CN104975031A - 尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因及其用途 - Google Patents

Abstract

尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因及其用途，涉及尖孢镰刀菌古巴专化型。所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因为序列表序列1中第1507～2763位核苷酸所示的基因。所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质为序列表序列3所示的蛋白质。所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质可用于调控尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢能力及其对香蕉的毒力。尖孢镰刀菌古巴专化型fogaa的基因表达量降低时，产孢量降低，对香蕉的致病性显著降低。

Description

尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因及其用途

技术领域

本发明涉及尖孢镰刀菌古巴专化型，尤其是涉及尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因及其用途。

背景技术

尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)是一种引起香蕉枯萎病的病原菌，属于半知菌亚门从梗孢目瘤座孢科镰刀菌属真菌。该真菌为土壤习居菌，可从根部侵入，造成维管束堵塞，叶片黄化，植株萎蔫和香蕉绝收。由该菌引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，植株一旦发病只能铲除，而且该菌可在土壤中长期存活，这使该病害防治十分困难。该病害在全世界香蕉种植区均有发生。

目前，防治由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的香蕉枯萎病，采用多菌灵、咪鲜胺等杀菌剂效果普遍不够理想。采用新型杀菌剂和选用抗病或耐病品种是今后香蕉枯萎病防治的主要方法。尖孢镰刀菌古巴专化型对香蕉植株的毒力受复杂信号网络的调控。迄今相关研究已发现一些致病基因包括编码甘露糖基转移酶的Fooch1基因、G蛋白亚基的fgb1基因、MAP激酶基因Foslt2等参与调控该真菌对香蕉的毒力。这些基因及其编码蛋白可能成为新型杀菌剂研发和抗病育种的靶标。Ghag SB等人(Ghag,S.B.,Shekhawat,U.K.&Ganapathi,T.R.(2014)Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vitalfungal genes confers efficient resistance against Fusarium wilt in banana.Plantbiotechnology journal,12:541-553)通过在香蕉中表达靶向致病基因(velvet和Fusariumtranscription factor 1)的小分子干扰RNA(SiRNA)，研究结果发现，合成的SiRNA在培养基中可以抑制尖孢镰刀菌古巴专化型的生长，转基因香蕉植株对尖孢镰刀菌古巴专化型的抗性显著增强。这些结果表明，这些致病基因可作为香蕉抗枯萎病育种和杀菌剂筛选的靶标。

再者，尖孢镰刀菌无性繁殖可产生3种类型无性孢子，包括小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣孢子。这些无性孢子也是该病原真菌传播扩散的主要方式。因此，分生孢子产生能力也影响该病原真菌的在香蕉植株中危害能力。

发明内容

本发明的目的是提供尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因。

本发明的另一目的是提供尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质的用途。

所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因为序列表序列1中第1507～2763位核苷酸所示的基因。

所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质为序列表序列3所示的蛋白质。

所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质可用于调控尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢能力及其对香蕉的毒力。

实验证明，尖孢镰刀菌古巴专化型fogaa的基因表达量降低时，产孢量降低，对香蕉的致病性显著降低。

所述调控尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢能力及其对香蕉的毒力的方法包括调控所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列3所示fogaa蛋白质的表达水平，或调控所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列2所示fogaa基因的转录水平的步骤。

本领域技术人员可根据实际需要，通过筛选或鉴定调控所述fogaa蛋白质表达量或者fogaa基因表达量的物质，或者在香蕉植株中表达抑制Fogaa蛋白质表达量或者fogaa基因表达量的物质来实现对尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和毒力的调控，最终控制香蕉枯萎病的发生和危害。

以下给出采用所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂的方法。

所述采用所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂的方法，包括但不限于以所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂的步骤。

所述采用所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂的方法，包括但不限于以所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列2所示的fogaa基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列2所示fogaa基因转录的待检测物质作为候选的香蕉枯萎病杀菌剂的步骤。

具有如下至少一种功能的物质在制备尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂中的应用：

1)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质表达水平；

2)降低序列表序列3所示氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa蛋白质的表达水平；

3)降低序列表序列2所示fogaa基因的转录水平；

4)降低序列表序列2所示核苷酸序列经过至少一个核苷酸碱基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa基因的转录水平。

具有如下至少一种功能的物质在制备抗枯萎病的香蕉植株中的应用：

1)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质表达水平；

2)降低序列表序列3所示氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的Fogaa蛋白质的表达水平；

3)降低序列表序列2所示fogaa基因的转录水平；

4)降低序列表序列2所示核苷酸序列经过至少一个核苷酸碱基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa基因的转录水平。

附图说明

图1为野生型尖孢镰刀菌古巴专化型菌株B2、突变体Δfogaa和互补体Δfogaa+fogaa的菌落。

图2为敲除载体pCTfogaa的构建示意图。上方为野生型菌株B2的fogaa基因片段，中间为敲除载体pCTfogaa的基因片段，下方为同源重组后基因置换结果。hph和gfp分别代表潮霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白表达盒，K代表Kpn I酶切位点，Xo为Xho I酶切位点，E为EcoR I酶切位点，Xa为Xba I酶切位点；P1～P6为验证引物起始扩增位置。

图3为fogaa基因敲除突变体和互补体的PCR验证。1～3所用引物为P1和P2，4～6所用引物为P3和P4，7～9所用引物为P5和P6；1和4为fogaa敲除突变体，2和5为敲除突变体的互补体，3和6为野生型。

图4为fogaa基因敲除突变体和互补体的RT-PCR验证。1为野生型，2为fogaa敲除突变体，3为fogaa敲除互补体，actin为对照。

图5为fogaa基因敲除突变体和互补体产孢能力比较。WT为野生型，Δfogaa为fogaa敲除突变体，Δfogaa+fogaa为互补体。图中所示为每mL悬浮液孢子量。

图6为fogaa基因敲除突变体和互补体在香蕉中的致病性比较。WT为接种野生型的香蕉植株发病指数，Δfogaa为接种fogaa敲除突变体型的香蕉植株发病指数，Δfogaa+fogaa为接种fogaa敲除突变体的互补体的香蕉植株，CK为对照。

图7为fogaa基因敲除突变体和互补体在粉蕉中的致病性比较。WT为接种野生型的粉蕉植株发病指数，Δfogaa为接种fogaa敲除突变体型的粉蕉植株发病指数，Δfogaa+fogaa为接种fogaa敲除突变体的互补体的粉蕉植株，CK为对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料如无特殊说明，均可从商业途径获得；所使用的野生型尖孢镰刀菌古巴专化型菌株B2，公众可从中国热带农业科学院环境与植物保护研究所获得。

实施例1、fogaa的功能验证

本发明采用基因敲除实验和基因互补实验证明fogaa在尖孢镰刀菌对香蕉致病性中的作用。首先构建敲除载体pCTfogaa和基因互补载体pSD-fogaa，然后将前者导入野生型尖孢镰刀菌古巴专化型中获得敲除体Δfogaa，将后者导入敲除体Δfogaa中获得互补转化体Δfogaa+fogaa。对得到的敲除体Δfogaa和互补转化体Δfogaa+fogaa进行致病性测定，以野生型尖孢镰刀菌古巴专化型B2为对照。基因敲除载体pCTfogaa的构建是将位于fogaa基因两侧的各一段DNA序列连入一个载体中，两者之间用潮霉素磷酸转移酶基因(hph)表达盒隔开。该基因敲除载体通过fogaa基因两侧的侧翼序列与野生型尖孢镰刀菌古巴专化型基因组的相应序列发生同源重组，从而将野生型B2菌株基因组中的fogaa与敲除载体上的潮霉素磷酸转移酶基因hph表达盒置换。互补载体的构建是将包含fogaa基因全长功能性序列的DNA片段与一个带有新霉素磷酸转移酶基因(npt II)的载体相连。然后将其导入fogaa敲除突变体Δfogaa中。

野生型尖孢镰刀菌古巴专化型菌株B2、突变体Δfogaa和互补体Δfogaa+fogaa的菌落参见图1。

一、基因敲除载体的构建与转化

1、基因敲除载体的构建

设计PCR引物，以野生型B2的基因组DNA为模板，分别扩增fogaa基因的左臂片段(673bp，序列表序列1的第229～901位)和右臂片段(735bp，序列表序列1的第2951～3685位)，左臂正向引物5'-ggggtaccATGGCTCATCTCATCTCATT-3'，其5'端带有Kpn I酶切位点，反向引物为5'-ccgctcgagATATGCTGTTCTGGGATTGA-3'，其5'端带有Xho I酶切位点；右臂正向引物5'-cggaattcCCATTACGCCAGATATACTACT-3'，其5'端带有EcoR I酶切位点，反向引物为5'-gctctagaTCACAAGCAACATCCAACT-'3，其5'端带有Xba I酶切位点。将扩增得到的左臂片段用Kpn I和Xho I酶切，右臂片段用EcoR I和Xba I酶切，将含有Kpn I和Xho I粘性末端的左臂先连接到质粒pCT74的经Kpn I和Xho I双酶切后的大片段上，得到中间载体pCT74-左臂，再把含有EcoR I和Xba I粘性末端的右臂连接到pCT74-左臂的经EcoR I和Xba I双酶切后的大片段上，获得图2所示的fogaa基因的敲除载体pCTfogaa，该载体可敲除野生型B2菌株中的序列表序列1的第1507～2763位所示的序列(该序列中包含序列表序列3所示蛋白质的编码序列)。

2、基因敲除载体的转化

将150mLPDB培养液(葡萄糖20g/L，200g/L马铃薯)装入250mL三角瓶，接入尖孢镰刀菌古巴专化型B2孢子液，在26～28℃、110r/min条件下震荡培养10～15h，用三层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤后转移至灭菌的50mL离心管中，每0.1克菌丝加入2mL的酶解液(含20mg/mL崩溃酶的0.7M氯化钠水溶液)，26～28℃、100r/min条件下酶解3～4h后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4,000r/min离心15min，再用STC溶液(1.2M山梨醇，50mM氯化钙，10mM Tris-Cl，pH7.5)洗涤原生质体一次，然后离心沉淀，最后用STC溶液将原生质体浓度调至0.5×10⁸-1×10⁸个/mL。

将制备好的原生质体分装于灭菌的2mL离心管中，每管200μL，加入约2～3μg经限制性内切酶Kpn I和Xba I线性化的敲除载体pCTfogaa，室温放置20min，每管加入1.2mLPTC溶液(40％聚乙二醇3350，50mM氯化钙，10mM Tris-Cl，pH7.0)，室温静置20min。将其加入100～150mL冷却至45℃的再生培养基(含50μg/升的潮霉素)，混匀，铺平板，每个培养皿大约15mL。置于28℃培养4～6天，出现的转化体经单胞纯化，用20％甘油溶液保存，下一步实验备用。

二、互补载体的构建和转化

1.互补载体的构建

设计PCR引物，扩增包含完整fogaa基因及其5’端上游启动子区和3’端下游的600bp左右的DNA片断(序列表序列1第430～3353位)。使用正向引物(5‘-ggttctcgaggtcgaATTCTGCTTCTGCTTCTGCTA-’3，包含Clonase酶重组位点)和反向引物(5‘-caagctggcagtcgaATCCGAGTGACGAGTGAGTA-’3，包含Clonase酶切位点)并以野生型菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，可获得fogaa互补DNA片断。该片断可编码序列表中序列3所示的蛋白质。用Clonase重组酶(Clontech，USA)将该片断与经限制性内切酶Sal I酶切后的质粒pSD1的大片段相连接，得到包含有fogaa基因互补DNA片断和新霉素磷酸转移酶基因(npt II)的质粒pSD-fogaa。该质粒可以用来互补基因fogaa的敲除体Δfogaa。

2、互补载体的转化

将互补载体pSD-fogaa按照步骤一中2的方法转入敲除体Δfogaa中，用含50μg/mL新霉素的再生培养基筛选转化体，得到敲除体Δfogaa的互补体Δfogaa+fogaa。

敲除突变体和互补体的PCR和RT-PCR验证

提取转化子和野生型菌株基因组DNA，以之为模板用设计的3对特异引物进行PCR扩增鉴定。第1对验证引物(P1:5’-ATTCAGCCGCTCGTGATAAC-‘3和P2:5’-CGTTGCAAGACCTGCCTGAA-‘3)可鉴定在fogaa左侧翼发生的同源重组，第2对验证引物(P3:5’-GACCACTACCAGCAGAACAC-‘3和P4:5’-TAGCAAGGTTAGCAAGTGTATG-‘3)可鉴定在fogaa右侧翼发生的同源重组，第3对验证引物(P5:5’-ATGGGCTGCGGAATGAGCA-‘3和P6:5’-GATAAGACCACAGAGACGCAGG-‘3)可鉴定fogaa基因的缺失。

PCR结果显示，用第1和第2对验证引物进行PCR扩增，fogaa敲除突变体Δfogaa和互补体Δfogaa+fogaa均可检测到预计的1.6kb条带，而野生型菌株则不能检测到。用第3对验证引物进行PCR鉴定，fogaa敲除突变体Δfogaa检测不到目标带，而野生型菌株可检测到大约1.2kb的条带(图2)。提取转化子和野生型菌株B2的总RNA并反转录合成cDNA第一链，以之为模板进行RT-PCR验证。用fogaa的引物fogaa-RT-F(5'-CTGCTCGGTGCTGGTGAATCTG-3')和fogaa-RT-F(5'-CATTGACTGAACGGTGTTGCTGAAG-3')和对照actin的引物actin-F(5'-CCAAGTCCAACCGTGAGAAGATGA-3')，actin-R(5'-CCAGAGTCCAGAACGATACCAGTG-3')分别进行PCR扩增。将扩增后得到的产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳。结果如图3和4所示：尖孢镰刀菌菌株B2和互补体Δfogaa+fogaa均可扩出344bp的目的条带，而敲除体Δfogaa不能扩出该目的条带。同时在所有菌株中均可扩增到Actin基因的预计条带。这些结果表明野生型尖孢镰刀菌菌株B2和互补体的fogaa基因可表达，而fogaa基因敲除突变体Δfogaa不能表达。

三、野生型、敲除体和互补体的产孢能力和致病力比较

1.产孢能力比较

将尖孢镰刀菌古巴专化型野生菌株B2、敲除体Δfogaa与互补体Δfogaa+fogaa分别接于PDA平板上，每个菌株重复3个平板，在28℃培养箱中静置培养5天。然后用打孔器在每个平板菌落中央打3个菌饼，放入50mL三角瓶中，并加入3mL无菌水充分冲洗，混匀，使孢子悬浮在水中，用血球计数板计数。

结果：野生型菌株B2和互补体Δfogaa+fogaa的产孢量分别为21.1×10⁶个/mL和19.3×10⁶个/mL，敲除突变体Δfogaa的产孢量为4.4×10⁶个/mL(图5)。结果表明fogaa基因敲除导致产孢量显著下降。

2.致病力比较

为验证fogaa基因在对香蕉致病力中的作用，将野生型尖孢镰刀菌古巴专化型菌B2、敲除体Δfogaa与互补体Δfogaa+fogaa分别接种于香蕉和粉蕉根系，接菌30天后，纵向切开球茎，观察球茎内部褐变程度，按照分级标准(0级-无褐变；1级-20％以内球茎褐变；2级-40％以内球茎褐变；3级-60％以内球茎褐变；4级-80％以内球茎褐变或者植株死亡)统计病情指数。

具体操作如下:

分别将野生型尖孢镰刀菌菌株B2、敲除体Δfogaa与互补体Δfogaa+fogaa接种于300mL的PDB培养液中，震荡培养7天。用血球计数板计算菌液的孢子浓度，并用无菌水将菌液调至10⁷个孢子/mL。

各取30株香蕉苗(株高约30cm)，取上述制备的孢子液50mL接种于香蕉根部，对照用无菌水接种。处理后的香蕉苗按照日常栽培管理方法进行。接种粉蕉苗方法与上述相同。致病力测试实验各重复3次。

结果：野生型尖孢镰刀菌菌株B2和互补体Δfogaa+fogaa在香蕉上的病情指数分别为55.0和52.2；而敲除体Δfogaa在香蕉的病情指数分别为12.1(如图6所示)。野生型尖孢镰刀菌菌株B2和互补体Δfogaa+fogaa在粉蕉上的病情指数分别为28.7和30.1；而敲除体Δfogaa在粉蕉的病情指数分别为11.6(如图7所示)。结果表明，由于fogaa基因的缺失，导致敲除体Δfogaa中序列表序列2的转录，也无序列表序列3所示蛋白质的表达，对香蕉和粉蕉的致病力显著下降。

本发明公开尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因及其用途。该fogaa基因及其编码的蛋白质序列分别如序列表序列1～3所示，该基因及其编码蛋白可用于调控尖孢镰刀菌古巴专化型病原菌的产孢能力及其对香蕉植株的毒力。实验证明，fogaa基因分别被潮霉素抗性表达盒置换后得到的基因敲除突变体产孢量和毒力显著下降，比野生型菌株和互补体产孢量和对香蕉和粉蕉的毒力更低。本发明所提供的方法和应用在尖孢镰刀菌古巴专化型引起枯萎病的控制方面具有重要意义。

Claims (9)

1.尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因为序列表序列1中第1507～2763位核苷酸所示的基因。

2.如权利要求1所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质为序列表序列3所示的蛋白质。

3.如权利要求2所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢能力及其对香蕉的毒力中应用。

4.如权利要求2所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂中的应用。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于所述调控尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢能力及其对香蕉的毒力的方法包括调控所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列3所示fogaa蛋白质的表达水平，或调控所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列2所示fogaa基因的转录水平的步骤。

6.如权利要求4所述应用，其特征在于所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂的方法，包括但不限于以所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列3所示的蛋白质为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列3所示蛋白质表达的待检测物质作为候选的尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂的步骤。

7.如权利要求4所述应用，其特征在于所述采用所述尖孢镰刀菌古巴专化型G蛋白fogaa基因的编码蛋白质在靶点筛选或鉴定香蕉枯萎病杀菌剂的方法，包括但不限于以所述尖孢镰刀菌古巴专化型中序列表序列2所示的fogaa基因为靶点对待检测物质进行筛选，将得到的抑制序列表序列2所示fogaa基因转录的待检测物质作为候选的香蕉枯萎病杀菌剂的步骤。

8.具有如下至少一种功能的物质在制备尖孢镰刀菌古巴专化型杀菌剂中的应用：

1)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质表达水平；

2)降低序列表序列3所示氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa蛋白质的表达水平；

3)降低序列表序列2所示fogaa基因的转录水平；

4)降低序列表序列2所示核苷酸序列经过至少一个核苷酸碱基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa基因的转录水平。

9.具有如下至少一种功能的物质在制备抗枯萎病的香蕉植株中的应用：

1)降低序列表序列3所示氨基酸序列组成的蛋白质表达水平；

2)降低序列表序列3所示氨基酸序列经过至少一个氨基酸残基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的Fogaa蛋白质的表达水平；

3)降低序列表序列2所示fogaa基因的转录水平；

4)降低序列表序列2所示核苷酸序列经过至少一个核苷酸碱基取代和/或缺失，和/或添加，且具有调控尖孢镰刀菌古巴专化型产孢能力和致病力功能的fogaa基因的转录水平。