CN102863271B - 一种广叶绣球菌合成培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种广叶绣球菌合成培养基。本发明提供的一种绣球菌的合成培养基，包括碳元素、氮元素、磷酸二氢钾、其他组分和水组成；所述其他组分为硫酸镁和维生素B1中的至少一种；所述碳元素、所述氮元素、所述磷酸二氢钾、所述硫酸镁和所述维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为8.0–25.0g/L、0.15–4.5g/L、0.5–2.0g/L、0–1.0g/L和0–0.1g/L；所述碳元素来源于蔗糖或葡萄糖或麦芽糖或乳糖或可溶性淀粉；所述氮元素来源于柠檬酸铵或硝酸铵或磷酸氢二铵或硝酸钾或硫酸铵。本发明提供的培养基具有成分清楚、质量稳定、杂质少等优点，适于绣球菌的工业化发酵生产和生理学研究，并有利于下游代谢产物的分离提取。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种广叶绣球菌合成培养基。
背景技术
广叶绣球菌[Sparassis latifolia Y.C.Dai&Zheng Wang]是一种名贵食药用菌，在生物分类上归属于真菌界（Kingdom Fungi）、担子菌门（Basidiomycota）、多孔菌目（Polyporales）、绣球菌科（Sparassidaceae）、绣球菌属（Sparassis）。新近的研究表明广叶绣球菌广泛分布于东亚亚热带和温带地区，包括我国吉林、黑龙江、云南、日本等地（Zhao et al.,2012,Mycological Progress,DOI 10.1007/s11557-012-0853-7），夏末秋初生于云杉、冷杉或松林及混交林的地上。
绣球菌富含蛋白质、必需氨基酸和维生素等多种营养成分（Chandrasekaran et al.,2011,International Journal of Medicinal Mushrooms,13(2):177–183），其主要活性成分β-葡聚糖含量丰富，日本食品分析化验所测定其含量为43.6%，是灵芝、姬松茸的2倍以上，为菇类之最，且具有较高的药用、保健功能，在日本有“梦幻之菇”之称。现代研究证实绣球菌具有抗肿瘤作用（Ohno et al.,2000,Biological & PharmaceuticalBulletin,23(7):866-872），免疫调节功能（Harada et al.,2002，Journal of Interferon &Cytokine Research,22(12):1227-1239），促进伤口愈合作用（Kwon et al.,2009,TheAmerican Journal of Surgery，197(4):503–509），促进造血功能（Harada et al.,2002,Biological & Pharmaceutical Bulletin,25(7):931-939）等等。
作为一种珍稀食药两用菌，绣球菌由于其良好的营养价值和保健功效，近年来受到了学者和消费者的极大关注。但是其野生资源少，采集困难，而栽培技术尚未成熟，价格昂贵。液体发酵具有周期短、产量高、不受环境限制、成本低、质量易控、没有重金属污染等优点，因此通过液体发酵生产菌丝体，已成为满足市场需求的重要途径。
国内绣球菌的专利主要是关于其人工栽培方面（绣球菌的人工栽培方法，申请号CN200610050003.1；一种绣球菌工厂化栽培基质配方及生产工艺，申请号：CN201010286462.6）。文献调查发现绣球菌培养的研究多是固体培养，虽然有少许几篇液体发酵的报道，但是游雄等（绣球菌的诱变育种和深层发酵工艺的初步研究，中国食用菌，2006(3):41-45）和刘成荣（绣球菌突变菌株液体发酵条件的研究，江西农业大学学报，2008(5):898-902）均采用了绣球菌的突变菌株来研究，突变菌株用于保健食品和药品有着其局限性，而且菌株本身具有不稳定性。因此，开发一种具有适于绣球菌工业化液体发酵生产的方法具有重要意义。本发明人曾于2011年申请了专利（珍稀食药用菌绣球菌的液体发酵培养方法及其专用培养基。中国专利申请号：201110220578.4），但是所述培养基较为复杂，需要利用松针、复合碳源等，原材料会受到一定的限制，同时复杂的成分给下游处理带来困难。全合成培养基具有成分清楚、质量稳定、杂质少等优点，可以用于绣球菌代谢产物合成的定向调控和代谢流分析，以及大规模生产过程质量控制的需要，同时有利于下游代谢产物的分离提取。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种绣球菌的合成培养基。
本发明提供的合成培养基，包括碳元素、氮元素、磷酸二氢钾、其他组分和水组成；所述其他组分为硫酸镁和维生素B1中的至少一种；
所述碳元素、所述氮元素、所述磷酸二氢钾、所述硫酸镁和所述维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为8.0–25.0g/L、0.15–4.5g/L、0.5–2.0g/L、0–1.0g/L和0–0.1g/L；
所述碳元素来源于蔗糖或葡萄糖或麦芽糖或乳糖或可溶性淀粉；所述氮元素来源于柠檬酸铵或硝酸铵或磷酸氢二铵或硝酸钾或硫酸铵。
上述的合成培养基中，所述碳元素、所述氮元素、所述磷酸二氢钾、所述硫酸镁、所述维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为12g/L–20g/L、0.35g/L–2.0g/L、1g/L–2g/L、0.05g/L–1.0g/L、0.05g/L–0.1g/L。
上述碳元素终浓度为按分子量计算的碳元素含量；上述氮元素终浓度为按分子量计算的氮元素含量。
上述绣球菌的合成培养基，为如下1）-4）中任意一种：
1）所示绣球菌的合成培养基包括可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和水；
2）所示绣球菌的合成培养基包括葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和水；
3）所示绣球菌的合成培养基包括麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1和水；
4）所示绣球菌的合成培养基包括乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和水。
上述绣球菌的合成培养基中，
1）所示的合成培养基中，所述可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1的终浓度依次为30-35g/L、3.18-5.3g/L、1.5-2.0g/L、0.5-1.0g/L、0.05-0.1g/L；
2）所示的合成培养基中，所述葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1的终浓度依次为20.0-50.0g/L、0.9-10.0g/L、0.5-2.0g/L、0.5-1.0g/L、0.05-0.1g/L；
3）所示的合成培养基中，所述麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1的终浓度依次为50-62.5g/L、0.9-10.0g/L、0.5-2.0g/L、0.05-0.1g/L；
4）所示的合成培养基中，所述乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁的终浓度依次为40–50g/L、10–12.9g/L、0.5–2.0g/L、0.05–0.1g/L；
上述绣球菌的合成培养基，1）所示的合成培养基中，所述可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1的终浓度依次为30g/L、3.18g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.1g/L；或所述可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1的终浓度依次为35g/L、5.3g/L、1.5g/L、1.0g/L、0.05g/L；
2）所示的合成培养基中，所述葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1的终浓度依次为20.0g/L、2.12g/L、0.5g/L、1.0g/L、0.05g/L；
3）所示的合成培养基中，所述麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1的终浓度依次为62.5g/L、9.4g/L、1.0g/L、0.05g/L；
4）所示的合成培养基中，所述乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁的终浓度依次为40g/L、12.9g/L、1.0g/L、0.05g/L。
上述合成培养基还包括琼脂，琼脂的量为常规加入量，只需要凝固为固体培养基即可，一般为1.5–2.0%（质量百分含量）。
上述合成培养基的pH值为3.0–6.0；所述合成培养基的pH值具体为3.5–5.0或3.5–4.0。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述的合成培养基的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述各组分按照各自对应的终浓度混合得到。具体为将上述质量配比的原料放入容器，加热溶解，混合均匀，灭菌即可。
本发明的第三个目的是提供一种生产绣球菌菌丝体的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述的合成培养基中培养绣球菌，得到绣球菌菌丝体。
所述培养为25℃，转速120rpm、振荡培养15-20天；在培养后，还包括如下步骤：将培养产物在6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体。
本发明的实验证明，本发明提供的绣球菌合成培养基，其组成成分明确、简单、易于获得、成本低，利用该培养基发酵生产绣球菌具有工艺简单，不存在重金属污染，菌体生长速度快，菌体产率高（可达15g/L以上），产品质量稳定等优点，同时培养基中不引入农副产品为碳氮源，利于代谢产物的分离提取，既适于绣球菌生理生化的研究，也适于绣球菌的工业化发酵生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、利用合成培养基发酵生产绣球菌菌丝体
绣球菌合成培养基配方为：可溶性淀粉30.0克(换算为碳元素12克)，柠檬酸铵3.18克（换算为氮元素0.54克），磷酸二氢钾2.0克，硫酸镁1.0克，维生素B10.1克，用水定容至1000毫升，调节pH值4.0，培养基分装灭菌。
对照培养基1：土豆200克，葡萄糖20.0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。
对照培养基2：土豆200克，红糖40.0克，蛋白胨3.0克，大豆油3.0克，KH2PO43.0g，MgSO4 1.5g，松针汁100ml，用水定容至1000mL，调pH值为4.0。土豆的处理：土豆去皮，切成小块煮沸半小时，然后用纱布过滤，得到土豆汁。松针汁的制备：搜集脱落的松针，取松针20克加入100ml水煮沸半小时，过滤定容至100ml。土豆汁中按上述配方加入松针汁、红糖、蛋白胨、大豆油、KH2PO4、MgSO4溶解，最后用水定容至1000毫升，调pH值为4.0。
将绣球菌菌种（原始编号：绣球菌18号；购自四川省绵阳市食用菌研究所）接种于马铃薯固体培养基（PDA）上活化，培养温度28℃，培养时间14天。起始pH值为4.0下，按10％的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌合成培养基中，然后在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养15天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达18.8g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基1中，在自然pH值条件下，25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0.64g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基2中，在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为6.10g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取基因组DNA，对其ITS（核糖体转录间隔区）进行PCR扩增（所用引物为ITS4和ITS5组成的引物对）并测序，在GenBank进行Blast分析。
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’。
测序结果如序列表的序列1所示，与GenBank中Sparassis latifolia指定副模式标本YCD2470（Dai et al.,2006,Mycologia,98(4):584-592）的ITS序列GENBANKACCESSIONNO.AY218424的序列同源性为99%。
结果表明本方法培养得到的菌丝体为广叶绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝体，且产量高于对照。
实施例2、利用合成培养基发酵生产绣球菌菌丝体
绣球菌合成培养基配方为：葡萄糖20.0克(换算为碳元素8克)，柠檬酸铵2.12克（换算为氮元素0.36克），磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁1.0克，维生素B10.05克，用水定容至1000毫升，调节pH值3.0，培养基分装灭菌。对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。
将绣球菌菌种（原始编号：绣球菌18号；购自四川省绵阳市食用菌研究所）接种于马铃薯固体培养基（PDA）上活化，培养温度20-28℃，培养时间14天。起始pH值为6.0下，按10％的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌合成培养基中，然后在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养15天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达15.46g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下，25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0.64g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS（核糖体转录间隔区）进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析。
结果表明本方法培养得到的菌丝体为广叶绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝体，且产量高于对照；也高于实施例1中的对照2。
实施例3、利用合成培养基发酵生产绣球菌菌丝体
绣球菌合成培养基配方为：麦芽糖62.5克(换算为碳元素25克)，磷酸氢二铵9.4克（换算为氮元素1.99克），磷酸二氢钾1.0克，维生素B10.05克，用水定容至1000毫升，调节pH值6.0，培养基分装灭菌。对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。
将绣球菌菌种（原始编号：绣球菌18号；购自四川省绵阳市食用菌研究所）接种于马铃薯固体培养基（PDA）上活化，培养温度20-28℃，培养时间14天。起始pH值为6.0下，按10％的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌合成培养基中，然后在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达7.57g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下，25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0.64g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS（核糖体转录间隔区）进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析。
结果表明本方法培养得到的菌丝体为广叶绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝体，且产量高于对照；且与实施例1中的对照2相比，产量略高，但所用培养基组成少且易于获得。
实施例4、利用合成培养基发酵生产绣球菌菌丝体
绣球菌合成培养基配方为：乳糖40.0克(换算为碳元素16克)，硝酸铵12.9克（换算为氮元素4.50克），磷酸二氢钾1.0克，硫酸镁0.05克，用水定容至1000毫升，调节pH值5.0，培养基分装灭菌。对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。
将绣球菌菌种（原始编号：绣球菌18号；购自四川省绵阳市食用菌研究所）接种于马铃薯固体培养基（PDA）上活化，培养温度20-28℃，培养时间14天。起始pH值为5.0下，按10％的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌合成培养基中，然后在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达6.13g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下，25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0.64g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS（核糖体转录间隔区）进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析。
结果表明本方法培养得到的菌丝体为广叶绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝体，且产量高于对照；且与实施例1中的对照2相比，产量无显著差异，但所用培养基组成少且易于获得。
实施例5、利用合成培养基发酵生产绣球菌菌丝体
绣球菌合成培养基配方为：可溶性淀粉35.0克(换算为碳元素14克)，柠檬酸铵0.90克（换算为氮元素0.15克），磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁1.0克，维生素B10.05克，用水定容至1000毫升，调节pH值3.5，培养基分装灭菌。对照培养基：土豆200克，葡萄糖20.0克，pH值自然，用水定容至1000毫升。
将绣球菌菌种（原始编号：绣球菌18号；购自四川省绵阳市食用菌研究所）接种于马铃薯固体培养基（PDA）上活化，培养温度20-28℃，培养时间14天。起始pH值为6.0下，按10％的接种量将绣球菌菌种接种于上述绣球菌合成培养基中，然后在25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养15天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率达15.39g/L。
同时按10％的接种量将绣球菌菌种接种于对照培养基中，在自然pH值条件下，25℃，转速120rpm，自然光照条件下进行振荡培养20天，6000rpm离心10分钟，去掉上清液，得到绣球菌菌丝体，菌丝体产率为0.64g/L。
将所得的绣球菌菌丝体提取DNA，对其ITS（核糖体转录间隔区）进行PCR扩增并测序，在GenBank进行Blast分析。
结果表明本方法培养得到的菌丝体为广叶绣球菌（Sparassis latifolia）菌丝体，且产量高于对照；也高于实施例1中的对照2。
Claims (8)
1.一种绣球菌的合成培养基，为如下1）-4）中任意一种：
1）可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和水；
所述可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为30–35g/L、3.18–5.3g/L、1.5–2.0g/L、0.5–1.0g/L、0.05–0.1g/L；
2）葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1和水；
所述葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为20.0–50.0g/L、0.9–10.0g/L、0.5–2.0g/L、0.5–1.0g/L、0.05–0.1g/L；
3）麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1和水；
所述麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为50–62.5g/L、0.9–10.0g/L、0.5–2.0g/L、0.05–0.1g/L；
4）乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和水；
所述乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁在所述合成培养基中的终浓度依次为40–50g/L、10–12.9g/L、0.5–2.0g/L、0.05–0.1g/L。
2.根据权利要求1所述的合成培养基，其特征在于：
1）所示的合成培养基中，所述可溶性淀粉、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为30g/L、3.18g/L、2.0g/L、1.0g/L、0.1g/L；
2）所示的合成培养基中，所述葡萄糖、柠檬酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为20.0g/L、2.12g/L、0.5g/L、1.0g/L、0.05g/L；
3）所示的合成培养基中，所述麦芽糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、维生素B1在所述合成培养基中的终浓度依次为62.5g/L、9.4g/L、1.0g/L、0.05g/L；
4）所示的合成培养基中，所述乳糖、硝酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁在所述合成培养基中的终浓度依次为40g/L、12.9g/L、1.0g/L、0.05g/L。
3.根据权利要求1所述的合成培养基，其特征在于：
所述合成培养基还包括琼脂。
4.根据权利要求1-3中任一所述的合成培养基，其特征在于：
所述合成培养基的pH值为3.0–6.0。
5.根据权利要求4所述的合成培养基，其特征在于：所述合成培养基的pH值为3.5–5。
6.根据权利要求5所述的合成培养基，其特征在于：所述合成培养基的pH值为3.5–4。
7.一种制备权利要求1-6任一所述的合成培养基的方法，包括如下步骤：将各组分按照各自对应的终浓度混合得到。
8.一种生产绣球菌菌丝体的方法，包括如下步骤：在权利要求1-6任一所述的合成培养基中培养绣球菌，得到绣球菌菌丝体。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20140312 |