CN103215295A - 一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。本发明使用电穿孔的方法将打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经过G418药物筛选和PCR分析后获得了打靶的阳性克隆细胞，以打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎，为研制抗乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

Description

一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞

技术领域

本发明属于基因克隆技术领域，涉及一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞。

背景技术

奶牛乳腺炎(Mastitis)是奶牛乳腺受到物理、化学刺激，尤其是细菌的侵袭而引起的一种炎症反应，造成奶牛产奶量下降，奶品质降低，增加生产成本，严重的使奶牛提早淘汰，给奶业发展造成了巨大的损失。据统计资料显示：世界上大多数国家乳腺炎的发病率平均约40%、美国高达48.5%、芬兰30.6%、加拿大19.8%、中国30%(Gill J.J etal,2006)。尽管引起奶牛乳腺炎的病原菌有137种之多(Ranjan R etal,2006)，但是金黄色葡萄球菌是最常见的乳腺炎病原菌之一，占到发病率的15-30%，通常引起亚临床型或者慢性感染(Sutra L etal,1994)。目前，治疗乳腺炎仍然采用抗生素治疗，尽管有效但治愈率低下，通常不足15%。这是由于金黄色葡萄球菌在感染的过程中形成荚膜，在乳腺上皮细胞和巨噬细胞里存活，从而导致对抗生素的不敏感(AlmeidaR.A etal,1996;Hebert A etal,2000;Hensen S.M etal,2000)。由于抗生素的长期使用，自然界中金黄色葡萄球菌的耐药性不断增强。从牛奶样本中分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌已经证明对万古霉素治疗几乎没有效果(Makovec J A etal,2003;Lee J2003)。耐药金黄色葡萄球菌的产生引起了人们极大的关注，如果它随着乳制品进入人体将产生很大的危害。因此，迫切要求寻找高效安全的新型抗菌药。

自身能够特异性的在乳房携带或者分泌抗乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。转基因动物的生产可以追溯到20世纪70年代中叶，用原核纤维注射生产转基因动物持续了20多年，但外源基因的随机整合和配子系传送外源基因的不准确性限制了这种技术的广泛应用。在小鼠上，胚胎干细胞可以代替原核注射，但胚胎干细胞系还没有在家畜上建立。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力，其突出的优点是将基因转移步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞为核供体进行体细胞核移植（SCNT），这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以降低其生产成本。

在杀灭金黄色葡萄球菌的药物中，溶葡萄球菌素（Lys）是独一无二的，无论是处于分裂期还是静息期，带荚膜和不带荚膜的金黄色葡萄球菌都有很强的杀菌能力。正因为如此，它可能更适合用在发病初期需要快速减少细菌数量的病例中。更重要的是，在目前有限的研究中，已经证明溶葡萄球菌素单独或者联合其他抗生素能够有效地治疗MRSA感染且无过敏反应。由于溶葡萄球菌素的独特性、低毒，高稳定性和高效性等优点，使其在未来预防和治疗金黄色葡萄球菌感染具有极大的潜力。

基因打靶也称为基因定点同源重组，是指通过外源DNA与染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定位点，从而改变生物遗传特性的方法。通过基因打靶可以纠正染色体特定位点上的自发突变，恢复细胞正常的生理功能；也可以把理想突变引入到基因组的某一位点，使之稳定地遗传下去。基因打靶的概念是20世纪70年代初在酵母研究中发展起来的，直到1985年Smithies等才首次报道在肿瘤细胞中实现人工打靶载体和内源β球蛋白基因间的同源重组，1987年Smithies和Capecchi的研究小组在小鼠胚胎干细胞实现了定点剔除，现在基因打靶技术在生命科学的多个领域都有应用。随着基因打靶技术的发展，已经出现了一些新的技术如ZFN技术和TALE技术，科学家利用ZFN技术和TALE技术在基因组特定位点产生双链断裂（DSB），DSB的产生大大提高了体细胞同源重组的效率。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的打靶载体及其构建的细胞，利用所构建的细胞作为核供体细胞，为研制抗乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种Lys乳腺特异性打靶载体，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。

所述的目的基因Lys的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的5’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

所述的5’同源臂的下游还连接有包括剪切拼接位点SA、多克隆位点和两个同向Loxp的序列。

所述的5’同源臂的下游连接的序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的多克隆位之间还插入有SV40PolyA序列。

所述的两个同向Loxp的序列之间还依次设有以下元件：PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因和SV40PolyA。

所述的5’同源臂和3’同源臂构建于pMD19-T载体上，在5’同源臂和3’同源臂之间还依次设有以下元件：剪切拼接位点SA、多克隆位点、SV40PolyA、Loxp1、PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因、SV40PolyA和Loxp2；

目的基因Lys插入到所述的多克隆位点之间；所述的抗生素筛选基因为neo，荧光标记基因为EGFP。

一种所述的Lys乳腺特异性打靶载体的重组细胞，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和锌指核酸酶表达载体，将目的基因Lys定点整合到牛胎儿成纤维细胞的CSN2位点。

所述的重组细胞，待目的基因Lys定点整合到牛胎儿成纤维细胞的CSN2位点后，还在重组细胞的培养液中加入Cre酶蛋白进行处理，将Loxp之间的筛选基因和标记基因去除。

所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆牛的核供体细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明构建了一种Lys乳腺特异性打靶载体，并通过基因打靶技术使Lys基因定点整合到牛β-酪蛋白位点，使得目的基因Lys在泌乳期牛的乳腺组织中特异的高效表达。

2、本发明将目的基因Lys克隆到通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体pTCSN2上，构建了Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP，将其转染到牛胎儿成纤维细胞，构建转基因的牛胎儿成纤维细胞系；荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性克隆细胞，并进行PCR鉴定证实目的基因Lys定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组CSN2位点。

3、以包含目的基因Lys的牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆牛的核供体细胞，通过SCNT获得转基因克隆牛，该转基因牛可预防乳房炎的发生。

本发明生产的转Lys基因克隆牛乳汁对大肠杆菌，葡萄球菌，无乳链球菌具有抑制作用。利用抑菌环实验初步检测转基因牛乳汁体外抑菌活性（如图10所示）。转基因牛乳样周围出现明显抑菌环，与100μg/ml Lys标准品相似，非转基因牛乳样周围没有形成抑菌环。

附图说明

图1是目的基因Lys密码子优化后的序列与原始序列的对比；

图2是Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP的质粒图谱；

图3是Lys基因ＰＣＲ结果

图4是酶切鉴定打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP的结果；

图5是荧光显微镜观察打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP转染牛胎儿成纤维细胞的结果图；

图6是发生基因打靶的阳性克隆细胞的PCR鉴定结果；

图7是发生基因打靶的阳性克隆细胞的Southern blot鉴定结果；

图8是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚。

图9是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。

图10是利用抑菌环实验检测转基因牛乳汁体外抑菌活性。

具体实施方式

本发明公开了一种利用Lys乳腺特异性打靶载体对牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶获得的β-酪蛋白位点定点整合Lys基因的牛胎儿成纤维细胞，通过对Lys基因进行序列优化，在通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体pTCSN2的多克隆位点处定向插入序列优化后的Lys基因表达序列，在锌指核酸酶的辅助作用下将Lys基因定点敲入到牛β-酪蛋白位点第二内含子中。利用打靶载体中剪切拼接位点SA的作用，使Lys基因在牛乳腺组织中实现正常转录和表达。本发明使用电穿孔的方法将打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，经过G418药物筛选和PCR分析后获得了打靶的阳性克隆细胞，以打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎，将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫中，最终获得了8头成活的转基因克隆牛。

本发明首先构建了含有序列优化的Lys基因的乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP，然后用电转染法将乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和对应的锌指核酸酶表达载体共转染到牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定和Southern blot鉴定，证实目的基因Lys定点整合到牛CSN2位点；最后，将发生基因打靶的阳性克隆细胞做为核供体细胞移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆牛。

具体所涉及的试剂和材料如下：G418、DMEM培养基购自美国GIBICO(Invitrogen）公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，胎牛血清购自中国杭州四季青公司，细胞培养板和培养皿为丹麦Nunclon公司产品，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自天根公司，Hot start DNA聚合酶和T4DNA连接酶购自Takara公司，电转染仪（ECM2001）购自美国BTX公司，限制性内切酶购自MBI公司。C57BL/6J鼠购自西安交大医学院，总RNA提取试剂盒购自promega公司。

I Reduced Serum Media购自Invitrogen公司。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP的构建

1.1目的基因Lys的序列优化

在溶葡萄球菌素全基因的DNA序列NCBI Reference Sequence:NC_013944.1的基础上，根据牛的密码子偏爱性进行密码子优化，优化后的序列如SEQ.ID.NO.1所示，序列优化与优化前的序列对比如图1所示。

由于野生型的Lys基因串联多个稀有密码子，可以降低翻译的效率甚至终止翻译，从而影响目的蛋白的表达。优化后的Lys基因改变为牛的密码子使用偏好性，使得CAI值从0.58提升到0.85。此外由于各种因素的调节和影响外源目的基因的表达水平，在优化时考虑到尽可能多的因素，包括：GC含量和不利的峰值被优化以延长mRNA的半衰期、影响核糖体结合和mRNA稳定性的Stem-Loop结构被打破，经过上述优化的外源目的基因可以达到可能的较高的表达水平。

具体的，优化后的序列由南京金斯瑞公司合成并克隆到PUC57载体中，得到载体PUC57-Lys。

1.2打靶载体pCSN2的构建

1.2.1同源臂序列的确定及其同源重组方案

1）以牛β-酪蛋白位点为整合位点，利用锌指核酸酶在牛β-酪蛋白位点第二内含子的锌指核酸酶识别处（只有一处识别位点）产生双链断裂（DSB），在断裂位点上下游各扩增700～800bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂，具体的上游扩增5’同源臂745bp，下游扩增3’同源臂789bp。利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点CSN2上。

锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3～4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6～8bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到DNA定点剪切的目的。

锌指核酸酶可以在基因序列的特定位点切开一个缺口，激活细胞内的DNA修复机制。通过同源重组，或非同源末端接合来实现高效的基因敲除或插入。传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10^－6级。而本发明通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率。

2）剪切拼接位点（SA）、多克隆位点（MCS）

进一步在5’同源臂的下游设计剪切拼接位点（SA），剪切拼接位点（SA）的插入便于转录后mRNA（同源重组后的mRNA）的正确拼接。多克隆位点（MCS）为稀少的酶切位点，从而便于将不同的目的基因插入到打靶载体中。

3）筛选基因及Lxop序列的设计

将筛选基因（neo）和标记基因（EGFP）分别插入到5’同源臂和3’同源臂之间，其中，在筛选基因（neo）和标记基因（EGFP）两端加入同向的Loxp序列，插入同向的Loxp序列便于去除筛选基因和标记基因。

1.2.2、载体构建所用到的载体及试剂

1）载体：

pMD19-T(TAKARA)，pMCIneopolyA(stratagen)，pEGFP-C1(Clontech)

2）菌株：DH5α（TAKARA）

3）试剂：内切酶（NEB公司），T4DNA连接酶（TAKARA），质粒小提试剂盒（上海生工），胶回收试剂盒（上海生工），LAtaq酶（TAKARA）,dNTP（TAKARA）,G418(SIGMA公司)。

4）合成如下引物：

P5HA1：5’-GGAATTCCCCAGAATCTAAGACATATC-3’

P5HA2：5’-GGGATCCTGAGATAGTGGATGAACGT-3’

P3HA1：5’-GGTCGACTATGGGACCACAAGTCTGAG-3’

P3HA2：5’-GAAGCTTTGCCTCTGAATGAACACTAT-3’

1.2.3、构建过程及方法

1）以引物P5HA1（引入EcoRⅠ酶切位点）及P5HA2（引入BamHⅠ酶切位点）为扩增引物，以牛基因组为模板扩增5’同源臂序列，凝胶回收PCR产物，所扩增的5’同源臂序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切PCR产物和pMD19-T载体，0.8%凝胶回收PCR酶切产物和酶切载体pMD19-T，T4DNA连接酶连接PCR酶切产物和酶切载体pMD19-T，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确连接单克隆，命名载体为p5HA。

2）以引物P3HA1（引入SalⅠ酶切位点）及P3HA2（引入HindⅢ酶切位点）作为引物，以牛基因组为模板扩增3’同源臂序列，凝胶回收PCR产物，3’同源臂序列的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

SalⅠ、HindⅢ双酶切3’同源臂序列PCR产物和载体p5HA，0.8%凝胶回收PCR酶切产物和酶切载体p5HA，T4DNA连接酶连接PCR酶切产物和酶切载体p5HA，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确连接单克隆，命名载体为pHA。

3）合成含有剪切拼接位点（SA）和多克隆位点（MCS）的序列，该序列是的核苷酸序列如下所示（即SEQ.ID.NO.4所示，具体可委托南京金斯瑞公司合成）：

GGATCCTAGGAAAATATTTAATAATGAGTTGACTGTGGGAACTAAA GTGTTTTTTTTTCTCTTTAGTCCGGAGGGCCCCCTAGGTGATCAAGATCTATCGATGGCCGGCCGCTAGCCGTACGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGATTAATACGCGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTCGAC；

划线的序列为剪切拼接位点（SA），其后为多克隆位点（MCS）的序列，这段序列的酶切位点顺序是：AccⅢ，ApaⅠ，AvrⅡ，BclⅠ，BglⅡ，ClaⅠ，FseⅠ，NheⅠ，SplⅠ，Loxp1，XhoⅠ，VspⅠ，MluⅠ，Loxp2，SalⅠ，序列上除稀少的酶切位点外还有两段34bp的回文序列Loxp，该序列合成后利用BamHⅠ和SalⅠ位点克隆到载体pHA上，鉴定正确连接单克隆，命名载体为pHA-SM。

其中剪切拼接位点SA保证转录后同源重组mRNA的正确剪切和拼接。而多克隆位点（MCS）将所感兴趣的目的基因定点插入到打靶载体中。回文序列Loxp包括同向的Loxp回文序列Loxp1和Loxp2，在Cre酶的作用下，Loxp1和Loxp2之间发生位点特异性重组，可以有效切除Loxp1和Loxp2之间的序列

进一步，在MCS之后还设置SV40PLOYA序列（其序列如SEQ.ID.NO.5所示），在合成其序列后（可由南京金斯瑞公司合成）直接插入到MCS的SplⅠ位点，其作用是终止插入在MCS中的目的基因的转录。

4）利用XhoⅠ、SalⅠ双酶切载体pMCIneoployA得到抗生素筛选基因（neo），凝胶回收（neo）基因，同时用XhoⅠ酶切载体pHA-SM并且0.8%凝胶回收骨架载体，T4DNA连接酶连接neo基因和胶回收酶切骨架载体pHA-SM，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确连接单克隆（其中neo基因插入到载体pHA-SM中Loxp1下游XhoⅠ酶切位点处），命名载体为pHA-SMN。

需要说明的是PTK是neo的启动子，和neo基因一起从载体pMCIneoployA中剪切下来的，用于启动neo基因的表达。

5）在pHA-SMN载体的Loxp2的上游插入EGFP

VspⅠ、MluⅠ双酶切载体pEGFP-C1得到荧光标记基因EGFP，胶回收EGFP基因，同时用相同的酶酶切载体pHA-SMN并且0.8%凝胶回收骨架载体片段，T4DNA连接酶连接标记基因（EGFP）和胶回收酶切骨架载体pHA-SMN，4℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，鉴定正确连接单克隆，命名载体为pTCSN2。

1.3将目的基因Lys亚克隆到载体pTCSN2上

以PUC57-Lys为模板用引物进行PCR扩增，其中，引物对为：

正向引物P1:5’-GCCTAGGATGGAAGGACGAGGCTCTCT-3’

反向引物P2:5’-GAGATCTTACTTGATTGTTCCCCACAG-3’

引物P1、P2当中的划线部分分别为AvrⅡ和BglII酶切位点；

PCR反应条件为:95℃预变性5min；95℃变性30s，56.5℃退火30s，72℃延伸1m，30个PCR循环；72℃再延伸7min。

对PCR扩增产物进行凝胶电泳的结果如图3所示，其中，泳道M为Maker，泳道A为PCR扩增的Lys序列，可以看到PCR扩增了830bp的Lys序列，将PCR扩增产物胶回收纯化后，以AvrⅡ/BglII双酶切后，胶回收纯化带有黏性末端的片段。AvrⅡ/BglII双酶切通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体pTCSN2，胶回收骨架载体大片段。T4DNA连接酶过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α，次日挑取阳性克隆,提取质粒用AvrⅡ/BglII双酶切鉴定，正确的命名pCSN2-Lys-Neo-EGFP，其质粒图谱如图2所示。

由于质粒在大肠杆菌中增殖，用普通的质粒提取方法容易将细菌内毒素带到终产物中，细菌内毒素的存在会影响质粒转染效率和细胞生长，所以本发明使用了去内毒素的质粒提取试剂盒，以减少内毒素对试验结果的负面影响。用promega公司的去内毒素的质粒纯化试剂盒提取质粒后用核酸蛋白测定仪测定质粒的浓度和纯度，经测定，质粒的浓度为620ng/μl，OD260/280为1.86，说明质粒较纯，可用于后续的细胞转染。

1.2.4、载体的转染及验证

1）将载体pTCSN2与锌指核酸酶表达载体（购自西格玛公司）共转染牛胎儿成纤维细胞，具体的采用电穿孔的方法共转染牛胎儿成纤维细胞。锌指核酸酶表达载体表达的锌指核酸酶在牛胎儿成纤维细胞基因组CSN2位点产生双链断裂，促进打靶载体pTCSN2与基因组发生同源重组。

2）成功转染的细胞表达绿色荧光蛋白，转染的细胞在药物G418（600μg/ml）的作用下可以筛选出稳定转染的阳性克隆细胞。转染48小时后在荧光显微镜下镜检，转染打靶载体的细胞可以观察到绿色荧光蛋白的表达。稳定转染打靶载体的细胞由于表达了新霉素抗性基因neo，对G418有抗性。而没有稳定转染打靶载体的细胞在600μg/ml的作用下会死亡，因此可以利用G418筛选出稳定转染的阳性克隆细胞。

3）利用同源臂外侧PCR的方法可以鉴定出发生同源重组的阳性克隆细胞。在同源臂外侧PCR检测中：

上游引物（5’-TTATGTGGGACAAAGGGGAGA-3’）设在5’同源臂上游，下游引物设在3’同源臂下游（5’-CAGGCTCCTCCTCTATGGGATTTT-3’）。

发生同源重组的细胞克隆可以扩增出1900bp和5700bp两条带，1900bp为野生型的等位基因，5700bp为敲入外源基因的等位基因。

4）将纯化的Cre酶蛋白转染发生同源重组的阳性克隆细胞中验证Loxp序列的功能

将纯化的Cre酶蛋白加到细胞培养液中，浓度150ng/ml，培养72小时；72小时后提取转染Cre酶的阳性克隆细胞和未转染Cre酶的阳性克隆细胞的基因组，设计引物扩增Loxp之间的序列：

上游引物：5’-GCCCAGTCATAGCCGAATAGC-3’,

下游引物：5’-TTTAGTTCCCACAGTCAACTCA-3’

比较两组的凝胶电泳图谱，发现转染Cre酶的阳性克隆细胞扩增出来的2600bp片段明显比未转染Cre酶的弱，说明Loxp序列在与Cre酶蛋白作用后，能够在打靶成功后的基因组中去除筛选和标记基因。

5）将打靶载体pTCSN2中5’同源臂序列上的CSN2第二外显子翻译起始位点ATG至第二内含子中锌指核酸酶识别切割位点的序列克隆并插入到载体pEGFP-N1（购自CLONTECH公司）多克隆位点，构建载体pEGFP-EI（见图11），将打靶载体中5’同源臂序列上的CSN2第二外显子翻译起始位点ATG至剪切拼接位点（SA）的序列克隆并插入到载体pEGFP-N1多克隆位点，构建载体pEGFP-EIS，其中CSN2第二外显子翻译起始位点ATG位于5’同源臂第514个碱基处。

分别将载体pEGFP-EI和载体pEGFP-EIS分别转染牛胎儿成纤维细胞，转染pEGFP-EI的细胞无绿色荧光蛋白表达，而转染pEGFP-EIS的细胞有绿色荧光蛋白表达，说明剪切拼接位点（SA）有功能，能够使插入打靶载体pTCSN2多克隆位点的目的基因完成转录后的正确剪切拼接，从而表达表达出需要的目的蛋白。

2、Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP与锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系

2.1牛胎儿成纤维细胞的培养

从液氮中取一管第三代荷斯坦奶牛的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻，离心。弃去废液，加3ml细胞悬浮液（含10%FBS的DMEM）重悬，接种于60mm的培养皿中（含10%FBS的DMEM），置于CO₂培养箱中37℃条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80%汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，在倒置显微镜下观察细胞。待大多数细胞变圆、细胞间隙扩大时，用等体积含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打混匀后，离心收集，悬浮，按1∶3的比例接种于60mm培养皿，放入CO₂培养箱中培养，选取3～10代传代的细胞达到90%汇合的牛胎儿成纤维细胞，作为用于转染的宿主细胞。

本发明以G418作为筛选药物，由于Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP的骨架上有G418抗性基因neo，外源基因pCSN2-Lys-Neo-EGFP得到表达的牛胎儿成纤维细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而未转染的正常细胞会在该浓度下死亡，因此需要确定正常细胞G418的最小致死浓度来作为筛选浓度。

G418最小致死浓度的测定：在牛胎儿成纤维细胞培养液（DMEM细胞培养液）中分别加入浓度梯度的G418筛选1周，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度大于或等于600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。

2.2Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP与锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞

转基因的方法有很多种，包括电穿孔法、显微注射法、基因枪法、病毒载体法、受体介导法等。本发明具体采用电转染法，将Lys乳腺特异性打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP与锌指核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞。

细胞达到90%汇合时，消化细胞后离心（1000r/min，4min）收集细胞，然后用

I Reduced Serum Media洗涤细胞2次，每次清洗的过程中要轻轻慢慢的吹打细胞，防止细胞受到损害，将电转染液（cell盐：opti=3:1V/V；cell盐为:Kcl:120mm;Cacl2:0.15mm;K2HPO4:10mm;Mgcl2:50mm;调PH至7.6；opti即

I Reduced Serum Media）和打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP（20μg）与锌指核酸酶表达载体pZFN1/pZFN2（各10μg）的混合液（400μl）加到经离心弃去培养液的离心管中（加完质粒后加opti至400μL），轻轻吹打细胞，使其完全吹散，混匀。将上述细胞悬液转移到BTX电击杯中（4mm间隙，黄色盖子，800μL容积），静置10min；将电转染参数设置如下：电压510V；脉冲时间1ms；电击次数3次，静置完成之后进行电转染。

转染完成后，细胞静置10min，然后将细胞悬液全部转移到90mm培养皿中；加入37°预温的含10%胎牛血清的DMEM完全培养液3mL，将培养液置于37°、5%的CO₂培养箱中，待细胞贴壁后，弃去培养液（培养液中含有电转染液影响细胞生长），换成经37°温育的DMEM完全培养液10mL，24h后加入G418至终浓度为600μg/ml。

2.3G418阳性克隆细胞筛选

电转染牛胎儿成纤维细胞24h后，在含血清的DMEM细胞培养液中添加600μg/ml的最小致死浓度的G418筛选；以未转染的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418（600μg/ml）。

电转染细胞24h后，打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP中的EGFP基因被表达之后能够在荧光显微镜下可以看到绿色荧光。当转基因的牛胎儿成纤维细胞发出如图4所示的绿色荧光，说明pCSN2-Lys-Neo-EGFP已经进入细胞；转染细胞7d后，对照组的细胞全部死亡，发生稳定转染的细胞形成克隆。

本发明筛选的阳性细胞克隆都是稳定转染pCSN2-Lys-Neo-EGFP的细胞，目的基因Lys整合到细胞的基因组上，而不是游离于基因组之外；以上构建的细胞克隆主要为发生同源重组的基因打靶细胞克隆。

2.4junction PCR筛选基因打靶的细胞克隆

取扩大培养后的稳定转染pCSN2-Lys-Neo-EGFP的牛胎儿成纤维细胞，提取细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR鉴定Lys基因是否定点整合到CSN2位点，阴性对照为未转染的正常牛胎儿成纤维细胞，junction PCR鉴定所用引物对为上游引物(5’-TTATGTGGGACAAAGGGGAGA-3’)和下游引物(5’-TTCCCGCCTCCATAGTTAGACC-3’)；

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1.5min，35个PCR循环；72℃再延伸5min；回收PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，其中，泳道M为DNA Marker，泳道NC为未转染的牛胎儿成纤维细胞，Lys基因定点整合到CSN2位点的细胞克隆会扩增出一条1.3kb的条带。

本发明筛选的基因打靶细胞克隆都是打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP与细胞基因组发生同源重组的细胞克隆，目的基因Lys定点整合到细胞的CSN2位点上，而不是随机整合到基因组上的。

2.4Southern blot鉴定基因打靶的细胞克隆

取扩大培养后的junction PCR筛选基因打靶的细胞克隆，提取细胞基因组DNA，用限制性内切酶BglII切基因组，用5′同源臂外侧探针杂交，CSN2位点发生基因打靶敲入外源基因的细胞克隆可以杂出两条带：野生型的CSN2等位基因杂出7.5kb的带，发生基因打靶的CSN2等位基因杂出5.6kb的带（图6）。其中，泳道NC为未转染的牛胎儿成纤维细胞，泳道22，51，63为junctionPCR筛选基因打靶的细胞克隆。

3、以上述基因组定点整合了目的基因Lys的牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞，构建转基因克隆牛

3.1卵母细胞的成熟培养

卵巢采自西安市屠宰场，无菌采取荷斯坦奶牛卵巢，在37℃无菌生理盐水中4～6小时内运回实验室，抽取3～8mm直径的卵泡，收集卵丘卵母细胞复合体，实体显微镜下挑选具有完整的三层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。卵母细胞的成熟培养液为：TCM199（Gibico）加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生长因子，培养条件为：38.5℃，5%CO₂、95%空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2%透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体的排放作为卵母细胞成熟的判定标志，挑选成熟卵母细胞用于核移植试验。

3.2转基因克隆胚的构建

采用体细胞核移植（SCNT）技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中，其中，整合有外源基因的供体细胞是关键，本发明将供体细胞控制到10代以内，这主要考虑减少体外培养导致的突变在培养过程中的积累。

核移植具体为：显微操作液为含10%FBS，5μg/ml细胞松弛素B的PBS，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10μg/mlHoechst33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。

卵母细胞的注核与融合，具体过程如下：0.25%胰蛋白酶消化接触抑制3d的6～10代的转染Psp-EGFP-Ipr1的荷斯坦牛胎儿成纤维细胞用做供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。核质复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进行电融合。融合电压为28V，融合时间为10μm。融合后的重组体放入10%FBS的M199中，38.5℃、5%CO₂、饱合湿度下培养，2h后观察融合情况。

3.3转基因克隆胚的激活及体外培养

融合的重组胚在含10%FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/L离子霉素（Ionomycin，购自SIGMA公司）的mSOFaa培养液（购自SIGMA公司）处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5%CO₂、饱和湿度下培养，第7～9天检查囊胚发育情况，如图7所示，图中红色箭头所示克隆胚正常发育至囊胚。

3.4转基因克隆牛的制备

将发育良好的囊胚移植的发情的红安格斯受体牛的子宫角（每头受体牛移植两枚胚胎）。90天后通过直肠检查或超声波检查受体牛的怀孕情况。10个月后，成功产下一头成活的基因打靶的转基因克隆牛（图8）。CSN2位点定点整合Lys基因的转基因克隆牛的制备成功，为预防牛乳房炎提供了坚实的基础。

3.5转基因克隆牛的抗菌检测

待受体牛生长到16～18月龄，进行选配和人工受精，60天后B超检测妊娠情况。转基因牛生产后（如图9所示），采集不同泌乳阶段乳汁。首先消毒乳头，弃去初始50mL乳汁，每个乳房收集50mL乳汁，混合后用于后续检测。以非转基因牛乳汁作为对照组。利用抑菌环实验和有限稀释法检测转基因牛乳汁中hLYZ的体外抗菌活性。

具体的，受试菌为大肠杆菌(E.coli),金黄色葡萄球菌(S.aureus)和无乳链球菌(S.agalactiae,)、购买自中国兽医药品监察所。细菌在37℃，50ml胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)中孵育过夜，3,000g离心5min，用PBS洗涤后悬浮至细菌数为1×10⁷CFU/ml。将100μl调整好的E.coli,S.aureus or S.agalactiae的菌液菌液涂抹在琼脂板上，室温干燥10min。将20μl全乳乳样点在灭菌滤纸片上，置于琼脂板上，37℃孵育24h。根据抑菌环大小初步评估HBD3的抗菌活性。非转基因牛乳汁和添加100or200μg/ml Lys标准品的非转基因牛乳汁作为阴性和阳性对照组。

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌的抑菌环检测结果分别如图10的A、B、C所示，可以看到转基因牛乳样（2、3、4号检测点）周围出现明显抑菌环，与100μg/ml Lys（5号检测点）标准品相似，而非转基因牛乳样周围没有形成抑菌环（1号检测点）。

Claims (10)

1.一种Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，包括目的基因Lys，在的基因Lys的上游和下游分别设有5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。

2.如权利要求1所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的目的基因Lys的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的5’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

3.如权利要求1所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游还连接有包括剪切拼接位点SA、多克隆位点和两个同向Loxp的序列。

4.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂的下游连接的序列如SEQ.ID.NO.4所示。

5.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的多克隆位之间还插入有SV40PolyA序列。

6.如权利要求3所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的两个同向Loxp的序列之间还依次设有以下元件：PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因和SV40PolyA。

7.如权利要求1所述的Lys乳腺特异性打靶载体，其特征在于，所述的5’同源臂和3’同源臂构建于pMD19-T载体上，在5’同源臂和3’同源臂之间还依次设有以下元件：剪切拼接位点SA、多克隆位点、SV40PolyA、Loxp1、PTK启动子、抗生素筛选基因、PolyA、CMV启动子、荧光标记基因、SV40PolyA和Loxp2；

目的基因Lys插入到所述的多克隆位点之间；所述的抗生素筛选基因为neo，荧光标记基因为EGFP。

8.一种基于权利要求7所述的Lys乳腺特异性打靶载体的重组细胞，其特征在于，以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pCSN2-Lys-Neo-EGFP和锌指核酸酶表达载体，将目的基因Lys定点整合到牛胎儿成纤维细胞的CSN2位点。

9.如权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，待目的基因Lys定点整合到牛胎儿成纤维细胞的CSN2位点后，还在重组细胞的培养液中加入Cre酶蛋白进行处理，将Loxp之间的筛选基因和标记基因去除。

10.权利要求8或9所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆牛的核供体细胞的应用。

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