CN112129868B - 用于通过液相色谱法优化缓冲条件的方法和系统 - Google Patents
用于通过液相色谱法优化缓冲条件的方法和系统 Download PDFInfo
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Abstract
采用具有一定范围内的恒定pH值的盐梯度或采用具有一定范围内的恒定盐浓度的pH梯度来运行多个色谱图。可以使用色谱优化算法来鉴定至少一个盐梯度色谱图或至少一个pH梯度色谱图,以建立优化的缓冲条件。所述色谱优化算法可以包含峰总数算法、峰谷算法和/或峰容量算法。
Description
技术领域
本发明总体上涉及用于通过液相色谱法优化缓冲条件的方法和系统。
背景技术
色谱法是一种广泛使用的用于分子的化学分析和分离的分析技术。色谱法涉及使一种或多种分析物物种与存在于样品中的其它基质组分分离。通常选择色谱柱的固定相,使得与分析物存在相互作用。这种相互作用可以是离子的、亲水的、疏水的或其组合。例如,固定相可以衍生化为具有离子部分,所述离子部分将理想地以不同的亲和力水平结合到离子分析物和基质组分上。使流动相渗滤通过固定相,并且与分析物和基质组分竞争结合到离子部分。流动相或洗脱液是用于描述液体溶剂或缓冲溶液的术语,所述液体溶剂或缓冲溶液被泵送通过色谱柱以随时间变化而将分析物和基质组分从固定相中洗脱出来,并且然后在检测器处被检测。一些典型检测器的实例是电导率检测器、UV-VIS分光光度计和质谱仪。多年来,色谱法已经发展成一种强大的分析工具,所述分析工具对于创造更健康的、更清洁的且更安全的环境是有用的,其中可以分离和分析复杂的样品混合物以用于各种行业,如水质、环境监测、食品分析、制药以及生物技术。
如离子交换色谱法(IEC)、疏水相互作用色谱法(HIC)和反相色谱法等色谱法广泛用于蛋白质表征和纯化。单克隆抗体(mAb)是已经在生物制药市场中使用的特定类型的蛋白质。出于质量和研究目的,可以使用具有定制的缓冲条件的色谱法来表征含有单克隆抗体的样品。可以使用pH梯度或盐梯度来改进对含有包含电荷变体、氧化变体和/或不同杂质的多种不同的蛋白质的样品进行的色谱分离。在某些情况下,盐梯度流动相的pH水平或pH梯度流动相的电解质浓度需要针对特定的蛋白质组分进行优化,这可能是耗时的步骤并且导致方法开发的瓶颈。申请人认为,需要用于确定盐梯度和/或pH梯度的缓冲条件以便色谱法分离生物分子的经过改进的方法和系统。
发明内容
在第一实施例中,描述了一种使用盐梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法。所述方法包含分别使用具有第一恒定pH值、第二恒定pH值和第三恒定pH值的流动相进行第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行以分析所述生物分子。所述流动相具有所述第一恒定pH值、所述第二恒定pH值和所述第三恒定pH值,并且是分别用第一预定比例、第二预定比例和第三预定比例的第一洗脱溶液和第二洗脱溶液制备的。所述第一预定比例、所述第二预定比例和所述第三预定比例是不同的。所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行各自使用相同的盐梯度浓度范围、相同的梯度时间和相同的盐梯度浓度变化率。所述第一洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第一洗脱溶液具有约为6的第一pH。所述第二洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第二洗脱溶液具有约为10的第二pH。在所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。对所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行色谱优化算法,以从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行。所述进行所述色谱优化算法从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定所述至少一个优化的盐梯度色谱运行。
关于第一实施例,所述色谱优化算法包含峰总数算法、峰谷算法和峰容量算法。所述峰总数算法包含:统计所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的测得的所述峰的总数;以及将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大的峰总数。所述峰谷算法包含计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的前一峰谷比。所述计算所述前一峰谷比包含鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰。所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应。鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰。所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间。鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷,其中所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间。将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的前一峰谷比。计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的后一峰谷比。所述计算所述后一峰谷比包含鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰。所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间。鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间。将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的后一峰谷比。将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的乘积。计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的复合峰谷比。将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比。所述峰容量算法包含基于方程式计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的峰容量。所述方程式包含 其中n'是所述峰容量,tg是梯度时间,PWHHM是所述主峰的半高峰宽。将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量。所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行:a)所述峰总数算法,b)所述峰谷算法,和/或c)所述峰容量算法。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大的峰总数的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第一区域中。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第二区域中。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第三区域中。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法可以精细化盐梯度范围。所述方法包含基于所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的所述至少一个优化的盐梯度色谱运行确定优化的恒定pH值。使用全部具有所述优化的恒定pH值的流动相进行第一精细化盐梯度色谱运行、第二精细化盐梯度色谱运行和第三精细化盐梯度色谱运行以分析所述生物分子。所述流动相是用相同比例的所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液制备的。所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行分别使用第一盐浓度变化率、第二盐浓度变化率和第三盐浓度变化率以及相同的梯度时间。所述第一盐浓度变化率、所述第二盐浓度变化率和所述第三盐浓度变化率是不同的。具有所述第一盐浓度变化率、所述第二盐浓度变化率和所述第三盐浓度变化率的所述流动相是用不同比例的水和盐溶液制备的。在所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。对所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行精细化色谱优化算法,以从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行。所述进行所述色谱优化算法从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行。
关于第一实施例的任何实施例,所述精细化色谱优化算法包含精细化峰总数算法、精细化峰谷算法和精细化峰容量算法。所述精细化峰总数算法包含统计所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的测得的峰的总数;以及将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大的峰总数。所述精细化峰谷算法包含计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的前一峰谷比。所述计算所述前一峰谷比包含鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰。所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应。鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰。所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间。鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷。所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间。将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的前一峰谷比。计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的后一峰谷比。所述计算所述后一峰谷比包含鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰。所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间。鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间。将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的后一峰谷比。将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的乘积。计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的复合峰谷比。将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比。所述精细化峰容量算法包含基于方程式计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的峰容量,其中n'是所述峰容量,tg是梯度时间,PWHHM是所述主峰的半高峰宽。将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量。所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行:a)所述精细化峰总数算法,b)所述精细化峰谷算法,和/或c)所述精细化峰容量算法。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大的峰总数的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第一区域中。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第二区域中。
关于第一实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第三区域中输出。
在第二实施例中,描述了一种使用pH梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法。所述方法包含分别使用具有第一恒定盐浓度、第二恒定盐浓度和第三恒定盐浓度的流动相进行第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行以分析所述生物分子。所述流动相具有所述第一恒定盐浓度、所述第二恒定盐浓度和所述第三恒定盐浓度,并且是分别用第一预定比例、第二预定比例和第三预定比例的水和盐溶液制备的。所述第一预定比例、所述第二预定比例和所述第三预定比例是不同的。所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行各自使用相同的pH梯度浓度范围、相同的梯度时间和相同的pH梯度浓度变化率。所述第一洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第一洗脱溶液具有约为6的第一pH。所述第二洗脱溶液包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第二洗脱溶液具有约为10的第二pH。在所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。对所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行色谱优化算法,以从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行。所述进行所述色谱优化算法从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定所述至少一个优化的pH梯度色谱运行。
第二实施例的所述色谱优化算法与第一实施例中所描述的算法类似。在第二实施例中,以与第一实施例类似的方式进行所述优化算法,除了用作为输入的所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行替换所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行之外。所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行:a)所述峰总数算法,b)所述峰谷算法,和/或c)所述峰容量算法。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大的峰总数的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第一区域中。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第二区域中。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第三区域中。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法可以精细化pH梯度范围。所述方法包含基于所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的所述至少一个优化的pH梯度色谱运行确定优化的恒定盐浓度。使用全部具有所述优化的恒定盐浓度的流动相进行第一精细化pH梯度色谱运行、第二精细化pH梯度色谱运行和第三精细化pH梯度色谱运行以分析所述生物分子。所述流动相是用相同比例的所述水和所述盐溶液制备的。所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行分别使用第一pH变化率、第二pH变化率和第三pH变化率以及相同的梯度时间。所述第一pH变化率、所述第二pH变化率和所述第三pH变化率是不同的。具有所述第一pH变化率、所述第二pH变化率和所述第三pH变化率的所述流动相是用不同比例的所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液制备的。在所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。对所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行精细化色谱优化算法,以从所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行。所述进行所述色谱优化算法从所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行。
第二实施例的所述精细化色谱优化算法与第一实施例中所描述的精细化算法类似。在第二实施例中,以与第一实施例类似的方式进行所述精细化优化算法,除了用作为输入的所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行替换第一实施例的所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行之外。所述进行所述精细化色谱优化算法基于以下从所述第一pH精细化梯度色谱运行、所述第二pH精细化梯度色谱运行和所述第三pH精细化梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行:a)所述峰总数算法,b)所述峰谷算法,和/或c)所述峰容量算法。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大的峰总数的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第一区域中。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第二区域中。
关于第二实施例的任何实施例,所述方法包含在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第三区域中。
关于上述实施例中的任何实施例,所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于约25毫摩尔。关于上述实施例中的任何实施例,所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于约250毫摩尔。
关于上述实施例中的任何实施例,恒定pH值可以指在色谱运行期间变化不超过预定量的pH值。所述预定量的范围可以是在色谱期间测得的pH值的取样部分的约0%到5%,并且优选地小于1%。其中进行pH测量的取样部分可以是色谱图或整个色谱图的一部分。所述取样部分可以是单次测量结果或特定时间范围的平均pH值。
关于上述实施例中的任何实施例,恒定盐浓度可以指在色谱运行期间变化不超过预定量的盐浓度。所述预定量的范围可以是标称盐浓度的约0%到5%,并且优选地小于1%。盐浓度可能由于泵取样和混合的变化而变化。
关于上述实施例中的任何实施例,盐梯度浓度范围包含在色谱图开始时的初始盐浓度和在色谱图结束时的最终盐浓度(例如,每单位时间的盐浓度的变化)。关于上述实施例中的任何实施例,盐浓度变化率表示盐浓度在初始盐浓度与最终盐浓度之间随时间的变化。例如,盐浓度变化率可以是线性变化,并且由斜率表征。关于上述实施例中的任何实施例,梯度时间可以表示pH或盐浓度针对峰的分离而变化的持续时间。
关于上述实施例中的任何实施例,pH梯度范围包含在色谱图开始时的初始pH和在色谱图结束时的最终pH(例如,每单位时间的pH的变化)。关于上述实施例中的任何实施例,pH变化率表示pH在初始pH与最终pH之间随时间的变化。例如,pH变化率可以是线性变化,并且由斜率表征。
关于上述实施例中的任何实施例,优化的色谱图可以是具有可以用于表征样品的分辨率最高的峰的色谱图。
关于上述实施例中的任何实施例,检测到的信号可以是来自色谱系统上的检测器的所测得信号。例如,所测得信号可以是来自UV-Vis分光光度计的吸光度值。检测到的信号可以是相对于基线值的绝对值。
关于上述实施例中的任何实施例,峰高度或谷高度可以是检测到的信号相对于基线信号的量值。
关于上述实施例中的任何实施例,第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行可以使用线性盐梯度,其中对于色谱运行的至少一部分,盐浓度随时间线性地变化。
关于上述实施例中的任何实施例,第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行可以使用线性pH梯度,其中对于色谱运行的至少一部分,pH随时间线性地变化。
附图说明
并入本文并构成本说明书的一部分的附图展示了本发明的目前优选的实施例,并且与上文给出的一般描述和下文给出的详细描述一起用于解释本发明的特征(其中相似的数字表示相似的元件)。
图1展示了被配置成用多达四个不同的流动相储存器进行梯度洗脱的色谱系统的示意图。
图2展示了包含含有用于生成pH和/或盐梯度的各种缓冲盐、水和电解质盐的四个储存器的缓冲系统实施例。
图3展示了用阳离子交换色谱柱分离含有单克隆抗体的样品的多个色谱图。色谱图是在各种pH水平下以相同的盐梯度运行。每个色谱图用其标称pH水平标记。
图4展示了所测得pH随泵送到色谱柱中的洗脱液C的%和洗脱液D的%的变化。
图5展示了用阳离子交换色谱柱分离含有单克隆抗体的样品的多个色谱图。色谱图是在各种盐水平下以相同的pH梯度运行。每个色谱图用其标称盐浓度标记。
图6展示了用阴离子交换色谱柱分离含有蛋白质(卵白蛋白)的样品的多个色谱图。色谱图是在各种pH水平下以相同的盐梯度运行。每个色谱图用其标称pH水平标记。
图7展示了用疏水相互作用色谱柱分离含有单克隆抗体的样品的多个色谱图。色谱图是在各种pH水平下以相同的盐梯度运行。每个色谱图用其标称pH值标记。
图8A示出了使用盐梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法的流程图。
图8B示出了使用pH梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法的流程图。
图9示出了包含用于确定建立pH梯度或盐梯度的缓冲条件的优化色谱图的各种算法的色谱优化算法的流程图。
图10A示出了在用于通过盐梯度确定缓冲条件的初始筛选之后,用于确定精细化的缓冲条件的方法的流程图。
图10B示出了在用于通过pH梯度确定缓冲条件的初始筛选之后,用于确定精细化的缓冲条件的方法的流程图。
图11示出了用于确定峰谷比的三个色谱峰和相关值的示意图。
具体实施方式
应当参照附图来读取以下详细说明,在附图中,不同附图中的相似元件用相同的附图标记表示。不一定按比例绘制的附图描绘了所选实施例并且不旨在限制本发明的范围。详细描述通过举例而非限制的方式展示了本发明的原理。本说明书将清楚地使本领域的技术人员能够制备和使用本发明,并且描述了本发明的若干实施例、修改、变化、替代方案以及用途,包含目前被认为是实施本发明的最佳模式的内容。如本文所使用的,针对任何数值或范围的术语“约”或“大约”指示合适的尺寸公差,所述尺寸公差允许组件的部分或集合用于如本文所描述的预期目的。
描述了一种用于通过液相色谱法优化缓冲条件的方法和系统。当开发使用具有梯度洗脱的特定柱的方法时(其中pH或盐浓度随时间变化),色谱法表征和分离新的生物分子样品可能是具有挑战性的。生物分子的实例包含蛋白质、肽、单克隆抗体、寡核苷酸、聚糖和糖蛋白。将描述可以提供盐或pH梯度洗脱的自动优化以减少在表征蛋白质中的工作流程所需的时间的系统和方法。然而,在描述此类系统和方法之前,下面将描述适用于优化缓冲条件的色谱系统。
图1展示了被配置成用多达四个不同的流动相类型进行梯度洗脱的色谱系统100的示意图。色谱系统100可以包含四个流动相储存器(102A,102B,102C,102D)、任选的脱气组合件104、洗脱液比例调节阀组合件106、管道组合件108、泵110、压力传感器112、梯度混合器114、注入阀116、色谱柱118、检测器120、pH传感器140和微处理器122。
泵110可以被配置成通过系统100从一个或多个储存器泵送液体。所泵送的液体可以流过任选的脱气组合件104,并且然后流到洗脱液比例调节阀组合件106。可以使用洗脱液比例调节阀组合件106从四个流动相储存器(102A,102B,102C,102D)中的每个流动相储存器提取预定比例的液体,并且将其传输到管道组合件108,并且然后传输到泵110。泵110包含初级泵头110A和次级泵头110B。洗脱液比例调节阀组合件106可以引导泵110在四个流动相储存器之一上进行抽取持续预定的时间段,并且然后切换到另一个流动相储存器。通常,泵在活塞循环期间将抽取至少一次所选流动相类型中的每个流动相类型,以形成多个邻接的溶剂体积。例如,四个流动相储存器(102A,102B,102C,102D)可以用于pH梯度洗脱。这将最初形成含有液体体积A、液体体积B、液体体积C和液体体积D的异质溶剂体积(未混合的)。请注意,溶剂体积A、B、C或D可以被称为液体塞,所述液体塞流过导管,使得在这四个塞之间不存在完全均质化。溶剂体积A、B、C或D可以是邻接关系和连续关系。溶剂体积A、B、C或D的比例取决于其中洗脱液比例调节阀组合件106在特定储存器上进行抽取的定时。异质溶剂体积从泵110输出,并且与来自一个泵循环的所输出溶剂相对应。请注意,溶剂体积A、B、C或D的比例可以随时间变化,以形成梯度洗脱。
泵110的输出连续地流到压力传感器112、混合装置114、注入阀116、色谱柱118、检测器120,并且然后流到pH传感器140。压力传感器112可以用于测量由泵110泵送的流动相的系统压力。注入阀116可以用于将样品的等分试样注入到洗脱液流中。色谱柱118可以用于将存在于液体样品中的各种基质组分与兴趣分析物分离。色谱柱118的输出可以流体连接到检测器120,并且然后流体连接到任选的pH传感器140。检测器120可以呈电导率检测器形式,所述电导率检测器可以监测导电率随时间的变化以鉴定分析物峰,或可替代地可以是紫外-可见分光光度计以监测入射光在预定波长下的吸光度。色谱柱118可以分离在不同保留时间下输出的样品的一种或多种分析物。
微处理器122可以包含存储器部分,并且可以用于控制色谱系统100的操作。微处理器122可以被集成到色谱系统100中,或可以是与色谱系统100通信的个人计算机的一部分。微处理器122可以被配置成与色谱系统的一个或多个组件(如泵110、洗脱液比例调节阀106、注入阀116和检测器120)通信并对其加以控制。存储器部分可以包含关于如何控制泵110、洗脱液比例调节阀106、注入阀116和检测器120的软件或固件指令。存储器部分还可以包含关于如何确定和优化用于使用一种类型的色谱柱分离特定蛋白质的缓冲条件的软件或固件指令。
图2展示了包含四个储存器(102A,102B,102C,102D)的缓冲系统实施例,所述四个储存器含有用于生成pH和/或盐梯度的各种缓冲盐、水和电解质盐。在一个实施例中,储存器102A含有水,并且更具体地去离子水(例如,1MΩ·cm到18MΩ·cm)。储存器102B包含具有范围为约0.1M到约5M的相对高盐浓度的电解质溶液。电解质溶液(例如,盐溶液)可以包含盐,如NaCl、KCl、LiCl、NaClO4、LiClO4、NH4OAc、Na2SO4、(NH4)2SO4和/或NH4Cl。储存器102C可以包含pH值为5.6的160mM MES、100mM BES、120mM TAPS和100mM CAPSO。储存器102D可以包含pH值为10.2的100mM MES、120mM BES、140mM TAPS和160mM CAPSO。
流动相储存器102C和102D分别可以被称为第一洗脱溶液和第二洗脱溶液,其各自包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐具有特定性质,所述性质是:a)这些缓冲盐是单价缓冲盐,b)在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,以及c)包含磺酸根基团和胺。在一个实施例中,第一洗脱溶液的第一pH可以为约6并且总缓冲盐浓度大于约25毫摩尔,并且第二洗脱溶液的第二pH可以为约10并且总缓冲盐浓度大于约25毫摩尔。
单价缓冲盐是仅具有一个酸/碱部分的缓冲液。对于本文所描述的缓冲系统,酸/碱部分的pKa值应处于相关pH范围之间,在这种情况下,所述pH范围为约pH 6到约10。另外,单价缓冲盐可以仅具有以下三种电荷状态之一,所述电荷状态是:单个正电荷、无净电荷(即,中性或两性离子电荷)或单个负电荷。
至少三种缓冲盐应各自在约6到约10的pH范围内包含净负电荷或净中性两性离子电荷,使得缓冲盐将不与阳离子交换柱强烈缔合或结合。阳离子交换材料通常具有负电荷,以用于结合到带正电荷的阳离子。因此,由于离子排斥,净带负电荷的缓冲盐不应结合到带负电荷的阳离子交换部分。由于在中性与带负电荷的物种之间缺乏净离子吸引,净中性两性离子带电荷的缓冲盐不应结合到带负电荷的阳离子交换材料。相比之下,由于离子吸引,带正电荷的缓冲盐应结合到带负电荷的阳离子交换材料。带正电荷的缓冲盐与阳离子交换材料的离子键合可能影响缓冲盐的缓冲能力并干扰pH梯度的线性。在一个实施例中,缓冲盐没有以允许缓冲盐有效地缓冲流动相和固定相两者的方式由固定相保留或从固定相中完全排除。请注意,如果从固定相中排除缓冲盐物种,则其无法以与未从固定相中排除的其它缓冲盐类似的方式缓冲固定相并促进分析物的洗脱。另外,由固定相保留的缓冲盐可能导致流动相pH与固定相pH之间的偏差,所述偏差取决于缓冲液在固定相上的保留特性。
至少三种缓冲盐应各自进一步包含磺酸根基团和胺。在一个实施例中,胺基可以是伯胺、仲胺或叔胺。缓冲盐可以呈这样的形式,其中来自磺酸基的氢使胺基质子化以形成带正电荷的部分和带负电荷的磺酸根基团,其一起形成两性离子。缓冲盐还可以呈这样的形式,其中经过质子化的胺基具有负抗衡离子,如氯,并且磺酸根基团具有正抗衡离子,如钠。应当注意的是,包含磺酸根基团和胺基的许多缓冲盐可以被称为“Good's缓冲液”。
尽管没有以特定缓冲盐的名称明确描述,但是本领域的普通技术人员将理解,作为缓冲盐名称的一部分的指定术语“磺酸盐”不应将缓冲盐限制为仅带负电荷的磺酸盐状态,并且在低pH条件下也可以呈磺酸形式。进一步,本领域的普通技术人员将理解,作为缓冲盐名称的一部分的指定术语“胺”不应将缓冲盐限制为仅中性的不含电荷的胺状态,并且当缓冲液呈微酸性时也可以呈具有抗衡阴离子的质子化铵形式。
在一个实施例中,第一洗脱溶液和第二洗脱溶液各自包含四种缓冲盐,可以是相同的化学物种。例如,第一洗脱溶液和第二洗脱溶液两者均含有以下四种缓冲盐,所述四种缓冲盐分别是:2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙磺酸盐(BES)、N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)。
第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的四种缓冲盐可以各自包含:具有第一pKa的第一缓冲盐、具有第二pKa的第二缓冲盐、具有第三pKa的第三缓冲盐和具有第四pKa的第四缓冲盐。第一pKa可以是四个pKa值中的最小pKa值,并且第四pKa可以是四个pKa值中的最大pKa值。可以选择缓冲盐,使得第一pKa与第一pH值大约相同,并且第四pKa与第二pH值大约相同。更具体地,可以选择缓冲盐,使得第一pKa处于第一pH值的0.5pH单位内,并且第四pKa处于第二pH值的0.5pH单位内。
还可以选择缓冲盐,使得pKa值大致且均匀地横跨于第一pH值与第二pH值之间。在一个实施例中,在第二pKa与第一pKa之间存在小于约1.5的第一差值,在第三pKa与第二pKa之间存在小于约1.5的第二差值,并且在第三pKa与第四pKa之间存在小于约1.5的第三差值。这四个pKa值的差值的范围可以选择为约0.5到约1.5pH单位,使得从第一pH到第二pH存在相对均匀的缓冲能力。在一个实施例中,第一pKa值、第二pKa值、第三pKa值和第四pKa值在25℃下可以为约6.1、7.1、8.4和9.6。应当注意的是,除非明确指出处于不同温度下,否则本文所述的所有pKa值均是相对于25℃陈述的。
在替代性实施例中,第一洗脱溶液的一种或多种缓冲盐可以是与第二洗脱溶液的缓冲盐不同的化学物种。例如,第一洗脱溶液可以包含MES、BES、TAPS和CAPSO,并且第二洗脱溶液可以包含MES、MOPS、TAPS和CAPSO。即使第二洗脱溶液的第二缓冲盐是不同的化学物种,但此缓冲液组合仍将提供线性pH梯度。
在一个实施例中,第一洗脱溶液和第二洗脱溶液的缓冲盐浓度值可以被选择成具有边界条件。例如,洗脱溶液可以各自具有所述至少四种缓冲盐中的最低和最高缓冲液浓度。可以选择缓冲盐浓度值,使得最高缓冲液浓度不大于最低缓冲液浓度的约60%以上。
第一洗脱溶液的所选缓冲盐浓度值的实例可以包含160mM MES、100mM BES、120mMTAPS和100mM CAPSO。在此,对于BES,最低缓冲盐浓度为100mM,并且对于CAPSO最低缓冲盐浓度为100mM,并且对于MES,最高缓冲盐浓度为160mM。因此,160mM MES不大于100mM BES或CAPSO的60%以上。
第二洗脱溶液的所选缓冲盐浓度值的实例可以包含100mM MES、120mM BES、140mMTAPS和160mM CAPSO。在此,对于MES,最低缓冲盐浓度为100mM,并且对于CAPSO,最高缓冲盐浓度为160mM。因此,160mM CAPSO不大于100mM MES的60%以上。
第一洗脱溶液和第二洗脱溶液可以各自包含至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐选自第一缓冲盐、第二缓冲盐、第三缓冲盐和第四缓冲盐。第一缓冲盐可以包含2-(N-吗啉代)乙磺酸盐(MES)。第二缓冲盐可以包含N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐(BES)或3-(N-吗啉代)丙磺酸盐(MOPS)。第三缓冲盐可以包含N-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸盐(TAPS)或N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(4-丁磺酸盐)(HEPBS)。第四缓冲盐可以包含3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸盐(CAPSO)或2-(环己基氨基)乙磺酸盐(CHES)。应当注意的是,使用上文所描述的第一缓冲盐、第二缓冲盐、第三缓冲盐或第四缓冲盐中的至少三种缓冲盐的任何组合可以提供适用于生成约pH 6到约pH 10的线性pH梯度的缓冲液组合。另外,可以修改上述缓冲盐,其中磺酸盐部分可以具有各种烷基链长度,例如,乙基磺酸盐、丙基磺酸盐、丁基磺酸盐和羟丙基磺酸盐。应当注意的是,上述缓冲盐是示例性的,并且本文所描述的用于生成线性pH梯度的缓冲液组合不应限制于上述示例性缓冲盐。
在一个实施例中,对于第一洗脱溶液和第二洗脱溶液两者,所述至少四种缓冲盐可以被选择为使得所述至少四种缓冲盐之一不具有上文所描述的a)到c)的所有特定性质。例如,每种缓冲盐在约6到约10的pH范围内可以具有净负电荷或净中性电荷(特征b),但不一定具有(特征a)和c))。一种或多种缓冲盐可以包含以下特性的一种或多种特性,所述特性是多价缓冲液,并且不包含磺酸根基团和胺两者。例如,这四种缓冲盐之一可以是磷酸盐。磷酸盐在约6到约10的pH范围内仅带负电荷,是多价缓冲液,并且不具有胺基或磺酸根基团。与本文所描述的缓冲液组合一起使用的磷酸盐可以呈一元、二元和/或三元的形式,其中抗衡离子是钠和/或钾。适用于本文所描述的缓冲液组合的含有磷酸盐功能的其它缓冲盐是焦磷酸盐和三聚磷酸盐。
在另一个实施例中,对于第一洗脱溶液和第二洗脱溶液两者,一种或多种缓冲盐可以包含以下特性的一种或多种特性,所述特性是:在约6到约10的pH范围内具有净正电荷或净中性电荷,并且不包含磺酸根基团。例如,缓冲盐之一可以是三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。TRIS在约6到约10的pH范围内可以是中性的或带正电荷的,并且不具有磺酸根基团。
令人惊讶的是,申请人发现包含具有以下特性的一种或多种特性的缓冲盐(如为多价缓冲盐,在约6到10的pH范围内带正电荷,不具有磺酸根基团或不具有胺),在所述pH范围内不会显著干扰缓冲液组合的pH线性,只要包含各自具有以下性质的至少三种缓冲盐即可,所述性质是:a)缓冲盐是单价缓冲盐,b)在约6到约10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且c)包含磺酸根基团和胺。因此,使用TRIS或磷酸盐作为本文所描述的缓冲液组合中的缓冲盐之一仍可以提供足够线性的pH梯度。
图8A展示了通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法800。所述方法包含运行采用一系列恒定pH值的盐梯度色谱图,其中每个色谱图具有恒定pH(步骤802),测量每个色谱图的一个或多个峰(步骤804),以及进行色谱优化算法以鉴定至少一个优化的盐梯度色谱图(步骤806)。
在步骤802中,可以使用分别具有第一恒定pH值、第二恒定pH值和第三恒定pH值的流动相进行第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行,以分析生物分子。对于每个运行,可以将相同的样品蛋白注入到色谱柱中。多个盐梯度色谱运行可以各自具有不同的恒定pH值,而对于步骤802中用于筛选缓冲条件的每个色谱运行,盐浓度的变化可以是相同的。分别具有第一恒定pH值、第二恒定pH值和第三恒定pH值的流动相是用第一预定比例、第二预定比例和第三预定比例的第一洗脱溶液(洗脱液C)和第二洗脱溶液(洗脱液D)制备的,其中所述第一预定比例、所述第二预定比例和所述第三预定比例是不同的。第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行使用相同的梯度浓度范围、变化率和相同的梯度时间。例如,每个色谱图可以用0mM NaCl(初始)到200mM NaCl(最终)的梯度浓度范围、15分钟的梯度时间,以及13.3毫米/分钟(例如,0毫米-200毫米/15分钟)的变化率来运行。
色谱分离平台可以包含使产生优化的一组缓冲条件的pH或盐梯度的生成自动化。缓冲系统可以包含第一储存器(洗脱液A,102A)、第二储存器(洗脱液B,102B)、第三储存器(洗脱液C,102C)以及第四储存器(洗脱液D,102D)。在一个实施例中,洗脱液A可以是水(例如,去离子水),洗脱液B可以是浓缩电解质(例如,1M NaCl),洗脱液C可以是在第一pH(例如,pH5.6)下的第一洗脱溶液,并且洗脱液D可以是在第二pH(例如,pH 10.2)下的第二洗脱溶液。
可以改变第三储存器和第四储存器的比率以控制流动相的pH。如果感兴趣的最高pH是X,感兴趣的最低pH是Y,并且有待测试的pH值的数量是Z,则pH值之间的增量是(X-Y)/(Z-1)。Z也可以被称为程序编号。例如,如表1所实施的,X可以是10.2,Y可以是5.2,并且Z可以是11,所述表示出了十一个程序编号、相关的洗脱液C%和洗脱液D%以及经过计算的pH值。作为对pH计算的验证,可以在柱后测量pH值,如表1所示。尽管表1中展示了11个运行,但程序也可以包含范围为3个或更多个不同数量的色谱运行。
表1.
程序编号 | 洗脱液C% | 洗脱液D% | pH(经过计算的) | pH(所测得的) |
I | 10 | 0 | 5.60 | 5.53 |
II | 9 | 1 | 6.06 | 6.01 |
III | 8 | 2 | 6.52 | 6.49 |
IV | 7 | 3 | 6.98 | 6.98 |
V | 6 | 4 | 7.44 | 7.50 |
VI | 5 | 5 | 7.90 | 8.05 |
VII | 4 | 6 | 8.36 | 8.53 |
VIII | 3 | 7 | 8.82 | 9.01 |
IX | 2 | 8 | 9.28 | 9.44 |
X | 1 | 9 | 9.74 | 9.85 |
XI | 0 | 10 | 10.20 | 10.22 |
在一个实施例中,用户将用于研究的pH范围(X,Y)和有待在所述pH范围内测试的pH值的数量(Z)输入色谱数据系统软件程序中。在替代性实施例中,软件程序可以具有值X、Y和Z作为默认参数,所述默认参数在没有用户修改的情况下被自动使用。软件程序可以输出有待运行的十一个色谱图的建议的梯度条件,其中每个色谱图使用根据表1的不同的恒定pH值。用户可以选择修改盐梯度参数,如初始盐浓度、最终盐浓度、在运行期间盐浓度的变化步长和/或速率,以及运行的持续时间。作为默认值,初始盐浓度可以为零,最终盐浓度可以为200mM,并且盐浓度可以在18分钟时间段内线性地变化。
可以使用来自表1的条件与步骤802中所指出的相同的盐梯度条件来自动进行多个色谱运行。在进行盐梯度色谱运行之后,可以分析色谱图以在步骤804中在第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。色谱图数据可以存储在色谱系统的存储器中和/或显示在计算机屏幕上。对于每个色谱图,可以确定如峰的保留时间、峰高度、峰之间的谷的高度、基线峰宽、半高峰宽等因素。
作为下一步骤,可以用软件程序实施步骤806来分析数据,以鉴定哪个程序编号或pH条件提供了蛋白质样品的最佳分离。在一个实施例中,可以使用微处理器将优化的盐梯度色谱运行自动鉴定为使用色谱优化算法的第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行之一。经过鉴定和优化的盐梯度色谱运行使用了优化的pH值,其可以输出和/或存储在色谱系统的存储器中。
图9示出了色谱优化算法806或856的流程图,其包含a)最大的峰总数算法(步骤902),b)峰谷算法(步骤904),和/或c)峰容量算法(步骤906)。应当注意的是,图8B中示出了步骤856。在进行步骤902、904和906中的一个或多个步骤之后,色谱优化算法鉴定优化的色谱图和相关的缓冲条件(步骤908)。在一个实施例中,色谱优化算法806基于以下自动鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行:a)峰总数算法,b)峰谷算法和/或c)峰容量算法。在另一个实施例中,色谱优化算法856基于以下自动鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行:a)峰总数算法,b)峰谷算法和/或c)峰容量算法。应当注意的是,步骤902、904和906可以被称为算法806或856的子程序。尽管图9被描绘为流程图,但是方法806或856不应限制于仅以一系列步骤进行,方法806或856的步骤也可以并行地进行。
在步骤902中,软件可以分析一组色谱图以用于对峰的数量进行计数,例如,分析来自表1的十一个色谱运行中的每个色谱运行。通常,色谱图中更大数量的峰提供了更多用于表征样品的信息。当来自检测器的所测得信号中的峰足够大时,所述峰可以被定义为与进一步分析相关。在一个实施例中,如果峰的面积大于最大主峰的面积的预定比例,则所述峰将用于进一步分析。最大主峰的面积的预定比例的范围可以是5%到1%,是1%、0.5%、0.1%或小于1%(但大于零)的值。此预定比例可以由用户输入或是默认值。应当注意的是,峰表示所测得信号中的局部最大值,其切向斜率为零。主峰是色谱图中具有最大峰面积的峰。具有最大峰数量的色谱图可以被鉴定为优化的色谱图,或一组色谱图可以被鉴定为由于具有最大峰数量而可以全部关联的优化的色谱图。可以选择与具有最大数量的峰的色谱图相关的pH值。可替代地,与具有大于峰的阈值数量的一组色谱图相关的pH值可以用于计算所选pH值。例如,可以使用与具有最大数量的峰的色谱图组相关的所有pH值来计算平均pH值。
应当注意的是,可以用每个色谱图进行背景校正以减少将背景噪声检测为峰的可能性。在一个实施例中,可以在没有样品注入的情况下运行每种条件的空白盐梯度或pH梯度色谱,以测量背景检测信号。然后可以用样品从对应的盐梯度或pH梯度色谱图中减去背景信号。
峰总数算法是在图3的色谱图上进行的。对于第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行,统计峰的总数。接着,鉴定具有最大的峰总数的盐梯度色谱运行。下表2中示出了结果,所述表显示,pH值6.5、7.0、7.5、8.0和8.5由于具有最大峰数量而关联。
表2.
峰数量 | |
pH 5.6 | 5 |
pH 6.1 | 5 |
pH 6.5 | 6 |
pH 7.0 | 6 |
pH 7.4 | 6 |
pH 7.9 | 6 |
pH 8.4 | 6 |
在步骤904中,软件可以分析用于进行峰谷比算法的一组色谱图,例如,分析来自表1的十一个色谱图运行中的每个色谱图运行。峰谷比可以用作两个色谱峰的分离程度的量度。在此算法中,可以针对色谱运行中的每个色谱运行来鉴定具有主峰保留时间t顶点的主峰,其中所述主峰的主峰高度(h顶点)与在所述主峰保留时间t顶点处的检测到的信号的最高绝对量值相对应,如图11所展示的。检测到的信号可以来自色谱系统的检测器。可以鉴定色谱运行中的每个色谱运行的前一峰和后一峰,并且所述前一峰和后一峰分别具有前一峰保留时间tpp和后一峰保留时间tsp。前一峰与主峰相邻,其中前一峰保留时间tpp小于主峰保留时间t顶点。类似地,后一峰与主峰相邻,其中后一峰保留时间tsp大于主峰保留时间t顶点。前一峰高度和后一峰高度两者均具有小于主峰高度的检测到的信号的绝对量值。应当注意的是,mAb通常具有主峰、前一峰和后一峰,其中主峰表示主要活性成分,并且前一峰和后一峰表示杂质(例如,电荷变体)。在阳离子交换色谱法中,前一峰可以被称为酸性的,并且后一峰可以被称为碱性的。在阴离子交换色谱法中,前一峰可以被称为碱性的,并且后一峰可以被称为酸性的。对于疏水相互作用色谱法,前一峰可以被称为比主峰的疏水性更低,而后一峰可以被称为比主峰的疏水性更高。
谷是所测得信号中的局部最小值,其切向斜率为零并且位于两个峰之间。具体地,前一谷定位在前一峰与主峰之间,而后一谷定位在主峰与后一峰之间。前一谷具有前一谷保留时间t起始,并且后一谷具有后一谷保留时间t结束。在此方法中,针对色谱运行中的每个色谱运行来鉴定前一谷、前一谷保留时间t起始、后一谷、后一谷保留时间t结束,如图11所展示的。前一谷的前一谷高度(h起始)与在前一谷保留时间t起始处的检测到的信号的绝对量值相对应。类似地,后一谷的后一谷高度(h结束)与在后一谷保留时间t结束处的检测到的信号的绝对量值相对应。谷高度可以被测量为信号相对于基线的绝对量值。前一谷保留时间t起始处于前一峰保留时间tpp与主峰保留时间t顶点之间。后一谷保留时间t结束处于主峰保留时间t顶点与后一峰保留时间tsp之间。
可以通过将h顶点除以h起始来计算前一谷的前一峰谷比(PVRp)(例如,PVRp=h顶点/h起始)。前一谷可以被称为在酸性峰的上下文中。可以通过将h顶点除以h结束来计算后一谷的后一峰谷比(PVRS)(例如,PVRS=h顶点/h结束)。前一谷可以被称为在碱性峰的上下文中,并且后一谷可以被称为在酸性峰的上下文中。在一个实施例中,具有最大PVRp的色谱图可以被鉴定为优化的色谱图。在另一个实施例中,具有最大PVRS的色谱图可以被鉴定为优化的色谱图。在又其它实施例中,可以计算以下参数,所述参数是:乘积(PVRp×PVRs)、乘积的平方根((PVRp×PVRs)1/2)和/或总和(PVRp+PVRs)。具有最大乘积、乘积的平方根和/或总和的色谱图可以被鉴定为优化的色谱图。在一个实施例中,仅具有最大数量的峰的色谱图经受峰谷比算法。应当注意的是,乘积的平方根(PVRp×PVRs)1/2可以通过有利于量值类似的峰谷比而在评估色谱图的质量方面提供益处。
峰谷比算法是在图3的色谱图上进行的。下表3中示出了结果,所述表显示,色谱图在pH 7.9下显示出最大的PVRp、PVRs,并且PVRp和PVRs的乘积的平方根可以被称为复合峰谷比CPVR,其中CPVR=(PVRp×PVRs)1/2。因此,在这种情况下,峰谷比算法的各种版本均表明pH7.9是最佳值。
表3.
PVRp | PVRs | CPVR | |
pH 5.6 | 5.36 | 8.45 | 6.73 |
pH 6.1 | 5.60 | 13.82 | 8.79 |
pH 6.5 | 6.08 | 17.41 | 10.28 |
pH 7.0 | 6.48 | 18.33 | 10.90 |
pH 7.4 | 7.31 | 18.48 | 11.62 |
pH 7.9 | 7.48 | 20.17 | 12.28 |
pH 8.4 | 6.62 | 17.25 | 10.69 |
在步骤906中,软件可以分析用于进行峰容量算法的一组色谱图,例如,分析来自表1的十一个色谱图运行中的每个色谱图运行。峰容量用于描述梯度洗脱的分离效率,其中更高的峰容量值与更好的分离相关。峰容量方程式如方程式1所示。
对于方程式1,n是峰容量,tg是梯度时间,W是在基线处的平均峰宽。梯度时间可以表示pH或盐浓度针对峰的分离而变化的持续时间。对于像图3中的情况,许多峰无法被很好地分辨,使得难以确定峰宽,并且因此W也不容易确定。相反,提出了经过修改的峰容量方程式,如方程式2所示。
对于方程式2,n'是所述峰容量,tg是梯度时间,PWHHM是所述主峰的半高峰宽。相比于方程式1,术语PWHHM不需要在基线处的若干个峰的平均宽度,其中若干个此类峰可能由于重叠而难以测量。作为方程式1的近似,新方程式2测量了主峰的1/2高度的宽度。由于在基线处未测量PWHHM,因此即使在主峰处存在一些峰重叠,也可以进行精确的测量。为了估算基线处的峰宽(W),将PWHHM乘以1.7。因此,方程式2提供了当存在与主峰的一些重叠时估算峰容量的经过改进的方法。
峰容量算法是在图3的色谱图上进行的。结果示出在下表4中,所述表示出了在pH8.4下的色谱图示出了最大n'。
表4.
PWHHM | n' | |
pH 5.6 | 0.108 | 82.70 |
pH 6.1 | 0.089 | 100.14 |
pH 6.5 | 0.080 | 111.29 |
pH 7.0 | 0.074 | 120.24 |
pH 7.4 | 0.073 | 121.87 |
pH 7.9 | 0.071 | 125.28 |
pH 8.4 | 0.068 | 130.76 |
在步骤908中,基于以下鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行:a)峰总数算法(步骤902),b)峰谷算法(步骤904)和/或c)峰容量算法(步骤906)。
在一个实施例中,可以通过对每个色谱图的峰总数(TNP)、复合峰谷比(CPVR)以及峰容量(n')的加权值进行求和来计算混合品质因数。所述至少一个优化的盐梯度色谱运行是基于具有最大混合品质因数的运行来鉴定的。混合品质因数(BMF)可以基于方程式3。
BMF=a1TNP+a2CPVR+a3n' (方程式3)
术语a1、a2和a3表示可以由用户设置或已经存储为默认值的加权因子。可以通过对每个色谱图的峰总数(TNP)、复合峰谷比(CPVR)以及峰容量(n')的加权值进行求和来计算混合品质因数BMF。
在另一个实施例中,可以通过针对步骤902、904和906的子例程中的每个子例程对经过分析的色谱图的顺序进行排序来计算混合排序分析。例如,表2-4示出,pH 6.5到8.4被绑定于最大TNP,pH 7.9示出最大CPVR,并且pH 8.4示出最大n'。因此,可以选择pH 8.4作为优化的色谱图,因为其在三个子例程中有两个具有初级排序。
色谱优化算法856也可以用图5的色谱数据来进行。算法856的输出在下表5中示出。
表5
NaCl浓度 | TNP | CPVR | n' |
10mM | 4 | 10.30 | 123.55 |
30mM | 5 | 11.44 | 92.91 |
60mM | 5 | 9.91 | 111.29 |
90mM | 4 | 7.37 | 128.88 |
使用混合排序分析,表5示出30mM和60mM NaCl被绑定于最大TNP,30mM NaCl示出最大CPVR,并且90mM NaCl示出最大n'。因此,可以选择30mM作为优化的色谱图,因为其在三个子例程中有两个具有初级排序。
色谱优化算法806也可以用图6的色谱数据来进行。算法806的输出在下表6中示出。
表6.
TNP | CPVR | n' | |
pH 5.6 | 14 | 8.57 | 86.25 |
pH 6.5 | 13 | 9.54 | 79.96 |
pH 7.4 | 11 | 9.61 | 66.36 |
pH 8.4 | 12 | 8.98 | 65.64 |
pH 9.3 | 10 | 7.06 | 63.58 |
pH 10.2 | 6 | 9.58 | 62.92 |
使用混合排序分析,表6示出了pH 5.6具有最大TNP,pH 7.4具有最大CPVR,并且pH5.6示出最大n'。因此,可以选择pH 5.6作为优化的色谱图,因为其在三个子例程中有两个具有初级排序。
色谱优化算法806也可以用图7的色谱数据来进行。算法806的输出在下表7中示出。
表7.
TNP | CPVR | n' | |
pH 5.6 | 7 | 17.37 | 41.369 |
pH 6.5 | 7 | 18.97 | 43.017 |
pH 7.4 | 5 | 20.28 | 42.592 |
pH 8.4 | 6 | 17.42 | 41.172 |
pH 9.3 | 6 | 16.95 | 33.551 |
pH 10.2 | 1 | n.a. | n.a. |
使用混合排序分析,表7示出了pH 5.6和6.5具有最大TNP,pH 7.4具有最大的CPVR,并且pH 6.5示出最大n'。因此,可以选择pH 6.5作为优化的色谱图,因为其在三个子例程中有两个具有初级排序。
在进行色谱优化算法806作为初始筛选之后,可以进行用于确定精细化的缓冲条件的方法1000,如图10A所示。方法1000包含在步骤1002中基于优化的盐梯度色谱图确定优化的pH值,在步骤1004中以优化的pH值运行精细化盐梯度色谱图,在步骤1006中测量每个色谱图的一个或多个峰,以及在步骤1008中进行色谱优化算法以鉴定至少一个精细化的优化的盐梯度色谱图。
在方法806中所鉴定的优化的色谱图可以用于在步骤1002中确定优化的pH值。可以基于鉴定和优化的色谱图来确定恒定的pH值。另外,精细化盐浓度范围可以基于其中峰洗脱的时间间隔来确定。精细化盐梯度具有更窄的盐浓度范围,以用于提高色谱图中所分析的峰的分辨率。经过鉴定的恒定pH可以用于进行另外的色谱图以用于精细化盐梯度,作为第二筛选阶段(步骤1004)。经过鉴定的pH值可以与在第二阶段中用于精细化盐梯度范围的洗脱液C%(CM)和洗脱液D%(DM)的特定值相关。软件程序可以生成具有相同的梯度持续时间,但具有不同的梯度起点和终点的5个后脚本序列,如表8所示。尽管表8中展示了5个后脚本序列,但程序也可以包含范围为2个或更多个的后脚本序列值。对于表8,X和Y的值可以由用户设置或可以是默认参数。在一个实施例中,X和Y的值可以是任何数字,只要条件0<X<Y<90保持为真。应当注意的是,90是示例性数字,并且当建立X和Y的边界条件时可能适合使用其它数字。在大多数情况下,X和Y值是基于前一组色谱图结果的优化的色谱图来确定的(例如,图3中pH恒定为8的色谱图)。X可以与其中第一峰洗脱的B%相对应,并且Y可以与其中最后一峰洗脱的B%相对应。可替代地,X和Y两者均可以对应B%,其中主峰洗脱以精细化主峰周围的分辨率。
表8.
可以使用表8的多种盐梯度参数来运行多个精细化色谱图,其中在此第二筛选期间对于每个色谱图而言优化的pH水平是固定的。接着,可以分析精细化盐梯度色谱图以在步骤1006中测量第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行期间的一个或多个峰。可以用优化算法806分析所得色谱图,以确定优化的精细化盐梯度色谱图以及精细化盐浓度范围(步骤1008)。现在可以输出优化的缓冲条件和/或可以用色谱系统实施所实施的优化的缓冲条件,以用于进行另外的样品分析。可替代地,可以以迭代的方式再次确定表8的X和Y值,其中可以使用表8的多种盐梯度参数来运行另一组多个色谱图,其中在第三筛选期间对于每个色谱图而言pH水平是固定的。例如,如果发现来自表8的程序3是最佳程序,则可以在更窄的操作范围内进行进一步优化,以进一步改善分离,如下表8a所示。
表8a.
现在已经描述了盐梯度优化方法,下面将描述pH梯度优化方法。图8B展示了通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法850。所述方法包含运行采用一系列恒定盐浓度的pH梯度色谱图,其中每个色谱图具有恒定盐浓度(步骤852),测量每个色谱图的一个或多个峰(步骤854),以及进行色谱优化算法以鉴定至少一个优化的pH梯度色谱图(步骤856)。
软件程序可以输出有待运行的四个色谱图的建议的pH梯度条件,其中每个色谱图使用根据表9的不同的恒定盐浓度pH值。对于pH梯度法侦察,所述方法通过保持A和B恒定,同时随时间变化C和D来定义。假设洗脱液B含有z M的电解质。流动相电解质浓度等于z*B%。对于每个程序,pH梯度条件可以是相同的。
表9
程序 | 洗脱液A% | 洗脱液B% |
I | 90-z/100 | z/100 |
II | 90-3z/100 | 3z/100 |
III | 90-6z/100 | 6z/100 |
IV | 90-9z/100 | 9z/100 |
可以使用来自表9的条件在相同的pH梯度条件下自动进行多个pH梯度色谱运行。尽管表9中展示了4个运行,但程序也可以包含范围为3个或更多个不同数量的色谱运行。在进行pH梯度色谱运行之后,可以分析色谱图以在第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。对于每个色谱图,可以确定如峰的保留时间、峰高度、峰之间的谷的高度、基线峰宽、半高峰宽等因素。
作为下一步骤,软件程序可以分析数据,以鉴定哪个程序编号或盐条件提供了生物分子样品的最佳分离。可以使用微处理器将优化的pH梯度色谱运行鉴定为使用色谱优化算法856的第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行之一。应当注意的是,对于盐梯度色谱运行和pH色谱运行(806和856)两者,色谱优化算法基本上是相同的。用于pH梯度色谱图的优化算法856以与用于盐梯度色谱图的优化算法806类似的方式进行,因为用作为优化算法的输入的第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行替换第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行。经过鉴定和优化的pH梯度色谱运行使用了优化的盐浓度值,其可以输出和/或存储在色谱系统的存储器中。在一个实施例中,色谱优化算法基于以下鉴定至少一种优化的pH梯度色谱运行:a)峰总数算法,b)峰谷算法,和/或c)峰容量算法。
在进行色谱优化算法856作为用于pH梯度色谱运行的初始筛选之后,可以进行用于确定精细化的缓冲条件的方法1050,如图10B所示。方法1050包含在步骤1052中基于优化的pH梯度色谱图确定优化的盐浓度,在步骤1054中以优化的盐浓度运行精细化pH梯度色谱图,在步骤1056中测量每个色谱图的一个或多个峰,以及在步骤1058中进行色谱优化算法以鉴定至少一个精细化的优化的pH梯度色谱图。
所鉴定的优化的色谱图可以用于确定优化的盐浓度。恒定的盐浓度可以基于经过鉴定和优化的色谱图来确定。另外,精细化pH范围可以基于其中峰洗脱的时间间隔来确定。精细化pH梯度具有更窄的pH值范围,以用于提高色谱图中所分析的峰的分辨率。经过鉴定的恒定盐浓度可以用于进行另外的色谱图以用于精细化pH梯度,作为第二筛选阶段。经过鉴定的盐浓度可以与在第二阶段中用于精细化pH梯度范围的洗脱液A%(AM)和洗脱液B%(BM)的特定值相关。软件程序可以生成具有相同的梯度持续时间,但具有不同的梯度起点和终点的5个后脚本序列,如表10所示。尽管表10中展示了5个后脚本序列,但程序也可以包含范围为2个或更多个的后脚本序列值。对于表10,X和Y的值可以由用户设置或可以是默认参数。在pH梯度方法(0<X<Y<10)中,X可以与其中第一峰洗脱的D%相对应,并且Y可以与其中最后一峰洗脱的D%相对应。
表10
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可以使用表10的多种pH梯度参数来运行多个精细化色谱图,其中在此第二筛选期间对于每个色谱图而言优化的盐浓度水平是固定的。接着,可以分析精细化pH梯度色谱图以在第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰。可以用优化算法856分析所得色谱图,以确定优化的精细化pH梯度色谱图以及精细化pH范围。现在可以输出优化的缓冲条件和/或可以用色谱系统实施所实施的优化的缓冲条件,以用于进行另外的样品分析。可替代地,可以以迭代的方式再次确定表10的X和Y值,其中可以使用表10的多种盐梯度参数来运行另一组多个色谱图,其中在第三筛选期间对于每个色谱图而言盐浓度是固定的。例如,如果发现来自表10的程序3是最佳程序,则可以在更窄的操作范围内进行进一步优化,以进一步改善分离,如下表10a所示。
表10a.
实例1-在阳离子交换柱上在各种pH条件下使用盐梯度的mAb样品的色谱图
以与图1类似的方式设置赛默飞世尔科技公司Vanquish Flex液相色谱系统100(Thermo Scientific Vanquish Flex liquid chromatography system)(可从德国格梅尔林的Dionex Softron GmbH商购获得)。赛默飞世尔科技公司Vanquish F自动进样器(可从德国格梅尔林的Dionex Softron GmbH商购获得)与系统一起使用,并且配置成具有25μL样品环。将阳离子交换色谱柱118(赛默飞世尔科技公司ProPac WCX-10柱,10微米粒径直径,弱阳离子交换基团,4×150mm—直径×长度)安装到系统100中。使用四元泵(106,108,110)将4个不同的储存器(102A,102B,102C,102D)的组合泵送到色谱柱以用于生成流动相。将泵流速设置为1毫升/分钟。将柱118放置于约30℃的温度下操作的热室中。检测器120(Vanquish F,赛默飞世尔科技戴安公司(Thermo Scientific Dionex),森尼维耳市,加利福尼亚州,美国)呈UV-VIS分光光度计的形式,并且设置为280纳米的波长。在检测器120之后,放置pH和电导率传感器140(UltiMate 3000PCM-3000,赛默飞世尔科技戴安公司,森尼维耳市,加利福尼亚州,美国)以监测洗脱液的pH。
四个流动相储存器(102A,102B,102C,102D)分别含有以下洗脱溶液。洗脱液A:去离子水;洗脱液B:4M氯化钠的水溶液;洗脱液C:pH为5.6的160mM MES、100mM MOPS、120mMTAPS、100mM CAPSO的水溶液;洗脱液D:pH为10.2的100mM MES、120MOPS、140mM TAPS、160mMCAPSO的水溶液。泵被配置成使用一定比例的四种洗脱溶液来提供盐梯度流动相。通过在15分钟时间段内将电解质浓度从0线性地变化到200mM NaCl(90%A+0%B到70%A+20%B)来建立盐梯度。将A%和B%的总和设置为等于90%。用5.6、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的各种恒定pH值运行盐梯度。修改流动相C和流动相D的比例以获得不同的pH条件,同时维持C%和D%的总和等于10%。应当注意的是,在此实例中,C%和D%在每个色谱运行期间保持恒定。
尽管A+B的条件已经设置为90%,并且C+D=10%,但A+B和C+D的总和可以各自设置为其它值,只要C+D的总和足以缓冲流动相。
图4示出了pH轨迹,所述pH轨迹监测洗脱液C和D的各种组合在pH传感器140处的pH。图3示出了使用盐梯度将含有浓度为5mg/mL的mAb(利妥昔单抗(Rituximab)生物仿制药)的样品分离的多个色谱图,其中每个色谱图使用不同的pH值运行。在更高的pH值下,峰分辨率通常会提高。
实例2-在阳离子交换柱上在各种盐条件下使用pH梯度的mAb样品的色谱图
在此实例中使用了与实例1类似的液相色谱系统。相比于实例1的盐梯度,此实例使用了通过在15分钟时间段内从pH 5.6到10.2线性地变化缓冲液储存器10%C+0%D到0%C+10%D的pH梯度。将C%和D%的总和设置为等于10%。用10、30、60和90mM NaCl的各种恒定电解质值运行pH梯度。修改流动相A和流动相B的比例以获得不同的盐浓度,同时维持C%和D%的总和等于10%。应当注意的是,在此实例中,A%和B%在每个色谱运行期间保持相对恒定。表11示出了允许不同盐浓度的A和B的比例。
表11.
洗脱液A% | 洗脱液B% | NaCl(mM) |
89 | 1 | 10 |
87 | 3 | 30 |
84 | 6 | 60 |
81 | 9 | 90 |
图5示出了使用pH梯度将含有浓度为5mg/mL的mAb(利妥昔单抗生物仿制药)的样品分离的多个色谱图,其中每个色谱图使用不同的盐浓度运行。
实例3-在阴离子交换柱上在各种pH条件下使用盐梯度的卵白蛋白样品的色谱图
在此实例中使用了与实例1类似的液相色谱系统,除了将阴离子交换色谱柱118(赛默飞世尔科技公司ProPac SAX-10柱,10微米粒径直径,季胺阴离子交换基团,4×250mm—直径×长度)安装到系统100中。与实例1类似,此实例使用了通过在20分钟时间段内将盐浓度从20mM线性地变化到500mM(88%A+2%B到40%A+50%B)的盐梯度。将A%和B%的总和设置为等于90%。用5.6、6.5、7.4、8.4、9.3和10.2的各种恒定pH值运行盐梯度,如图6所示。修改流动相A和流动相B的比例以获得不同的盐浓度,同时维持C%和D%的总和等于10%。应当注意的是,在此实例中,C%和D%在色谱运行期间保持恒定。图6示出了使用盐梯度在5mg/mL的浓度下分离含有卵白蛋白的样品的多个色谱图,其中每个色谱图使用不同的pH值运行。在更低的pH值下,峰分辨率通常会提高。
实例4-在疏水相互作用柱上在各种pH条件下使用盐梯度的mAb样品的色谱图
在此实例中使用了与实例1类似的液相色谱系统。相比于实例1的阳离子交换色谱柱,此实例使用疏水相互作用色谱柱(赛默飞世尔科技公司MAbPac HIC-Butyl柱,5μm粒径直径,4.6mm×100mm)。梯度是通过表12中所提供的参数针对pH 5.6条件而配置的。对于其它pH条件,流动相A和流动相B以及时间的参数是相同的,而只有C和D的比例发生变化。
表12.
时间 | A% | B% | C% | D% |
-5.0 | 0 | 90 | 10 | 0 |
0.0 | 0 | 90 | 10 | 0 |
1.0 | 0 | 90 | 10 | 0 |
15.0 | 90 | 0 | 10 | 0 |
20.0 | 90 | 0 | 10 | 0 |
将单克隆抗体样品(利妥昔单抗生物仿制药)注入到色谱系统中。最高峰被指定为主峰。在主峰前面的前一峰被指定为亲水性变体。比主峰晚洗脱的后一峰被指定为疏水性变体(图7)。在此实例中,亲水变体和疏水变体的分离受到所使用的pH条件的影响。可以使用此方法选择最佳分离pH条件,所述条件是pH 5.6。
尽管本文中已经示出并且描述了本发明的优选实施例,但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是,此类实施例仅通过举例的方式提供。在不背离本发明的情况下,本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。尽管已经依据特定变化和说明性附图描述了本发明,但是本领域的普通技术人员将认识到,本发明不限制于所描述的变化或附图。另外,当上文所描述的方法和步骤表明某些事件以某种顺序发生时,本领域的普通技术人员将认识到,可以修改某些步骤的顺序,并且此类修改是根据本发明的变化进行的。另外,如上文所描述的,在可能的情况下可以在并行过程中同时进行所述步骤中的某些步骤,以及依次进行。因此,在本发明的变化处于本公开的精神内或等同于权利要求书中发现的发明的程度上,意图是此专利也将涵盖这些变化。
Claims (14)
1. 一种使用盐梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法,所述方法包括:
A)分别使用具有第一恒定pH值、第二恒定pH值和第三恒定pH值的流动相进行第一盐梯度色谱运行、第二盐梯度色谱运行和第三盐梯度色谱运行以分析生物分子,其中具有所述第一恒定pH值、所述第二恒定pH值和所述第三恒定pH值的所述流动相是分别用第一预定比例、第二预定比例和第三预定比例的第一洗脱溶液和第二洗脱溶液制备的,其中所述第一预定比例、所述第二预定比例和所述第三预定比例是不同的,其中所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行各自使用相同的盐梯度浓度范围、相同的梯度时间和相同的盐梯度浓度变化率,其中
a)所述第一洗脱溶液包括至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在6到10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第一洗脱溶液具有为6的第一pH,
b)所述第二洗脱溶液包括至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,在6到10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第二洗脱溶液具有为10的第二pH ;
B)在所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行期间测量一个或多个峰;以及
C)对所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行色谱优化算法,以从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行,
其中所述进行所述色谱优化算法从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行,其中所述色谱优化算法包括:
a)峰总数算法,所述峰总数算法包括:
a1)统计所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行所测得的峰的总数;以及
a2)将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大的峰总数;
b)峰谷算法,所述峰谷算法包括:
b1)计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的前一峰谷比,所述计算所述前一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰,其中所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应;
ii)鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰,其中所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间;
iii)鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷,其中所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间;以及
iv)将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的前一峰谷比;
b2)计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的后一峰谷比,所述计算所述后一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰,其中所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间;以及
ii)鉴定所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间;
iii)将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的后一峰谷比;
b3)将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的乘积;
b4)计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的复合峰谷比;以及
b5)将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比;以及
c)峰容量算法,所述峰容量算法包括:
c1)基于一方程式计算所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的每个盐梯度色谱运行的峰容量,所述方程式包括:,其中n'是所述峰容量,t g 是梯度时间,PWHH M 是所述主峰的半高峰宽;以及
c2)将所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的至少一个盐梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量,
其中所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的盐梯度色谱运行:a)所述峰总数算法,b)所述峰谷算法,以及c)所述峰容量算法。
2.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括:
D)在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大峰总数的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第一区域中;
E)在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第二区域中;以及
F)在显示屏上,输出与所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第三区域中。
3.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括:
D)基于所述第一盐梯度色谱运行、所述第二盐梯度色谱运行和所述第三盐梯度色谱运行中的所述至少一个优化的盐梯度色谱运行确定优化的恒定pH值;
E)使用全部具有所述优化的恒定pH值的流动相进行第一精细化盐梯度色谱运行、第二精细化盐梯度色谱运行和第三精细化盐梯度色谱运行以分析所述生物分子,其中所述流动相是用相同比例的所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液制备的,其中所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行分别使用第一盐浓度变化率、第二盐浓度变化率和第三盐浓度变化率以及相同的梯度时间,其中所述第一盐浓度变化率、所述第二盐浓度变化率和所述第三盐浓度变化率是不同的,其中具有所述第一盐浓度变化率、所述第二盐浓度变化率和所述第三盐浓度变化率的所述流动相是用不同比例的水和盐溶液制备的;
F)在所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行期间测量一个或多个峰;以及
G)对所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行精细化色谱优化算法,以从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行,
其中所述进行所述色谱优化算法从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定所述至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述精细化色谱优化算法包括:
a)精细化峰总数算法,所述精细化峰总数算法包括:
a1)统计所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行所测得的所述峰的总数;以及
a2)将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大峰总数;
b)精细化峰谷算法,所述精细化峰谷算法包括:
b1)计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的前一峰谷比,所述计算所述前一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰,其中所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应;
ii)鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰,其中所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间;
iii)鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷,其中所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间;以及
iv)将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的前一峰谷比;
b2)计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的后一峰谷比,所述计算所述后一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰,其中所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间;以及
ii)鉴定所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间;
iii)将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的后一峰谷比;
b3)将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的乘积;
b4)计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的复合峰谷比;以及
b5)将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比;以及
c)精细化峰容量算法,所述精细化峰容量算法包括:
c1)基于方程式计算所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的每个精细化盐梯度色谱运行的峰容量,所述方程式包括:,其中n'是所述峰容量,t g 是梯度时间,PWHH M 是所述主峰的半高峰宽;以及
c2)将所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中的至少一个精细化盐梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量,
其中所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化盐梯度色谱运行:a)所述精细化峰总数算法,b)所述精细化峰谷算法,以及c)所述精细化峰容量算法。
5.根据权利要求4所述的方法,其进一步包括:
H)在显示屏上,输出与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大峰总数的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第一区域中;
E)在显示屏上,输出与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第二区域中;以及
F)在显示屏上,输出与所述第一精细化盐梯度色谱运行、所述第二精细化盐梯度色谱运行和所述第三精细化盐梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个精细化盐梯度色谱运行相对应的至少一个优化的pH值到所述显示屏的第三区域中。
6.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于25毫摩尔。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于250毫摩尔。
8.一种使用pH梯度通过色谱柱确定用于分析生物分子的缓冲条件的方法,所述方法包括:
A)分别使用具有第一恒定盐浓度、第二恒定盐浓度和第三恒定盐浓度的流动相进行第一pH梯度色谱运行、第二pH梯度色谱运行和第三pH梯度色谱运行以分析生物分子,其中具有所述第一恒定盐浓度、所述第二恒定盐浓度和所述第三恒定盐浓度的所述流动相是分别用第一预定比例、第二预定比例和第三预定比例的水和盐溶液制备的,其中所述第一预定比例、所述第二预定比例和所述第三预定比例是不同的,其中所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行各自使用相同的pH梯度浓度范围、相同的梯度时间和相同的pH梯度浓度变化率,其中用于所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行的所述流动相是用第一洗脱溶液和第二洗脱溶液制备的:
a)所述第一洗脱溶液包括至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,在6到10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第一洗脱溶液具有为6的第一pH,
b)所述第二洗脱溶液包括至少四种缓冲盐,其中所述四种缓冲盐中的至少三种缓冲盐是单价缓冲盐,其在6到10的pH范围内具有净负电荷或净中性两性离子电荷,并且包含磺酸根基团和胺,其中所述第二洗脱溶液具有为10的第二pH;
B)在所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰;以及
C)对所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行色谱优化算法,以从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行,
其中所述进行所述色谱优化算法从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行,其中所述色谱优化算法包括:
a)峰总数算法,所述峰总数算法包括:
a1)统计所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行所测得的峰总数;以及
a2)将所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的至少一个pH梯度色谱运行鉴定为具有最大峰总数;
b)峰谷算法,所述峰谷算法包括:
b1)计算所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的前一峰谷比,所述计算所述前一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰,其中所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应;
ii)鉴定所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰,其中所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间;
iii)鉴定所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷,其中所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间;以及
iv)将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的前一峰谷比;
b2)计算所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的后一峰谷比,所述计算所述后一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰,其中所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间;以及
ii)鉴定所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间;
iii)将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的后一峰谷比;
b3)将所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的乘积;
b4)计算所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的复合峰谷比;以及
b5)将所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的至少一个pH梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比;以及
c)峰容量算法,所述峰容量算法包括:
c1)基于方程式计算所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的每个pH梯度色谱运行的峰容量,所述方程式包括:,其中n'是所述峰容量,t g 是梯度时间,PWHH M 是所述主峰的半高峰宽;以及
c2)将所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的至少一个pH梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量,
其中所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的pH梯度色谱运行:a)所述峰总数算法,b)所述峰谷算法,以及c)所述峰容量算法。
9.根据权利要求8所述的方法,其进一步包括:
D)在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大峰总数的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第一区域中;
E)在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第二区域中;以及
F)在显示屏上,输出与所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第三区域中。
10.根据权利要求8所述的方法,其进一步包括:
D)基于所述第一pH梯度色谱运行、所述第二pH梯度色谱运行和所述第三pH梯度色谱运行中的所述至少一个优化的pH梯度色谱运行确定优化的恒定盐浓度;
E)使用全部具有所述优化的恒定盐浓度的流动相进行第一精细化pH梯度色谱运行、第二精细化pH梯度色谱运行和第三精细化pH梯度色谱运行以分析所述生物分子,其中所述流动相是用相同比例的所述水和所述盐溶液制备的,其中所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行分别使用第一pH变化率、第二pH变化率和第三pH变化率以及相同的梯度时间,其中所述第一pH变化率、所述第二pH变化率和所述第三pH变化率是不同的,其中具有所述第一pH变化率、所述第二pH变化率和所述第三pH变化率的所述流动相是用不同比例的所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液制备的;
F)在所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行期间测量一个或多个峰;以及
G)对所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行的测得的一个或多个峰进行精细化色谱优化算法,以从所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行,
其中所述进行所述色谱优化算法从所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述精细化色谱优化算法包括:
a)精细化峰总数算法,所述精细化峰总数算法包括:
a1)统计所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行所测得的所述峰的总数;以及
a2)将所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的至少一个精细化pH梯度色谱运行鉴定为具有最大峰总数;
b)精细化峰谷算法,所述精细化峰谷算法包括:
b1)计算所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的前一峰谷比,所述计算所述前一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的具有主峰保留时间的主峰,其中所述主峰的主峰高度与检测到的信号的最高绝对量值相对应;
ii)鉴定所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的具有前一峰保留时间和前一峰高度的前一峰,其中所述前一峰与所述主峰相邻,并且所述前一峰保留时间小于所述主峰保留时间;
iii)鉴定所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的具有前一谷保留时间和前一谷高度的前一谷,其中所述前一谷位于所述主峰与所述前一峰之间;以及
iv)将所述主峰高度除以所述前一谷高度以形成所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的前一峰谷比;
b2)计算所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的后一峰谷比,所述计算所述后一峰谷比包括:
i)鉴定所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的具有后一峰保留时间和后一峰高度的后一峰,其中所述后一峰与所述主峰相邻,并且所述后一峰保留时间大于所述主峰保留时间;以及
ii)鉴定所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的具有后一谷保留时间和后一谷高度的后一谷,其中所述后一谷位于所述主峰与所述后一峰之间;
iii)将所述主峰高度除以所述后一谷高度以形成所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的后一峰谷比;
b3)将所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的所述前一峰谷比分别乘以所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的所述后一峰谷比,以形成所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的乘积;
b4)计算所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的所述乘积的平方根,以形成所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的复合峰谷比;以及
b5)将所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的至少一个精细化pH梯度色谱运行鉴定为具有最大复合峰谷比;以及
c)精细化峰容量算法,所述精细化峰容量算法包括:
c1)基于方程式计算所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的每个精细化pH梯度色谱运行的峰容量,所述方程式包括:,其中n'是所述峰容量,t g 是梯度时间,PWHH M 是所述主峰的半高峰宽;以及
c2)将所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中的至少一个精细化pH梯度色谱运行鉴定为具有最大峰容量,
其中所述进行所述色谱优化算法基于以下从所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中鉴定至少一个优化的精细化pH梯度色谱运行:a)所述精细化峰总数算法,b)所述精细化峰谷算法,以及c)所述精细化峰容量算法。
12.根据权利要求11所述的方法,其进一步包括:
H)在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大峰总数的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第一区域中;
E)在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大复合峰谷比的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第二区域中;以及
F)在显示屏上,输出与所述第一精细化pH梯度色谱运行、所述第二精细化pH梯度色谱运行和所述第三精细化pH梯度色谱运行中具有所述最大峰容量的所述至少一个精细化pH梯度色谱运行相对应的至少一个优化的盐浓度到所述显示屏的第三区域中。
13.根据权利要求8所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于25毫摩尔。
14.根据权利要求8所述的方法,其中所述第一洗脱溶液和所述第二洗脱溶液两者的总缓冲盐浓度均大于250毫摩尔。
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