CN103734022B - 生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)TIB.BPE.10010，保藏编号为CGMCC No.6232。本发明还涉及麦角硫因的制备方法，包括发酵培养糙皮侧耳CGMCC No.6232生物合成麦角硫因和从菌丝体细胞内浸提麦角硫因的步骤。

Description

生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法

技术领域

本发明属于生物资源、发酵工程和天然产物的生物合成领域。更具体地，本发明涉及一株生产麦角硫因的菌株，糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)，以及利用该菌株发酵制备麦角硫因的方法。

背景技术

麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，是机体内重要的天然活性物质，具有很强的有抗氧化活性：清除活性氧族和活性氮化物，激活抗氧化物酶，抑制超氧化物歧化酶(Aruoma OI，Whiteman M，England TG，Halliwell B.Antioxidantaction ofergothioneine assessment of its ability to scavengeperoxynitrite.BBRC，1997，231：389～391.)，抑制各种血红素蛋白发生氧化反应等(RomaroR，et al.The reactivity of thiols and disulfides with different redoxstates tomyoglobin[J].Biol.Chem.，1992，267：1680～1688.)。此外，麦角硫因还具有防止紫外辐射(Rougee M，et al.Deactivation of singlet molecularoxygen by thiolsand related compounds，possible protectors against skinphotosensitivity[J].Photochem.Photobiol.1988，47：485～489.)，螯合二价金属离子，调节生物体内的氧化还原平衡，参与细胞内的能量调节(Hartman PE.Ergothioneine as an antioxidant[J].Methods Enzymol，1990，186：310～318.)，保护线粒体DNA，对外源物质解毒及细胞生理保护剂等多种功能。与其它抗氧化剂和活性物质相比，麦角硫因具有以下的优势：它是生物体内的天然产物，无毒，无异味；稳定性好，生理pH条件下不会自发氧化；极易溶于水，在水溶液中不易分解；对光、热不敏感；能同时清除自由基和活性氧化物；对O^2-具有极高的亲和力。因此，麦角硫因在器官和细胞保存、医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域具有广泛的用途和市场前景。

麦角硫因的制备方法有三类：化学合成法、提取法以及生物合成法。生物合成法包括固体发酵和液体深层发酵。用化学法合成左旋的麦角硫因十分困难，合成的原料昂贵，合成成本高，麦角硫因产品必须达到很高的纯度才能保证产品的安全；提取法因原料中麦角硫因的含量低，提取成本高；菌丝体的固体发酵法可以使用的提高麦角硫因含量的技术手段极为有限，菌丝体中麦角硫因的含量低；利用食用菌深层发酵制备麦角硫因是其商业化绿色生产的主导方向。

Pramvadee Tepwong(Pramvadee Tepwong，Anupam Giri，FumitoSasaki，etal.Mycobial enhancement of ergothioneine by submergedcultivation of ediblemushroom mycelia and its application as anantioxidative compound[J].FoodChemistry，2012，131：247～258.)、AhnJ(Republic KR Forestry Res Inst.Culturemedium of Ganodermaneo-japonicum for increasing ergothioneine and culturemethod ofGanoderma neo-japonicum[P].KR：KR20100025825A.)和黄龄谊(黄龄谊，高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾：中兴大学，2010.)等人利用香菇(Lentinula edodes)、新日本灵芝(Ganoderma peo-japonicum)和杏鲍菇(Pleurotuseryngii)菌丝体进行液体深层发酵，菌丝体中麦角硫因的含量分别达到3.45mg/g DW、3.43mg/g DW和3.93mg/g DW，折算成发酵液中麦角硫因的含量分别为23.6mg/L、57.5mg/L和62.2mg/L。

目前深层发酵法制备麦角硫因的主要问题是产物的产率低，影响麦角硫因发酵产率的两个主要因素是生产菌种和生产工艺。因此，迫切需要筛选得到麦角硫因的高产菌株，建立菌株高效合成麦角硫因的方法。

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)，属担子菌亚门(Basidiomycotina)，侧耳属(Pleurotus)，是一种食用菌。糙皮侧耳含丰富的营养物质，每百克干品含蛋白质20～23克，氨基酸成分种类齐全，矿物质含量丰富，含有钾、钠、钙、镁、锰、铜、锌、硫等14种微量元素，还含有维生素B₂、维生素C、维生素D以及麦角固醇等。糙皮侧耳易于进行固体栽培和液体发酵培养，且生长迅速，产量高。

发明内容

本发明一个方面是提供一株糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)TIB.BPE.10010，已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.6232。

该糙皮侧耳CGMCC No.6232在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较快，于25℃黑暗条件下生长7天，菌落直径为58～60mm，呈白色，絮状，气生菌丝茂盛；背面呈浅褐色，无水溶性色素；其菌落形态特征参见图1。该菌株的营养菌丝壁光滑或粗糙，具分隔，分枝多，宽2.1～8.6μm；有锁状联合现象，未见无性孢子，参见图2。

该糙皮侧耳CGMCC No.6232的rRNA基因序列(28S rDNA的D1D2区序列片段)和ITS序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，参见图3和图4。

本发明所提供的糙皮侧耳CGMCC No.6232的脂肪酸成分见后文的表1，G+C mol％含量为50.95％，该菌株的适宜生长温度是19～31℃，液体深层发酵时可以生物合成麦角硫因。

本发明的另一个方面是提供一种麦角硫因的生物合成制备方法，通过利用糙皮侧耳CGMCC No.6232液体深层发酵而制备麦角硫因。

具体地，本发明提供一种麦角硫因的制备方法，包括：(a)在液体培养基中培养糙皮侧耳CGMCC No.6232；和(b)将培养的糙皮侧耳CGMCC No.6232在其生长期内接种至发酵培养基，由此通过糙皮侧耳CGMCC No.6232使发酵培养基发酵。优选地，糙皮侧耳CGMCCNo.6232获自PDA(Becton，Dickinson and Company)斜面菌种。还优选地，培养的糙皮侧耳CGMCC No.6232按4～20％的接种量(V/V)接种至发酵培养基。进一步优选地，步骤(a)的培养在约19～31℃、优选约25～28℃进行至少3天，例如约3～15天，优选约3～7天，更优选约3～5天；步骤(b)的培养在约19～31℃、优选约25～28℃进行至少6天，例如约7～20天，优选约7～15天，更优选约8～15天。更进一步地，培养在摇床上进行。仍进一步地，所述摇床的转速被设定为约100～200rpm。通过该方法，发酵液中麦角硫因的浓度至少为35mg/L，优选至少为50mg/L，更优选至少为70mg/L，还更优选至少为90mg/L，进一步优选至少为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L或140mg/L。

更具体地，本发明的麦角硫因的制备方法包括如下步骤：

1)将糙皮侧耳CGMCC No.6232的固体菌种(优选PDA(Becton，Dickinson andCompany)斜面菌种)接种至液体种子培养基，在19～31℃、优选25～28℃摇床100～200rpm培养至少3天，例如约3～15天，优选约3～7天，更优选约3～5天，制备种子液；

2)将种子液按4～20％的接种量(V/V)接种至发酵培养基，发酵培养基在500mL三角瓶中的装液量为100～200mL，然后在19～31℃、优选25～28℃摇床100～200rpm培养至少6天，例如约7～20天，优选约8～15天，更优选约7～15天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液；

3)发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50～100℃、优选60～95℃、更优选80～90℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中

所述的液体种子培养基的组成为：玉米粉15～50g/L(优选25～40g/L)、豆粕粉10～35g/L(优选15～25g/L)、α-淀粉酶20～80U/L(优选30～65U/L)、KH₂PO₄1～6g/L(优选2～4.5g/L)、MgSO₄0.2～5g/L(优选0.2～3g/L)，其余为水，初始pH自然，于500mL三角瓶中装液量为100～250mL。

进一步地，所述糙皮侧耳CGMCC No.6232的种龄优选为4天。

所述的发酵培养基的组成为：碳源10～80g/L，氮源5～70g/L(优选5～40g/L)，无机盐1.2～11g/L(优选2.2～7.5g/L)，其余为水。

进一步地，所述的发酵培养基的碳源可以包括但不限于以下的一种或几种：糊精、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油、麦芽糊精、麦芽糖浆、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、乳糖、玉米淀粉和玉米粉。

所述发酵培养基的氮源可以包括但不限于以下的一种或几种：酵母浸粉、玉米浆、麸皮、豆粕粉、豆饼粉、花生饼粉、麦芽浸出物、酪蛋白、浓缩蛋白、脱脂奶粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵、氨水、尿素、碳酸铵和硝酸钠。

所述发酵培养基的无机盐是KH₂PO₄和MgSO₄。

更进一步地，所述的发酵培养基优选为：甘油10～80g/L，酪蛋白胨10～40g/L，KH₂PO₄2～4g/L，MgSO₄0.5～2g/L，其余为水。利用本发明方法生产麦角硫因，发酵液中麦角硫因的含量至少为35mg/L，优选至少为50mg/L，更优选至少为70mg/L，还更优选至少为90mg/L，进一步优选至少为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L或140mg/L。为了减少麦角硫因产品中的杂质，可以使用水浸提：发酵结束后，菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体的水悬液。将菌丝体水悬液升温至50～100℃、优选60～95℃、更优选80～90℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，麦角硫因从菌丝体的细胞内被浸提到细胞外的水溶液中。

所述菌丝体发酵液的固液分离方法可以是过滤或离心。

本发明还涉及包括糙皮侧耳菌丝体和发酵液的组合物，所述发酵液包括麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度至少为35mg/L，优选至少为50mg/L，更优选至少为70mg/L，还更优选至少为90mg/L，进一步优选至少为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L或140mg/L。所述糙皮侧耳优选为本发明所述的糙皮侧耳CGMCC No.6232。

本发明的优势在于：利用本发明所提供的糙皮侧耳CGMCC No.6232和本发明的发酵方法，进行液体深层发酵，发酵液中麦角硫因的含量高，原料价廉易得。

附图说明

图1是糙皮侧耳CGMCC No.6232的菌落形态特征的照片。

图2是糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体的显微照片。

图3是糙皮侧耳CGMCC No.6232的rRNA基因序列的测定结果(28S rDNA的D1D2区序列片段)。

图4是糙皮侧耳CGMCC No.6232的ITS序列测定结果。

图5显示不同发酵培养基碳源对麦角硫因产率的影响。

图6显示不同发酵培养基氮源对麦角硫因产率的影响。

具体实施方式

本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：糙皮侧耳CGMCC No.6232菌体脂肪酸成分的测定

(1)测定方法

使用美国MIDI(Microbial Identification)公司Sherolock全自动细菌鉴定系统对实验菌株进行菌体脂肪酸成分分析。

(2)试剂的配制

溶液I：将45g氢氧化钠溶于150mL甲醇及150mL蒸馏水。

溶液II：将190mL浓盐酸、275mL甲醇溶于135mL蒸馏水。

溶液III：将200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀。

溶液IV：将10.8g氢氧化钠溶于900mL蒸馏水。

溶液V：饱和氯化钠溶液。

(3)提取方法

用接种环从PDA培养基表面刮取适量培养物，置于8mL螺口玻璃管中，加入1mL溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min。

待样品管冷却后，加入2mL溶液II，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏。

在冷却的样品管中加入1.25mL溶液III，快速振荡10min左右，弃去下层水相。在剩余有机相中加入3mL溶液IV和几滴溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

(4)色谱分析：

采用Agilent Technologies的6890N气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HPCHEMSTATION verA5.05)；色谱柱为UItra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每分钟5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100∶1，进样量2μL；检测器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min。

(5)测定结果：

菌体脂肪酸成分测定结果见下表1：

表1.糙皮侧耳CGMCC No.6232菌株的菌体脂肪酸成分测定结果

实施例2：糙皮侧耳CGMCC No.6232基因组DNA的G+C mol％含量的测定

检测方法：菌株基因组DNA的G+C mol％含量测定使用熔解温度(Tm)法，以大肠埃希氏菌(E.coli K12，CGMCC1.365)为参比对照，所用仪器为PerkinElmer公司的Lambda35UV/VIS Spectrometer；用PerkinElmer公司的PTP-1Peltier System数字温度控制仪控温。步骤如下：

(1)将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD_260nm值于0.3～0.4之间；

(2)在波长260nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃；

(3)OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕；

(4)根据热变性曲线，得出熔链温度(Tm)，计算G+C(mol％)含量。在0.1×SSC溶液中计算公式为：

G+C(mol％)＝G+C(mol％_1.365)+2.08(Tm_未知-Tm_1.365)

检测结果见表2。

表2.糙皮侧耳CGMCC No.6232基因组DNA的G+C mol％含量的测定结果

菌株编号	Tm值(℃)	G+C(mol％)
			CGMCC1.365	76.951	51.2
CGMCC6232	76.829	50.95

实施例3：糙皮侧耳CGMCCNo.6232的麦角硫因发酵

液体种子培养基：玉米粉(梅河口市兴达米业有限责任公司)30g/L、豆粕粉(北京中棉紫光生物科技有限公司)15g/L、α-淀粉酶(北京索莱宝科技有限公司)54U/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，在500mL三角瓶中的装液量为150mL。

发酵培养基：糊精(天津市北方天医化学试剂厂)20g/L、酵母浸粉(安琪酵母股份有限公司)15g/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，在500mL三角瓶中的装液量为150mL。

向每瓶液体种子培养基中接种从菌种斜面上挑取的约1cm²大小的糙皮侧耳CGMCCNo.6232菌苔，在25℃摇床150rpm培养4天，得到种子液。将种子液按体积比8％的接种量接入发酵培养基，25℃摇床150rpm培养12天，即得糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体发酵液，麦角硫因在菌丝体的细胞内积累。

实施例4：麦角硫因的浸提

(1)麦角硫因的发酵液浸提：将菌丝体发酵液100mL置于90℃水浴，以600rpm搅拌，当发酵液的温度达到90℃开始计时，浸提60min，浸提结束以水定容至100mL，得到麦角硫因的浸提液。

(2)麦角硫因的菌丝体浸提：取100mL菌丝体发酵液，过滤，弃滤液，收集菌丝体，加入水100mL，制成菌丝体悬液。将菌丝体悬液置于85℃水浴，以500rpm搅拌，当菌丝体悬液的温度达到85℃开始计时，浸提60min，浸提结束以水定容至100mL，得到麦角硫因的水浸提液。

实施例5：麦角硫因的检测

高效液相色谱法检测麦角硫因的含量，具体方法如下：

麦角硫因浸提液的前处理：将由实施例4处理得到的麦角硫因浸提液静置或离心，取上清液，经孔径为3kDa的超滤膜超滤，透过液即为麦角硫因待测样。

标准品溶液的准备：精确称取麦角硫因标准品(Biomol InternationalInc.，纯度≥98％)10mg，于25mL容量瓶中以纯水配制成浓度为400mg/L的标准品贮备液。再用纯水将贮备液分别稀释成浓度为40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L的标准品溶液。

定性与定量检测：相同色谱条件下，对麦角硫因标准品与待测样品进行HPLC测定，将样品色谱图与麦角硫因标准溶液色谱图进行对照，根据保留时间确定样品中的麦角硫因峰。以标准品麦角硫因的浓度与相应的峰面积绘制标准曲线，在标准品与样品进样量相同的情况下，用外标法定量，计算出样品中麦角硫因的含量，待测样中麦角硫因的浓度即为发酵液中麦角硫因的浓度。

HPLC检测条件：Agilent1260高效液相色谱仪，Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)，两根柱子串联使用；流动相为V(甲醇)∶V(纯水)＝2∶98，用硼酸调节流动相的pH至5.0；流速0.7mL/min，柱温25℃，进样量5μL，紫外检测波长254nm。

每克菌丝体干重的麦角硫因含量的计算公式：

实施例6：不同发酵碳源对麦角硫因产率的影响

将所述发酵培养基的碳源分别替换为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油、麦芽糊精、麦芽糖浆、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、乳糖、玉米淀粉、玉米粉，按照实施例3的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图5。甘油作为碳源时，麦角硫因的产量最高，可作为糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体液体发酵生产麦角硫因的优选碳源。其次为麦芽糊精和麦芽糖浆。

实施例7：不同发酵氮源对麦角硫因产率的影响

将所述发酵培养基的氮源分别替换为玉米浆、麸皮、豆粕粉、豆饼粉、花生饼粉、麦芽浸出物、酪蛋白、浓缩蛋白、脱脂奶粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵、氨水、尿素、碳酸铵、硝酸钠，按照实施例3的方法进行发酵培养，发酵结束后测定发酵液中麦角硫因的含量，结果见图6。酪蛋白胨作为氮源时，麦角硫因的产量大幅度提高，可作为糙皮侧耳CGMCC No.6232菌丝体液体发酵生产麦角硫因的优选氮源。

实施例8：发酵培养基中碳源与氮源的含量对麦角硫因产率的影响

发酵碳源与氮源分别按照甘油和酪蛋白胨10～80g/L与5～40g/L的含量制备发酵培养基，其他条件同实施例3，进行发酵培养，培养结束后测定菌丝体发酵液中麦角硫因的含量，结果见表3。

表3.发酵培养基中碳源与氮源的含量对麦角硫因产率的影响

实施例9：糙皮侧耳CGMCC No.6232的优化发酵培养基配方

糙皮侧耳CGMCC No.6232经优化发酵培养基碳源、氮源的种类及碳源与氮源的含量，得到优化培养基配方，配方如下：

发酵培养基：甘油50g/L、酪蛋白胨35g/L、KH₂PO₄3g/L、MgSO₄1.5g/L，其余为水，于121℃灭菌20min，在500mL三角瓶中的装液量为150mL。

Claims (11)

1.一株糙皮侧耳，特征在于其保藏编号为CGMCC No.6232。

2.如权利要求1所述的糙皮侧耳，特征在于其rRNA基因序列的28S rDNA的D1D2区序列片段为SEQ ID NO.1。

3.如权利要求1所述的糙皮侧耳，特征在于其ITS序列为SEQ ID NO.2。

4.如权利要求1所述的糙皮侧耳，特征在于其菌体脂肪酸成分包括1.33wt％的omega5c-十五碳单不饱和脂肪酸、11.05wt％的十六碳饱和脂肪酸、0.63wt％的十七碳饱和脂肪酸、78.13wt％的反异式饱和十八碳脂肪酸/omega 6,9c-型十八碳双不饱和脂肪酸、7.93wt％的omega 9c-十八碳单不饱和脂肪酸和0.92wt％的饱和十八碳脂肪酸。

5.如权利要求1所述的糙皮侧耳，特征在于其基因组DNA的G+C mol％含量为50.95％。

6.如权利要求1所述的糙皮侧耳，特征在于其能够在发酵液中产生麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度至少为35mg/L。

7.一种组合物，包括糙皮侧耳菌丝体和发酵液，所述发酵液包括麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度至少为35mg/L，所述糙皮侧耳为如权利要求1－6中任一项所述的糙皮侧耳。

8.一种麦角硫因的制备方法，包括如下步骤：

将糙皮侧耳CGMCC No.6232的固体菌种接种至液体种子培养基，在25～28℃培养3～5天，制备种子液；和

将种子液按4～20％体积比的接种量接种至发酵培养基，然后在19～31℃培养7～15天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液，

其中所述的液体种子培养基的组成为：玉米粉25～40g/L、豆粕粉15～25g/L、α-淀粉酶30～65U/L、KH₂PO₄ 2～4.5g/L、MgSO₄ 0.2～3g/L，其余为水，且

所述的发酵培养基的组成为：碳源10～80g/L，酪蛋白胨5～40g/L，KH₂PO₄ 2～4.5g/L，MgSO₄ 0.2～3g/L，其余为水，其中所述碳源包括以下的一种或几种：甘油、麦芽糊精和麦芽糖浆。

9.如权利要求8所述的方法，进一步包括在发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50～100℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中的步骤。

10.如权利要求8所述的方法，进一步包括在发酵结束后，菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体悬液，将菌丝体悬液升温至50～100℃，以0～600rpm搅拌浸提10～100min，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到水溶液中的步骤。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述的发酵培养基为：甘油10～80g/L，酪蛋白胨5～40g/L，KH₂PO₄ 2～4.5g/L，MgSO₄ 0.2～3g/L，其余为水。