CN108396004B - 一株高效降解黄曲霉毒素b1的大肠杆菌cg1061 - Google Patents

一株高效降解黄曲霉毒素b1的大肠杆菌cg1061 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichia coli）CG1061菌株。该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324。该菌株分离自鸡盲肠，是一株非致病性大肠杆菌，可高效降解AFB1，可应用于制备黄曲霉毒素B1的脱毒菌剂、脱毒酶制剂等，在食品、饲料加工等领域具有良好的应用前景。

Description

一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061
技术领域
本发明属于霉菌毒素降解技术领域。更具体地，涉及一株高效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的大肠杆菌（Escherichia coli）CG1061菌株。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一类由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，具有致癌、致畸和致细胞突变的作用，其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）的毒性最强、危害最大。AFB1对动物的直接毒性表现为肝脏致癌性，间接毒性表现为引起动物的饲料转换率、免疫力、繁殖力等的下降。黄曲霉毒素主要存在于花生、大豆、玉米等粮食作物中，由此加工的食品和饲料流入市场严重威胁人类和畜禽的健康。因此，迫切需要一种高效的脱毒方法去除这类毒素。
传统的脱毒方法有物理和化学方法，包括碱法、高温法、射线辐照法、吸附法等。由于这些方法存在特异性不强、营养成分损失大、对环境造成二次污染等缺点，均无法广泛应用。生物脱毒法是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法，生物脱毒法具有特异性强、效率高以及对食品、饲料和环境没有污染等优点，是黄曲霉毒素脱毒的主要发展方向。
目前，已发现多种可以代谢AFB1毒素的微生物，其中真菌主要有糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）、假蜜环菌（Armilariella tabescens）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等，还包括一些酵母如酿酒酵母（Saccaromyces cerevisiae）等。细菌方面，如诺卡氏菌（Nocardia corynebacterioides）、结合分支杆菌（Mycobacterium fluoranthenivorans）、红串红球菌（Rhodococcus erythropolis）、嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、假单胞菌（Pseudomonas putida）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等。目前国内外AFB1降解菌虽有较多报道，但是种类依然受限，且多数降解菌的代谢产物及其毒性不清楚，因此实际应用受到了限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有黄曲霉毒素降解技术的缺陷和不足，提供一种能高效降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的大肠杆菌，且其代谢产物及产物毒性明确，可应用于饲料和食品原料的脱毒。
本发明的目的是提供一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌（Escherichia coli）CG1061菌株。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明研究发现大肠杆菌对黄曲霉毒素B1具有降解作用，并筛选分离得到了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061菌株，可高效将AFB1降解代谢为无毒产物。
因此，所述大肠杆菌CG1061菌株应在本发明的保护范围之内，该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324。
同时，包含有所述大肠杆菌CG1061菌株的黄曲霉毒素B1脱毒制剂，以及以所述大肠杆菌CG1061菌株为基础构建得到的黄曲霉毒素B1脱毒工程菌，也应在本发明的保护范围之内。
另外，如下应用也均应在本发明的保护范围之内：
大肠杆菌CG1061菌株在降解代谢黄曲霉毒素B1方面的应用。
所述脱毒制剂或所述工程菌在降解代谢黄曲霉毒素B1方面的应用。
优选地，是应用于饲料加工或食品加工领域中黄曲霉毒素B1的脱毒。
本发明具有以下有益效果：
本发明研究发现大肠杆菌对黄曲霉毒素B1具有降解作用，并筛选分离得到了一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌CG1061菌株，可高效将AFB1降解代谢为无毒产物；且该菌株是一株非致病性大肠杆菌，可应用于制备黄曲霉毒素B1的脱毒菌剂、脱毒酶制剂等，在食品、饲料加工等领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为鸡肠道微生物菌群对AFB1的降解能力。
图2为菌株CG1008对AFB1的降解能力。
图3为菌株CG1061的16S rRNA基因系统发育树。
图4为大肠杆菌CG1061的致病基因检测结果。
图5为大肠杆菌CG1061对AFB1代谢产物毒性。
图6为大肠杆菌CG1061对AFB1代谢产物结构分析。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1 鸡盲肠微生物AFB1降解活性
1、方法
（1）从广州五山菜市场随机购买一只活鸡，宰杀后取出鸡盲肠，剪开盲肠取其内容物，加入10ml LB培养基搅拌混匀，静置10min，上清即为盲肠混合微生物。
（2）取100μl加入到900μl LB培养基中，添加250µg/ml AFB1母液10μl，使其终浓度为2.5 μg/ml。
（3）37 ℃，180r/min，黑暗条件下培养3天。
（4）取200μl加入等量的二氯甲烷萃取三次，10000rpm，离心1min，将上清用N2吹干。加入150μL甲醇充分溶解残留物，用0.22μm的尼龙针式滤器过滤至上样瓶。
（5）使用高效液相色谱HPLC对AFB1残留量进行检测。
（6）AFB1代谢率（%）=(1－AFB1样品峰面积/ AFB1对照峰面积)×100
2、结果如附图1所示，所分离的鸡肠道微生物菌群对AFB1具有高效的降解能力，降解率为93.9%。
实施例2 大肠杆菌CG1061的分离鉴定
1、平板分离法筛选AFB1降解菌
对实施例1所述的鸡肠道微生物菌群进行稀释平板法分离AFB1降解菌。将灭菌的LB固体培养基趁热倒入无菌平板中，凝固后备用。鸡肠道微生物菌群进行梯度稀释，取10-5、10-6两种菌液稀释液中吸取200μL菌悬液放入平板中央位置，每个稀释度做3个重复，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置5～10min。把所有平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24h。根据菌落的形态不同随机挑取50个单菌落，分别接入含150μL 液体LB培养基的96孔细胞培养板中，37 ℃摇床上震荡培养过夜。各取10μL加190μL LB培养液，加入250µg/ml AFB1母液2μl，使其终浓度为2.5 μg/ml，以不接菌的LB培养液加AFB1作为空白对照。37 ℃，180 r/min，黑暗条件下培养72 h，按照实施例1的方法检测AFB1残留量，筛选出降解活性最高的菌落，并进行单菌落纯化保存，编号CG1061。菌株CG1061的降解活性如附图2所示，代谢率为93.7%。
2、高效AFB1降解菌的鉴定
形态鉴定的同时，对单菌落CG1061做16S rRNA基因测序，并构建系统发育树（如附图3所示）。
综合鉴定结果显示，该菌株属于大肠杆菌（Escherichia coli），因此，将该菌株命名为大肠杆菌CG1061，已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324；保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3大肠杆菌CG1061致病性检测
1、按照DNA提取试剂盒说明书提取大肠杆菌CG1061基因组DNA，按照Diarrhoeagenic E. coli PCR Kit ( Statens Serum Institut, Denmark)说明书进行多重PCR，检测目前报道的十个致病基因ipaH, aatA, eltA,vtx2, eae, aggR, vtx1, aaiC,estA-porcine, estA-human的表达情况。
2、大肠杆菌CG1061的致病性检测结果如附图4所示。结果表明大肠杆菌CG1061不携带上述已知致病基因。
实施例4大肠杆菌CG1061对AFB1的降解作用及代谢产物毒性
1、采用MTT法检测大肠杆菌CG1061代谢产物毒性。
1）将CG1061菌液接种至含12.5µg/ml AFB1的LB溶液，置于37 ℃，180 r/min，黑暗条件下培养72 h，得到AFB1降解产物溶液，即CG1061-degraded AFB1; 不接种的作为Standard AFB1。
2）收集对数生长期的LMH细胞，胰酶消化制备成单细胞悬液，调整细胞悬液的浓度，每孔加入200 µl细胞培养液，接种到96孔板使待测细胞密度为6×103个/孔，板的边缘孔需用无菌PBS缓冲液填充；
3）5% CO2，37℃恒温培养36 h，待细胞贴壁；
4）将96孔板中原有的培养液丢弃，将12.5µg/ml CG1061-degraded AFB1和Standard AFB1分别用William’s E培养液梯度稀释（终浓度为0.25 µg/ml、0.5 µg/ml、1 µg/ml、2 µg/ml、3.75 µg/ml），每孔加200 µl ，每个浓度设5个平行孔；
5）5% CO2，37℃恒温培养48 h，每孔加入20 µl MTT溶液（5 mg/ml，即0.5% MTT），继续培养4 h；
6）终止培养，移液器小心地吸干每孔内培养液，避免触碰细胞；
7）每孔加入150 µl 二甲基亚砜（DMSO），放置脱色摇床上低速振荡15 min，使结晶物充分溶解，然后经酶标仪测量每孔在OD490 nm处的吸光度；
8）同时设置调零孔，即空白组（培养液、MTT、DMSO），对照组（细胞、相同浓度的药物溶解介质DMSO、培养液、MTT）；
9）计算细胞存活率：细胞存活率（%）=(加药孔OD值/对照孔OD值)×l00%；
2、结果如附图5所示，AFB1经过CG1061代谢后毒性显著降低。
实施例5 大肠杆菌CG1061对AFB1的降解作用及代谢产物结构
1、取20μL大肠杆菌CG1061菌液加380 μL LB培养液，加入250 µg/ml AFB1母液2μl，使其终浓度为2.5 μg/ml，37℃、180r/min避光培养72 h，按照实验例1的方法萃取、吹干、溶解至甲醇中，过滤备用。采用UPLC 1290-6540B Q-TOF液相色谱-质谱联用仪检测代谢产物。
2、结果如附图6所示，AFB1经过CG1061代谢产生AFD1和AFD3（目前已经证明的无毒或低毒产物）。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株高效降解黄曲霉毒素B1的大肠杆菌(Escherichia coli)CG1061菌株，其特征在于，该菌株已于2018年2月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60324。
2.一种黄曲霉毒素B1脱毒制剂，其特征在于，包含有权利要求1所述大肠杆菌CG1061菌株。
3.权利要求2所述脱毒制剂在降解代谢黄曲霉毒素B1方面的应用。
4.权利要求2所述脱毒制剂在饲料加工或食品加工领域中黄曲霉毒素B1的脱毒方面的应用。
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