JP7120588B2 - 新規微生物およびエルゴチオネインの生産方法 - Google Patents
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Description
ディルクメイア・チュラシマエンシス(Dirkmeia churashimaensis)S111(以下、「酵母S111」と略記する場合がある)は、茨城県つくば市内で収集した木の葉(若葉)を分離源として初めて分離された微生物である。
パピリオトレマ・フラベセンス(Papiliotrema flavescens)EA071(以下、「酵母EA071」と略記する場合がある)は、本栖湖周辺で収集したススキの葉を分離源として初めて分離された微生物である。
パピリオトレマ・フラベセンス(Papiliotrema flavescens)EA361(以下、「酵母EA361」と略記する場合がある)は、諏訪湖周辺で収集した木の皮を分離源として初めて分離された微生物である。
アピオトリカム・ポロサム(Apiotrichum porosum)EA702(以下、「酵母EA702」と略記する場合がある)は、いわき市で収集した土壌を分離源として初めて分離された微生物である。
本実施形態のエルゴチオネインの生産方法は、上記微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。
本実施形態に係る微生物は、ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物(NITE BP-03054)、パピリオトレマ・フラベセンスに属する微生物(NITE BP-03051)、パピリオトレマ・フラベセンスに属する微生物(NITE BP-03052)、または、アピオトリカム・ポロサムに属する微生物(NITE BP-03053)である。
まず、植物および土壌等の環境からの微生物サンプル採取を2回に分けて行った。その結果、合計113のサンプル(1回目30、2回目83)を採取した。
上記(1)で選抜した111のサンプルの培養液を、YM培地で100倍または100000倍に希釈した。そして、YM寒天培地、および、3mMのH2O2が添加されたYM寒天培地(以下、H2O2含有YM寒天培地と略記する。)に希釈した培養液を塗布し、25℃において2~5日間培養した。
上記(2)で選抜したコロニー164個を、1mLのYM培地を含む96ウェルプレートに植菌し、1600rpmにおいて、3~4日間25℃にて培養した。培養後、回収した培養液を2000rpmにおいて、10分間4℃にて遠心分離させた。遠心分離により得られた菌体ペレットを純粋1mLで洗浄し、再度遠心分離に供した。
上記(3)で得られた抽出液0.15mLとアセトニトリル0.35mLとを混合した溶液を0.45μmのPVDFフィルターで濾過した。得られた濾液をLCMS測定のサンプルとして使用した。
上記(4)で選抜した14個のコロニーを、50mLのYM培地を含む300mLフラスコに植菌し、200rpmにおいて、7日間25℃にて培養した(n=1)。
選抜した5株の帰属分類群の推定は、リボソームRNA遺伝子の26S rDNAのD1/D2領域およびITS領域の塩基配列の解析により行った。
S111株の26S rDNAのD1/D2領域塩基配列およびITS-5.8 rDNA塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するBLAST相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるディルクメイア・チュラシマエンシスの複数の塩基配列に対して、相同率98.4~100%の相同性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、S111株はディルクメイア・チュラシマエンシスの複数の塩基配列と同一の分子系統学的位置を示した。
EA071株の26S rDNAのD1/D2領域塩基配列およびITS-5.8 rDNA塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するBLAST相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるクリプトコッカス・フラベセンス(Cryptococcus flavescens、現行名パピリオトレマ・フラベセンス)の複数の塩基配列に対して、相同率99.4~100%の相同性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、EA071株はパピリオトレマ属で構成される系統群に含まれた。そして、クリプトコッカス・フラベセンス(現行名パピリオトレマ・フラベセンス)CBS942Tと同一の分子系統学的位置を示した。
EA361株の26S rDNAのD1/D2領域塩基配列およびITS-5.8 rDNA塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するBLAST相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるクリプトコッカス・フラベセンス(現行名パピリオトレマ・フラベセンス)の複数の塩基配列に対して、相同率99.4~100%の相同性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、EA361株はパピリオトレマ属で構成される系統群に含まれた。そして、クリプトコッカス・フラベセンス(現行名パピリオトレマ・フラベセンス)CBS942Tと同一の分子系統学的位置を示した。
EA702株の26S rDNAのD1/D2領域塩基配列およびITS-5.8 rDNA塩基配列について、国際塩基配列データベースに対するBLAST相同検索を行った。その結果、担子菌系酵母の一種であるトリコスポロン・ポロサム(現行名アピオトリカム・ポロサム)の複数の塩基配列に対して、相同率99.3~100%の相同性を示した。また、得られた塩基配列をもとに解析した分子系統樹において、EA702株はトリコスポロン(アピオトリカム)属で構成される系統群に含まれた。そして、トリコスポロン・ポロサム(現行名アピオトリカム・ポロサム)CBS2040Tと同一の分子系統学的位置を示した。
NITE BP-03052
NITE BP-03053
NITE BP-03054
Claims (2)
- ディルクメイア・チュラシマエンシスに属する微生物(NITE BP-03054)、パピリオトレマ・フラベセンスに属する微生物(NITE BP-03051)、パピリオトレマ・フラベセンスに属する微生物(NITE BP-03052)、または、アピオトリカム・ポロサムに属する微生物(NITE BP-03053)。
- 請求項1に記載の微生物を培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む、エルゴチオネインの生産方法。
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