CN118127111A - 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法 - Google Patents

一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118127111A
CN118127111A CN202410543621.8A CN202410543621A CN118127111A CN 118127111 A CN118127111 A CN 118127111A CN 202410543621 A CN202410543621 A CN 202410543621A CN 118127111 A CN118127111 A CN 118127111A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
peanut meal
peanut
temperature
enzymolysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202410543621.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN118127111B (zh
Inventor
崔言峰
任帅
高冠勇
宋立里
孙晓青
张明华
邹业飞
鲁源
周茂鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Jinsheng Grain And Oil Food Co ltd
Original Assignee
Shandong Jinsheng Grain And Oil Food Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Jinsheng Grain And Oil Food Co ltd filed Critical Shandong Jinsheng Grain And Oil Food Co ltd
Priority to CN202410543621.8A priority Critical patent/CN118127111B/zh
Publication of CN118127111A publication Critical patent/CN118127111A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN118127111B publication Critical patent/CN118127111B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/011—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法，属于花生蛋白加工技术领域。本发明所述方法包括使用复合菌发酵、萃取、复合分解酶酶解、富集等步骤。利用本发明所提供的方法得到的功能性短肽分子量小、易吸收，具有较高的增强免疫力活性，具有较高的应用价值。

Description

一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法
技术领域
本发明属于花生蛋白加工技术领域，涉及一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法。
背景技术
花生是世界上主要的油料资源之一，在世界植物油资源中占第四位，约占世界油料产量的14%。我国花生资源也很丰富，是我国的六大油料作物之一。我国是世界上重要的花生生产国，正常年景我国花生产量约1000万吨左右，约占世界总产量的 40%。山东是中国最大的花生产区，花生出口量占全国一半以上。
在我国，花生除直接食用外，主要用于榨油，花生粕就是花生仁经压榨提炼油料后的产品，通常花生粕分一次粕，二次粕。一次粕的意思是经过初次压榨剩余的花生渣，二次粕即压榨过两次的花生渣。花生粕其实是一种很好的植物蛋白资源，其中含有近50%的蛋白质，约63%是球蛋白，33%是伴花生球蛋白。花生蛋白的营养价值很高，其生物价为58，蛋白质有效价为1.7，比面粉和玉米高，它对维护人体健康和幼儿发育具有重要作用。
花生粕的营养价值较高， 其代谢能是粕类饲料中最高的， 粗蛋白质含量接近大豆粕，高达达48%以上， 精氨酸含量高达5.2%，是所有动、植物饲料中最高的。花生粕营养成分含量随着粕中含壳量多少而有差异，含壳量越多，粕的粗蛋白质及有效能值越低。不脱壳花生榨油生产出的花生饼，粗纤维含量可达25%。花生果仁中含有胰蛋白酶抑制因子， 加热可将抑制因子破坏，但温度过高会影响蛋白质的利用率。花生粕中常规营养成分含测定结果表明，花生粕中水分含量为10.69%，蛋白质含量为45.42%，脂肪含量为1.04%，黄酮含量为1.12%。由此可见,花生粕是一类高蛋白低脂肪、黄酮含量也非常高的食品资源。
花生粕中氨基酸含量丰富,共有18种氨基酸，而且必需氨基酸种类齐全、含量高。花生粕中总氨基酸、必需氨基酸和非必需氨基酸含量分别为39.65%、10.85%、28.80%；必需氨基酸占总氨基酸含量的27.36%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为0.3767。
由此可以看出，花生粕是一种高蛋白、低脂肪的天然优质保健食品的新资源。花生肽是以花生粕或花生蛋白为原料，经复合酶梯度酶解、灭酶、干燥等过程精制而成。已有文献公开，花生肽具有降低胆固醇、预防心血管疾病、延缓人体衰老、保肝护肝的功效，由于花生肽良好的营养特性、保健特性及加工性能使其具有广阔的市场空间，可开发出许多功能性保健产品。虽然花生肽具有较全面而均衡的营养，但其蛋白质可消化性较差，人体并不能完整吸收，因此，开展对花生蛋白的研究，寻求分子量小、易吸收、易溶解、易加工、热稳定，且营养成分不容易受外界影响而失活的花生短肽是十分有必要的。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种从高温花生粕中提取功能性短肽的方法，采用该方法可制得分子量小、具有调节免疫力作用的花生短肽。
本发明采用了以下技术方案来实现上述目的：
一种从高温花生粕中提取功能性短肽的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，将高温花生粕粉碎，将花生粕粉与水按照1:(3-5)的料液比混合，调节pH值至4-5，得到花生粕溶液；
步骤2，将复合菌接种至步骤1所得花生粕溶液中，在温度为20-35℃、湿度为70-80%的条件下发酵1-3天，得到发酵液；
步骤3，将步骤2所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至35-40℃，挥发除去残留乙醇，溶液备用；
步骤4，调节步骤2所得溶液的pH值至7-9，再向溶液中加入复合分解酶，在温度为25-40℃的条件下酶解3-5小时，酶解后灭酶，得到酶解液；
步骤5，将步骤4所得的酶解液浓缩至固形物含量为40-50%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到20-30%，搅拌，离心，取上清液；调整上清液pH值至2-3，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。
进一步的，所述步骤2中复合菌含有枯草芽孢杆菌、海枣曲霉。
所述步骤3中乙酸乙酯-乙醇混合溶液中乙酸乙酯、乙醇的体积比为10:(1-3)。
所述步骤4中的复合分解酶含有枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、纳豆激酶、葡聚糖内切酶。
更进一步的，所述步骤2复合菌液中枯草芽孢杆菌、海枣曲霉的质量比例为1:(3-5)。
步骤4中复合分解酶中枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、纳豆激酶、葡聚糖内切酶的质量比例为(3-5):(1-3):(0.5-1.5):(0.5-1)。
更进一步的，所述步骤2中复合菌的使用量为花生粕质量的5-15%；
所述步骤4中复合酶的使用量为花生粕质量的1-2%。
本发明提供所述功能性短肽的具体用途，即所述功能性短肽具有调节免疫力的功效，可用于制备增强免疫力的产品，例如药物或保健品。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明以高温花生粕为原料制备具有增强免疫力的功能性短肽，解决了高温花生粕中蛋白质高温变性，可消化性较差，人体并不能完整吸收的难题，制得的功能性短肽分子量小，吸收率高，具有显著的增强免疫力的作用，通过免疫活性试验可知，本发明所得到的功能性短肽具有较高的免疫活性，可用于加工药品或食品，实现了对花生粕的高效利用，避免了资源浪费。
2.本发明所提供的花生粕功能性短肽的制备方法中，对发酵的菌种进行了筛选，创造性的引入了海枣曲霉进行发酵，海枣曲霉与枯草芽孢杆菌协同作用，对花生粕进行发酵，对其中的纤维素、多糖、脂肪等成分进行有效分解，使得蛋白质脱落，便于后续的酶解反应，提高酶解效率。在酶解过程中，确定了最佳的水解酶种类及配比，使得酶解后的产物营养组成和活性得到了很大改善。
3.本发明在制备花生粕功能性短肽过程中对发酵液采用了有机溶剂萃取的方式，有效去除了发酵液中存在的黄酮、脂肪等杂质，实现了对多肽的纯化，便于在酶解过程中，水解酶对多肽的有效分解；并采用醇沉的方式除杂，酸沉的方式得到功能性短肽。
4.本发明所提供的花生粕中功能性短肽的制备方法，简单易操作，仅需发酵-酶解过程即可得到，无需进行复杂的重复发酵或重复酶解等过程，可有效减少人力物力，节约生产成本、无趣然，产品安全、无毒、无副作用，前景广阔。
附图说明
图1：小鼠体重平均增值。
图2：小鼠胸腺指数，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图3：小鼠脾脏指数，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图4：小鼠足跖肿胀度，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图5：小鼠半数溶血值（HC50），其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图6：吞噬百分率，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图7：吞噬指数，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
图8：小鼠乳酸脱氢酶活性，其中*表示，与空白组相比，P＜0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请权利要求所保护的范围。
实施例1
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入40L蒸馏水混合均匀，调节pH值至4.5，得花生粕溶液；将1kg复合菌（含0.25kg枯草芽孢杆菌、0.75kg海枣曲霉）接种至所得花生粕溶液中，在温度为30℃、湿度为70%的环境中发酵3天，得到发酵液；所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇（10:2，v/v）的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至35℃，挥发除去残留溶剂，溶液备用；调节溶液pH值至9，再加入0.2kg复合分解酶（0.1kg枯草杆菌蛋白酶、0.05kg菠萝蛋白酶、0.025kg纳豆激酶、0.025kg葡聚糖内切酶），在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为40%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到30%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至2，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
实施例2
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入50L蒸馏水混合均匀，调节pH值至5，得花生粕溶液；将1.5kg复合菌（含0.25kg枯草芽孢杆菌、1.25kg海枣曲霉）接种至所得花生粕溶液中，在温度为35℃、湿度为80%的环境中发酵1天，得到发酵液；所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇（10:1，v/v）的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至40℃，挥发除去残留溶剂，溶液备用；调节溶液pH值至7，再加入0.1kg复合分解酶（0.05kg枯草杆菌蛋白酶、0.03kg菠萝蛋白酶、0.015kg纳豆激酶、0.005kg葡聚糖内切酶），在温度为40℃的条件下搅拌酶解5小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为50%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到20%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至3，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
实施例3
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入30L蒸馏水混合均匀，调节pH值至4，得花生粕溶液；将0.5kg复合菌（含0.1kg枯草芽孢杆菌、0.4kg海枣曲霉）接种至所得花生粕溶液中，在温度为20℃、湿度为80%的环境中发酵3天，得到发酵液；所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇（10:3，v/v）的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至40℃，挥发除去残留溶剂，溶液备用；调节溶液pH值至8，再加入0.2kg复合分解酶（0.12kg枯草杆菌蛋白酶、0.04kg菠萝蛋白酶、0.02kg纳豆激酶、0.02kg葡聚糖内切酶），在温度为25℃的条件下搅拌酶解4小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为45%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到25%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至3，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
对比实施例1
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入40L蒸馏水混合均匀，调节pH值至4.5，得花生粕溶液；将2kg复合菌（含1kg植物乳杆菌、0.5kg黑曲霉、0.5kg纳豆菌）接种至所得花生粕溶液中，在温度为30℃、湿度为70%的环境中发酵3天，得到发酵液；所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇（10:2，v/v）的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至35℃，挥发除去残留溶剂，溶液备用；调节溶液pH值至9，再加入0.2kg复合分解酶（0.05kg枯草杆菌蛋白酶、0.05kg菠萝蛋白酶、0.05kg纳豆激酶、0.05kg葡聚糖内切酶），在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为40%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到30%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至2，取沉淀，洗涤，冻干，即得花生肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中植物乳杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、黑曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、纳豆菌购自昆山佰生优生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
对比实施例2
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入40L蒸馏水混合均匀，调节pH值至4.5，得花生粕溶液；将1kg复合菌（含0.5kg枯草芽孢杆菌、0.5kg海枣曲霉）接种至所得花生粕溶液中，在温度为30℃、湿度为70%的环境中发酵3天，得到发酵液；所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇（10:2，v/v）的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至35℃，挥发除去残留溶剂，溶液备用；调节溶液pH值至9，再加入0.2kg复合分解酶（0.1kg无花果蛋白酶、0.05kg木瓜蛋白酶、0.05kg胰蛋白酶），在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为40%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到30%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至2，取沉淀，洗涤，冻干，即得花生肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、其中无花果蛋白酶购自济南允诚生物科技有限公司，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。
对比实施例3
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入40L蒸馏水混合均匀，调节pH值至4.5，得花生粕溶液；将1kg复合菌（含0.25kg枯草芽孢杆菌、0.75kg海枣曲霉）接种至所得花生粕溶液中，在温度为30℃、湿度为70%的环境中发酵3天，得到发酵液；调节发酵液pH值至9，再加入0.2kg复合分解酶（0.1kg枯草杆菌蛋白酶、0.05kg菠萝蛋白酶、0.025kg纳豆激酶、0.025kg葡聚糖内切酶），在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得到酶解液；将所得的酶解液浓缩至固形物含量为40%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到10%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；往上清液中继续添加无水乙醇，使乙醇含量为50%，恒温匀速搅拌1h，离心，取沉淀部分，去除沉淀部分残余乙醇，冻干，得花生肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
对比实施例4
取10kg高温花生粕，粉碎，过40目筛，120℃温度下灭菌1小时，冷却后加入40L蒸馏水混合均匀，得花生粕溶液；向花生粕溶液中加入0.1kg枯草杆菌蛋白酶、0.025kg葡聚糖内切酶，在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得初步酶解液；向初步酶解液中接种0.25kg的枯草芽孢杆菌，在温度为30℃、湿度为70%的环境中发酵2天，再向发酵的花生粕溶液中接种0.75kg海枣曲霉，在温度为35℃、湿度为80%的环境中发酵2天，得发酵液；调节发酵液pH值至9，再加入0.05kg菠萝蛋白酶、0.025kg纳豆激酶，在温度为30℃的条件下搅拌酶解3小时，酶解后灭酶，得到终酶解液；将终酶解液浓缩至固形物含量为40%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到30%，恒温匀速搅拌1h，离心，取上清液；调整上清液pH值至2，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。本实施例中所使用的菌与酶均为现有市售产品，其中枯草芽孢杆菌购自山东中科嘉亿生物工程有限公司、海枣曲霉购自上海玉博生物科技有限公司、枯草杆菌蛋白酶与菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司、纳豆激酶购自陕西青淼生物科技有限公司、葡聚糖内切酶购自上海超研生物科技有限公司。
实验一 花生粕中功能性短肽理化指标测定。
分别测定实施例1-3、对比实施例1-4所得花生粕短肽的短肽得率和分子量分布。
表1 不同实施例花生粕短肽理化指标。
表2 不同实施例花生粕短肽的分子量分布。
自表1、表2中可知，实施例1-3所得的花生短肽分子量在2000Da以下的多肽片段占总量的95%以上，可见本发明中枯草芽孢杆菌、海枣曲霉的复合菌对花生粕中脂肪、纤维素、多糖等成分进行了有效分解，使得蛋白质更易脱落，并暴露更多的结合位点，被水解的几率增加，在使用复合分解酶进行酶解时，提高了酶解效率，且采用本发明所提供的复合分解酶对蛋白质水解具有专一性，酶解活性较高；采用对发酵液萃取的方式，可有效去除发酵液中存在黄酮、脂肪等成分，后采用醇沉、酸沉方式对分子量在2000Da以下的短肽进行富集。
实验二 花生粕功能性短肽的药理活性。
按照《保健食品检验与评价技术规范（2023版）》的指导原则，将本发明所得功能性短肽进行免疫力实验，具体过程如下所述。
1 实验分组。
取100只雄性昆明种小鼠，体重18-22g，许可证号SYXK(鲁) 2022 0009，适应性喂养7天后，随机分为空白组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组、实验5组、实验6组、实验7组、实验8组、实验9组，除正常喂养外，分别按照下述给药剂量给予相应的受试物。
2 给药剂量。
空白组：灌胃给予生理盐水；
实验1组：灌胃给予实施例1所制备的短肽，50mg/kg，每日一次；
实验2组：灌胃给予实施例1所制备的短肽，100mg/kg，每日一次；
实验3组：灌胃给予实施例1所制备的短肽，1000mg/kg，每日一次；
实验4组：灌胃给予实施例2所制备的短肽，100mg/kg，每日一次；
实验5组：灌胃给予实施例3所制备的短肽，100mg/kg，每日一次；
实验6组：灌胃给予对比实施例1所制备的花生肽，100mg/kg，每日一次；
实验7组：灌胃给予对比实施例2所制备的花生肽，100mg/kg，每日一次；
实验8组：灌胃给予对比实施例3所制备的花生肽，100mg/kg，每日一次；
实验9组：灌胃给予对比实施例4所制备的花生肽，100mg/kg，每日一次；
连续给药30天。
3 增强免疫力评价试验。
末次给药后禁食禁水24h，测量体重后小鼠处死，测定脏器指数、细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能测定、NK细胞活性（乳酸脱氢酶活性）。
3.1 脏器指数。
小鼠处死前称量小鼠体重，处死后解剖取出胸腺及脾脏并称重，按照下列公式计算：
胸腺指数=胸腺重量（mg）/小鼠体重（g）；
脾脏指数=脾脏重量（mg）/小鼠体重（g）。
3.2 细胞免疫功能-迟发型变态反应（足跖增厚法）。
小鼠用2%（v/v）绵羊红细胞腹腔注射免疫，每只小鼠注射0.2mL（约1×108个绵羊红细胞）；在免疫后4天，测量小鼠左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%（v/v）绵羊红细胞，每只小鼠20μL（约1×108个绵羊红细胞），注射24h后测量小鼠左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。
3.3 体液免疫功能-血清溶血素（半数溶血值测定）。
绵羊颈静脉取血，放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，脱纤维，备用；采集5只豚鼠血，分离血清，将1mL压积绵羊红细胞加入到5mL豚鼠血清中，放4℃冰箱30min，经常振荡，离心取上清液，作为补体。
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min离心10min。将压积绵羊血细胞用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只小鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。5天后，小鼠摘眼球取血，放置析出血清，2000r/min离心10min，收集血清。取血清用SA缓冲液稀释300倍，将稀释后的血清1mL置于试管内，一次加入10%（v/v）绵羊红细胞0.5mL，补体1mL（用SA缓冲液按照1:8稀释）。另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。置于37℃恒温水浴中保温30min，冰浴终止反应，2000r/min离心10min，取上清液1mL，加都式试剂3mL，同时取10%（v/v）绵羊红细胞0.25mL加都式试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。
3.4 单核-巨噬细胞功能-小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）。
取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维，用生理盐水洗涤3次，2000r/min离心10min，取上清，用生理盐水配成20%（v/v）的鸡红细胞悬液。
每只小鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1mL，间隔1h，颈椎脱臼处死小鼠，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后析出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min，孵毕，在生理盐水中漂洗，除去未贴片细胞，晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。
油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按照下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬指数（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的吞噬细胞数×100%；
吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。
3.5 NK细胞活性-乳酸脱氢酶测定法。
靶细胞传代：实验前24h将靶细胞（YAC-1细胞）进行传代培养，用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
效应细胞：小鼠无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液，用Hank's液清洗2次，每次在1000r/min下离心10min，弃上清液将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL 2倍Hank's液及8mLHank's液，1000r/min，离心10min，弃去上清，用1mL含10%小牛血清的RPMI 1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数，最后用RPMI 1640调整细胞浓度为2×107个/mL。
NK细胞活性检测：取靶细胞和效应细胞各100μL（效靶比50:1），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL，上述各项均设三个平行孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，室温下反应10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。
NK细胞活性（%）=（反应孔OD-自然释放孔OD）/（最大释放孔OD-自然释放孔OD）×100%。
4 结果及分析。
4.1 小鼠体重变化。
实验过程中对各组小鼠整体状态进行了观察记录：各组小鼠在实验期间饮食饮水、毛发、毛色、精神状态、行为活动等生理及行为状态均正常。 各给药组小鼠在试验期间的体重与空白组相比，略有增长，但整体无显著性差异（P＞0.05）。结果见图1。
4.2 脏器指数变化。
实验数据显示，实验2-5组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均有所提高，与空白组相比，差异性显著（P＜0.05），实验1组、对比实施例1组小鼠胸腺指数、脾脏指数略有升高，但整体与空白组相比，无显著性差异（P＞0.05），实验7-9组小鼠的胸腺指数、脾脏指数与空白组相比相当，无显著性差异（P＞0.05）。结果见图2、图3。
胸腺和脾脏重量的提高提示淋巴细胞数量的增加，体现出免疫应答反应的增强。
4.3 细胞免疫功能变化。
从实验结果可以看出，实验1-6组小鼠足跖肿胀程度与空白组相比，有显著性差异（P＜0.05），实验7-9组小鼠足跖肿胀程度与空白组相比，无显著性差异（P＞0.05）。结果见图4。
4.4 体液免疫功能变化。
与空白组相比，实验2-5组小鼠的半数溶血值显著提升，具有显著性差异（P＜0.05）；其余各组小鼠半数溶血值与空白组相比，无显著性差异（P＞0.05），但实验1组、实验6组小鼠的半数溶血值要高于实验7-9组。结果见图5。
4.5 单核-巨噬细胞功能测定。
自结果可知，实验1-5组小鼠的、吞噬百分率、吞噬指数较空白组，明显增加，具有显著性差异（P＜0.05）；实验6-9组小鼠的吞噬百分率、吞噬指数与空白组相比，无显著性差异（P＞0.05），其中实验6组小鼠吞噬百分率、吞噬指数较实验7-9组偏高。结果见图6、图7。
4.6 NK细胞活性。
自结果可知，实验1-5组小鼠NK细胞活性与空白组相比明显升高，具有显著性差异（P＜0.05）；实验6组小鼠NK细胞活性与空白组相比有所增加，但无显著性差异（P＞0.05），其余各组小鼠的NK细胞活性与空白组相比，无较大差别，无显著性差异（P＞0.05）。结果见图8。

Claims (7)

1.一种从高温花生粕中提取功能性短肽的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1，将高温花生粕粉碎，将花生粕粉与水按照1:(3-5)，g/mL的料液比混合，调节pH值至4-5，得到花生粕溶液；
步骤2，将含有枯草芽孢杆菌、海枣曲霉的复合菌接种至步骤1所得花生粕溶液中，在温度为20-35℃、湿度为70-80%的条件下发酵1-3天，得到发酵液；
步骤3，将步骤2所得发酵液采用乙酸乙酯-乙醇的混合溶液萃取，取萃取下层溶液，置于通风容器内，加热至35-40℃，挥发除去残留乙醇，溶液备用；
步骤4，调节步骤3所得溶液的pH值至7-9，再向溶液中加入含有枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、纳豆激酶、葡聚糖内切酶的复合分解酶，在温度为25-40℃的条件下酶解3-5小时，酶解后灭酶，得到酶解液；
步骤5，将步骤4所得的酶解液浓缩至固形物含量为40-50%，加入无水乙醇，使得溶液体系中的乙醇含量达到20-30%，搅拌，离心，取上清液；调整上清液pH值至2-3，取沉淀，洗涤，冻干，即得功能性短肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2复合菌中枯草芽孢杆菌、海枣曲霉的质量比为1:(3-5)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2中复合菌的使用量为花生粕质量的5-15%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4复合分解酶中枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶、纳豆激酶、葡聚糖内切酶的质量比为(3-5):(1-3):(0.5-1.5):(0.5-1)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤4中复合分解酶的使用量为花生粕质量的1-2%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3中乙酸乙酯-乙醇混合溶液中乙酸乙酯、乙醇的体积比为10:(1-3)。
7.一种功能性短肽在制备增强免疫力的产品中的应用，所述的功能性短肽是由权利要求1-6任一项所述的方法制备而成。
CN202410543621.8A 2024-05-06 2024-05-06 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法 Active CN118127111B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410543621.8A CN118127111B (zh) 2024-05-06 2024-05-06 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410543621.8A CN118127111B (zh) 2024-05-06 2024-05-06 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN118127111A true CN118127111A (zh) 2024-06-04
CN118127111B CN118127111B (zh) 2024-08-06

Family

ID=91232696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410543621.8A Active CN118127111B (zh) 2024-05-06 2024-05-06 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118127111B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570774A (zh) * 2009-06-01 2009-11-04 天津市食品加工工程中心 微生物发酵法制备花生蛋白多肽的方法
CN102174628A (zh) * 2011-01-12 2011-09-07 武汉百信食品有限公司 一种花生生物活性肽的制备方法
CN105886582A (zh) * 2014-11-03 2016-08-24 重庆市涪陵区渝杨榨菜（集团）有限公司 一种花生功能性混合短肽及其制备方法
CN107723329A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 山东农业大学 一种高免疫活性花生肽的制备方法
WO2021004463A1 (zh) * 2019-07-08 2021-01-14 桂林理工大学 一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法
CN115141870A (zh) * 2022-09-05 2022-10-04 烟台融科生物科技有限公司 一种花生蛋白肽的制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101570774A (zh) * 2009-06-01 2009-11-04 天津市食品加工工程中心 微生物发酵法制备花生蛋白多肽的方法
CN102174628A (zh) * 2011-01-12 2011-09-07 武汉百信食品有限公司 一种花生生物活性肽的制备方法
CN105886582A (zh) * 2014-11-03 2016-08-24 重庆市涪陵区渝杨榨菜（集团）有限公司 一种花生功能性混合短肽及其制备方法
CN107723329A (zh) * 2017-11-28 2018-02-23 山东农业大学 一种高免疫活性花生肽的制备方法
WO2021004463A1 (zh) * 2019-07-08 2021-01-14 桂林理工大学 一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法
CN115141870A (zh) * 2022-09-05 2022-10-04 烟台融科生物科技有限公司 一种花生蛋白肽的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOWEN PI ET AL.: ""Changes in IgE binding capacity, structure, physicochemical properties of peanuts through fermentation with Bacillus natto and Lactobacillus plantarum along with autoclave pretreatment"", 《FOOD CHEMISTRY》, vol. 392, 13 May 2022 (2022-05-13), pages 1 - 10 *
展俊岭 等: ""利用花生粕中蛋白制备多肽方法研究现状"", 《农业与技术》, vol. 37, no. 21, 31 December 2017 (2017-12-31), pages 7 - 8 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN118127111B (zh) 2024-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108796017B (zh) 牛骨肽及其酶解提取方法
CN109717340A (zh) 一种结合复合酶解的两步式蛹虫草酵素的发酵制备方法
KR101169775B1 (ko) 항염 활성을 갖는 발효녹용 추출물의 제조 방법, 이로부터 얻어진 추출물 및 이러한 추출물의 용도
CN109402204B (zh) 一种小球藻免疫活性肽的制备方法
CN111685286B (zh) 一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用
KR100894528B1 (ko) 스킨케어 촉진제
CN110495611A (zh) 一种提高海参营养保健功效的工艺
CN112515179A (zh) 一种利用黑曲霉液体发酵制备苦荞可溶性膳食纤维的方法
CN108185176A (zh) 具有提高免疫性能的生猪饲料
CN105859839B (zh) 一种促进仔猪生长的生物活性肽及其制备方法和应用
CN109223603B (zh) 治疗脱发组合物的制备方法
CN111449239B (zh) 一种灵芝菌发酵沙棘籽粕的功能性食品添加物及其制备方法
WO2019100540A1 (zh) 一种南美白对虾饲料添加剂的制备方法
CN118127111B (zh) 一种从高温花生粕中制备功能性短肽的方法
CN109232758B (zh) 一种榆黄蘑菌糠多糖及其提取工艺和应用
CN111903840A (zh) 一种富含益生菌的复方银杏叶饲料添加剂
CN116355816A (zh) 一种发酵翅果油种子的微生物及其降血脂组合物
CN116407572A (zh) 一种沙棘提取物及其制备方法和应用
CN109820088B (zh) 一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用
US20220305069A1 (en) A preparation method of antrodia cinnamomea water-insoluble dietary fiber
CN111543541A (zh) 一种鸡粪菌发酵黄芩茎叶水煎药渣制备的禽用饲料添加剂及其制备方法和应用
CN113439838A (zh) 发酵方法、发酵产物及包含其的试剂盒
CN117322629B (zh) 一种基于发酵酶解工艺的马蹄降脂组合物的制备方法
CN111011712B (zh) 一种具有肠道益生活性的发酵米糠及其制备方法
CN117257865B (zh) 一种用于提高禽畜免疫力的发酵型中药组合物的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant