CN109293734A - 一种消除层析中洗脱肩峰的方法 - Google Patents
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- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
Abstract
本发明提供一种消除层析中洗脱肩峰的方法，是使用离子交换填料以结合洗脱的方式进行蛋白纯化，同时消除目的蛋白洗脱时UV检测出现的肩峰。其中，离子交换填料为Capto S ImpAct，该方法包括以下步骤：a)平衡：上样前用平衡缓冲液对离子交换填料进行平衡；b)上样：将蛋白样品加载至离子交换填料上，目的蛋白与离子交换填料结合；c)淋洗：用淋洗缓冲液淋洗离子交换填料；d)洗脱：用洗脱缓冲液将目的蛋白从填料上洗脱下来。本发明的方法通过利用差异化平衡缓冲液/淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的pH值的方法达到了消除纯化蛋白过程中洗脱肩峰的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及层析步骤中一种消除层析中洗脱肩峰的方法一种消除层析中洗脱肩峰的方法。
背景技术
离子交换层析，作为生物制药下游工艺中的精细纯化步骤，能够高效去除杂质，提高生物药蛋白质量。在结合洗脱模式的离子交换层析中，填料上结合的目的蛋白在盐浓度梯度或pH梯度洗脱过程中以单峰形式洗脱，但部分蛋白也会出现双峰形式的洗脱特征。在大规模生产中洗脱出现肩峰会影响样品的质量和生产操作复杂性。通过特殊地改变离子交换层析条件消除肩峰现象，有利于工艺的改进和样品质量的控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种消除层析中洗脱肩峰的方法，能够消除离子交换层析中的目的蛋白洗脱出现肩峰的问题，提高生产的可控性和工艺文稳健性。
为解决上述技术问题，本发明的一种消除层析中洗脱肩峰的方法，是使用离子交换填料以结合洗脱的方式进行蛋白纯化，同时消除目的蛋白洗脱时UV检测出现的肩峰。
具体的，所述离子交换填料为Capto S ImpAct。
具体的，所述方法包括以下步骤：
a)平衡：上样前用平衡缓冲液对离子交换填料进行平衡；
b)上样：将蛋白样品加载至离子交换填料上，目的蛋白与离子交换填料结合；
c)淋洗：用淋洗缓冲液淋洗离子交换填料；
d)洗脱：用洗脱缓冲液将目的蛋白从填料上洗脱下来。
具体的，所述方法还包括步骤：
e)结果评价：评估洗脱样品质量和层析图谱的特征。
具体的，所述平衡缓冲液与所述淋洗缓冲液的pH值相同，且低于所述洗脱缓冲液的pH值。
具体的，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液为50mM NaAc-HAc(pH 5.0)。
具体的，所述平衡缓冲液的体积为2-5个柱体积；
具体的，所述淋洗缓冲液的体积为3-5个柱体积。
具体的，所述洗脱缓冲溶液为50mM NaAc-HAc，70mM NaCl(pH 5.5)。
具体的，所述蛋白样品的pH为5.5，电导小于5mS/cm。
具体的，所述方法中，b)上样和c)淋洗的保留时间相同并大于3分钟。
本发明的方法是利用差异化平衡缓冲液/淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的pH值的方法来消除纯化蛋白过程中洗脱肩峰的现象。研究发现，在目的蛋白的离子交换层析中，将平衡缓冲液/淋洗缓冲液的pH值调至低于洗脱缓冲液的pH值，可以消除出现目的蛋白洗脱时UV检测出现肩峰的现象。
附图说明
图1为原有离子交换层析工艺图谱(结合洗脱模式)。
图2为本发明的离子交换层析工艺图谱(结合洗脱模式)。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
对比例1
离子交换层析具体方法(结合洗脱模式)如下：
层析填料为Capto S ImpAct；
消毒：0.5M NaOH溶液，消毒2个柱体积，暂停60分钟。
平衡：平衡缓冲液50mM NaAc-HAc,pH 5.5；平衡3个柱体积。
上样：目的蛋白与填料结合。
淋洗：淋洗缓冲液为50mM NaAc-HAc,pH 5.5；淋洗5个柱体积。
洗脱：洗脱缓冲液为50mM NaAc-HAc,70mM NaCl,pH 5.5；截峰收集。
评估层析结果，UV检测结果如图1所示。
实施例1
采用本发明提供的一种消除层析中洗脱肩峰的方法，对IgG1单克隆单体进行纯化。
离子交换层析具体方法(结合洗脱模式)如下：
离子交换层析填料为Capto S ImpAct；
消毒：0.5M NaOH溶液，消毒2个柱体积，暂停60分钟。
柱平衡：平衡缓冲液50mM NaAc-HAc,pH 5.0；平衡3个柱体积。
上样：蛋白样品上载结合到填料，目的蛋白会与离子交换填料结合。
淋洗：淋洗缓冲液为50mM NaAc-HAc,pH 5.0；淋洗5个柱体积。
洗脱：洗脱缓冲液为50mM NaAc-HAc,70mM NaCl,pH 5.5；洗脱截峰收集。
评估层析结果，包括图谱的特征，样品质量等。UV检测结果如图2所示。
结合图1和图2可以看出，图1存在一个明显的肩峰，但采用本发明的方法处理之后，目的蛋白的出峰位置和峰型不变，但肩峰消失。
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种消除层析中洗脱肩峰的方法，其特征在于，使用离子交换填料以结合洗脱的方式进行蛋白纯化，同时消除目的蛋白洗脱时UV检测出现的肩峰。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换填料为Capto S ImpAct。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)平衡：上样前用平衡缓冲液对离子交换填料进行平衡；
b)上样：将蛋白样品加载至离子交换填料上，目的蛋白与离子交换填料结合；
c)淋洗：用淋洗缓冲液淋洗离子交换填料；
d)洗脱：用洗脱缓冲液将目的蛋白从填料上洗脱下来。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
e)结果评价：评估洗脱样品质量和层析图谱的特征。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液与所述淋洗缓冲液的pH值相同，且低于所述洗脱缓冲液的pH值。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液为50mM NaAc-HAc，pH 5.0。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的体积为2-5个柱体积；所述淋洗缓冲液的体积为3-5个柱体积。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲溶液为50mM NaAc-HAc，70mMNaCl，pH 5.5。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白样品的pH为5.5，电导小于5mS/cm。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法中，b)上样和c)淋洗的保留时间相同并大于3分钟。
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| CN102471377A (zh) * | 2009-07-24 | 2012-05-23 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 优化抗体的生产 |
| CN106380519A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-02-08 | 深圳万乐药业有限公司 | 一种单克隆抗体的纯化方法 |
| CN108350027A (zh) * | 2015-11-18 | 2018-07-31 | 默克专利股份公司 | 用于改进的蛋白质分离的相反的pH-盐梯度 |
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