CN103897988A - 利用美洲大蠊培养虫草菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用美洲大蠊培养虫草菌的方法。方法主要包括：（1）菌种制备；（2）固体培养基的制备；（3）固体培养；（4）固体培养物后处理；使用本发明所提出的利用美洲大蠊培养虫草菌的方法，使虫草菌充分发酵转化美洲大蠊，促进培养物药用成分的积累。本发明操作简便，效果良好，可进行大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，涉及利用美洲大蠊培养虫草菌的方法。
背景技术
美洲大蠊Periplaneta americanaL.属于昆虫纲蜚蠊目蜚蠊科，俗称“蟑螂”，是我国传统的中药材，其入药始载于《神农本草经》，谓“治：血瘀，症坚、寒热、破积聚、喉咽痹”。《本草纲目》记载其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”。美洲大蠊中含有大量的蛋白质、氨基酸、脂质、矿质元素和微量元素，具有较高的营养价值。美洲大蠊提取物具有很强的修复能力，可用于治疗烧伤、烫伤、溃疡等疾病，现代医学研究表明美洲大蠊还具有抗癌、解毒、治疗心血管疾病等功效。中国科学院昆明动物研究所研究表明，从美洲大蠊提取的氨基酸与粘多糖的化合物具有较强的抗艾滋病毒活性。此外，美洲大蠊繁殖快、易培养，具有十分重要的药用价值及经济价值，目前已作为康复新、心脉龙、肝龙等药品的重要原料。
虫草是虫草真菌寄生在昆虫上形成的复合体，虫草的主要成分包括虫草酸、腺苷、虫草素、腺嘌呤等，虫草属中许多种类都是名贵的中药材。冬虫夏草具益精气、补虚损、止咳化痰之功效，具有免疫调节、抗肿瘤、升白细胞、降血压、抗衰老、抗疲劳、调节内分泌、抗病毒等多种药理作用，长期以来被视为珍贵的滋补中药。禅花的药用已有1000多年的历史，宋朝唐慎微所著《经史证类备急本草》中言“蝉花味甘寒，无毒，主小儿天吊，夜啼，心悸”。蛹虫草含有虫草素、腺苷、多糖、凝集素等活性物质，具有抗肿癌，抗炎，抗病毒，增强机体免疫力等功效。蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali Chen et Shen），蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali Chen et Dai），蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson）和蛹草拟青霉（Paecilomyces militaris Liang）分别分离自冬虫夏草，蝉花和蛹虫草。人工培养的虫草菌丝体不仅具有野生虫草主要活性成分，并且能在短时间内获得高于天然虫草营养价值和药用价值的虫草培养物。
随着人类掠夺式的采挖以及生态环境的破坏，导致虫草产量逐年降低，价格涨幅较大，因此人工培育虫草菌丝体用于替代天然虫草成为趋势。利用中药材发酵培养虫草菌，可使培养物兼具虫草和中药材的功效成分，如蔡海德发明的复方发酵虫草菌粉黄芩苷组合药物（中国发明专利 201110177641.0）。目前利用中药材发酵培养虫草菌，普遍使用植物药材为原料，但植物药材营养成分较为单一，需加入多种原料促进虫草菌的生长，从而影响了虫草菌对中药材的发酵转化。动物药材含有较丰富的虫草菌所需营养成分，无需加入过多原料，可使中药材的发酵更加充分。本发明利用美洲大蠊丰富的营养成分培养虫草菌，促进培养物药用成分的积累。
发明内容
本发明提供了一种利用美洲大蠊培养虫草菌的方法。
该方法的操作步骤如下：
（1） 生产菌株为蝙蝠蛾被毛孢（Hirsutella hepiali Chen et Shen），蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali Chen et Dai），蝉拟青霉（Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson），蛹草拟青霉（Paecilomyces militaris Liang）；
（2） 菌种制备：将蝙蝠蛾被毛孢菌株接种到PDA液体培养基，于18 ℃恒温培养50 d，待用；将蝙蝠蛾拟青霉，蝉拟青霉，蛹草拟青霉分别接种到PDA斜面培养基，于25 ℃恒温培养30 d，待用；
（3） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃高压灭菌30 min；
（4） 固体培养：将步骤（2）中制备好的菌种分别按2 ml/瓶的量接入步骤（3）三角瓶固体培养基中，于18-25 ℃静置培养20-50 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（5） 培养物后处理：将步骤（4）中培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80 目粉末；检测虫草酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、3′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量。
本发明的关键点在于：充分利用美洲大蠊丰富的营养成分培养虫草菌，调整温度、时间等培养条件，以上关键点如能把握好，可以显著提高发酵物的主要药用成分含量。
本发明操作简便，效果良好，成本低廉，可应用到大规模培养生产虫草菌丝体的实际生产过程中。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不是对本发明的限制。
实施例1：利用美洲大蠊培养蝙蝠蛾被毛孢
（1） 菌种制备：将蝙蝠蛾被毛孢菌株接种到PDA液体培养基，于18 ℃恒温培养50 d，待用；
（2） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃灭菌30 min；
（3） 固体培养：将制备好的菌种按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于18 ℃静置培养50 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（4） 固体培养物后处理：将培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80目粉末，检测虫草酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量，其结果见表1。
表1利用美洲大蠊培养蝙蝠蛾被毛孢培养物的重要指标成分含量
| 药用成分 | 虫草酸 % | 腺苷 ug/g | 2′-脱氧腺苷 | 尿嘧啶 ug/g | 腺嘌呤 ug/g | 蛋白质 % |
| 蝙蝠蛾被毛孢 | 0.86 | 51.36 | 29.21 | 252.21 | 71.84 | 63.17 |
| 空白对照 | 0.77 | 35.64 | 0 | 113.07 | 9.26 | 63.03 |
注：空白对照为相同条件下，不接菌的培养基为空白对照。
实施例2：利用美洲大蠊培养蝙蝠蛾拟青霉
（1） 菌种制备：将蝙蝠蛾拟青霉菌株接种到PDA斜面培养基，于25 ℃恒温培养30 d，待用；
（2） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃灭菌30 min；
（3） 固体培养：将制备好的菌种按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于25 ℃静置培养30 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（4） 培养物后处理：将培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80目粉末，检测虫草酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量，其结果见表2。
表2利用美洲大蠊培养蝙蝠蛾拟青霉培养物的重要指标成分含量
| 药用成分 | 虫草酸 % | 腺苷 ug/g | 2′-脱氧腺苷 | 尿嘧啶 ug/g | 腺嘌呤 ug/g | 蛋白质 % |
| 蝙蝠蛾拟青霉 | 1.43 | 118.61 | 227.19 | 57.23 | 23.58 | 61.17 |
| 空白对照 | 0.77 | 35.64 | 0 | 113.07 | 9.26 | 63.03 |
注：空白对照为相同条件下，不接菌的培养基为空白对照。
实施例3：利用美洲大蠊培养蝉拟青霉
（1） 菌种制备：将蝉拟青霉菌株接种到PDA斜面培养基，于25 ℃恒温培养30 d，待用；
（2） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃灭菌30 min；
（3） 固体培养：将制备好的菌种按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于25 ℃静置培养25 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（4） 培养物后处理：将培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80目粉末，检测虫草酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量，其结果见表3。
表3利用美洲大蠊培养蝉拟青霉培养物的重要指标成分含量
| 药用成分 | 虫草酸 % | 腺苷 ug/g | 2′-脱氧腺苷 | 尿嘧啶 ug/g | 腺嘌呤 ug/g | 蛋白质 % |
| 蝉拟青霉 | 1.31 | 48.68 | 309.30 | 344.98 | 71.84 | 60.56 |
| 空白对照 | 0.77 | 35.64 | 0 | 113.07 | 9.26 | 63.03 |
注：空白对照为相同条件下，不接菌的培养基为空白对照。
实施例4：利用美洲大蠊培养蛹草拟青霉
（1） 菌种制备：将蛹草拟青霉菌株接种到PDA斜面培养基，于25 ℃恒温培养30 d，待用；
（2） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃灭菌30 min；
（3） 固体培养：将制备好的菌种按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于25 ℃静置培养20 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（4） 固体培养物后处理：将培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80目粉末，检测虫草酸、腺苷、3′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量，其结果见表4。
表4利用美洲大蠊培养蛹草拟青霉菌培养物的重要指标成分含量
| 药用成分 | 虫草酸 % | 腺苷 ug/g | 3′-脱氧腺苷 | 尿嘧啶 ug/g | 腺嘌呤 ug/g | 蛋白质 % |
| 蛹草拟青霉 | 1.69 | 49.65 | 2737.75 | 619.48 | 200.64 | 56.09 |
| 空白对照 | 0.77 | 35.64 | 0 | 113.07 | 9.26 | 63.03 |
注：空白对照为相同条件下，不接菌的培养基为空白对照。
Claims (1)
1.一种利用美洲大蠊培养虫草菌的方法，其特征在于该方法的操作步骤包括：
（1） 菌种制备：将蝙蝠蛾被毛孢菌株接种到PDA液体培养基，于18 ℃恒温培养50 d，待用；将蝙蝠蛾拟青霉，蝉拟青霉，蛹草拟青霉分别接种到PDA斜面培养基，于25 ℃恒温培养30 d，待用；
（2） 固体培养基的制备：固体培养基的配方为：美洲大蠊20 g，蔗糖2 g，水60 ml，混匀装入300 ml三角瓶中，121 ℃高压灭菌30 min；
（3） 固体培养：将制备好的菌种分别按2 ml/瓶的量接入三角瓶固体培养基中，于18-25 ℃静置培养20-50 d，取出培养物；相同条件下，不接菌的培养基为空白对照；
（4） 固体培养物后处理：将培养好的固体培养物50 ℃恒温烘干，然后粉碎至80目粉末，检测虫草酸、腺苷、2′-脱氧腺苷、3′-脱氧腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤和蛋白质的含量。
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