CN112641031B - 一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法 - Google Patents
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Abstract
一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，涉及消毒灭菌领域，具体包括如下步骤：材料准备；接种大肠杆菌；加入甲壳素和百里香酚材料；迅速将样品溶液移入超高压设备内，对样品进行超高压处理；将处理后的样品溶液从超高压设备内取出；进行后续大肠杆菌的菌落培养和总数检测。本发明首次将天然植物精油、多糖与超高压技术协同用于大肠杆菌的杀灭，即采用添加百里香酚和甲壳素的方法，对耐压性大肠杆菌进行协同杀灭。本发明方法可有效减低大肠杆菌耐压性，符合食品安全要求，使用的材料如百里香酚和甲壳素等价格低廉，配制及使用方法简单，对技术人员要求低，适合食品加工企业大规模采用。
Description
技术领域
本发明涉及消毒灭菌领域，具体涉及一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法。
背景技术
大肠杆菌特别是食源性致病菌肠出血性大肠杆菌(EHEC)长期威胁大众食品安全，是食品安全领域的重要隐患因素之一，该类致病菌的感染剂量非常低，不到10个细胞即可致人死亡，致死率高达30％。近年来EHEC曾在牛肉、豆芽和面粉等多种食品中被检出，造成严重的食品安全事件。
传统食品加工领域通常采用热加工方法处理杀灭EHEC，效果不够理想。近年来，超高压技术(high hydrostatic pressure，HHP)作为非热加工技术越来越受欢迎，在400～600MPa 条件下，HHP可有效减少致病菌和腐败菌，从而达到食品在低温条件下的杀菌效果，同时保留食品的品质，该技术目前已经在世界范围内得到广泛应用。然而研究发现，即使食品经过 HHP处理，依然有部分致病菌存活下来。曾有研究发现，将100株大肠杆菌E.coli分别进行 HHP(600MPa)处理，发现绝大多数E.coli的菌落数减少不到5log(cfu/mL)，由此可知大多数属于耐压菌株。因此，如何实现大肠杆菌的高效杀灭，是目前消毒灭菌技术领域的一大难题。
百里香酚是一个单萜，是常见的一类天然植物精油，作为对异丙基甲苯的酚衍生物，其与香芹酚是同分异构体，由于被发现于百里香中而得名。萃取得到的百里酚是白色结晶固体，有令人愉快的芳香气味；甲壳质是一种线型高分子多糖，又称甲壳素、几丁质，英文名 Chitin，属于天然的中性粘多糖，化学上不活泼，不与体液发生变化，对组织不起异物反应，无毒，具有抗血栓、耐高温消毒等特点，它是自然界中一种带正电荷的天然高分子材料，而且只能通过生物法降解。目前百里香酚、甲壳质或者两者协同应对大肠杆菌的使用尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，解决现有技术中即使经过HHP处理、依然有较高比例的大肠杆菌菌株存活下来、不能有效降低到合理标准的问题。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、材料准备，包括配置pH范围为5～6的MES缓冲液，准备甲壳素和百里香酚材料；步骤二、取一定量的步骤一配置的MES缓冲液接种大肠杆菌，至大肠杆菌数为106～108log (cfu/mL)；
步骤三、在步骤二培养的大肠杆菌中加入甲壳素和百里香酚材料，至最终质量百分数范围分别为0.025％～0.25％和0.01％～0.1％，形成样品溶液；
步骤四、迅速将步骤三的样品溶液移入超高压设备内；
步骤五、对样品进行超高压处理，压力为600MPa，温度为20℃，时间为3～10min；
步骤六、将步骤五处理后的样品溶液从超高压设备内取出；
步骤七、进行后续大肠杆菌的菌落培养和总数检测。
其中，作为本发明的优选技术方案，所述步骤三中，甲壳素的最终质量百分数为0.075％；百里香酚的最终质量百分数0.025％。
进一步优选的，所述步骤五中，超高压处理的时间为3min或6min。
进一步优选的，所述步骤二中，大肠杆菌数为107log(cfu/mL)。
进一步优选的，所述步骤二中，每个样品溶液量为200uL。
进一步优选的，所述步骤一中，MES缓冲液的pH范围为5.5。
进一步优选的，所述步骤七中，菌落培养具体包括梯度稀释、涂板和培养，所用培养基为LB培养基。
更优选的，所述步骤七中，将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的大肠杆菌菌落数。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
1、本发明首次将天然植物精油、多糖与超高压技术协同用于大肠杆菌的杀灭，即采用添加百里香酚和甲壳素的方法，对耐压性大肠杆菌进行协同杀灭。其中，百里香酚和甲壳素的协同选用为首创，具有创造性，目前很多添加剂未见与HHP产生显著的协同作用，如玫瑰精油等，有的添加剂与HHP产生拮抗作用，如香芹酚，还有的添加剂虽有效果，但效果不显著或使用量较大，不适合往食品中添加，如异硫氰酸烯丙酯，此外部分虽然有虽有效果，但价格太高，如乳铁蛋白、溶菌酶等；
2、本发明方法可有效减低大肠杆菌耐压性，可将耐压性大肠杆菌降低至5log(cfu/mL)以下。经HHP处理3min后，耐压性大肠杆菌的菌落数约降低2.2(cfu/mL)；经HHP处理6min后，耐压性大肠杆菌的菌落数降低约3.24log(cfu/mL)；大肠杆菌菌落数降至3.16(cfu/mL)，符合食品安全要求；
3、本发明方法使用的材料如百里香酚和甲壳素等价格低廉，配制及使用方法简单，对技术人员要求低，适合食品加工企业大规模采用。
附图说明
图1为本发明涉及的实施例与对照例的结果对比分析柱形图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，所用设备中，超高压设备型号： HPP600MPa/30—200L，工作压力：0～600Mpa。其余设备均为微生物实验室常用设备，此处不再赘述。
本发明涉及一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，百里香酚和甲壳素的选用具有独创性，其主旨在于在低成本、低操作要求下实现大肠杆菌耐压性的显著降低，促进企业大规模应用。主要步骤如下：
步骤一、材料准备，包括配置pH范围为5～6的MES缓冲液，准备甲壳素和百里香酚材料；步骤二、取一定量的步骤一配置的MES缓冲液接种大肠杆菌，至大肠杆菌数为106～108log (cfu/mL)；步骤三、在步骤二培养的大肠杆菌中加入甲壳素和百里香酚材料，至最终质量百分数范围分别为0.025％～0.25％和0.01％～0.1％，形成样品溶液；步骤四、迅速将步骤三的样品溶液移入超高压设备内；步骤五、对样品进行超高压处理，压力为600MPa，温度为20℃，时间为3～10min；步骤六、将步骤五处理后的样品溶液从超高压设备内取出；步骤七、进行后续大肠杆菌的菌落培养和总数检测。菌落培养具体包括梯度稀释、涂板和培养，所用培养基为LB培养基。将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的大肠杆菌菌落数。
其中，确定甲壳素和百里香酚的浓度方法为：采用不同浓度梯度进行大肠杆菌抑制效果实验，将分别添加二者、但未进行HHP处理的样品进行大肠杆菌菌落计数，以添加所致的菌落减少数<1log(cfu/mL)为最佳，最终确定甲壳素的最终质量百分数为0.075％；百里香酚的最终质量百分数0.025％。
在超高压处理的时间选用上，在3～10min内设置梯度时间点，分别对不同样品连续超高压处理之目标时间点后，对不同长度超高压处理时间的处理样品进行对比检测，发现，经HHP处理3min，发现甲壳素和百里香酚与HHP产生协同作用，在处理时间为3min或6min时，发现2.0％的氨基葡萄糖与HHP产生显著的协同作用效果最好，其余处理时间条件下协同效果相对较弱。同样的，经过单变量梯度实验，确定MES缓冲液的优选PH为5.5；接种时大肠杆菌数优选为107log(cfu/mL)。
下面通过实施例和对照例进一步对本发明内容进行说明：
实施例：同时添加百里香酚和甲壳素并超高压处理(THY+CHI+HHP)
本实施例涉及的同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法具体包括如下步骤：
步骤一、配置MES buffer(pH＝5.5)；
步骤二、在5mL中接种耐压性大肠杆菌至107log(cfu/mL)；
步骤三、加入甲壳素和百里香酚至最终质量百分数分别为0.075％和0.025％；
步骤四、迅速将上述溶液在聚乙烯管内进行封装后，移入超高压设备内，设置压力为600MPa, 温度为20℃，时间为3、6min。按设定条件对各样品进行超高压处理。
步骤五、处理后的样品从HHP设备内取出后，进行梯度稀释、涂板、培养，所用培养基为LB培养基。
步骤六、将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的菌落数。
对比例一：不做任何添加、只进行HHP处理(Control)
步骤一、配置MES buffer(pH＝5.5)；
步骤二、在5mL中接种耐压性大肠杆菌至107log(cfu/mL)；
步骤三、将处理后的样品进行梯度稀释、涂板、培养，所用培养基为LB培养基。
步骤四、将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的菌落数。
对比例二：单独添加百里香酚并超高压处理(THY)
具体步骤如下：
步骤一、配置MES buffer(pH＝5.5)；
步骤二、在5mL MES buffer中接种大肠杆菌至107log(cfu/mL)；
步骤三、向步骤二的菌液中加入百里香酚至最终质量百分数别为0.025％；
步骤四、迅速将上述溶液在聚乙烯管内进行封装后，移入超高压设备内，设置压力为600MPa, 温度为20℃，时间为3、6min。按设定条件对各样品进行超高压处理。
步骤五、处理后的样品从HHP设备内取出后，进行梯度稀释、涂板、培养，所用培养基为LB培养基。
步骤六、将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的菌落数。
对比例三：单独添加甲壳素并超高压处理(CHI)
具体步骤如下：
步骤一、配置MES buffer(pH＝5.5)；
步骤二、在5mL MES buffer中接种大肠杆菌至107log(cfu/mL)；
步骤三、向步骤二的菌液中加入甲壳素至最终质量百分数别为0.075％；
步骤四、迅速将上述溶液在聚乙烯管内进行封装后，移入超高压设备内，设置压力为600MPa, 温度为20℃，时间为3、6min。按设定条件对各样品进行超高压处理。
步骤五、处理后的样品从HHP设备内取出后，进行梯度稀释、涂板、培养，所用培养基为LB培养基。
步骤六、将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的菌落数。
本发明每个样品处理做三遍生物学重复，将不做任何添加、只进行HHP处理、单独添加百里香酚并HHP处理、单独添加甲壳素并HHP处理的菌液分别作为对照，结果如表1：
表1.本发明涉及实施例与对照例中培育后的大肠杆菌数Cellcounts【log(cfu/
mL)】对比分析表
| Untreated byHP | 标准差 | HHP-600MPa,3min | 标准差 | HHP-600MPa,6min | 标准差 | |
| 对比例一：CONTROL | 7.97 | 0.20 | 7.10 | 0.11 | 5.67 | 0.33 |
| 对比例二：THY | 6.48 | 0.60 | 7.00 | 0.45 | 4.79 | 1.03 |
| 对比例三：CHI | 7.38 | 0.50 | 6.69 | 0.92 | 6.45 | 0.29 |
| 实施例：THY+CHI | 6.40 | 0.12 | 4.18 | 0.27 | 3.16 | 0.39 |
上述实施例中，所用的百里香酚和甲壳素均来自市场采购，大肠杆菌为从牛肉厂生牛肉上利用培养基培养分离得到的菌株。将上述结果进行分析，如图1，可以看出：
1.单独添加百里香酚，经HHP处理3min后，耐压性大肠杆菌的菌落数几乎不变；经HHP处理6min后，耐压性大肠杆菌的菌落数降低仅约1.7log(cfu/mL)
2.单独添加甲壳素，经HHP处理3min后，耐压性大肠杆菌的菌落数几乎不变；经HHP处理6min后，耐压性大肠杆菌的菌落数降低仅约0.9log(cfu/mL)
3.同时添加百里香酚和甲壳素后，经HHP处理3min后，耐压性大肠杆菌的菌落数约降低 2.2(cfu/mL)；经HHP处理6min后，耐压性大肠杆菌的菌落数降低约3.24log(cfu/mL)；大肠杆菌菌落数降至3.16(cfu/mL)，符合食品安全要求。
由此可见，本发明可有效减低大肠杆菌耐压性，此外，本发明所用材料如百里香酚和甲壳素等价格低廉，配制及使用方法简单，对技术人员要求低，适合食品加工企业大规模采用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (8)
1.一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、材料准备，包括配置pH范围为5～6的MES缓冲液，准备甲壳素和百里香酚材料；
步骤二、取一定量的步骤一配置的MES缓冲液接种大肠杆菌，至大肠杆菌数为106～108log (cfu/mL)；
步骤三、在步骤二培养的大肠杆菌中加入甲壳素和百里香酚材料，至最终质量百分数范围分别为0.025%～0.25%和0.01%～0.1%，形成样品溶液；
步骤四、迅速将步骤三的样品溶液移入超高压设备内；
步骤五、对样品进行超高压处理，压力为600MPa，温度为20℃，时间为3 ～10 min；
步骤六、将步骤五处理后的样品溶液从超高压设备内取出；
步骤七、进行后续大肠杆菌的菌落培养和总数检测。
2.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤三中，甲壳素的最终质量百分数为0.075%；百里香酚的最终质量百分数0.025%。
3.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤五中，超高压处理的时间为3min或6min。
4.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤二中，大肠杆菌数为107log (cfu/mL)。
5.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤二中，每个样品溶液量为200 μ L 。
6.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤一中，MES缓冲液的pH范围为5.5。
7.根据权利要求1所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤七中，菌落培养具体包括梯度稀释、涂板和培养，所用培养基为LB培养基。
8.根据权利要求7所述的一种同时利用天然植物精油和多糖有效降低大肠杆菌耐压性的方法，其特征在于：所述步骤七中，将平板放置37℃培养箱进行培养24h后，进行菌落计数，计算原始样品中的大肠杆菌菌落数。
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Citations (5)
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| KR20020046272A (ko) * | 2002-05-03 | 2002-06-20 | 이원희 | 키토올리고당을 포함하는 된장 |
| CN106387602A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-02-15 | 广东工业大学 | 一种非热食品熏杀防腐保鲜方法 |
| CN110236070A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-09-17 | 华中农业大学 | 一种纯精油抗菌乳液、制备方法及其应用 |
| CN111053942A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-04-24 | 东华大学 | 一种甲壳素百里香精油凝胶及其制备方法 |
| CN112023842A (zh) * | 2020-08-29 | 2020-12-04 | 汕头市奇伟实业有限公司 | 一种百里香精油微胶囊、防腐组合物及其制备方法 |
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2020
- 2020-12-14 CN CN202011468246.3A patent/CN112641031B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 壳聚糖-百里香酚复合物的抑菌活性研究;胡瑛等;《武汉大学学报(理学版)》;20030423(第02期);全文 * |
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| CN112641031A (zh) | 2021-04-13 |
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