CN102660596B - 侧耳菌发酵生产截短侧耳素的培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种侧耳菌生产截短侧耳素的培养基及发酵方法，该培养基包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于一级种子培养基和二级种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉和有机硅消泡剂；发酵种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉、有机硅消泡剂和玉米油。本发明通过采用由玉米油、冷榨豆饼粉替代豆油、热榨豆饼粉，优化其培养基配方，克服截短侧耳素的发酵单位低、单罐菌丝体数量少等技术缺陷，提供一种提高发酵单位，改善菌体发酵质量，同时最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现了截短侧耳素稳定、高效的生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种侧耳菌生产截短侧耳素的培养基及发酵方法。
背景技术
截短侧耳素(Pleuromutilin)是由侧耳菌(Pleurotus mutilus)通过发酵产生的一类广谱的二萜烯类抗生素，是截短侧耳素类半合成衍生物的前体。截短侧耳素类是一大类具有较好抗菌活性的抗生素家族，能够有效抑制大部分革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌。
目前，国内大部分生产厂家侧耳菌的种子培养基基础原料是酵母粉、葡萄糖、糊精、磷酸二氢钾、硫酸铵；发酵培养基基础原料是豆油、葡萄糖、热榨黄豆饼粉、酵母粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硝酸钙、氯化钠和硫酸铁。以上述培养基基础发酵生产截短侧耳素所存在的问题是：
1、截短侧耳素发酵培养基采用豆油作为基础碳源之一，因不同生产厂家提供的豆油质量不一致，导致高温灭菌后容易出现豆油与固体颗粒结块现象，产生较多泡沫，泡沫会影响发酵过程中的氧传递，导致菌体生长异常。同时，随着高温时间延长，豆油中所含有的部分亚油酸、油酸和亚麻酸分解为小分子化合物并进一步氧化为有机酸，酸价增大，导致发酵液pH下降。pH变化影响发酵培养基中各种酶的活性、菌体对基质的利用速率和细胞结构，从而影响了菌种生长，减少初级、次级代谢产物的合成。另外，豆油中除含有脂肪外，还含有磷脂，甾醇类物质以及少量蛋白质和麦胚酚等物质，易引起豆油酸败。豆油在长期储存中，油色会由浅逐渐变深，原因是油脂自动氧化，生成醛、酮、酸类有机物。所以豆油是不宜长期贮藏。
2、发酵培养基中使用热榨黄豆饼粉，由于生产工艺的蒸炒温度在130～140℃，因而导致其含油量和蛋白质含量明显降低，低于冷榨豆饼粉。所以，发酵过程中，热榨黄豆饼粉用量加大，最终导致生产成本大，发酵生产成本一般在150～250元/公斤。
3、采用上述培养基发酵，由于豆油、热榨黄豆饼等原辅料利用率低，导致菌渣产量低，影响截短侧耳素后提取收率。
4、采用上述培养基发酵，发酵效价单位低，其发酵单位仅为9000～11000u/ml。
发明内容
本发明目的就在于克服上述截短侧耳素发酵单位低、生产成本高等技术缺陷，提供一种可替代热榨黄豆饼粉、豆油，达到提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料来源受环境影响因素，保证其供应充足，实现截短侧耳素稳定、高效地生产的侧耳菌发酵生产截短侧耳素的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产截短侧耳素的发酵方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种侧耳菌发酵生产截短侧耳素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于一级种子培养基和二级种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉和有机硅消泡剂；发酵种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉、有机硅消泡剂和玉米油。
上述一级种子培养基的组成为：葡萄糖5～20g/L、冷榨黄豆饼粉20～50g/L、磷酸氢二钾1～10g/L、硫酸镁0.1～0.4g/L、硝酸钙0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.2g/L、有机硅消泡剂0.3～0.9g/L。
上述二级种子培养基的组成为：葡萄糖18～22g/L、冷榨黄豆饼粉10～15g/L、磷酸氢二钾1～4g/L、硫酸镁0.2～0.4g/L、硝酸钙0.2～0.4g/L、氯化钠0.1～0.2g/L、有机硅消泡剂0.5～0.9g/L。
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖20～30g/L、冷榨黄豆饼粉15～20g/L、玉米浆15～20g/L、硫酸镁0.2～0.4g/L、磷酸氢二钾1～4g/L、硝酸钙0.5～1g/L、酵母粉2～5g/L、玉米油5～15ml/L、有机硅消泡剂0.2～0.5g/L。
一种利用上述培养基的发酵方法，其工艺步骤包括：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌、冷却，用无菌空气保压（压力控制在0.01～0.02MPa）。要求灭菌后的一级种子培养基pH控制在5～8；氨基氮含量控制在10～50%；还原糖含量控制在1～5%。在火焰保护下，将已经培养好的侧耳菌母瓶种子液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在一级种子培养基体积的5～10％。
培养条件为：罐压0.02～0.06MPa；罐温20～28℃；空气流量：0～15h：1～5m3/h；15h～移种：5～10m3/h；搅拌转速100～120r/min；培养时间40～60h。
2）二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却，用无菌空气保压（压力控制在0.01～0.02MPa）。要求灭菌后的二级种子培养基pH控制在5～8；氨基氮含量控制在10～50%；还原糖含量控制在1～5%。然后将一级种子液全部移入二级种子罐进行培养。
培养条件为：罐压0.02～0.06MPa；罐温20～28℃；空气流量：0～20h：5～10m3/h；20h～移种：10～12m3/h；搅拌转速150～160r/min；培养时间：30～60h。
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压（压力控制在0.01～0.02MPa）。要求灭菌后的发酵培养基pH控制在6～8；氨基氮控制在20～80%；还原糖含量控制在1～5%。然后将二级种子液全部移入发酵罐进行培养。
整个发酵过程中：
a 氨基氮控制：发酵周期50～180h控制在5～10%；发酵周期181h～发酵结束控制在1～5%。
b 发酵周期：培养时间200～300h。
c pH控制：0～60h，pH自然，不受控制；81～180h,pH控制在6～8；181h～发酵结束，pH控制在6.2～7.8。
d 空气流量：0～40h：10～20m3/h；41～180h：20～40m3/h；181h～发酵结束：15～20m3/h。
e 压力控制：罐压0.01～0.05MPa。
f 温度控制：发酵全程温度控制在20～28℃。
g 无菌检查：发酵过程中进行菌检，要求无其它杂菌。
h 菌体浓度：0～90h,菌体自然生长，浓度不受控制；91～180h,菌体浓度控制在50～60%；181h～发酵结束，菌体浓度控制在30～40%。
I 搅拌转速：0～80h,搅拌转速控制在80～100r/min；81～200h,搅拌转速控制在120～150r/min；181h～发酵结束，搅拌转速控制在，100～120r/min。
4）在发酵过程中进行补料，
a 补油：补油选择玉米油，采用流加法进行补料。发酵周期在50～180h过程中，当脂肪含量＜2%，采用留加的方式补入玉米油，脂肪含量控制在2～3%；发酵周期181h～发酵结束过程中，脂肪含量＜1%，采用流加的方式补入玉米油，脂肪含量控制在1～2%。
b 补糖：补糖选择葡萄糖，浓度控制在29～30%，采用流加法进行补料。发酵周期在60～180h过程中，还原糖的含量控制在2～3%，当还原糖浓度＜2%，补入已灭菌的葡萄糖溶液。发酵周期181h～发酵结束过程中，还原糖的含量控制在1～2%，当还原糖浓度＜1%，补入已灭菌的葡萄糖溶液。
c 补水：发酵过程中，按照工艺要求必须定时补入一定量的水，其目的是控制菌体浓度，有利于产物的生成。发酵周期91～180h过程中,菌体浓度＞60%，采用留加的方式补入已灭菌的自来水，控制菌体浓度在50～60%；发酵周期181h～发酵结束，菌体浓度＞40%，采用流加的方式补入已灭菌的自来水，控制菌体浓度在30～40%。
d 补酸或碱：0～80h：pH处在发酵自然状态；81～180h，pH控制在6～8；181h～发酵结束，pH 6.2～7.8。当pH检测结果低于控制范围的下限，加入10～20%、已灭菌的氢氧化钠溶液进行调节；当pH检测结果高于控制范围的上限，加入30～40%、已灭菌的磷酸氢铵溶液调节pH，控制其在工艺要求的范围内。
本发明通过优化截短侧耳素发酵生产过程中的种子培养基和发酵培养基的成分配比，尤其是以主要是不饱和酸占85%、营养价值高、热稳定性强，耐高温，泡沫产生少的玉米油代替豆油，以在70～80℃冷榨温度下生产出来的含油量和蛋白质含量明显高于热榨黄豆饼粉的冷榨黄豆饼粉代替热榨黄豆饼粉，从而1）减少了原辅料的投料量，降低了发酵成本，其生产成本为100～150元/十亿；2）提高了发酵效价，其发酵单位为16000～18000u/ml，远远超过现有技术中发酵单位9000～10000u/ml，达到国内外先进发酵水平；3）采用该发酵工艺，发酵周期在10天左右，菌渣产量高，平均产量为400～500kg/m3，提取收率相对高；4）最大限度的降低原辅料来源的环境影响因素，保证原料的充足供应，实现截短侧耳素稳定、高效地生产。
具体实施方式
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用侧耳菌(Pleurotus mutilus)：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量：pH5～7；菌体浓度10～30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位13000～14000u/ml。
以下实施例中有机硅消泡剂选择潍坊金水源化工有限公司生产的。
实施例1
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入葡萄糖5kg、冷榨黄豆饼粉20kg、磷酸氢二钾1kg、硫酸镁100g、硝酸钙100g、氯化钠100g、有机硅消泡剂300g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01MPa。取样检测，其pH为5.4，氨基氮含量为18.2%，还原糖含量为1.3%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入葡萄糖180kg、冷榨黄豆饼粉100kg、磷酸氢二钾10kg、硫酸镁2kg、硝酸钙2kg、氯化钠1kg、有机硅消泡剂5kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～123℃；灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01MPa。取样检测，其pH为5.8，氨基氮含量为19.1%，还原糖含量为1.7%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入葡萄糖2000kg、冷榨黄豆饼粉1500kg、玉米浆1500kg、硫酸镁20kg、磷酸氢二钾100kg、硝酸钙50kg、酵母粉200kg、玉米油500L、有机硅消泡剂20kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间36min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01MPa。取样检测，其pH为6.2，氨基氮含量为22.7%，还原糖含量为1.5%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度15.4%，pH5.9、摇瓶效价13584u/ml）的侧耳菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.5%,罐压控制在0.02MPa；罐温20～23℃；空气流量：0～15h：1m3/h；15h～移种：5m3/h；搅拌转速100r/min。一级种子培养结束，pH6.3；菌体浓度15.9%；镜检无杂菌；培养时间42h。
二级种子培养过程控制：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.02MPa；罐温20～23℃；空气流量：0～20h：5m3/h；21h～移种：10m3/h；搅拌转速120r/min。二级种子培养结束，pH6.6；菌体浓度24.3%；镜检无杂菌；培养时间31.2h。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.01MPa；发酵温度控制在20～23℃；搅拌转速：发酵开始～80h控制在80r/min；81～200h控制在120r/min；181h～发酵结束控制在100r/min。空气流量：0～40h控制在10m3/h；41～180h控制在20m3/h；181h～发酵结束控制在15m3/h。发酵过程中，每隔8小时取样进行检测，pH：81～180h控制在6～8；181h～发酵结束控制在6.2～7.8；氨基氮：发酵周期50～180h控制在5～10%；发酵周期181h～发酵结束控制在1～5%；菌体浓度：91～180h,菌体浓度控制在50～60%；181h～发酵结束，菌体浓度控制在30～40%。
发酵过程中补玉米油954L；补水834L、补糖4275kg。
发酵结束，菌体浓度32%、氨基氮5.3%、脂肪0.03%、还原糖0.10%，发酵效价为16065u/ml、发酵周期268h。
实施例2
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入葡萄糖12kg、冷榨黄豆饼粉35kg、磷酸氢二钾5kgL、硫酸镁250g、硝酸钙250g、氯化钠150g、有机硅消泡剂600g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa。取样检测，其pH为6.3，氨基氮含量为28.4%，还原糖含量为3.4%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入葡萄糖200kg、冷榨黄豆饼粉130kg、磷酸氢二钾20kg、硫酸镁3kg、硝酸钙3kg、氯化钠1.5kg、有机硅消泡剂7kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～123℃；灭菌时间32min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa。取样检测，其pH为6.6，氨基氮含量为32.4%，还原糖含量为4.3%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入葡萄糖2500kg、冷榨黄豆饼粉1800kg、玉米浆1800kg、硫酸镁30kg、磷酸氢二钾250kg、硝酸钙75kg、酵母粉350kg、玉米油1000L、有机硅消泡剂350kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.15～0.14MPa；温度122～123℃；时间35min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa。取样检测，其pH为7.0，氨基氮含量为38.1%，还原糖含量为3.6%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度16.2%，pH6.1、摇瓶效价13712u/ml）的侧耳菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.2%,罐压控制在0.04MPa；罐温23～25℃；空气流量：0～15h：3m3/h；15h～移种：7.5m3/h；搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，pH6.9；菌体浓度23.4%；镜检无杂菌；培养时间49h。
二级种子培养过程控制：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.04MPa；罐温23～25℃；空气流量：0～20h：7.5m3/h；21h～移种：11m3/h；搅拌转速135r/min。二级种子培养结束，pH6.8；菌体浓度28.9%；镜检无杂菌；培养时间43.5h。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.03MPa；发酵温度控制在23～25℃；搅拌转速：发酵开始～80h控制在90r/min；81～200h控制在135r/min；181h～发酵结束控制在110r/min。空气流量：0～40h控制在15m3/h；41～180h控制在30m3/h；181h～发酵结束控制在17.5m3/h。发酵过程中，每隔8小时取样进行检测，pH：81～180h控制在6～8；181h～发酵结束控制在6.2～7.8；氨基氮：发酵周期50～180h控制在5～10%；发酵周期181h～发酵结束控制在1～5%；菌体浓度：91～180h,菌体浓度控制在50～60%；181h～发酵结束，菌体浓度控制在30～40%。
发酵过程中补玉米油835L；补水789L、补糖4086kg。
发酵结束，菌体浓度43.2%、氨基氮6.1%、脂肪1.4%、还原糖1.3%，发酵效价为17472u/ml、发酵周期256h。
实施例3
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入葡萄糖20kg、冷榨黄豆饼粉50g、磷酸氢二钾10kgL、硫酸镁400g、硝酸钙400g、氯化钠200g、有机硅消泡剂900g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间30min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa。取样检测，其pH为6.5，氨基氮含量为41.4%，还原糖含量为4.6%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入葡萄糖220kg、冷榨黄豆饼粉150kg、磷酸氢二钾40kg、硫酸镁4kg、硝酸钙4kg、氯化钠2kg、有机硅消泡剂9kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～123℃；灭菌时间33min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01MPa。取样检测，其pH为6.5，氨基氮含量为36.7%，还原糖含量为4.1%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入葡萄糖3000kg、冷榨黄豆饼粉2000kg、玉米浆2000kg、硫酸镁40kg、磷酸氢二钾400kg、硝酸钙100kg、酵母粉500kg、玉米油1500L、有机硅消泡剂500kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度122～123℃；时间34min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.02MPa。取样检测，其pH为6.2，氨基氮含量为54.3%，还原糖含量为4.5%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度15.4%，pH6.2、摇瓶效价13316u/ml）的侧耳菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.6%,罐压控制在0.06MPa；罐温25～28℃；空气流量：0～15h：5m3/h；15h～移种：10m3/h；搅拌转速120r/min。一级种子培养结束，pH6.4；菌体浓度24.7%；镜检无杂菌；培养时间44h。
二级种子培养过程控制：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.06MPa；罐温25～28℃；空气流量：0～20h：10m3/h；21h～移种：12m3/h；搅拌转速150r/min。二级种子培养结束，pH6.7；菌体浓度31.8%；镜检无杂菌；培养时间37.1h。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.05MPa；发酵温度控制在25～28℃；搅拌转速：发酵开始～80h控制在100r/min；81～200h控制在150r/min；181h～发酵结束控制在120r/min。空气流量：0～40h控制在20m3/h；41～180h控制在40m3/h；181h～发酵结束控制在20m3/h。发酵过程中，每隔8小时取样进行检测，pH：81～180h控制在6～8；181h～发酵结束控制在6.2～7.8；氨基氮：发酵周期50～180h控制在5～10%；发酵周期181h～发酵结束控制在1～5%；菌体浓度：91～180h,菌体浓度控制在50～60%；181h～发酵结束，菌体浓度控制在30～40%。
发酵过程中补玉米油911L；补水1045L、补糖4194kg。
发酵结束，菌体浓度51.2%、氨基氮8.1%、脂肪1.2%、还原糖1.4%，发酵效价为16128u/ml、发酵周期268h。
实施例4 对比实例：以热榨豆饼粉、豆油为原料，按照截短侧耳素发酵工艺生产截短侧耳素。
一级种子培养基配制过程：在1m3一级种子罐中加入葡萄糖13kg、热榨黄豆饼粉35kg、磷酸氢二钾5kgL、硫酸镁250g、硝酸钙250g、氯化钠150g、有机硅消泡剂600g。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～122℃；灭菌时间31min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.01MPa。取样检测，其pH为6.5，氨基氮含量为23.1%，还原糖含量为1.7%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
二级种子培养基制备过程：在10m3二级种子罐中加入葡萄糖200kg、热榨黄豆饼粉130kg、磷酸氢二钾20kg、硫酸镁3kg、硝酸钙3kg、氯化钠1.5kg、有机硅消泡剂7kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.10～0.14MPa；温度120～123℃；灭菌时间33min，冷却并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa。取样检测，其pH为6.3，氨基氮含量为23.5%，还原糖含量为2.4%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
发酵培养基制备过程：在100m3发酵罐中加入葡萄糖2500kg、热榨黄豆饼粉1800kg、玉米浆1800kg、硫酸镁30kg、磷酸氢二钾250kg、硝酸钙75kg、酵母粉350kg、豆油1000L、有机硅消泡剂350kg。完成配料后进行灭菌处理，灭菌条件：压力0.15～0.14MPa；温度122～123℃；时间34min。冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.015MPa。取样检测，其pH为6.7，氨基氮含量为27.9%，还原糖含量为2.0%，符合培养基灭菌要求，等待接种。
一级种子培养过程控制：将符合接种条件（镜检无杂菌，菌体浓度16.7%，pH6.3、摇瓶效价13587u/ml）的侧耳菌母瓶发酵液在火焰保护下，由接种口接入以及种子培养罐，接种量控制在种子培养基体积的6.3%,罐压控制在0.04MPa；罐温23～25℃；空气流量：0～15h：3m3/h；15h～移种：7.5m3/h；搅拌转速110r/min。一级种子培养结束，pH6.3；菌体浓度18.2%；镜检无杂菌；培养时间48h。
二级种子培养过程控制：符合移种条件的一级种子液由移种管道全部移入二级种子罐。罐压控制在0.04MPa；罐温23～25℃；空气流量：0～20h：7.5m3/h；21h～移种：11m3/h；搅拌转速135r/min。二级种子培养结束，pH6.8；菌体浓度28.9%；镜检无杂菌；培养时间43.5h。
发酵培养基过程控制：将符合移种条件的二级种子液由移种管道全部移入发酵罐。罐压控制在0.03MPa；发酵温度控制在23～25℃；搅拌转速：发酵开始～80h控制在90r/min；81～200h控制在135r/min；181h～发酵结束控制在110r/min。空气流量：0～40h控制在15m3/h；41～180h控制在30m3/h；181h～发酵结束控制在17.5m3/h。发酵过程中，每隔8小时取样进行检测，pH：81～180h控制在6～8；181h～发酵结束控制在6.2～7.8；氨基氮：发酵周期50～180h控制在5～10%；发酵周期181h～发酵结束控制在1～5%；菌体浓度：91～180h,菌体浓度控制在50～60%；181h～发酵结束，菌体浓度控制在30～40%。
发酵过程中补豆油1156L；补水1245L、补糖4154kg。
发酵结束，菌体浓度39.2%、氨基氮4.8%、脂肪1.2%、还原糖1.3%，发酵效价为13819u/ml、发酵周期261h。
Claims (8)
1. 一种侧耳菌发酵生产截短侧耳素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于一级种子培养基和二级种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉和有机硅消泡剂；发酵种子培养基中含有冷榨黄豆饼粉、有机硅消泡剂和玉米油；
上述一级种子培养基的组成为：葡萄糖5～20g/L、冷榨黄豆饼粉20～50g/L、磷酸氢二钾1～10g/L、硫酸镁0.1～0.4g/L、硝酸钙0.1～0.4g/L、氯化钠0.1～0.2g/L、有机硅消泡剂0.3～0.9g/L；
上述二级种子培养基的组成为：葡萄糖18～22g/L、冷榨黄豆饼粉10～15g/L、磷酸氢二钾1～4g/L、硫酸镁0.2～0.4g/L、硝酸钙0.2～0.4g/L、氯化钠0.1～0.2g/L、有机硅消泡剂0.5～0.9g/L；
上述发酵培养基的组成为：葡萄糖20～30g/L、冷榨黄豆饼粉15～20g/L、玉米浆15～20g/L、硫酸镁0.2～0.4g/L、磷酸氢二钾1～4g/L、硝酸钙0.5～1g/L、酵母粉2～5g/L、玉米油5～15ml/L、有机硅消泡剂0.2～0.5g/L。
2.一种利用权利要求1所述培养基生产截短侧耳素的发酵方法，其工艺步骤包括：将已经培养好的侧耳菌母瓶种子液接入含有一级种子培养基的一级种子罐中进行一级种子液的培养，至菌体浓度15～25%，pH值6～8时全部移入含有二级种子培养基的二级种子罐中进行二级种子液的培养，至菌体浓度20～40%，pH值6～8时全部移入含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵液的培养，至发酵液中菌体浓度30～40％，氨基氮在5～10%，脂肪在1～2%，还原糖在1～2%，化学效价达到16000～18000u/ml时发酵终止。
3.按照权利要求2所述的发酵方法，其特征是：在侧耳菌母瓶种子液接入一级种子培养基之前，首先要将一级种子培养基灭菌、冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01～0.02MPa，要求灭菌后的种子液pH控制在5～8；氨基氮含量控制在10～50%；还原糖含量控制在1～5%。
4.按照权利要求2所述的发酵方法，其特征是：在一级种子液移入二级种子培养基之前，首先要将二级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01～0.02MPa，要求灭菌后的种子液pH控制在5～8；氨基氮含量控制在10～50%；还原糖含量控制在1～5%。
5.按照权利要求2所述的发酵方法，其特征是：在二级种子液移入发酵培养基之前，首先要将发酵培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，压力控制在0.01～0.02MPa，要求灭菌后的发酵液pH控制在6～8；氨基氮控制在20～80%；还原糖含量控制在1～5%。
6.按照权利要求2或3述的发酵方法，其特征是：所述侧耳菌母瓶种子液的接种量控制在一级种子培养基体积的5～10％。
7.按照权利要求2述的发酵方法，其特征在于所述二级种子液的培养条件为：罐压0.02～0.06MPa；罐温20～28℃；空气流量：0～20h：5～10m3/h；21h～移种：10～12m3/h；；搅拌转速120～150r/min；培养时间：30～60h。
8.按照权利要求2述的发酵方法，其特征是：在发酵过程中进行补料，
a.补油：补充玉米油，在发酵50～180h过程中，当脂肪含量＜2%，采用流加的方式补入玉米油，脂肪含量控制在2～3%；在发酵181h～发酵结束过程中，当脂肪含量＜1%，采用流加的方式补入玉米油，脂肪含量控制在1～2%；
b.补糖：补糖选择浓度为29～30%葡萄糖，在发酵60～180h过程中，当还原糖浓度＜2%，补入葡萄糖溶液，还原糖的含量控制在2～3%，在发酵181h～发酵结束过程中，当还原糖浓度＜1%，补入葡萄糖溶液，还原糖的含量控制在1～2%；
c.补水，在发酵周期91～180h过程中，当菌体浓度＞60%，补入已灭菌的自来水，控制菌体浓度在50～60%，在发酵181h～发酵结束，当菌体浓度＞40%，补入已灭菌的自来水，控制菌体浓度在30～40%；
d.根据需要补酸或碱使发酵过程中pH满足下列条件：在发酵开始～80h，pH处在发酵自然状态，在发酵81～180h，pH控制在6～8，181h～发酵结束，pH 6.2～7.8。
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