CN101302537A - 一种位点特异整合性慢病毒载体系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异整合性慢病毒载体及其制备方法。该载体系统由FattbC31UGW质粒、CMVΔ8.9－D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成。为了克服慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险，本发明对现有慢病毒载体系统进行了改造，并通过与phiC31整合酶系统结合，获得了位点特异整合性慢病毒载体系统。该病毒载体携带的转基因可稳定整合在宿主基因组特定位点上。作为集有效性、安全性、操作简便性于一体的新型慢病毒载体，本发明一方面可用于鉴定外源基因的功能，尤其是在基因修饰的细胞工程中的作用；另一方面本发明为抑制肿瘤和抗病毒等领域的基因治疗提供了新的更安全更高效的途径。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异整合性慢病毒载体系统及其制备方法。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)属于逆转录病毒亚属，以人类免疫缺陷病毒(human immunodefficiency virus，HIV)为代表.慢病毒不仅具有感染分裂靶细胞并整合其基因组中，尤其是具有感染包括神经元细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和干细胞等在内的多种非分裂细胞能力，因而，慢病毒载体已作为基因转移的有效工具，被广泛应用于基因功能尤其是基因治疗的研究。
基于I型人类免疫缺陷型病毒(human immunodefficiency virus，type1；HIV-1)的慢病毒载体目前已发展到第三代。第一代是复制缺陷型HIV-1的慢病毒载体，仅获得较低的重组滴度，且仅能感染CD4的靶细胞，并存在产生野生性HIV的严重危险。第二代慢病毒载体的一个重要改进，是采用了其它病毒的包膜蛋白基因代替HIV的包膜蛋白基因，构建成假型慢病毒载体(pseudotypelentivirus vector)。该载体含有水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)env蛋白G糖蛋白，使病毒颗粒非特异性地结合于靶细胞的膜磷脂，而不需要特异性膜受体。第三代慢病毒载体，缺失了与病毒包装和感染无关的序列，这些序列通常与病毒复制和致病性有关。第四代慢病毒载体，为自灭活性载体。该类载体将3-LTR中所有参与病毒复制的非必需序列缺失，使其经包装产生的子代重组病毒完全失去了复制能力，因而更安全。然而，同其它病毒如反转录病毒一样，慢病毒的整合是随机的，因而常导致插入突变之风险，该风险巨大阻碍着慢病毒载体系统在基因功能和基因治疗上的广泛地应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种位点特异整合性慢病毒载体系统，以克服慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险，赋予该类载体系统位点特异整合功能；同时，通过改造包装载体，使该载体成为集有效性、安全性和操作简便性于一体的新型慢病毒载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体的制备方法。
本发明的再一个目的是提供一种位点特异整合试剂盒，用于将基因位点特异性整合在基因组中。
本发明提供了一种位点特异性整合慢病毒载体系统，由FattbC31UGW质粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成(其结构示意图分别如图1、2和3所示)；FattbC31UGW质粒是将attB位点序列和位点特异整合酶C31基因序列依次连接并且克隆到FUGW载体的PACI酶切点而得；CMVΔ8.9-D64N/D116N质粒是由CMVΔ8.9质粒中的pol基因D64N和D116N突变而得。
FUGW、pCMVΔ8.9(即CMVΔ8.9质粒)及VSVG来源于美国Carlos Lois博士惠赠。本发明的FUGW慢病毒载体来源于文章：Lois C，et al.Germlinetransmission and tissue-specific expression of transgenes delivered bylentiviral vectors.Science，2002，295：868-72。FUGW以除去有害基因后的HIV作为骨架，表达由泛素(Ubiquitin-C，UBC)调控的绿色荧光蛋白基因(EGFP)；pCMVΔ8.9为包装结构质粒，主要起病毒包装功能，表达酶蛋白形成病毒衣壳结构及整合酶(IN)；VSVG为包膜质粒。
一方面，包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N是由CMVΔ8.9中pol基因(其NCBI登陆号AAC54634)编码的HIV整合酶D64N和D116N双突变而成，使其仅有包装功能而未整合作用。另一方面，FattbC31UGW质粒是由attB位点序列和位点特异整合酶基因C31(即phi C31，其NCBI登陆号AX816372)序列克隆到FUGW载体的pacI酶切点而得到，赋予了该载体位点特异整合的功能。
新型慢病毒载体FattbC31UGW设计策略：FUGW载体与attB位点序列和位点特异整合酶基因phi C31的融合序列Attb-C31经PACI酶切，回收，连接而得到.如下图所示。
新型慢病毒包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N设计策略：编码HIV整合酶基因位于pol基因内，与整合有关残基被定向突变D64N/D116N，以此获得新型未整合活性低的慢病毒包装载体CMVΔ8.9-D64N/D116N如下图所示：
另一方面，本发明还提供了位点特异整合性慢病毒载体系统的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)获得Attb-C31编码序列；
(2)将(1)获得的序列克隆至FUGW载体pacI酶切位点获得质粒FattbC31UGW；
(3)以质粒CMVΔ8.9为模版，将pol基因中的D64N和D116N突变后得到CMVΔ8.9-D64N/D116N；
(4)将FattbC31UGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D116N质粒混合，混合比例为1.5-10∶1-5∶1；即形成如权利要求1所述慢病毒载体系统。
本发明的制备方法中，(1)用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶编码序列。
本发明的制备方法中，克隆序列可以采用PCR，人工合成，酶切等方法实现，拼接序列则可能采用酶切、退火、连接粘性末端等方法实现。
本发明的制备方法(1)中，可以首先将attb序列插入CMV-c31质粒获得重组CMV-Attb-C31质粒，然后用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶编码序列。
例如，合成带有KpnI/speI酶切点的ATTB寡核甘酸序列5-ATAATCGGTACCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCATACTAGTTT-3，经退火酶切回收后克隆到CMVC31质粒，得到重组CMV-ATTB-C31质粒.扩增Attb-C31整合酶编码序列，所用引物含有pacI的酶切位点，PCR产物经酶切后回收。CMV C31质粒来自美国Stanford University的Michele P.Calos教授，文章出自“A phage integrase directs efficient site-specific integrationin human cells，PNAS，2000，97，5995-6000.”
本发明的制备方法(3)中，用定向突变方法获得了HIV整合酶突变的表达载体CMVΔ8.9-D64N/D116N。
例如，以质粒CMVΔ8.9为模版，合成寡核甘酸序列：D64N，F-5-TATGGCAGCTAAATTGTACACATT-3；D64N，R-5AATGTGTACAATTTAGCTGCCATA；D116NF-5-ACAGTACATACAAACAATGGCAGC-3和D116NR-5-GCTGCCATTGTTTGTATGTACTGT。用定向突变试剂盒进行定向突变，克隆经测序证实后得到CMVΔ8.9-D64N/D116N。
本发明的制备方法中，(4)中采用混合质量比可以是5∶4∶3或者4∶3∶2。质粒FattbC31UGW，pCMVΔ8.9-D64N/D116N及VSVG三部分共转染时，三者质量比可以为2∶1.5∶1；如三质粒共转染100CM培养皿，FattbC31UGW，pCMV.Δ8.9-D64/D116N及VSVG所需量可以是10ug，7.5ug和5ug。共转染方法可以通过脂质体，磷酸钙，PEI等。
本发明中，所适用宿主包括各种真核生物。
本发明中，位点特异整合性慢病毒载体系统应用的宿主细胞可以是静止细胞或者分裂细胞。其中，静止细胞可以是神经元细胞、胶质细胞或者成体干细胞和胚胎干细胞。本发明中，静止期细胞也可以是原代细胞。
本发明还提供了一种位点特异性整合试剂盒，该载体试剂盒中含有上述慢病毒包装载体系统。本发明的载体系统可将所携带核酸片段稳定整合于宿主基因组假attP位点。
该载体试剂盒中除了含有上述FattbC31UGW质粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG，还可以含有常见的缓冲液，使用说明等。
本发明的位点特异整合性慢病毒载体系统，不仅在哺乳动物细胞中证实了该载体系统具有感染神经元细胞、胶质细胞、巨噬细胞、肝细胞、心肌细胞和各种干细胞等在内的多种非分裂或静止期细胞能力，而且，病毒载体携带的转基因在C31整合酶介导下可稳定整合在基因组假attP位点上；但由于C31整合酶基因整合使其失去LTR的调控作用而失活，因而，可避免C31整合酶过表达对细胞的毒性。本发明的位点特异整合性慢病毒感染细胞后进行整合分析，其结果显示本发明的位点特异整合性慢病毒载体可插入在基因组假attP位点上。
本发明对现有慢病毒载体系统进行了改造，获得了位点特异整合性慢病毒载体。经该病毒载体携带的转基因可稳定整合在宿主基因组特定位点上，克服了慢病毒载体系统随机整合导致插入突变之风险。本发明一方面可用于鉴定外源基因的功能，尤其是在原代细胞等非分裂细胞中的作用；另一方面本发明为抑制肿瘤和抗病毒等领域的基因治疗提供了新的更安全更高效的途径。
附图说明
图1.FattbC31UGW载体结构示意图。
图2.VSVG载体结构示意图。
图3.pCMVΔ8.9-D64N/D116N结构示意图。
图4FattbC31UGW感染细胞结果示意图。显示绿色荧光处(高亮显示处)为感染成功的细胞。
具体实施方式
实施例1新型慢病毒包装载体CMVΔ8.9-D64N/D64N制备方法
合成寡核甘酸序列D64N，F-5-TATGGCAGCTAAATTGTACACATT-3，D64N，R-5-AATGTGTACAATTTAGCTGCCATA；D 116NF-5-ACAGTACATACAAACAATGGCAGC-3和D116NR-5-GCTGCCATTGTTTGTATGTACTGT-3，以质粒CMVΔ8.9为模版，用定向突变试剂盒进行定向突变，酶切鉴定，并序列分析正确.获得CMVΔ8.9-D64N/D116N。
实施例2位点特异整合性慢病毒载体的制备
合成带有KpnI/speI酶切点的ATTB寡核甘酸序列5-ATAATCGGTACCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCATACTAGTTT-3，经退火酶切回收后克隆到CMVC31质粒，得到CMV-ATTB-C31质粒.扩增Attb-C31整合酶编码序列，所用引物含有pacI的酶切位点，PCR产物经酶切后回收.
实施例3被质粒CMVΔ8.9-D64N/D64N包装的位点特异整合性慢病毒制备
将FattbC31UGW载体，与包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D64N和包膜质粒(VSVG)以2∶1∶1质量比例混合。利用脂质体LipofectamineTM在293T细胞上进行转染，24-48h后在荧光显微镜下观察，出现大量荧光后收集病毒上清，收集的病毒上清浓缩后分装备用或立即使用.重组慢病毒活性测定时，将浓缩后的病毒贮存液作不同比例稀释，感染细胞48h后在荧光显微镜下进行荧光计数，确定滴度。FUGW载体作为对照。结果显示，位点特异整合性慢病毒滴度为6.8*10-7TU/ml。
实施例4位点特异整合性慢病毒系统感染细胞分析
将上述1ul整合性慢病毒FattbC31UGW感染6孔板上293细胞系.72h后在荧光显微镜下进行观察，结果显示，293系细胞可见绿色荧光；感染效率为82.1％.细胞经传代后6天，发现293系细胞荧光计数百分比未有改变。该结果说明了位点特异整合性慢病毒FattbC31UGW，在phiC31整合酶介导下可整合到细胞基因组中。
实施例5FattbC31UGW慢病毒感染细胞后位点特异整合分析
抽提上述被感染细胞基因组DNA，用PCR和序列分析方法鉴定是否病毒基因组位点特异整合假attP位点，引物psaF：5’-GATATGGGAGGCCACAGTTG-3’(见SEQ ID NO 1)；C31R：5’-ATGCCCGACGAACCTGAACCGGC-3’(见SEQ ID NO 2)。结果显示，FattbC31UGW慢病毒感染293系细胞，能扩增出287bp的条带。序列分析见SEQ ID NO 3，其中包括宿主基因组假attP位点序列(见SEQ ID NO 3中nt1-97)、attB序列(见SEQ ID NO 3中nt98-127)和C31序列(见SEQ IDNO 3中自nt127以后序列)的一部分。这说明FattbC31UGW慢病毒感染细胞后特异整合在假attP位点上。
序列表
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<222>(1)..(97)
<223>
<220>
<221>attb
<222>(98)..(127)
<223>
<220>
<221>c31
<222>(128)..(287)
<223>
<400>3
gatatgggag gccacagttg agatgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttcccttggg ctccccgggc gcgtactcca 120
tactagtatg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccg 180
tcagtcgcgc gagcgcgaga attcgagcgc agcaagccca gcgacacagc gtagcgccaa 240
cgaagacaag gcggccgacc ttcagcgcga agtcgagcgc gacgggg 287
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<400>4
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<212>DNA
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<400>7
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<210>8
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<213>Artificial
<400>8
ataatcggta ccgggtgcca gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta ctccatacta 60
gttt 64
Claims (7)
1.一种位点特异整合性慢病毒载体系统，其特征在于，该载体系统由FattbC31UGW质粒、CMVΔ8.9-D64N/D116N和包膜质粒VSVG组成；FattbC31UGW质粒是将attB位点序列和位点特异整合酶C31基因序列依次连接并且克隆到FUGW载体的pacI酶切点而得；CMVΔ8.9-D64N/D116N质粒是由CMVΔ8.9质粒中的pol基因D64N和D116N突变而得。
2.如权利要求1所述慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
(1)获得Attb-C31编码序列；
(2)将(1)获得的序列克隆至FUGW载体pacI酶切位点获得质粒FattbC31UGW；
(3)以质粒CMVΔ8.9为模版，将pol基因中的D64N和D116N突变后得到CMVΔ8.9-D64N/D116N；
(4)将FattbC31UGW质粒、包膜质粒VSVG和包装结构质粒CMVΔ8.9-D64N/D116N质粒混合，混合比例为1.5-10∶1-5∶1；即形成如权利要求1所述慢病毒载体系统。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该制备方法中(1)用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶编码序列。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该制备方法中(1)中，首先将attb序列插入CMV-c31质粒获得重组CMV-Attb-C31质粒，然后用PCR方法或者人工合成方法得到Attb-C31整合酶编码序列。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，该制备方法(3)用定向突变方法，获得了HIV整合酶突变的表达载体CMVΔ8.9-D64N/D116N。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，(4)中采用混合比例为5∶4∶3或者4∶3∶2。
7.一种位点特异性整合试剂盒，其特征在于，该载体试剂盒中含有权利要求1所述的慢病毒包装载体系统。
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