CN115414312B - 一种含有松花粉提取物的发酵组合物及其在护肤品上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L‑阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。所述含有松花粉提取物的发酵组合物可以做成面霜，眼霜，乳液等多种护肤品。作为优选，其可以做成面霜，配方如下：含有松花粉提取物的发酵组合物(1％)，加入硬脂酸3％、十八醇3％、蜂蜡0.5％、吐温60 0.5％、甘油硬脂酸酯2％、角鲨烷1％、棕榈酸异丙酯3％、凡士林3％、环五聚二甲基硅氧烷1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯丁酯0.1％、甘油乙基己酸酯4％、甘油3％、丙二醇6％、三乙醇胺1.5％、香精0.1％，余量为水。

Description

一种含有松花粉提取物的发酵组合物及其在护肤品上的应用
技术领域
本发明涉及化妆品配方技术领域，特别涉及具体是一种含有松花粉提取物的发酵组合物及其护肤品的制备方法。
背景技术
皮肤由表皮和真皮组成，真皮衰老在皮肤衰老过程中起着重要作用。真皮由成纤维细胞及其产生的胶原纤维、弹力纤维及基质组成。胶原是细胞外基质最基本的成分之一，但是现代生活中，各种内外因素机制的发生，导致疾病皮肤老化发生，产生了皱纹，皮肤表皮变薄、粗糙、萎缩、下垂、色素沉着不均，皮肤内水分及脂肪含量变少等等。研究表明：这可能是由内在和外在机制共同引起的。皮肤老化虽然是随着年龄的增长而发生。但是如果减缓氧化应激的累积效应而发生的，加强皮肤日常健康养护，就可以提高人体皮肤的质量和状态。但是往往人们还使用劣质化妆品，加重了各种皮肤问题，倒是皱纹和提前老化等。
松花粉是我国特有树种马尾松的雄性配子体，又名松黄，是我国传统食药兼用的花粉品种。除含有一般营养物质外，还含有多种对人体生理机能具有特殊功能的物质。自古以来就是人们治病强身、延年益寿的食疗保健品。在国内外已被广泛地应用于保健品、药品、化妆品和饲料添加剂等领域。天然松花粉由主体和两个气囊组成。气囊主要由半纤维素组成，内含大量植物低聚糖。天然松花粉经过现代破壁技术处理后粗纤维、半纤维素等含量均大幅度下降，总能量、粗蛋白、总脂、淀粉含量则明显提高。
古书典籍中早有记载松花粉有美容功效，可促进皮肤细胞新陈代谢，延缓皮肤细胞衰老，增加皮肤弹性，使皮肤洁白红润健美的特殊效果，被誉为“吃的化妆品”。松花粉中富含20余种氨基酸、15种维生素、30多种矿物质元素、近百种酶和辅酶，以及核酸、卵磷脂、类黄酮、单糖、多糖、胆碱等200余种，同时还含有许多生物活性物质。但是，纯天然松花粉能够有效应用在抗氧化、抗衰老方面的美容护肤品非常少。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种对人体无毒副作用的具有抗氧化、保湿、减少色素分布、减缓皮肤衰老功效，能够将天然松花粉有效应用在护肤品上的组合物。
本发明是通过以下技术方案予以实现：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
益生菌发酵产物滤液，13份具体为：植物乳杆菌CT152发酵滤液8份，枯草芽孢杆菌T8发酵滤液5份。
所述含有松花粉提取物的发酵组合物可以做成面霜、眼霜等多种护肤品剂型。
其可以做成面膜，取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(1％)，加入硬脂酸3％、十八醇3％、蜂蜡0.5％、吐温60 0.5％、甘油硬脂酸酯2％、角鲨烷1％、棕榈酸异丙酯3％、凡士林3％、环五聚二甲基硅氧烷1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯丁酯0.1％、甘油乙基己酸酯4％、甘油3％、丙二醇6％、三乙醇胺1.5％、香精0.1％，余量为水。搅拌使混匀，乳化20分钟，制得面霜。
其可以做成眼霜，取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(2％)，加入10％甜杏仁油、5％霍霍巴油、1％甘油、2％1,3丁二醇、25％玫瑰纯露、0.5％汉生胶、1％聚丙烯酸钠/C18-C21烷/十三烷醇聚醚-6、0.1％双(羟甲基)咪唑烷基脲以及水余量，高速搅拌(10000r/min)20min使混匀，再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得眼霜。
其可以做成乳液，取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(1％)，加入3％EDTA二钠、5％甘油、1％黄原胶、5％角鲨烷、5％甜扁桃油、3％辛酸/癸酸甘油三酯、5％牛油果油、0.1％二甲基聚硅氧烷、0.5％霍霍巴油、1％甘油酸硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、2％甘油硬脂酸酯、1％司盘60、1％硬脂酸、0.1％羟苯甲酯、0.3％三乙醇胺以及水余量，搅拌使混匀，再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得乳液。
中国专利201910709658.2披露了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CT152，该菌株已于为2019年7月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉大学武汉中国，保藏编号：CCTCC NO:M 2019591。该菌株具有较好的抗氧化和降糖效果。
中国专利2019102973836披露了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T8，于2018年12月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018860。该菌株具有纤维素降解能力，有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。
松花粉提取物的制备方法为：取一定量的天然松花粉采用低温高速气流粉碎技术破壁处理20min，在常温常压下10倍量水35℃温浸蒸馏水浸泡30min后，超声提取60min，10000rpm/min低温离心15min，取上清液弃除固体物质，5℃条件下用分子筛超滤分离出分子量3000D以下的水溶性分子物质，经冷冻干燥得到冻干粉，－20℃保存备用。
松花粉的水提取率显著高于95％乙醇提取率，并且水提物活性明显高于醇提物。所以本实验的松花粉提取物选取的水提法。
植物乳杆菌CT152发酵滤液的制备方法，步骤如下：
(1)将冷冻保存的植物乳杆菌CT152接种于MRS培养基中，在温度37℃好氧环境培养12h进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为1*108cfu/ml，按照5％(v/v)MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养24h；
(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液(转速10000r/min，时间10min)，将上清液过0.22um除菌过滤器得到植物乳杆菌CT152发酵滤液备用。
枯草芽孢杆菌T8发酵滤液的制备方法，步骤如下：
(1)将冷冻保存的枯草芽孢杆菌T8接种于营养肉汁琼脂培养基中(NaCl 5g/L，牛肉浸出物3g/L，蛋白胨10g/L)，发酵培养2天进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为5*107cfu/ml，按照3％(v/v)发酵培养基培养3天；
所述发酵培养条件为培养温度为30℃，摇床转速为120rpm/min；
所述的发酵培养基是：CMC-Na 10g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、K2HPO42g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L；
(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液(转速8000r/min，时间10min)，将上清液过0.22um除菌过滤器得到枯草芽孢杆菌T8发酵滤液备用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明是制备一种含有松花粉提取物的发酵组合物。可以利用该组合物为重要原料，制备出具有抗氧化、保湿、减少色素分布、减缓皮肤衰老功能的无毒副作用的护肤品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
益生菌发酵产物滤液，13份具体为：植物乳杆菌CT152发酵滤液8份，枯草芽孢杆菌T8发酵滤液5份。
所述松花粉提取物的制备方法为：取一定量的天然松花粉采用低温高速气流粉碎技术破壁处理20min，在常温常压下10倍量水35℃温浸蒸馏水浸泡30min后，超声提取60min，10000rpm/min低温离心15min，取上清液弃除固体物质，5℃条件下用分子筛超滤分离出分子量3000D以下的水溶性分子物质，经冷冻干燥得到冻干粉，－20℃保存备用。
松花粉的水提取率显著高于95％乙醇提取率，并且水提物活性明显高于醇提物。所以本实验的松花粉提取物选取的水提法。
所述植物乳杆菌CT152发酵滤液的制备方法，步骤如下：
(1)将冷冻保存的植物乳杆菌CT152接种于MRS培养基中，在温度37℃好氧环境培养12h进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为1*108cfu/ml，按照5％(v/v)MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养24h；
(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液(转速10000r/min，时间10min)，将上清液过0.22um除菌过滤器得到植物乳杆菌CT152发酵滤液。
所述枯草芽孢杆菌T8发酵滤液的制备方法，步骤如下：
(1)将冷冻保存的枯草芽孢杆菌T8接种于营养肉汁琼脂培养基中(NaCl 5g/L，牛肉浸出物3g/L，蛋白胨10g/L)，发酵培养2天进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为5*107cfu/ml，按照3％(v/v)发酵培养基培养3天；
所述发酵培养条件为培养温度为30℃，摇床转速为120rpm/min；
所述的发酵培养基是：CMC-Na 10g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、K2HPO42g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L；
(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液(转速8000r/min，时间10min)，将上清液过0.22um除菌过滤器得到枯草芽孢杆菌T8发酵滤液。
实施例2对比例
对比例1：
一种发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水31份。
所述益生菌发酵产物滤液均为植物乳杆菌CT152发酵滤液。
对比例2：
一种发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水31份。
所述益生菌发酵产物滤液均为枯草芽孢杆菌T8发酵滤液。
对比例3：
一种含有松花粉提取物的组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水43份。
对比例4：
一种发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水31份。
所述益生菌发酵产物滤液具体为：植物乳杆菌CT152发酵滤液8份，枯草芽孢杆菌T8发酵滤液5份。
对比例5：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
所述益生菌发酵产物滤液13份具体为：植物乳杆菌CT152发酵滤液13份。
对比例6：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
所述益生菌发酵产物滤液13份具体为：枯草芽孢杆菌T8发酵滤液13份。
对比例7：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
益生菌发酵产物滤液具体为：植物乳杆菌CGMCC1.12732发酵滤液13份。
实验方法同实施例1，但是将植物乳杆菌CT152更换成植物乳杆菌CGMCC1.12732进行发酵，其他不变。
对比例8：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
益生菌发酵产物滤液具体为：枯草芽孢杆菌CGMCC 1.12938发酵滤液13份。
实验方法同实施例1，但是将枯草芽孢杆菌T8更换成枯草芽孢杆菌CGMCC1.12938进行发酵，其他不变。
对比例9：
一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：
松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。
益生菌发酵产物滤液具体为：植物乳杆菌发酵滤液8份，枯草芽孢杆菌发酵滤液5份。
实验方法同实施例1，但是将植物乳杆菌CT152更换成植物乳杆菌CGMCC1.12732，讲枯草芽孢杆菌T8更换成枯草芽孢杆菌CGMCC 1.12938进行发酵，其他不变。
实施例2中所有对比例中发酵液制备方法和松花粉提取物制备方法均同实施例1。
实施例3
抑制非酶糖基化试验
非酶糖基化(NEG)是一系列复杂的非酶促反应，蛋白质和葡萄糖在体内发生非酶促反应形成Schiff碱等早期糖基化产物，进而经过一系列过程，形成不可逆的非酶糖基化终产物。从而使得蛋白质功能降低、老化，皮肤中的非酶糖基化反应会导致色素异常，分布不均，皮肤表现老状。本实验通过牛血清白蛋白和果糖混合孵育来模拟人体内非酶糖基化反应。
取一定量含10mg/mL牛血清白蛋白和0.25mol/L果糖的混合溶液作为反应液。设阳性对照组(质量分数为1.00％的Vc乙基醚)、阴性对照组(PBS代替样品)、空白组(PBS代替反应液)、PBS配制1％质量分数的实施例1组、对比例1-9组溶液做为处理组，每组设置3个平行。37℃避光孵育。第1、3、5、7天用荧光酶标仪在370nm(吸收波长)/440nm(激发波长)检测各试验组的荧光强度(RFU，Relative Fluorescence Unit)，并计算抑制率。结果如表1所示。
抑制率(％)＝[1-(RFU抑制组-RFU空白组)/RFU阴性对照组]×100％
表1抑制非酶糖基化试验结果
相对抑制率 D1 D3 D5 D7
阳性组(％) 45.36±3.66 53.36±5.20 61.20±6.00 67.26±5.20
实施例1组(％) 47.21±5.26 59.26±5.29 65.29±6.20 70.02±7.58
对比例1组(％) 12.26±2.06 14.06±2.69 16.25±2.96 17.29±2.66
对比例2组(％) 15.26±1.96 17.36±2.36 20.52±2.06 22.10±1.96
对比例3组(％) 19.26±1.55 21.64±3.26 25.67±4.36 26.26±3.86
对比例4组(％) 16.03±1.55 18.95±1.09 21.63±1.99 23.06±2.93
对比例5组(％) 20.26±2.41 22.06±3.02 25.11±2.68 28.25±4.26
对比例6组(％) 22.69±1.26 25.39±3.22 28.96±2.82 31.25±2.59
对比例7组(％) 18.26±1.26 22.16±3.33 25.26±3.98 27.21±3.26
对比例8组(％) 20.25±3.68 23.26±2.14 25.26±2.58 26.66±2.77
对比例9组(％) 20.25±1.98 23.44±2.49 26.24±3.55 28.58±4.10
从表1所示各个实验组经过培养时间的延长，对非酶糖基化反应的抑制率增加逐渐升高。
含有松花粉提取物和不含有松花粉提取物的组别比较，抑制能力更高，说明含有松花粉提取物有一定的抑制非酶糖基化能力。含有枯草芽孢杆菌T8的组别，其抑制率比不含有T8的组别稍高(对比例1、2)。含有松花粉提取物和其中一种发酵滤液(对比例5、6、7、8)，相对于只含有松花粉提取物组(对比例3)，有轻微的升高，其中含有枯草芽孢杆菌T8的组别升高稍多(对比例6)，但是均没有明显高于接近或者高于阳性组。说明单独一种滤液对松花粉提取物的抑制非酶糖基化能力提升有限。
实施例1和使用阳性组相比较，其抑制非酶糖基化能力更高。结果表明植物乳杆菌CT152+枯草芽孢杆菌T8发酵滤液配合松花粉提取物的时候，抑制效果最好，甚至高于阳性对照组，说明其相互之间有很好的协同作用，能够大大加强抑制非酶糖基化的能力。而使用其植物乳杆菌CGMCC 1.12732和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1293的滤液配合松花粉提取物，相对于松花粉组(对比例3、9)，升高程度并不明显。
研究表明枯草芽孢杆菌T8能够产生纤维素酶，且具有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。结合本实验，考虑枯草芽孢杆菌T8可能具备一定的提高清除糖基化产物的能力。枯草芽孢杆菌T8能够一定程度提高松花粉提取物的非酶糖基化抑制能力，当同时加入植物乳杆菌CT152和枯草芽孢杆菌T8发酵液时候，含有松花粉提取物的发酵组合物的非酶糖基化抑制能力甚至大于阳性组，这是出乎预料的。
实施例4
评估含有松花粉提取物的发酵组合物羟自由基清除能力的测定。
设置将实施例1组、对比例1-9组和VC组，VC作为阳性对照组用药。各组均分别用纯净水充分溶解，配制成浓度为15ug/ml、20ug/ml、25ug/ml、30ug/ml、35ug/ml的样品溶液，按照A0、A1、A2的配置方法分别加入样品、FeSO4·7H2O溶液(4.5mmol/L)、水杨酸-乙醇溶液(4.5mmol/L)和H2O2溶液(4.4mmol/L)，然后混合均匀，于37℃恒温水浴锅中避光温浴30min，测定510nm处的吸光度。计算公式如下：
羟自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
A0：1.0ml FeSO4·7H2O+1.0ml水杨酸+1.0ml过氧化氢+1.0mlH2O
A1：1.0ml FeSO4·7H2O+1.0ml水杨酸+1.0ml过氧化氢+1.0ml样品
A2：1.0ml FeSO4·7H2O+1.0ml水杨酸+1.0ml H2O+1.0ml样品
相关测试数据如表2所示：
表2不同浓度羟自由基清除率
Figure BDA0003843416870000121
Figure BDA0003843416870000131
从表2中的测试数据可以看出，实施例1和使用Vc的阳性实验组相比较，其羟自由基清除能力更高；而不含有松花粉提取物，只含有植物乳杆菌CT152或枯草芽孢杆菌T8发酵滤液的清除率最低(对比例1+2组清除率最低)；含有松花粉提取物的组合物有一定的羟自由基清除能力，但是仍然明显小于Vc组(对比例3组)；不含有松花粉提取物，含有两种发酵滤液的清除率相对较只含有一种发酵滤液略高，但是没有明显增高，说明两种发酵滤液组有轻微的协同效应(对比例4组)；含有松花粉提取物和其中一种发酵滤液(对比例4、5、7、8组)，相对于只含有松花粉提取物组(对比例3组)，对于提高松花粉提取物对自由基的清除率不太明显，说明单独一种滤液对松花粉提取物的抗氧化能力无明显提升。
但是当植物乳杆菌CT152+枯草芽孢杆菌T8发酵滤液配合松花粉提取物的时候，清除自由基的效果最好，甚至明显高于Vc组，说明其相互之间有很好的协同作用，能够大大加强自由基清除效果。而使用其植物乳杆菌CGMCC 1.12732和枯草芽孢杆菌CGMCC 1.1293的滤液配合松花粉提取物，相对于松花粉提取物组，升高程度并不明显。我们还单独使用其他两种滤液进行了相应的实验，也没有发现明显的提升作用。
研究发现植物乳杆菌CT152本身具有特殊的抗氧化和抗糖尿病的特性，枯草芽孢杆菌T8具有良好的纤维素降解能力，能够产生纤维素酶，且具有较强的内切葡萄糖苷酶活性、滤纸酶活性、外切酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。植物乳杆菌CT152+枯草芽孢杆菌T8+松花粉提取物(实施例1组)的羟自由基清除能力强，可能原因是植物乳杆菌CT152+枯草芽孢杆菌T8的上清液中产生的特殊成分有有协同作用，两种发酵液可以明显保护和提高了松花粉提取物中的抗氧化酶的活性，而其他乳杆菌和枯草芽胞杆菌却不具备这个能力(对比例9组)，植物乳杆菌CT152+枯草芽孢杆菌T8发酵液大大提高松花粉提取物的羟自由基清除能力的协同作用是出于预料的。
实施例5
细胞毒理测试：
将实施例1和实施例2得到的含有松花粉提取物的发酵组合物溶于无血清DMEM培养液中，各配制质量分数分别为0.25％、0.5％、1％、2％的4个样品，以无血清DMEM培养液为阴性对照样组进行MTT检测，评价含有松花粉提取物的发酵组合物的细胞毒性。
按照100μL/孔接种L929细胞至96孔板，调整浓度为1×105个/mL，在37℃、5％CO2，无血清DMEM培养液培养24h进行贴壁后，吸弃培养液，每孔加入100μL不同质量分数的样品溶液，阴性对照样组继续无血清DMEM培养，常规培养48h。再加入5mg/mL MTT溶液20μL，置培养箱内避光孵育4h。弃上清液加入DMSO100μL，摇床低速振荡20min，570nm波长处测定吸光度值。按下式计算其他各组细胞相对存活率(β)。结果如表3所示。
β＝An/A0
式中，An为实验组吸光度，A0为阴性对照组吸光度
表3细胞毒理实验
细胞相对存活率(％) 0.25％ 0.5％ 1％ 2％
实施例1组 93.36±9.63 92.36±9.36 90.36±7.26 88.36±9.06
对比例1组 97.63±9.29 96.36±8.69 95.21±6.99 90.36±9.31
对比例2组 95.62±6.30 94.26±9.67 90.39±8.93 89.26±9.12
对比例3组 96.36±9.31 93.30±8.96 90.36±9.06 87.36±9.03
对比例4组 94.01±7.97 93.53±7.12 90.01±7.35 89.01±7.11
对比例5组 93.67±8.76 92.36±8.50 90.12±8.24 88.37±7.95
对比例6组 95.29±8.23 92.36±9.82 91.51±9.52 89.26±9.26
对比例7组 94.30±7.36 92.99±9.74 91.06±9.25 88.29±8.92
对比例8组 96.78±6.24 93.87±9.87 90.87±8.15 8934±9.78
对比例9组 95.36±9.45 92.16±7.69 90.31±10.36 88.36±8.94
根据ISO 10993-5:2009所述的毒性分级评价方法，细胞存活率大于70％，可视为无毒性。本发明的组合物在所选取质量浓度下，细胞存活率较高均高于85％，考虑其无细胞毒性。
实施例6皮肤斑贴安全性试验
对本发明的含有松花粉提取物的发酵组合物进行人体安全性研究，选用1％浓度的本发明实施例1的含有纯净水溶液作为测试组1以及蒸馏水作为对照组进行测试。根据《化妆品卫生规范》(2007年版)中的规定，30位受试者中出现“++”级皮肤不良反应的人数多于2位或出现任何1位“+++”级或“+++”级以上皮肤不良反应时，判定受试物对人体有不良反应。相关测试结果显示，在去除斑试器0.5，24和48h后，30名受试者中蒸馏水对照区均未观察到皮肤不良反应，含有松花粉提取物的发酵组合物受试区无1例出现“++”反应，该结果表明含有松花粉提取物的发酵组合物安全性很高，对人体皮肤未引起不良反应。
实施例7
按照实施例1制备的含有松花粉提取物的发酵组合物各自再添加以下原料制备相对应的护肤品：
1.面霜的制备
一种含有松花粉提取物的护肤品的制备方法，包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(1％)，加入硬脂酸3％、十八醇3％、蜂蜡0.5％、吐温60 0.5％、甘油硬脂酸酯2％、角鲨烷1％、棕榈酸异丙酯3％、凡士林3％、环五聚二甲基硅氧烷1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯丁酯0.1％、甘油乙基己酸酯4％、甘油3％、丙二醇6％、三乙醇胺1.5％、香精0.1％，余量为水。搅拌使混匀，乳化20分钟，制得面霜。
2.眼霜的制备
一种含有松花粉提取物的发酵组合物的护肤品的制备方法，包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(2％)，加入10％甜杏仁油、5％霍霍巴油、1％甘油、2％1,3丁二醇、25％玫瑰纯露、0.5％汉生胶、1％聚丙烯酸钠/C18-C21烷/十三烷醇聚醚-6、0.1％双(羟甲基)咪唑烷基脲以及水余量，高速搅拌(10000r/min)20min使混匀，再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得眼霜。
3.乳液的制备
一种含有松花粉提取物的护肤品的制备方法，包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物(1％)，加入3％EDTA二钠、5％甘油、1％黄原胶、5％角鲨烷、5％甜扁桃油、3％辛酸/癸酸甘油三酯、5％牛油果油、0.1％二甲基聚硅氧烷、0.5％霍霍巴油、1％甘油酸硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、2％甘油硬脂酸酯、1％司盘60、1％硬脂酸、0.1％羟苯甲酯、0.3％三乙醇胺以及水余量，搅拌使混匀，再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得乳液。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种含有松花粉提取物的发酵组合物，其特征在于，以重量份数计，包括以下原料：松花粉提取物1份、益生菌发酵产物滤液13份、L-阿拉伯糖0.5份、蔗糖脂肪酸酯1份、去离子水30份。其中所述益生菌发酵产物滤液13份具体为：植物乳杆菌CT152发酵滤液8份，枯草芽孢杆菌T8发酵滤液5份；
所述植物乳杆菌CT152发酵滤液的制备方法，步骤如下：(1)将冷冻保存的植物乳杆菌CT152接种于MRS培养基中，在温度37℃好氧环境培养12h进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为1*108cfu/ml，按照5％(v/v)MRS液体培养基培养于37℃培养箱静置培养24h；(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液,转速为10000r/min，时间10min，然后将上清液过0.22um除菌过滤器得到植物乳杆菌CT152发酵滤液；
所述枯草芽孢杆菌T8发酵滤液的制备方法，步骤如下：(1)将冷冻保存的枯草芽孢杆菌T8接种于营养肉汁琼脂培养基中；所述营养肉汁琼脂培养基是NaCl5g/L、牛肉浸出物3g/L、蛋白胨10g/L；发酵培养2天进行活化，活化后的菌液混匀调整细菌浓度为5*107cfu/ml，按照3％(v/v)发酵培养基培养3天；所述发酵培养条件为培养温度为30℃，摇床转速为120rpm/min；所述的发酵培养基是：CMC-Na10g/L、(NH4)2SO44.0g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、K2HPO42g/L、牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L；(2)将由步骤(1)所得的发酵液离心收集上清液，转速为8000r/min，时间10min，将上清液过0.22um除菌过滤器得到枯草芽孢杆菌T8发酵滤液。
2.权利要求1所述的含有松花粉提取物的发酵组合物制备成面霜的应用，其特征在于：
包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物1％，加入硬脂酸3％、十八醇3％、蜂蜡0.5％、吐温60 0.5％、甘油硬脂酸酯2％、角鲨烷1％、棕榈酸异丙酯3％、凡士林3％、环五聚二甲基硅氧烷1％、羟苯甲酯0.1％、羟苯丁酯0.1％、甘油乙基己酸酯4％、甘油3％、丙二醇6％、三乙醇胺1.5％、香精0.1％，余量为水，搅拌使混匀，乳化20分钟，制得面霜。
3.权利要求1所述的含有松花粉提取物的发酵组合物制备成眼霜的应用，其特征在于：
包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物2％，加入10％甜杏仁油、5％霍霍巴油、1％甘油、2％1,3丁二醇、25％玫瑰纯露、0.5％汉生胶、1％聚丙烯酸钠/C18-C21烷/十三烷醇聚醚-6、0.1％双(羟甲基)咪唑烷基脲以及水余量，高速搅拌20min，转速为10000r/min，混匀后再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得眼霜。
4.权利要求1所述的含有松花粉提取物的发酵组合物制备成乳液的应用，其特征在于：
包括以下步骤：取上述含有松花粉提取物的发酵组合物1％，加入3％EDTA二钠、5％甘油、1％黄原胶、5％角鲨烷、5％甜扁桃油、3％辛酸/癸酸甘油三酯、5％牛油果油、0.1％二甲基聚硅氧烷、0.5％霍霍巴油、1％甘油酸硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、2％甘油硬脂酸酯、1％司盘60、1％硬脂酸、0.1％羟苯甲酯、0.3％三乙醇胺以及水余量，搅拌使混匀，再加入0.1％香精混合，乳化20分钟，制得乳液。
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