CN102460147A - 可重复使用的色谱设备的鉴定 - Google Patents

Abstract

本文报道了测定至少是在多肽纯化的纯化步骤中第二次使用的可重复使用的色谱柱填料是否在该多肽的所述纯化的所述纯化步骤中降低了分离效能的方法。该方法包括以下步骤：a)鉴定和测定通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，b)通过拟合所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，c)确定所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，e)当步骤d)中计算的差异的绝对值超过0.1时，确定所述可重复使用的色谱柱填料的下降的分离效能，其中式I的函数具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及其中erf是误差函数。

Description

可重复使用的色谱设备的鉴定

本文报道的方法属于色谱领域，尤其是制备型柱色谱领域。本文报道了根据过程数据直接测定色谱柱的填料质量的方法。利用该方法，可实现节省处理时间和资源，因为其能够省去仅用于柱完整性测定目的的额外的数据采集。

发明背景

目前几乎所有用于药物的多肽都是通过重组方式制备的。由于严格的管理规范和要求，必须从治疗性多肽制剂中尽可能多地除去副产物。因此，在重组生产后的粗的多肽原料的下游处理中会使用至少一个色谱步骤。由于与发酵方法的产量相关的色谱设备尺寸有限，尤其是色谱柱的分离能力有限，必须处理多个批次才能够提供需要量的纯化的治疗性多肽。

为了确保每个批次的纯化的治疗性多肽具有相同的药学作用，每个批次都必须符合一系列的分析参数。如果纯化过程的各步骤操作稳定而有效，则能达到这一点。但是，如果纯化过程的一个步骤工作不正常，所得的产物将很有可能不能通过分析测试，而且在最坏的情况下，该批次将不能使用。因此，需要提供用于确定纯化步骤的性能和功效的方法。

Teeters，M.A.和Quinones-Garcia，I.(J.Chrom.A 1069(2005)53-64)报道了通过使用对来自示踪试验和过程转变的基于电导率的脉冲和阶跃输入的响应、尤其是来自测量的滞留时间分布，评价和监测生产规模的色谱柱的填料性能。Norling等人(Norling，L.等人，J.Chrom.A 1069(2005)79-89)报道了阴离子交换色谱介质的多次重复使用对病毒去除的影响。Larson等人报道了使用过程数据来评价生产规模的蛋白纯化柱的色谱性能(Larson，T.M.等人，Biotechnol.Prog.19(2003)485-492)。Moscariello，J.等人，J.Chrom.A 908(2001)131-141报道了工业规模的柱的性能鉴定。Vink，H.，J.Chrom.69(1972)237-242报道了色谱的拆分和柱效能。Sarker，M.和Guiochon，G.，J.Chrom.A 702(1995)27-44报道了用于制备型色谱的轴向压缩柱的填料性能研究。

发明概述

使用本文所报道的方法，能够测定可重复使用的色谱柱填料的分离效能和/或填料质量的降低，而不需要在分离粗品多肽溶液前使用和注入另外的示踪化合物来测定柱材料的完整性或者不需要该纯化步骤的历史数据。

本文报道的第一方面是测定至少是在多肽纯化的纯化步骤中第二次使用的可重复使用的色谱柱填料是否降低了分离效能的方法，例如与其在同一多肽的相同纯化的相同纯化步骤中首次使用时的分离效能相比是否降低，该方法包括以下步骤：

a)鉴定和测定通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，

b)通过拟合至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

e)当步骤d)中计算的差异的绝对值超过0.1时，确定所述可重复使用的色谱柱填料的下降的分离效能，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!}.$

本文报道的另一方面是多肽的色谱纯化方法，其中包含至少一个使用可重复使用的色谱柱填料的色谱步骤，该方法包括以下步骤：

a)鉴定和测定通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，

b)通过拟合至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!},$ 和

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.05或更低时，继续使用可重复使用的色谱柱填料，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是大于0.05但小于0.2时，对纯化的多肽进行额外的鉴定，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.2或更高时，更换可重复使用的色谱柱填料。

在一个实施方案中，通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的所述惰性改变是指由所述流动相中包含的不与可重复使用的色谱柱填料相互作用的物质的浓度变化造成的显著的信号改变。在另一个实施方案中，所述测定实验数据是指测定随时间的惰性改变的理化参数的实验数据。在另一个实施方案中，通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的所述惰性改变是指流动相从含有变性剂的100％溶液到不含有所述变性剂的100％溶液的改变，或者是从不含有所述变性剂的100％溶液到含有变性剂的100％溶液的改变。在另一个实施方案中，所述变性剂选自氢氧化钠、胍氯化物、尿素或有机溶剂。在一个实施方案中，所述步骤c)是对每个实验数据点测定所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异。在一个实施方案中，所述信号改变是电导率或在280nm的吸收的改变。在另一个实施方案中，所述惰性改变是S形的(sigmoid)变化。在另一个实施方案中，所述至少一种理化参数是在预处理(conditioning)或再生步骤中测定。

发明详述

本文报道的第一方面是测定至少在多肽纯化的纯化步骤中第二次使用的可重复使用的色谱柱填料与其在同一多肽的相同纯化的相同纯化步骤中首次使用时的分离效能相比是否降低了分离效能的方法，该方法包括以下步骤：

a)在色谱柱填料至少第一次使用后，鉴定惰性改变和随时间测定通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的惰性改变的理化参数的实验数据，所述惰性改变是流动相从含有变性剂的100％溶液到不含有所述变性剂的100％溶液的改变，或者反之亦然，

b)通过拟合a)中获得的至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

e)当步骤d)中计算的差异的绝对值超过0.05时，确定所述可重复使用的色谱柱填料的下降的分离效能，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!}.$

术语“可重复使用的色谱柱填料”是指填充到色谱柱中的色谱材料，其中该色谱材料在纯化后以未改变的形式获得，即，具有与纯化前相同的特性。纯化步骤是指通常包括色谱柱填料的预处理、粗多肽溶液上样、任选地冲洗色谱材料、从色谱柱填料回收纯化的多肽、以及色谱柱填料的再生的循环。在本文报道的各方面的一个实施方案中，通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的所述惰性改变是理化参数随时间的惰性改变和/或理化参数在色谱柱填料的预处理中的和/或在色谱柱填料的再生中的惰性改变。

如上所述的可重复使用的色谱柱填料的定义需要纯化中的所有各步骤都是完全可逆的。但这并不是这种情况。在纯化步骤中，例如填充的色谱材料的完全均一的性质可能被打乱，经过分离基质的液流能够被妥协。在某一时间点，可重复使用的色谱材料的分离效能和/或回收和/或填料质量仍然足以使多肽从副产物中纯化，但是不能达到符合所述多肽的规范要求的纯度。因此，该批次的多肽可能无法用作治疗剂，必须进一步处理或被丢弃。

使用本文所报道的方法，能够测定可重复使用的色谱柱填料的分离效能和/或填料质量和/或回收的降低，而不需要：i)在分离粗品多肽溶液前使用和注入另外的示踪化合物来测定柱材料的完整性，或者ii)该纯化步骤的历史数据。因此，本发明的方法允许根据通常在多肽的色谱纯化步骤期间获得的数据来确定可重复使用的色谱柱填料的质量，从而不必进行注入示踪物质的额外步骤。

本文所报道的方法是基于以下发现：在多肽纯化期间通过可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变能够用来测定色谱材料的分离效能和/或填料质量。这类“惰性改变”是指至少一种、优选一种理化参数随时间的变化，例如流动相中包含的物质的浓度，或者在纯化步骤中流动相本身的变化。所述物质不与实现多肽纯化的色谱材料的官能团相互作用。通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的示例性的惰性改变有：i)从变性条件到非变性条件的变化，或ii)从强碱性条件到缓冲条件的变化，或iii)从有机溶剂到水的变化。在一个实施方案中，所述改变是从100％的0.5-1M氢氧化钠溶液或5M氯化胍溶液或8M尿素溶液或有机溶剂到100％缓冲液或100％水(任选地包含离子化试剂如最多1％(v/v)的三氟乙酸)。或者反之亦然，所述改变是：i)从非变性条件到变性条件的变化，或ii)从缓冲条件到强碱性条件的变化，或iii)从水到有机溶剂的变化。在另一个实施方案中，所述改变是从100％缓冲液或100％水(任选地包含离子化试剂如最多1％(v/v)的三氟乙酸)到100％的0.5-1M氢氧化钠溶液或100％的5M氯化胍溶液或100％的8M尿素溶液或有机溶剂。图1显示了惰性改变的色谱图，表明没有分离效能/填料质量的下降，图4显示了惰性改变的色谱图，表明有分离效能/填料质量的下降。

在一个实施方案中，所述至少一种理化参数随时间的惰性改变是通过纯化期间记录的实验数据确定的，例如在280nm的吸收，或者离开色谱柱的流动相的电导率，或者离开色谱柱的有机溶剂浓度。

术语“流动相”是指用于柱色谱的一种液体，其围绕在色谱柱填料的色谱材料周围，后者相应地作为固定相。

已经发现，根据至少第二次使用的所述可重复使用的色谱柱填料的惰性改变期间记录的实验数据与拟合式I的函数的至少第二次使用的所述可重复使用的色谱柱填料的惰性改变期间记录的实验数据的比较，能够获得所述可重复使用的色谱柱填料的分离效能/填料质量的测定。在一个实施方案中，所述实验数据是在使用由色谱材料制成的柱填料进行的所述多肽的至少第二次纯化期间记录的，所述色谱材料已经在该次使用前在同一多肽的相同纯化的相同纯化步骤中使用过一次或多次。式I的函数如下所示：

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，

起始值A0，

平均值m，

标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!}.$

本文所报道的方法使用高斯分布的积分形式，得到柱填料的质量属性。利用式I的函数，能够测定在柱入口处所述化合物的近似矩形脉冲中包含的化合物的纯扩散控制的分布机制的偏差。这是通过比较在多肽纯化中所鉴定的惰性改变期间记录的实验数据拟合的式I的函数与所记录的实验数据本身而实现的，其中在所拟合的函数和未拟合的实验数据在惰性改变期间的差异不应当超过预定的阈值，以提供具有所需性质的纯化多肽。

通过计算用于拟合式I的函数的实验数据和拟合的式I的函数之间的差异来进行比较。为了使各纯化的结果彼此相当，将结果或差异进行标准化，例如将该值除以在所述惰性改变期间的所述理化参数的实验数据的最大值。在一个实施方案中，所述标准化是通过除以所拟合的式I的函数的参数A0的值而实现的。在一个实施方案中，使用标准化的差异函数，如下面的式II所示：

$\mathrm{yII}=(x-(\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0))/A0.$

因此，在一个实施方案中，步骤b)理解为：通过拟合所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据而确定式I的函数的参数，并且用其确定式II的标准化的差异函数的参数，步骤c)理解为：测定所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式II的函数之间的差异。在另一项实施方案中，所述标准化是在计算实验数据和用所述实验数据拟合的式I的函数之间确定的差异的最大值和最小值之间的差异的步骤中进行，通过将所述差异除以在惰性改变期间的所述理化参数的实验数据的最大值而使所述差异标准化。

用于惰性改变的色谱图的示例性的差异函数显示于图3，其没有分离效能和/或填料质量的下降；用于惰性改变的色谱图的示例性的差异函数显示于图6，其具有分离效能和/或填料质量的下降。

为了计算绝对差异值，测定对每个实验数据点计算的实验数据与拟合的实验数据之间的差异的全局极大值和全局极小值。计算该极大值和该极小值之间的差异，提供能够用于确定可重复使用的色谱柱填料的填料质量的参数。在一个实施方案中，所述差异通过将所计算的差异值除以用于该计算的实验数据的最大值而标准化。

根据要纯化的多肽及其需要达到的特性，能够给出该差异函数的最大值和最小值之间的绝对差异的阈值，因此超出各自阈值的个体导致了将要进行的操作。在一个实施方案中，如果所计算的差异的绝对值小于0.2或0.1或0.05，标准化的差异函数的最大值和最小值之间的所述差异能够被接受，填料可被进一步使用。在一个实施方案中，如果绝对值是0.05或更高但小于0.2，或绝对值是0.1或更高但小于0.2，或绝对值是0.1或更高但小于0.15，标准化的差异函数的最大值和最小值之间的所述差异能够被接受，但是需要进行额外的分析和/或评价，以确保纯化多肽的规格一致。在一个实施方案中，如果绝对值是0.2或更高，或者是0.15或更高，标准化的差异函数的最大值和最小值之间的所述差异不能被接受，填料必须更换/更新。

因此，本文报道的另一方面是多肽的色谱纯化方法，其中包含至少一个使用可重复使用的色谱柱填料的色谱步骤，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)鉴定和测定通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，

b)通过拟合至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!},$ 和

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.05或更低时，继续使用可重复使用的色谱柱填料，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.05或更高、但小于0.2时，对纯化的多肽进行额外的评估和/或鉴定，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.2或更高时，更换该可重复使用的色谱柱填料。

“多肽”是由通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，无论其是天然产生的还是合成的。少于约20个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由两个或更多的多肽组成的分子或者包含超过100个氨基酸残基的一个多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽还可包含非氨基酸成分，例如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。所述非氨基酸成分可由其中表达该多肽的细胞添加，并且可以随细胞类型不同而变化。本文以其氨基酸骨架结构或编码其的核酸来定义多肽。通常不明确指出添加例如碳水化合物基团，但是其仍然可以存在。

在一个实施方案中，所述多肽是重组产生的。在另一个实施方案中，所述多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白偶联物。术语“免疫球蛋白”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因和大量的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，包括例如Fv、Fab和F(ab)₂以及单链(scFv)或双体(例如Huston，J.S.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)5879-5883；Bird，R.E.，等人，Science 242(1988)423-426；通常，Hood，L.E.，等人，Immunology，Benjamin N.Y.，第二版(1984)；和Hunkapiller，T.和Hood，L.E.，Nature 323(1986)15-16)。术语“免疫球蛋白偶联物”是指包含至少一个免疫球蛋白重链或轻链结构域的多肽，其通过肽键与其他多肽偶联。所述的其他多肽是非免疫球蛋白肽，例如激素或生长因子或抗融合肽或补体因子等，或者免疫球蛋白片段例如Fv、Fab和F(ab)₂以及单链抗体(scFv)或双体。

用于纯化多肽和免疫球蛋白的方法已经建立完善并且广泛应用，它们可单独或组合使用。这类方法是，例如和在某些实施方案中，使用衍生自微生物的蛋白的亲和色谱(例如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)、离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和复合型交换色谱)、嗜硫吸附(例如具有β-巯基乙醇和其他SH配基)、疏水作用或芳香吸附色谱(例如具有苯基-琼脂糖、氮杂-亲砂(aza-arenophilic)树脂或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱(例如具有Ni(II)-和Cu(II)-亲和性材料)、尺寸排阻色谱和制备型电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。在一个实施方案中，所述色谱柱填料是选自亲和色谱材料、或离子交换色谱材料、或嗜硫吸附色谱材料、或疏水作用色谱材料、或芳香吸附色谱材料、或金属螯合亲和色谱材料、或尺寸排阻色谱材料的色谱材料。

在另一个实施方案中，本文报道的方法用于测定除了色谱材料外的过程硬件是否降低了分离效能。

提供以下的实施例和附图来帮助理解本发明，但本发明的实际范围陈述于所附的权利要求中。由于在做出本发明时我们的实验室中能够获得足够量的这种多肽，即红细胞生成素，因此本发明以该多肽为例进行说明。这并不应当理解为限定，其仅仅是本发明的一个例子。应当理解，可以在不背离本发明的主旨的情况下对本文所述的方法进行修改。

附图简述

图1：可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据，其未降低分离效能/填料质量(空心圆圈)；X-轴：时间[分钟]；Y-轴：电导率[mS/cm]。

图2：可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据，其未降低分离效能/填料质量(空心圆圈)，和根据式I的函数拟合的函数；X-轴：时间[分钟]；Y-轴：电导率[mS/cm]。

图3：未降低分离效能/填料质量的可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据(空心圆圈)与根据式I拟合的函数之间的绝对差异；X-轴：时间；Y-轴：差异。

图4：可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据，其具有降低的分离效能/填料质量(空心圆圈)；X-轴：时间[分钟]；Y-轴：电导率[mS/cm]。

图5：可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据，其具有降低分离效能/填料质量(空心圆圈)，和根据式I的函数拟合的函数；X-轴：时间[分钟]；Y-轴：电导率[mS/cm]。

图6：具有降低的分离效能/填料质量的可重复使用的色谱柱填料电导率的示例性惰性改变的实验数据(空心圆圈)与根据式I的函数拟合的函数之间的绝对差异；X-轴：时间[分钟]；Y-轴：差异[mS/cm]。

图7：使用式II在50个色谱循环中用本文报道的方法监测柱子完整性。

图8：使用式II用本文报道的方法监测柱子完整性。

实心圆圈：柱填料未改变的柱子的再生所得到的参数。

空心圆圈：在第9个循环期间具有破裂床的柱子的再生所得到的参数。

实施例1

红细胞生成素的发酵和纯化

红细胞生成素可以按照例如WO 01/87329进行制备和纯化。

该纯化包括一些色谱步骤。其中之一是蓝琼脂糖色谱。蓝琼脂糖包括琼脂糖小珠，其表面共价连接了Cibacron蓝染料。由于红细胞生成素对蓝琼脂糖的结合更强于大多数非蛋白质的污染物(一些非蛋白质的杂质和PVA)，红细胞生成素可在该步骤中富集。蓝琼脂糖柱的洗脱是通过增加盐浓度和pH而进行的。将柱子填充蓝琼脂糖，用NaOH再生，用平衡缓冲液(氯化钠/钙和乙酸钠)平衡。将酸化和过滤的发酵罐上清液上柱。在完成上柱后，将柱子首先用类似于平衡缓冲液的含有更高氯化钠浓度的缓冲液清洗，连续用TRIS-碱缓冲液清洗。产物用TRIS-碱缓冲液洗脱，按照主要的洗脱曲线收集为单个流分。

在色谱循环的平衡、分离和再生步骤中，测定柱子入口处的流动相的电导率，用标准的测量电导率的装置记录。

实施例2

柱性质的改变

使用本文报道的方法在连续的过程中监测柱子。微小的变化独立于其他过程参数成为可检测的。在图7中显示柱填料的改变，导致分离性质的变化。该改变发生在第40个循环之后。

在柱子具有破裂的床的情况下，配合的质量显著下降，其在衍生的参数残留差异中可见，如图8的第9个循环所示(空心圆圈)。

Claims (8)

1.测定至少是在多肽纯化的纯化步骤中第二次使用的可重复使用的色谱柱填料是否在该多肽的所述纯化的所述纯化步骤中降低了分离效能的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)鉴定和测定通过至少第二次使用的所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，

b)通过拟合所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

e)当步骤d)中计算的差异的绝对值超过0.1时，确定所述可重复使用的色谱柱填料的下降的分离效能，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!}.$

2.多肽的色谱纯化方法，其中包含至少一个使用可重复使用的色谱柱填料的色谱步骤，其特征在于该方法包括以下步骤：

a)鉴定和测定通过至少第二次使用的所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的惰性改变的实验数据，

b)通过拟合所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据，确定式I的函数的参数，

c)确定所述至少第二次使用的理化参数的惰性改变的实验数据与具

有步骤b)中确定的参数的式I的函数之间的差异，

d)计算步骤c)中确定的差异的最大值和最小值之间的差异，并将所述差异标准化，

其中式I的函数是

$\mathrm{yI}=\frac{1}{2}P1\·(1+\mathrm{erf}\left(\frac{x-m}{s\·\sqrt{2}}\right))+A0,$

具有振幅P1，起始值A0，平均值m，标准偏差s，以及

$\mathrm{erf}\left(x\right)=\frac{2}{\sqrt{\mathrm{\π}}}\underset{0}{\overset{\∞}{\mathrm{\Σ}}}\frac{{(-1)}^n{x}^{2n+1}}{(2n+1)n!},$ 和

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.05或更低时，继续使用该可重复使用的色谱柱填料，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是大于0.05但小于0.2时，对纯化的多肽进行额外的鉴定和/或评估，或

-当步骤d)中计算的差异的绝对值是0.2或更高时，更换该可重复使用的色谱柱填料。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的所述惰性改变是由流动相中的不与所述可重复使用的柱填料相互作用的物质的浓度变化造成的改变。

4.根据上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述惰性改变是电导率或在280nm的吸收的改变。

5.根据上述权利要求任一项的方法，其特征在于通过所述可重复使用的色谱柱填料的流动相的至少一种理化参数的所述惰性改变是从含有变性剂的100％溶液到不含有所述变性剂的100％溶液的改变，或者反之亦然。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述变性剂选自氢氧化钠、胍氯化物、尿素或有机溶剂。

7.根据上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述惰性改变是S形的变化。

8.根据上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述惰性改变是随时间的改变。

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