CN108003224A - 一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法 - Google Patents

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韩瑞
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Abstract

本发明涉及蛋白纯化领域，特别涉及一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；第一缓冲液洗涤阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；梯度洗脱阴离子交换层析柱，收集第一洗脱液；第一洗脱液上样于第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，梯度液洗脱疏水层析柱，收集第二洗脱液；进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白。该方法先使用柱层析的方法，然后再进行膜包过滤，整个过程需要10h左右，具有纯化时间短，纯化效率高，收率为80％‑85％，SDS检测无杂带，纯化效果好。

Description

一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法
技术领域
本发明涉及蛋白纯化领域，具体而言，涉及一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法。
背景技术
多杀性巴氏杆菌毒素占多杀性巴氏杆菌细菌总蛋白量的1％左右，由于杂蛋白含量极多，大量的杂蛋白极大的影响了毒素灭活以及引起疫苗副反应等问题。大量制备纯化多杀性巴氏杆菌毒素是配制猪萎缩性鼻炎灭活疫苗中极其重要的一步。
目前国内尚无相关类毒素产品上市，也没有生产相关类毒素的大量纯化技术的报道。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，该方法纯化过程简单，时间短，纯化效率高，回收率在80％以上，纯化效果佳。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，包括以下步骤：
(a)、采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；
(b)、所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；
(c)、采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度洗脱所述阴离子交换层析柱，所述第二缓冲液的体积百分数为55％-70％，收集第一洗脱液；
(d)、所述第一洗脱液上样于所述第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度液洗脱所述疏水层析柱，所述第一缓冲液的体积百分数为40％-65％，收集第二洗脱液；
(e)、所述第二洗脱液进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白；
所述第一缓冲液为pH为8.0±0.2的50±2mM Tris溶液；
所述第二缓冲液含有50±2mM Tris和1±0.2M NaCl，pH为8.0±0.2。
本发明提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，先使用柱层析的方法，仅需两步即可对多杀性巴氏杆菌细菌总蛋白进行纯化，纯化时间约8h；然后再进行膜包过滤，约1h即可完成。整个过程需要10h左右，而直接用膜包进行处理则需要170h左右，并且纯化后还含有较多的杂蛋白。可见，本发明提供的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，具有纯化时间短，纯化效率高，收率为80％-85％，SDS检测无杂带，纯化效果好。
本发明中，柱子的预处理包括洗涤和平衡的步骤。
本发明中，波长为280nm的吸光度即紫外光在特定波长下的数值，是对样品照射后的吸光度，能够反映出被照射样品的属性。
进一步地，所述阴离子交换层析柱为阴离子交换层析柱MAX Q-H。
优选地，步骤(a)中，上样的速度为2±0.2mL/min。通过适当的上样速度，使得目标蛋白充分挂到柱子上。
第一缓冲液在阴离子交换层析柱上洗涤很重要，因为这一步样品中杂蛋白以及其他杂质较多，不洗涤的话会直接影响阴离子交换层析柱的回收样品的纯净度。进一步地，步骤(b)中，所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱的速度为2-4mL/min，优选为2-2.5mL/min。
进一步地，步骤(c)中，洗脱的速度为1.5±0.2mL/min。这一步样品量很大，杂蛋白也很多，无法去除所有杂蛋白，所以，先快速去除一部分即可。综合考虑洗脱效果和时间，选用该洗脱速度。
进一步地，所述疏水层析柱为疏水层析柱MAX pheny 1。
进一步地，步骤(d)中，上样的速度为2±0.2mL/min。通过适当的上样速度，使得目标蛋白充分挂到柱子上。
上样后，可以选用第二缓冲液洗涤疏水层析柱，也不可以不洗涤。
优选地，步骤(d)中，洗脱的速度为1±0.2mL/min。综合考虑洗脱效果和时间，选用该洗脱速度，通过低速洗脱，得到纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白。
进一步地，步骤(e)中，所用的膜包为100kD膜包，所述膜包过滤时的流速10±1mL/min，膜包过滤过程中关闭流穿阀，仅收集滤液。
进一步地，所述阴离子交换层析柱与所述疏水层析柱的容量均为50mL，所述待纯化样品的浓度为150-250μg/mL，体积为5L，步骤(c)中,所述第一洗脱液与待纯化样品的体积比为1:8-10；
步骤(d)中，所述第一洗脱液与所述第二洗脱液的体积比为1:1±0.2。
经多次试验筛选，在阴离子交换层析柱进行该梯度洗涤的效果佳，进一步地，步骤(c)中，梯度洗涤中，所述第二缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％，60-150min为65％-70％，150-240min为70％。
经多次试验筛选，在疏水层析柱进行该梯度洗涤的效果佳，进一步地，步骤(d)中，梯度洗涤中，所述第一缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-20min为40％-45％，20-80min为45％-50％，80-140min为50％-55％，140-200min为55％-60％，200-240min为60％-65％。
另外，本发明收集的第二洗脱液可用100倍体积PBS缓冲液稀释，即可获得原倍多杀性巴氏杆菌毒素纯化样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，先使用柱层析的方法，增加两步进行纯化后，再进行膜包处理，大幅度缩短时间。
(2)本发明提供的一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，选用特定的阴离子交换层析柱和疏水层析柱，柱子纯化效率高，收率为80％左右，纯化效果好，SDS检测无杂带。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1不同洗脱液洗脱阴离子交换层析柱收集的洗脱液的电泳图；
图2为本发明实施例1不同洗脱液洗脱疏水层析柱收集的洗脱液的电泳图；
图3为本发明实施例1膜包处理后收集的滤液的电泳图；
图4为本发明对比例1膜包纯化法收集的纯化液体的电泳图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)的纯化方法，包括以下步骤：
1.试验材料
AKTApurifier蛋白纯化仪、电泳仪、pH计、电导仪、15mL离心管、阴离子交换层析柱MAX Q-H一根(50mL)、疏水交换层析株MAX pheny 1一根(50mL)、10倍浓缩粗提多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)5L。
2.试验缓冲液
buffer A:50mM Tris，pH 8.0；
buffer B:50mM Tris，1M NaCl，pH 8.0。
3.纯化过程
3.1阴离子交换层析
连接阴离子交换层析柱于蛋白纯化仪上，使用阴离子交换层析缓冲液buffer A对层析柱进行洗涤、平衡。当柱内pH值与电导值稳定后准备上样。
调节待纯化样品10倍浓缩多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)粗提液的pH值和电导值与阴离子交换层析缓冲液buffer A相同。按照2mL/min上样，上样量为5L。
上样结束后使用buffer A洗涤杂蛋白，洗涤速度为2mL/min，洗涤至λ280值开始明显上扬并平稳。
分别施用不同的梯度洗涤阴离子交换层析柱，然后得到的洗脱液进行电泳，结果如图1所示。
图1中，E1是5％-25％洗脱液；E2是25％-55％洗脱液；使用55％至70％buffer B梯度清洗阴离子交换层析柱，不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％(E3收集)，60-150min为65％-70％(E4收集)，150-240min为70％(E5收集)；E6是70％-90％洗脱液；FT3为流穿液，也就是上样流下的液体；W1为buffer A洗涤杂蛋白的清洗液。
可见，采用60％至70％buffer B梯度清洗阴离子交换层析柱的洗脱液含有目标蛋白。
后进行试验，使用55％至70％buffer B梯度清洗阴离子交换层析柱，不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％，60-150min为65％-70％，150-240min为70％，洗脱速度为1.5±0.2mL/min，均能得到目的蛋白。因此，选用该浓度范围进行梯度清洗阴离子交换层析柱。
3.2疏水层析柱
连接疏水层析柱于蛋白纯化仪上，使用buffer B对该层析柱进行洗涤、平衡。当柱内pH值与电导值稳定后准备上样。
调节上述洗脱样品的pH值和电导值，与buffer B相同。按照2mL/min上样，上样量为500mL。
上样结束后，用buffer B洗涤，收集洗涤液为W。经试验发现，该步骤可有可无。
使用40％至65％比例bufferA梯度清洗疏水层析柱，bufferA在不同时间段的体积百分比为：0-20min为40％-45％(E1收集)，20-80min为45％-50％(E2收集)，80-140min为50％-55％(E3收集)，140-200min为55％-60％(E4收集)，200-240min为60％-65％(E5收集)。另外，FT1和FT2分别为流穿液，也就是上样流下的液体；D为经阴离子交换层析处理后的洗脱液。
收集洗脱样品4小时，洗脱样品量约为500mL。
然后得到的洗脱液进行电泳，结果如图2所示。
3.3膜包过滤
3.2中收集的洗脱液进行膜包过滤，所用的膜包为100kD膜包(购自pall中国公司)，所述膜包过滤时的流速10±1mL/min，膜包过滤过程中关闭流穿阀，仅收集滤液，约1h收集完毕。
得到的滤液进行电泳，结果如图3所示。
将滤液样品用100倍体积PBS缓冲液稀释，即可获得原倍多杀性巴氏杆菌毒素纯化样品。
其中，本发明实施例中，阴离子交换层析柱MAX Q-H和疏水交换层析株MAX pheny1均购自捷恩智(上海)企业管理有限公司。
实施例2
一种多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)的纯化方法，包括以下步骤：
1.试验材料
AKTApurifier蛋白纯化仪、电泳仪、pH计、电导仪、15mL离心管、阴离子交换层析柱MAX Q-H一根(50mL)、疏水交换层析株MAX pheny 1一根(50mL)、10倍浓缩粗提多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)5L。
2.试验缓冲液
buffer A:50mM Tris，pH 8.0；
buffer B:50mM Tris，1M NaCl，pH 8.0。
3.纯化过程
3.1阴离子交换层析
连接阴离子交换层析柱于蛋白纯化仪上，使用阴离子交换层析缓冲液buffer A对层析柱进行洗涤、平衡。当柱内pH值与电导值稳定后准备上样。
调节待纯化样品10倍浓缩(浓度为200μg/mL)多杀性巴氏杆菌毒素(PMT)粗提液的pH值和电导值与阴离子交换层析缓冲液buffer A相同。按照2mL/min上样，上样量为5L。
上样结束后使用buffer A洗涤杂蛋白，洗涤速度为2mL/min，洗涤至λ280值开始明显上扬并平稳。
使用55％至70％buffer B梯度清洗阴离子交换层析柱，不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％，60-150min为65％-70％，150-240min为70％，洗脱速度为1.5±0.2mL/min，均能得到目的蛋白。因此，选用该浓度范围进行梯度清洗阴离子交换层析柱。收集洗脱样品4小时，洗脱样品量约为500mL。得到的洗脱液进行SDS电泳，得到的条带同图1的E3-E5条带一致。
3.2疏水层析柱
连接疏水层析柱于蛋白纯化仪上，使用buffer B对该层析柱进行洗涤、平衡。当柱内pH值与电导值稳定后准备上样。
调节上述洗脱样品的pH值和电导值，与buffer B相同。按照2mL/min上样，上样量为500mL。
使用40％至65％比例bufferA梯度清洗疏水层析柱，洗脱速度为1±0.2mL/min，bufferA在不同时间段的体积百分比为：0-20min为40％-45％，20-80min为45％-50％，80-140min为50％-55％，140-200min为55％-60％，200-240min为60％-65％。收集洗脱样品4小时，洗脱样品量约为500mL。
然后得到的洗脱液进行电泳，结果如图2所示的E1-E5条带一致。
3.3膜包过滤
3.2中收集的洗脱液进行膜包过滤，所用的膜包为100kD膜包(购自pall中国公司)，所述膜包过滤时的流速10±1mL/min，膜包过滤过程中关闭流穿阀，仅收集滤液，约1h收集完毕。
得到的滤液进行电泳，结果同图3一致。
将滤液样品用100倍体积PBS缓冲液稀释，即可获得原倍多杀性巴氏杆菌毒素纯化样品。
计算目标蛋白的浓度，收率为85％。
其中，本发明实施例中，阴离子交换层析柱MAX Q-H和疏水交换层析株MAX pheny1均购自捷恩智(上海)企业管理有限公司。
实施例3
与实施例2不同的是，3.1阴离子交换层析中，buffer A洗涤杂蛋白，洗涤速度为4mL/min。
计算目标蛋白的浓度，收率为80％。
对比例1
膜包纯化法
使用蠕动泵与30kD膜包，对PMT蛋白进行纯化。流速10mL/min，每工作1小时需使用1M氢氧化钠清洗膜包1小时，以防止膜包堵塞。
此方法只能对蛋白原液进行纯化，浓缩液极易导致膜包堵塞。纯化50L粗提多杀性巴氏杆菌毒素蛋白，需要170小时左右时间。
纯化效果如图4所示。
从图4可以看出，纯化后杂蛋白量较大，与目的蛋白量基本相同，且纯化耗时较长。
对比例2
与实施例2不同的是，洗脱速度不同，具体如下：
阴离子交换柱的洗脱速度为2mL/min，疏水层析柱的洗脱速度为1.5mL/min。
计算目标蛋白的浓度，收率为75％。
对比例3
与实施例2不同的是，洗脱速度不同，具体如下：
阴离子交换柱的洗脱速度为1mL/min，疏水层析柱的洗脱速度为0.5mL/min。
计算目标蛋白的浓度，收率为85％。
对比例4
与实施例2不同的是，选用的柱子不同。
选用的是GE公司的阴离子交换柱：Capto Q；疏水层析柱：Capto phenyl。
计算目标蛋白的浓度，收率为60％。
对比例5
与实施例2不同的是，选用的柱子不同。
选用的是GE公司的阴离子交换柱：Capto Q；疏水层析柱：Capto Butyl。
计算目标蛋白的浓度，收率为57％。
对比例6
与实施例2不同的是，选用的柱子不同。
选用的是苏州纳微科技公司的阴离子交换柱：NanoQ；疏水层析柱：疏水层析柱：UniHR Phenyl-30S。
计算目标蛋白的浓度，收率为55％。
对比例7
与实施例2不同的是，选用的柱子不同。
选用的是苏州纳微科技公司的阴离子交换柱：NanoQ；疏水层析柱：疏水层析柱：UniHR Butyl-30S。
计算目标蛋白的浓度，收率为58％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)、采用第一缓冲液对阴离子交换层析柱进行预处理，然后将待纯化样品上样；
(b)、所述第一缓冲液洗涤所述阴离子交换层析柱，至波长为280nm的吸光度数值开始明显上扬并平稳；
(c)、采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度洗脱所述阴离子交换层析柱，所述第二缓冲液的体积百分数为55％-70％，收集第一洗脱液；
(d)、所述第一洗脱液上样于所述第二缓冲液预处理后的疏水层析柱，采用所述第一缓冲液和第二缓冲液的混合液梯度液洗脱所述疏水层析柱，所述第一缓冲液的体积百分数为40％-65％，收集第二洗脱液；
(e)、所述第二洗脱液进行膜包过滤，得到的滤液即为纯化的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白；
所述第一缓冲液为pH为8.0±0.2的50±2mM Tris溶液；
所述第二缓冲液含有50±2mM Tris和1±0.2M NaCl，pH为8.0±0.2。
2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析柱为阴离子交换层析柱MAX Q-H。
3.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(a)中，上样的速度为2±0.2mL/min。
4.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(c)中，洗脱的速度为1.5±0.2mL/min。
5.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析柱为疏水层析柱MAX pheny 1。
6.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(d)中，上样的速度为2±0.2mL/min，洗脱的速度为1±0.2mL/min。
7.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(e)中，所用的膜包为100kD膜包，所述膜包过滤时的流速10±1mL/min，膜包过滤过程中关闭流穿阀，仅收集滤液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，所述待纯化样品的浓度为150-250μg/mL，体积为5L，步骤(c)中,所述第一洗脱液与待纯化样品的体积比为1:8-10；
步骤(d)中，所述第一洗脱液与所述第二洗脱液的体积比为1:1±0.2。
9.根据权利要求8所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(c)中，梯度洗涤中，所述第二缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-10min为55％-60％，10-60min为60％-65％，60-150min为65％-70％，150-240min为70％。
10.根据权利要求8所述的多杀性巴氏杆菌毒素蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(d)中，梯度洗涤中，所述第一缓冲液在不同时间段的体积百分比为：0-20min为40％-45％，20-80min为45％-50％，80-140min为50％-55％，140-200min为55％-60％，200-240min为60％-65％。
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汤细彪,等: "猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素PMT的提纯、对Vero细胞生物学活性及其毒素抗体的制备", 《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会论文集 》 *
范锋锋，等: "白喉毒素无毒突变体H21G蛋白的分泌性表达及纯化", 《中国生物制品学杂》 *

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