CN113088559A - 一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速筛选CRISPR‑Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，涉及基因编辑技术领域，包括以下步骤：(1)在靶标基因的不同位置设计N个靶点，分别构建基因组编辑载体和LUC融合靶点的表达载体；(2)测试LUC融合靶点后载体中双荧光素酶能正常表达；(3)将N个靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体，利用双荧光素酶报告系统测定原生质体LUC和REN的活性，比较N个靶点LUC/REN的比值，确定最小比值者为最佳靶点。本发明方法具有靶位点的选择不受限制性内切酶位点的限制，可选择性广，且成本低，能够快速筛选出基因编辑活性高的靶位点进行下一步CRISPR‑Cas9基因组编辑工作。

Description

一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，更具体的说是涉及一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法。

背景技术

目前，基因组编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已广泛应用于动植物基因的功能和分子育种工作。CRISPR/Cas9的基因组编辑主要由Cas9蛋白与sgRNA(single-guide RNA)组成，靶位点通常由20碱基的碱基序列构成，靶点的3′端连有PAM序列，Cas9蛋白的PAM序列为NGG，N为任意碱基。Cas9蛋白与gRNA结合后，先识别基因组PAM序列，然后通过gRNA与靶序列DNA链互补配对，完成靶位点的定位过程，定点后Cas9蛋白在离PAM序列3-4碱基的位置进行切割靶点DNA的两条链，从而形成DSB结构，然后细胞启动自我修复机制，在DNA切口处产生碱基丢失、插入或替换，造成基因的突变，实现对目的基因精确的编辑。

然而，现有研究发现，对于同一个基因，不同靶位点产生的基因组编辑效率差异很大；而且，基因组编辑突变的实现是基于稳定的遗传转化体系的，对于植物特别是园艺作物来说，其稳定的遗传转化体系的效率低，周期长。如香蕉的遗传转化周期长达1-2年。为了快速高效的得到基因组编辑突变材料，很有必要在进行稳定的基因组编辑株系创制前，对不同靶位点的gRNA的编辑突变效率进行筛选，挑选高活性的靶位点进行稳定转化操作。目前，进行gRNA活性检测的方法主要两种：一种是PCR-RE，需要设计含有限制性内切酶位点的靶位点，这样使可选择靶位点的数量受到很大限制；另一种是PCR扩增子高通量二代测序方法，该方法测序需委托公司进行，价较昂贵，且测序周期长，影响研究进展。

因此，提供一种快速筛选高活性基因组编辑gRNA靶位点的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种快速筛选高活性基因组编辑gRNA靶位点的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，包括以下步骤：

(1)在靶标基因的不同位置设计N个靶点，分别构建基因组编辑载体和LUC融合靶点的表达载体；

(2)测试LUC融合靶点后载体中双荧光素酶能正常表达；

(3)将N个靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体，利用双荧光素酶报告系统测定原生质体LUC和REN的活性，比较N个靶点LUC/REN的比值，确定最小比值者为最佳靶点。

将不同靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体后，由于基因组编辑载体的表达，会在LUC融合靶点载体中相应的靶点位置产生插入或缺失突变，使LUC编码框移码，从而产生无活性的LUC蛋白，进一步使检测的LUC活性下降，降低LUC/REN的比值。

作为本发明优选的技术方案，N≥2。

对基因组进行编辑时，选择2个及以上靶点进行筛选，可快速定位编辑活性高的位点，进一步利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，提高育种成功几率。

本发明的另一目的为提供上述快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法在基因组编辑中的应用。

经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，与现有技术相比，本发明方法具有靶位点的选择不受限制性内切酶位点的限制，可选择性广，且成本低，能够快速筛选出基因编辑活性高的靶位点进行下一步CRISPR-Cas9基因组编辑工作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为香蕉PDS基因结构及靶位点示意图；

图2附图为CRISPR/Cas9基因组编辑载体示意图；

图3附图为LUC融合靶点活性检测结果示意图；

图4附图为不同靶位点gRNA活性鉴定双荧光素酶报告系统示意图；

图5附图为不同靶位点基因组编辑活性LUC/REN结果示意图；

图6附图为高通量测序扩增示意图；

图7附图为不同靶位点高通量测序法基因组编辑效率分析示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

构建LUC融合靶点的表达载体和基因组编辑载体。

1.以香蕉白化基因PDS为靶标基因，分别选取MaPDS基因的第二和第七个外显子上的5′-CATCTTTCTGCAATGGTCCACGG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-CCGGACCGAGTCAATGATGAAGT-3′(SEQ ID NO：2)为靶标位点，记为T1和T2(如附图1所示)。

2.以pGreenⅡ0800-LUC载体为基础，针对不同靶位点T1和T2，构建靶点融合荧光素酶的LUC表达载体。

(1)以pGreenⅡ0800-LUC载体上的35S启动子为模板，设计引物扩增35S启动子。

PCR扩增长条件为：95℃3min；95℃5S,56℃15S,72℃30S35个循环，72℃5min。

PCR反应体系为：

两对引物如下(在下游引物中引入含有香蕉PDS基因靶点的序列)：

F1:5′-GTGGAGATCGAATTCCCATGGTGAGACTTTTCAACAAAGG-3′(SEQ ID NO：3)；

R1:5′-TATGTTTTTGGCGTCTTCGCCGTGGACCATTGCAGAAAGATGCATTGTCCTCTCCAAATGAAAT-3′(下划线部分为含靶位点的24bp序列)(SEQ ID NO：4)。

F2:5′-GTGGAGATCGAATTCCCATGGTGAGACTTTTCAACAAAGG-3′(SEQ ID NO：5)；

R2:5′-TATGTTTTTGGCGTCTTCAACTTCATCATTGACTCGGTCCGGCATTGTCCTCTCCAAATGAAAT-3′(下划线部分为含靶位点的24bp序列)(SEQ ID NO：6)。

(2)将PCR扩增产物用常规胶回收试剂盒对片段进行回收，测定浓度。

(3)将pGreenⅡ0800-LUC质粒载体按如下体系用Nco I酶进行消化，反应30分钟后用常规胶回收试剂盒对片段进行回收，测定浓度。

(4)片段与载体连接反应

利用

II One Step Cloning Kit(C112)试剂盒(南京诺唯赞)按如下体系进行连接反应：

最终确定最适插入片段是为0.06pmol；载体用量为0.03pmol。

(5)转化大肠杆菌感受态，涂布于LB卡那平板上，利用引物组F：5′-gtaaaacgacggccagtgaa-3′(SEQ ID NO：7)；R：5′-aattgttccaggaaccagggc-3′(SEQ ID NO：8)进行菌落验证，验证正确的菌落委托上海生工生物工程有限公司进行测序，测序引物为M13F。

3.以pCMABIA 1300载体为基础，针对不同靶位点T1和T2，构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体。

(1)以pCAMBIA 1300载体为基础，委托上海生工生物工程有限公司合成包括MaCas9(香蕉密码子优化的Cas9蛋白)+Nos(终止子)在内的4493bp序列(SEQ ID NO：9)，将合成序列克隆至Eco RI和Kpn I酶切线性化的pCMABIA 1300载体，形成pCMABIA1300+MaCas9载体。

(2)利用Eco RI位点，PCR扩增Ubi启动子，将Ubi启动子克隆至MaCas9的上游形成pCAMBIA 1300+Ubi::opMaCas9载体。

F3:5′-GCTATGACTGATTACGAATTCGTCGTGCCCCTCTCTAGAGA-3′(SEQ ID NO：10)；

R3:5′-TTTTTTCGGTGCCATGAATTCCTGCAGAAGTAACACCAAACAACA-3′(SEQ ID NO：11)。

(3)取100ng pBlue-MaU6c质粒(合成MaU6c序列后克隆至pBluescript SK载体)为模板，根据靶标位点设计反应引物，分别扩增驱动gRNA表达的启动子片段和含靶标位点的gRNA片段，电泳验证PCR产物长度。

引物组序列：

MaU6c-T1F:5′-GATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCAATTGGCACATTCTTTTGGTATCTT-3′(SEQ ID NO：12)；

MaU6c-T1R:5′-TGGACCATTGCAGAAAGATGCAACAGCGTTACCGATCGACG-3′(SEQ ID NO：13).

gRNA-T1F:5′-GCATCTTTCTGCAATGGTCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3′(SEQ IDNO：14)；

gRNA-T1R:5′-TCCCCGGGTACCCACTACGGCGCGCCAAAAAAAGCACCGACTCG-3′(SEQ IDNO：15).

MaU6c-T2F:5′-GATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCAATTGGCACATTCTTTTGGTATCTT-3′(SEQ ID NO：16)；

MaU6c-T2R:5′-GACCGAGTCAATGATGAAGTCAACAGCGTTACCGATCGACG-3′(SEQ ID NO：17).

gRNA-T2F:5′-GACTTCATCATTGACTCGGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT-3′(SEQ IDNO：18)；

gRNA-T2R:5′-TCCCCGGGTACCCACTACGGCGCGCCAAAAAAAGCACCGACTCG-3′(SEQ IDNO：19).

PCR程序：

94℃10s，57℃15s，72℃20-50s，30-35循环。

进一步用Asc I酶切pCAMBIA 1300+Ubi:opMaCas9载体，然后利用诺唯赞

MultiS One Step Cloning Kit多片段克隆试剂盒，按照说明书，将MaU6c启动子和含靶位点的gRNA片段克隆进pCAMBIA 1300+Ubi:MaCas9载体形成pCAMBIA 1300+Ubi::opMaCas9+MaU6c::T1/T2gRNA载体，用于基因组编辑。

(4)按如下体系进行连接克隆反应(线性化载体200ng、启动片段15ng、gRNA10ng、5×CE MultiS Buffer4μl、Exnase MultiS 2μl、ddH₂O补足至20μl)：37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却备用。

(5)取1-1.5μl连接产物热击转化E.coli DH5α感受态细胞，热击激后加入1ml LB培养基，37℃培养1-1.5h。涂板培养基为LB+50μg/ml Kan。

提取质粒，利用测序引物F:5′-gcggtgtcatctatgttactag-3′(SEQ ID NO：20)和R:5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′(SEQ ID NO：21)对MaU6c-gRNA表达框的序列(SEQ ID NO：22)进行确认。

将测序确认正确的质粒电击转化农杆菌EHA105。从农杆菌克隆中提取质粒，取约5-10ng质粒为模板，用扩增启动子和扩增gRNA的引物进行PCR确认，构建好的载体如附图2所示。

4.原生质体分离及载化

选择颗粒较小、且分布均匀的继代培养10天左右香蕉悬浮细胞，吸取掉M2培养基，加入10ml酶解液(3.0％纤维素酶R-10，1％离析酶R-10，0.2％果胶酶Y-23，15.2g/L KCl，7.8g/L CaCl₂，100mg/LMES，10％甘露醇，pH 5.7)，26-28℃，50rpm/min摇床黑暗培养6-8小时；然后显微镜下观察原生质体的产量，待酶解充分，加入10ml W5溶液稀释酶解液，摇荡10s，使原生质体分开；用75微米的滤膜过滤酶解液至圆底离心管中；100g离心3min，用移液枪去掉上清；加入15ml W5 Solution重悬，冰浴30min，使原生质体沉淀，弃上清；在室温下用MMG Solution重悬，调整原生质体浓度为2×10⁶-2×10⁷，至冰上，待转化；加20μg质粒到2ml离心管中，离心使沉淀至管底，用去尖1ml枪头吸取200μl原生质体至离心管中，轻弹混匀，立即加入250μl 50％PEG 4000，轻轻敲打离心管使之混匀，避光诱导转化30min；加900μl W5 Solution稀释混合液，轻轻颠倒混匀，使之停止转染；100g离心3min，弃上清；用1mlW5重悬原生质体；颠倒混匀，26-28℃黑暗培养。

实施例2

检测荧光素酶活性。

(1)检测LUC融合靶点后载体中双荧光素酶的表达情况，结果显示，在转化香蕉原生质体后，LUC能正常表达(如附图3所示)。

(2)检测

按照试剂盒Dual-luciferase reporter assay kit(美国Promega公司)的说明对转化后的原生质体进行处理，用多功能酶标仪检测荧光素酶的活性。

(1)转化后的香蕉原生质体暗培养4-5天后取出，100g离心2分钟，去除上清液。

(2)加入100μl 1×PLB裂细胞重悬，在室温下轻柔震荡10分钟，离心5秒后取上清液用于检测。

(3)样品处理完后，将多功能酶标仪的“measurement”设定为10秒。

(4)然后向荧光96孔酶标板中先加入20μl细胞裂解液，再依次加入100μl LAR II，用移液器轻轻混匀2-3次。

(5)加样完成后，放入多功能酶标仪样品槽中测定LUC的荧光强度。

(6)取出荧光96孔板，向每孔中加入100μl Stop&Glo buffer，读取REN的荧光强度，每个样品测5-6个重复。

不同靶位点gRNA活性鉴定双荧光素酶报告系统如附图4所示。不同靶位点基因组编辑活性(LUC/REN比值)结果如附图5所示。

系统报告显示靶点T1的LUC/REN比值为0.53，靶点T2的LUC/REN比值为0.31，T2比T1比值小，靶点T2的基因编辑活性比靶点T1高。

实施例3

扩增子高通量测序验证基因组编辑效率。

转化的原生质体在暗培养4-5天后，采用天根公司的快捷型植物基因组提取试剂盒提取原生质体DNA。

在T1、T2靶位点的上、下游分别设计引物组，第一轮PCR扩增800-1000bp的片段，然后将PCR产物稀释10倍作为模板，进行第二轮扩增150-200bp的片段，针对每个靶位点在进行第二轮扩增引物的5′端加上特异的6个碱基的barcode，切胶回收第二轮扩增的PCR产物(如附图6所示)。每个样品取200ng混合成一个库，将混合的样品委托上海生工生物工程有限公司进行二代高通量测序，深度一般为2-3G。利用引物5′端加上的barcode挑选出每个样品的序列(6-8个碱基)，然后与参考序列对比分析，存在INDEL的序列被认为发生了基因组编辑突变，通过统计发生突变的reads来确定基因组编辑效率。

PCR扩增条件为：30-35循环：94℃10s，57℃15s，72℃1min(第一轮)；30-35循环：94℃10s，57℃15s，72℃30s(第二轮)。

T1靶点第1轮引物：

F:TAAGAATATAGAGGCCAGCATGAACATTATCGG(SEQ ID NO：23)；

R:TCACTCCATATACATGTTGGCATCTTTAGCA(SEQ ID NO：24)。

T1靶点第2轮编辑载体转化引物：

F:AGTCAATGATTTATCACCGGGAAATAGTGGA(SEQ ID NO：25)；

R:AGTTCCCTAAAGATATCAGAATGTCATACCTGCAC(SEQ ID NO：26)。

T1靶点第2轮对照载体转化引物：

F:CACGATTGATTTATCACCGGGAAATAGTGGA(SEQ ID NO：27)；

R:CACTCACTAAAGATATCAGAATGTCATACCTGCAC(SEQ ID NO：28)。

T2靶点第1轮引物：

F:ATATAAACATGTCATTTCGTGTCAACCAGT(SEQ ID NO：29)；

R:TTTGTGCATTTTGTTCGATATGAATATGGACT(SEQ ID NO：30)。

T2靶点第2轮编辑载体转化引物：

F:CAACTACTTTGCTAAGTTAATATGTTCTTTGATAAGTG(SEQ ID NO：31)；

R:CACCGGAAAACGGTTCAAAGCAATTAATACACA(SEQ ID NO：32)。

T2靶点第2轮对照载体转化引物：

F:TCGAAGCTTTGCTAAGTTAATATGTTCTTTGATAAGTG(SEQ ID NO：33)；

R:TCGGCAAAAACGGTTCAAAGCAATTAATACACA(SEQ ID NO：34)。

原生质体DNA提取：转化的原生质体在暗培养4-5天后，收集原生质体，提取原生质体DNA，原生质体DNA小量提取采用天根公司的快捷型植物基因组提取试剂盒。具体操作步骤如下：

(1)将原始质体12000rpm离心2min，去上清，加入400μL缓冲液FP1和6μL的RNaseA(10mg/mL)，旋涡1分钟，室温放置10分钟。(2)加入130μL缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1分钟。(3)12,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的1.5mL离心管中。(4)向离心管中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，于-20℃冰箱放置30min，然后12,000rpm离心10min，弃上清，保留沉淀。(5)加入700μL 70％乙醇，涡旋振荡5秒，12,000rpm离心2min，弃上清。重复一次。(6)打开离心管的盖子，置于室温过夜风干，彻底去除残余的乙醇。(7)加入适量65℃预热的ddH2O溶解DNA。(8)测定DNA浓度后于-20℃冰箱保存。

上海生工生物工程有限公司进行二代高通量测序的结果如附图7所示，靶点T2的基因组编辑效率明显高于靶点T1，与通过靶位点gRNA活性鉴定双荧光素酶得出的结果是一致的。证明本发明方法在快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的应用上切实可行，具有成本低，时间短的优势，对于遗传转化周期长的作物，具有重要的意义和现实前景。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东省农业科学院果树研究所

<120> 一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

catctttctg caatggtcca cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaccgag tcaatgatga agt 23

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggagatcg aattcccatg gtgagacttt tcaacaaagg 40

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatgtttttg gcgtcttcgc cgtggaccat tgcagaaaga tgcattgtcc tctccaaatg 60

aaat 64

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtggagatcg aattcccatg gtgagacttt tcaacaaagg 40

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatgtttttg gcgtcttcaa cttcatcatt gactcggtcc ggcattgtcc tctccaaatg 60

aaat 64

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtaaaacgac ggccagtgaa 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aattgttcca ggaaccaggg c 21

<210> 9

<211> 4493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcaccga aaaaaaagag gaaggtcggt atacatgggg ttcctgcagc tgataaaaag 60

tatagcattg gcttggacat agggactaat tctgttggtt gggccgtcat aacagatgag 120

tacaaagtac cttctaagaa gttcaaggtt ctgggtaaca ccgaccgtca ctctattaag 180

aagaacctca ttggcgctct tctgttcgac tccggggaga ccgctgaagc aacgcggttg 240

aagcgtaccg ctcggcggcg ttataccagg cgtaagaacc gtatttgcta cttgcaggag 300

atattctcaa atgagatggc gaaagtggat gactctttct tccataggtt ggaggagagt 360

ttcctcgttg aggaagataa gaaacatgag cgacatccga tcttcgggaa tatcgttgat 420

gaagtcgctt atcacgagaa gtatcccacg atctaccatc tgcggaaaaa gctggtcgat 480

agtacggata aggcggactt gcgcctcatc tacctggctc ttgcacacat gattaagttt 540

agggggcatt tccttataga aggagacctt aaccccgata atagtgacgt ggataaattg 600

tttatacaac tcgttcagac gtacaaccaa ttgttcgagg agaacccaat aaatgcaagt 660

ggtgtcgatg ctaaagcaat tttgtcagcg agactctcca agagccgtcg tctcgaaaac 720

cttatagctc aactgcccgg ggagaaaaaa aacgggttgt tcggcaacct cattgcgttg 780

tctttgggcc tgactccgaa ttttaaatca aatttcgacc tcgcagagga cgccaagctc 840

caactcagta aagacacgta cgatgacgat ctcgacaatc tgctggccca gattggcgat 900

caatatgccg atctctttct cgcagcaaag aatctgtctg acgctatcct gctctcagac 960

atcctgagag ttaatactga gatcacgaaa gcacctttgt cagctagtat gataaagcgt 1020

tatgatgaac atcaccagga tctgaccttg cttaaggccc ttgtccggca gcaactccct 1080

gagaaatata aggagatctt cttcgatcaa tccaagaacg ggtatgctgg gtatatcgat 1140

gggggcgctt cacaggaaga gttctacaag tttatcaaac ctattttgga gaagatggac 1200

ggaacggagg aactgctcgt caagcttaac cgtgaggatc ttctccgaaa acagagaaca 1260

ttcgataatg gctcaatacc acatcaaatc catctcgggg agcttcacgc aatcctccga 1320

cggcaagagg acttctaccc attcttgaag gataatcgtg agaagattga aaagattttg 1380

acattccgga taccatatta tgtggggcca ctggcccgcg gtaattctcg cttcgcctgg 1440

atgacccgga agtccgagga gactatcacg ccgtggaatt ttgaagaggt tgttgataag 1500

ggggcttcgg cccagtcatt catagagagg atgacgaatt tcgacaagaa cttgccaaat 1560

gagaaagtgc tccctaagca tagtttgttg tatgagtatt tcacagtgta caatgaactc 1620

actaaagtaa agtacgttac ggaaggcatg cgcaagcctg cctttctctc gggtgagcaa 1680

aaaaaggcta tcgtcgatct gttgtttaag actaatcgga aggtcacagt caagcaactg 1740

aaggaggact actttaaaaa aattgagtgc ttcgactcag tggagattag cggggtggaa 1800

gataggttca atgcgtcctt gggcacttac cacgacttgc tgaagatcat caaggacaaa 1860

gattttcttg acaatgaaga aaacgaagat attttggagg atatcgtctt gactctgacc 1920

ctgtttgagg atagggaaat gattgaggaa agactgaaga cgtacgcgca tttgtttgat 1980

gacaaggtga tgaagcagtt gaaaagacgg cggtatactg gatgggggag gctctctaga 2040

aagttgatta acggtatcag agataaacag agtggcaaga ccatactcga ttttctcaaa 2100

tcagacggat tcgctaatag gaatttcatg cagctgatcc atgacgactc tctcaccttc 2160

aaagaggaca ttcagaaagc ccaagtttca ggacagggtg acagtctcca cgaacatatc 2220

gcaaacctcg ctggctctcc cgctattaag aaagggattc tgcaaactgt aaaggtggtc 2280

gatgagcttg tgaaagttat gggaaggcat aagcctgaga acattgtgat tgaaatggcg 2340

agggagaacc aaactactca gaagggtcaa aaaaactcga gagagcgtat gaagcgaatt 2400

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caattgcaaa atgagaagct gtatctctac taccttcaga atggaaggga tatgtacgtg 2520

gaccaagaac tggatattaa tcggctctcg gattacgatg ttgaccatat tgttccgcag 2580

tcattcctca aagatgacag tattgataat aaagtgctta cccgtagcga taagaatagg 2640

ggaaaatccg acaacgtgcc aagtgaggag gtggtgaaaa agatgaagaa ctattggcgt 2700

cagctcctga atgcaaagct tataacacag cgtaaattcg acaacctgac caaggctgag 2760

cgtggtgggc tctcagaact cgataaggcg gggttcatta aacggcagct cgtagagact 2820

cggcagatca ccaaacacgt ggcacaaatc ctggactcta ggatgaacac caagtatgac 2880

gagaatgaca agctgattcg tgaagtcaag gttattaccc tcaagagcaa gttggtctca 2940

gattttagga aagattttca gttctacaaa gttcgcgaga tcaataacta tcaccatgca 3000

cacgatgcat acctgaatgc cgtcgttggg acagccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060

gagtccgagt ttgtgtacgg agactacaag gtgtacgatg taaggaaaat gatcgcgaag 3120

tctgagcaag agataggcaa ggcaactgca aagtatttct tctactctaa tataatgaat 3180

ttctttaaga ccgagatcac gcttgccaat ggcgagatta ggaagagacc cctgatagag 3240

actaacgggg aaacgggtga gattgtttgg gataaagggc gggatttcgc gacggttcgg 3300

aaggtgttgt ctatgcctca ggttaacata gttaagaaga ctgaggtcca gacgggtgga 3360

ttctcaaagg agagcatcct gcctaaacgt aatagtgaca aattgatagc acggaagaag 3420

gattgggacc ctaagaagta cggcggattc gattctccga ccgtagccta cagtgttctg 3480

gtggtggcca aggtcgagaa gggaaagagc aagaagctga aatccgtgaa ggaactgttg 3540

gggataacta taatggagcg tagttcgttt gaaaagaacc ctattgattt ccttgaagcc 3600

aagggttaca aagaagtgaa gaaggatctg atcatcaagc ttcccaagta ctcactgttt 3660

gagctggaga acggaaggaa aaggatgttg gcatccgctg gtgagctcca gaaggggaat 3720

gagctcgctt tgcctagtaa gtacgtgaat ttcctctacc tcgcctcaca ctatgaaaag 3780

ctgaagggat caccggaaga caatgagcag aagcaactct ttgtggaaca acacaagcac 3840

tacttggatg agataattga gcaaatttca gagtttagca aaagagtgat tttggcagac 3900

gctaacctgg acaaagtctt gtccgcatat aataagcacc gggacaaacc aatccgtgag 3960

caagccgaga acattataca tttgtttacc cttactaacc tcggcgcacc ggcagcattt 4020

aagtatttcg acacgaccat agatagaaaa cgttacacct caacaaagga agtgctggac 4080

gctactctca ttcaccaatc gattactggc ctttatgaga caagaattga cctctctcag 4140

ttgggcggcg acaaaaggcc ggctgctaca aagaaagctg gtcaagcgaa gaaaaagaag 4200

taagatcctc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 4260

gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 4320

aacatgtaat gcatgacgtt atttatgagg tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 4380

tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 4440

gcggtgtcat ctatgttact agatcgggag caccggtaag gcgcgccgta gtg 4493

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctatgactg attacgaatt cgtcgtgccc ctctctagag a 41

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttttttcggt gccatgaatt cctgcagaag taacaccaaa caaca 45

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatcgggagc accggtaagg cgcgccaatt ggcacattct tttggtatct t 51

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tggaccattg cagaaagatg caacagcgtt accgatcgac g 41

<210> 14

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcatctttct gcaatggtcc agttttagag ctagaaatag caagt 45

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tccccgggta cccactacgg cgcgccaaaa aaagcaccga ctcg 44

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gatcgggagc accggtaagg cgcgccaatt ggcacattct tttggtatct t 51

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaccgagtca atgatgaagt caacagcgtt accgatcgac g 41

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gacttcatca ttgactcggt cgttttagag ctagaaatag caagt 45

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tccccgggta cccactacgg cgcgccaaaa aaagcaccga ctcg 44

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gcggtgtcat ctatgttact ag 22

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 22

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aattggcaca ttcttttggt atcttaactg tttcttcttt ttcttatact aactttatga 60

tagctaatta attatctaac tggtctacta gtttattgaa actagtcaca gtaactttgt 120

tttactagcc gcaaaaatga tgtgttttac ttcactagat aagatttaaa catgggtgca 180

gacctcttta cctgtctaaa tattaaggtt tctctttgcc tgcctaaata ttaaagattc 240

aagtcaattg aggataatcc atctttttgc aagccaatat atgactatgc tgtttctata 300

gaatgcttag acatactttt cctgtaaact tgggaggcgg gtcggagcag tgaagctggt 360

agatgattcg agaatataac tagtgtgctg catttgaacc gacgaataat tattgcattg 420

gggttctcgt aagaagaaac aagatagaga gagcactatc ggttttgata agagtttatt 480

agcagcataa tggcgttgtg atggctgctg aagaagaagg gagttattag cagcaaagac 540

ttgggtgggg tgggtggtgc agaagaaagc ttgggtcggt gggtgaaatt taattatttt 600

caatttaaat atagttatta gcaaggttta gtcccacatc gtaattattt tcaagctaac 660

atctttttat caatccgtcg atcggtaacg ctgttggttt tagagctaga aatagcaagt 720

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttc 780

aagagcttgg agtggatgga tacgcgtcgg tcgagaccca cgct 824

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

taagaatata gaggccagca tgaacattat cgg 33

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcactccata tacatgttgg catctttagc a 31

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agtcaatgat ttatcaccgg gaaatagtgg a 31

<210> 26

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agttccctaa agatatcaga atgtcatacc tgcac 35

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

cacgattgat ttatcaccgg gaaatagtgg a 31

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cactcactaa agatatcaga atgtcatacc tgcac 35

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atataaacat gtcatttcgt gtcaaccagt 30

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tttgtgcatt ttgttcgata tgaatatgga ct 32

<210> 31

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caactacttt gctaagttaa tatgttcttt gataagtg 38

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

caccggaaaa cggttcaaag caattaatac aca 33

<210> 33

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tcgaagcttt gctaagttaa tatgttcttt gataagtg 38

<210> 34

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcggcaaaaa cggttcaaag caattaatac aca 33

Claims (3)

1.一种快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在靶标基因的不同位置设计N个靶点，分别构建基因组编辑载体和LUC融合靶点的表达载体；

(2)测试LUC融合靶点后载体中双荧光素酶能正常表达；

(3)将N个靶点的基因组编辑载体与LUC融合靶点载体共表达原生质体，利用双荧光素酶报告系统测定原生质体LUC和REN的活性，比较N个靶点LUC/REN的比值，确定最小比值者为最佳靶点。

2.根据权利要求1所述的快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法，其特征在于，N≥2。

3.上述快速筛选CRISPR-Cas9基因组编辑gRNA靶位点的方法在基因组编辑中的应用。

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