CN103820544B - 一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法 - Google Patents

一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测水产品中腐败希瓦氏菌（<i>Shewanella？putrefaciens</i>）检测方法，属于生物技术领域。一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，包括如下步骤：a、腐败希瓦氏菌的分离：无菌取鲜活水产样品10g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提DNA；b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌的基因组DNA，进行PCR扩增。该检测方法从分离、纯化到PCR扩增等步骤进行了优化，检测结果特异性强，灵敏度高，达10-100？CFU/mL，可以对水产品中腐败希瓦氏菌进行快速分离、鉴定和分析。

Description

一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测水产品中腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
养殖鱼类富含营养，消费量逐年增加。然而，水产品组织脆弱，水分和蛋白含量高、组织酶活跃，极易导致鲜度下降及腐败变质。自溶酶、脂肪氧化、外源污染、机械损伤等因素均会引起鱼肉品质劣变，其中微生物生长及代谢形成的胺、硫化物、醛、酮和有机酸等，产生不良气体和风味，是引起腐败的主要原因。然而，由于水产品的种类、加工方式和贮藏条件的差异，水产品中存在不同的微生物构成。在这些微生物菌相中，往往只有一种或几种特定微生物能适合生存和大量繁殖，并产生腐败异味和臭味的代谢产物，称之为特定腐败菌（specificspoilageorganism,SSO）。在有氧冷藏条件下水产品的SSO多为腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）或假单胞菌（Pseudomonasspp.）。已发现我国东海产量较高的大黄鱼和带鱼，其冷藏过程中的SSO也是腐败希瓦氏菌。腐败希瓦氏菌为希瓦氏菌属（Shewanella），革兰氏阴性，运动杆菌，嗜冷性，能把氧化三甲胺还原为三甲胺，产H2S，腐败时出现酸臭味，是水生动物和富含蛋白食品的典型腐败菌。
细菌菌群的鉴定大多依赖传统简便的表现型试验，包括革兰氏染色、生化试验，然而使用这些方法对细菌进行分离和鉴定存在一定的局限性。随着细菌鉴定和分类方法的更新，分子生物学技术是细菌鉴定和特性分析的有效工具，已被成功用于流行病学中的细菌分析。
发明内容
本发明一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，主要用于检测鲜活水产品贮藏过程中特定腐败菌腐败希瓦氏菌（Shewanellaputrefaciens）的分离和检测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种检测腐败希瓦氏菌的引物对，其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成：第一引物对为
一条引物的序列为F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQIDNO.1，另一条的序列为R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA，记为SEQIDNO.2；或者是第二引物对为
一条引物的序列为F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQIDNO.3，另一条的序列为R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为SEQIDNO.4。
一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，包括如下步骤：
a、腐败希瓦氏菌的分离：无菌取鲜活水产样品10g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提DNA；
b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌的基因组DNA，进行PCR扩增，设计的引物序列为：
F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQIDNO.1，和
R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA，记为SEQIDNO.2；
或者是
F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQIDNO.3，和
R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为SEQIDNO.4。
本发明所指的水产品包括鲜活、冷藏的鱼类、甲壳类、软体动物等。本发明根据腐败希瓦氏菌产H2S的特性，先用TSA琼脂进行分离，再用铁琼脂纯化，（TSA更适合分离），采用腐败希瓦氏菌的2个特异性引物进行鉴定。特异性引物和扩增的片段大小，见表1。
表1引物序列和扩增PCR产物大小
作为优选，大豆酪蛋白琼脂培养基和铁琼脂平板培养的温度为25℃，培养时间为48h。
作为优选，扩增反应体系组分为：PCRBuffer（含Mg2+）5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，20μmol/L正反引物各lμl，DNA模板1μl，5U/μlTaq酶0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl。
作为优选，扩增反应条件：94℃预变性5min，变性94℃40s，退火55℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。
作为优选，所述的铁琼脂平板培养基的组分如下：细菌蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母浸出粉3g，柠檬酸铁0.3g，硫代硫酸钠0.3g，NaCl5g，L-半胱氨酸0.6g，琼脂20g，溶于1L水中。
本发明人对该PCR扩增技术进行了特异性验证和灵敏度检验，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标菌，而避免假阳性的出现；同时确认了该方法对腐败希瓦氏菌的最低检测限为100CFU/mL。
本发明的有益效果是：该检测方法从分离、纯化到PCR扩增等步骤进行了优化，检测结果特异性强，灵敏度高，达10-100CFU/mL，可以对水产品中腐败希瓦氏菌进行快速分离、鉴定和分析。而且检测周期短，成本相对较低，可推广应用于水产品等鲜活农产品等腐败微生物的研究。
附图说明
图1是实施例1中PCR检测靶标基因的特异性电泳图，其中M.BioMarkerI；1.腐败希瓦氏菌ATCC株；2.创伤弧菌；3.副溶血性弧菌；4.甲型副伤寒沙门氏菌；5.福氏志贺氏菌；6.金黄色葡萄球菌；7.大肠杆菌O157；
图2是实施例1中PCR检测靶标基因的灵敏度电泳图，其中M.BioMarkerI；1-6表示创伤弧菌的菌液浓度从105CFU/mL到100CFU/mL；
图3是实施例2中PCR检测靶标基因的特异性电泳图，其中M.BioMarkerI；1.腐败希瓦氏菌ATCC株；2.创伤弧菌；3.副溶血性弧菌；4.甲型副伤寒沙门氏菌；5.福氏志贺氏菌；6.金黄色葡萄球菌；7.大肠杆菌O157；
图4是实施例2中PCR检测靶标基因的灵敏度电泳图，其中M.BioMarkerI；1-6表示创伤弧菌的菌液浓度从105CFU/mL到100CFU/mL。
图5是实施例3中PCR检测2个靶标基因的灵敏度电泳图，其中M.BioMarkerI；1.Sputcn32_0857（目的片段154bp）；2.Sputcn32_1376（目的片段424bp）。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒，杭州昊天生物科技有限公司提供。
实施例1冰鲜大黄鱼在冰藏过程中腐败希瓦氏菌的检测：
无菌取0、2、4、6天冰藏大黄鱼样品10g，放入无菌袋中，加入90mL0.1%无菌蛋白胨生理盐水中，拍打混匀。分别取1ml进行10倍稀释后，取合适的稀释度，取1ml涂布在TSA平板上，在25℃培养48h，挑取菌落形态不同的30个菌落，划线到铁琼脂平板上。在25℃培养48h，产生黑色菌落后，挑取和收集黑色的菌落，，使用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒提取菌液中混合菌的DNA与1.5mL离心管中-20℃保存。
所述的铁琼脂平板培养基的组分如下（下同）：细菌蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母浸出粉3g，柠檬酸铁0.3g，硫代硫酸钠0.3g，NaCl5g，L-半胱氨酸0.6g，琼脂20g，溶于1L水中。
提取的产H2S细菌的DNA使用PCR检测，反应体系总体积为50μl，PCR反应体系中各试剂加入量如下：
PCRBuffer（含Mg2+）5μl，
dNTP（各2.5mmol/L）4μl，
采用序列号为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的正反引物（20μmol/L）各lμl，
DNA模板1μl，
Taq酶（5U/μl）0.5μl，
灭菌双蒸水补足50μl。
整个加样过程中保持冰浴状态，振荡混匀后，放入PCR仪，设置如下参数进行扩增：94℃预变性5min，变性94℃40s，退火55℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。扩增完毕后将扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测靶标基因的特异性电泳图和灵敏度电泳如图1和图2所示。电泳图中仅在腐败希瓦氏菌中出现一条150bp带，表明该引物特异性强，灵敏性结果显示最低检测限为102CFU/mL。证明Sputcn32_0857基因的特异性强，具有较高的灵敏性。
实施例2腐败大黄鱼中腐败希瓦氏菌的检测：
取冰藏腐败的大黄鱼（约5天）样品25g，放入无菌袋中，加入225mL0.1%无菌蛋白胨生理盐水中，拍打混匀。分别取1ml进行10倍稀释后，取合适的稀释度，取1ml涂布在TSA平板上，在25℃培养48h，挑取菌落形态不同的30个菌落，划线到铁琼脂平板上。在25℃培养48h，产生黑色菌落后，离心收集细菌，使用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒提取菌液中混合菌的DNA与1.5mL离心管中-20℃保存。
提取的产H2S细菌的DNA使用PCR检测，反应体系总体积为50μl，PCR反应体系中各试剂加入量如下：
PCRBuffer（含Mg2+）5μl，
dNTP（各2.5mmol/L）4μl，
采用序列号为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的正反引物（20μmol/L）各lμl，
DNA模板1μl，
Taq酶（5U/μl）0.5μl，
灭菌双蒸水补足50μl。
整个加样过程中保持冰浴状态，振荡混匀后，放入PCR仪，设置如下参数进行扩增：94℃预变性5min，变性94℃40s，退火55℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。扩增完毕后将扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测靶标基因的特异性电泳图和灵敏度电泳图分别见图3和图4。电泳图中仅在腐败希瓦氏菌中出现一条420bp条带，表明该引物特异性强，灵敏性结果显示最低检测限为101CFU/mL。Sputcn32_1376基因的特异性强，灵敏度高。
实施例3鲜活鲈鱼在冷藏过程中腐败希瓦氏菌的检测：
将鲜活鲈鱼用碎冰致死后，放入灭菌袋中，分别于4℃和-2℃冰箱中贮藏。每隔3天取样，测定腐败希瓦氏菌变化。具体为：无菌取不同冷藏条件下鲈鱼样品10g，放入无菌袋中，加入90mL0.1%无菌蛋白胨生理盐水中，拍打混匀。分别取1ml进行10倍稀释后，选择合适的稀释度，取1ml涂布在TSA平板上，在25℃培养48h，挑取菌落形态不同的30个菌落，分别接种到铁琼脂平板上，在25℃继续培养48h，产生黑色菌落后，收集细菌，使用Biospin细菌DNA基因组抽提试剂盒提取产H2S细菌的DNA，在-20℃保存。
提取的产H2S细菌的DNA使用PCR检测，反应体系总体积为50μl，PCR反应体系中各试剂加入量如下：
PCRBuffer（含Mg2+）5μl，
dNTP（各2.5mmol/L）4μl，
采用序列号为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，及SEQIDNO.3和SEQIDNO.4的正反引物（20μmol/L）各lμl，
DNA模板1μl，
Taq酶（5U/μl）0.5μl，
灭菌双蒸水补足50μl。
整个加样过程中保持冰浴状态，振荡混匀后，放入PCR仪，设置如下参数进行扩增：94℃预变性5min，变性94℃40s，退火55℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。扩增完毕后将扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图5，在凝胶成像系统观察预期150bp和420bp条带。结论，两对引物可用于腐败希瓦氏菌的快速检测，具有特异性强，灵敏性高的优点。
本发明人对该PCR扩增技术进行了特异性验证和灵敏度检验，证明了引物设计的种间特异性和种内保守性，确保该反应能特异性检测出目标菌，而避免假阳性的出现；同时确认了该方法对腐败希瓦氏菌的最低检测限为100CFU/mL。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCELISTING
<110>浙江工商大学
<120>一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法
<130>GSDX001
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cagttgggcctttgatgctt20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cacagaggtcccttcatcga20
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcaggataaaacattaccattgga24
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ccaggaaaatcttggtggaa20

Claims (6)

1.一种检测腐败希瓦氏菌的引物对，其特征在于其是由具有如下所述的核苷酸序列的引物组成：
第一引物对为
一条引物的序列为F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQIDNO.1，另一条的序列为R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA，记为SEQIDNO.2；
或者是第二引物对为
一条引物的序列为F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQIDNO.3，另一条的序列为R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为SEQIDNO.4。
2.一种水产品中腐败希瓦氏菌的分离和检测方法，其特征在于包括如下步骤：
a、腐败希瓦氏菌的分离：无菌取冰藏水产样品10g，加入无菌蛋白胨生理盐水制成溶液，稀释后涂布于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）上进行培养，挑取菌落，分别划线到铁琼脂平板上继续培养，挑取黑色的菌落，收集细菌，抽提细菌DNA；
b、PCR分离鉴定：提取待测的产硫化氢细菌的基因组DNA，进行PCR扩增，设计的引物序列为：
F-CAGTTGGGCCTTTGATGCTT，记为SEQIDNO.1，和
R-CACAGAGGTCCCTTCATCGA，记为SEQIDNO.2；
或者是
F-TCAGGATAAAACATTACCATTGGA，记为SEQIDNO.3，和
R-CCAGGAAAATCTTGGTGGAA，记为SEQIDNO.4。
3.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：大豆酪蛋白琼脂培养基和铁琼脂平板培养的温度为25℃，培养时间为48h。
4.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：扩增反应体系组分为：含Mg2+的PCRBuffer5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，20μmol/L正反引物各lμl，DNA模板1μl，5U/μlTaq酶0.5μl，灭菌双蒸水补足至50μl。
5.根据权利要求2或4所述的分离和检测方法，其特征在于：扩增反应条件：94℃预变性5min，变性94℃40s，退火55℃1min，延伸72℃1min，30个循环，终延伸72℃5min。
6.根据权利要求2所述的分离和检测方法，其特征在于：所述的铁琼脂平板培养基的组分如下：细菌蛋白胨20g，牛肉膏3g，酵母浸出粉3g，柠檬酸铁0.3g，硫代硫酸钠0.3g，NaCl5g，L-半胱氨酸0.6g，琼脂20g，溶于1L水中。
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