CN107779405A

CN107779405A - 一种珊瑚拟青霉菌种及其培育方法、应用

Info

Publication number: CN107779405A
Application number: CN201710712719.1A
Authority: CN
Inventors: 陈文华; 徐凌川
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2018-03-09
Anticipated expiration: 2037-08-18
Also published as: CN107779405B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种珊瑚拟青霉菌种及其培育方法、应用，该菌株的保藏编号为CGMCC 14129，本发明通过固体培养及液体培养后，筛选出的菌株具有旺盛的菌丝体生长能力，富含丰富的蛋白质、醌茜素、无机盐及多种多糖体，在保健和医药行业具有重要的作用，为肿瘤和抑郁症患者带来新的福音；本发明培养的菌株耐盐碱性提高。

Description

一种珊瑚拟青霉菌种及其培育方法、应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种珊瑚拟青霉菌种及其培育方法、应用。

背景技术

珊瑚拟青霉最早于1887年被Solms-Laubach和Reink发现，广泛的在印度尼西亚等热带地区的柿子上发现。在台湾收集到的pesudocordyceps seminicola自然生长的成熟子座上发现了子囊孢子。Penicilliopsis clavariaeformis AP结晶纯化得到的代谢产物penicilliopsin，是一种橘黄色的色素物质，分离提取得到醌茜素(skyrin(dediemodin(8,8’)）或大黄素(emodin）。Skyrin和emodin有抗抑郁或者抗肿瘤活性。近年来，具有抗抑郁和抗肿瘤作用的先导化合物一直是国内、外药物工作者寻找的热点。而最理想的有效成分来源途径是通过微生物发酵培养大规模生产低成本原料。现有技术中，我国大陆地区尚未发现珊瑚拟青霉菌种。本发明首次在中国大陆地区发现了珊瑚拟青霉新菌株。

发明内容

本发明提供了一种新的珊瑚拟青霉菌种。

本发明还提供了上述珊瑚拟青霉菌种的培育方法。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种珊瑚拟青霉菌株，其保藏编号为CGMCC 14129。

本发明还提供了一种珊瑚拟青霉菌种的培育方法，包括以下步骤：

（1）制作母种：将第二年不能正常发芽的君迁子种子用75%酒精消毒2-3次，再切成小块放置于消毒好的PDA培养皿中，然后置于 25℃培养箱中恒温暗培养7d，直至长出黄绿色菌丝即得生产母种，再用试管培养基斜面保存；

（2）固体培养：将斜面保存的珊瑚拟青霉菌株，取小块接在新鲜的燕麦固体斜面培养基上，然后置25 ℃ 的恒温培养箱中培养7 d，将该菌种放入－4 ℃的冰箱内冷冻保存待用；

（3）液体培养：从燕麦固体培养基上挑选棒状菌丝接种与种子培养液中，置25℃控温摇床和150 r·min^-1的转速下培养3 d，备用。

进一步的，所述综合 PDA 斜面是由以下重量本分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂 2%、磷酸二氢钾 0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水。

进一步的，所述燕麦斜面培养基是由燕麦40g、琼脂6 g、葡萄糖20g、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、0.2g枸缘酸铵、25g橘汁及水组成。

进一步的，所述燕麦斜面培养基采用以下方法制备而成：称取重量份燕麦煮沸 30min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂，待琼脂完全溶解，再加入葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、枸缘酸铵及橘汁，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面。

进一步的，所述种子培养液是由以下重量百分比的原料组成：蔗糖3%、葡萄糖3%、酵母膏2%、蛋白胨1%、MgSO₄0.05%、KH₂PO₄0.1%、琼脂2%、余量为蒸馏水，PH值5.0--5.5。

本发明还提供了一种培育的珊瑚拟青霉在抗肝癌和鼻咽癌或抗抑郁症药物中的应用。

发明人在山东进行水生、耐盐中药资源普查时发现的一种拟青霉类的真菌，经过人工培养和分子鉴定为Penicilliopsis clavariaeformis AP，即“珊瑚拟青霉”

Penicilliopsis clavariaeformis AP.是penicilliopsis pesudocordyceps的无性型，Penicilliopsis pesudocordyceps的全型是pesudocordyceps seminicola。

本发明的有益效果为：

（1）本发明通过固体培养及液体培养后，筛选出的菌株具有旺盛的菌丝体生长能力，富含丰富的蛋白质、醌茜素、无机盐及多种多糖体，在保健和医药行业具有重要的作用；

（2）本发明培养的菌株耐盐碱性提高；

（3）珊瑚拟霉菌菌丝体中多糖具有显著地还原力和清除自由基的能力，能够显著提高抗氧化酶活性。

菌种保藏信息

保藏时间：2017年6月1日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No. 14129，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

分类命名：Penicilliopsis clavariaeformis。

附图说明

图1为实施例1中产孢结构的光学显微镜图。

图2为产孢结构脱落的孢子及正常孢子形态结构的光学显微镜图。

图3为实施例1中光学显微镜下的菌丝结构图。

图4为实施例1中菌丝的扫描电镜图。

图5为分生孢子的扫描电镜图。

图6为培育的菌丝体。

图7为不同碳源对珊瑚拟青霉发酵液3天后的PH值变化图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

材料与方法

1.1 材料与试剂

实验室所用的珊瑚拟青霉（Penicilliopsis clavariaeformis AP）菌株采集于君迁子（ Diospyros lotus L ）种子，该种子从济南佛慧山摘取。

硫酸亚铁、硝酸钠、甘油、二甲亚砜、石油醚、乙酸乙酯、95%乙醇、正丁醇、甲醇、磷酸二氢钾、苯酚均购自天津广成公司

1.2仪器

OBY-S80-SE1智能生化培养箱常州欧邦电子公司

SW-CJ-1G型单人净化工作台苏州净化设备公司

实施例1

一种珊瑚拟青霉菌种的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述综合 PDA 斜面是由以下重量本分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂2%、磷酸二氢钾 0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水；

（2）固体培养：将燕麦斜面保存的珊瑚拟青霉菌株，取小块接在新鲜的燕麦固体斜面培养基上，然后置25 ℃ 的恒温培养箱中培养7 d，将该菌种放入－4 ℃的冰箱内冷冻保存待用；

所述斜面培养基制备方法为：称取燕麦40 g煮沸 30 min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂棒6 g，使琼脂完全溶解，再加入葡萄糖20 g 、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、枸缘酸铵0.2g、橘汁25g，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面；

本发明中接种量均按本领域的常规接种量进行接种即可。

该实施例中中，产孢结构由菌柄、小枝、梗基组成，菌柄黄褐色，圆柱形，光滑，分支或不分支，5.0-6.0 um；每个菌柄有2-3个小枝，橄榄绿色，短棒状或筒状6-15 um，每个小枝上有3-5个梗基，棒状，光滑，顶部有微小的孢子，5-14 um；每个梗基上有5-10个瓶梗，紧密，淡黄色，长筒状，3-15 um。分生孢子由上到下产生，淡黄色到橄榄绿色，卵圆形（4.32*7.50um）到长椭圆形（3.27*7.70 um），光滑或稍粗糙，如图1和图2所示；

菌丝透明或半透明，光滑，直径4-7 um，有扫帚状，对称，有明显的分隔，紧密的分生孢子梗，分生孢子梗光滑，产孢结构帚状二轮生或者多轮生，孢子梗上有无色或淡黄色的宽卵形或长卵形分生孢子，光滑或稍粗糙，单个排列，具体如图3所示。

扫描电镜下菌丝体(如图4）形态光滑或稍微皱缩，密集成簇分布，粗细大致均匀，表面有明显的分隔，直径约4-6 um。大量分生孢子（如图5）紧贴在菌丝，极面观长椭圆形或宽椭圆形，赤道面观近球形。表面皱缩，大小约（6.5-9.5）um×（3.5-5.5）um，形态饱满，两端较尖；培育的珊瑚拟霉菌如图6所示。

菌株序列拼接和去除低质量区后序列

Record of Penicilliopsis clavariiformis (Ascomycota子囊菌门)on seeds ofDiospyros crassiflora (Ebenaceae柿树科).

菌株的ITS序列与Penicilliopsis clavariaeformis AP的ITS序列相似度上达到99%，利用MEGA软件分析后，同源性达到了99%，再结合显微形态学鉴别确定该菌株是珊瑚拟青霉（Penicilliopsis clavariaeformis AP）。

发明人经过大量试验发现，现有的培养基对于拟青霉菌的培养并不适合，对于液体培养基的不同碳源对拟青霉菌丝产量的影响进行了筛选，具体结果如表1。

表1不同碳源对珊瑚拟青霉菌丝产量的差异结果

由表1及图7可以看出，蔗糖和葡萄糖最适合珊瑚拟青霉菌丝生长，而不同碳源对菌丝体的产量影响还是很大的，最适碳源与其他真菌的最适碳源也不相同，这说明每一种新发现的真菌都有单因素筛选碳源的必要性。在发酵前测得所有液体培养基PH都在5.0-5.5之间，发酵后液体PH整体都有降低趋势，蔗糖、葡萄糖和麦芽糖变化更明显，而单因素碳源的PH的降低趋势与菌丝产量成正相关，现有技术中并未有相关报道。

效果实施例

（一）将本发明实施例中培养的菌株对菌丝干重、多糖含量、醌茜素进行检测，对比组为现有的发现的柿子上的珊瑚拟青霉，检测方法如下：

菌丝干重测定：真空抽滤200 mL发酵液得到菌丝体，然后置冰箱冷冻1 d,再置冷冻干燥机内冷冻干燥1 d，用分析天平精密称重。

多糖含量测定：采用硫酸-苯酚法。

具体检测结果见表2。

表2

（二）将培育的菌株进行醌茜素的提取，采用现有的常规提取方法进行提取。

1、抗抑郁活性：

试验方法：采用药理实验方法学中的小鼠强迫游泳和小鼠悬尾试验，均采用亚急性处理，腹腔给药方式。以氟西汀作为阳性对照。

小鼠强迫游泳测试试验结果见表3。

表3

小鼠悬尾测试结果见表4。

表4

2、提取的醌茜素及大黄素抗肿瘤活性

试验动物：昆明种小鼠60只，雄性，体重18-22g，由山东中医药大学实验动物中心提供。

瘤株：肝癌HepS22，上海谷研生物科技有限公司提供。

具体操作方法：将肝癌HepS22细胞在培养基中培养，至对数生长期时用生理盐水制备成单细胞悬液，10只小鼠皮下接种肝癌细胞0.2mL，接种4天后，小鼠腹腔明显肿大，颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，选择肿瘤生长旺盛、无坏死的癌组织，加入无菌生理盐水，制备成单细胞悬液，瘤细胞计数为2×10⁶个/ml，然后接种于健康小鼠右前肢下，接种0.2mL。给药时用蒸馏水进行稀释，空白组K1喂生理盐水即可，按照0.5g/kg体重进行灌胃，每天一次，给药10天后处死。摘瘤，称重，计算抑瘤率，结果见表5。

表5

上述抑瘤率（抑瘤率≥30%判定具有一定的抗癌作用）的计算公式为：

抑瘤率（%）=（空白组平均瘤重-给药组平均瘤重）/空白组平均瘤重×100%。

采用本发明提取的醌茜素及大黄素同样对鼻咽癌小鼠模型，将鼻咽癌细胞贴壁或成活经传代2-3代，将肿瘤细胞悬液皮下注射至裸鼠腋窝，注射剂量0.2mL/只，记录肿瘤生长情况，SPF条件下饲养至肿瘤长至5mm左右即可。按照上述同样的方法进行喂药，统计发现抑瘤率可达51.2%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种珊瑚拟青霉菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC 14129。

2.一种如权利要求 1 所述的珊瑚拟青霉菌种的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述综合 PDA 斜面是由以下重量本分比的原料组成：马铃薯 20%、葡萄糖 2%、琼脂 2%、磷酸二氢钾 0.3%、硫酸镁 0.15%，其余为水。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述燕麦斜面培养基是由燕麦40g、琼脂6g、葡萄糖20g、蔗糖10 g、蛋白胨2 g 、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）1 g、硫酸镁（MgSO₄）0.5 g、0.2g枸缘酸铵、25g橘汁及水组成。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述燕麦斜面培养基采用以下方法制备而成：称取重量份燕麦煮沸 30 min，过滤，取其滤液按比例加入琼脂，待琼脂完全溶解，再加入葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、枸缘酸铵及橘汁，加水至 1000 m L后灭菌，温度降至室温时倒入试管中制备成为斜面。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养液是由以下重量百分比的原料组成：蔗糖3%、葡萄糖3%、酵母膏2%、蛋白胨1%、MgSO₄0.05%、KH₂PO₄0.1%、琼脂2%、余量为蒸馏水，PH值5.0--5.5。

7.一种如权利要求2-6任一项所述的方法培育的珊瑚拟青霉在抗肝癌和鼻咽癌或抗抑郁症药物中的应用。