CN112794877A - 一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 - Google Patents
一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112794877A CN112794877A CN202110120701.9A CN202110120701A CN112794877A CN 112794877 A CN112794877 A CN 112794877A CN 202110120701 A CN202110120701 A CN 202110120701A CN 112794877 A CN112794877 A CN 112794877A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mucus
- snakehead
- freeze
- antibacterial peptide
- collecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 title claims abstract description 114
- 241001597062 Channa argus Species 0.000 title claims abstract description 77
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 62
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 18
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 11
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 30
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 25
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 241001417978 Channidae Species 0.000 claims description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 14
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 10
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920000715 Mucilage Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 abstract description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 12
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 abstract description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 abstract 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 abstract 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 abstract 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 16
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 10
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 7
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 102000014133 Antimicrobial Cationic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010050820 Antimicrobial Cationic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- -1 flavoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/195—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物提取技术领域，涉及一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。制备步骤如下：收集乌鳢背部表皮的黏液，进行水浴加热，然后经冷却、离心收集上清液；预冷冻后，冻干得到乌鳢表皮黏液的冻干粉；采用Sephadex G‑100凝胶柱对冻干粉进行纯化，然后收集产物在280nm下检测吸光值，收集组分，经冻干得到冻干的组分；再采用阳离子交换柱进一步纯化，收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到乌鳢表皮黏液抗菌肽；本发明工艺简单且成本较低，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抑制效果，具有广谱抑菌性，可用于制备鱼类防腐剂或饲料添加剂，有助于实现乌鳢加工副产物高值化利用。
Description
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是广泛分布于哺乳动物，两栖动物，昆虫或其他无脊椎动物中的一类具有抗菌活性的多肽类物质，也称为宿主防御肽，是先天免疫系统的重要组成部分。AMP通常在10至50个氨基酸之间，净正电荷为2至8，对多种微生物包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，真菌，病毒和寄生虫表现出广泛的活性，且毒性很小或没有毒性。抗菌肽具有热稳定性、广谱抑菌及不易产生耐药性等优点，研究发现其具有代替传统抗生素的潜力。
鱼类抗菌肽是鱼体非特异性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或受到病原侵袭时，能迅速产生抗菌肽杀伤病原微生物防御入侵。鱼的天然免疫力与唾液、黏液、循环系统和其他易受病原体影响的系统中抗微生物肽(AMPs)的分泌有关。皮肤粘液为鱼类提供了抵抗水生微生物的第一道防线，除了充当鱼类与其水生环境之间的物理屏障之外，皮肤粘液还具有通过一系列先天免疫因子(如溶菌酶，凝集素，蛋白水解酶，黄素酶，免疫球蛋白和C反应蛋白)介导的抗菌活性，因此，从鱼类皮肤粘液中提取抗菌肽是获得抗菌肽的有效途径。
关于抗菌肽提取制备方法主要有直接浸提法、酶解制备法、化学合成法和工程菌表达法。化学合成法目前为抗菌肽生产中较为常见的方法，但人工合成抗菌肽成本较高，使其难以批量用于生活、养殖等低成本生产中。乌鳢俗称黑鱼，是一种经济价值和营养医学价值较高的淡水名贵鱼类，随着乌鳢养殖业的发展，在乌鳢加工过程中产生大量黏液未被有效利用，既浪费了生物资源，也对生态环境产生了巨大压力；因此，寻找简单高效的提取方法，从乌鳢表皮黏液中提取抗菌物质是亟需解决的技术问题，这有助于提高乌鳢的副产物加工和综合利用、实现废弃物料高值化利用、减少环境污染、促进乌鳢的可持续发展。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题与不足，本发明的首要目的在于提供一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法。创建了无酸碱预处理的乌鳢黏液抗菌物质提取技术，以期得到一种绿色清洁的黏液抗菌物质提取方法。
本发明的目的通过以下方案实现：
一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)乌鳢前处理：收集乌鳢表皮的黏液，备用；
(2)热处理：将步骤(1)收集得到的乌鳢表皮的黏液进行水浴加热，得到热处理的黏液；
(3)离心：将步骤(2)中热处理的黏液冷却至一定温度后，离心收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液进行预冷冻后，再采用真空冷冻干燥机进行干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液的冻干粉，即为粗提物；
(5)采用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中的冻干粉进行纯化，然后用蒸馏水洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经冻干处理，得到冻干的组分；
(6)采用阳离子交换柱对步骤(5)中得到冻干的组分进一步纯化，使用磷酸盐缓冲液线性洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到的产物即为乌鳢表皮黏液抗菌肽。
优选的，步骤(1)中所述收集乌鳢表皮的黏液的具体操作为：将新鲜乌鳢受伤处理后、洗净，置于水中，每隔1-2小时用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背收集黏液；未收集乌鳢腹侧皮肤的粘液，以避免肠和精子污染。
优选的，步骤(2)中所述水浴加热的温度为50～80℃，加热时间为5～10min。
优选的，步骤(3)中所述冷却至一定温度为5℃以下；所述离心的条件为：离心转速为6000～8000r/min，离心时间为20～40min。
优选的，步骤(4)中所述预冷冻的温度为-40℃，时间为5～7h。
优选的，步骤(5)中，所述纯化时上样的样品为冻干粉与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL；所述纯化的柱规格为1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为2-5mL。
优选的，步骤(6)中，所述纯化时上样的样品为冻干的组分与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL；所述纯化的柱规格为1.2cm×50cm，流速为0.8-1.5mL/min；所述磷酸盐缓冲液线性洗脱时的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为40-50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.0–6.5；所述洗脱液B是在洗脱液A中加入NaCl，NaCl的终浓度为0.5-1.0M。
本发明制备的乌鳢表皮黏液抗菌肽用于制备免疫制剂或饲料添加剂的用途；所述乌鳢表皮黏液抗菌肽制备的免疫制剂或饲料添加剂能够抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长活性；具体包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
乌鳢表皮黏液抗菌肽活性测定方法包括：琼脂扩散法测定抑菌圈判断抑菌效果，生长曲线判断对测试菌的生长抑制作用；
(1)琼脂板法测定抑菌圈：以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为供试菌株，将保存好的上述菌株分别接种到营养肉汤培养基中，在37℃下培养过夜。再以2％的接种量重新接种，在37℃、160r/min摇床中培养12h。调整细菌浓度为1×106CFU/mL备用。用琼脂扩散法检验提取物的抑菌活性强度。培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20mL置于平板中作为底层，使其在皿底内均匀推布，凝固后，另取培养基适量加热融化后分别在平皿中加入待测菌悬液摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后在平皿中放入已消毒的牛津杯，取出牛津杯后形成样空。以无菌超纯水作为阴性对照，以乌鳢表皮黏液提取物作为实验组，将样液分别加入到牛津杯孔中，盖上培养皿盖。在37℃下过夜培养。观察结果，用游标卡尺准确测量其抑菌圈直径大小。
(2)生长曲线：在对数中期中收集大肠杆菌及金黄色葡萄球菌细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，并以1×10 6CFU/mL悬浮在新鲜的营养肉汤培养基中。将100μL重悬的细菌与热处理黏液在96孔板中分别以MIC(最小抑菌浓度)、2倍MIC的终浓度孵育，并将相同体积的PBS缓冲液用作阴性对照。每2小时测量一次OD 595，在37℃下最多测量12小时。
本发明相对于现有技术，具有如下优点和有益效果：
(1)本发明提供了一种乌鳢表皮黏液抗菌肽，经实验证明可有效抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长活性，可以应用于制备鱼类尤其是乌鳢免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用前景；
(2)本发明采用凝胶层析技术及离子层析技术对提取物质进行分离纯化，根据被洗脱样品相对分子量及所带电荷量差异进行分离，将样品配制成10mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜离心上样，使用蒸馏水做洗脱剂，经280nm下紫外检测后洗脱得到组分，然后用阳离子交换柱进一步分离纯化，使用磷酸盐缓冲液作为洗脱剂，在280nm下紫外检测洗脱得到组分，筛选得到三个组分，均对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有良好的抑制效果，其中一个组分对大肠杆菌的抑菌圈直径为22.36mm，表现出优异的抗菌活性。
(3)本发明中以乌鳢表皮黏液为原料制备抗菌肽，创建了无酸碱预处理的乌鳢黏液抗菌物质提取技术，制备方法工艺简单且成本较低，易于工业化大规模生产，有效提高乌鳢加工和综合利用问题、实现废弃物料高值化利用、减少环境污染、促进乌鳢的可持续发展。
附图说明
图1为本发明中实施例2得到的粗提物的抑菌活性效果图，其中A大肠杆菌、B金黄色葡萄球菌；
图2为实施例2中A图为热处理的黏液对大肠杆菌的生长抑制效果图；B图为热处理的黏液对金黄色葡萄球菌生长抑制效果图；
图3为实施例2中A图为不同浓度的热处理的黏液对大肠杆菌的生长抑菌效果图；B图为不同浓度热处理的黏液对金黄色葡萄球菌的生长抑菌效果图；
图4为实施例2中阳离子交换层析图；
图5为实施例2中交换层析收集组分的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步的详细的说明，但本发明的实施方式不限于此；应当理解，此处所描述的实施例仅用于解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
实施例1：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热5min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为8000r/min，离心时间为20min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h，再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量2mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为0.8mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冷冻干燥，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)中抗菌活性最高的肽组分进一步纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.0的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl的终浓度为0.2M，线性梯度洗脱，流速为0.8mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，再进行透析脱盐，冻干，得到乌鳢表皮黏液抗菌肽；
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为19.22mm。
实施例2：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热10min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为6000r/min离心时间为40min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h,再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，即得乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量4mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)中的冻干组分进一步纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.0的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl终浓度为0.5M，线性梯度洗脱，流速为1.0mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗菌组分即为乌鳢表皮黏液抗菌肽；
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为22.36mm；
图2实验操作：在对数中期中收集大肠杆菌及金黄色葡萄球菌细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，调整菌液浓度为1×10 6CFU/mL；
A图中：取100ul大肠杆菌菌液在96孔板，分成四组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；然后分别加入100ul水、营养肉汤培养基、热处理的黏液和未进行热处理的黏液；水加入Ⅰ组记为water组(water)，营养肉汤培养基加入Ⅱ组记为LB组(LB)，热处理的黏液加入Ⅲ组记为Heat-treated mucus组(Heat-treated mucus)，未进行热处理的黏液,加入Ⅳ组记为Mucus组(Mucus)；然后进行共同孵育，每2个小时测定OD600的值，结果如图2所示；
B图中：取100ul金黄色葡萄球菌在96孔板，分成四组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ；然后分别对应加入100ul水、营养肉汤培养基、热处理的黏液和未进行热处理的黏液；水加入Ⅰ组记为water组(water)，营养肉汤培养基加入Ⅱ组记为LB组(LB)，热处理的黏液加入Ⅲ组记为Heat-treated mucus组(Heat-treated mucus)，未进行热处理的黏液,加入Ⅳ组记为Mucus组(Mucus)；然后进行共同孵育，每2个小时测定OD600的值，结果如图2所示；
图3实验操作：在对数中期中收集大肠杆菌及金黄色葡萄球菌细胞，用PBS缓冲液洗涤三次，调整菌液浓度为1×10 6CFU/mL；
A图中：取100ul大肠杆菌菌液在96孔板，分成五组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ；然后分别对应加入100ul的水、营养肉汤培养基、不同浓度热处理黏液(使用无菌水调整浓度分别为5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL)；水加入Ⅰ组记为water组(water)，营养肉汤培养基加入Ⅱ组记为LB组(LB)，然后进行共同孵育，每2个小时测定OD600的值，结果如图3所示；B图中：取100ul金黄色葡萄球菌在96孔板，分成五组，分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V；然后分别对应加入100ul的水、营养肉汤培养基、不同浓度热处理黏液(使用无菌水调整浓度分别为5mg/mL、25mg/mL、50mg/mL)；水加入Ⅰ组记为water组(water)，营养肉汤培养基加入Ⅱ组记为LB组(LB)，然后进行共同孵育，每2个小时测定OD600的值，结果如图3所示；
由图1-3可知，通过琼脂扩散法测定粗提物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的生长均具有一定抑制作用，热处理能够有效提高抑菌效果，且随着浓度增加抑菌圈直径逐渐增加。
由图4和5可知，通过阳离子交换层析分离纯化得到三个组分，经透析脱盐、冻干，得到乌鳢表皮黏液抗菌肽，分别记为F1、F2和F3，通过抑菌活性实验可知，F1、F2和F3均有良好的抑菌效果；其中F3对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制活性最好，其中对大肠杆菌的抑菌圈直径为22.36mm。
实施例3：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热5min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为7000r/min离心时间为30min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h，再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为10mg/mL)，流速为1.2mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冷冻干燥，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)的冻干组分进一步纯化；将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.0的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl终浓度为1M，线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗菌组分即为乌鳢表皮黏液抗菌肽；
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为21.04mm。
实施例4：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热10min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为8000r/min离心时间为30min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h,再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量4mL(上样浓度为15mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冷冻干燥，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)中的冻干组分进一步纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.5的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl终浓度为0.2M，线性梯度洗脱，流速为1.0mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗菌组分即为乌鳢表皮黏液抗菌肽；
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为18.72mm。
实施例5：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热10min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为6000r/min离心时间为40min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h，再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为15mg/mL)，流速为1.0mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)中的冻干组分进一步纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.5的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl终浓度为0.5M，线性梯度洗脱，流速为1.2mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗菌组分即为乌鳢表皮黏液抗菌肽；
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为22.04mm。
实施例6：
(1)乌鳢前处理：对新鲜乌鳢鱼背进行受伤处理，用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背，每隔2小时收集黏液备用；
(2)热处理：将收集得到的乌鳢表皮黏液立即置于热水中加热8min；
(3)离心：将步骤(2)中热水加热的黏液冷却至5℃以下，对热处理的黏液进行高速离心处理，转速为7000r/min离心时间为30min，收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液放入-40℃冰箱预冷冻6h,再采用全自动真空冷冻干燥机干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液冻干粉，即为粗提物；
(5)使用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中冻干粉进行纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，柱规格1.2cm×70cm，上样量5mL(上样浓度为20mg/mL)，流速为1.2mL/min，蒸馏水洗脱，280nm下检测吸光值，收集组分，冻干，得到冻干组分，进行抗菌活性测定，得到冻干组分的抗菌活性结果；
(6)使用阳离子交换柱对(5)中的冻干组分进一步纯化，将冻干粉溶于蒸馏水，制备成浓度为10mg/mL的混合液进行上样；柱规格1.2cm×50cm，洗脱液包括：洗脱液A为pH为6.5的50mM磷酸盐缓冲液，洗脱液B为A基础上加入NaCl，NaCl终浓度为1.0M线性梯度洗脱，流速为1.5mL/min，280nm下检测吸光值，收集组分，透析脱盐，冻干备用，活性最高的抗菌组分即为乌鳢表皮黏液抗菌肽。
(7)经琼脂扩散法测定步骤(6)中乌鳢表皮黏液抗菌肽的抑菌圈直径为20.86mm。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)乌鳢前处理：收集乌鳢表皮的黏液，备用；
(2)热处理：将步骤(1)收集得到的乌鳢表皮的黏液进行水浴加热，得到热处理的黏液；
(3)离心：将步骤(2)中热处理的黏液冷却至一定温度后，离心收集上清液；
(4)冷冻干燥保存：将步骤(3)中收集得到的上清液进行预冷冻后，再采用真空冷冻干燥机进行干燥制粉，得到乌鳢表皮黏液的冻干粉，即为粗提物；
(5)采用Sephadex G-100凝胶柱对步骤(4)中的冻干粉进行纯化，然后用蒸馏水洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经冻干处理，得到冻干的组分；
(6)采用阳离子交换柱对步骤(5)中得到冻干的组分进一步纯化，使用磷酸盐缓冲液线性洗脱，洗脱后收集产物在280nm下检测吸光值，最后收集组分，经透析脱盐、冻干，得到的产物即为乌鳢表皮黏液抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述收集乌鳢表皮的黏液的具体操作为：将新鲜乌鳢受伤处理后、洗净，置于水中，每隔1-2小时用塑料刮刀轻轻刮擦鱼背收集黏液；未收集乌鳢腹侧皮肤的粘液，以避免肠和精子污染。
3.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述水浴的温度为50～80℃，时间为5～10min。
4.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷却至一定温度为5℃以下；所述离心的条件为：离心转速为6000～8000r/min，离心时间为20～40min。
5.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述预冷冻的温度为-40℃，时间为5～7h。
6.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述纯化时上样的样品为冻干粉与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL；所述纯化的柱规格为1.2cm×70cm，流速为0.8-1.2mL/min，上样体积为2-5mL。
7.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述纯化时上样的样品为冻干的组分与蒸馏水的混合溶液，样品浓度为10～20mg/mL。
8.根据权利要求1所述的乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述纯化的柱规格为1.2cm×50cm，流速为0.8-1.5mL/min；所述磷酸盐缓冲液线性洗脱时的洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B；所述洗脱液A为40-50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.0–6.5；所述洗脱液B是在洗脱液A中加入NaCl，NaCl的终浓度为0.5-1.0M。
9.根据权利要求1-8任一所述方法制备的乌鳢表皮黏液抗菌肽用于制备免疫制剂或饲料添加剂的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述乌鳢表皮黏液抗菌肽制备的免疫制剂或饲料添加剂能够抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的生长活性。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110120701.9A CN112794877A (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110120701.9A CN112794877A (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112794877A true CN112794877A (zh) | 2021-05-14 |
Family
ID=75812561
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110120701.9A Pending CN112794877A (zh) | 2021-01-28 | 2021-01-28 | 一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112794877A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111171132A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 华南农业大学 | 乌鳢抗菌肽 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101348519A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-01-21 | 淮海工学院 | 黄鳝抗菌肽的制备工艺及应用 |
| CN111171132A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 华南农业大学 | 乌鳢抗菌肽 |
-
2021
- 2021-01-28 CN CN202110120701.9A patent/CN112794877A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101348519A (zh) * | 2008-09-05 | 2009-01-21 | 淮海工学院 | 黄鳝抗菌肽的制备工艺及应用 |
| CN111171132A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 华南农业大学 | 乌鳢抗菌肽 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 伍晓云等: "乌鳢体表粘液抗菌肽的制备、抑菌活性验证及机理研究", 中国食品科学技术学会第十七届年会摘要集 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111171132A (zh) * | 2020-02-07 | 2020-05-19 | 华南农业大学 | 乌鳢抗菌肽 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhunia et al. | Purification, characterization and antimicrobial spectrum of a bacteriocin produced by Pediococcus acidilactici | |
| Zeya et al. | Arginine-rich proteins of polymorphonuclear leukocyte lysosomes: antimicrobial specificity and biochemical heterogeneity | |
| CN101294188B (zh) | 乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与它们的用途 | |
| CN106701610B (zh) | 一种多粘类芽孢杆菌及其培养方法和应用 | |
| CN107460145B (zh) | 海洋解淀粉芽孢杆菌bmf01及其抗菌蛋白的分离方法及产品 | |
| CN103275191B (zh) | 一种大量快速提取鲎素肽的方法 | |
| CN106701833B (zh) | 一种抑菌的类芽孢杆菌发酵液提取物 | |
| CN112794877A (zh) | 一种乌鳢表皮黏液抗菌肽的制备方法 | |
| CN113142214B (zh) | 甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法 | |
| CN112521456A (zh) | 一种抗菌肽及其制备方法与应用 | |
| CN106674331B (zh) | 抗菌脂肽bacaucin及其制备方法与应用 | |
| CN117286058A (zh) | 一种植物乳植杆菌zjuids19及制备和应用 | |
| CN117050920A (zh) | 副干酪乳酪杆菌iob413后生元粉活性成分的制备方法及应用 | |
| CN116606777A (zh) | 一种植物乳杆菌菌株及其饲料添加剂与饲料 | |
| CN110746488A (zh) | 一种具有食品防腐保鲜作用的细菌素pe-zyb1及其应用 | |
| CN110747251A (zh) | 一种抑制病原菌的潜在益生菌株的快速筛选方法 | |
| CN102516382B (zh) | 一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-5及其基因、应用 | |
| CN113528600A (zh) | 一种利用沙门氏菌诱导蝇蛆制备抗菌肽的方法 | |
| CN103172721B (zh) | 一种海南湍蛙抗微生物肽Hainanenin-1及其基因、分离纯化、化学合成和应用 | |
| CN106214704B (zh) | 一种柞蚕蛹提取物、规模化生产方法及应用 | |
| CN112575055A (zh) | 利用缺陷型秀丽隐杆线虫快速检测牛源志贺菌毒力的方法 | |
| CN116143876B (zh) | 一种鲤鱼鳞抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| CN112011484A (zh) | 一株益生芽胞杆菌的筛选及应用 | |
| CN116694485B (zh) | 一种胶孢炭疽菌及其胞外多糖作为植物免疫诱抗剂的应用 | |
| CN1161377C (zh) | 大蹼铃蟾皮肤肽及其制备方法和在制药中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240327 Address after: 1003, Building A, Zhiyun Industrial Park, No. 13 Huaxing Road, Henglang Community, Dalang Street, Longhua District, Shenzhen City, Guangdong Province, 518000 Applicant after: Shenzhen Wanzhida Technology Transfer Center Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Zhenjiang City, Jiangsu Province, 212013 Jingkou District Road No. 301 Applicant before: JIANGSU University Country or region before: China |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240621 Address after: 250002 No. 602, unit 1, building 1, No. 7, Jida Road, Shizhong District, Jinan City, Shandong Province Applicant after: Wang Taihua Country or region after: China Address before: 1003, Building A, Zhiyun Industrial Park, No. 13 Huaxing Road, Henglang Community, Dalang Street, Longhua District, Shenzhen City, Guangdong Province, 518000 Applicant before: Shenzhen Wanzhida Technology Transfer Center Co.,Ltd. Country or region before: China |