CN112041673A - 色谱柱鉴定的转变分析方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种操作色谱柱的方法。该方法涉及在包括柱填料的色谱柱的操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。使用模型γ累积分布曲线的参数来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，并且基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。如果在常规柱监测期间观察到HETP的不利趋势或超过控制限度，则应评价洗脱产品质量、柱工艺性能和/或杂质去除数据以确保所识别批次的产品质量。如果产品质量或柱性能中的任一者未能满足标准设定，则应在释放以供进一步使用之前执行适当的校正动作，诸如调节、再装填或替换柱，以及鉴定。

Description

色谱柱鉴定的转变分析方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月20日提交的美国临时申请62/660,340的优先权，该申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种色谱柱鉴定的方法。
背景技术
柱色谱法是在用以制备治疗性蛋白质的纯化过程中使用的重要技术。从工作台顶部到制造厂并且贯穿整个柱寿命，随着过程扩大，必须保持柱的性能。随着柱直径、设备和缓冲剂消耗的增加以扩大过程，柱评价程序、装填床完整性的潜在变化以及物流可能会出现困难。
用于色谱柱鉴定的当前方法通过从峰最大值和与半高度处的峰的宽度的标准偏差估计平均值来计算理论塔板等效高度(HETP)，其为脉冲注射之后的色散量度。该方法的主要局限性是当峰形状偏离高斯分布时，它不提供准确的色散量度(即，HETP)。为了补偿灵敏度的不足，利用第二测量(不对称性)来评估峰偏度。该量度比较在最大峰高度的10％处的前伸峰宽度和拖尾峰宽度。该方法的局限性导致对柱性能变化的灵敏度不足，并且通常导致柱的再装填或调节，而柱性能实际上是可接受的。已经报道了用于柱鉴定的其他策略。这些策略包括使用高斯分布或非高斯分布来在过程转变中建模(参见例如Larson等人，“Use of Process Data to Assess Chromatographic Performance in Production-Scale Protein Purification Columns,”Biotechnol.Prog.19:485-492(2003)以及授予Belousov等人的美国专利9,047,438和授予Ganguly的美国专利8,410,928)。高斯方法具有与上述注射方法相同的灵敏度局限性，并且所报告的非高斯方法需要复杂的计算。
需要具有更大灵敏度和更合理限定的极限的改善的鉴定程序来监测在重复操作期间的色谱柱性能变化，并评价柱在其寿命内将执行的有效性。本发明涉及克服本领域中的这种缺陷。
发明内容
本发明的实施方案分别由本文所附的独立权利要求和从属权利要求限定，为了简洁起见，这些权利要求以引用方式并入本文。根据下面结合附图的详细描述，本发明的各个方面的其他实施方案、特征和优点是显而易见的。
在某些实施方案中，本发明提供了一种操作色谱柱的方法。该方法涉及在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。该方法还涉及使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
Figure BDA0002733944430000021
或者
Figure BDA0002733944430000022
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
Figure BDA0002733944430000023
其中
μ＝kθ+Vi，
Figure BDA0002733944430000031
并且
L＝柱长度
基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于该评估，色谱柱被重复使用、调节、替换或再装填。
已开发出用于评估柱完整性的新方法，本文称为γ分布转变分析(GDTA)。该新方法使用数学模型通过在柱操作的常规过程步骤期间生成的流动相变前沿数据来拟合曲线。然后利用模型曲线参数来计算整个柱床上的分散，作为柱质量的量度。流动相变前沿由色谱纯化过程内的离散步骤产生，其中使用具有不同特性(诸如电导率、pH和/或缓冲剂组分)的工艺缓冲剂/洗涤溶液。该方法通常可应用于在正常柱处理期间生成的任何一个或多个流动相变前沿。
GDTA方法的主要优点是，与高斯HETP估计方法相比，它提供了在整个柱床上更灵敏的色散计量。通过使用GDTA，不再需要测量不对称性，因为GDTA模型从曲线拟合正确地测量色散。另外，当与先前报告的另选的非高斯方法相比时，γ分布函数的使用便于前沿转变的分析。色谱工艺中已经存在的流动相变的使用避免了对额外离线处理步骤的需要。此外，在许多情况下，历史数据允许在实施之前建立柱效率的历史范围。最后，GDTA方法可自动化，以确保一致的应用。
在某些实施方案中，本发明提供了一种操作色谱柱的方法，所述方法包括：
在包括柱填料的所述色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于所述至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
Figure BDA0002733944430000041
或者
Figure BDA0002733944430000042
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定所述曲线的形状、缩放和偏移参数；
使用式II和所述模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算所述至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
Figure BDA0002733944430000043
其中
μ＝kθ+Vi
Figure BDA0002733944430000044
L＝柱长度；以及
基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量。
在某些实施方案中，本发明提供了一种操作色谱柱的方法，所述方法还包括：
基于所述评估来调节、替换或再装填所述色谱柱。
在某些实施方案中，本发明提供了一种操作色谱柱的方法，所述方法还包括：
在所述色谱柱填料的一次或多次后续使用期间，在对应的流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用在所述色谱柱填料的所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和所述计算；
基于所述执行来在所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间确定所述色谱柱填料的HETP值；
编译两次或更多次后续使用的所述色谱柱填料的所确定的HETP值的趋势；以及
基于所编译的趋势来识别所述色谱柱填料的所述质量的变化，其中所述调节、替换或再装填所述色谱柱基于所述识别。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中与所述柱填料的一次或多次早期使用中的色谱柱填料的HETP值相比，所述柱填料的一次或多次后续使用中的色谱柱填料的HETP值的增加识别出色谱柱填料的质量降低。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中收集在柱填料的所述第一操作期间两个或更多个不同的流动相变前沿的柱出口信号和累积流量参数，所述方法包括：
使用针对所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿独立地收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和计算，以计算所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿的HETP值；
基于两个或更多个所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的所述质量，由此所述调节、替换或再装填所述色谱柱基于所述评估。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从含有变性剂的流动相到含有非变性剂的流动相的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从含有非变性剂的流动相到含有变性剂的流动相的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从碱性流动相条件到更酸性流动相条件的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从酸性流动相条件到更碱性流动相条件的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从含有有机溶剂的流动相到含水流动相的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中流动相变前沿由从含水流动相到含有有机溶剂的流动相的变化生成。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中柱出口信号为电导率。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述确定包括：
通过将最小信号值设定为0并且将最大电导率值设定为1来归一化所述流动相变前沿的所收集的柱出口信号。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述收集包括：
将第一流动相添加至含有所述柱填料的所述色谱柱；
将第二流动相添加至含有所述柱填料的所述色谱柱，其中所述第一流动相和所述第二流动相具有不同的可检测柱出口信号；以及
在所述第一流动相和所述第二流动相之间在所述流动相变的两个或更多个间隔处收集所述柱出口信号和累积流量参数。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中第一流动相和第二流动相的柱出口信号在信号上相差超过信号噪声的量。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中柱出口信号和累积流动参数在整个流动相变前沿中在各种间隔处收集。
在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中色谱柱填料选自亲和色谱填料材料、离子交换色谱填料材料、吸附色谱填料材料、疏水相互作用色谱填料材料、金属螯合物亲和色谱填料材料、尺寸排阻色谱填料材料或分子排阻色谱填料材料。
附图说明
图1A-图1B示出了示例性γ分布转变分析曲线拟合的曲线图。图1A是示出拟合到流动相变数据的示例性γ分布转变分析曲线的曲线图。图1B是示出拟合到流动相变数据的示例性γ分布转变分析曲线的曲线图，其中来自该曲线的参数用于计算理论塔板等效高度(HETP)作为柱效率的量度。
图2是示出本文所述的色谱柱鉴定系统的示意图。
图3是未进行转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的概率图。
图4是未进行转化的蛋白质A柱平衡前沿的平方和(SS)的概率图。
图5是未进行转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的概率图。
图6是未进行转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的概率图。
图7是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的概率图。
图8是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的SS的概率图。
图9是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的概率图。
图10是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的概率图。
图11是蛋白质A柱平衡的平均值(Vm)的概率图。
图12是蛋白质A柱洗涤前沿的平均值(Vm)的概率图。
图13是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的控制图表。UCL＝控制上限；LCL＝控制下限。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图14是蛋白质A柱平衡前沿的HETP的时间序列图。UCL来源于图13中的转化数据。
图15是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的SS的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图16是蛋白质A柱平衡前沿的SS的时间序列图。UCL来源于图15中的转化数据。
图17是蛋白质A柱平衡前沿的平均值(Vm)的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图18是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图19是蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的时间序列图。UCL来源于图18中的转化数据。
图20是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图21是蛋白质A柱洗涤前沿的SS的时间序列图。UCL来源于图20中的转化数据。
图22是蛋白质A柱洗涤前沿的平均值(Vm)的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图23是按柱包装分组的直接产物捕获(DPC)蛋白质A柱平衡前沿的HETP结果的时间序列图。
图24是按柱包装分组的DPC蛋白质A柱洗涤前沿的HETP结果的时间序列图。
图25是按滑道分组的DPC蛋白质A柱平衡前沿的HETP结果的时间序列图。
图26是按滑道分组的DPC蛋白质A柱洗涤前沿的HETP结果的时间序列图。
图27是示出DPC蛋白质A柱平衡的平均流量的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图28是平衡期间柱前平均压力的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图29是DPC蛋白质A柱洗涤前沿的平均洗涤流速的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图30是DPC蛋白质A柱洗涤前沿的平均洗涤压力的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图31是示出改变洗涤流速之前和之后的HETP的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图32是如针对45批
Figure BDA0002733944430000091
(英夫利昔单抗)在平衡前沿上评估的两种不同蛋白质A柱包装的HETP的时间序列图。
图33是SP-琼脂糖高性能(SPHP)柱平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图34是SPHP柱WFI冲洗前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图35是SPHP柱储存前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图36是Q2柱平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图37是Q2柱反萃取平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图38是Q2柱储存前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
具体实施方式
本公开涉及一种用于在柱的重复操作期间监测装填色谱柱床的变化的改善的鉴定程序。该方法与规模无关，提供了评价柱在整个柱寿命内将执行的有效性的实际手段。
色谱柱分离效率通常使用色谱的理论塔板模型来表征。使用该方法，色谱柱被认为由多个阶段或理论塔板组成。每个塔板是样品组分在流动相和固定相之间实现平衡的距离(参见Van Deemter、Zuiderweg和Klinkenberg，“Longitudinal Diffusion andResistance to Mass Transfer as Causes of Nonideality in Chromatography,”Chem.Engng.Sci.5:271-289(1956)，该文献据此全文以引用方式并入)。柱效率通过柱中的理论塔板数Np来测量，其中柱中的塔板越多意味着平衡越多、色谱带的色散越小、峰越窄并且质量分离越好。给定柱中塔板的数量越多，塔板高度越低。因此，柱效率也可通过计算塔板高度来测量，该塔板高度被称为“理论塔板等效高度”或HETP。使用该方法，HETP值越小，柱分离效率越高。
通过将色谱柱长度L除以理论板塔数Np来计算HETP。
HETP＝L/Np
在历史上，通过使用下式检查脉冲注射后的色谱峰来确定柱具有的理论塔板的数量：
Figure BDA0002733944430000101
其中tR为保持时间，并且w1/2为半高度处的峰宽度。然而，当用于计算Np的峰形状偏离高斯分布时，该方法不提供柱效率的准确测量。为了补偿灵敏度的这种不足，利用第二测量(不对称性)来评估峰偏度。该量度比较在最大峰高度的10％处的前伸峰宽度和拖尾峰宽度。如上所述，该模型缺乏检测柱性能变化的灵敏度。
本文所述的方法提供了基于在常规色谱柱操作期间发生的一个或多个流动相变前沿上的γ分布的HETP的另选且更准确的测量。因此，本公开涉及操作色谱柱的方法。该方法涉及在含有柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。该方法还涉及使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。
Figure BDA0002733944430000111
或者
Figure BDA0002733944430000112
参考式Ia和式Ib，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
Figure BDA0002733944430000113
其中
μ＝kθ+Vi
Figure BDA0002733944430000114
并且
L＝柱长度。
基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于对柱质量的评估，确定色谱柱对于后续使用是可接受的，否则必须调节、替换或再装填该色谱柱。
本文所公开的柱鉴定方法可应用于任何色谱柱。示例性色谱柱包括但不限于用于液相色谱、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱、亲和色谱、分子排阻、超临界流体色谱、气相色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、二维色谱、快速蛋白(FPLC)色谱、逆流色谱、手性色谱、水相正相色谱(ANP)、混合模式色谱和伪亲和色谱的那些色谱柱。示例性柱填料材料包括但不限于亲和色谱填料材料(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和色谱填料材料)、离子交换色谱填料材料(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换色谱填料材料)、吸附色谱填料材料(例如，硅胶或氧化铝填料材料)、疏水相互作用色谱填料材料(例如，苯基-琼脂糖凝胶、氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸填料材料)、金属螯合物亲和色谱填料材料(例如，Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱填料材料(例如，凝胶电泳或毛细管电泳填料材料)或分子排阻色谱填料材料(例如，聚苯乙烯)。
本文所述的方法可在常规色谱柱操作期间，例如在样品中的化学或生物实体的分离、纯化或识别期间应用。此类化合物可包括例如但不限于蛋白质(例如，抗体及其片段)、核酸、碳水化合物、脂质、有机小分子、无机小分子、病毒、脂质体以及任何此类化合物的杂合物或变体形式。
与先前的色谱柱鉴定方法(其需要将柱离线进行测试，例如脉冲注射方法)相比，如本文所述的方法在常规柱操作期间进行。本方法利用了涉及具有不同特性的工艺缓冲剂和溶液的流动相过程转变，这在常规柱纯化过程期间发生。
根据本发明的方法，“流动相”是柱色谱中围绕色谱柱填料的固定色谱材料并移动通过色谱柱填料的固定色谱材料的液相。在色谱柱操作期间，流动相的组成和特性通常随每个过程步骤(例如，平衡、洗涤等)而改变。可在洗脱物(即，在通过固定相后从柱洗脱的流动相)中检测和测量流动相特性的变化。如本文所用，“柱出口信号”是当洗脱物从柱上洗脱时检测到的来自流动相的洗脱物的物理或化学特性的信号。提供柱出口信号的物理或化学特性可以是可使用任何典型的色谱检测器测量的任何特性，诸如pH、电导率、光吸收、荧光、电荷、盐浓度、偏振测定、折射率、电化学响应、质荷比等。适用于测量柱出口信号的色谱检测器包括但不限于质谱仪、红外光谱仪、可见光光谱仪、紫外光光谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、火焰离子化检测器、小角度激光散射检测器、二极管阵列检测器、荧光光度计、pH检测器、电导率检测器、电化学检测器和折射率检测器。
从洗脱物收集柱出口信号。此外，为了收集柱出口信号，还收集“累积流量”。“累积流量”是随时间推移从柱洗脱的流体的总体积。该值除以柱的体积以用柱体积为单位来表示。
转变前沿由柱出口信号在累积流量上的变化生成。转变前沿由将具有一个或多个不同特性(例如，电导率、pH等)的不同流动相顺序施加到柱而产生。根据本文所述的方法，可将转变前沿上的柱出口信号归一化为具有最大值1和最小值0。如本文所提及的，“下降转变前沿”是其中起始流动相具有高于顺序引入的流动相的柱出口信号的柱出口信号(例如，电导率)的流动相变。
如本文所用，“上升转变前沿”是其中起始流动相具有低于顺序引入的流动相的柱出口信号的柱出口信号(例如，电导率)的流动相变。
通过在色谱柱操作过程期间向含有待鉴定的柱填料的色谱柱中添加第一流动相来创建转变前沿。在添加第一流动相之后的某个时间，例如，随着第一流动相开始洗脱，将具有与第一流动相相比不同的可检测柱出口信号的第二流动相添加到含有柱填料的色谱柱。当流动相在第一流动相和第二流动相之间转变时，通过在流动相的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数来检测转变前沿。
在一个实施方案中，第一流动相和第二流动相的柱出口信号在信号上相差超过信号噪声的量。在一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高5％。在另一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高至少10％。在另一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高至少15％。
在一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号为电导率。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少1μS/cm、至少10μS/cm、至少100μS/cm、至少1mS/cm，或大于1mS/cm。
在另一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号为pH。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少0.05个pH单位、至少0.1个pH单位、至少1个pH单位、至少2个pH单位，或大于2个pH单位。
在另一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号为UV-Vis吸光度。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少0.01个吸光度单位、至少0.1个吸光度单位、至少0.5个吸光度单位、至少0.8个吸光度单位，或超过0.8个吸光度单位。
在另一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号是红外吸光度。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少1％透射率、至少10％透射率、至少20％透射率、至少30％透射率或超过30％透射率。
在一个实施方案中，流动相变前沿由从含有变性剂的流动相到含有非变性剂的流动相的变化生成。在另一个实施方案中，流动相变前沿由从含有非变性剂的流动相到含有变性剂的流动相的变化生成。
在另一个实施方案中，流动相变前沿由从碱性流动相条件到中性或更酸性流动相条件的变化生成。另选地，流动相变前沿由从酸性流动相条件到中性或更碱性流动相条件的变化生成。
在另一个实施方案中，流动相变前沿由从含有有机溶剂的流动相到含水流动相的变化生成。另选地，流动相变前沿由从含水流动相到含有有机溶剂的流动相的变化生成。
在流动转变前沿的过程中以各种间隔收集柱出口信号和累积流量参数。优选地，在从最小柱出口信号到最大柱出口信号或反之亦然的整个流动转变前沿过程中收集柱出口信号和累积流量参数。在一个实施方案中，在不规则的间隔处收集柱出口信号和累积流量参数，例如当检测到柱出口信号的变化时收集。在另一个实施方案中，在整个流动转变前沿的过程中在规则的时间间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。例如，在一个实施方案中，在整个流动转变前沿的过程中在1秒间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。在另一个实施方案中，在流动转变阶段的过程中在5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒或60秒间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。
在一个实施方案中，通过在分析周期中将最大值设定为1并且将最小值设定为0，如上所述归一化柱出口信号数据。还将流量转换成柱体积以标准化，从而比较不同柱填料之间的数据。使用该数据，γ累积分布函数(“CDF”)用于生成最佳拟合所收集的数据点的曲线。γCDF使用下式I由三个值确定：形状参数k；缩放参数θ(theta)；以及偏移参数Vi：
C＝f(V,k,θ,Vi) 式I
参考式I，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积。从式I导出的式Ia用于确定沿着上升转变前沿的γ分布函数值。
Figure BDA0002733944430000151
其中
Γ是上不完全γ函数，并且
γ是下不完全γ函数。
另选地，同样从式I导出的式Ib用于确定沿着下降转变前沿的γ分布函数值。
Figure BDA0002733944430000152
图1A是绘出在柱转变前沿上收集的示例性归一化柱出口信号和柱体积数据的曲线图。式Ia用于生成与数据拟合的曲线。
通过操纵k、θ和Vi的值以找到产生具有与数据的最小平方和偏差的模型曲线的参数来确定最佳拟合γCDF参数。该曲线通过来自整个转变前沿的数据点来拟合，以生成最佳拟合模型。来自该曲线的k、θ和Vi参数用于计算柱中塔板的数量Np或塔板高度(即，HETP)作为柱效率的指标。
基于模型曲线的平均值μ和方差σ2来计算塔板的数量Np。平均值和方差从曲线如下导出：
平均值，μ＝kθ+Vi
方差，σ2＝kθ2
基于平均值和方差来如下计算塔板的数量：
塔板的数量，Np＝μ2/σ2
HETP如上所述基于以厘米为单位的柱长度L除以塔板数量Np来如下计算。
Figure BDA0002733944430000161
图1B示出与图1A所示相同的曲线图，其中定义了平均值μ和方差σ2参数。
为了评价与如本文所述计算的数据的模型拟合，还可以确定平均值(Vm)、平方和(SS)和模式。SS是模型曲线与其所导出的过程数据的偏差的直接量度。Vm值为转变的中心点的量度，以柱体积为单位。该值应接近一，因为其通常需要一个柱体积来进行缓冲剂转变。平均值通常不受前沿形状的影响。平均值用于检查自动计算的误差。例如，低值可能指示数据收集错误并且可能需要进一步调查以确认结果。该模式对应于变化率最大的体积。这将等于转变曲线对称时的平均值。通常，转变是偏斜的，并且模式低于平均值。
除了HETP之外，可由k(形状)参数计算的其他因素包括偏度(γ1)(其为与不对称性相关的量度)和峰度(γ2)(其为峰锐度的量度)。这些因素可用于识别柱性能的变化。
Figure BDA0002733944430000162
Figure BDA0002733944430000163
根据本文所述的方法，每当柱过程在柱上运行时，针对相同的流动转变阶段收集柱出口信号和累积流量参数，以从γCDF计算HETP。由用于相同过程步骤和相同规模的柱生成的历史数据也可以被检索并用于计算HETP。编译HETP数据以识别历史操作或当前操作期间对应转变的HETP值的趋势，从而识别HETP值的控制上限和下限。控制限值是定义可接受HETP值范围HETP的高值和低值，即，对应于可接受柱效率的HETP值。这些控制上限和下限可基于统计评价来设定。例如，在一个实施方案中，通过计算平均值+/-2、3或4个标准偏差来设定控制上限和下限。在一个实施方案中，如本文实施例中所述，通过计算平均值+/-3个标准偏差来设定控制上限和下限。在另一个实施方案中，可通过由历史数据计算置信区间来设定控制上限和下限。在一个实施方案中，通过由历史数据计算95％、96％、97％或98％置信区间来设定控制上限和下限。在另一个实施方案中，通过由历史数据计算99％置信区间来设定控制上限和下限。
利用控制上限和下限来识别柱效率随时间推移的变化和柱的使用。通常，超过控制上限的HETP的任何增加可指示柱效率的降低。如果在常规柱监测期间观察到HETP的不利趋势或超过控制限度，则应评价洗脱产品质量、柱工艺性能和/或杂质去除数据以确保所识别批次的产品质量。如果产品质量或柱性能中的任一者未能满足标准设定，则应在释放以供进一步使用之前执行适当的校正动作，诸如调节、再装填或替换柱，以及鉴定。调节色谱柱以使主体床重新分布的方法将根据所采用的柱而变化，但这是本领域技术人员熟知的。
在柱操作期间对柱性能的监测可基于通常包括在纯化方案中的一个或多于一个的转变阶段。优选地，监测基于HETP值，该HETP值基于纯化方案期间两个、或三个或更多个转变阶段的γCDF来计算。
如下所述，使用本文所述的GDTA方法计算HETP以确定柱性能可基于从用于相同过程步骤和相同规模的柱收集的历史数据。从过程步骤的合格的缩小规模模型生成的数据也可用于评价。这允许与鉴定数据相比评估柱的性能的质量。
诸如流速(VanDeemter效应)、潜在的缓冲剂相互作用和额外的柱体积之类的因素可影响本文所述的GDTA方法的结果，并且应当在设定GDTA的控制限度的中进行评估。GDTA中包括的转变前沿优选地满足某些标准，诸如流动相柱出口信号测量均是按规模的，流动相之间的柱出口信号测量差值高于背景信号噪声，并且流动相和树脂之间的相互作用是一致的和可再现的。
用于在使用期间释放和监测的常见柱评价标准应通过评估特定于设备和树脂类型的历史数据来确定。表1中列出了可用于评价柱鉴定结果与性能之间的关系的常规产品质量和工艺性能测量的示例。用于评价的常规质量和工艺性能测量不限于表1中所列的那些，但该列表意在作为指导原则，并且应基于所评估的项目和过程步骤的特定要求。产品质量和工艺性能的规格和接受标准是项目特定的，并且将基于工艺要求来确定。
表1：常规质量和步骤性能测量
参数 分析方法
预洗脱体积(CV)
洗脱体积(CV)
步骤收率
色谱图 目视检查
洗脱物浓度 A<sub>280</sub>
洗脱单体 DW-SE-HPLC
工艺杂质 各种测定
如本文所述的γ分布转变分析方法可以在柱操作期间实时进行。该方法涉及通过色谱柱鉴定计算装置在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；通过色谱柱鉴定计算装置，使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。
Figure BDA0002733944430000181
或者
Figure BDA0002733944430000182
参考式Ia和式Ib，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。该方法还涉及通过色谱柱鉴定计算装置，使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
Figure BDA0002733944430000191
其中
μ＝kθ+Vi
Figure BDA0002733944430000192
L＝柱长度。
该方法还涉及使用色谱柱鉴定计算装置，基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于该评估，色谱柱操作员可确定在下一个柱操作之前色谱柱是否可重复使用，或者是否需要替换、重装填或调节。
图2是提供如本文所述操作色谱柱并实时评估柱效率的方法和系统的概述的示意图。如图2中所示和上文所述，系统10包括用于分离作为复杂混合物(即，洗脱物14)引入柱中的生物分子的色谱柱12，当洗脱物从色谱柱洗脱时检测洗脱物中的柱输出信号的检测器20，从检测器20传输信号/数据的通信接口22，柱鉴定计算装置24，以及服务器26。
色谱柱12填充有可渗透的、半渗透的或不可渗透的固相柱填料材料。合适的色谱柱和柱填料材料在上文有所描述。将含有感兴趣的生物分子的洗脱物14引入色谱柱12中。流动相16也被引入色谱柱12中。流动相16有利于通过色谱柱12的固定相分离生物分子，并通过色谱柱的输出18洗脱洗脱物中的生物分子。根据如本文所述的方法，流动相16包含顺序引入的柱缓冲剂和/或洗涤试剂，该柱缓冲剂和/或洗涤试剂在如下文所述的一种或多种物理或化学特性(例如，pH、电导率、盐浓度)上彼此不同。检测器20在洗脱物中检测到一种或多种物理或化学特性的这些差异。
检测器20耦接到色谱柱12的输出18。因此，检测器20经由色谱柱12的洗脱物监测并收集柱输出信号。上文描述了合适的检测器和洗脱物的特性，即检测到的柱输出信号。检测器耦接到通信接口单元22，该通信接口单元将由检测器20收集的数据(例如，柱输出信号和累积流量参数)传输到用于数据处理的柱鉴定计算装置24和/或用于存储的服务器26。
本文所述的系统的柱鉴定计算装置24可以是任何计算装置，例如计算机、个人计算装置、智能电话等，其包括通过总线36或其他链路耦接在一起的中央处理单元(CPU)或处理器32、存储器30、网络接口28和用户界面34。柱鉴定计算装置24可以包括其他配置中的其他类型和/或数量的部件和元件。
柱鉴定计算装置24中的处理器32执行用于以本文示例的方式描述和示出的γ分布转变分析的一个或多个方面的存储指令的程序，但可使用其他类型和/或数量的处理装置，并且处理器32可执行其他类型和/或数量的编程指令。在一个实施方案中，处理器32仅位于柱鉴定计算装置24上。在另一个实施方案中，处理器分布在检测器20与柱鉴定计算装置24之间。例如，在一个实施方案中，柱鉴定计算装置24的处理器32包括耦接到检测器的微控制器。在该实施方案中，微控制器用作机载处理器，该机载处理器能够将由检测器20收集的数据映射或转换成数字信号，该数字信号被传输到柱鉴定计算装置24。耦接到一个或多个检测器的微控制器能够执行柱鉴定计算装置24的一个或多个处理功能。
柱鉴定计算装置24中的存储器30存储用于如本文所述的GDTA的一个或多个方面的这些编程指令。多种不同类型的存储器存储装置可用于存储器30，诸如定时处理器装置中的随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM)，或软盘、硬盘、CDROM、DVDROM、或者由耦接到柱鉴定计算装置24中的处理器32的磁性、光学或其他读取和写入系统读取和写入的其他计算机可读介质。
柱鉴定计算装置24的网络接口28操作性地耦接并促进柱鉴定计算装置24与检测器20之间的通信，但也可使用具有其他类型和/或数量的连接和配置的其他类型和/或数量的通信网络或系统。
柱鉴定计算装置24还可包括用户界面34，诸如图形用户界面、触摸用户界面或基于网络的用户界面。用户界面被配置为向用户显示关于色谱柱鉴定参数的信息。用户界面还被配置为从用户接收关于色谱柱参数的输入。
图2中描绘的服务器26可以是一个或多个计算装置，每个计算装置包括CPU或处理器、存储器和网络接口，它们通过总线或类似于针对柱鉴定计算装置24所述的其他链路耦接在一起。服务器26可包括其他配置中的其他类型和/或数量的部件和元件。
本文所述的系统的通信接口22可包括一个或多个局域网(LAN)和/或广域网(WAN)。仅以举例的方式，通信接口22可使用以太网上的TCP/IP和工业标准协议，包括超文本传输协议(HTTP)和/或安全HTTP(HTTPS)，但也可使用其他类型和/或数量的通信网络。
本公开的另一方面涉及一种非暂态计算机可读介质，该非暂态计算机可读介质具有存储在其上的用于使用γ分布转变分析进行色谱柱鉴定的指令。这些指令包括可执行代码，该可执行代码在由处理器执行时，致使处理器执行包括以下的步骤：在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；使用如上所述的用于上升转变前沿的式Ia或如上所述的用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线；使用如上所述的式II和如本文所述的模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值；以及基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量。
本公开的另一方面涉及色谱柱鉴定装置。该装置包括处理器和耦接到处理器的存储器。存储器被配置为执行存储在存储器中的编程指令。这些指令包括：在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；使用如上所述的用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线；使用如上所述的式II和如本文所述的模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，并且基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。
实施例
实施例1–γ分布转变分析用于
Figure BDA0002733944430000222
(英夫利昔单抗)制造中使用的蛋 白质A色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
治疗抗体
Figure BDA0002733944430000221
(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。在这些柱步骤中的每一个柱步骤期间，将用于柱鉴定的γ分布转变分析(GDTA)应用于两次或三次转变。该实施例描述了将GDTA方法应用于在
Figure BDA0002733944430000223
(英夫利昔单抗)制造期间采用的蛋白质A柱纯化步骤。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的两个转变前沿，即，平衡和中间洗涤。
在69批
Figure BDA0002733944430000224
(英夫利昔单抗)的连续纯化的129个前沿上执行GDTA，包括60个平衡和69个洗涤前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在
Figure BDA0002733944430000225
(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的285个批次的历史数据，如本文所述。数据集包括253个平衡前沿和285个洗涤前沿，总共538个历史前沿。不生成32个批次的平衡前沿，其中执行使用前消毒。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表11个柱包装。
GDTA方案：
对于蛋白质A柱纯化(即洗涤和平衡)期间的每个转变前沿，记录电导率和累积流量。通过评估预柱电导率和压力的趋势来完成起始点的确定，以便识别柱内联放置的点。创建并设置电子表格以在前沿的持续时间内使用计算的10秒间隔从服务器检索流量和电导率数据。
通过将最大值设定为1并且将最小值设定为0并且按比例缩放其他点来归一化电导率数据。另外，将流量转换成柱体积。
通过使用与PI模块相同的起始k、θ、Vi参数来计算起始γCDF。从γ分布函数的x项中的每个体积值中减去Vi。为了归一化在纯化期间增加的电导率，对于小于Vi的体积将电导率值设定为0，并且将最大值设定为1。
计算每个电导率值与每个体积点的模型拟合之间的差值(误差)。另外，计算0.5CV和1.8CV之间的误差的平方和。使用Excel解算器计算最佳拟合γCDF参数，以使用下式找到产生具有平方和的最小值的模型曲线的k、θ和Vi参数
Figure BDA0002733944430000231
使用GRG非线性方法，在k≥0.0001和Vi≥0的约束下，将解算器运行10,000次迭代，以确保达到最接近的拟合。
由k、θ和Vi的最终值计算以下参数：
平均值(Vm)，μ＝kθ+Vi，
方差，σ2(Σ平方)＝kθ2
模式＝(k-1)θ+Vi
Figure BDA0002733944430000232
计算每个前沿在0.5CV至1.8CV周期内的平均流速和柱前压力。
接受标准的分析和评价：
正态性
通过创建概率图来评估HETP和SS对于平衡前沿和洗涤前沿两者的结果的正态性。在概率图(图3-图12)中，数据点(HETP或SS的结果)表示在样品中观察到的实际累积分布。这些线表示拟合累积分布以及使用从样品估计的参数基于正态分布的上置信区间和下置信区间。转化百分位数规模，使得拟合的分布形成直线。HETP和SS数据集在下端各自由0界定，然而正态分布模型表明为负值。所得概率图显示曲线形状。参见图3-图6。因此，使用对数转化，结果拟合更好。参见图7-图10的对数转化数据的概率图。
还评估了平均值(Vm)的数据的正态性。图11和图12示出数据符合正态分布，仅有几个异常值。因此，不需要转化。该参数未在方案中指定，但提供曲线拟合有效的有用保证。该参数的控制限度也将从该分析中生成。
异常值的识别和变型的原因。
为了识别异常值并评估结果的可变性，生成每个参数的控制图表。参见图13-图22。控制图表使用HETP和SS的转化数据，其中应用自然对数转化。还将数据绘制在时间序列图中，其中这些参数中的每一个参数都具有转化的控制上限。
HETP：许多异常值和趋势在平衡前沿和洗涤前沿两者的HETP结果中是显而易见的。另外，图13和图18示出了基于Shewhart规则1、2和3的数据趋势，这些规则由图中的正方形表示，并根据以下项进行编号。
Figure BDA0002733944430000241
与这些偏移相关联的批次不被排除在分析之外，因为它们代表了可接受的过程。
两个控制图表(图13和图18)均示出了多个Shewhart规则1违反，其也超过了控制限度。在每种情况下，通过再调节柱来识别和校正问题。
如所预期的，由于柱包装的变化，运行次数满足规则2和3的标准。为了进一步评估趋势，用按柱包装(图23-图24)和滑道(图25-图26)分组的数据制备时间序列图。这些图表显示，许多特殊原因的变化归因于柱劣化和一些孤立的偏移。对于平衡前沿，HETP增加的趋势对于每个柱随时间推移是显而易见的(图23)。观察到的洗涤前沿的偏移看起来在不同时间与一个滑道或另一个滑道隔离(图26)，表明在滑道中可能存在柱性能可变性的来源。
平方和(SS)：平方和是γ分布与过程数据的拟合程度的量度。该量度将提供检查以确保HETP结果有效。在图15和图20中分别示出了平衡和洗涤的转化数据的控制图表。该量度仅具有控制上限。图15示出超过控制上限的6个点。这些点中的四个点与较高HETP相关联。批次880572M在前沿期间具有流动中断，这导致SS高但不影响HETP。
流量和压力的评价。
评价数据集的平均流速和柱前压力以识别任何异常值。评估所识别的差值与结果之间的关系。
流速和柱前压力在图27-图30中呈现趋势。图表显示了步骤中的每一个步骤的流速的优异控制。在该评估期间改变洗涤流速。柱前压力示出与滑道和柱相关的变化，但通常在一定范围内稳定。图31示出HETP值不受洗涤流速变化的显著影响。
蛋白质A柱的控制限度
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度最好通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来确定，如图13对于平衡和图18对于洗涤前沿所示。控制图表显示了通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差计算的转化数据的控制限度(还可参见下表2)。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。
每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图14和图19中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限最好通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来确定，如图15对于平衡前沿和图20对于洗涤前沿所示。控制图表显示了通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差计算的转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。控制图表示出了转化数据的控制上限，这些转化数据被逆转化以分别得到平衡前沿和洗涤前沿的0.050和0.989(参见表2)。每个前沿的SS结果和控制限度的时间序列图在图16和图20中示出。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡前沿和洗涤前沿的平均值大致垂直分布并且不需要转化，参见图11和图12。平衡前沿的平均值紧密分布在1.07CV附近，其中一些异常值存在于任一侧上并且在高侧上接近1.2，参见图17。洗涤前沿示出略微更大的变化并且以0.99CV为中心，其中若干低异常值接近0.8，参见图22。建议对两个前沿的平均值应用0.80至1.20CV的控制限度(参见表2)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度。
表2：在
Figure BDA0002733944430000261
(英夫利昔单抗)制造期间用于蛋白质A柱纯化的推荐 HETP、SS和平均值控制限度
Figure BDA0002733944430000262
实施例2–γ分布转变分析用于
Figure BDA0002733944430000263
(英夫利昔单抗)制造中使用的蛋 白质A色谱柱的亚最佳性能检测的应用
治疗抗体
Figure BDA0002733944430000264
(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。在这些柱步骤中的每一个柱步骤期间，将用于柱鉴定的γ分布转变分析(GDTA)应用于两次或三次转变。该实施例描述了将GDTA方法应用于
Figure BDA0002733944430000265
(英夫利昔单抗)制造所采用的蛋白质A柱纯化步骤。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的两个转变前沿，即，平衡和中间洗涤。
由45批
Figure BDA0002733944430000266
(英夫利昔单抗)的连续纯化在45个平衡前沿上执行GDTA，包括在柱包装883333M001上处理的23批和在柱包装885473M001上处理的22批。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在
Figure BDA0002733944430000271
(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
45个批次的平衡HETP结果的趋势(参见图32)示出了柱包装之间的显著差异。用于柱评估的当前控制未识别两个柱包装之间的任何差异。批次收率的评价显示在两个柱包装上处理的批次之间的显著(P＝0.001)差异，对于具有较高HETP值的柱包装估计低4.3％。对其他潜在因素进行评价，并且其显示与收率差异无相关性。因此，由该分析得出的结论是柱性能差异导致较低的收率。基于该发现，在继续使用之前调节较低收率的塔以改善柱填料。该实施例展示了GDTA方法在评估色谱柱质量中的灵敏度。
实施例3–γ分布转变分析用于
Figure BDA0002733944430000272
(英夫利昔单抗)制造中使用的SP- 琼脂糖高性能色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
如上所述，
Figure BDA0002733944430000273
(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。该实施例描述了将GDTA方法应用于
Figure BDA0002733944430000274
(英夫利昔单抗)制造所采用的SP-琼脂糖高性能(SPHP)柱纯化步骤。SPHP柱是阳离子交换色谱柱。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的三个转变前沿，即，平衡、WFI冲洗和储存前沿。
在23批
Figure BDA0002733944430000275
(英夫利昔单抗)的纯化的69个前沿上执行GDTA，包括23个平衡、WFI冲洗和储存前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在
Figure BDA0002733944430000276
(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的189个转变前沿的历史数据，如本文所述。数据集包括64个平衡前沿、63个WFI冲洗前沿和62个储存前沿。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表6个柱包装。
SPHP柱前沿的GDTA如上文实施例1所述进行。该分析产生了每个前沿的HETP、SS和平均值的测量结果。基于统计评价得出的这三个参数中的每一个参数的控制限度在下表3中列出。
SPHP柱的控制限度：
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择25的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图33(平衡前沿)、图34(WFI冲洗前沿)和图35(储存前沿)中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度将用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。将转化数据的控制上限逆转化以给出0.110的平衡前沿、0.027的WFI冲洗前沿和0.073的储存前沿(参见表3)。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡、WFI冲洗和储存前沿的平均值具有不规则的分布，并且不会受益于转化。建议对前沿中的每一个前沿的平均值应用0.80CV至1.20CV的控制限度(参见表3)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。预期这些限度足以识别与预期计算结果的显著偏离。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度，可以看出该灵敏度随每个柱包装而变化。
表3：在
Figure BDA0002733944430000291
(英夫利昔单抗)制造期间用于SPHP柱纯化的推荐HETP、SS 和平均值控制限度
Figure BDA0002733944430000292
实施例4–γ分布转变分析用于
Figure BDA0002733944430000293
(英夫利昔单抗)制造中使用的Q2 色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
该实施例描述了将GDTA方法应用于
Figure BDA0002733944430000294
(英夫利昔单抗)制造所采用的次级阴离子交换(Q2)柱纯化步骤。Q2柱为阴离子交换色谱柱。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的三个转变前沿，即，平衡、反萃取和储存前沿。
在68个前沿上执行GDTA，前沿包括23个平衡和反萃取前沿、以及22个储存前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在
Figure BDA0002733944430000295
(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的324个转变前沿的历史数据，如本文所述。数据集包括121个平衡前沿、124个反萃取前沿和79个储存前沿。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表10个柱包装。
Q2柱前沿的GDTA如上文实施例1所述进行。该分析产生了每个前沿的HETP、SS和平均值的测量结果。基于统计评价得出的这三个参数中的每一个参数的控制限度在下表4中列出。
Q2柱的控制限度：
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。
每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图36(平衡前沿)、图37(反萃取前沿)和图38(储存前沿)中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度将用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。根据储存前沿的聚集数据确定标准偏差，因为移动范围方法产生更高的标准偏差。控制限度在下表4中报告。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡、反萃取和储存前沿的平均值具有不规则的分布，并且不会受益于转化。建议对前沿中的每一个前沿的平均值应用0.80CV至1.20CV的控制限度(参见表4)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。预期这些限度足以识别与预期计算结果的显著偏离。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度，可以看出该灵敏度随每个柱包装而变化。
表4：在
Figure BDA0002733944430000311
(英夫利昔单抗)制造期间用于Q2柱纯化的推荐HETP、SS和 平均值控制限度
Figure BDA0002733944430000312
虽然本文已经描绘和详述了优选的实施方案，但对于相关领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明的实质的情况下进行各种修改、添加、取代等，并因此认为这些在如下权利要求中所定义的本发明的范围之内。

Claims (17)

1.一种操作色谱柱的方法，所述方法包括：
在包括柱填料的所述色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于所述至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
Figure FDA0002733944420000011
或者
Figure FDA0002733944420000012
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定所述曲线的形状、缩放和偏移参数；
使用式II和所述模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算所述至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
Figure FDA0002733944420000013
其中
μ＝kθ+Vi
Figure FDA0002733944420000014
L＝柱长度；以及
基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：
基于所述评估来调节、替换或再装填所述色谱柱。
3.根据权利要求1所述的方法，还包括：
在所述色谱柱填料的一次或多次后续使用期间，在对应的流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用在所述色谱柱填料的所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和所述计算；
基于所述执行来在所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间确定所述色谱柱填料的HETP值；
编译两次或更多次后续使用的所述色谱柱填料的所确定的HETP值的趋势；以及
基于所编译的趋势来识别所述色谱柱填料的所述质量的变化，其中所述调节、替换或再装填所述色谱柱基于所述识别。
4.根据权利要求3所述的方法，其中与所述柱填料的一次或多次早期使用中的所述色谱柱填料的HETP值相比，所述柱填料的所述一次或多次后续使用中的所述色谱柱填料的HETP值的增加识别出所述色谱柱填料的质量降低。
5.根据权利要求1所述的方法，其中收集在所述柱填料的所述第一操作期间两个或更多个不同的流动相变前沿的柱出口信号和累积流量参数，所述方法包括：
使用针对所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿独立地收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和计算，以计算所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿的HETP值；
基于两个或更多个所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的所述质量，由此所述调节、替换或再装填所述色谱柱基于所述评估。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从含有变性剂的流动相到含有非变性剂的流动相的变化生成。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从含有非变性剂的流动相到含有变性剂的流动相的变化生成。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从碱性流动相条件到更酸性流动相条件的变化生成。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从酸性流动相条件到更碱性流动相条件的变化生成。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从含有有机溶剂的流动相到含水流动相的变化生成。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相变前沿由从含水流动相到含有有机溶剂的流动相的变化生成。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述柱出口信号为电导率。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定包括：
通过将最小信号值设定为0并且将最大电导率值设定为1来归一化所述流动相变前沿的所收集的柱出口信号。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述收集包括：
将第一流动相添加至含有所述柱填料的所述色谱柱；
将第二流动相添加至含有所述柱填料的所述色谱柱，其中所述第一流动相和所述第二流动相具有不同的可检测柱出口信号；以及
在所述第一流动相和所述第二流动相之间在所述流动相变的两个或更多个间隔处收集所述柱出口信号和累积流量参数。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一流动相和所述第二流动相的所述柱出口信号在信号上相差超过信号噪声的量。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述柱出口信号和累积流量参数在整个所述流动相变前沿中在各种间隔处收集。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述色谱柱填料选自亲和色谱填料材料、离子交换色谱填料材料、吸附色谱填料材料、疏水相互作用色谱填料材料、金属螯合物亲和色谱填料材料、尺寸排阻色谱填料材料或分子排阻色谱填料材料。
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