CN101586082B - 产紫杉醇亮白曲霉菌及用其制备紫杉醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及到从曼地亚红豆杉(Taxus x media)中分离到的一种产紫杉醇的内生真菌亮白曲霉(Aspergillus candidus)。在温度为25℃、180rpm振荡培养的条件下，野生菌株亮白曲霉HUST-RBB3在300mL土豆葡萄糖液体培养基中发酵10天，可以得到大约120μg/L的紫杉醇，是目前已报道在未优化培养条件下的较高紫杉醇产量的野生菌株。在初步优化的发酵条件下，亮白曲霉HUST-RBB3发酵可生产约497.3μg/L紫杉醇。通过该菌株发酵生产紫杉醇，具有生产周期短、菌种选育和保藏容易等优点。该发明为利用微生物发酵生产紫杉醇提供了新的菌种及相应的发酵生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术、生物制药领域，具体涉及产紫杉醇亮白曲霉(Aspergillus candidus)及一株产紫杉醇亮白曲霉HUST-RBB3菌株，以及用其制备抗癌药物紫杉醇的方法。
背景技术
分离自红豆杉树皮的紫杉醇是目前国际上公认的重要抗肿瘤药物，但由于红豆杉资源的短缺，导致紫杉醇药源紧张。微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的最有效途径之一。微生物发酵生产紫杉醇具有易培养、易控制、生产成本低，可通过优化发酵条件等手段大幅度提高紫杉醇产量等优点，其大规模工业化生产比较容易实现，应用前景广阔。
自1993年Stierle等首次报道了从太平洋红豆杉树中分离到一种可产紫杉醇的内生真菌以来，国内外已有30多种可产紫杉醇的真菌报道。但是，目前发现的产紫杉醇真菌的紫杉醇产量都比较低，首次发现的安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)的紫杉醇产率只有24～50ng/L(Stierle et al.，1993，Science，260：214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇产量高的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产紫杉醇的亮白曲霉及用其制备紫杉醇的方法，该菌种的发明为通过微生物发酵法生产紫杉醇提供了新的菌株。
本发明提供的新的紫杉醇产生菌亮白曲霉HUST-RBB3已于2008年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，CCTCC)，该菌种保藏号为CCTCC No.M208209，分类命名为亮白曲霉(Aspergillus candidus)。
本发明的亮白曲霉HUST-RBB3菌株具有以下特征：在25～28℃温度下，在PDA(potato dextrose agar medium)平板上生长，两星期后菌落直径大约1cm，在CYA(Czapek yeast autolysate agar medium)平板上在可以达到4～5cm，而在37℃不能生长；菌落为白色，有光泽，菌落背面为浅黄色；菌丝直径约为5～8μm，分枝、有隔；分生孢子大小为2.5～3.5μm、白色、表面光滑、水珠型；具有特征性的孢子头结构，直径约为20～50μm，白色，球形；分生孢子梗约600～900μm，顶囊球形或近球形，小梗双层，在顶囊头部着生。详细的形态学特征和生理生化特征见图1和表1。
上述亮白曲霉HUST-RBB3发酵产紫杉醇可在18～32℃、pH4.0～8.0、需氧条件下进行。该菌株产生的紫杉醇，主要储藏于细胞中，一部分分泌于细胞外的培养基中。本发明提供的由发酵制造紫杉醇的方法，其特征在于：在培养基中培养亮白曲霉HUST-RBB3菌株以在其细胞内和培养基中聚集紫杉醇后，从其细胞内和培养基中提取紫杉醇。
在温度为25℃、180rpm振荡培养的条件下，野生亮白曲霉HUST-RBB3菌株在300ml土豆葡萄糖液体培养基中发酵10天，可以得到大约120μg/L的紫杉醇，是首次发现的产紫杉醇真菌安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)的紫杉醇产量(24～50ng/L)的2～5倍，是目前已报道在未优化培养条件下的紫杉醇产量较高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液体培养基按下述配比和条件制备：马铃薯300g，葡萄糖30g，马铃薯去皮，切成块后用800ml蒸馏水煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖，溶化后补蒸馏水至1L，自然pH值，121℃，灭菌15分钟后使用。
亮白曲霉HUST-RBB3菌株所产紫杉醇已经被本发明人证实，其结构和天然红豆杉植物中分离、纯化得到的紫杉醇标准品完全一致。
附图说明
图1为亮白曲霉HUST-RBB3的形态观察图，其中，(A)为CYA平板上的菌落，(B)为分生孢子头(光学显微镜镜)，(C)为分生孢子(电镜)。
具体实施方式
使用本发明提供的亮白曲霉HUST-RBB3菌株进行发酵培养可以制备紫杉醇，其发酵制备紫杉醇的优化方案为：
(1)将亮白曲霉HUST-RBB3菌株接种在PDA培养基平板上，25℃～30℃静置培养10～15天后，加入灭菌的蒸馏水，通过玻璃棉过滤器过滤收集孢子，用无菌生理盐水洗涤3～5次，然后用无菌生理盐水稀释至106～108个孢子/ml的数目。
(2)按每300～500ml液体发酵培养基接种1～5ml亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子悬液，将亮白曲霉HUST-RBB3菌株接种到液体发酵培养基中，发酵培养是在需氧条件下、18～32℃、pH4.0～8.0下进行的，发酵培养10～15天后，分别收集菌丝体和发酵液；
(3)菌丝体在45℃～50℃条件下烘干，然后研磨粉碎，过200目筛子收集细粉，每1.0g细粉用6ml甲醇/氯仿抽提3～5次，合并所有抽提液，甲醇/氯仿的体积比为1∶0～1∶1；
(4)发酵液用氯仿振荡抽提3～5次，发酵液与氯仿的体积比为1∶1～3∶1，合并所有抽提液；
(5)将(3)和(4)中得到的抽提液分别在45℃～50℃条件下减压蒸馏回收溶剂，并将蒸馏回收溶剂后的残余物质溶解在适量的100％甲醇中，即获得紫杉醇粗提溶液。
上述发酵条件的进一步优化条件为：在初始pH为6.0的300ml液体发酵培养基中接种1ml浓度为108个孢子/ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子悬液，200rpm，30.0℃条件下恒温发酵培养13天。在该优化的发酵条 件下，亮白曲霉HUST-RBB3菌株可生产497.3μg/L的紫杉醇。
上述液体发酵培养基按下述配比和条件制备：葡萄糖80g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，苯甲酸钠10mg，苯丙氨酸25mg，丝氨酸15mg，甘氨酸20mg，水杨酸15mg，加入适量蒸馏水溶化后，用蒸馏水定容至1L，调节pH至6.0，121℃，灭菌15分钟后使用。
紫杉醇粗提溶液依据常规紫杉醇纯化方法(余龙江，等。2002，林产化学与工业，22：45-48)进行纯化后可直接用于高相液相色谱(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)分析。对于HPLC，色谱柱为C18反向柱(5×300mm，Waters)，流动相为甲醇∶H2O(68∶32，v/v)，流速为1.0ml/min，紫外波长设定为227nm。通过对比紫杉醇标准品的吸收峰停留时间、峰面积和亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵后分离纯化获得的紫杉醇的吸收峰停留时间、峰面积，可计算其紫杉醇的浓度。
通过借助以下实施例将更加详细说明本发明，且以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。
[实施例1]
采集华中科技大学校园苗圃种植的曼地亚红豆杉树皮组织，用无菌小刀切成(～0.5×0.5×0.5cm)小块，用70％(v/v)酒精进行表面消毒3min，用灭菌的ddH2O漂洗3次，然后用无菌小刀剥取内表皮并均匀放置在含有50μg/mL的氨苄青霉素的PDA培养基平板上，在25℃～28℃的培养箱中静置培养，根据真菌生长情况，采用菌丝顶端分离纯化法将形态不同的真菌分离到新的PDA培养基平板上。分离后的真菌在25℃～28℃培养传代并检测纯度，直至获得单克隆。最后，每个真菌的单克隆再次通过菌丝顶端分离法将真菌接种到新的PDA斜面进行保藏，并收集相应真菌的孢子制备孢子悬液，加入终浓度为15％(v/v)的甘油在-70℃进行低温保藏。亮白曲霉HUST-RBB3是依据实施例1从曼地亚红豆杉内表皮中自行分离到的 一株产紫杉醇内生真菌。
上述PDA培养基按下述配比和条件制备：马铃薯300g，葡萄糖30g，琼脂20g，马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖和琼脂，溶化后补足水至1L，自然pH值，121℃，灭菌15分钟后使用。
[实施例2]
用接种针将保藏于PDA斜面的亮白曲霉HUST-RBB3挑取少许，接种到300ml土豆葡萄糖液体培养基中(1L三角烧瓶)，在25℃、180rpm条件下培养10天。将发酵液在4℃、12000rpm条件下，离心10min，分别收集菌丝体和发酵液依据上述优化方案中的步骤(3)～(5)，制备获得2ml溶解在100％甲醇中的紫杉醇粗提液。依据常规紫杉醇纯化方法(余龙江，等.2002，林产化学与工业，22：45-48)进行纯化后，获得溶解在1ml 100％甲醇中的紫杉醇溶液。取10μl用于HPLC分析，仪器为Agilent 1200 HPLCSystem，色谱柱为C18反向柱(5×300mm，Waters)，流动相为甲醇∶H2O(68∶32，v/v)，流速为1.0ml/min，紫外波长设定为227nm，柱温为25℃。通过HPLC法计算其紫杉醇的浓度发现，亮白曲霉HUST-RBB3菌株在该条件下，可以生产约120μg/L的紫杉醇。
[实施例3]
取实施例2中所得亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵后分离纯化的紫杉醇10μl进行质谱分析(由华中科技大学分析测试中心完成)。质谱仪为Agilent 1100 LC/MSD Trap，采用电喷雾质谱(electrospray massspectrometry)技术，喷射电压(a spray voltage)：2.2kV；柱型：C18分离柱(5×300mm，Waters)；进样量：10μl；检测波长：227nm；流动相为：甲醇∶H2O(68∶32，v/v)；流速：1ml/min，以标准品紫杉醇做对照。结果表明，亮白曲霉HUST-RBB3菌株所产紫杉醇和天然红豆杉植物中分离的紫 杉醇标准品具有一样的分子量。
取实施例2中所得亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵后分离纯化的紫杉醇500μl，减压蒸馏回收溶剂后，将蒸馏后的残余物质重新溶解在100％的氘代甲醇中，进行核磁共振谱(Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)分析(由华中科技大学分析测试中心完成)，仪器为Bruker 400MHzinstrument，结果表明，亮白曲霉HUST-RBB3菌株所产紫杉醇和天然红豆杉植物中分离纯化得到的紫杉醇标准品的1H、13C-NMR谱完全一致，即二者具有一样立体化学结构。
[实施例4]
在PDA培养基平板上，25℃静置培养亮白曲霉HUST-RBB3菌株10天后，加入灭菌的蒸馏水，通过玻璃棉过滤器过滤收集孢子，用无菌生理盐水洗涤3～5次，然后用无菌生理盐水稀释获得浓度为108个孢子/ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子悬液。
配制以下初始发酵培养基各300ml，每升初始液体发酵培养基(I)中各组分的质量分别为：葡萄糖80g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，pH自然；每升初始液体发酵培养基(II)中各组分的质量分别为：葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2PO4 4g，MgSO4·7H2O2g，pH自然；每升初始液体发酵培养基(III)中各组分的质量分别为：葡萄糖100g，酵母粉15g，蛋白胨1g，KH2PO4 5g，MgSO4·7H2O 3g，pH自然；每升初始液体发酵培养基(IV)中各组分的质量分别为：葡萄糖100g，酵母粉10g，蛋白胨3g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 3g，pH自然。各接入1ml亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子悬液，在25℃、180rpm条件下恒温发酵培养10天。将发酵液在4℃、12000rpm条件下，离心10min，分别收集菌丝体和发酵液，依据上述优化方案中的步骤(3)～(5)，制备获得紫杉醇，并最终定容在2ml的100％甲醇中，依据常规紫杉醇纯化方法(余 龙江，等.2002，林产化学与工业，22：45-48)进行纯化后，获得溶解在1ml100％甲醇中的紫杉醇溶液。各取10μl用于HPLC分析(条件同[实施例2])，测定其紫杉醇的含量，实施例结果表明，用初始发酵培养基(I)、(II)、(III)、(IV)进行亮白曲霉HUST-RBB3菌株的发酵，都有紫杉醇的合成，其中，初始发酵培养基(I)的紫杉醇产量最高，为135.1μg/L。
[实施例5]
依据实施例4的发酵培养基(I)组成配制发酵培养基，并分别将初始pH调至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，然后各接入1ml亮白曲霉HUST-RBB3的孢子悬液，在25℃、180rpm条件下恒温培养10天。4℃、12000rpm离心10min收集菌丝体和发酵液，依据上述优化方案中的步骤(3)～(5)制备获得紫杉醇，并最终定容在2ml的100％甲醇中，依据常规紫杉醇纯化方法(余龙江，等.2002，林产化学与工业，22：45-48)进行纯化后，获得溶解在1ml 100％甲醇中的紫杉醇溶液。各取10μl用于HPLC分析(条件同[实施例2])，测定其紫杉醇的含量，实施例结果表明，用液体发酵培养基(I)进行亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵，初始pH为4.0～8.0时，都有紫杉醇的合成，其中pH6.0是亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵产紫杉醇的最适初始pH值，该条件下紫杉醇的产量为150.5μg/L。
[实施例6]
在实施例5的基础上，亮白曲霉HUST-RBB3菌株分别在16.0℃、18.0℃、20.0℃、22.0℃、24.0℃、26.0℃、28.0℃、30.0℃、32.0℃、34.0℃条件下，180rpm发酵培养10天后，4℃、12000rpm离心10min收集菌丝体和发酵液，依据上述优化方案中的步骤(3)～(5)制备获得紫杉醇，并最终定容在2ml的100％甲醇中，依据常规紫杉醇纯化方法(余龙江，等.2002，林产化学与工业，22：45-48)进行纯化后，获得溶解在1ml100％甲醇中的紫 杉醇溶液。各取10μl用于HPLC分析(条件同[实施例2])，测定其紫杉醇的含量，实施例结果表明，用初始pH6.0的液体发酵培养基(I)进行亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵，培养温度在18℃～32℃都有紫杉醇的合成，其中，30.0℃是亮白曲霉HUST-RBB3菌株发酵产紫杉醇的最适培养温度，该条件下紫杉醇产量为171.6μg/L。
[实施例7]
在初始pH为6.0的300ml优化的液体发酵培养基中接种1ml浓度为108个孢子/ml的亮白曲霉HUST-RBB3菌株的孢子悬液，在初步优化后的发酵条件下，即200rpm，30.0℃条件下恒温发酵培养13天，亮白曲霉HUST-RBB3菌株可生产497.3μg/L的紫杉醇。每升优化的液体发酵培养基中各组分的质量分别为：葡萄糖80g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 1g，苯甲酸钠10mg，苯丙氨酸25mg，丝氨酸15mg，甘氨酸20mg，水杨酸15mg。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于上述实施例所公开的内容。所以，凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
表1：亮白曲霉HUST-RBB3菌株的形态特征和生理特征
(注：+：positive；-：negative)
Claims (5)
1.一种产紫杉醇亮白曲霉(Aspergillus candidus)，其保藏号为CCTCCNo.M208209。
2.一种利用权利要求1所述产紫杉醇亮白曲霉发酵制造紫杉醇的方法，其特征在于：在18～32℃、pH4.0～8.0、需氧条件下，在培养基中培养产紫杉醇亮白曲霉菌株以在其细胞内和培养基中聚集紫杉醇后，从其细胞内和培养基中提取紫杉醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法具体包括下述步骤：
(1)将产紫杉醇亮白曲霉菌株接种在PDA培养基平板上，25℃～28℃静置培养10～15天后，加入灭菌的蒸馏水，通过玻璃棉过滤器过滤收集孢子，用无菌生理盐水洗涤3～5次，然后用无菌生理盐水稀释至106～108个孢子/ml的数目；
(2)按每300～500ml液体发酵培养基接种1～5ml产紫杉醇亮白曲霉菌株的孢子悬液，将产紫杉醇亮白曲霉菌株接种到液体发酵培养基中，在18～32℃、pH4.0～8.0、需氧条件下发酵培养10～15天后，分别收集菌丝体和发酵液；
(3)菌丝体在45℃～50℃条件下烘干，然后研磨粉碎，过200目筛子收集细粉，每1.0g细粉用6ml甲醇/氯仿抽提3～5次，合并所有抽提液，甲醇/氯仿的体积比为1∶0～1∶1；
(4)发酵液用氯仿振荡抽提3～5次，发酵液与氯仿的体积比为1∶1～3∶1，合并所有抽提液；
(5)将步骤(3)和(4)中得到的抽提液分别在45℃～50℃条件下减压蒸馏回收溶剂，并将蒸馏回收溶剂后的残余物质溶解在适量的100％甲醇中，即获得紫杉醇粗提溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基按下述配比制备：葡萄糖80g，酵母粉10g，蛋白胨5g，KH2PO4 2g，MgSO4·7H2O 1g，苯甲酸钠10mg，苯丙氨酸25mg，丝氨酸15mg，甘氨酸20mg，水杨酸15mg，加入适量蒸馏水溶化后，用蒸馏水定容至1升。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵的优化条件为：在初始pH为6.0的300ml液体发酵培养基中，接种1ml浓度为108个孢子/ml的产紫杉醇亮白曲霉菌株的孢子悬液，200rpm，30.0℃条件下恒温发酵培养13天。
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Granted publication date: 20101222 Termination date: 20161210 |