuucuac agcuagcagt t 21 <210> 301 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 301 uacauuucua cagcuagcat t 21 <210> 302 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 302 uaggauacau uucuacagct t 21 <210> 303 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 303 ucaggauaca uuucuacagt t 21 <210> 304 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 304 uucaggauac auuucuacat t 21 <210> 305 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 305 uaucaggaua cauuucuact t 21 <210> 306 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 306 uguuuaucag gauacauuut t 21 <210> 307 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 307 uuaauguuua ucaggauact t 21 <210> 308 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 308 uuaagauuac aguguuuaat t 21 <210> 309 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 309 ucacuuuuaa gauuacagut t 21 <210> 310 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 310 uacacuuuua agauuacagt t 21 <210> 311 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 311 uuacacuuuu aagauuacat t 21 <210> 312 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 312 uuuacacuuu uaagauuact t 21 <210> 313 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 313 ucacaauuac acuuuuaagt t 21 <210> 314 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 314 uaguuucuca cuacagguat t 21 <210> 315 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 315 uucuuccaag ugaucauaat t 21 <210> 316 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 316 uaaucuucca agugaucaut t 21 <210> 317 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 317 uacaaaucuu ccaagugaut t 21 <210> 318 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 318 uaacuauaca aaucuuccat t 21 <210> 319 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 319 uuuuuaacug aguuuuauat t 21 <210> 320 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 320 ugacauuuua acugaguuut t 21 <210> 321 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 321 ucaggucauu gaaacagact t 21 <210> 322 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 322 uuggcaaaau acaggucaut t 21 <210> 323 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 323 ugucuggcaa aauacaggut t 21 <210> 324 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 324 uagucuggca aaauacaggt t 21 <210> 325 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 325 uauacccauc ugugauuuat t 21 <210> 326 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 326 uuuaauaccc aucugugaut t 21 <210> 327 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 327 uuuuaauacc caucugugat t 21 <210> 328 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 328 uaguuuaaua cccaucugut t 21 <210> 329 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 329 uaaguuuaau acccaucugt t 21 <210> 330 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 330 ucaaguuuaa uacccaucut t 21 <210> 331 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 331 ugacaaguuu aauacccaut t 21 <210> 332 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 332 ugaaauucug acaaguuuat t 21 <210> 333 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 333 uauucacagg cuugaaugat t 21 <210> 334 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 334 uuauucacag gcuugaaugt t 21 <210> 335 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 335 uccauacagg guuuuuauut t 21 <210> 336 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 336 ugccauacag gguuuuuaut t 21 <210> 337 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 337 uuaagugcca uacaggguut t 21 <210> 338 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 338 uauaagugcc auacagggut t 21 <210> 339 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 339 ugauucuuuu aauagccuct t 21 <210> 340 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 340 uuuugaauuu ggauucuuut t 21 <210> 341 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <400> 341 uuaguuugaa uuuggauuct t 21 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 342 caaugugacu gcugacaacc c 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 343 uuugucagca gucacauugu u 21 <210> 344 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 344 caaugugacu gcugacaauc c 21 <210> 345 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 345 caaugugacu gcugacaagc c 21 <210> 346 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 caaugugacu gcugacaaac c 21 <210> 347 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 caaugugaca gcugacaaac c 21 <210> 348 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 caaugugacu gcugacaacc 20 <210> 349 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 caaugugacu gcugacaauc cc 22 <210> 350 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 caaugugacu gcugacaaca c 21 <210> 351 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 uuugucagca gucacauugu c 21 <210> 352 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 caaugugacu gcugacaaau c 21 <210> 353 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 353 caaugugacu gcugacaauu c 21 <210> 354 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 uuugucagca gucacauuga c 21 <210> 355 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 355 caaugugacu gcugacaauc cc 22 <210> 356 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 cgacgaaggc cgugugcgcc c 21 <210> 357 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 357 ucgcacacgg ccuucgucgu u 21 <210> 358 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 ugacuugggc aaagguggcc c 21 <210> 359 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 uccaccuuug cccaagucau u 21 <210> 360 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 aacucaucug uuauccugcc c 21 <210> 361 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 ucaggauaac agaugaguuu u 21 <210> 362 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 ccccuuaacu caucuguucc c 21 <210> 363 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 uaacagauga guuaaggggu u 21 <210> 364 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 364 cccuuaacuc aucuguuacc c 21 <210> 365 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 365 uuaacagaug aguuaagggu u 21 <210> 366 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 366 aacucaucug uuaucuugcc c 21 <210> 367 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 367 gcuguggaaa uguaucuucc c 21 <210> 368 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 368 uaggauacau uucuacagcu u 21 <210> 369 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 369 ugacuugggc aaaggugagc c 21 <210> 370 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 370 ccccuuaacu caucuguugc c 21 <210> 371 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 371 cccuuaacuc aucuguuagc c 21 <210> 372 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 aacucaucug uuaucuuagc c 21 <210> 373 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gcuguggaaa uguaucuugc c 21 <210> 374 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 ugacuugggc aaagguaggc c 21 <210> 375 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 ccccuuaaca caucuguuac c 21 <210> 376 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 cccuuaacug aucuguuaac c 21 <210> 377 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 aacucaucuc uuaucuugcc c 21 <210> 378 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 gcuguggaau uguaucuugc c 21 <210> 379 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 ugacuugggg aaaggugagc c 21 <210> 380 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 aacucaucug uuaucuuggc c 21 <210> 381 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 381 ccccuuaacu cauuuguucc c 21 <210> 382 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 382 ugacuugggc aaagguagcc c 21 <210> 383 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 383 caaugugacu gcugacaaa 19 <210> 384 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 384 uuugucagca gucacauugu c 21 <210> 385 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 385 gcagguccuc acuuuaaugc c 21 <210> 386 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 386 gauuaaagug aggaccugcu u 21 <210> 387 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 387 ggcaauguga cugcugaccc c 21 <210> 388 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 388 ugucagcagu cacauugccu u 21 <210> 389 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 gcagguccuc acuuuaauuc c 21 <210> 390 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 ggcaauguga cugcugaugc c 21 <210> 391 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gcagguccuc acuuuaaucc c 21 <210> 392 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 ggcaauguga cugcugauac c 21 <210> 393 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 gcagguccug acuuuaaucc c 21 <210> 394 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 394 ggcaaugugu cugcugauac c 21 <210> 395 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 395 gauuaaagug aggaccugcu uu 22 <210> 396 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 396 ugucagcagu cacauugccu uu 22

Claims (25)

  1. 세포에서 SOD1의 발현을 저해 또는 억제하기 위한 2개의 역위 말단 반복(ITR) 사이에 위치한 핵산 서열을 포함하는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터로서, 상기 핵산 서열은 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 포함하고, 상기 센스 가닥 서열은 표 3, 표 11 또는 표 14에 나열된 서열의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 다른 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥 서열은 표 3, 표 11 또는 표 14에 나열된 서열의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 다른 15개 이상의 인접한 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 센스 가닥 서열 및 상기 안티센스 가닥 서열은 4 뉴클레오티드 이상 길이의 상보성 영역을 공유하는, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서,상기 핵산 서열은 siRNA 이중가닥의 센스 가닥 서열 및 안티센스 가닥 서열을 포함하는, AAV 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 siRNA 이중가닥은 siRNA 이중가닥 ID 번호 D-2741 내지 ID 번호 D-2985로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 상기 siRNA 이중가닥은 siRNA ID: D-2757, D-2806, D-2860, D-2861, D-2875, D-2871, D-2758, D-2759, D-2866, D-2870, D-2823 및 D-2858의 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는, AAV 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 17 뉴클레오티드 이상인, AAV 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 19 내지 21 뉴클레오티드인, AAV 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 상보성 영역은 길이가 19 뉴클레오티드인, AAV 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 서열 및 상기 안티센스 가닥 서열은 독립적으로 30 뉴클레오티드 이하인, AAV 벡터.
  9. 제1항에 있어서, 하나 이상의 상기 센스 가닥 서열 및 상기 안티센스 가닥 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, AAV 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 하나 이상의 상기 센스 가닥 서열 및 상기 안티센서 가닥 서열은 2개 이상의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는, AAV 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV9.47, AAV9(hu14), AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ8 및 AAV-DJ 및 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 캡시드 혈청형을 포함하는, AAV 벡터.
  12. 세포에서 SOD1 유전자의 발현을 저해하는 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포유류 세포는 운동 뉴런인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 포유류 세포는 성상세포인 방법.
  16. 치료를 필요로 하는 대상에 근위축성 측삭 경화증 (ALS)을 치료 및/또는 개선하기 위한 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 치료 유효량의 조성물을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, SOD1 발현이 저해되거나 억제되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 SOD1은 야생형 SOD1, 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 SOD1, 또는 야생형 SOD1 및 하나 이상의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 SOD1 둘 다인, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 SOD1 발현이 약 20% 내지 약 100%까지 저해되거나 억제되는, 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 ALS는 확인된 SOD1 유전자 돌연변이를 갖는 가족성 ALS인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 ALS는 산발성 ALS인 방법.
  22. 세포에서 SOD1 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 AAV 벡터를 포함하는 조성물을 상기 세포에 투여하는 것을 포함하되, 상기 SOD1 유전자는 상기 세포 내부에서 기능 효과의 수득을 야기하는 돌연변이를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 방법.
  24. 제23항에 있어서 상기 포유류 세포는 운동 뉴런인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 포유류 세포는 성상세포인 방법.
KR1020177012963A 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법 KR102599909B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237037989A KR20230169197A (ko) 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462079588P 2014-11-14 2014-11-14
US62/079,588 2014-11-14
US201562211992P 2015-08-31 2015-08-31
US62/211,992 2015-08-31
US201562234466P 2015-09-29 2015-09-29
US62/234,466 2015-09-29
PCT/US2015/060562 WO2016077687A1 (en) 2014-11-14 2015-11-13 Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237037989A Division KR20230169197A (ko) 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170071541A true KR20170071541A (ko) 2017-06-23
KR102599909B1 KR102599909B1 (ko) 2023-11-09

Family

ID=55955103

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237037989A KR20230169197A (ko) 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
KR1020177012963A KR102599909B1 (ko) 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237037989A KR20230169197A (ko) 2014-11-14 2015-11-13 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법

Country Status (15)

Country Link
US (4) US10597660B2 (ko)
EP (1) EP3218484A4 (ko)
JP (4) JP2017535266A (ko)
KR (2) KR20230169197A (ko)
CN (2) CN107109407A (ko)
AU (2) AU2015346162B2 (ko)
BR (1) BR112017010087A2 (ko)
CA (2) CA2967367C (ko)
HK (1) HK1244299A1 (ko)
IL (3) IL292999A (ko)
MX (2) MX2017006216A (ko)
RU (2) RU2716422C2 (ko)
SG (1) SG11201703281RA (ko)
WO (1) WO2016077687A1 (ko)
ZA (1) ZA201702991B (ko)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20220798T1 (hr) 2014-04-01 2022-10-14 Biogen Ma Inc. Pripravci za modulaciju ekspresije sod-1
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
GB201609597D0 (en) * 2016-06-01 2016-07-13 Univ Sheffield Therapy
JP2020518266A (ja) * 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
CN110913866A (zh) * 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
WO2018204803A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating huntington's disease
WO2019079242A1 (en) * 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
JP7502991B2 (ja) * 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
CN113005123A (zh) * 2017-10-23 2021-06-22 普利维尔治疗公司 用于神经变性疾病的基因疗法
WO2019132624A1 (ko) * 2017-12-29 2019-07-04 주식회사 헬릭스미스 하이브리드 hgf 유전자가 도입된 aav(아데노-연관 바이러스) 벡터
JP7350019B2 (ja) * 2018-05-31 2023-09-25 イミュニティ ファルマ リミテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）を治療するための組成物、及び治療のためにそれを使用する方法
EP3807404A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Voyager Therapeutics, Inc. Engineered 5' untranslated regions (5' utr) for aav production
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
US20210254103A1 (en) * 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
CN112770812A (zh) 2018-07-24 2021-05-07 沃雅戈治疗公司 产生基因治疗制剂的系统和方法
TW202035689A (zh) 2018-10-04 2020-10-01 美商航海家醫療公司 測量病毒載體粒子的效價及強度之方法
CN113166731A (zh) 2018-10-05 2021-07-23 沃雅戈治疗公司 编码aav生产蛋白的工程化核酸构建体
EP3867389A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Voyager Therapeutics, Inc. Expression vectors for large-scale production of raav in the baculovirus/sf9 system
JP2022513721A (ja) * 2018-12-06 2022-02-09 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症における治療的介入を導くためのニューロフィラメントタンパク質
EP3911410A1 (en) 2019-01-18 2021-11-24 Voyager Therapeutics, Inc. Methods and systems for producing aav particles
CN113924115A (zh) 2019-01-31 2022-01-11 俄勒冈健康与科学大学 用于aav衣壳的使用转录依赖性定向进化的方法
WO2020223296A1 (en) * 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
EP3962536A1 (en) 2019-04-29 2022-03-09 Voyager Therapeutics, Inc. Systems and methods for producing baculoviral infected insect cells (biics) in bioreactors
EP4010465A1 (en) 2019-08-09 2022-06-15 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
US20220364114A1 (en) 2019-08-26 2022-11-17 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
US20220389067A1 (en) * 2019-11-05 2022-12-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of Treating Neurodegenerative Diseases Caused by G4C2 Expansion in C9ORF72
EP3892283A1 (en) * 2020-04-09 2021-10-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Nucleic acids encoding human fus protein and use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
WO2022023284A1 (en) 2020-07-27 2022-02-03 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules, methods of making therefor, and methods of use thereof
WO2022032153A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Cell culture medium for use in producing gene therapy products in bioreactors
WO2022109368A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-27 Texas Tech University System Methods of treating or preventing neurological disorders using zpr1
IL304880A (en) * 2021-02-12 2023-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Superoxide dismutase 1 (SOD1) IRNA compositions and methods of using them to treat or prevent superoxide dismutase 1- (SOD1-) associated neurodegenerative diseases
TW202246516A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商航海家醫療公司 病毒蛋白之控制表現
WO2022187548A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins
WO2023042178A2 (en) * 2021-09-20 2023-03-23 Aleta Neuroscience, Llc Combination therapy for neurodegenerative diseases
US20230193281A1 (en) * 2021-11-08 2023-06-22 University Of Massachusetts Oligonucleotides for sod1 modulation
US11912997B2 (en) 2022-06-15 2024-02-27 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for inhibiting expression of Superoxide Dismutase 1 (SOD1), compositions thereof, and methods of use
WO2024054983A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Voyager Therapeutics, Inc. Controlled expression of viral proteins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007109097A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi MODULATION OF TGF-BETA AND THERAPEUTIC USES THEREOF
JP2013143917A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Mie Univ 線維症予防又は治療剤

Family Cites Families (514)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2942578B2 (ja) 1988-06-14 1999-08-30 カイロン コーポレイション 新しい結合特性を有する超酸化物不均化酵素類縁体
US5171680A (en) 1988-06-14 1992-12-15 Chiron Corporation Superoxide dismutase analogs having novel binding properties
FR2640638B1 (fr) 1988-12-20 1991-02-15 Commissariat Energie Atomique Bioreacteur et dispositif pour la culture de cellules animales
AU7906691A (en) 1990-05-23 1991-12-10 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6268213B1 (en) 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
EP0755454B1 (en) 1994-04-13 2008-02-13 The Rockefeller University Aav-mediated delivery of dna to cells of the nervous system
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US20020159979A1 (en) 1994-06-06 2002-10-31 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US5856152A (en) 1994-10-28 1999-01-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US5652224A (en) 1995-02-24 1997-07-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for gene therapy for the treatment of defects in lipoprotein metabolism
US5741657A (en) 1995-03-20 1998-04-21 The Regents Of The University Of California Fluorogenic substrates for β-lactamase and methods of use
US6281010B1 (en) 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
US5756283A (en) 1995-06-05 1998-05-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy
US5688676A (en) 1995-06-07 1997-11-18 Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US5741683A (en) 1995-06-07 1998-04-21 The Research Foundation Of State University Of New York In vitro packaging of adeno-associated virus DNA
US6676935B2 (en) 1995-06-27 2004-01-13 Cell Genesys, Inc. Tissue specific adenoviral vectors
US6197293B1 (en) 1997-03-03 2001-03-06 Calydon, Inc. Adenovirus vectors specific for cells expressing androgen receptor and methods of use thereof
US6143548A (en) 1995-08-30 2000-11-07 Genzyme Corporation Chromatographic purification of adeno-associated virus (AAV)
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
US5846528A (en) 1996-01-18 1998-12-08 Avigen, Inc. Treating anemia using recombinant adeno-associated virus virions comprising an EPO DNA sequence
US5858351A (en) 1996-01-18 1999-01-12 Avigen, Inc. Methods for delivering DNA to muscle cells using recombinant adeno-associated virus vectors
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US5952221A (en) 1996-03-06 1999-09-14 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a first and second nucleic acid sequence
CA2255774C (en) 1996-05-29 2008-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US7026468B2 (en) 1996-07-19 2006-04-11 Valentis, Inc. Process and equipment for plasmid purification
IL128736A0 (en) 1996-09-06 2000-01-31 Univ Pennsylvania Methods using cre-lox for production of recombinant adeno-associated viruses
US20020037867A1 (en) 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
AU4255397A (en) 1996-09-06 1998-03-26 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Chimpanzee adenovirus vectors
WO1998010088A1 (en) 1996-09-06 1998-03-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing t7 polymerase
AU723497C (en) 1996-09-06 2001-10-11 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
US5866552A (en) 1996-09-06 1999-02-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for expressing a gene in the absence of an immune response
US20030215422A1 (en) 1996-09-11 2003-11-20 John A. Chiorini Aav4 vector and uses thereof
ATE550429T1 (de) 1996-11-20 2012-04-15 Crucell Holland Bv Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
EP0950091A2 (en) 1996-12-18 1999-10-20 Targeted Genetics Corporation Aav split-packaging genes and cell lines comprising such genes for use in the production of recombinant aav vectors
US6156303A (en) 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6710036B2 (en) 1997-07-25 2004-03-23 Avigen, Inc. Induction of immune response to antigens expressed by recombinant adeno-associated virus
US6251677B1 (en) 1997-08-25 2001-06-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
AU9774998A (en) 1997-09-19 1999-04-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Method for gene transfer using bcl2 and compositions useful therein
WO1999014354A1 (en) 1997-09-19 1999-03-25 The Trustees Of The University Of The Pennsylvania Methods and vector constructs useful for production of recombinant aav
EP1015619A1 (en) 1997-09-19 2000-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
US6642051B1 (en) 1997-10-21 2003-11-04 Targeted Genetics Corporation Amplifiable adeno-associated virus(AAV) packaging cassettes for the production of recombinant AAV vectors
IT1297074B1 (it) 1997-11-21 1999-08-03 Angeletti P Ist Richerche Bio Forme ormone-dipendenti delle proteine rep del virus adeno-associato (aav-2), sequenze di dna codificanti per esse, vettori che le
EP1042494A1 (en) 1997-12-23 2000-10-11 Introgene B.V. Adeno-associated virus and adenovirus chimeric recombinant viruses useful for the integration of foreign genetic information into the chromosomal dna of target cells
US6410300B1 (en) 1998-01-12 2002-06-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV
AU2882899A (en) 1998-02-26 1999-09-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Stable protection from dystrophic sarcolemmal degeneration and restoration of the sarcoglycan complex
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6521426B1 (en) 1998-04-08 2003-02-18 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus
FR2778413B1 (fr) 1998-05-07 2000-08-04 Immunotech Sa Nouveaux reactifs et methode de lyse des erythrocytes
EP1078096A1 (en) 1998-05-11 2001-02-28 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Multiviral compositions and uses thereof
EP1849872A1 (en) 1998-05-20 2007-10-31 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US6436392B1 (en) 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
EP1080218A1 (en) 1998-05-27 2001-03-07 University of Florida Method of preparing recombinant adeno-associated virus compositions by using an iodixanol gradient
CA2329143A1 (en) 1998-05-27 1999-12-02 Cell Genesys, Inc. Adeno-associated viral vector-mediated expression of factor viii activity
US6984517B1 (en) 1998-05-28 2006-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector and uses thereof
ATE402254T1 (de) 1998-05-28 2008-08-15 Us Gov Health & Human Serv Aav5 vektoren und deren verwendung
GB2338236B (en) 1998-06-13 2003-04-09 Aea Technology Plc Microbiological cell processing
US6900049B2 (en) 1998-09-10 2005-05-31 Cell Genesys, Inc. Adenovirus vectors containing cell status-specific response elements and methods of use thereof
WO2000022152A1 (en) 1998-10-13 2000-04-20 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
MXPA01004169A (es) 1998-10-27 2002-06-04 Crucell Holland Bv Produccion mejorada de vector de virus adenoasociados.
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
US6689600B1 (en) 1998-11-16 2004-02-10 Introgen Therapeutics, Inc. Formulation of adenovirus for gene therapy
US6759050B1 (en) 1998-12-03 2004-07-06 Avigen, Inc. Excipients for use in adeno-associated virus pharmaceutical formulations, and pharmaceutical formulations made therewith
US6225113B1 (en) 1998-12-04 2001-05-01 Genvec, Inc. Use of trans-activation and cis-activation to modulate the persistence of expression of a transgene in an at least E4-deficient adenovirus
US6387368B1 (en) 1999-02-08 2002-05-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof
DE19905501B4 (de) 1999-02-10 2005-05-19 MediGene AG, Gesellschaft für molekularbiologische Kardiologie und Onkologie Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus, geeignete Mittel hierzu sowie Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
US6509150B1 (en) 1999-03-05 2003-01-21 Universite De Nantes Compositions and methods for recombinant Adeno-Associated Virus production
JP4693244B2 (ja) 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
JP2002542805A (ja) 1999-04-30 2002-12-17 ユニバーシティ オブ フロリダ アデノ随伴ウイルス送達リボザイム組成物および使用方法
AU2409200A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Compositions and methods useful for production of recombinant viruses which require helper viruses
JP4969002B2 (ja) 1999-06-08 2012-07-04 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン ｒＡＡＶ形質導入を増加するための化合物および方法
EP1212411A2 (en) 1999-08-20 2002-06-12 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods and compositions for the construction and use of fusion libraries
US6399385B1 (en) 1999-09-29 2002-06-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for rapid PEG-modification of viral vectors, compositions for enhanced gene transduction, compositions with enhanced physical stability, and uses therefor
US6365394B1 (en) 1999-09-29 2002-04-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus
US7241447B1 (en) 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
CA2386546A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated viruses and uses thereof
WO2001032711A2 (en) 1999-10-21 2001-05-10 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus aav rep78 major regulatory protein, mutants thereof and uses thereof
AU3642601A (en) 1999-11-05 2001-05-30 Avigen, Inc. Ecdysone-inducible adeno-associated virus expression vectors
WO2001036603A2 (en) 1999-11-17 2001-05-25 Avigen, Inc. Recombinant adeno-associated virus virions for the treatment of lysosomal disorders
EP1240345A2 (en) 1999-12-10 2002-09-18 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Methods for expression of genes in primates
US20020045264A1 (en) 2000-03-14 2002-04-18 During Matthew J. Production of chimeric capsid vectors
US7638120B2 (en) 2000-03-14 2009-12-29 Thomas Jefferson University High transgene expression of a pseudotyped adeno-associated virus type
US6855314B1 (en) 2000-03-22 2005-02-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services AAV5 vector for transducing brain cells and lung cells
US6468524B1 (en) 2000-03-22 2002-10-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services AAV4 vector and uses thereof
US7048920B2 (en) 2000-03-24 2006-05-23 Cell Genesys, Inc. Recombinant oncolytic adenovirus for human melanoma
EP2345742B1 (en) 2000-03-30 2014-06-11 The Whitehead Institute for Biomedical Research RNA sequence-specific mediators of RNA interference
GB0009887D0 (en) 2000-04-20 2000-06-07 Btg Int Ltd Cytotoxic agents
US7125705B2 (en) 2000-04-28 2006-10-24 Genzyme Corporation Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
WO2001083692A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids
US20030013189A1 (en) 2000-04-28 2003-01-16 Wilson James M. Compositions and methods useful for non-invasive delivery of therapeutic molecules to the bloodstream
ES2256265T3 (es) 2000-06-01 2006-07-16 University Of North Carolina At Chapel Hill Vectores de parvovirus duplicados.
US20020106381A1 (en) 2000-06-13 2002-08-08 High Katherine A. Methods for administering recombinant adeno-associated virus virions to humans previously exposed to adeno-associated virus
EP1302542B1 (en) 2000-07-18 2007-06-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Novel physiologically active peptide and use thereof
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
US6329181B1 (en) 2000-08-07 2001-12-11 Neurologix, Inc. Helper functions for recombinant vector production
AU2001294096A1 (en) 2000-08-17 2002-02-25 Uichi Ikeda Adeno-associated virus-mediated delivery of angiogenic factors
DE10066104A1 (de) 2000-09-08 2003-01-09 Medigene Ag Wirtszellen zur Verpackung von rekombinantem Adeno-assoziiertem Virus (rAAV), Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung
FR2813891B1 (fr) 2000-09-14 2005-01-14 Immunotech Sa Reactif multifonctionnel pour erythrocytes mettant en jeu des carbamates et applications
ATE303808T1 (de) 2000-10-24 2005-09-15 Mitsubishi Pharma Corp Mittel zur behandlung der amyotrophischen lateralsklerose (als)
JP2002153278A (ja) 2000-11-22 2002-05-28 Hisamitsu Pharmaceut Co Inc ウイルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウイルスベクターの製造方法
WO2002070719A2 (en) 2001-01-19 2002-09-12 Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulatable gene expression system
JP2004532822A (ja) 2001-03-14 2004-10-28 アビジェン， インコーポレイテッド ビリオンの管逆行感染による組換えアデノ随伴ウイルス媒介遺伝子移入
EP2270024B1 (en) 2001-06-21 2018-10-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US7344872B2 (en) 2001-06-22 2008-03-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method for rapid screening of bacterial transformants and novel simian adenovirus proteins
US20040136963A1 (en) 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
AU2007201330C1 (en) 2001-07-12 2011-06-09 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
EP1900815B1 (en) 2001-07-12 2016-09-07 University of Massachusetts In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing
EP1412371B1 (en) 2001-07-12 2016-02-24 University of Massachusetts IN VIVO PRODUCTION OF SMALL INTERFERING RNAs THAT MEDIATE GENE SILENCING
US8241622B2 (en) 2001-07-13 2012-08-14 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences
EP1279740A1 (en) 2001-07-26 2003-01-29 Vrije Universiteit Brussel Recombinant vector derived from adeno-associated virus for gene therapy
JP2004538005A (ja) 2001-08-08 2004-12-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア シアル酸に結合するタンパク質を有するウイルスベクターの精製法
US20030092161A1 (en) 2001-09-19 2003-05-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for production of recombinant viruses, and uses therefor
EP2428569B1 (en) 2001-09-28 2018-05-23 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
WO2003042361A2 (en) 2001-11-09 2003-05-22 Government Of The United States Of America, Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
NZ600121A (en) 2001-11-13 2013-12-20 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
EP1944043A1 (en) 2001-11-21 2008-07-16 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
NZ550416A (en) 2001-11-21 2008-06-30 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
CA2469623C (en) 2001-12-12 2012-05-29 F H Faulding & Co Limited Composition for the preservation of viruses
AU2002360291A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 8 sequences
AU2002359284A1 (en) 2001-12-17 2003-06-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses therefor
AU2002359786A1 (en) 2001-12-19 2003-07-09 Hiroaki Mizukami Adeno-associated virus-mediated delivery of gdnf to skeletal muscles
CN1617938A (zh) 2002-01-16 2005-05-18 戴诺生物技术有限公司 从单个样品中分离核酸和蛋白质的方法
US20030180756A1 (en) * 2002-03-21 2003-09-25 Yang Shi Compositions and methods for suppressing eukaryotic gene expression
GB0208390D0 (en) 2002-04-11 2002-05-22 Univ London Adeno-associated virus producer system
US20030198620A1 (en) 2002-04-16 2003-10-23 Keiya Ozawa Method of treating amino acid metabolic disorders using recombinant adeno-associated virus virions
DE60310297T2 (de) 2002-04-29 2007-06-06 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methode für die direkte Gewinnung und Amplifikation von integrierten Viren aus zellulärer Gewebe-DNA
MXPA04010603A (es) 2002-04-30 2004-12-13 Oncolytics Biotech Inc Metodos mejorados de purificacion viral.
NZ561656A (en) 2002-05-01 2009-03-31 Univ Florida Improved rAAV expression systems for genetic modification of specific capsid proteins
PT1504126E (pt) 2002-05-03 2014-06-02 Univ Duke Um método para regular a expressão génica
US20050196854A1 (en) 2002-05-14 2005-09-08 Konz John O.Jr. Methods of adenovirus purification
US7419817B2 (en) 2002-05-17 2008-09-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services, Nih. Scalable purification of AAV2, AAV4 or AAV5 using ion-exchange chromatography
WO2003104413A2 (en) 2002-06-05 2003-12-18 University Of Florida Production of pseudotyped recombinant aav virions
US20080274989A1 (en) 2002-08-05 2008-11-06 University Of Iowa Research Foundation Rna Interference Suppression of Neurodegenerative Diseases and Methods of Use Thereof
US20050255086A1 (en) 2002-08-05 2005-11-17 Davidson Beverly L Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene
US20040241854A1 (en) 2002-08-05 2004-12-02 Davidson Beverly L. siRNA-mediated gene silencing
JP2006515162A (ja) 2002-08-29 2006-05-25 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 環状核酸ベクター、ならびに同ベクターの作製法および使用法
AU2003273336A1 (en) 2002-09-18 2004-04-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Efficient reduction of target rna's by single- and double-stranded oligomeric compounds
US7892793B2 (en) 2002-11-04 2011-02-22 University Of Massachusetts Allele-specific RNA interference
US20060041022A1 (en) 2002-11-06 2006-02-23 Pasinetti Giulio M Treatment of amyotrophic lateral sclerosis with nimesulide
US7169612B2 (en) 2002-11-11 2007-01-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure
EP1418185A1 (en) 2002-11-11 2004-05-12 Aventis Pharma Deutschland GmbH Use of EDG2 receptor in an animal model of heart failure
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US7618948B2 (en) 2002-11-26 2009-11-17 Medtronic, Inc. Devices, systems and methods for improving and/or cognitive function through brain delivery of siRNA
WO2005017127A2 (en) 2003-02-21 2005-02-24 The Penn State Research Foundation Rna interference compositions and methods
WO2004075861A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Children's Hospital, Inc. Recombinant adeno-associated virus production
WO2004083441A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Random peptide library displayed on aav vectors
WO2004108922A2 (en) 2003-04-25 2004-12-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of aav comprising a capsid protein from aav7 or aav8 for the delivery of genes encoding apoprotein a or e genes to the liver
US8927269B2 (en) 2003-05-19 2015-01-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Avian adenoassociated virus and uses thereof
ES2521682T3 (es) 2003-05-21 2014-11-13 Genzyme Corporation Procedimientos para producir preparaciones de viriones de AAV recombinantes sustancialmente exentas de cápsidas vacías
PL1633767T3 (pl) 2003-06-02 2019-07-31 University Of Massachusetts Sposoby i kompozycje do kontrolowania wydajności wyciszania rna
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
WO2005001043A2 (en) 2003-06-02 2005-01-06 University Of Massachusetts METHODS AND COMPOSITIONS FOR ENHANCING THE EFFICACY AND SPECIFICITY OF FNAi
EP1486567A1 (en) 2003-06-11 2004-12-15 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved adeno-associated virus (AAV) vector for gene therapy
JP4888876B2 (ja) 2003-06-13 2012-02-29 田平 武 アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター
PL1633772T3 (pl) 2003-06-19 2016-10-31 Wiriony AAV o zmniejszonej immunoreaktywności i ich zastosowanie
US7291498B2 (en) 2003-06-20 2007-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US7491508B2 (en) 2003-06-20 2009-02-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses
US9441244B2 (en) 2003-06-30 2016-09-13 The Regents Of The University Of California Mutant adeno-associated virus virions and methods of use thereof
WO2005007875A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 University Of Massachusetts Enhanced promoters for synthesis of small hairpin rna
ES2391975T3 (es) 2003-07-25 2012-12-03 Genvec, Inc. Vacunas a base de vector adenovírico
US7683036B2 (en) 2003-07-31 2010-03-23 Regulus Therapeutics Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding RNAs
WO2005019828A1 (en) 2003-08-20 2005-03-03 Amorfix Life Sciences Ltd. Epitope protection assay and method for detecting protein conformations
EP2821085B1 (en) 2003-09-12 2020-04-29 University of Massachusetts Rna interference for the treatment of gain-of-function disorders
US20050064489A1 (en) 2003-09-24 2005-03-24 Zhang Fang Liang Engineered U6 and H1 promoters
JP5054975B2 (ja) 2003-09-30 2012-10-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア アデノ随伴ウイルス（ａａｖ）の同源系統群、配列、それらを含有するベクターおよびそれらの用途
CN1926551B (zh) 2003-10-27 2010-06-16 罗斯塔生化科技有限责任公司 用于基因沉默的siRNA的设计方法
WO2005062937A2 (en) 2003-12-22 2005-07-14 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of single and double blunt-ended sirna
ATE508190T1 (de) 2004-03-05 2011-05-15 Benitec Inc Mehrfachpromotor-expressionskassetten zurgleichzeitigen zuführung von rnai-agentien
WO2005096781A2 (en) 2004-04-06 2005-10-20 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating gain-of-function disorders using rna interference
EP1742668B1 (en) 2004-04-28 2011-02-09 The Trustees of The University of Pennsylvania Sequential delivery of immunogenic molecules via adenovirus and adeno-associated virus-mediated administrations
GB0412072D0 (en) * 2004-05-28 2004-06-30 Syngenta Participations Ag Chemical compounds
ES2647477T3 (es) 2004-06-01 2017-12-21 Genzyme Corporation Composiciones y métodos para prevenir la agregación del vector AAV
US7815623B2 (en) 2004-10-05 2010-10-19 Genzyme Corporation Stepped cannula
US7901921B2 (en) 2004-10-22 2011-03-08 Oncolytics Biotech Inc. Viral purification methods
EP2189469B1 (en) 2004-11-18 2015-09-16 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Multicistronic siRNA constructs to inhibit tumors
CN1286981C (zh) 2004-11-30 2006-11-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
AU2005316476A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
WO2006066203A2 (en) * 2004-12-16 2006-06-22 Alsgen, Llc Small interfering rna (sirna) molecules for modulating superoxide dismutase (sod)
JP4292416B2 (ja) 2005-01-12 2009-07-08 住友電気工業株式会社 超電導ケーブルの端末構造
US7803611B2 (en) 2005-02-03 2010-09-28 Benitec, Inc. RNAi expression constructs
US8614101B2 (en) 2008-05-20 2013-12-24 Rapid Pathogen Screening, Inc. In situ lysis of cells in lateral flow immunoassays
US7625570B1 (en) 2005-03-10 2009-12-01 The Regents Of The University Of California Methods for purifying adeno-associated virus
WO2006102072A2 (en) 2005-03-23 2006-09-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a pa131 polypeptide in treatment of atherosclerosis
JP5702519B2 (ja) 2005-04-07 2015-04-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア Ａａｖベクターの機能を上げる方法
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
CN107007842A (zh) 2005-05-02 2017-08-04 建新公司 神经代谢疾病的基因治疗
WO2007022470A2 (en) 2005-08-18 2007-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating neurological disease
US9089667B2 (en) 2005-08-23 2015-07-28 The Regents Of The University Of California Reflux resistant cannula and system for chronic delivery of therapeutic agents using convection-enhanced delivery
EP1857552A1 (en) 2006-05-20 2007-11-21 Cargill Incorporated Thermostable xylose isomerase enzyme
EP2311967B1 (en) 2005-10-20 2017-09-20 UniQure IP B.V. Improved AAV vectors produced in insect cells
US7887803B2 (en) 2005-12-02 2011-02-15 Amorfix Life Sciences Methods and compositions to treat misfolded-SOD1 mediated diseases
US7794692B2 (en) 2005-12-02 2010-09-14 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions for detecting amyotrophic lateral sclerosis
EP1986609A2 (en) 2006-01-26 2008-11-05 University of Massachusetts Rna silencing agents for use in therapy and nanotransporters for efficient delivery of same
US7867484B2 (en) 2006-01-27 2011-01-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
EP1979485A2 (en) 2006-01-31 2008-10-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Self-complementary parvoviral vectors, and methods for making and using the same
WO2007098607A1 (en) 2006-03-03 2007-09-07 Amorfix Life Sciences Ltd. Methods and compositions to treat and detect misfolded-sod1 mediated diseases
WO2007120542A2 (en) 2006-03-30 2007-10-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid library and aav capsid proteins
ES2715625T3 (es) 2006-04-03 2019-06-05 Roche Innovation Ct Copenhagen As Composición farmacéutica que comprende oligonucleótidos antisentido anti-miARN
DE602007004470D1 (de) 2006-04-28 2010-03-11 Univ Pennsylvania Modifiziertes adenovirus-hexon-protein und anwendungen davon
US20090317417A1 (en) 2006-04-28 2009-12-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified AAV Vectors Having Reduced Capsid Immunogenicity and Use Thereof
ES2400235T3 (es) 2006-04-28 2013-04-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Método de producción escalable de AAV
US20080003565A1 (en) 2006-05-02 2008-01-03 Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Viral nucleic acid microarray and method of use
AU2007257093A1 (en) 2006-05-05 2007-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression of PCSK9
ES2378333T3 (es) 2006-05-25 2012-04-11 Sangamo Biosciences, Inc. Métodos y composiciones para la inactivación de genes
RU2457252C2 (ru) 2006-06-21 2012-07-27 Амстердам Молекьюла Терапьютикс (Амт) Ип Б.В. AAV ВЕКТОРЫ С УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫМИ Rep-КОДИРУЮЩИМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫМИ В СИСТЕМАХ ПРОДУКЦИИ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ
WO2008011636A2 (en) 2006-07-21 2008-01-24 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
US8945918B2 (en) 2006-08-24 2015-02-03 Virovek, Inc. Expression in insect cells of genes with overlapping open reading frames, methods and compositions therefor
FR2905806B1 (fr) 2006-09-13 2008-12-26 Valeo Equip Electr Moteur Arbre de rotor a griffes, rotor a griffes equipe d'un tel arbre et machine electrique tournante equipee d'un tel rotor
HUE031182T2 (en) 2006-10-03 2017-06-28 Genzyme Corp Gene therapy for spinal muscle atrophy
US7794443B2 (en) 2006-10-24 2010-09-14 Medtronic, Inc. System and method for intraparenchymal drug infusion
WO2008067480A2 (en) 2006-11-29 2008-06-05 Nationwide Children's Hospital Myostatin inhibition for enhancing muscle and/or improving muscle function
US8227592B2 (en) 2006-11-29 2012-07-24 University Of Iowa Research Foundation Alternative export pathways for vector expressed RNA interference
US8173614B2 (en) 2007-01-03 2012-05-08 Medtronic, Inc. Therapeuting compositions comprising an RNAi agent and a neurotrophic factor and methods of use thereof
US8183219B2 (en) 2007-01-03 2012-05-22 Medtronic, Inc. Therapeuting compositions comprising an RNAi agent and a neurotrophic factor and methods of use thereof
WO2008094516A2 (en) 2007-01-29 2008-08-07 City Of Hope Multi-targeting short interfering rnas
WO2008097503A2 (en) 2007-02-02 2008-08-14 Biogen Idec Ma Inc. Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
EP3492596A1 (en) 2007-04-09 2019-06-05 University of Florida Research Foundation, Inc. Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
WO2008128251A1 (en) 2007-04-17 2008-10-23 The Children's Hospital Of Philadelphia Humanized viral vectors and methods of use thereof
US20090036395A1 (en) 2007-04-26 2009-02-05 Davidson Beverly L Rna interference suppression of neurodegenerative diseases and methods of use thereof
EP2158211B1 (en) 2007-05-31 2016-08-10 Medigene AG Mutated structural protein of a parvovirus
AU2008260103B2 (en) 2007-05-31 2014-04-03 University Of Iowa Research Foundation Reduction of off-target RNA interference toxicity
EP2012122A1 (en) 2007-07-06 2009-01-07 Medigene AG Mutated parvovirus structural proteins as vaccines
US8841437B2 (en) 2008-06-20 2014-09-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Precursor miRNA loop-modulated target regulation
KR101183764B1 (ko) 2007-06-29 2012-09-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 프로모터
CA2728575A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Boston Biomedical, Inc. Enabling the use of long dsrna for gene targeting in mammalian and other selected animal cells
EP3121190A1 (en) 2007-07-14 2017-01-25 University of Iowa Research Foundation Methods and compositions for treating brain diseases
EP2019143A1 (en) 2007-07-23 2009-01-28 Genethon CNS gene delivery using peripheral administration of AAV vectors
WO2009014445A2 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Baculoviral vectors comprising repeated coding sequences with differential codon biases
CA2735166C (en) 2007-08-27 2020-12-01 Boston Biomedical, Inc. Compositions of asymmetric interfering rna and uses thereof
EP2198016B1 (en) 2007-09-04 2015-05-27 Her Majesty The Queen In Right of Canada as represented by The Minister of Health Porcine adeno-associated viruses
WO2009038462A1 (en) 2007-09-19 2009-03-26 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Use of aav replication machinery for improved protein production
EP2058401A1 (en) 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
WO2009051421A2 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Lg Electronics Inc. Method and system for transmitting and receiving signals
CN101883858B (zh) 2007-11-28 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴亚家族E腺病毒SAdV-39、-25.2、-26、-30、-37和-38及其应用
MX2010005860A (es) 2007-11-28 2010-06-22 Univ Pennsylvania Adenovirus simianos de la subfamilia c sadv-40, sadv-31 y sadv-34 y usos de los mismos.
BRPI0822651A2 (pt) 2007-11-28 2014-10-14 Univ Pennsylvania Subfamília b de adenovírus sadv-28, -27, 29, -32, -33 e -35 de símio e seus usos
US8480626B2 (en) 2007-11-30 2013-07-09 Medtronic, Inc. Infusion catheter assembly with reduced backflow
EP2247617B1 (en) 2008-01-18 2013-02-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for targeting polyubiquitin
CA2713338C (en) 2008-01-29 2021-10-26 Applied Genetic Technologies Corporation Recombinant virus production using mammalian cells in suspension
EP3643782A1 (en) * 2008-02-11 2020-04-29 Phio Pharmaceuticals Corp. Modified rnai polynucleotides and uses thereof
WO2009104964A1 (en) 2008-02-19 2009-08-27 Amsterdam Molecular Therapeutics B.V. Optimisation of expression of parvoviral rep and cap proteins in insect cells
CN102016011B (zh) 2008-03-04 2013-12-11 宾夕法尼亚大学托管会 猿猴腺病毒sadv-36、-42.1、-42.2和-44及其应用
US8632764B2 (en) 2008-04-30 2014-01-21 University Of North Carolina At Chapel Hill Directed evolution and in vivo panning of virus vectors
WO2009134681A2 (en) 2008-04-30 2009-11-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav7 viral vectors for targeted delivery of rpe cells
CN102159713A (zh) 2008-05-20 2011-08-17 Eos神经科学公司 用于递送光敏蛋白的载体和使用方法
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
US8951979B2 (en) 2008-06-13 2015-02-10 Cornell University Pain treatment using ERK2 inhibitors
US20110171262A1 (en) 2008-06-17 2011-07-14 Andrew Christian Bakker Parvoviral capsid with incorporated gly-ala repeat region
US8945885B2 (en) 2008-07-03 2015-02-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Minicircle DNA vector preparations and methods of making and using the same
JP5328244B2 (ja) 2008-07-07 2013-10-30 株式会社ニュージェン・ファーマ 筋萎縮性側索硬化症治療剤
WO2010011346A1 (en) 2008-07-24 2010-01-28 Rxi Pharmaceuticals Corporation Rnai constructs and uses therof
WO2010014857A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 University Of Massachusetts Chromosome therapy
US8664189B2 (en) 2008-09-22 2014-03-04 Rxi Pharmaceuticals Corporation RNA interference in skin indications
WO2010036118A1 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) B.V. Porphobilinogen deaminase gene therapy
AU2009308293B2 (en) 2008-10-22 2015-02-05 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
US8940290B2 (en) 2008-10-31 2015-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50 and uses thereof
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
PT2403867T (pt) 2009-03-04 2019-08-29 Deutsches Krebsforsch Proteína de ativação de montagem (aap) e a sua utilização para o fabrico de partículas de parvovírus essenciais consistindo de vp3
CN102448501A (zh) 2009-03-27 2012-05-09 西马生物医学计划公司 治疗肝硬化和肝纤维化的方法和组合物
CN102439157B (zh) 2009-04-30 2015-09-16 宾夕法尼亚大学托管会 包含腺伴随病毒构建体的靶向传导气道细胞组合物
WO2010138263A2 (en) 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof
EP2435575A2 (en) 2009-05-28 2012-04-04 Deutsches Krebsforschungszentrum Modified aav capsid polypeptides
EP2435559A1 (en) 2009-05-29 2012-04-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus 41 and uses thereof
CA3077531C (en) 2009-06-16 2022-09-20 Genzyme Corporation Improved methods for purification of recombinant aav vectors
WO2011005786A2 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing production of a biological product
WO2011008348A2 (en) 2009-07-15 2011-01-20 Calimmune Inc. Dual vector for inhibition of human immunodeficiency virus
EP2292781A1 (en) 2009-08-17 2011-03-09 Genethon Baculovirus-based production of biopharmaceuticals free of contaminating baculoviral virions
WO2011038187A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Controlled adeno-associated virus (aav) diversification and libraries prepared therefrom
BR112012010866A2 (pt) 2009-11-09 2016-11-29 Genepod Therapeutics Ab "nova construção de vetor viral para síntese específica otimizada contínua de dopa por neurônios in vivo".
EP2508603B1 (en) 2009-11-19 2015-05-13 National University Corporation Okayama University System for increasing gene expression, and vector supporting said system
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2011088081A1 (en) 2010-01-12 2011-07-21 The University Of North Carolina At Chapel Hill Restrictive inverted terminal repeats for viral vectors
WO2011097456A2 (en) 2010-02-05 2011-08-11 The University Of North Carolina At Chapel Hill Compositions and methods for enhanced parvovirus transduction
US9163261B2 (en) 2010-02-22 2015-10-20 Koteswara Rao KOLLIPARA Adeno-associated virus 2/8—micro RNA-101 therapy for liver cancer
US9228174B2 (en) 2010-03-11 2016-01-05 Uniqure Ip B.V. Mutated rep encoding sequences for use in AAV production
EP2550021A2 (en) 2010-03-22 2013-01-30 Association Institut de Myologie Methods of increasing efficiency of vector penetration of target tissue
US9315825B2 (en) * 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
US20130023033A1 (en) 2010-03-29 2013-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
WO2011122950A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Amsterdam Molecular Therapeutics (Amt) Ip B.V. Monomeric duplex aav vectors
EP3444346B1 (en) 2010-04-23 2022-07-27 University of Massachusetts Aav-based treatment of cholesterol-related disorders
US9546369B2 (en) 2010-04-23 2017-01-17 University Of Massachusetts Multicistronic expression constructs
EP2826860B1 (en) 2010-04-23 2018-08-22 University of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
US8927514B2 (en) 2010-04-30 2015-01-06 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
US9839696B2 (en) 2010-04-30 2017-12-12 City Of Hope Recombinant adeno-associated vectors for targeted treatment
WO2012029994A1 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Kyoto University Pharmaceutical composition for prevention and treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US8808684B2 (en) 2010-09-10 2014-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Epidermal growth factor receptor (EGFR) and methods of use in adenoviral-associated virus type 6 (AAV6) transduction
EP2612909B1 (en) 2010-10-05 2015-02-25 Takara Bio, Inc. Method for producing virus vector
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012057363A1 (ja) 2010-10-27 2012-05-03 学校法人自治医科大学 神経系細胞への遺伝子導入のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
WO2012064920A1 (en) 2010-11-11 2012-05-18 University Of Miami Methods, compositions, cells, and kits for treating ischemic injury
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
ES2739804T3 (es) 2011-02-12 2020-02-04 Univ Iowa Res Found Compuestos terapéuticos
ES2724800T3 (es) 2011-02-17 2019-09-16 Univ Pennsylvania Composiciones y métodos para alterar la especificidad de tejido y mejorar la transferencia génica mediada por AAV9
GB201103062D0 (en) 2011-02-22 2011-04-06 Isis Innovation Method
EP2500434A1 (en) 2011-03-12 2012-09-19 Association Institut de Myologie Capsid-free AAV vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
EP2700399B1 (en) 2011-04-18 2017-05-31 National Center of Neurology and Psychiatry Drug delivery particles and method for producing same
EP2699688A1 (en) 2011-04-20 2014-02-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regimens and compositions for aav-mediated passive immunization of airborne pathogens
US9226976B2 (en) 2011-04-21 2016-01-05 University Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating alpha-1 anti-trypsin deficiencies
RS60207B1 (sr) 2011-04-22 2020-06-30 Univ California Adeno-povezani virioni virusa sa varijantama kapsida i postupci za njihovu primenu
WO2012149646A1 (en) 2011-05-05 2012-11-08 Sunnybrook Research Institute Mirna inhibitors and their uses
US9249425B2 (en) 2011-05-16 2016-02-02 The Trustees Of The University Of Pennslyvania Proviral plasmids and production of recombinant adeno-associated virus
WO2012159006A2 (en) 2011-05-18 2012-11-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Polypeptides and vectors for targeting her2/neu expressing cells and uses thereof
AU2012266754B2 (en) 2011-06-06 2016-04-21 Biocartis Nv Selective lysis of cells by ionic surfactants
US20130019580A1 (en) 2011-07-20 2013-01-24 Anderson Noel W Bidirectional harvesting system
EP3290055A3 (en) 2011-07-25 2018-05-30 Nationwide Children's Hospital, Inc. Recombinant virus products and methods for inhibition of expression of dux4
IN2014CN00688A (ko) 2011-07-27 2015-04-03 Genethon
US8852911B2 (en) 2011-08-04 2014-10-07 The Regents Of The University Of California Method of producing dicer
ES2558168T3 (es) 2011-09-08 2016-02-02 Uniqure Ip B.V. Eliminación de virus contaminantes en preparaciones AVV
US9056892B2 (en) 2011-09-09 2015-06-16 University Of Washington Retrograde transport peptide and use of same for delivery to central nervous system
US9441206B2 (en) 2011-10-28 2016-09-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Cell line for production of adeno-associated virus
EP3539568A1 (en) 2011-11-22 2019-09-18 The Children's Hospital of Philadelphia Virus vectors for highly efficient transgene delivery
WO2013078199A2 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Children's Medical Center Corporation Methods for enhanced in vivo delivery of synthetic, modified rnas
WO2013103896A1 (en) 2012-01-06 2013-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cardiovascular or renal diseases
HUE036640T2 (hu) 2012-02-14 2018-07-30 Univ California Parakrin gének szisztémás bejuttatása és szabályozott expressziója szív és érrendszeri betegségekre és egyéb állapotokra
ES2752191T3 (es) 2012-02-17 2020-04-03 Childrens Hospital Philadelphia Composiciones y métodos con vectores de AAV para la transferencia de genes a células, órganos y tejidos
IN2014DN08812A (ko) 2012-04-18 2015-05-22 Philadelphia Children Hospital
EP2660325A3 (en) 2012-05-02 2014-02-12 Christian Medical College AAV vectors and corresponding nucleotide sequences and methods
US9163259B2 (en) 2012-05-04 2015-10-20 Novartis Ag Viral vectors for the treatment of retinal dystrophy
US9677088B2 (en) 2012-05-09 2017-06-13 Oregon Health & Science University Adeno associated virus plasmids and vectors
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
TWI775096B (zh) 2012-05-15 2022-08-21 澳大利亞商艾佛蘭屈澳洲私營有限公司 使用腺相關病毒(aav)sflt-1治療老年性黃斑部退化(amd)
AU2013262626B2 (en) 2012-05-18 2018-11-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1302, A1320, A1331 and A1337 and uses thereof
WO2013177367A2 (en) 2012-05-23 2013-11-28 The Johns Hopkins University Compounds and methods of use thereof for treating neurodegenerative disorders
AU2013287261B2 (en) 2012-07-06 2019-03-07 University Of Iowa Research Foundation Modified adeno-associated virus vector compositions
CN104603272B (zh) 2012-07-06 2017-11-07 宝生物工程株式会社 能够产生腺伴随病毒载体的细胞
EP2875133B1 (en) 2012-07-17 2018-01-10 Université de Genève Nucleic acids for down-regulation of gene expression
ES2684222T3 (es) 2012-08-01 2018-10-01 Nationwide Children's Hospital Administración intratecal de virus adenoasociado 9 recombinante
JP2015529685A (ja) 2012-09-17 2015-10-08 ザ・リサーチ・インスティテュート・アット・ネイションワイド・チルドレンズ・ホスピタルＴｈｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｔｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ 筋萎縮性側索硬化症の処置のための組成物および方法
WO2014052789A1 (en) 2012-09-28 2014-04-03 The University Of North Carolina At Chapel Hill Aav vectors targeted to oligodendrocytes
US20140243783A1 (en) 2012-10-06 2014-08-28 Raghu Raghavan Method of backflow reduction during material delivery through a needle into tissue
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2014071042A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for identifying candidates for the treatment of neurodegenerative diseases
AU2013337651B2 (en) 2012-11-01 2018-12-13 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
EP2931897B1 (en) 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
US9938541B2 (en) 2012-12-25 2018-04-10 Takara Bio Inc. AAV variant
CA2897444A1 (en) 2013-01-08 2014-07-17 Genzyme Corporation Use of inos inhibitors to increase viral yield in culture
SG10201705518SA (en) 2013-01-08 2017-08-30 Benitec Biopharma Ltd Age-Related Macular Degeneration Treatment
EP2954051B1 (en) 2013-02-08 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified aav8 capsid for gene transfer for retinal therapies
WO2014160092A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The Children's Hospital Of Philadelphia Adeno-associated virus vectors and methods of use thereof
WO2014143932A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The University Of North Carolina At Chapel Hill Synthetic adeno-associated virus inverted terminal repeats
US9428537B2 (en) 2013-03-15 2016-08-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA derived small RNAs (tsRNAs) involved in cell viability
CN105612253A (zh) 2013-03-15 2016-05-25 费城儿童医院 含有填充者/填充物多核苷酸序列的载体及其制备方法
JP6516725B2 (ja) 2013-04-08 2019-05-22 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン キメラアデノ随伴ウイルス／ボカウイルスパルボウイルスベクター
EP2792742A1 (en) 2013-04-17 2014-10-22 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf (UKE) Gene-therapy vectors for treating cardiomyopathy
AU2014255665B2 (en) 2013-04-18 2018-08-02 Fondazione Telethon Effective delivery of large genes by dual AAV vectors
AU2014253730B2 (en) 2013-04-20 2018-09-13 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Recombinant adeno-associated virus delivery of exon 2-targeted U7snRNA polynucleotide constructs
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
KR20220119187A (ko) 2013-05-15 2022-08-26 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 중추 신경계로의 아데노-연관 바이러스 매개 유전자 전달
US10006049B2 (en) 2013-05-16 2018-06-26 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Hairpin mRNA elements and methods for the regulation of protein translation
US11136557B2 (en) 2013-05-31 2021-10-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
WO2014201308A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 Washington University Endothelial-targeted adenoviral vectors, methods and uses therefor
EP3567112A1 (en) 2013-06-13 2019-11-13 Translate Bio, Inc. Messenger rna based viral production
KR102380265B1 (ko) 2013-07-22 2022-03-29 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 변종 ａａｖ 및 조성물, 세포, 기관 및 조직으로의 유전자 전이를 위한 방법 및 용도
RU2018128780A (ru) 2013-07-26 2018-12-05 Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн Способы и композиции для лечения болезней мозга
ITTO20130669A1 (it) 2013-08-05 2015-02-06 Consiglio Nazionale Ricerche Vettore adeno-associato ricombinante muscolo-specifico e suo impiego nel trattamento di patologie muscolari
KR20160106040A (ko) 2013-08-14 2016-09-09 퀴아젠 맨스필드, 인코퍼레이티드 ｃＭＥＴ 핵산의 멀티모달 분석을 위한 조성물 및 방법
HUE061629T2 (hu) 2013-08-27 2023-07-28 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Termékek és módszerek amyotrophiás lateralis sclerosis kezelésére
WO2015031686A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
EP3561062A1 (en) 2013-09-13 2019-10-30 California Institute of Technology Selective recovery
EP3633041A3 (en) 2013-09-26 2020-07-29 University of Florida Research Foundation, Inc. Synthetic combinatorial aav capsid library for targeted gene therapy
EP3068889B1 (en) 2013-09-26 2019-04-17 Universitat Autònoma De Barcelona Gene therapy compositions for use in the prevention and/or treatment of non-alcoholic fatty liver disease
CN106232618A (zh) 2013-10-11 2016-12-14 马萨诸塞眼科耳科诊所 预测祖先病毒序列的方法及其用途
WO2015060722A1 (en) 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
EP3065784A4 (en) 2013-11-05 2017-05-10 The Research Institute at Nationwide Children's Hospital COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING NF- kB AND SOD-1 TO TREAT AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS
WO2015108610A1 (en) 2013-11-08 2015-07-23 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Adeno-associated virus "x" oncogene
CN105934515B (zh) 2013-11-26 2020-08-04 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 用于治疗糖原贮积病的腺相关病毒载体
KR102245861B1 (ko) 2013-11-29 2021-04-28 다카라 바이오 가부시키가이샤 아데노 수반 바이러스의 정량 방법
US20170002350A1 (en) 2013-12-03 2017-01-05 Agency For Science, Technology And Research Tailed mirtron effectors for rnai-mediated gene silencing
US9732345B2 (en) 2013-12-09 2017-08-15 Baylor College Of Medicine Hippo and dystrophin complex signaling in cardiomyocyte renewal
MX2016007325A (es) 2013-12-12 2017-07-19 Broad Inst Inc Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos.
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
US20150197809A1 (en) 2014-01-13 2015-07-16 Trustees Of Boston University Methods and assays relating to huntingtons disease and parkinson's disease
GB201401707D0 (en) 2014-01-31 2014-03-19 Sec Dep For Health The Adeno-associated viral vectors
GB201403684D0 (en) 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
WO2015124546A1 (en) 2014-02-19 2015-08-27 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii- Cnic Aav vectors for the treatment of ischemic and non-ischemic heart disease
US20170007720A1 (en) 2014-02-21 2017-01-12 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for gene delivery to on bipolar cells
CA2941640A1 (en) 2014-03-04 2015-09-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav vectors and methods for transduction of photoreceptors and rpe cells
US10837027B2 (en) 2014-03-10 2020-11-17 Uniqure Ip B.V. Further improved AAV vectors produced in insect cells
US10280418B2 (en) 2014-03-18 2019-05-07 Univeristy Of Massachusetts RAAV-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
HRP20220798T1 (hr) 2014-04-01 2022-10-14 Biogen Ma Inc. Pripravci za modulaciju ekspresije sod-1
EP2933335A1 (en) 2014-04-18 2015-10-21 Genethon A method of treating peripheral neuropathies and motor neuron diseases
EP3919508A1 (en) 2014-04-25 2021-12-08 The Trustees of The University of Pennsylvania Ldlr variants and their use in compositions for reducing cholesterol levels
WO2015164786A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
US9194250B1 (en) 2014-05-07 2015-11-24 General Electric Company Embedded wireless sensors for turbomachine component defect monitoring
RU2691102C2 (ru) 2014-05-08 2019-06-11 Сангамо Байосайенсиз, Инк. Способы и композиции для лечения болезни хантингтона
WO2015173436A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Vrije Universiteit Brussel Genetic correction of myotonic dystrophy type 1
JP6663859B2 (ja) 2014-05-20 2020-03-13 ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ハンチントン病の治療化合物
EP3160980B1 (en) 2014-05-28 2020-05-20 The Regents of the University of California HYBRID tRNA/pre-miRNA MOLECULES AND METHODS OF USE
US10577627B2 (en) 2014-06-09 2020-03-03 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
US11207424B2 (en) 2014-06-13 2021-12-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for increasing viral vector infectivity
US10781459B2 (en) 2014-06-20 2020-09-22 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods of packaging multiple adeno-associated virus vectors
US10526583B2 (en) 2014-07-02 2020-01-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for purifying recombinant adeno-associated virus
WO2016006658A1 (ja) 2014-07-10 2016-01-14 タカラバイオ株式会社 非エンベロープウイルス粒子の製造方法
JP6872479B2 (ja) 2014-07-31 2021-05-19 アソシアシオン・アンスティテュ・ドゥ・ミオロジーＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅ Ｍｙｏｌｏｇｉｅ 筋萎縮性側索硬化症の処置
WO2016019364A1 (en) 2014-08-01 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for self-regulated inducible gene expression
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
US10711270B2 (en) 2014-10-03 2020-07-14 University Of Massachusetts High efficiency library-identified AAV vectors
WO2016057975A2 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Guided injections for aav gene transfer to muscle
RU2020140209A (ru) 2014-10-21 2021-01-25 Юниверсити Оф Массачусетс Варианты рекомбинантных aav и их применения
US10907130B2 (en) 2014-11-05 2021-02-02 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Methods and materials for producing recombinant viruses in eukaryotic microalgae
WO2016077607A1 (en) 2014-11-13 2016-05-19 The Regents Of The University Of California Adjustable stepped cannula
US10597660B2 (en) 2014-11-14 2020-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
SG11201703419UA (en) 2014-11-14 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
KR20240063169A (ko) 2014-11-21 2024-05-10 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐 중추 신경계에 표적화된 aav 벡터
EP3221456B1 (en) 2014-11-21 2021-09-22 University of Florida Research Foundation, Inc. Genome-modified recombinant adeno-associated virus vectors
FI3224376T4 (fi) 2014-11-28 2023-08-31 Dna-epäpuhtaudet koostumuksessa, joka käsittää parvovirusvirionin
US11697825B2 (en) 2014-12-12 2023-07-11 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scAAV
LT3237618T (lt) 2014-12-24 2019-07-10 Uniqure Ip B.V. Rnri sukeltas hantingtino geno slopinimas
ES2962439T3 (es) 2014-12-30 2024-03-19 Univ Iowa Res Found Agente terapéutico que activa la función mTORC1 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington
CA2972807C (en) 2015-01-14 2024-01-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for targeted gene transfer
MX2017009336A (es) 2015-01-16 2017-11-15 Voyager Therapeutics Inc Polinucleótidos dirigidos al sistema nervioso central.
US20180008727A1 (en) 2015-01-30 2018-01-11 The Regents Of The University Of California Spinal subpial gene delivery system
US20180030096A1 (en) 2015-02-03 2018-02-01 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
PL3256594T3 (pl) 2015-02-10 2022-02-14 Genzyme Corporation Ulepszone dostarczanie cząstek wirusa do prążkowia i kory
BR112017017028A2 (pt) 2015-02-10 2018-04-10 Genzyme Corp rnai variante
WO2016137949A1 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
US20180094280A1 (en) 2015-03-20 2018-04-05 Bluebird Bio, Inc. Vector formulations
ES2860712T3 (es) 2015-03-24 2021-10-05 Univ California Variantes de virus adenoasociados y métodos de uso de las mismas
JP6892433B2 (ja) 2015-04-03 2021-06-23 ユニバーシティ・オブ・マサチューセッツＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ 十分に安定化された非対称ｓｉｒｎａ
DK3277814T3 (da) 2015-04-03 2020-08-24 Univ Massachusetts Oligonukleotidforbindelser til målretning mod huntingtin-mrna
US10081659B2 (en) 2015-04-06 2018-09-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Adeno-associated vectors for enhanced transduction and reduced immunogenicity
TWI707951B (zh) 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
ES2763551T3 (es) 2015-04-16 2020-05-29 Univ Emory Promotores y vectores recombinantes para la expresión de proteínas en el hígado y uso de los mismos
WO2016172155A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 University Of Massachusetts Modulation of aav vector transgene expression
WO2016172008A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 University Of Massachusetts Modified aav constructions and uses thereof
US20160346359A1 (en) 2015-05-01 2016-12-01 Spark Therapeutics, Inc. Adeno-associated Virus-Mediated CRISPR-Cas9 Treatment of Ocular Disease
CA2985223A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods of delivering an agent to the eye
AU2016262467B2 (en) 2015-05-11 2020-09-10 Alcyone Therapeutics, Inc. Drug delivery systems and methods
JP6805174B2 (ja) 2015-05-12 2020-12-23 アメリカ合衆国 神経成長因子シグナルペプチド及び副甲状腺ホルモンを含むａａｖ分離株及び融合タンパク質
US20170067028A1 (en) 2015-05-15 2017-03-09 Douglas J. Ballon Radiolabeling of adeno associated virus
WO2016191418A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Salk Institute For Biological Studies Motor neuron-specific expression vectors
US11027024B2 (en) 2015-05-29 2021-06-08 University Of Iowa Research Foundation Methods of delivery of transgenes for treating brain diseases
RU2761564C9 (ru) 2015-05-29 2022-03-17 Дзе Трастиз Оф Дзе Юнивёрсити Оф Пенсильвания Композиции и способы деградации неправильно упакованных белков
WO2017004514A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant adeno-associated virus vectors to target medullary thyroid carcinoma
US20170009304A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Splicingcodes.Com Method and kit for detecting fusion transcripts
US20170007669A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peptide-mediated delivery of active agents across the blood-brain barrier
WO2017005806A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for expressing a polynucleotide of interest in the peripheral nervous system of a subject
WO2017015102A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for achieving high levels of transduction in human liver cells
WO2017019876A1 (en) 2015-07-28 2017-02-02 University Of Massachusetts Transgenic expression of dnase i in vivo delivered by an adeno-associated virus vector
US10738087B2 (en) 2015-07-30 2020-08-11 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Ancestral virus sequences and uses thereof
US20180201937A1 (en) 2015-08-04 2018-07-19 The University Of Chicago Inhibitors of cacna1a/alpha1a subunit internal ribosomal entry site (ires) and methods of treating spinocerebellar ataxia type 6
US10047377B2 (en) 2015-09-22 2018-08-14 Loyola University Of Chicago Methods for modulating KLHL1 levels, methods for modulating current activity in T-type calcium channels, molecules therefor, and methods for identifying molecules therefor
PT3356390T (pt) 2015-09-28 2021-04-21 Univ Florida Métodos e composições para vetores virais que se evadem a anticorpos
US11473084B2 (en) 2015-10-09 2022-10-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating Huntington's disease and related disorders
EP3359665A2 (en) 2015-10-09 2018-08-15 Genzyme Corporation Improved flare (flow cytometry attenuated reporter expression) technology for rapid bulk sorting
US10123969B2 (en) 2015-10-15 2018-11-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Osmotic enhancement of drug/therapeutic delivery to the brain following infusion or injection into the cerebrospinal fluid
CA3002982A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance in neurodegenerative disease
CA3002980A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
US20200181644A1 (en) 2015-10-22 2020-06-11 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Synthetic combinatorial aav3 capsid library
US20180236105A1 (en) 2015-10-23 2018-08-23 University Of Iowa Research Foundation Methods for treating neurodegenerative diseases using gene therapy to delay disease onset and progression while providing cognitive protection
WO2017075335A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Voyager Therapeutics, Inc. Regulatable expression using adeno-associated virus (aav)
WO2017079768A1 (en) 2015-11-08 2017-05-11 Genentech, Inc. Methods of screening for multispecific antibodies
US10633662B2 (en) 2015-11-10 2020-04-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating AAV infection
CN108603174A (zh) 2015-12-01 2018-09-28 星火治疗有限公司 在适用于临床应用的无血清悬浮细胞培养体系中产生重组腺相关病毒(aav)载体的可扩展方法
US20170151416A1 (en) 2015-12-01 2017-06-01 Invivo Therapeutics Corporation Methods and Systems for Delivery of a Trail of a Therapeutic Substance into an Anatomical Space
WO2017096164A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Novel recombinant adeno-associated virus capsids with enhanced human skeletal muscle tropism
US10406244B2 (en) 2015-12-02 2019-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University AAV vectors with expanded packaging capacity
EP3383896A1 (en) 2015-12-03 2018-10-10 Genethon Compositions and methods for improving viral vector efficiency
CN108699565B (zh) 2015-12-11 2023-08-08 加州理工学院 用于定向腺相关病毒(aav)的靶向肽
US11098286B2 (en) 2015-12-11 2021-08-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAV9
WO2017100674A1 (en) 2015-12-11 2017-06-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for aav1
US11028372B2 (en) 2015-12-11 2021-06-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Scalable purification method for AAVRH10
ES2934848T3 (es) 2015-12-11 2023-02-27 Univ Pennsylvania Método de purificación escalable para AAV8
JP7406783B2 (ja) 2015-12-14 2023-12-28 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル パルボウイルスベクターの高められた送達のための改変キャプシドタンパク質
WO2017112948A1 (en) 2015-12-24 2017-06-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved aav production using suspension adapted cells
US20190022251A1 (en) 2016-01-15 2019-01-24 Jichi Medical University Adeno-Associated Virus Virions for Treatment of Epilepsy
US11826433B2 (en) 2016-02-02 2023-11-28 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic AAV gene delivery to the central nervous system
CA3012653A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 Emory University Injection of single-stranded or self-complementary adeno-associated virus 9 into the cerebrospinal fluid
US11702672B2 (en) 2016-02-08 2023-07-18 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
CA3014637A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Mark A. Kay Novel recombinant adeno-associated virus capsids resistant to pre-existing human neutralizing antibodies
US20190071681A1 (en) 2016-02-26 2019-03-07 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Aav heparin mutants that display significantly improved eye and brain transduction
DK3423110T3 (da) 2016-03-03 2021-11-15 Univ Massachusetts Lineært duplex-dna med lukket ende til ikke-viral genoverførsel
MX2018010842A (es) 2016-03-07 2019-07-04 Univ Iowa Res Found Expresion mediada por el virus adeno-asociado (aav) usando un promotor y pontenciador sintetico.
WO2017165859A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Modified viral capsid proteins
DK3436593T3 (da) 2016-03-28 2023-02-20 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Fremgangsmåder til varmeinaktivering af adenovirus
EP3436476A4 (en) 2016-03-28 2020-04-29 The Regents of The University of California ANTI-RYK ANTIBODIES AND METHOD FOR USE THEREOF
CN109563496B (zh) 2016-03-30 2023-08-29 星火治疗有限公司 用于重组蛋白和/或病毒载体生产的细胞系
SG11201808354PA (en) 2016-03-31 2018-10-30 Spark Therapeutics Inc Column-based fully scalable raav manufacturing process
CN109661470A (zh) 2016-04-15 2019-04-19 宾夕法尼亚州大学信托人 新型aav8突变衣壳和含有其的组合物
WO2017181162A1 (en) 2016-04-16 2017-10-19 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods of enhancing biological potency of baculovirus system-produced recombinant adeno-associated virus
EP3445381A4 (en) 2016-04-21 2019-10-02 Virovek, Inc. AAV PREPARATION IN INSECT CELLS, METHOD AND COMPOSITIONS THEREFOR
EP3235516B1 (en) 2016-04-22 2019-06-26 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts Universitätsmedizin Regulatable adeno-associated virus (aav) vector
EP3449250B1 (en) 2016-04-28 2020-11-04 Indiana University Research & Technology Corporation Methods and compositions for resolving components of a virus preparation
WO2017189963A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017192699A1 (en) 2016-05-03 2017-11-09 Children's Medical Research Institute Adeno-associated virus polynucleotides, polypeptides and virions
WO2017192750A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Oregon Health & Science University Recombinant adeno-associated viral vectors
SG11201809643UA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
KR102392236B1 (ko) 2016-05-18 2022-05-03 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
JP2020518266A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 調節性ポリヌクレオチド
CN110913866A (zh) 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
US20220090127A1 (en) 2017-06-02 2022-03-24 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm Viral vector combining gene therapy and genome editing approaches for gene therapy of genetic disorders
JP7221275B2 (ja) 2017-08-03 2023-02-13 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａａｖを送達するための組成物および方法
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
JP7502991B2 (ja) 2017-10-16 2024-06-19 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
TW202015742A (zh) 2018-05-15 2020-05-01 美商航海家醫療公司 投遞腺相關病毒（ａａｖ）之組成物和方法
US20210361318A1 (en) 2018-07-02 2021-11-25 Voyager Therapeutics, Inc. Cannula system and use thereof
US20210254103A1 (en) 2018-07-02 2021-08-19 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
WO2020077165A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of aav
WO2020223296A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007109097A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi MODULATION OF TGF-BETA AND THERAPEUTIC USES THEREOF
JP2013143917A (ja) * 2012-01-13 2013-07-25 Mie Univ 線維症予防又は治療剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ann Neurol.,제57권,5호,773-776면(2005.05.) 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210139915A1 (en) 2021-05-13
IL278001A (en) 2020-11-30
SG11201703281RA (en) 2017-05-30
AU2022202979A1 (en) 2022-05-26
MX2017006216A (es) 2018-08-29
US20230332156A1 (en) 2023-10-19
HK1244299A1 (zh) 2018-08-03
JP2017535266A (ja) 2017-11-30
CN114717264A (zh) 2022-07-08
WO2016077687A4 (en) 2016-08-04
RU2020108189A (ru) 2020-03-11
IL251911B (en) 2020-11-30
US10597660B2 (en) 2020-03-24
MX2023007728A (es) 2023-09-11
IL292999A (en) 2022-07-01
WO2016077687A1 (en) 2016-05-19
US11542506B2 (en) 2023-01-03
US20180282732A1 (en) 2018-10-04
JP2024079794A (ja) 2024-06-11
IL278001B (en) 2022-06-01
EP3218484A4 (en) 2018-05-30
AU2015346162B2 (en) 2022-02-10
JP2021007394A (ja) 2021-01-28
CN107109407A (zh) 2017-08-29
CA2967367C (en) 2023-05-16
US20200157547A1 (en) 2020-05-21
RU2017116576A (ru) 2018-11-14
ZA201702991B (en) 2019-12-18
US10920227B2 (en) 2021-02-16
CA2967367A1 (en) 2016-05-19
EP3218484A1 (en) 2017-09-20
KR20230169197A (ko) 2023-12-15
RU2017116576A3 (ko) 2019-04-16
RU2716422C2 (ru) 2020-03-11
JP2022081546A (ja) 2022-05-31
BR112017010087A2 (pt) 2018-06-05
KR102599909B1 (ko) 2023-11-09
AU2015346162A1 (en) 2017-05-11
IL251911A0 (en) 2017-06-29
CA3193811A1 (en) 2016-05-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11542506B2 (en) Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
US20230295663A1 (en) Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
CN109831916B (zh) 治疗亨廷顿氏舞蹈病的组合物和方法
JP7502991B2 (ja) 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
AU2018261003A1 (en) Compositions and methods of treating Huntington&#39;s Disease
CN112567035A (zh) 肌萎缩侧索硬化症及脊髓相关病症的治疗
WO2020223296A1 (en) Treatment of amyotrophic lateral sclerosis and disorders associated with the spinal cord
US20200199625A1 (en) RNAi induced reduction of ataxin-3 for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 3
TW202413649A (zh) 肌萎縮性脊髓側索硬化症(als)之治療

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right