JP7344902B2 - 抗ｔｎｆ抗体組成物を産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの品質評価 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１８年４月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／６６０，３４０号に対する優先権を主張するものであり、特許仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦα抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）、及び当該抗体に関する特定の医薬組成物を産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの品質評価方法に関する。

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２０１９年４月１２日付で作成された「ＪＢＩ６０８３ＵＳＮＰ１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、７ｋｂのサイズを有する配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

カラムクロマトグラフィは、治療用タンパク質を産生するための精製プロセスにおいて使用される重要な技術である。カラムの性能は、プロセスがベンチトップから製造プラントまでスケールアップされた場合にも、並びにカラム寿命にわたって、維持されなければならない。プロセスをスケールアップするため、カラム径、装置、及びバッファ消費量が増加すると、カラム評価の手順が難しくなったり、充填されたベッドの状態（integrity）が変化する可能性があったり、ロジスティックスが生じる可能性がある。

クロマトグラフィカラムの品質評価のための現在の方法は、ピークの最大値から平均値を推定し、ピーク半分高さの幅からの標準偏差を推定することによって、パルス注入後の分散の尺度である理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算する。この方法の主な制限は、ピーク形状がガウス分布から逸脱している場合には分散（すなわち、ＨＥＴＰ）の正確な測定を提供しないというものである。感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピークの歪みを評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのリーディングピーク幅とテーリングピーク幅とを比較している。この手法の限界により、カラム性能の変化に対する感度が不足することとなり、実際には許容可能なカラム性能でありながらも、カラムの再充填又はコンディショニングがなされることが多い。カラムの品質評価のための他の方策が報告されている。これらの方策としては、プロセスの推移をモデル化するためにガウス分布又は非ガウス分布を使用することが含まれる（例えば、Ｌａｒｓｏｎら、「Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄａｔａ ｔｏ Ａｓｓｅｓｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：４８５－４９２（２００３年）及びＢｅｌｏｕｓｏｖらの米国特許第９，０４７，４３８号及びＧａｎｇｕｌｙの米国特許第８，４１０，９２８号を参照）。ガウス法は、注入方法に関して上述したように感度に同じ制限を有しており、報告されている非ガウス法は複雑な計算を必要とする。

繰り返し操作している間、クロマトグラフィカラム性能の変化を監視し、カラムがその寿命にわたって示す有効性を評価するために、より感度が高く、より合理的に設定された限界を有する、改良された品質評価手順が必要とされる。本発明は、技術分野におけるこの不足を克服することを目的とする。

簡潔さのために、参照により本明細書に組み込まれる、本明細書に添付の独立及び従属請求項によって、本発明の実施形態がそれぞれ定義される。本発明の様々な態様の他の実施形態、特徴、及び長所は、添付の図面に関連付けられる以下の発明を実施するための形態から明らかになる。

特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦ抗体を産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、又はそれらの抗原結合フラグメントを含む、抗ＴＮＦ抗体、及び当該抗体に関する特定の医薬組成物を提供する。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集することを含む。この方法は、上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定することを更に含み、式Ｉａ又は式Ｉｂは、

各式中、Ｃは所与のＶについてのカラム出口信号であり、Ｖは累積流量をカラム体積で除算したものであり、ｋ、θ、及びＶ_ｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩと、ガンマモデルの累積分布曲線パラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて計算され、式ＩＩは、

である。

計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の質が評価される。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは再利用、コンディショニング、交換、又は再充填される。

本明細書でガンマ分布の推移分析（Gamma Distribution Transition Analysis、ＧＤＴＡ）と称される、カラムの状態（integrity）を評価するための新たな方法が開発された。この新規方法は、カラム操作の規則的なプロセス工程の間に生成される移動相のトランジションフロントデータをもとに曲線あてはめをする数学的モデルを使用する。次いで、モデルの曲線パラメータを利用して、カラムの質の尺度としてカラムベッド全体の分散を計算する。移動相トランジションフロントは、伝導率、ｐＨ、及び／又はバッファ成分などの異なる特性を有するプロセスバッファ／洗浄液が使用されるクロマトグラフィ精製プロセスの別個の工程から生じる。方法は、一般に、通常のカラム処理中に生成される任意の１つ又は複数の移動相トランジションフロントに適用することができる。

ＧＤＴＡ法の主要な利点は、ガウス分布によりＨＥＴＰを推定する方法よりもカラムベッド全体の分散をより高感度で評価できることである。ＧＤＴＡ法を使用すると、このモデルは曲線あてはめからの分散を正確に測定することから、非対称性を測定する必要がなくなる。加えて、ガンマ分布関数を使用することで、以前に報告された代替の非ガウス法と比較して、フロントトランジションの解析が容易になる。クロマトグラフィプロセスにおいて既に存在する移動相トランジションを使用することで、余分なオフラインプロセス工程の必要がなくなる。更に多くの場合、実施前に、過去のデータから前例によるカラム効率の範囲を設定することができる。最後に、ＧＤＴＡ法を自動化して、一貫性のある適用を保証することができる。

特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＮＦ抗体を産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法を提供し、抗ＴＮＦ抗体は配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、又はそれらの抗原結合フラグメントを含み、当該方法は、
カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、

であり、各式中、Ｃは所与のＶのカラム出口信号であり、Ｖは累積流量をカラム体積で除算したものであり、ｋ、θ、及びＶ_ｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットについてのパラメータである、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程と、
式ＩＩと、ガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、

である、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、

当該計算されたＨＥＴＰ値に基づき、クロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含む。

特定の実施形態では、本発明は、当該評価に基づいてクロマトグラフィカラムをコンディショニング、交換、又は再充填する工程、を更に含む方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラム充填について１回又は複数回の後の使用の間に、対応する移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号と、累積流量パラメータとを収集する工程と、
クロマトグラフィカラム充填について１回又は複数回の後の使用の各回の間に、収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを用い、当該決定及び当該計算を実行する工程と、
当該実行する工程に基づき、当該１回又は複数回の後の使用の各回の間に、クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
２回以上の後の使用に関し、クロマトグラフィカラム充填について決定されたＨＥＴＰ値の傾向を蓄積する工程と、
当該蓄積した傾向に基づき、当該クロマトグラフィカラム充填の質における変化を検出する工程と、を更に含み、当該クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換又は再充填が、当該評価に基づくものである、方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、当該カラム充填の１回又は複数回の後の使用におけるクロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値が、当該カラム充填の１回又は複数回の以前の使用における、クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値と比較して、増加していることにより、クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を検出する方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、カラム充填の当該初回の操作の間に、２つ以上の異なる移動相のトランジションフロントについてのカラム出口信号及び累積流量パラメータが収集される方法を提供し、当該方法は、
２つ以上の異なる移動相トランジションフロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を計算するために、２つ以上の異なる移動相トランジションフロントのそれぞれについて別個に収集されたカラム出口信号及び累積流量パラメータを用い、当該決定する工程及び計算する工程を実行する工程と、
２つ又はそれ以上のＨＥＴＰ計算値に基づき、クロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含み、クロマトグラフィカラムの当該コンディショニング、交換又は再充填は、当該評価に基づくものである。

特定の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィカラムが、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラム、陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び陰イオン交換クロマトグラフィカラムからなる群から選択される方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムがＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムを含み、陽イオン交換クロマトグラフィカラムがＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムを含み、陰イオン交換クロマトグラフィカラムがＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを含む、方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムにおける移動相のトランジションフロントが、抗ＴＮＦ抗体の溶出中に生成されるフロント、グアニジンＨＣｌでのカラムの殺菌中に生成されるフロント、殺菌後の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）でのリンス中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィカラムにおける移動相のトランジションフロントが、抗ＴＮＦ抗体を含み溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理された材料の充填中に生成されるフロント、抗ＴＮＦ抗体の溶出中に生成されるフロント、及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、方法を提供する。

特定の実施形態では、本発明は、陽イオン交換クロマトグラフィカラムにおける移動相のトランジションフロントが、水酸化ナトリウムでのカラムの洗浄中に生成されるフロント及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、方法を提供する。

例示的なガンマ分布の推移分析の曲線あてはめのグラフを示す。図１Ａは、例示的なガンマ分布の推移についての分析曲線の、移動相トランジションデータに対するあてはめを示すグラフである。 例示的なガンマ分布の推移分析の曲線あてはめのグラフを示す。図１Ｂは、カラム効率の尺度として理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）を計算するために使用される曲線からのパラメータを有する、移動相転移データへの例示的なガンマ分布の推移分析曲線のあてはめを示すグラフである。 本明細書に記載されるクロマトグラフィカラムの品質評価システムを示す図である。 プロテインＡカラム平衡化フロントについての、変換を行っていないＨＥＴＰの確率プロットである。 プロテインＡカラム平衡化フロントについての、変換を行っていない平方和（ＳＳ）の確率プロットである。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての変換を行っていないＨＥＴＰの確率プロットである。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての変換を行っていないＳＳの確率プロットである。 プロテインＡカラム平衡化フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＨＥＴＰの確率プロットである。 プロテインＡカラム平衡化フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＳＳの確率プロットである。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＨＥＴＰの確率プロットである。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＳＳの確率プロットである。 プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖ_ｍ）の確率プロットである。 プロテインＡカラム洗浄フロントの平均値（Ｖ_ｍ）の確率プロットである。 プロテインＡカラム平衡化フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＨＥＴＰの管理図である。ＵＣＬ＝上方管理限界（upper control limit）；ＬＣＬ＝下方管理限界である（lower control limit）。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰの結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 プロテインＡカラム平衡化フロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１３の変換データから導出される。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 プロテインＡカラム平衡化フロントのＳＳについての時系列プロットである。ＵＣＬは、図１５の変換データから導出される。 プロテインＡカラム平衡化の平均値（Ｖ_ｍ）の管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＨＥＴＰの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 プロテインＡカラム洗浄フロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。ＵＣＬは、図１８の変換データから導出される。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての、自然対数（λ＝０）変換を行ったＳＳの管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 プロテインＡカラム洗浄フロントについてのＳＳの時系列プロットである。ＵＣＬは、図２０の変換データから導出される。 プロテインＡカラム洗浄フロントについての平均値（Ｖ_ｍ）の管理図である。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 カラム充填によってグループ化された直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）プロテインＡカラム平衡化フロントについてのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。 カラム充填によってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントについてのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。 スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム平衡化フロントについてのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。 スキッドによってグループ化されたＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントについてのＨＥＴＰ結果の時系列プロットである。 ＤＰＣプロテインＡカラム平衡化についての平均流量を示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 平衡化中のプレカラムの平均圧力についてのチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール則１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントについての平均洗浄流量のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 ＤＰＣプロテインＡカラム洗浄フロントについての平均洗浄圧力のチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 洗浄流量を変更する前及び後のＨＥＴＰを示すチャートである。チャート上の番号付けされた点は、シューハートのルール１、２及び３に基づいて、ＨＥＴＰ結果における明らかな外れ値及び／又は傾向を示し、すなわち、１は管理限界外の１点を表し、２は中心線の同じ側にある８点を表し、３は着実に増加又は減少する６つの連続した点を表す。 ４５バッチのＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）（インフリキシマブ）の平衡化フロントに対し評価した２つの異なるプロテインＡカラム充填についてのＨＥＴＰの時系列プロットである。 ＳＰ－セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム平衡化フロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 ＳＰＨＰカラムＷＦＩフラッシュフロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 ＳＰＨＰカラムストレージフロントのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 Ｑ２カラム平衡化フロントのＨＥＴＰについての時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 Ｑ２カラムストリップ平衡化フロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 Ｑ２カラムストレージフロントについてのＨＥＴＰの時系列プロットである。管理限界は、自然対数Ｂｏｘ－Ｃｏｘ変換データから導出される。 ９段階でのゴリムマブ製造プロセスの概要を示す。 ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の溶出中に生成されるフロントの段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接的な生成物捕集を指す。 グアニジンＨＣｌでの殺菌中に生成されるフロントの、段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接的な生成物捕集を指す。 殺菌後の０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５でのリンス中に生成されるフロントの、段階３のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＤＰＣは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の直接的な生成物捕集を指す。 ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）を含む溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理した材料の充填中に生成される、段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）カラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。 ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の溶出中に生成される、段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）カラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。 カラムストリップの間に生成される、段階６のＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムフロントについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ１は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）カラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程１を指す。 水酸化ナトリウムでの洗浄の間に生成される、段階７のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムフロントについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ２は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬカラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程２を指す。 カラムストリップ中に生成される、段階７のＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムフロントについてのＨＥＴＰ結果を示すチャートである。ＰＳ２は、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬカラムでのＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の研磨工程２を指す。

本開示は、抗ＴＮＦ抗体、例えば抗ＴＮＦα抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）、及び当該抗体に関する特定の医薬組成物を産生するための製造方法において、カラム操作を繰り返し行っている間、クロマトグラフィカラムに充填されたベッドの変化をモニタリングするための、改良された品質評価手順に関する。この方法は、スケールとは無関係に、カラムの寿命を通してカラムが性能を発揮する有効性を評価する実用的な手段を提供する。

クロマトグラフィカラムの分離効率は、クロマトグラフィの理論段モデルを使用して特性評価されることが多い。この手法を用い、クロマトグラフィカラムは、多数の段階又は理論段からなるものとして認識される。各段は、試料成分が移動相と固定相との間の平衡を達成する距離である（Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ、Ｚｕｉｄｅｒｗｅｇ及びＫｌｉｎｋｅｎｂｅｒｇ、「Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｍａｓｓ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓ Ｃａｕｓｅｓ ｏｆ Ｎｏｎｉｄｅａｌｉｔｙ ｉｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇｎｇ．Ｓｃｉ．５：２７１～２８９（１９５６年）を参照されたい。この刊行物はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。カラム効率は、そのカラムにおける理論段数Ｎ_ｐにより測定され、カラムの段数が多くなるほど、平衡化が進み、クロマトグラフィのバンドの分散が少なくなり、ピークが狭くなり、分離の質が向上することを意味する。所与のカラムにおいて、段数が多くなるほど段の高さは低くなる。したがって、カラム効率は、段の高さを計算することによっても測定することができ、これは、「理論段相当高さ」又はＨＥＴＰと呼ばれる。この手法を使用すると、ＨＥＴＰ値が小さくなるほど、カラム分離の効率が高くなる。

ＨＥＴＰは、クロマトグラフィカラムの長さＬを、理論段数Ｎ_ｐで割ることによって計算される。
ＨＥＴＰ＝Ｌ／Ｎ_ｐ

カラムが有する理論段数は、過去にはパルス注入後のクロマトグラフのピークを以下の式で検査することによって決定されてきた：

式中、ｔ_Ｒは保持時間であり、ｗ_１／２はピーク半分高さの幅である。しかし、この手法は、Ｎ_ｐを計算するために使用されるピーク形状がガウス分布から逸脱している場合、カラム効率の正確な測定値を提供しない。この感度の不足を補うために、第２の測定値である非対称性を利用して、ピークの歪みを評価する。この測定値は、最大ピーク高さの１０％でのピーク幅のリーディングとテーリングとを比較している。上述のように、このモデルは、カラム性能の変化を検出には感度不足である。

本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラムの操作の間に生じる１つ又は複数の移動相トランジションフロントのガンマ分布に基づく、代替的でより正確なＨＥＴＰの測定を提供する。したがって、本開示は、クロマトグラフィカラムを操作する方法を目的とする。この方法は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集することを含む。この方法は、上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、

式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶについてのカラム出口信号であり、Ｖは累積流量をカラム体積で除算したものであり、ｋ、θ、及びＶ_ｉは曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットパラメータである。理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値は、式ＩＩと、ガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて計算され、

クロマトグラフィカラム充填の質は、計算されたＨＥＴＰ値に基づいて評価される。カラムの質の評価に基づいて、クロマトグラフィカラムは、それ以降の使用が許容可能であると判定され、そうでない場合には、コンディショニング、交換、又は再充填されなければならない。

本明細書に開示されるカラムの品質評価の方法は、任意のクロマトグラフィカラムに適用することができる。例示的なクロマトグラフィカラムとしては、液体クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、分子排除、超臨界流体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、二次元クロマトグラフィ、高速タンパク質（ＦＰＬＣ）クロマトグラフィ、向流クロマトグラフィ、キラルクロマトグラフィ、水性順相（ＡＮＰ）、混合モードクロマトグラフィ、及びシュードアフィニティ（pseudo affinity）クロマトグラフィに使用されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的なカラム充填剤としては、アフィニティクロマトグラフィ充填剤（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティクロマトグラフィ充填剤）、イオン交換クロマトグラフィ充填剤（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、及び混合モード交換クロマトグラフィ充填剤）、吸着クロマトグラフィ充填剤（例えば、シリカゲル又はアルミナ充填剤）、疎水性相互作用クロマトグラフィ充填剤（例えば、フェニル－セファロース、アザ－アレノフィル樹脂、又はｍ－アミノフェニルボロン酸充填剤）、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ充填剤（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）－及びＣｕ（ＩＩ）－アフィニティクロマトグラフィ充填剤）、サイズ排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ゲル電気泳動又はキャピラリ電気泳動充填剤）、又は分子排除クロマトグラフィ充填剤（例えば、ポリスチレン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書に記載される方法は、ルーチンのクロマトグラフィカラムの操作の間、例えば、試料中の化学物質又は生物学的物質の単離、精製、又は同定の間に適用することができる。このような化合物としては、例えば、タンパク質（例えば、抗体及びそのフラグメント）、核酸、炭水化物、脂質、有機低分子、無機低分子、ウイルス、リポソーム、及び任意のそのような化合物のハイブリッド又は多様体を挙げることができるが、これらに限定されない。

試験のためにカラムをオフラインにする必要がある、以前のクロマトグラフィカラムの品質評価方法、例えば、パルス注入法とは対照的に、本明細書に記載される法は、ルーチンのカラム操作中に実施される。本方法は、ルーチンのカラム精製プロセス中に生じる、プロセスバッファ及び異なる特性を有する溶液を含む移動相のプロセスの推移に関する利点を有する。

本発明の方法によれば、「移動相」とは、カラムクロマトグラフィにおける液相であって、クロマトグラフィカラム充填の固定相のクロマトグラフィ材料を取り囲み、移動するものである。クロマトグラフィカラムの操作の間、移動相の組成及び特性は、各プロセス工程、例えば、平衡化、洗浄などで変化することが多い。移動相の特性の変化は、溶出液、すなわち、固定相を通過した後にカラムから溶出する移動相で検出及び測定することができる。本明細書で使用するとき、「カラム出口信号」は、カラムから溶出液が溶出する際に検出される、移動相に由来する溶出液の物理的又は化学的特性についての信号である。カラム出口信号を示す物理的又は化学的特性は、任意の典型的なクロマトグラフィ検出器を使用して測定することができる、ｐＨ、導電率、光吸収、蛍光、電荷、塩濃度、偏光測定、屈折率、電気化学反応、質量電荷比などの任意の特性であり得る。カラム出口信号を測定するのに好適なクロマトグラフィ検出器としては、質量分析計、赤外分光計、可視分光計、紫外分光計、フーリエ変換赤外分光計、炎イオン化検出器、低角度レーザ光散乱検出器、ダイオードアレイ検出器、蛍光分光計、ｐＨ検出器、導電率検出器、電気化学検出器、及び屈折率検出器などが挙げられるが、これらに限定されない。

カラム出口信号は、溶出液から収集される。更に、カラム出口信号を収集するために、「累積流量」も収集される。「累積流量」は、カラムから経時的に溶出される流体の総体積である。この値をカラム体積で割った値を、カラムの体積単位で表す。

トランジションフロントは、累積流量に対するカラム出口信号の変化によって生成される。トランジションフロントは、１つ又は複数の異なる特性（例えば、導電率、ｐＨなど）を有する異なる移動相の、カラムへの連続的な適用から生じる。本明細書に記載される方法によれば、トランジションフロントに対するカラム出口信号は、最大値１及び最小値０を有するように正規化され得る。本明細書で言及されるとき、「下降トランジションフロント」とは、開始移動相が、順次導入された移動相のカラム出口信号よりも高いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相トランジションのことである。

本明細書で使用されるとき、「上昇トランジションフロント」とは、開始移動相が、順次導入される移動相のカラム出口信号よりも低いカラム出口信号、例えば、導電率を有する移動相トランジションのことである。

トランジションフロントは、カラム操作の過程で認定されることになるカラム充填を含むクロマトグラフィカラムに、第１の移動相を添加することによって作成される。第１の移動相の添加後ある程度の時点で、例えば、第１の移動相が溶出を開始した時点で、第１の移動相とは異なる検出可能なカラム出口信号を有する第２の移動相が、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムに添加される。第１の移動相と第２の移動相との間でのトランジション時に、移動相について、２つ以上の間隔でカラム出口信号及び累積流量パラメータを収集することにより、トランジションフロントを検出する。

一実施形態では、第１及び第２の移動相のカラム出口信号は、信号ノイズを超える量で信号が異なる。一実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンドの信号ノイズよりも５％大きい。別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンドの信号ノイズよりも少なくとも１０％大きいである。別の実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号の差は、バックグラウンドの信号ノイズよりも少なくとも１５％大きい。

一実施形態では、トランジションフロントに対して検出されるカラム出口信号は導電率である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１μＳ／ｃｍ、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、又は１ｍＳ／ｃｍ超異なる。

別の実施形態では、トランジションフロントに対して検出されるカラム出口信号は、ｐＨである。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも０．０５のｐＨ単位、少なくとも０．１のｐＨ単位、少なくとも１のｐＨ単位、少なくとも２のｐＨ単位、又は２を超えるｐＨ単位で異なる。

別の実施形態では、トランジションフロントに対して検出されるカラム出口信号は、ＵＶ－Ｖｉｓ吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは少なくとも０．０１の吸光度単位、少なくとも０．１の吸光度単位、少なくとも０．５の吸光度単位、少なくとも０．８の吸光度単位、又は０．８を超える吸光度単位で異なる。

別の実施形態では、トランジションフロントに対して検出されるカラム出口信号は、赤外吸光度である。この実施形態では、第１の移動相と第２の移動相との間のカラム出口信号は、好ましくは、少なくとも１パーセントの透過率、少なくとも１０パーセントの透過率、少なくとも２０パーセントの透過率、少なくとも３０パーセントの透過率、又は３０パーセントを超える透過率で異なる。

一実施形態では、移動相のトランジションフロントは、変性剤を含む移動相から変性剤ではない剤を含む移動相への変化によって生成される。別の実施形態では、移動相のトランジションフロントは、変性剤ではない剤を含む移動相から変性剤を含む移動相への変化によって生成される。

別の実施形態では、移動相のトランジションフロントは、移動相の状態がアルカリ性から中性又はより酸性の状態へと変化することによって生成される。あるいは、移動相のトランジションフロントは、移動相の状態が酸性から中性又はよりアルカリ性へと変化することによって生成される。

別の実施形態では、移動相のトランジションフロントは、有機溶媒を含む移動相から水性移動相へと変化することによって生成される。あるいは、移動相のトランジションフロントは、水性の移動相から有機溶媒を含む移動相へと変化することによって生成される。

カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動相トランジションフロント（mobile transition front）の過程で様々な間隔で収集される。好ましくは、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、最小カラム出口信号から最大カラム出口信号まで、又はその逆に最大カラム出口信号から最小カラム出口信号までが、移動相トランジションフロント（mobile transition front）の全体の過程で収集される。一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、不規則な間隔で収集され、例えば、カラム出口信号の変化が検出されると収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動相トランジションフロント（mobile transition front）の全体の過程で一定の時間間隔で収集される。例えば、一実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動相トランジションフロント（mobile transition front）の全体の過程で１秒間隔で収集される。別の実施形態では、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、移動相のトランジションフェーズ（mobile transition phase）の過程で５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０秒間隔で収集される。

一実施形態では、カラム出口信号データは、分析期間にわたって最大値を１に設定し、最小値を０に設定することによって、上述のように正規化される。流量はまた、カラム体積に変換され、異なるカラム充填間のデータの比較のために標準化される。このデータを使用して、ガンマ累積分布関数（「ＣＤＦ」）を使用して、収集されたデータ点に最もあてはまる曲線を生成する。ガンマＣＤＦは、以下の式Ｉ用い、３つの値：形状パラメータｋ、スケールパラメータθ（シータ）、オフセットパラメータＶ_ｉに基づいて決定される。
Ｃ＝ｆ（Ｖ，ｋ，θ，Ｖｉ）式Ｉ

式Ｉを参照すると、Ｃは、所与のＶについてのカラム出口信号であり、Ｖは、累積流量をカラム体積で除算したものである。式Ｉａは式Ｉから導出されるものであり、上昇トランジションフロントに沿ってガンマ分布の関数の値を決定するために用いる。

式中、
Γは、第２種不完全ガンマ関数であり、
γは、第１種不完全ガンマ関数である。

あるいは、式Ｉｂはまた、式Ｉから導出され、下降トランジションフロントに沿ってガンマ分布の関数の値を決定するために使用される。

図１Ａは、カラムトランジションフロントに対して収集され、正規化された、例示的なカラム出口信号及びカラム体積データをプロットするグラフである。式Ｉａを使用して、データに対する曲線あてはめを生成した。

最適にあてはめられるガンマＣＤＦパラメータは、ｋ、θ、及びＶ_ｉの値を操作してデータからの平方和の偏差が最小となるモデル曲線を生成するパラメータを見出すことによって決定される。この曲線は、トランジションフロント全体からのデータ点を介してあてはめられ、最適にあてはめられるモデルが生成される。この曲線からｋ、θ、及びＶ_ｉのパラメータを利用して、カラム効率の指標として、カラムの段数Ｎ_ｐ又は段の高さ、すなわち、ＨＥＴＰを計算する。

段数Ｎ_ｐは、曲線モデルの平均μ及び分散σ^２に基づいて計算する。平均及び分散は、以下のように曲線から導出される：
平均、μ＝ｋθ＋Ｖ_ｉ
分散、σ^２＝ｋθ^２

段数は、以下の平均及び分散に基づいて計算される：
段数、Ｎ_ｐ＝μ^２／σ^２

ＨＥＴＰは、以下のように、センチメートルでのカラムの長さＬを段数Ｎ_ｐで割ったものに基づいて、上述のように計算される。

図１Ｂは、定義された平均μ及び分散σ２のパラメータを有する、図１Ａに示されるものと同じグラフを示す。

本明細書に記載されるように計算されたデータに対するモデルのあてはめを評価するために、平均（Ｖ_ｍ）、平方和（ＳＳ）、及びモードも決定することができる。ＳＳは、導出されるプロセスデータからの曲線モデルの偏差の直接的な測定である。Ｖ_ｍ値は、カラムの体積単位におけるトランジションの中心点の尺度である。バッファのトランジションには典型的には１カラム体積が必要なため、この値は１に近い値にする必要がある。平均は、典型的には、フロントの形状に影響されない。平均値を使用して、誤差について自動計算をチェックする。例えば、値が低い場合は、データ収集のエラーを示している可能性があり、結果を確認するために更なる調査を必要とする可能性がある。モードは、変化率が最大である体積に対応する。トランジション曲線が対称である場合には平均と等しくなる。典型的には、トランジションに歪みがあり、モードは平均よりも低い。

ＨＥＴＰに加えて、ｋ（形状）パラメータから計算することができる他の因子としては、非対称性に関連する尺度である歪み（γ_１）、及びピーク先鋭度の尺度である尖度（γ_２）が挙げられる。これらの因子を使用して、カラム性能の変化を特定することができる。

本明細書に記載される方法によれば、カラム出口信号及び累積流量パラメータは、ガンマＣＤＦからＨＥＴＰを計算するために、カラムプロセスがカラムで実行されるたびに、同じ移動相のトランジションフェーズ（mobile transition phase）について収集される。同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムにより生成された過去のデータはまた、ＨＥＴＰを計算するために取得し、利用することができる。ＨＥＴＰデータを算出して、過去又は現在の操作間の一致するトランジションについてＨＥＴＰ値の傾向を特定し、ＨＥＴＰ値の上方及び下方管理限界を特定する。管理限界は、許容可能なＨＥＴＰ値の範囲、すなわち、許容可能なカラム効率に対応するＨＥＴＰ値を定義する、ＨＥＴＰの高値及び低値である。これらの上方及び下方管理限界は、統計的評価に基づいて設定することができる。例えば、一実施形態では、上方及び下方管理限界は、平均＋／－２、３、又は４の標準偏差を計算することによって設定される。一実施形態では、上方及び下方管理限界は、本明細書の実施例に記載される平均＋／－３の標準偏差を計算することによって設定される。別の実施形態では、上方及び下方管理限界は、過去のデータから信頼区間を計算することによって設定することができる。一実施形態では、上方及び下方管理限界は、過去のデータから９５％、９６％、９７％、又は９８％信頼区間を計算することによって設定される。別の実施形態では、上方及び下方管理限界は、過去のデータから９９％信頼区間を計算することによって設定される。

上方及び下方管理限界を利用して、カラムの時間及び使用に対するカラム効率の変化を特定する。典型的には、上方管理限界を超えるＨＥＴＰの任意の増加は、カラム効率の低下を示し得る。ルーチンのカラムモニタリング中に、ＨＥＴＰの有害な傾向が観察されるか、又は管理限界を超えた場合、溶出液の製品品質、カラムプロセス性能、及び／又は不純物除去データを評価して、特定されたバッチの製品品質を確保する必要がある。製品品質又はカラム性能のいずれかが設定された基準を満たさない場合は、カラムのコンディショニング、再充填又は交換などの適切な補正処置を行い、更なる使用のためにリリースする前に品質評価を行う必要がある。充填されたベッドを再分配するためにクロマトグラフィカラムをコンディショニングする方法は、使用されるカラムに応じて異なるが、当業者には十分に把握されている。

カラム操作の間のカラム性能のモニタリングは、精製プロトコルにルーチンに含まれる１つ又は２つ以上のトランジション相に基づくものであり得る。好ましくは、モニタリングは、精製プロトコルの間の２つ又は３つ以上のトランジション相についてのガンマＣＤＦに基づき計算されたＨＥＴＰ値に基づく。

以下に記載されるように、カラム性能を決定するための、本明細書に記載されるＧＤＴＡ法を用いたＨＥＴＰの計算は、同じプロセス工程及び同じスケールで使用されるカラムから収集された過去のデータに基づくものとすることができる。プロセス工程について適格な縮小スケールモデルから生成されたデータを評価に使用することもできる。これにより、品質評価データと比較して、カラム性能の質を評価することができる。

流量（Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒ効果）、生じ得るバッファ相互作用、及び余分なカラム体積などの因子は、本明細書に記載されるＧＤＴＡ法の結果に影響を与える可能性があり、ＧＤＴＡの管理限界を設定する際に評価する必要がある。ＧＤＴＡに含まれるトランジションフロントは、両方の移動相のカラム出口信号の測定値がスケール上にあり、移動相間のカラム出口信号測定値の差がバックグラウンドの信号ノイズを上回っており、移動相と樹脂との間の相互作用が一貫しており、再現性があるなどの特定の基準を満たすことが好ましい。

使用中のリリース及びモニタリングに使用されるカラムに共通する評価基準は、装置及び樹脂の種類に固有の過去のデータを評価することによって決定されるものとする。カラムの品質評価の結果と性能との間の関係を評価するために使用することができる、ルーチンの製品品質及びプロセス性能の測定の例を表１に掲載する。評価に使用するルーチンの質及びプロセス性能の測定は、表１に掲載されるものに限定されないものの、リストはガイドラインであることを意味し、評価するプロジェクト及びプロセス工程に関する具体的な要件に基づくものである必要がある。製品品質及びプロセス性能に関する仕様及び許容基準は、プロジェクトに固有であり、プロセス要件に基づいて決定される。

本明細書に記載されるガンマ分布の推移の分析方法は、カラムの操作中にリアルタイムで実行することができる。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価計算装置によって、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、クロマトグラフィカラムの品質評価計算装置によって、上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程とを含む。

式Ｉａ及び式Ｉｂを参照すると、Ｃは所与のＶについてのカラム出口信号であり、Ｖは累積流量をカラム体積で除算したものであり、ｋ、θ、及びＶ_ｉは、曲線を画定するために使用される形状、スケール及びオフセットについてのパラメータである。この方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価計算装置によって、式ＩＩと、ガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程を更に含む。

本方法は、クロマトグラフィカラムの品質評価の計算装置を使用して、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいて、クロマトグラフィカラム充填の質を評価することを更に含む。この評価に基づいて、クロマトグラフィカラムの操作者は、クロマトグラフィカラムを再使用できるか、又は次のカラム操作の前に交換、再充填、又はコンディショニングする必要があるかを判断することができる。

図２は、クロマトグラフィカラムを操作し、本明細書に記載されるようにカラム効率をリアルタイムで評価する方法及びシステムの概要を提供する図である。図２及び上述のように、システム１０は、複雑な混合物としてカラムに導入された生体分子を分離するために使用されるクロマトグラフィカラム１２、すなわち、溶出液１４、クロマトグラフィカラムからの溶出の際の溶出液のカラム出力信号を検出する検出器２０、検出器２０からの信号／データを送信する通信インタフェース２２、カラムの品質評価の計算装置２４、及びサーバ２６を含む。

クロマトグラフィカラム１２は、透過性、半透過性、又は不透過性の固相カラム充填材料で充填される。好適なクロマトグラフィカラム及びカラム充填材料は、上述のように記載されている。対象となる生体分子を含む溶出液１４をクロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６もまた、クロマトグラフィカラム１２に導入する。移動相１６は、クロマトグラフィカラム１２の固定相を通じた生体分子の分離、及びクロマトグラフィカラムの出力１８を通じた溶出液中の生体分子の溶出を促進する。本明細書に記載される方法によって、移動相１６は、以下に記載されるように、１つ又は複数の物理的又は化学的特性、例えば、ｐＨ、導電率、塩濃度が互いに異なる、連続的に導入される複数のカラムバッファ及び／又は洗浄試薬を含む。１つ又は複数の物理的又は化学的特性におけるこれらの差違は、検出器２０によって溶出液において検出される。

検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の出力１８に連結される。したがって、検出器２０は、クロマトグラフィカラム１２の溶出液を介してカラム出力信号をモニタリング及び収集する。好適な検出器及び溶出液の特性、すなわち、検出されるカラム出力信号は、上述されている。検出器は、検出器２０によって収集されたデータ（例えば、カラム出力信号及び累積流量パラメータ）を、データ処理用のカラムの品質評価計算装置２４及び／又はストレージのためのサーバ２６に送信する通信インタフェースユニット２２に連結されている。

本明細書に記載されるシステムのカラムの品質評価の計算装置２４は、バス３６又は他のリンクによって一緒に結合される、中央処理装置（ＣＰＵ）又はプロセッサ３２、メモリ３０、ネットワークインタフェース２８、及びユーザインタフェース３４を含む、任意の計算装置、例えばコンピュータ、パーソナルコンピュータ、スマートフォンなどであってもよい。カラムの品質評価の計算装置２４は、他の構成で、他のタイプ及び／又は数の構成要素及び要素を含んでもよい。

カラムの品質評価の計算装置２４内のプロセッサ３２は、本明細書の実施例によって説明及び例示される、１つ又は複数の態様のガンマ分布の推移分析について記憶された命令のプログラムを実行するが、他のタイプ及び／又は数の処理装置を使用することができ、プロセッサ３２は、他のタイプ及び／又は数のプログラムされた命令を実行することができる。一実施形態では、プロセッサ３２は、カラムの品質評価の計算装置２４にのみ設置される。別の実施形態では、プロセッサは、検出器２０とカラムの品質評価の計算装置２４との間に配置される。例えば、一実施形態では、カラムの品質評価の計算装置２４のプロセッサ３２は、検出器に連結されたマイクロコントローラを含む。この実施形態では、マイクロコントローラは、検出器２０によって収集されたデータを、カラムの品質評価の計算装置２４に送信されるデジタル信号にマッピング又は変換することができるオンボードプロセッサとして機能する。１つ又は複数の検出器に連結されたマイクロコントローラは、カラムの品質評価の計算装置２４の１つ又は複数の処理機能を実行することができる。

カラムの品質評価の計算装置２４内のメモリ３０は、本明細書に記載されるように、１つ又は複数の態様のＧＤＴＡのためのこれらのプログラムされた命令を記憶している。メモリ３０には、タイミングプロセッサ装置内のランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）及び／又はリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、又はカラムの品質評価の計算装置２４内のプロセッサ３２に連結された磁気的、光学的、又は他の読み書きシステムによって読み書きされるフロッピーディスク、ハードディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、又は他のコンピュータ読み取り可能な媒体など、様々な種類のメモリ記憶装置を使用することができる。

カラムの品質評価の計算装置２４のネットワークインタフェース２８は、カラムの品質評価の計算装置２４と検出器２０との間の通信を操作可能なように連結し、通信を容易にするが、他のタイプ及び／又は数の接続及び構成を有する他のタイプ及び／又は数の通信ネットワーク又はシステムを使用することができる。

カラムの品質評価の計算装置２４は、例えば、グラフィカルユーザインタフェース、タッチユーザインタフェース、又はウェブベースのユーザインタフェースなどのユーザインタフェース３４を更に含んでもよい。ユーザインタフェースは、クロマトグラフィカラムの品質評価パラメータに関する情報をユーザに表示するように構成される。ユーザインタフェースはまた、クロマトグラフィカラムパラメータに関するユーザからの入力を受信するように構成される。

図２に示すサーバ２６は、それぞれがＣＰＵ又はプロセッサ、メモリ、及びネットワークインタフェースを含む１つ又は複数の計算装置であってもよく、これらは、カラムの品質評価のコンピューティング装置２４に関して記載されたものと同様のバス又は他のリンクによって一緒に結合される。サーバ２６は、他のタイプ及び／又は数の他の構成の構成要素及び要素を含んでもよい。

本明細書に記載されるシステムの通信インタフェース２２は、１つ又は複数のローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含むことができる。例示としてのみ、通信インタフェース２２は、ハイパーテキスト転送プロトコル（ＨＴＴＰ）及び／又はセキュアＨＴＴＰ（ＨＴＴＰＳ）を含む、イーサネット上のＴＣＰ／ＩＰ及び業界標準プロトコルを使用することができるが、他のタイプ及び／又は数の通信ネットワークが利用されてもよい。

本開示の別の態様は、クロマトグラフィカラムの品質評価のためガンマ分布の推移分析を使用する命令を記憶している、非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。これらの命令は、プロセッサによって実行されると、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、上昇するトランジションフロントについては上述の式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては上述の式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程と、上述の式ＩＩと、本明細書に記載されるガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づき、クロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含む工程をプロセッサに実行させる、実行可能なコードを含む。

本開示の別の態様は、クロマトグラフィカラムの品質評価の装置に関する。この装置は、プロセッサ及びプロセッサに連結されたメモリを含む。メモリは、メモリに記憶されたプログラム命令を実行するように構成される。これらの命令は、カラム充填を含むクロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、上述のように、上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程と、上述のように、式ＩＩと、本明細書に記載されるガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、当該計算されたＨＥＴＰ値に基づいてクロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含む。

実施例１－レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムのカラムの品質評価への、ガンマ分布の推移分析の適用
概論：
治療用抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、複数の段階を含み、そのうちの４段階はクロマトグラフィによる精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布の推移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間の２つ又は３つの推移に適用した。本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造中に使用されるプロテインＡカラム精製工程へのＧＤＴＡ法の適用を記載する。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つのトランジションフロント、すなわち、平衡化フロント及び中間洗浄フロントを含む。

６９バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の連続精製から、６０の平衡化フロント及び６９の洗浄フロントを含む１２９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマモデルによるフロント分布分析は製造と並行して行われ、製造プロセスには影響しなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行った。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。

ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された２８５バッチの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、２５３の平衡化フロント及び２８５の洗浄フロントを含む、合計５３８の過去のフロントが含まれていた。使用前に殺菌を行った３２バッチについては、平衡化のフロントは生成されなかった。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択されたものであり、１１のカラム充填を表す。

ＧＤＴＡプロトコル：
プロテインＡカラム精製中、すなわち、洗浄及び平衡化中の各トランジションフロントについて、導電率及び累積流量を記録した。カラムがインラインに置かれた時点を特定するために、プレカラム導電率及び圧力の傾向を評価することによって、開始点の決定を行った。フロントの持続時間について、スプレッドシートを作成し、計算された１０秒の間隔を使用して、サーバから流量及び導電率のデータを取得するように設定した。

導電率データは、最大値を１及び最小値を０とし、他の点を相対的にスケーリングすることで正規化した。加えて、流量をカラム体積に変換した。

開始ガンマＣＤＦを、ＰＩモジュールと同じ開始ｋ、θ、Ｖ_ｉパラメータを使用して計算した。Ｖ_ｉは、ガンマ分布関数のｘ項の各体積値から減算した。精製中に増加していた導電率を正規化するために、Ｖ_ｉ未満の体積では導電率の値を０に設定し、最大値を１に設定した。

各導電率値と各体積点に対するモデルあてはめとの差（誤差）を計算した。加えて、０．５～１．８ＣＶの誤差に対する平方和を計算した。次の式を用い平方和の最小値を有するモデル曲線を生成するｋ、θ、及びＶ_ｉパラメータを見つけるために、Ｅｘｃｅｌソルバーを使用して最良にあてはめられるガンマモデルのＣＤＦパラメータを計算した。

ソルバーは、最も近いあてはめを確実に達成するために、ｋ≧０．０００１及びＶ_ｉ≧０の制約を有するＧＲＧ非線形法を使用して、１０，０００回の反復を行った。

ｋ、θ、及びＶ_ｉの最終値から以下のパラメータを計算した：

平均流量及びプレカラム圧力を、各フロントについて０．５～１．８ＣＶの期間にわたって計算した。

受入基準の分析及び評価：
正規性
平衡化フロント及び洗浄フロントの両方についてのＨＥＴＰ及びＳＳの結果を、確率プロットを作成することによって正規性について評価した。確率プロット（図３～図１２）では、データ点（ＨＥＴＰ又はＳＳの結果）は、試料で観察された実際の累積分布を表している。線は、試料から推定されるパラメータを使用した正規分布に基づいて、あてはめられた累積分布並びに信頼区間の上限値及び下限値を表している。パーセンタイルスケールを変換することにより、あてはめられた分布が直線を形成する。ＨＥＴＰ及びＳＳのデータセットは、それぞれ下端が０に固定されているが、正規分布モデルは負の値を示唆している。得られた確率プロットは、曲線形状を示す。図３～図６を参照されたい。したがって、結果は、自然対数変換を用いて良好にあてはめられる。自然対数変換データの確率プロットについては、図７～図１０を参照されたい。

平均（Ｖ_ｍ）のデータもまた、正規性について評価した。図１１及び図１２は、データが正規分布にあてはめられ、外れ値はごくわずかであることを示す。したがって、変換は必要なかった。このパラメータは、プロトコルにおいて指定されなかったが、曲線あてはめが有効であることを保証した。このパラメータの管理限界もまた、この分析から生成される。

外れ値の特定及び変動の原因。
外れ値を特定し、結果の変動性を評価するために、各パラメータについての管理図を作成した。図１３～図２２を参照されたい。管理図は、ＨＥＴＰ及びＳＳの変換されたデータを使用し、自然対数変換が適用された。データはまた、これらのパラメータのそれぞれについて、変換された上方管理限界を有する時系列プロットでプロットされる。

ＨＥＴＰ：ＨＥＴＰ結果において、平衡化フロント及び洗浄フロントの両方について多くの外れ値及び傾向が明らかである。加えて、図１３及び図１８は、図中の四角で表され、以下に番号を付したシューハートのルール１、２及び３に基づくデータの傾向を示している。

これらの逸脱に関連するバッチは、許容可能なプロセスを代表するものであることから分析から除外されなかった。

管理図（図１３及び図１８）は両方とも、管理限界を超えるシューハートルール１の違反を数多く示している。各場合において、問題は、カラムを再コンディショニングすることによって特定及び修正された。

予想されるように、カラム充填の変動により、いくつかの実行は、ルール２及び３の基準を満たしていた。傾向を更に評価するために、カラム充填（図２３～図２４）及びスキッド（図２５～図２６）によりグループ化したデータを使用して時系列プロットを作成した。これらのチャートは、特別な原因による変動の多くが、カラムの劣化及びいくつかの孤立した逸脱に起因することを示している。各カラムについて、平衡化フロントの時間に対してＨＥＴＰの増加傾向が明らかである（図２３）。洗浄フロントで観察された逸脱は、異なる時間で一方のスキッド又は他方のスキッドに分離されているように見え（図２６）、これは、スキッドにおけるカラム性能の変動の原因がある可能性を示唆している。

平方和（ＳＳ）：平方和は、ガンマ分布がプロセスデータにどのくらい良好にあてはめられるかの尺度である。この測定は、ＨＥＴＰ結果が有効なものであることを確認するためのチェックを提供する。変換されたデータの管理図は、それぞれ平衡化及び洗浄について図１５及び図２０に示される。この測定値は、上方管理限界のみを有する。図１５は、上方管理限界を超えた６点を示す。これらのうちの４つは、より高いＨＥＴＰと関連付けられる。バッチ８８０５７２Ｍは、フロントの間に流れが乱れてＳＳが高くなったが、ＨＥＴＰには影響しなかった。

流量及び圧力の評価。
データセットの平均流量及びプレカラム圧力を評価して、任意の外れ値を特定した。特定された差違と結果との間の関係を評価した。

流量及びプレカラム圧力は、図２７～図３０の傾向がある。チャートは、各工程の流量制御が優れていることを示している。この評価の間、洗浄流量を変化させた。プレカラム圧力は、スキッド及びカラムに関連する変動を示しているが、概して、ある範囲内で安定である。図３１は、ＨＥＴＰ値が洗浄流量の変化によって有意な影響を受けていないことを示している。

プロテインＡカラムの管理限界
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連するものであり、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、０超でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、平衡化について図１３及び洗浄フロントについて図１８に示すように、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最適に決定される。管理図は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算され変換されたデータの管理限界を示す（以下の表２も参照されたい）。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上方及び下方管理限界を逆変換（ｅ^ｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。

各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図１４及び図１９に示す。この過去のレビューに基づき、これらの限界内での動作であれば、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待される。上方管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下方管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。

平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマモデルの分布がどのくらい良好にデータにあてはめられるかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値がプロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は０超でなければならない。ＳＳの上方管理限界は、平衡化フロントについて図１５及び洗浄フロントについて図２０に示すように、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最適に決定される。管理図は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算され変換されたデータの管理限界を示す。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。管理図は、平衡化フロント及び洗浄フロントについてそれぞれ０．０５０及び０．９８９を与えるように逆変換した、変換されたデータの上方管理限界を示している（表２を参照されたい）。各フロントのＳＳ結果及び管理限界の時系列プロットを図１６及び図２０に示す。限界内にある結果は、モデルがデータ及び過去の結果にあてはめられることを保証する。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。

平均値：
平均値を、ガンマモデルの分布の精度についての第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、システム内で当該値をシフトさせる、大過剰のカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用などといった他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化フロント及び洗浄フロントの両方の平均値はほぼ正規分布しており、変換を必要としない。図１１及び図１２を参照されたい。平衡化フロントの平均は１．０７ＣＶ付近に密に分布しており、いくつかの外れ値がいずれかの側に存在し、高い側では１．２に接近している。図１７を参照されたい。洗浄フロントは、わずかに多くの変動を示し、かつ０．９９ＣＶを中心としており、０．８付近に低い外れ値がいくつか存在する。図２２を参照されたい。両フロントの平均については、０．８０～１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表２を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかを確認するためのチェックとして用いられるものであることから、これは適切である。より厳しい管理限界は、このチェックの感度としては必要とされていない。

実施例２－レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、プロテインＡクロマトグラフィカラムの最適以下の性能での検出のための、ガンマ分布の推移分析の適用
治療抗体レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは複数の段階を含み、そのうちの４段階はクロマトグラフィ精製を含む。カラムの品質評価のためのガンマ分布の推移分析（ＧＤＴＡ）を、これらのカラム工程のそれぞれの間の２つ又は３つの推移に適用した。本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用されるプロテインＡカラム精製工程へのＧＤＴＡ法の適用を記載する。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した２つのトランジションフロント、すなわち、平衡化フロント及び中間洗浄フロントを含む。

カラム充填８８３３３３Ｍ００１で処理された２３バッチ及びカラム充填８８５４７３Ｍ００１で処理された２２バッチを含む、４５バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の連続した精製から、４５の平衡化フロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマモデルによるフロント分布分析は製造と並行して行われ、製造プロセスには影響しなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行った。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。

４５バッチの平衡化ＨＥＴＰ結果の傾向は（図３２を参照されたい）、カラム充填間の有意差を示した。カラム評価のための現在の対照では、２つのカラム充填間の差は確認されなかった。バッチ収率の評価は、２つのカラム充填で処理されたバッチ間の有意な差（ｐ＝０．００１）を示し、より高いＨＥＴＰ値を有するカラム充填の方が４．３％低いと推定された。他の潜在的要因を評価したところ、収率差に対する相関は示さなかった。したがって、この分析からは、カラムの性能差により低収率が生じたという結論が得られる。この発見に基づいて、より低い収率のカラムをコンディショニングして、使用を連続する前にカラム充填を改善した。この実施例は、クロマトグラフィカラムの質を評価する際のＧＤＴＡ法の感度を示す。

実施例３－レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、ＳＰ－セファロース高性能クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価への、ガンマ分布の推移分析の適用
概論：
上述のように、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造プロセスは、複数の段階を含み、そのうちの４段階はクロマトグラフィ精製を含む。本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用されるＳＰ－セファロース高性能（ＳＰＨＰ）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載する。ＳＰＨＰカラムは陽イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つのトランジションフロント、すなわち、平衡化フロント、ＷＦＩフラッシュフロント、及びストレージフロントを含む。

２３バッチのレミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の精製から、２３の、平衡化フロント、ＷＦＩフラッシュフロント、及びストレージフロントを含む６９のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマモデルによるフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスには影響しなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。

ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された１８９のトランジションフロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、６４の平衡化フロント、６３のＷＦＩフラッシュフロント、及び６２のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択されたものであり、６のカラム充填を表す。

ＳＰＨＰカラムフロントについてのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載するように行った。この分析により、ＨＥＴＰ、ＳＳ、及び各フロントの平均値についての測定値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれについて導出された管理限界を以下の表３に列挙する。

ＳＰＨＰカラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連するものであり、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、０超でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、２５の移動範囲を選択した。上方及び下方管理限界を逆変換（ｅ^ｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３３（平衡化フロント）、図３４（ＷＦＩフラッシュフロント）、及び図３５（ストレージフロント）に示す。この過去のレビューに基づき、これらの限界内での動作であれば、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上方管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下方管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。

平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマモデルの分布がどのくらい良好にデータにあてはめられるかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値がプロセスデータを表すことを確認する。下限は存在せず、結果は０超でなければならない。ＳＳの上方管理限界は、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。変換されたデータの上方管理限界を逆変換して、平衡化フロントについて０．１１０、ＷＦＩフラッシュフロントについて０．０２７、及びストレージフロントについて０．０７３を得た（表３を参照されたい）。限界内にある結果は、モデルがデータ及び過去の結果にあてはめられることを保証する。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。

平均値：
平均値を、ガンマモデルの分布の精度についての第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、システム内で当該値をシフトさせる、大過剰のカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用などといった他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化フロント、ＷＦＩフラッシュフロント及びストレージフロントの平均値は不規則な分布を有し、変換の恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０～１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表３を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかを確認するためのチェックとして用いられるものであることから、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するのに十分なものであると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックの感度としては必要とされず、これについては各カラム充填で変化すると見られる。

実施例４－レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される、Ｑ２クロマトグラフィカラムのカラムの品質評価への、ガンマ分布の推移分析の適用
概論：
本実施例は、レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）の製造に使用される二次陰イオン交換（Ｑ２）カラム精製工程にＧＤＴＡ法を適用することを記載する。Ｑ２カラムは、陰イオン交換クロマトグラフィカラムである。精製プロセスは、本明細書に記載されるように、ＧＤＴＡに適した３つのトランジションフロント、すなわち、平衡化フロント、ストリップフロント、及びストレージフロントを含む。

２３の平衡化フロント及び２３のストリップフロント、及び２２のストレージフロントを含む６８のフロントについてＧＤＴＡを実行した。ガンマモデルによるフロント分布分析は、製造と並行して行われ、製造プロセスには影響しなかった。全ての製造、モニタリング及び制御は、現在の有効な手順を使用して行われた。レミケード（登録商標）（インフリキシマブ）のカラムクロマトグラフィ精製中、導電率（すなわち、カラム出口信号）及び溶出液の流量（すなわち、累積流量）を記録した。

ＧＤＴＡをリアルタイムでカラム操作に適用したことに加えて、過去４年間に処理された３２４のトランジションフロントの過去のデータもまた、本明細書に記載されるように収集及び分析した。データセットには、１２１の平衡化フロント、１２４のストリップフロント、及び７９のストレージフロントが含まれた。このデータセットは、カラムの寿命を通じて均等な分布を提供するために選択されたものであり、１０のカラム充填を表す。

Ｑ２カラムフロントのＧＤＴＡは、上記実施例１に記載されるように行われた。この分析は、ＨＥＴＰ、ＳＳ、及び各フロントの平均値についての測定値を生成した。統計的評価に基づいてこれら３つのパラメータのそれぞれについて導出された管理限界を以下の表４に列挙する。

Ｑ２カラムの管理限界：
ＨＥＴＰ：
ＨＥＴＰは、カラム性能に直接関連するものであり、分散を増加させる可能性があるシステム内の他の要因によっても影響を受ける。結果は、０超でなければならない。ＨＥＴＰの管理限界は、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。上方及び下方管理限界を逆変換（ｅ^ｘ）して、変換されていないデータの管理限界を決定する。

各フロントのＨＥＴＰ結果及び管理限界の時系列プロットを図３６（平衡化フロント）、図３７（ストリップフロント）、及び図３８（ストレージフロント）に示す。この過去のレビューに基づき、これらの限界内での動作であれば、許容可能なクロマトグラフ性能が得られると期待されている。上方管理限界を超える値は、カラム流量の問題を示している可能性があり、更に評価する必要がある。下方管理限界を下回る値は、計算エラーを示している可能性がある。

平方和（ＳＳ）：
ＳＳは、ガンマモデルの分布がどのくらい良好にデータにあてはめられるかを示す尺度である。この尺度を使用して、ＧＤＴＡ法で計算されたＨＥＴＰ値がプロセスデータを表すことを保証する。下限は存在せず、結果は０超でなければならない。ＳＳの上方管理限界は、自然対数のＢｏｘ－Ｃｏｘ変換（λ＝０）を用いることによって最良に決定される。変換されたデータの管理限界は、平均＋／－３の標準偏差を用いＭｉｎｉｔａｂにより計算した。標準偏差は、平均移動範囲に基づいて決定される。カラム寿命の間のカラム性能の変動を考慮するために、１００の移動範囲を選択した。移動範囲による方法ではより高い標準偏差が出ていたため、ストレージフロントについての集計データから標準偏差を決定した。管理限界を下の表４に報告する。限界内にある結果は、モデルがデータ及び過去の結果にあてはめられることを保証する。結果がこの範囲外である場合、特別な原因が考えられる。

平均値：
平均値を、ガンマモデルの分布の精度についての第２の尺度として加えた。平均値は、フロントの理論的な質量中心を表し、システム内で当該値をシフトさせる、大過剰のカラム体積や移動相と樹脂との間の相互作用などといった他の要因がない限り、常に１カラム体積に近い値であるべきである。平衡化フロント、ストリップフロント、及びストレージフロントの平均値は不規則な分布を有し、変換の恩恵を受けていない。フロントのそれぞれの平均については、０．８０～１．２０ＣＶの管理限界を適用することが推奨される（表４を参照されたい）。平均値はカラム性能の尺度ではなく、分析が適切であったかを確認するためのチェックとして用いられるものであることから、これは適切である。これらの限界は、予想される計算結果からの有意な逸脱を特定するのに十分なものであると予想される。より厳しい管理限界は、このチェックの感度としては必要とされず、これについては各カラム充填で変化すると見られる。

実施例５－ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造プロセス
ゴリムマブのバックグラウンド
抗ＴＮＦα剤を用いた治療は炎症性関節炎の治療に成功裏に使用されてきたが、初期の抗ＴＮＦα剤は安全性、投与計画、費用及び／又は免疫原性に関して限界がある。いくつかの限界に対処するために、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）と表される完全ヒト抗抗ＴＮＦα ｍＡｂが開発された。ゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８及びｒＴＮＶ１４８Ｂとしても既知である）は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）重鎖アイソタイプ（Ｇ１ｍ［ｚ］アロタイプ）及びκ軽鎖アイソタイプを有する完全ヒトモノクローナル抗体である。ゴリムマブは、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）を有する。ゴリムマブの分子量は、１４９，８０２～１５１，０６４ダルトンの範囲である。

ゴリムマブは、高親和性及び特異性を有し、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の可溶性の形態及び膜貫通型の生物活性形態の両方を有する高親和性の安定複合体を形成し、これは、ＴＮＦαの受容体への結合を防止し、ＴＮＦαの生理活性を中和する。他のＴＮＦαスーパーファミリーリガンドに対する結合は観察されなかった。具体的には、ゴリムマブは、ヒトリンパ球に結合しない、又は中和しない。ＴＮＦαは、自己会合して生物活性ホモトリマーを形成し、タンパク質分解によって細胞表面から急速に放出される膜貫通タンパク質として、主として活性化された単球、マクロファージ及びＴ細胞により合成される。ＴＮＦαのｐ５５又はｐ７５ ＴＮＦ受容体のいずれかへの結合により、受容体細胞質ドメインがクラスター化し、シグナル伝達が開始される。腫瘍壊死因子αは、様々な刺激に応答して産生され、続いて、カスパーゼ依存性アポトーシス経路の活性化及び転写因子核因子（ＮＦ）－Ｂ及び活性化タンパク質－１（ＡＰ－１）の活性化による炎症応答を促進する、主要なセンチネルサイトカインとして同定されている。腫瘍壊死因子αはまた、胚中心での免疫細胞の組織化における役割を介して免疫応答を調節する。ＴＮＦαの発現の上昇は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）などの慢性炎症性疾患、並びに乾癬性関節炎（ＰｓＡ）及び強直性脊椎炎（ＡＳ）などの脊椎関節症に関連しており、これらの疾患に特徴的な関節性炎症及び構造的損傷の重要なメディエーターである。

ゴリムマブを用いた臨床経験
強直性脊椎炎（ＡＳ）を対象としたゴリムマブ皮下（ＳＣ）投与のグローバル無作為化二重盲検プラセボ対照第３相試験（試験Ｃ０５２４Ｔ０９）において、ゴリムマブは、強直性脊椎炎（ＡＳ）に罹患した被験者における徴候及び症状、身体機能、健康関連の生活の質（ＨＲＱＯＬ）の改善に有効であることが実証された。更に、安全性分析では、ＳＣゴリムマブは一般的に良好に忍容されることが示され、また他の抗ＴＮＦα剤で観察されたものと同様の安全性プロファイルを示された。

ＳＣゴリムマブの既知の安全性及び有効性を考慮すると、ＩＶゴリムマブは、ＲＡ、ＰｓＡ、及びＡＳなどのリウマチ性疾患における他の抗ＴＮＦα剤と一致する許容可能な安全性プロファイルで有効であることが証明されると予想された。ゴリムマブの静脈内投与は、ＲＡ治療の承認の基礎となったフェーズ３試験（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）で確定的に研究されている。ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１試験は、同時メトトレキサート（ＭＴＸ）療法にもかかわらず活動性ＲＡを有する対象における、０週目、４週目、及びその後８週ごと（ｑ８ｗ）に３０±１０分にわたって注入されるゴリムマブ２ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与の有効性及び安全性に関する、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、多施設２群試験であった。ＭＴＸにもかかわらず活動性ＲＡを有する対象は、０週目、４週目、及び８週ごとに２４週まで２ｍｇ／ｋｇでプラセボ注入又はゴリムマブのＩＶ投与のいずれかを受けるように無作為化された。２４週目に開始して、１００週まで、全ての対象をＩＶゴリムマブで治療した。ＩＶゴリムマブは、ＲＡの徴候及び症状、身体機能、並びに健康関連の生活の質の改善、並びに構造的損傷の進行の抑制において実質的な利益を提供することが実証された。ＲＡの治療における静脈内投与では、ゴリムマブ（ＣＮＴＯ１４８ＡＲＴ３００１）の輸注反応の発生率は低く、強力な有効性と許容される安全性プロファイルとを示した。

より最近では、活動性強直性脊椎炎（ＡＳ）及び活動性乾癬性関節炎（ＰｓＡ）に罹患した被験者の治療において、静脈内（ＩＶ）ゴリムマブの有効性及び安全性を評価するための２つの第３相試験が設計された。現在入手可能なＩＶ抗ＴＮＦα剤は免疫原性及び輸注反応に関して制限があり、ＩＶゴリムマブの３０±１０分間の注入と比較してより長い注入時間（６０～１２０分間）を有することから、被験者におけるＩＶ投与経路が評価される。患者はまた、ＳＣ剤と比較してより頻繁な投与よりもＩＶゴリムマブの維持投与計画を好むかもしれない。

配列
例示的抗ＴＮＦα抗体配列－ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）
各重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）は、ゴリムマブの重鎖及び軽鎖（Ｋａｂａｔにより定義）に下線が引かれている。

重鎖（ＨＣ）－配列番号：１
［１］

軽鎖（ＬＣ）－配列番号：２
［２］

組換え発現カセット
本発明は核酸を含む組換え発現カセットを使用する。核酸配列、例えば本発明の方法に使用される抗体をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え体発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に操作可能に連結される、ポリヌクレオチドを含む。異種及び非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を利用して、核酸の発現を導くことができる。

一部の実施形態では、プロモーター、エンハンサー、又は他の要素として機能する単離された核酸を、ポリヌクレオチドの発現を上方又は下方調節するために、本発明の非異種形のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、下流、又はイントロン内）に導入することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで変異導入、欠失及び／又は置換により、内因性プロモーターを変えることができる。

ベクター及び宿主細胞
本発明は、単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作される宿主細胞、及び技術分野において周知である組換え技術による少なくとも１つの抗ＴＮＦα抗体の産生にも関する。

ポリヌクレオチドは、任意選択的に、宿主の増殖についての選択マーカーを含有するベクターに連結することができる。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物内、又は荷電脂質との複合体内に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでこれをパッケージングし、その後、宿主細胞内に形質導入することができる。

ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに機能的に連結されるべきである。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終結部位、及び転写された領域内に、翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含む。構築により発現する成熟した転写産物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始及び終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）で始まる翻訳を含み、哺乳動物細胞又は真核生物細胞の発現ではＵＡＡ及びＵＡＧが好ましい。

発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含むが、これは任意である。かかるマーカーは、例えば、真核細胞の培養のためのメトトレキサート（methotrexate、ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase、ＤＨＦＲ、米国特許第４，３９９，２１６号；同第４，６３４，６６５号；同第４，６５６，１３４号；同第４，９５６，２８８号；同第５，１４９，６３６号；同第５，１７９，０１７号、アンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、マイコフェノール酸又はグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）（米国特許第５，１２２，４６４号；同第５，７７０，３５９号；同第５，８２７，７３９号）抵抗性遺伝子、並びに大腸菌及び他の細菌又は原核生物における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン抵抗性遺伝子を含むが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞に対して適切な培養培地及び条件は、技術分野において既知である。適切なベクターは、当事者にとって容易に明白となるであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン介在トランスフェクション、カチオン性脂質介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の既知の方法により影響を受け得る。このような方法は技術分野において既知であり、多く記述されている。

本発明の方法に使用される少なくとも１つの抗体は、融合タンパク質などの修飾された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、異種に由来する追加の機能領域も含み得る。例えば、追加のアミノ酸領域、特に荷電アミノ酸を抗体のＮ末端に追加して、精製中又は後続の処理及び保存中の、宿主細胞における安定性及び持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本発明の抗体に追加して、精製を促進することもできる。抗体又は少なくとも１つのその断片の最終調製前に、かかる領域を除去することができる。このような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、この方法は技術分野において既知であり、多く記述されている。

当業者であれば、本発明の方法に使用されるタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系について精通している。あるいは、核酸は、抗体をコードする内因性ＤＮＡを含有する宿主細胞内で、（操作により）オン切換えすることにより、宿主細胞中で発現させることができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、及び同第５，７３３，７６１号に記載されているように、技術分野において既知である。

抗体、その特定された部分又は変異体の産生にとって有用な細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳類細胞系は、細胞の単層の形態で培養されることが多いが、細胞はまた、例えば、振盪フラスコ又はバイオリアクター内の懸濁液中で増殖するように適応させることもできる。インタクトなグリコシル化タンパク質を発現可能な多くの好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されており、これにはＣＯＳ－１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ－７（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０）、ＢＳＣ－１（例えばＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｈｅｏ Ｇ２、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ細胞などが挙げられ、これらは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手できる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、並びに骨髄腫及びリンパ腫細胞などのリンパ系に由来する（lymphoid origin）細胞、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８０）及びＳｐ２／０－Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８１）が挙げられる。

これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号；同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセラートキナーゼ）プロモーター、ＥＦ－１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、並びに／又はリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ Ａｇポリ付加部位）、及び転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されない、発現制御配列のうちの１つ又は２つ以上を含み得る。本発明の核酸又はタンパク質の生成に有用な他の細胞は既知であり、並びに／あるいは例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の既知の若しくは商業的供給源から入手可能である。

真核宿主細胞が利用されるとき、典型的には、ベクター内にポリアデニル化配列又は転写終結配列が組み込まれる。終結配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライシングのための配列も、同様に含むことができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０に由来するＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３－７８１（１９８３年））。加えて、当該技術分野において既知であるように、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。

ＣＨＯ細胞株
他にもいくつかの哺乳動物細胞株が利用可能性であるものの、現在生産されている治療用組換えタンパク質のほとんどは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で作成されている（Ｊａｙａｐａｌ ＫＰら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｏ ｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｒｏｍ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ－２０ ｙｅａｒｓ ａｎｄ ｃｏｕｎｔｉｎｇ．」Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｐｒｏｇ．２００７年；１０３：４０－４７；Ｋｕｎｅｒｔ Ｒ、Ｒｅｉｎｈａｒｔ Ｄ．「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．」Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６年；１００（８）：３４５１－６１）。それらの強みは、例えば、付着細胞としての又は懸濁液中での堅牢な増殖、無血清培地及び合成培地への適応性、高い生産性、並びに治療用の組換えタンパク質の産生についてこれまでに法的な承認が確立されていること、が挙げられる。これらはまた、非常に遺伝子改変を受け入れやすく、細胞のトランスフェクション、組換えタンパク質発現、及びクローン選択の方法は十分に特徴付けられる。ＣＨＯ細胞はまた、ヒトに適合する翻訳後修飾を提供することができる。本明細書で使用するとき、「ＣＨＯ細胞」としては、例えば、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋｌ、ＣＨＯ－Ｍ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト、並びにこれらの改変及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

ＣＨＯ細胞におけるクローニング及び発現。
ＣＨＯ細胞での発現に一般的に使用されるベクターの一種に、ｐＣ４がある。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ（登録商標）３７１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でマウスＤＨＦＲ遺伝子を含有する。ジヒドロ葉酸の活性を欠損しており、これらのプラスミドでトランスフェクトされるチャイニーズハムスター卵巣細胞又はその他の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを添加した選択培地（例えば、α－ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で細胞を増殖させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対して耐性を有する細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に実証されている（例えば、Ｆ．Ｗ．Ａｌｔら、「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｕｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ．」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７－１３７０（１９７８年）；並びにＭ．Ｊ．Ｐａｇｅ及びＭ．Ａ．Ｓｙｄｅｎｈａｍ、「Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ．」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４－６８（１９９１年））。ＭＴＸ濃度が上昇する（increasing concentrations）中で成長した細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子が増幅される結果として、標的酵素であるＤＨＦＲを過剰生産することにより、薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に連結されている場合、通常、共増幅され、過剰発現される。このアプローチを使用して、増幅遺伝子の１，０００を超えるコピーを有する細胞株を開発できることが、当該技術分野において知られている。続いて、メトトレキサートを取り除いたときに、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。

対象遺伝子を発現させるために、プラスミドｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ ｌｏｃａｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ．」Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３８－４４７（１９８５年））と、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、「Ａ ｖｅｒｙ ｓｔｒｏｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｉｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ａｎ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ．」Ｃｅｌｌ ４１：５２１－５３０（１９８５年））とを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８制限酵素切断部位である。これらのクローニング部位の後に、プラスミドは、ラットのプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン及びポリアデニル化部位を含有する。他の高効率のプロモーター、例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期若しくは後期プロモーター、又は他のレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶＩに由来する長い末端反復も発現に使用することができる。クロンテックのＴｅｔ－Ｏｆｆ及びＴｅｔ－Ｏｎ遺伝子発現系並びに同様の系を使用して、哺乳動物細胞において調節された方法でタンパク質を発現することもできる（Ｍ．Ｇｏｓｓｅｎ、及びＨ．Ｂｕｊａｒｄ、「Ｔｉｇｈｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７－５５５１（１９９２年））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒト成長ホルモン遺伝子又はグロビン遺伝子からの他のシグナルも使用することができる。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定した細胞株は、ｇｐｔ、Ｇ４１８又はハイグロマイシンなどの選択マーカーとの共トランスフェクションにより選択することもできる。最初に１つを超える選択マーカー、例えばＧ４１８、に加えてメトトレキサートを使用するのが有利である。

一般的な精製方法
抗ＴＮＦ抗体αは、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ及びレクチンクロマトグラフィが挙げられるがこれらに限定されない既知の方法により、組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）を精製に利用することもできる。

本明細書で使用するとき、用語「抗体」又は「複数の抗体」は、２００９年のバイオロジクス価格競争・イノベーション法（ＢＰＣＩ Ａｃｔ）並びに同様の世界的な法律及び規則で承認されたバイオシミラー抗体分子を含む。ＢＰＣＩ Ａｃｔの下で、抗体は、臨床的に不活性な成分がわずかに違っていたとしても、基準品と「非常に類似」しており、安全性、純度、効力の点で基準品と同等の臨床結果が得られると「期待される」ことをデータが示す場合、バイオシミラーであることが実証され得る（Ｒ．Ｄｏｌｉｎａｒ、Ｆ．Ｌａｖｅｒｎｉａ、及びＳ．Ｅｄｅｌｍａｎ．「Ａ ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＦＯＬＬＯＷ－ＯＮ ＢＩＯＬＯＧＩＣＳ ＡＮＤ ＢＩＯＳＩＭＩＬＡＲＳ ＷＩＴＨ Ａ ＦＯＣＵＳ ＯＮ ＩＮＳＵＬＩＮ．」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：２０１８年２月、２４巻、Ｎｏ．２、１９５－２０４ページ）。これらのバイオシミラー抗体分子は、出願人がイノベーターの基準品の臨床データに依拠して法的な承認を確保する、短縮された承認経路を提供する。臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベーター参照抗体と比較して、バイオシミラー抗体分子は、本明細書では、「フォローオン生物学的」であると呼ばれる。本明細書に提示されるように、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、臨床試験の成功に基づいてＦＤＡに承認されたオリジナルのイノベーター参照抗ＴＮＦα抗体である。ゴリムマブは、２００９年から米国で販売されている。

本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」は、例えば、二重特異性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィドにより安定化した二重特異性抗体（ｄｓ二重特異性抗体）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価二重特異性抗体）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原には結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体断片などの抗体断片を指す。抗原結合断片は、親抗体又は親抗体断片が結合する同じ抗原に結合することができる。特定の実施形態によると、抗原結合断片は、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、及びＦｄセグメント（すなわち、Ｆａｂ断片に含まれる重鎖の部分）を含む。他の特定の実施形態によると、抗原結合断片は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）を含む。

製造プロセスの概要
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）は、連続的な細胞の灌流培養、続いて精製を含む９段階のプロセスで製造される。製造工程の概要は、図３９に示されている。

本明細書で使用するとき、用語「培養」、「培養する」、「培養された」、及び「細胞培養物」は、細胞集団の生存及び／又は増殖に好適な条件下で培地中に懸濁される細胞集団を指す。当業者には文脈から明らかであるように、本明細書で使用されるこれらの用語はまた、細胞集団と、当該集団が懸濁される培地とを含む組み合わせを指す。細胞培養物は、例えば、バッチ、フェドバッチ又は灌流細胞培養法などによって増殖させた細胞を含む。特定の実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である。

本発明で使用するための細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ細胞）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞）、及びヒト網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用するとき、用語「合成培地」、「複数の合成培地」、「ハイブリドーマ用合成培地」、又は「ハイブリドーマ用の複数の合成培地」は、全ての成分の同一性及び濃度が既知である合成増殖培地を指す。合成培地は、細菌、酵母、動物、又は植物抽出物、動物血清又は血漿を含まないが、個々の植物又は動物由来の構成成分（例えば、タンパク質、ポリペプチドなど）を含んでも含まなくてもよい。合成培地は、増殖を支えるのに必要なリン酸塩、硫酸塩などの無機塩を含んでもよい。炭素源は規定されており、通常、グルコース、ラクトース、ガラクトースなどの糖、又はグリセロール、乳酸、アセテートなどの他の化合物である。特定の化学的に規定された培地はまた、バッファとしてリン酸塩を使用するが、クエン酸塩、トリエタノールアミンなどの他のバッファを使用してもよい。市販の化学的に規定された培地の例としては、サーモフィッシャーのＣＤハイブリドーマ培地及びＣＤハイブリドーマＡＧＴ（商標）培地、様々なダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地（シグマアルドリッチ社；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、ハムの栄養混合液（シグマアルドリッチ社；ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｉｎｃ）、これらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。化学的に規定された培地を調製する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，１７１，８２５号及び同第６，９３６，４４１号、国際公開第２００７／０７７２１７号、並びに米国特許出願公開第２００８／０００９０４０号及び同第２００７／０２１２７７０号に既知である。

本明細書で使用するとき、用語「バイオリアクター」は、細胞培養物の増殖に有用な任意の容器を指す。バイオリアクターは、細胞の培養に有用であるものであるならば、任意の大きさであってもよい。特定の実施形態では、このような細胞は哺乳動物細胞である。典型的には、バイオリアクターは、少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。培養期間中、ｐＨ及び温度を含むがこれらに限定されない、バイオリアクターの内部条件を任意に制御することができる。バイオリアクターは、本発明の培養条件下で培地に懸濁された哺乳動物細胞培養物を保持するのに好適な、ガラス、プラスチック、又は金属を含む、任意の材料から構成することができる。本明細書で使用するとき、用語「産生バイオリアクター」は、対象とするポリペプチド又は糖タンパク質の産生に使用される最終バイオリアクターを指す。産生バイオリアクターの体積は、典型的には少なくとも５００リットルであり、１，０００、２，５００、５，０００、８，０００、１０，０００、１２，０００リットル以上、又はこれらの間の任意の体積であってもよい。当業者であれば、本発明の実施に使用するのに好適なバイオリアクターを選択することができるであろう。

段階１及び２において、前培養、細胞増殖、及び細胞産生が行われる。段階１では、ゴリムマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現しているトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞の単一のワーキングセルバンクバイアルから前培養を開始し、培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び内部スピンフィルタを備えた５０Ｌ灌流播種バイオリアクター又はオルタネーティング・タンジェンタル・フロー（alternating tangential flow）中空糸フィルタ（ＡＴＦ）細胞保持システムを備えた２００Ｌ灌流播種バイオリアクターのいずれかで細胞を増殖させる。５００Ｌ又は１０００Ｌの産生バイオリアクターの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。段階２では、ＡＴＦシステムを使用して、５００Ｌ又は１０００Ｌの産生バイオリアクター内で細胞培養物を連続的に灌流する。細胞培養透過液（回収物）をＡＴＦシステムから回収し、細胞はバイオリアクターに戻し、培養物には新鮮な培地を補充する。バイオリアクターから除去されたバイオマスを、ＡＴＦシステムから回収した回収物と組み合わせ、次いで、更なる処理のためにプールされた回収物を生成するために、清澄化してもよい。

細胞培養回収物からのゴリムマブの精製は、段階３～８において、アフィニティ及びイオン交換クロマトグラフィ工程と、可能性のあるウイルス汚染を不活化又は除去する工程（溶媒／洗剤処理及びウイルス除去濾過）とを組み合わせて行われる。段階３では、回収及び／又はプールされた回収物を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して清澄化及び精製する。得られた直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）溶出液は、更なる処理まで凍結する。段階４で、解凍後、ＤＰＣ溶出液を濾過し、プールし、その後、段階５でトリ－ｎ－ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）で処理して、存在する可能性があり脂質エンベロープを有する任意のウイルスを不活性化する。

段階６では、陽イオン交換クロマトグラフィを用いて、ＴＮＢＰ及びＰＳ８０試薬並びに不純物をゴリムマブ生成物から除去する。ゴリムマブ生成物は、ＤＮＡ、存在する可能性のあるウイルス、及び不純物を除去するために、段階７において陰イオン交換クロマトグラフィを使用して更に精製される。段階８では、精製したゴリムマブ生成物を希釈し、ウイルス捕捉性フィルタを通して濾過する。

ゴリムマブの最終調製は、段階９で行われる。限外濾過工程はゴリムマブ生成物を濃縮し、透析濾過工程により、製剤賦形剤が添加され、プロセス中のバッファ塩が除去される。ＰＳ ８０を添加し、製剤化されたバルクとして凍結保存するために、バルク中間体をポリカーボネート容器に濾過する。

バッチは、特性及び品質が均一であることが意図され、規定された製造サイクル中に製造された材料、中間体、又は最終製品として定義される。用語「バッチ」は、以下に適用される：
・前培養
・５０Ｌの播種用リアクター／５００Ｌの産生用バイオリアクター
・２００Ｌの播種用バイオリアクター
・１０００Ｌの産生用バイオリアクター
・直接的な生成物捕集
・下流処理

製造プロセスの複数の段階中に、様々なバッチ番号が割り当てられる。以下の要約は、バッチとして定義される製造プロセスの複数の段階について与えられる。

製造プロセスにおける第１段階は、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルからの前培養の開始である。各前培養又はバックアップ前培養は、バッチとして識別される。

前培養物が接種基準を満たす場合、５０Ｌの播種用バイオリアクターに前培養物を移し、１つの５０Ｌの播種用バイオリアクターの前培養物を１つの５００Ｌの産生用バイオリアクターに移し、５０Ｌのバイオリアクターと５００Ｌのバイオリアクターとの各組み合わせをバッチとして識別する。バイオリアクターから取り出したバイオマスを、ＡＴＦシステムから回収した回収物と組み合わせ、次いで、更なる処理のためにプールされた回収物を生成するために清澄化してもよい。１つの５００Ｌバイオリアクターに由来する全ての細胞培養上清回収物又はプールされた回収物は、バイオリアクターのバッチ番号に加えて、特定の回収物に対応する拡張番号（例えば、００１、００２など）を付される。

前培養物を２００Ｌの播種用バイオリアクターに移し、１つの２００Ｌの播種用バイオリアクターの内容物を１つの１０００Ｌの産生用バイオリアクターに移すこともできる。各個々の２００Ｌ及び１０００Ｌのバイオリアクターは、バッチとして同定される。１つの１０００Ｌのバイオリアクターに由来する全ての細胞培養上清回収物は、バイオリアクターのバッチ番号に加えて、特定の回収物に対応する拡張番号（例えば、００１、００２など）を付される。

複数のバイオリアクターからの細胞培養上清回収物のプールは、直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）のプロテインＡクロマトグラフィ工程で精製することができる。ＤＰＣの稼働はそれぞれ、バッチとして識別される。ＤＰＣには、直径２８、４０、６０又は８０ｃｍのカラムが使用されてもよい。各バッチは、異なる量のゴリムマブ出発物質を含んでもよく、ゴリムマブ出発物質の量に基づいて異なる直径のカラムが使用される。複数のＤＰＣバッチをプールして下流処理（ＤＳＰ）バッチを開始する。この処理バッチは、様々な量のゴリムマブについて開始することができる。

バルク製造プロセスは、プロテインＡクロマトグラフィによる更なる処理（段階３）のために、プロセス内管理の受入基準を満たす任意の回収物をプールしておくことができる。同様に、下流バッチを開始するために、プロセス内管理の仕様を満たす任意のＤＰＣバッチをプールすることができる（段階４）。しかし、ＤＰＣプールに寄与する細胞培養回収物の質量加重平均した日齢は、１５～５１日（両端を含む）でなければならない。

ＤＰＣプールの質量加重平均した日齢は、各回収物によって与えられたゴリムマブの質量に回収日数を乗じた値の合計を、ＤＰＣプールのゴリムマブの総質量で除算した値として定義される：

式中、ｍは、各回収物によってプールに与えられたゴリムマブの質量であり、ｄは、回収物ロットの回収が完了した際のバイオリアクターの日数である。

入力（すなわち、プロセスパラメータ）及び出力（すなわち、プロセス内管理［ＩＰＣ］及びプロセスモニタリング試験［ＰＭＴ］）の両方を含むプロセス変数は、プロセス及び製品の一貫性を確保するために、製造プロセス全体を通じて管理され、生産バッチ記録へと文書化されている。

製造プロセス及びプロセス管理の詳細な説明
ステージ１
前培養及び増殖
ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の産生における第１の段階は、ゴリムマブのＨＣ及びＬＣ配列を発現するトランスフェクトされたＳｐ２／０細胞のワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルからの前培養の開始並びに培養フラスコ、使い捨て培養バッグ、及び５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターにおける細胞培養物の増殖である。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターへの接種に必要な細胞密度及び体積が得られるまで細胞を培養する。

製造手順
ＷＣＢからの凍結バイアルを解凍し、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを添加したハイブリドーマ用同性培地（ＣＤＨ－Ａ培地）で、０．２～０．４×１０^６個（ＶＣ）／ｍＬの播種密度になるように希釈した。解凍時の培養物生存率は≧５０％なければならない。初期の継代は、バッチ記録に規定される範囲内で温度及びＣＯ_２を制御した加湿ＣＯ_２インキュベーター内の培養フラスコに維持される。培養物を、０．６×１０^６個ＶＣ／ｍＬの最小細胞密度が得られるまで２～３日間インキュベートする。

スケールアップは、培養フラスコ及び使い捨て培養バッグ内で培養物を連続的に増殖させることによって達成される。各継代は、ＣＤＨ－Ａ培地で希釈することによって、０．２～０．４×１０^６個ＶＣ／ｍＬの細胞密度で開始される。各増殖工程で、継代培養を、０．６×１０^６個ＶＣ／ｍＬの最小細胞密度が得られるまで２～３日間インキュベートする。使い捨て培養バッグで、≧０．８×１０^６個ＶＣ／ｍＬ及び≧８０％の培養物生存率で十分な培養量が達成されたら、培養物を５０Ｌ又は２００Ｌの播種バイオリアクターに接種してもよい。

各前培養継代を、生存細胞密度（ＶＳＤ）、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためにサンプリングする。５０又は２００Ｌの播種バイオリアクターへの接種前に、前培養物をバイオバーデン測定のためにサンプリングする。前培養は、解凍後最大３０日間維持され得る。微生物汚染が検出されるか、又は最大持続時間を超過した場合、前培養を終了する。播種用バイオリアクターへの接種時にバックアップ用の前培養が保持されてもよく、又は当該前培養は、新しいＷＣＢバイアルを解凍して開始されてもよい。バックアップ用の前培養物は、上述のように増殖され、初代培養と同じプロセス内管理及び操作パラメータに供される。必要に応じて５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに接種するために、バックアップ用の前培養物を維持し、使用することができる。

前培養物が接種基準を満たす場合、使い捨て培養バッグの内容物を５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに移し、≧０．３×１０^６個の播種密度を達成する。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターに、ＣＤＨ－Ａ培養培地を供給し、最大稼働量で灌流モードで操作する。培養物は、細胞増殖を支えるよう、ｐＨ、温度、及び溶存酸素濃度について制御される。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの培養物を、≧８０％培養物生存率で≧２．０×１０^６個ＶＣ／ｍＬの細胞密度が得られるまで増殖させる。５０又は２００Ｌ播種用バイオリアクターの培養物を、ＶＣＤ、培養物生存率、及び顕微鏡検査のためのプロセスを通してサンプリングする。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種前に、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターをバイオバーデン測定のためにサンプリングする。５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターのＶＣＤが≧２．０×１０^６個ＶＣ／ｍＬに達し、５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種の準備ができていない場合、５０Ｌの播種用バイオリアクターの接種後６日及び２００Ｌの播種用バイオリアクターの接種後７日を最大培養期間として、灌流モードで培養を継続することができる。微生物汚染が検出されるか、又は最大持続時間を超過した場合、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの操作を終了する。

段階２
バイオリアクター産生
製造プロセスにおける第２段階は、５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターにおける、細胞の灌流培養である。オルタネーティング・タンジェンタル・フロー（ＡＴＦ）中空糸の細胞保持装置を介して細胞を保持しながら、産生用バイオリアクターから細胞培養物の透過液（permeate）（回収物）を回収し、培養物には新鮮な培地を補充する。

製造手順
５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種は、５０又は２００Ｌの播種用バイオリアクターの内容物を、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、及び５０ｍｇ／Ｌのキサンチンを添加したハイブリドーマ用合成培地（ＣＤＨ－Ａ培地）を含む５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターに移すことによって行う。移される体積は、≧０．３×１０^６個生存細胞（ＶＣ）／ｍＬの播種密度をもたらすのに十分なものでなければならない。培養物を３４．０～３８．０℃の温度、６．８０～７．４０のｐＨ及び１０～８０％の溶存酸素濃度で維持する。生存細胞密度（ＶＣＤ）、培養物生存率、バイオバーデン、及び免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）濃度の測定のために、５００又は１０００Ｌの生産用プロセス全体を通してサンプリングを行う。

接種後、培養物への培地の供給量は、最大供給量に達するまで、所定のスケジュールに従って増加される。最大供給量は、１日当たり０．８０～１．５０の反応器体積に制御される。バイオリアクターの最大稼働量に達したなら、ＡＴＦ系を使用して灌流を開始して、透過液から細胞を分離する。ＡＴＦフィルタを通して透過液を連続的に回収する一方で、細胞培養をＡＴＦ系とバイオリアクターとの間で循環させる。ＡＴＦ透過液は、バイオプロセス容器（ＢＰＣ）に回収される。

ＶＣＤが≧８．５×１０^６個ＶＣ／ｍＬに達したとき、但し５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの接種後１５日目までに、バイオリアクターへの培地供給を、ＣＤＨ－Ａから、６ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２．５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、５０ｍｇ／Ｌのキサンチン、及び１０ｍＭの酢酸ナトリウムを添加したＣＤハイブリドーマ用培地（ＣＤＨ－Ｂ培地）に切り替える。バイオリアクター内の生存細胞の密度は、培養物から可変量でバイオマス流を除去することによって、少なくとも１２．０×１０^６個ＶＣ／ｍＬの目標値に制御される。

バイオリアクターから除去されたバイオマスは、廃棄されてもよく、又はＡＴＦ透過液と共に組み合わせられて、濾過によって清澄化されてもよい。

ＡＴＦ透過液は、回収物流と表される。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を回収物流に５～２０ｍＭの濃度まで添加する。回収物は、バイオリアクターから回収した後、バイオプロセス容器（ＢＰＣ）にて、２～８℃の環境下で、最長２１日間保存される。直接的な生成物の捕集前に、各回収物のＢＰＣに対し、ＩｇＧ濃度、エンドトキシン、及びバイオバーデンの測定のためにサンプリングする（段階３）。

５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターにおける細胞の灌流培養操作は、接種後最大６０日間継続する。５００又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターの稼働の最終日に、培養物をマイコプラズマ及び外来性ウイルスについての試験のためにサンプリングする。バイオリアクターのＩｇＧ濃度をモニタリングし、情報のみを報告する。

段階３
直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）
段階３では、１つ又は複数の５００Ｌ又は１０００Ｌの産生用バイオリアクターからの回収物は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラム及び自動クロマトグラフィスキッドを使用して精製する。ゴリムマブ生成物は、回収物から捕捉され、培地成分及び宿主細胞に関連する不純物（例えば、ＤＮＡ及び宿主細胞タンパク質）を含むプロセス関連不純物、並びに存在する可能性のあるウイルスが除去される。得られた直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）の溶出液は、更なる処理まで凍結する。

プロテインＡカラムの調製及び再生
充填を回収する前に、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のポリソルベート８０（ＰＳ８０）、ｐＨ７．３（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが平衡化されていることを確認するために、カラム溶出液をｐＨ及び導電率についてモニタリングする。

使用後、６ＭのグアニジンＨＣｌを適用し、続いて０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）ですすぎ、続いて平衡化バッファで洗浄することによって、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡカラムを再生することができる。平衡化バッファ、続いて６ＭのグアニジンＨＣｌ、続いて平衡化バッファ、続いて０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、続いて平衡化バッファを適用することを含む再生手順も代替として使用され得る。必要に応じて、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂を２０％エタノールに保存する。

製造手順
回収物を０．４５μｍフィルタに通し、２０～５０ｇ／Ｌの充填速度でプロテインＡカラムに充填する。２８０ｎｍ（Ａ_２８０）での紫外線吸光度が経路長１ｍｍ当たり≦１００ｍＡＵに戻るまで平衡化バッファでカラムを洗浄した後、結合したゴリムマブ生成物を有するカラムを、２～６カラム体積（ＣＶ）の更なる平衡化バッファで洗浄する。その後、４．５～７．０ＣＶの０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で中間洗浄を行う。

ゴリムマブ生成物を、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）バッファを使用して溶出する。溶出生成物の回収は、≧５０ｍＡＵ／ｍｍ経路長の上昇Ａ_２８０－信号で開始し、≧５０ｍＡＵ／ｍｍ経路長の下降Ａ_２８０－信号で停止する。充填、洗浄、及び溶出中に適用する流速は、１５０～５００ｃｍ／ｈとする。

回収後、１．０Ｍのトリスバッファ（未滴定）及び必要に応じて１．０Ｍのクエン酸（未滴定）を添加することにより、ゴリムマブＤＰＣ溶出液をｐＨ６．０～６．５に中和する。ｐＨ調整中、ＤＰＣ溶出液を混合して溶液の均質性を確保する。ｐＨ調整したゴリムマブＤＰＣ溶出液を、０．２μｍ濾過の前にバイオバーデンについての分析のためにサンプリングする。第２の０．２μｍ濾過は、第１の０．２μｍ濾過の際に使用した０．２μｍフィルタの状態（integrity）についての試験が失敗した場合に、実施され得る。

濾過ＤＰＣ溶出液を、ポリカーボネート容器に小分けする。濾過したＤＰＣ溶出液を、モノマー含有量、バイオバーデン、エンドトキシン、及びタンパク質濃度の分析のためにサンプリングする（ここから工程収率が計算され、工程収率は≧５５％であるべきである）。濾過したＤＰＣ溶出液を、≦－４０℃で保存する前に、１５～２５℃で≦４８時間及び２～８℃で≦１６８時間の累計時間にわたって保持することができる。

段階４
直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）の溶出物の解凍及びプール
段階４では、複数の直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）溶出液を解凍し、濾過し、溶媒／洗剤処理前にプールする。

製造手順
ＤＰＣ溶出液を、ＤＰＣプールの質量加重平均の日齢が１５～５１日（両端を含む）になるように選択する。凍結したＤＰＣ溶出液を１５～２５℃で解凍する。視認される氷が溶出液に含まれていなければ、解凍は完了していると考えられる。解凍は１２０時間を超えてはならない。解凍、プール、混合後、プールしたＤＰＣ溶出液のｐＨを試験し、必要に応じて、１．０Ｍのトリス（未滴定）又は１．０Ｍのクエン酸（未滴定）のいずれかを添加することにより、５．９～６．５のｐＨに調整する。最終ｐＨに達した後、プールしたＤＰＣ溶出液をバイオバーデンについての分析のためにサンプリングする。プールのタンパク質濃度は、総プール体積及びプール中の総タンパク質重量（ｇ）に基づいて計算される。次いで、プールしたＤＰＣ溶出液を、混合容器内に０．２μｍで濾過する。濾過し、プールしたＤＰＣ溶出液を、段階５で更に処理する前に、１５～２５℃で≦４８時間及び２～８℃で≦１６８時間の累計時間にわたって保持することができる。

段階５
ＤＰＣ溶出液の溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理
段階５では、プールした直接的な生成物捕集（ＤＰＣ）の溶出液を、トリ－ｎ－ブチルホスファート（ＴＮＢＰ）及びポリソルベート８０（ＰＳ８０）（溶媒／洗剤［Ｓ／Ｄ］処理）と共にインキュベートして、存在する可能性があり脂質エンベロープを有する任意のウイルスを不活性化する。

製造手順
０．０８～０．１２（ｖ／ｖ）の比が達成されるまで、２％ＴＮＢＰ／１０％ＰＳ８０（ｗ／ｗ）を含むＳ／Ｄストック溶液を、プールしたＤＰＣ溶出液が入っている混合容器に移す。溶液を混合して溶液の均質性を確保し、次いで不活性化容器内に移す。移した後、１５～２５℃の温度で少なくとも９０分間インキュベートすることによってウイルスの不活性化が達成される。Ｓ／Ｄ処理されたゴリムマブ生成物の陽イオン交換クロマトグラフィカラムへの充填（段階６）は、Ｓ／Ｄ－化学物質の添加の≦２０時間後に完了する（段階５）。

段階６
陽イオン交換クロマトグラフィ
段階６では、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）で処理した段階５の材料を、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）陽イオン交換クロマトグラフィカラム及び自動クロマトグラフィスキッドを使用して精製する。段階６は、製品からＳ／Ｄプロセスの化学物質（トリ－ｎ－ブチルホスファート［ＴＮＢＰ］及びポリソルベート８０［ＰＳ８０］）及び他の不純物を除去するように設計されている。

クロマトグラフィカラムの調製及び再生
充填前に、充填カラムを、３０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５のバッファ（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが平衡化されていることを確認するために、カラム溶出液をｐＨ及び導電率についてモニタリングする。

使用後、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換カラムを、５０ｍＭのトリス、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファで洗浄し、続いて１．０ＭのＮａＯＨを使用して殺菌することにより再生し、必要に応じて溶液（０．１ＭのＮａＯＨ）に保存する。

製造手順
充填中、Ｓ／Ｄ処理した生成物を水でインラインで希釈して、１．５～４．５ｍＳ／ｃｍの充填導電率を達成する。カラムを３５～５５ｇのゴリムマブ／Ｌの充填率に充填した後、カラムを１．６～６．７カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファで洗浄し、その後、５．２～９．８ＣＶの５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．６～８．０のバッファで洗浄する。

次いで、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファを使用して、材料を陽イオン交換カラムから溶出する。溶出生成物の回収は、≧３０ｍＡＵ／ｍｍ経路長の２８０ｎｍ（Ａ_２８０）での上昇紫外吸光度で開始し、≧７５ｍＡＵ／ｍｍ経路長の下降Ａ_２８０で停止する。充填、洗浄、及び溶出中に適用する流速は、４５～１５０ｃｍ／ｈとする。

溶出した材料を、バイオバーデン、ＨＣＰ、残留プロテインＡ、凝集体、及びタンパク質濃度の分析のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、≧８０％を満たさなければならない。次いで、生成物を、段階７で更に処理する前に０．２μｍで濾過する。

あるいは、溶出した材料を、バイオバーデン測定のためサンプリングし、生成物を０．２μｍで濾過し、ＨＣＰ、残留プロテインＡ、凝集体、及びタンパク質濃度の分析のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、≧８０％を満たさなければならない。次いで、材料を段階７で更に処理する。

管理された室温（１５～２５℃）での７０～９０時間の製造操作範囲（manufacturing operating range、ＭＯＲ）より、ゴリムマブの段階６～８の累計処理時間及び保持時間について立証された許容範囲（proven acceptable range、ＰＡＲ）は１１５時間以下である。累計処理時間及び保持時間は、段階６の生成物溶出の終了時から始まり、段階９の生成物濃縮の開始時に終了すると規定され、アクティブなプロセス工程及び段階間の中間保持時間を含む。３段階では材料の条件が変化しないため、段階６、７、又は８の個々の段階に個別の限界は設定されていない。したがって、プロセス管理は、３段階にわたる累計時間に基づく。

段階７
陰イオン交換樹脂
段階７では、段階６の材料を、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）陰イオン交換クロマトグラフィカラム及び自動クロマトグラフィスキッドを使用して精製する。ゴリムマブは樹脂を通って流れる一方で、ＤＮＡ、他の不純物、及びウイルス（存在する場合）は保持される。

クロマトグラフィカラムの調製及び再生
充填前に、陰イオン交換カラムを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０（平衡化バッファ）で平衡化する。カラムが平衡化されていることを確認するために、カラム溶出液をｐＨ及び導電率についてモニタリングする。

使用後、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを、５０ｍＭのトリス、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０バッファで洗浄し、続いて２．０ＭのＮａＯＨを使用して殺菌し、ＷＦＩ、３．０Ｍ ＫＣｌ、及びＷＦＩで連続したすすぎを行うことにより再生し、又は（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＢＶ［ＪＢＶ］のみで）１．０ＭのＮａＯＨ／１．０ＭのＮａＣｌを使用して殺菌し、ＷＦＩですすぐことにより再生し、必要に応じてカラムを溶液（０．１ＭのＮａＯＨ）で保存する。

製造手順
陽イオン交換クロマトグラフィ（段階６）によって精製された材料を、５０～２５０ｃｍ／ｈの充填速度及び５０～１５０ｇ／Ｌの充填率で陰イオン交換カラムに装填する。ゴリムマブはカラムを通って流れ（非結合モード）、２８０ｎｍ（Ａ_２８０）での紫外線吸光度が≧３０ｍＡＵ／ｍｍ経路長まで上昇した時点で回収される。充填後、カラムを５０～２５０ｃｍ／ｈの流量の平衡化バッファで洗浄する。生成物フロースルーの回収は、Ａ_２８０の読み取りが≧８０ｍＡＵ／ｍｍ経路長に戻るまで継続する。

フロースルーを、バイオバーデン及びタンパク質濃度の分析のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、≧８０％を満たさなければならない。次いで、材料を、段階８で更に処理する前に０．２μｍで濾過する。

あるいは、フロースルーを、バイオバーデンの分析のためにサンプリングし、次いで、材料を、０．２μｍで濾過し、タンパク質濃度の測定のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、≧８０％を満たさなければならない。その後、段階８の処理に必要であれば、材料を５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０で希釈して≦６．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度にし、段階８で更に処理する前に混合する。

管理された室温（１５～２５℃）での７０～９０時間の製造操作範囲（ＭＯＲ）より、ゴリムマブの段階６～８の累計処理時間及び保持時間について立証された許容範囲（ＰＡＲ）は１１５時間以下である。累計処理時間及び保持時間は、段階６の生成物溶出の終了時から始まり、段階９の生成物濃縮の開始時に終了すると規定され、アクティブなプロセス工程及び段階間の中間保持時間を含む。プロセス管理が３段階にわたる累計時間に基づいているため、段階６、７、又は８の個々の段階に個別の限界は設定されていない。

段階８
ウイルス除去濾過
段階８では、陰イオン交換クロマトグラフィによって精製された段階７の材料を、ＮＦＰ（商標）ウイルス保持フィルタを通して濾過する。この工程は、存在する可能性のある小型ウイルス及び大型ウイルスの両方を除去することを目的とする。

ＮＦＰ（商標）フィルタ調製
使用前に、ＮＦＰ（商標）フィルタをＮＦＰ（商標）濾過システムに取り付け、注入用水（ＷＦＩ）でフラッシュし、オートクレーブ処理する。オートクレーブ処理後、フィルタをＷＦＩでフラッシュし、次いで、水透過性について試験する。フィルタを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファで平衡化する。ＮＦＰ（商標）フィルタが平衡化されていることを確認するために、濾液をｐＨ及び導電率についてモニタリングする。

生成物の濾過及びバッファのすすぎ後、ＮＦＰ（商標）フィルタに対し個別にその状態（integrity）についての試験を行う。

製造手順
必要に応じて、生成物濾過の前に、陰イオン交換クロマトグラフィ（段階７）で精製した生成物を、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０で希釈して、≦６．５ｇ／Ｌのタンパク質濃度にする。希釈後、生成物溶液を混合し、その後、０．２μｍフィルタを通して濾過する。

次いでこの希釈した生成物は、≦３．１バールの圧力を用い、平衡化されたＮＦＰ（商標）フィルタを通して濾過する。≦７２５ｇ／ｍ^２の膜負荷を適用する。初期生成物の濾過流速は、プロセスの生成物濾過の開始から２０分以内に記録することができる。初期生成物の濾過流速は、生成物濾過の開始後に、９フィルタについて≦１５４Ｌ以内、又は１０フィルタについて≦１７１Ｌ以内で記録することができる。初期流速（流速減衰０％として定義される）からの減少が７４％を超えないことを確認するために、流速減衰をモニタリングする。流速減衰が７４％の限界（流速減衰限界として定義される）に達する場合、フィルタを分離して、そのフィルタへの生成物充填を停止させることができる。分離されたフィルタは、バッファフラッシュ工程、後充填のためにインラインに戻される。濾過中、流速減衰が７４％の限界（流速減衰限界として定義される）に達する場合、濾過を停止し、バッファのフラッシングを即座に実行することができる。

濾過が完了したならば、フィルタを含むシステムは、濾過圧力≦３．１バールを用いて、合計≦１０．１Ｌ／ｍ^２の５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファでフラッシングする。バッファを回収し、残りのＮＦＰ（商標）－濾過生成物と組み合わせ、混合し、バイオバーデン及びタンパク質濃度の測定のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、≧９０％を満たさなければならない。次いで、組み合わせたＮＦＰ（商標）－濾液を０．２μｍフィルタを通して濾過した後、段階９で更なる処理を行う。

段階７で希釈された材料を、ＮＦＰ（商標）濾過の直前にバイオバーデンの分析のためにサンプリングすることができる。濾過が完了したならば、フィルタを含むシステムは、濾過圧力≦３．１バールを用いて、合計≦１０．１Ｌ／ｍ^２の５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファでフラッシングする。バッファフラッシュを回収し、残りのＮＦＰ（商標）濾過材料と組み合わせ、混合し、タンパク質濃度の分析のためにサンプリングする。工程収率は、タンパク質濃度から計算され、段階９における更なる処理の前に≧９０％を満たさしなければならない。

管理された室温（１５～２５℃）での７０～９０時間の製造操作範囲（ＭＯＲ）より、ゴリムマブの段階６～８の累計処理時間及び保持時間について立証された許容範囲（ＰＡＲ）は１１５時間以下である。累計処理時間及び保持時間は、段階６の溶出の終了時から始まり、段階９の濃縮の開始時に終了すると定義され、アクティブなプロセス工程及び段階間の中間保持時間を含む。プロセス管理が３段階にわたる累計時間に基づいているため、段階６、７、又は８の個々の段階に個別の限界は設定されていない。

段階９
製剤化されたバルク（ＦＢ）を得るための濃縮及び透析濾過
段階９では、段階８の材料を濃縮し、透析濾過して、製剤賦形剤を添加する。その後、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）を、濃縮及び透析濾過したゴリムマブ溶液に添加し、製剤化されたバルク（ＦＢ）を得る。

限外濾過システム調製
使用前に、膜を含む限外濾過システムを、５０ｍＭのトリス、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６～８．０のバッファで平衡化する。膜が平衡化されていることを確認するために、濾液及び保持液をモニタリングする。

使用後、膜を含む限外濾過システムは、注入用の水（ＷＦＩ）及び１．０ＭのＮａＯＨでフラッシングすることにより殺菌される。次いで、当該システムにＷＦＩを通してフラッシュし、標準化された透水性試験を実施する。必要に応じて、システム及び膜は適切な溶液に保存される。

製造手順
ウイルス除去濾過（段階８）により精製されたゴリムマブ生成物を４０～９０ｇ／Ｌに濃縮し、８～１２透析濾過体積の１０ｍＭのヒスチジン、４．５％のソルビトール、ｐＨ５．３のバッファ（透析濾過バッファ）を使用して透析濾過する。バッファ交換が完全に行われたことを確認するために、透析濾過後、濾液のｐＨ、導電率、及び浸透圧を試験する。バッファの交換後、溶液を≦１８０ｇ／Ｌに過剰濃縮し、次いで、システムを空にして回収する。濃縮、透析濾過、及び過剰濃縮の間、供給圧力及び保持液圧力は、それぞれ≦２．８バール及び≦２．１バールになるように制御することができる。あるいは、膜貫通圧力（ＴＭＰ）は、濃縮、透析濾過、及び過剰濃縮の間、≦２．５バールで制御することができる。保持タンクの温度を≦３５℃になるようにモニタリングする。

過剰濃縮したゴリムマブ生成物のタンパク質濃度を決定した後、希釈に必要とされる、計算された量の≦１００％の透析濾過バッファを使用してバッファフラッシュを用い、残りの生成物をシステムから回収する。回収したバッファフラッシュ及び過剰濃縮したゴリムマブ生成物の組み合わせのタンパク質濃度を決定した後、希釈に必要とされる、計算された量の≦１００％の透析濾過バッファを添加することにより、生成物の濃度を生成物の濃度を更に調整する。収率をモニタリングする。≧９０％である必要がある。

次いで、ＦＢは、１０ｍＭのヒスチジン、４．５％のソルビトール、ｐＨ５．３のバッファ中の１％のＰＳ８０を、０．０１３～０．０１７％（ｖ／ｖ）のバッファ対生成物比で、濃縮及び透析濾過したゴリムマブ生成物に添加することにより調製される。添加後、ゴリムマブ生成物を混合して溶液の均質性を確保する。ＦＢをバイオバーデンの分析のためにサンプリングし、プレフィルタを使用して濾過し、続いて０．２μｍで濾過してポリカーボネート容器に入れる。生成物サンプルを、ゴリムマブオリゴ糖ＩＰＣ試験及びＦＢ放出試験のために採取する。オリゴ糖組成物を、蛍光検出を用いて、順相陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析する。最後の０．２μｍでの濾過の前及び／又は後に、ＦＢを、１５～２５℃又は２～８℃で合計≦１２０時間保持してから４０℃で保存することができる。

実施例６－ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造に使用される、クロマトグラフィカラムへの、ガンマ分布の推移分析（ＧＤＴＡ）法の適用
この実施例は、抗ＴＮＦ抗体、例えば、抗ＴＮＦα抗体ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の製造中の精製における、クロマトグラフィカラム、例えば、段階３でのプロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラム、段階６での陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び段階７での陰イオン交換クロマトグラフィカラムへのＧＤＴＡ法の適用を記載する。

段階３－プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラム
段階３では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムを使用し、分析されたトランジションフロントは、例えば、溶出フロント（図４０）、グアニジンＨＣｌでの殺菌中に生成されるフロント（図４１）、及び０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５での殺菌後のすすぎ中に生成されるフロント（図４２）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の１６０バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能において明らかないくらかのドリフト及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立することを目的として、他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析を完了させる。

段階６－陽イオン交換クロマトグラフィカラム
段階６では、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムを使用して、分析されたトランジションフロントは、例えば、溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理した材料の充填中に生成されるフロント（図４３）、溶出中に生成されるフロント（図４４）、及びストリップの間に生成されるフロント（図４５）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の７２バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのドリフト及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立することを目的として、他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析を完了させる。

段階７－陰イオン交換クロマトグラフィカラム
段階７では、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを使用して分析されたトランジションフロントは、例えば、水酸化ナトリウムで洗浄する間に生成されるフロント（図４６）及びストリップの間に生成されるフロント（図４７）を含む。示される結果は、ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標）（ゴリムマブ）の７１バッチの分析を表す。傾向の予備評価は、カラム性能で明らかないくらかのドリフト及びカラム充填間で観察されたいくらかの差違を示す。将来的にリアルタイムでプロセスをモニタリングするためのＧＤＴＡ法を実施する際に使用するための管理限界を確立することを目的として、他の利用可能なバッチ情報及びカラム性能データとの比較を含む、このデータの完全な分析を完了させる。

好ましい実施形態を本明細書で詳細に描写及び説明するが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは以下の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることは、当業者には明らかであろう。

Claims (10)

1. 抗ＴＮＦ抗体を産生するための製造方法におけるクロマトグラフィカラムの操作方法であって、前記抗ＴＮＦ抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）、又はそれらの抗原結合フラグメントを含み、前記操作方法が、
   カラム充填を含む前記クロマトグラフィカラムの初回の操作中に、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号及び累積流量パラメータを収集する工程と、
   上昇するトランジションフロントについては式Ｉａを用い、又は下降するトランジションフロントについては式Ｉｂを用い、前記少なくとも１つの移動相のトランジションフロントに関し前記収集したカラム出口信号と累積流量パラメータとに基づいて、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程であって、式Ｉａ又は式Ｉｂは、
   

   

   
   であり、各式中、Ｃは所与のＶについてのカラム出口信号であり、Ｖは累積流量をカラム体積で除算したものであり、ｋ、θ、及びＶ_ｉは前記曲線を画定するために使用される形状、スケール、及びオフセットについてのパラメータである、ガンマモデルの累積分布曲線を決定する工程と、
   式ＩＩと、前記ガンマモデルの累積分布曲線のパラメータｋ、θ、及びＶ_ｉとを用い、少なくとも１つの移動相のトランジションフロントについての理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程であって、式ＩＩは、
   
   
   

   

   
   式中、
   

   

   
   である、理論段相当高さ（ＨＥＴＰ）値を計算する工程と、
   前記計算されたＨＥＴＰ値に基づき、前記クロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含む、方法。
2. 前記評価に基づいて、前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換、又は再充填を行うことを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記クロマトグラフィカラム充填について１回又は複数回の後の使用の間に、対応する移動相トランジションフロントについて、２つ以上の間隔で、カラム出口信号と、累積流量パラメータとを収集する工程と、
   前記クロマトグラフィカラム充填について前記１回又は複数回の後の使用の各回の間に、収集された前記カラム出口信号及び累積流量パラメータを用い、前記決定する工程及び前記計算する工程を実行する工程と、
   前記実行する工程に基づき、前記１回又は複数回の後の使用の各回の間に、前記クロマトグラフィカラム充填のＨＥＴＰ値を決定する工程と、
   ２回以上の後の使用の前記クロマトグラフィカラム充填の前記決定されたＨＥＴＰ値の傾向を蓄積する工程と、
   前記蓄積した傾向に基づき、前記クロマトグラフィカラム充填の前記質における変化を検出する工程と、を含み、
   前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換、又は再充填が、前記検出に基づくものである、請求項１に記載の方法。
4. 前記カラム充填の前記１回又は複数回の後の使用における前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値が、前記カラム充填の１回又は複数回の以前の使用における、前記クロマトグラフィカラム充填の前記ＨＥＴＰ値と比較して、増加していることにより、前記クロマトグラフィカラム充填の品質の低下を検出する、請求項３に記載の方法。
5. 前記カラム充填の前記初回の操作の間に、２つ以上の異なる移動相のトランジションフロントについてのカラム出口信号及び累積流量パラメータが収集され、
   前記方法が、
   前記２つ以上の異なる移動相トランジションフロントのそれぞれについてＨＥＴＰ値を計算するために、前記２つ以上の異なる移動相トランジションフロントのそれぞれについて別個に収集された前記カラム出口信号及び累積流量パラメータを用い、前記決定する工程及び前記計算する工程を実行する工程と、
   前記２つ又はそれ以上のＨＥＴＰ計算値に基づき、前記クロマトグラフィカラム充填の質を評価する工程と、を含み、
   前記クロマトグラフィカラムのコンディショニング、交換、又は再充填が、前記評価に基づくものである、請求項１に記載の方法。
6. 前記クロマトグラフィカラムが、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラム、陽イオン交換クロマトグラフィカラム、及び陰イオン交換クロマトグラフィカラムからなる群から選択される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 前記プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムを含み、前記陽イオン交換クロマトグラフィカラムが、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｓ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィカラムを含み、前記陰イオン交換クロマトグラフィカラムが、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ陰イオン交換クロマトグラフィカラムを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記プロテインＡアフィニティクロマトグラフィカラムにおける前記移動相のトランジションフロントが、抗ＴＮＦ抗体の溶出中に生成されるフロント、グアニジンＨＣｌでのカラムの殺菌中に生成されるフロント、殺菌後のカラムの０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）でのリンス中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
9. 前記陽イオン交換クロマトグラフィカラムにおける前記移動相のトランジションフロントが、抗ＴＮＦ抗体を含み溶媒／洗剤（Ｓ／Ｄ）処理された材料の充填中に生成されるフロント、抗ＴＮＦ抗体の溶出中に生成されるフロント、及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
10. 前記陰イオン交換クロマトグラフィカラムにおける前記移動相のトランジションフロントが、水酸化ナトリウムでのカラムの洗浄中に生成されるフロント及びカラムストリップ中に生成されるフロントからなる群から選択される１つ又は複数のフロントから生成される、請求項６に記載の方法。
    

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