CN111671069A - 一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法，包括如下步骤：(1)糊化：以破壁松花粉或破壁松花粉残渣为原料，加水并升温，使淀粉糊化；(2)一次酶解：将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，使用淀粉酶进行酶解，酶解结束后弃上清，取沉淀；(3)二次酶解：将步骤(2)获得的沉淀使用蛋白酶进行酶解，酶解结束后取沉淀；(4)沉淀洗涤：先使用乙醇洗涤，再使用水清洗。本发明通过从破壁松花粉中提取松花粉壁的制备方法，摒弃采用强酸、强碱及有机试剂洗涤来去除内容物提取松花粉壁的常规方法，而是通过采用酶处理以及水和乙醇洗涤这种温和的方法，从而最大限度的避免对松花粉壁的品质影响。

Description

一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法
技术领域
本发明属于医药保健食品技术领域，具体涉及一种从破壁松花粉中提取 松花粉壁的方法。
背景技术
松花粉多指马尾松Pinus massoniana Lamb.、油松(Pinus tabulaeformisCarr.)、赤松(Pinus densiflora)、黑松等松科植物的雄性生殖细胞。松花粉在 我国的应用历史千年有余。松科植物约110种，分布于欧洲、亚洲、北美洲、 非洲北部。马尾松、油松、华山松等为我国特有的乡土树种，黑松原产日本 进和韩国东部沿海地区，在我国辽宁、河北、河南、山东、江苏、浙江、江 西及湖北等地大面积引种栽培。
其中云南松(Pinus yunnanensis)花粉除有美容、养颜的功效外,对心血 管疾病、肝脏疾病、内分泌疾病、糖尿病等均有显著疗效。松花粉壁主要由 孢粉素和纤维素组成，其中孢粉素作为花粉壁的主要成分，是一种难于分解 且抗逆性强、耐高温、耐强酸碱的惰性生物聚合物，由脂肪族-聚酮化合物衍 生的聚乙烯醇单元和7-O-p-香豆酰化的C16脂肪族单元组成，通过具有缩醛 的独特二恶烷部分交联，它使花粉外壁非常牢固，保护着花粉颗粒内的营养 成分和遗传物质。人类和单胃动物的消化液无法破坏花粉壁，因此目前大多的松花粉产品选择了破壁处理，或提取松花粉内容物研制开发产品。
已有大量研究探究过松花粉的各种生理功能，但目前鲜有对于松花粉壁 的研究，虽然对其成分结构已有了解，但对其生理活性的介绍相对较少。孢 粉素曾被认为是一种膳食纤维，且花粉外壁还含有大量的纤维素，虽然不溶 性膳食纤维无法被机体消化吸收，但可由肠道内的微生物发酵降解，并通过 调节肠道菌群、释放短链脂肪酸等代谢物、促进胆固醇和胆汁酸排出来维护 肠道健康，进而预防血脂异常、糖尿病、冠心病、肥胖症等代谢性疾病的发 生。大豆膳食纤维是大豆中以纤维素、果胶质、木聚糖、甘露糖为主的膳食 纤维，具有良好的胆固醇和胆汁酸结合能力，能有效较低大鼠血清总胆固醇 和LDL水平并改善葡萄糖耐量，大豆壳中的膳食纤维对粪便微生物群具有 积极作用，能够明显改变粪便微生物群的结构，不同程度的增加双歧杆菌和 乳杆菌等有益菌的丰度，并能够在人类和动物的肠道中被微生物降解利用， 有效促进短链脂肪酸(SCFAs)的产生。已知纤维素是一种有助于改善肥胖 的主要膳食纤维，那么在花粉壁中含量更高的孢粉素会不会有相同的功效， 这是目前还没有进行过的探究。
发明内容
本发明针对传统强酸、强碱等提取方法易产生溶剂残留以及对成分破坏 严重等问题，提供一种温和的从破壁松花粉中提取松花粉壁的制备方法。
具体技术方案如下：
一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法，包括如下步骤：
(1)糊化：以破壁松花粉或破壁松花粉残渣为原料，加水并升温，使淀 粉糊化；
(2)一次酶解：将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，使用淀粉 酶进行酶解，酶解结束后弃上清，取沉淀；
(3)二次酶解：将步骤(2)获得的沉淀使用蛋白酶进行酶解，酶解结 束后取沉淀；
(4)沉淀洗涤：先使用乙醇洗涤，再使用水洗涤。
进一步，步骤(1)中：糊化的条件为100℃热处理10-15mi n，通过糊化 除去淀粉，利于后续的酶解反应进行。
进一步，步骤(1)中：原料与水的质量比为1：(3-5)。
所述的原料优选为破壁松花粉经过活性成分提取后剩余的残渣，尤其是 经水提取后剩余的残渣。
所述的破壁松花粉的破壁率为93％-98％，破壁率通过显微镜观察测得。
进一步，步骤(2)中，所述的淀粉酶为α-淀粉酶和β-淀粉酶。
在进一步，步骤(2)的工作条件为：
向步骤(1)获得的体系中加入以原料计0.05wt％-0.2wt％的α-淀粉酶 和以原料计0.05wt％-0.2wt％的β-淀粉酶，在55-60℃、pH5.5-7.5的条件 下酶解60-90min，离心，弃去上清，保留沉淀。
进一步，步骤(3)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。
再进一步，步骤(3)中，酶解前，向沉淀中向步骤(2)获得的沉淀中 加入以其质量计3倍的pH为9的硼酸-硼砂缓冲液，以维持料液PH在9-11 之间。
步骤(3)的工作条件优选为：
向步骤(2)获得的沉淀中加入以其质量计2.5-4倍的pH为9的硼酸- 硼砂缓冲液，得料液；向料液中加入以原料计0.5wt％-1.5wt％的碱性蛋白酶， 在40-55℃的条件下酶解2-3h，将酶灭活，离心，弃去上清，保留沉淀。
其中，酶的灭活方法为高温灭活。
其中，步骤(2)与步骤(3)中的离心优选条件为：转速8000rpm，离 心时间5min。
进一步，步骤(4)的工作条件为：
进行乙醇洗涤，向步骤(3)获得的沉淀中加入无水乙醇，20-25℃超声 20-30min，离心，弃上清；共进行上述乙醇洗涤三次；
进行水洗涤，向沉淀中加入水，90-100℃超声20-30min，离心，弃上清； 共进行上述水洗涤三次。
再进一步，每次乙醇洗涤中，无水乙醇与步骤(3)获得的沉淀的质量比 为(3-4)：1；每次水洗涤中，水与步骤(3)获得的沉淀的质量比为(3-4)： 1。
再进一步，所述的超声的频率为200-400Hz。
本发明的有益效果如下：
本发明通过从破壁松花粉中提取松花粉壁的制备方法，摒弃采用强酸、 强碱及有机试剂洗涤来去除内容物提取松花粉壁的常规方法，而是通过采用 酶处理以及水和乙醇洗涤这种温和的方法，从而最大限度的避免对松花粉壁 的品质影响，并且减少有机试剂残留，增高松花粉壁提取率。本发明方法提 前的松花粉壁对小鼠的肝脏病变与血脂异常均有显著的缓解作用，优于传统 的酸法提取，也优于大豆膳食纤维。
附图说明
图1为实施例1中破壁松花粉残渣与松花粉壁的电镜图；
图2为实施例2中破壁松花粉残渣与松花粉壁的电镜图；
图3为实施例3中破壁松花粉残渣与松花粉壁的电镜图；
图4为对比例中破壁松花粉残渣与松花粉壁的电镜图；
图5为小鼠体重变化(A)、花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠体脂水平的 影响(B)和对肝指数的影响(C)；
图6为花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠TC(A)、TG(B)、HDL-C(C)和 LDL-C(D)含量的影响，花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠炎性细胞因子TNF-α (E)和I L-6(F)含量的影响。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
具体实施方式中使用松花粉为云南松花粉(Pinus yunnanensi)；使用 的松花粉残渣为云南松花粉水提残渣；
具体实施方式中使用的α-淀粉酶(3700活力单位/克)厂家北京索莱 宝科技有限公司；β-淀粉酶的(酶活10万单位/克)厂家北京索莱宝科技 有限公司；碱性蛋白酶(20万U/g)厂家北京索莱宝科技有限公司；
具体实施方式中使用的仪器如下:
Avanti JXN-26高速离心机(美国BECKMAN公司)；Spectra Max Plus酶 标仪(美国Molecular Devices公司)；TM3030台式电子显微镜(日本日立 公司)；Spectra Max Plus酶标仪(美国Molecular Devices公司)。
实施例1
(1)糊化：
以破壁松花粉残渣为原料，加入以其质量计3倍的水并沸水浴15min， 使淀粉糊化；
(2)一次酶解：
将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，其中加入以原料(壁松花 粉残渣)计0.1wt％的α-淀粉酶和以原料计0.1wt％的β-淀粉酶，在55℃水 浴、pH为6的条件下酶解60min，转速8000rpm离心5min，弃去上清，保留 沉淀；
(3)二次酶解：
向步骤(2)获得的沉淀中加入以其质量计3倍的pH为9的硼酸-硼砂 缓冲液，得料液；向料液中加入以原料计0.5wt％的碱性蛋白酶，在50℃水 浴的条件下酶解2h，沸水浴将酶灭活，转速8000rpm离心5min，弃去上清， 保留沉淀；
(4)沉淀洗涤：
进行乙醇洗涤，向步骤(3)获得的沉淀中加入无水乙醇，20℃超声30min， 超声频率为300Hz；离心，弃上清；共进行上述乙醇洗涤三次；每次乙醇洗 涤中，无水乙醇与步骤(3)获得的沉淀的质量比为3：1；
进行水洗涤，向沉淀中加入水，100℃超声30min，超声频率为300Hz； 离心，弃上清；共进行上述水洗涤三次；每次水洗涤中，水与步骤(3)获得 的沉淀的质量比为3：1；
将洗涤的沉淀烘干至恒重，即获得松花粉壁。
(5)松花粉壁的组成成分分析：
计算得松花粉壁的得率为43.75％。对蛋白质、还原糖和脂肪的含量进行 测定发现，经过酶处理和洗涤的松花粉壁基本上不含有营养成分，见表1。 (表1中的“洗涤”为未进行糊化和酶解，仅对其进行步骤(4)的洗涤)说 明此方法可以作为松花粉壁的提取方法，用于后续研究。苯酚硫酸法测得松 花粉壁中纤维素的含量为41.80％。
得率＝(松花粉壁质量/破壁松花粉残渣质量)×100％
表1松花粉壁提取优化过程的营养成分表
Figure BDA0002550585580000061
(6)进行形态学观察：
取原料破壁松花粉残渣与获得的松花粉壁，在电子显微镜下观察拍照， 照片见图1。图1中，左侧为处理前的破壁松花粉残渣，右侧为制备得的松 花粉壁。
实施例2
(1)糊化：
以破壁松花粉残渣为原料，加入以其质量计4倍的水并沸水浴12min， 使淀粉糊化；
(2)一次酶解：
将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，其中加入以原料计0.2wt％ 的α-淀粉酶和以原料计0.15wt％的β-淀粉酶，在60℃水浴、pH为7.5的 条件下酶解75min，转速8000rpm离心5min，弃去上清，保留沉淀；
(3)二次酶解：
向步骤(2)获得的沉淀中加入以其质量计3倍的pH为9的硼酸-硼砂 缓冲液，得料液；向料液中加入以原料计1.5wt％的碱性蛋白酶，在45℃水 浴的条件下酶解2.5h，沸水浴将酶灭活，转速8000rpm离心5min，弃去上 清，保留沉淀；
(4)沉淀洗涤：
进行乙醇洗涤，向步骤(3)获得的沉淀中加入无水乙醇，25℃超声25min， 超声频率为350Hz；离心，弃上清；共进行上述乙醇洗涤三次；每次乙醇洗 涤中，无水乙醇与步骤(3)获得的沉淀的质量比为4：1；
进行水洗涤，向沉淀中加入水，95℃超声25mi n，超声频率为350Hz；离 心，弃上清；共进行上述水洗涤三次；每次水洗涤中，水与步骤(3)获得的 沉淀的质量比为4：1；
将洗涤的沉淀烘干至恒重，即获得松花粉壁。
(5)松花粉壁的组成成分分析：
计算得松花粉壁的得率为45.36％。对蛋白质、还原糖和脂肪的含量进行 测定发现，经过酶处理和洗涤的松花粉壁基本上不含有营养成分，见表2(表 2中的“洗涤”为未进行糊化和酶解，仅对其进行步骤(4)的洗涤)。说明 此方法可以作为松花粉壁的提取方法，用于后续研究。苯酚硫酸法测得松花 粉壁中纤维素的含量为43.71％。
得率＝(松花粉壁质量/破壁松花粉残渣质量)×100％
表2松花粉壁提取优化过程的营养成分表
Figure BDA0002550585580000081
(6)进行形态学观察：
取原料破壁松花粉残渣与获得的松花粉壁，在电子显微镜下观察拍照， 照片见图2。图2中，左侧为处理前的破壁松花粉残渣，右侧为制备得的松 花粉壁。
实施例3
(1)糊化：
以破壁松花粉残渣为原料，加入以其质量计5倍的水并沸水浴13min， 使淀粉糊化；
(2)一次酶解：
将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，其中加入以原料计0.15wt％ 的α-淀粉酶和以原料计0.2wt％的β-淀粉酶，在58℃水浴、pH为5.5的条 件下酶解90min，转速8000rpm离心5min，弃去上清，保留沉淀；
(3)二次酶解：
向步骤(2)获得的沉淀中加入以其质量计3倍的pH为9的硼酸-硼砂 缓冲液，得料液；加入以原料计1.0wt％的碱性蛋白酶，在40℃水浴的条件 下酶解3h，沸水浴将酶灭活，转速8000rpm离心5min，弃去上清，保留沉 淀；
(4)沉淀洗涤：
进行乙醇洗涤，向步骤(3)获得的沉淀中加入无水乙醇，22℃超声20min， 超声频率为400Hz；离心，弃上清；共进行上述乙醇洗涤三次；每次乙醇洗 涤中，无水乙醇溶液与步骤(3)获得的沉淀的质量比为3.5：1；
进行水洗涤，向沉淀中加入水，95℃超声20min，超声频率为400Hz；离 心，弃上清；共进行上述水洗涤三次；每次水洗涤中，水与步骤(3)获得的 沉淀的质量比为3.5：1；
将洗涤的沉淀烘干至恒重，即获得松花粉壁。
(5)松花粉壁的组成成分分析：
计算得松花粉壁的得率为46.09％。对蛋白质、还原糖和脂肪的含量进行 测定发现，经过酶处理和洗涤的松花粉壁基本上不含有营养成分，见表3(表 3中的“洗涤”为未进行糊化和酶解，仅对其进行步骤(4)的洗涤)。说明 此方法可以作为松花粉壁的提取方法，用于后续研究。苯酚硫酸法测得松花 粉壁中纤维素的含量为42.26％。
得率＝(松花粉壁质量/破壁松花粉残渣质量)×100％
表3松花粉壁提取优化过程的营养成分表
Figure BDA0002550585580000091
(6)进行形态学观察：
取原料破壁松花粉残渣与获得的松花粉壁，在电子显微镜下观察拍照， 照片见图3。图3中，左侧为处理前的破壁松花粉残渣，右侧为制备得的松 花粉壁。
对比例
对破壁松花粉残渣进行酸解。
将40g破壁松花粉残渣粉悬浮于300ml磷酸(85％v/v)中。将其置于 装有玻璃冷凝器的1000ml单颈瓶中，并在温和搅拌(220rpm)下在70℃下 回流5h。在酸解后，收集孢粉质胶囊。在真空下过滤并按如下步骤洗涤如下： 在热水(5×100mL)，热丙酮(2×100mL)，热2M盐酸(1×100mL)，热水 (5)中洗涤×100mL)，热丙酮(1×100mL)，热乙醇(2×100mL)，热 水(1×100mL)。通过真空过滤收集最终产物。将洗过的松花粉壁转移到干 净的玻璃盘中，铺展以覆盖整个表面，并在通风橱中风干过夜。然后在真空 条件下在热板炉中完成干燥(60℃，4小时)，最终得松花粉壁。
松花粉壁的组成成分分析：
计算得松花粉壁的得率为35.21％。对蛋白质、还原糖和脂肪的含量进行 测定，结果见表4(表4中的“洗涤”为未进行酸解，直接进行对比例中的 洗涤)。苯酚硫酸法测得松花粉壁中纤维素的含量为37.94％。说明此方法提 取的松花粉壁不如实施例的效果好。
得率＝(松花粉壁质量/破壁松花粉残渣质量)×100％
表4松花粉壁提取优化过程的营养成分表
Figure BDA0002550585580000101
取原料破壁松花粉残渣与获得的松花粉壁，在电子显微镜下观察拍照， 照片见图4。图4中，左侧为处理前的破壁松花粉残渣，右侧为制备得的松 花粉壁。
实验
以下通过动物实验进一步说明本发明的有益效果。
1.1实验材料
大豆膳食纤维由山东禹王集团提供。基础饲料购自山东大学实验动物中 心。实验动物许可证号码：SCXK(鲁)20130009，山东大学实验动物中心。
1.2试验试剂
纤维素酶，丙硫氧嘧啶，猪胆盐，油红O染液，苏木素染液(北京Solarbio 公司)；小鼠IL-1，IL-6，TNF-α检测试剂盒(96T，杭州联科生物公司)； D2O(含0.1％TSP，美国Sigma公司)；胆固醇(北京鼎国昌盛生物技术有限 公司)。
1.3试验仪器
Thermo冰冻切片机(美国thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus 公司)；生化分析仪(贝克曼库尔特)；AVANCE III 400MHz全数字化超导 核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；核磁管(5mm；美国Wilmad公司)； 生物样品均质仪(杭州奥盛仪器有限公司)；离心机(德国Hettich公司)； Illumina MiSeq测序平台(苏州金唯智生物科技有限公司)。
1.4实验过程
C57BL/6雄性小鼠50只，适应性饲养7天后，随机分为5组：空白对照 组(HC)、肥胖模型组(MC)、松花粉壁组(PW-1)(实施例1)、松花粉壁组 (PW-2)(对比例)和大豆膳食纤维组(FC)。小鼠单笼饲养，5组小鼠分别给 予基础饲料、高脂饲料(基础饲料80wt％，猪油10wt％，蔗糖5wt％，胆固醇 4wt％，猪胆盐0.5wt％，丙硫氧嘧啶0.2wt％)、含2.5wt％松花粉壁(实施例 1)的高脂饲料、含2.5wt％松花粉壁(对比例)的高脂饲料和含2.5wt％大豆膳食纤维的高脂饲料喂养，松花粉壁的添加量根据松花粉的推荐摄入量经过 折算和预实验确定。保持充足的饮食和饮水，温度适宜，12小时光照，12小 时黑暗，隔日记录小鼠的体重。喂养6周后，收集新鲜粪便，禁食16h后麻 醉小鼠，眼球取血，引颈处死小鼠，解剖后分离肝脏、肾周、附睾脂肪和盲 肠，收集盲肠内容物，用于后续实验。
1.4.1血清生化分析
血清样本收集后于-80℃储存，使用时离心去除样本中的悬浮物，按不 同指标的试剂盒说明书对样本进行操作，全自动生化分析仪上样并检测，生 成样本浓度。
1.4.2肝脏细胞因子
使用小鼠IL-6、TNF-αELISA试剂盒对小鼠肝脏细胞因子进行检测。 将试剂盒从4℃中取出恢复至室温，按照试剂盒说明书的指示配制试剂并进 行实验，在酶标仪450nm和630nm处检测吸光度值，并根据标准曲线计算两 种细胞因子的浓度，实验设置5个重复。
1.5实验结果分析
1.5.1各组对小鼠体重、血脂和肝脏炎症的影响
实验结果见表5、表6与图5、图6。
图5为小鼠体重变化(A)、花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠体脂水平的 影响(B)和对肝指数的影响(C)。(注：*P<0.05，**P≤0.01，*** P≤0.005)
图6为花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠TC(A)、TG(B)、HDL-C(C)和 LDL-C(D)含量的影响，花粉壁和大豆膳食纤维对小鼠炎性细胞因子TNF-α (E)和IL-6(F)含量的影响。(注：*P<0.05，**P≤0.01，***P≤0.005)
表5小鼠肝指数与体脂比数据表
组别 肝重 肝指数/％ 脂肪 体脂比/％
空白对照组(HC) 1.273 5.40 0.311 1.32
肥胖模型组(MC) 1.098 5.98 0.253 1.39
松花粉壁组(PW-1) 1.079 6.09 0.202 1.18
松花粉壁组(PW-2) 1.195 6.21 0.264 1.36
大豆膳食纤维组(FC) 1.132 6.17 0.237 1.24
表6小鼠血液生化分析表
Figure BDA0002550585580000131
由表5可见，与HC组相比，MC组、PW组和FC组小鼠的体重在喂养第 二天出现了轻微下降，并在之后的六周缓慢上升，趋势接近(图5A)。在高 脂饮食诱导后，小鼠的体脂比略有升高，而摄入松花粉壁和大豆膳食纤维均 降低了体脂水平，且PW-1组更为明显，但均不存在显著差异。小鼠的肝指 数在高脂饮食诱导后显著上升，松花粉壁和大豆膳食纤维对高脂饮食诱导的 肝重增加预防效果有限。
由表6可见，与HC组相比，其余三组血清中的TC、HDL-C和LDL-C含 量均显著升高，其中PW-1组的TC水平略低于MC组，PW-1组和FC组的HDL- C含量显著低于MC组，而四个组的TG水平不存在显著差异。高脂饮食显著 升高了肝脏中的TNF-α含量，而PW-1组显著逆转了这种变化，I L-6含量的 变化也呈现了相同的趋势，并且PW-1优于PW-2组，但各组间均不存在显著 差异。上述结果说明摄入通过本专利所述提取方法得到的松花粉壁和大豆膳 食纤维以及实施例中提取方法得到的松花粉壁均对高脂饮食诱导的血脂异 常和肝脏炎症均有缓解作用，且本专利所述提取方法得到的松花粉壁的效果 相对更明显，优于其他两者。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种从破壁松花粉中提取松花粉壁的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)糊化：以破壁松花粉或破壁松花粉残渣为原料，加水并升温，使淀粉糊化；
(2)一次酶解：将步骤(1)获得的体系冷却至60℃以下后，使用淀粉酶进行酶解，酶解结束后弃上清，取沉淀；
(3)二次酶解：将步骤(2)获得的沉淀使用蛋白酶进行酶解，酶解结束后取沉淀；
(4)沉淀洗涤：先使用乙醇洗涤，再使用水洗涤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中：
糊化的条件为100℃热处理10-15min；原料与水的质量比为1：(3-5)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的淀粉酶为α-淀粉酶和β-淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)的工作条件为：
向步骤(1)获得的体系中加入以原料计0.05wt％-0.2wt％的α-淀粉酶和0.05wt％-0.2wt％的β-淀粉酶，在55-60℃、pH 5.5-7.5的条件下酶解60-90mim，离心，弃去上清，保留沉淀。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，酶解前，向沉淀中加入pH为9的硼酸-硼砂缓冲液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)的工作条件为：
向步骤(2)获得的沉淀中加入以其质量计2.5-4倍的pH为9的硼酸-硼砂缓冲液；加入以原料计0.5wt％-1.5wt％的碱性蛋白酶，在40-50℃的条件下酶解2-3h，将酶灭活，离心，弃去上清，保留沉淀。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)的工作条件为：
进行乙醇洗涤，向步骤(3)获得的沉淀中加入无水乙醇，20-25℃超声20-30min，离心，弃上清；共进行乙醇洗涤三次；
进行水洗涤，向沉淀中加入水，90-100℃超声20-30min，离心，弃上清；共进行水洗涤三次。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，每次乙醇洗涤中，无水乙醇与步骤(3)获得的沉淀的质量比为(3-4)：1；每次水洗涤中，水与步骤(3)获得的沉淀的质量比为(3-4)：1。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的超声的频率为200-400Hz。
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